JPH04502854A - 変形性関節症の初期段階の診断、モニタリングならびに治療の方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 変形性関節症の初期段階の診断、モニタリングならびに治療の方法および組成物 発明の分野 本発明は、変形性関節症のヒトおよび動物の軟骨プロテオグリカンの、非定型コ ンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸グリコサミノグリカン鎖上の抗原決定基を特 異的に認識するモノクローナル抗体を用いた、変形性関節症の初期の診断、モニ タリングならびに治療の方法および組成物に関する。この非定型の鎖は、変形性 関節症のマーカーである。

発明の背景 変形性関節症は、関節表面およびその周辺における、機能低下、関節軟骨の剥離 および新しい骨形成により特徴づけられる関節の変質過程である。これは、米国 だけでも約４０００万人の成人がかかっていると推定されている。この疾患は、 特に、５５才を超える人々に流行していて、人口の高齢化に伴い、医療期間にお いて大きな関心を寄せられる疾患となっている。

ヒトにおいて、変形性関節症の発症には数年を要する。この疾患の進行に伴い、 病巣の軟骨が文字通り剥がれていく。

現在、変形性関節症は、変質過程において極めて遅い時期にならないと診断する ことができない。従って、現在の医学的治療法は、主に、この疾患の後期炎症段 階を回復させることを試みるものである。この時点では、変質過程を停止または 回復させるには、事実上遅すぎる。

長い間、文献において、これら後期炎症段階に達するまでの現象が最も重要であ ることがいわれてきた。多くの製薬会社が、例えば抗炎症剤による変形性関節症 治療の考え方をあきらめており、現在、初期の損傷、すなわちこの疾患の初期段 階を治療する薬剤の発見および開発を試みている。しかし、これらの薬剤の変形 性関節症の初期段階に対する有効性をモニターするアッセイはまだわかっていな い。さらに、この疾患の初期段階における診断もできない。このため、臨床的に は、最も初期段階ではどの患者がこの疾患に感染しているのかわからないし、そ のため、このような薬剤および治療法をどの患者に行えばよいのかわからない。

米国特許第４．７０４．３５６号は、変形性関節症の診断のだめの潜在的マーカ ーに関するものである。それは、ケラタン硫酸の定量的イムノアッセイを用いて おり、この物質は、変形性関節疾患者において増加すると考えられている。この イムノアッセイは、変形性関節症診断を満足するものではない。第一に、それは 、正常組織成分からの放出の増加を検出するが、病理学的過程を選択的に同定す るものではない。さらに重要なことは、変質過程の初期段階において、ケラタン 硫酸が異常に高くなったり、異常に低くなったりするものかどうかについてはま だ多くの議論がある。最後に、上記３５６米国特許のこの方法は、予見的検査と してのみ、すなわち、変形性関節症の存在を確認する上で有用なのである。この 方法は、この疾患をその初期段階において診断あるいは探知するために用いられ ていない。

結果として、変形性関節症の臨床評価は、十分な診断基準がなく、関節障害の進 行過程を検出かつ測定する方法がないために、妨げられている。この疾患は、広 範囲に、不均一に、ゆっくりと進行するため、明確で信頼性の高い検査法が、診 断のためだけでなく、縦の評価、すなわち疫学および薬剤の開発のためにも、非 常に必要とされている。

１豆旦！１ 本発明の目的は、それ故に変形性関節症の初期段階゛に特徴的なマーカーを確認 することにある。さらに、本発明の目的は、変形性関節症の診断、モニタリング および治療における方法および組成物の開発のためにこのマーカーを用いること にある。

本発明は、変形性関節症の軟骨プロテオグリカンの非定型コンドロイチン硫酸あ るいはデルマタン硫酸グリコサミノグリカン鎖が、変形性関節症の初期段階に特 徴的なマーカーであることを初めて証明することにより、これらの目的が達成さ れる。我々は、これらのマーカーが、正常な成熟軟骨組織において見いだされた 通常のコンドロイチン硫酸あるいはデルマタン硫酸グリコサミノグリカン鎖に対 し非定型な、微細構造ドメインを含むと考えている。

さらに本発明の実施態様において、これらの非定型構造を選択的に認識するモノ クローナル抗体を、変形性関節症の初期段階の診断の方法および組成物に使用す るために産生ずる。

本発明のもう一つの目的は、本発明のモノクローナル抗体と結合させた治療薬を 用いて変形性関節症を治療するための方法および組成物を提供することである。

このようにして、この薬剤は、正常な組織と区別して、疾患のみられる組織を特 異的に標的とする。

さらに、本発明のもう一つの目的は、変形性関節症の経過のモニタリングおよび その治療効果の判定のための方法および組成物にこれらのモノクローナル抗体を 用いることである。

この実施態様は、特に、動物モデルにおいて、変形性関節症の最も初期段階を予 防または治療する薬剤のスクリーニングおよび試験に特に有用である。

［Ｌ旦隻生星翌里 第１図は、正常な犬の頚骨、大腿骨、および膝蓋骨溝の軟骨から、および実験的 に変形性関節症を誘発した３ケ月後の成熟イヌの変形性関節症の膝関節から採取 したプロテオグリカンの５／６／３−Ｂ−３イムノプロツトのデンジトメトリッ クスキャンを示す。

第２図は、正常な犬および実験的に変形性関節症を誘発した３ケ月後の成熟イヌ の変形性関節症軟骨由来のプロテオグリカンＭＢ物のＢ／２５／１−Ｄ−４イム ノプロツトのデンジトメトリックスキャンを示す。

第３図ａおよび第３図すは、正常ヒト軟骨由来のプロテオグリカンの５／６／３ −Ｂ−３イムノプロツトのデンジトメトリックスキャンを示す。

第４図ａおよび第４図すは、変形性関節症ヒト軟骨由来の、プロテオグリカンの ５／６／３−Ｂ−３イムノプロツトのデンジトメトリックスキャンを示す。

置皿μＪ」酊り疲脈 ここに示す発明を、より十分に理解するため、以下に詳細な説明を示す。

プロテオグリカンは、軟骨の細胞外基質の主要成分であり、この組織の硬直性お よび弾性に関わる。軟骨プロテオグリカンは、長く延びたタンパクのコアに、多 くのグリコサミノグリカン鎖とオリゴ糖が結合した高分子複合体である。軟骨プ ロテオグリカンのタンパクコア中で５つの異なるドメインが同定されている。す なわち、ヒアルロン酸結合部位を形成する球体部分に高度に包まれたもの、機能 のわからない２番目の球状ドメインでヒアルロン酸結合部位と相同性を示す配列 の一部、短く延びたケラタン硫酸に富む部分、長（延びたコンドロイチン硫酸を 持つ部分、およびレクチン様性質を有するＣ末端球状ドメインである。デルマタ ン硫酸は、コンドロイチン硫酸のグルクロン酸残基の代わりに、イズロン酸残基 の種々の部分が存在することのみが異なる。

ここの記載および本願において、非定型コンドロイチン硫＃／デマルタン硫酸は 、変形性関節症に特徴的な微細構造ドメインを有する鎖として定義される（正常 軟骨！ａ織にはみられない）。これらの非定型フンドロイチン硫酸／デルマタン 硫酸鎖には、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３（ヒト、イヌおよびモルモ ット（ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ）軟骨プロテオグリカン）あるいは８／２５／７− Ｄ−４（イヌおよびモルモット軟骨プロテオグリカン）により特異的に認識され る鎖が含まれる。他のこのような非定型フンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖 は、本発明の他のモノクローナル抗体により特異的に認識される。

ここに示すように、これら郭定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖の我々 の発見と同定およびこれらが変形性関節症の特異的マーカーとなることについて の我々の確認は、哺乳類における変形性関節症の初期段階を診断するための方法 オよび組成物の開発を可能にした。これら郭定型コンドロイチン硫酸／デルマタ ン硫酸鎖の我々の発見は、哺乳類における変形性関節症の経過をモニタリングす るための方法および組成物の開発をも可能にした。これらのモニタリングは、薬 剤の開発およびスクリーニングにおいて特にＭ要であり、臨床応用において選択 された治療法の経通を追跡する上でも特に重要である。例えば、変形性関節症の 初期段階の予防あるいは治療を行う薬剤の研究および試験のために製薬会社およ び他の研究者が動物モデルにおいて本発明の方法および組成物を使用し得ること は、本発明の重要な目的でもある。

本発明のモニタリングおよび診断の実施態様に有用なこの組成物は、以下のプロ トコールを用いて選択可能なモノクローナル抗体により特徴づけられる。すなわ ち、変形性関節症を発症している哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリ カンに対して生じたモノクローナル抗体のうち、以下の条件においてスクリーニ ングされた抗体により特徴づけられる。

）（１）変形性関節症を発症しだ哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリ カンを選択的に認識する（抗体作成に用いられた抗原を採取した哺乳類と同じで あることが望ましい）、（２）変形性関節症を発症していない哺乳類から採取し た軟骨抽出物のプロテオグリカンを認識しないかもしくは（１）のスクリーニン グにおいてよりも有意に認識の程度が低い（最初のスクリーニングに使用した哺 乳類と同じであることが望ましく、および抗原を採取した哺乳類と最初のスクリ ーニングに使用した哺乳類とが同じであることがより望ましい）、（３）変形性 関節症を発症した哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカンから、酵素 的もしくは化学的処理により、フンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖を完全に 除去したものを認識しない（さらに、抗体作成に用いられた抗原を採取した哺乳 類と同じであることが最も好ましく、最初と２回目のスクリーニングに用いられ た哺乳類が同じであることも最も望ましい）。

上記（１）および（２）のスクリーニングにおいて、変形性関節症を発症してい る哺乳類もしくは発症していない哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリ カンは、鎖構造を切断もしくは修飾し得るフンドロイチナーゼ、ヒアルロニダー ゼ、その他の酵素で処理されていないことが重要である。コンドロイチン硫酸／ デルマタン硫酸鎖は、酵素的な方法あるいは、アルカリボロハイドライド、無水 フッ化水素、あるいはトリフルオロメタンスルホン酸等の化学的方法により完全 に取り除くことができる。スクリーニング（３）は、コンドロイチン硫酸／デル マタン硫酸鎖構造の部分ではないプロテオグリカン抗原を認識する抗体を除くの に役立つ。

この示されたプロトコールによる選択可能な抗体には、モノクローナル抗体５／ ６／３−Ｂ−３，８／２５／７−Ｄ−４およびこれらと免疫学的な交叉活性を示 す抗体がある（免疫学的な交叉活性とは、郭定型コンドロイチン硫酸／デルマタ ン硫酸鏡上の実質的に同一のエピトープに対する結合能として定義される）。

本発明に先立ち、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３は、正常なコンドロイ チン−６−硫酸プロテオグツカンの定量に用いられていた。このモノクローナル 抗体５／６／３−８−３の使用については、その組織またはサンプルがフンドロ イチナーゼまたはヒアルロニダーゼにより前処理されていることが必要であり、 これによって、グリコサミノグリカン鎖を切断し、５／６／３−Ｂ−３エピトー プにより特徴づけられた短くされた鎖が残る。

Ｃａｔｅｒｓｏｎら、「プロテオグリカン構造と機能を解明するためのプローブ としてのモノクローナル抗体Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆＰｒｏｔｅｏｇｌｙｃａ ｎｓ、　Ｔ、　ｌｆｊｇｈｔ　ａｎｄ　Ｒ，Ｍｅｃｈａｍ　ｍ、　ｐｐ、　１− ２６゜Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、（１９８７）　ｏ　これに 対し、グリコサミノグリカン鎖を切断して短い鎖とする酵素、あるいは鎖全体を 除去する酵素、または化学物質で組織またはサンプルを前処理しないで抗体を使 用することが、本発明による方法および組成物の不可欠な特徴である。

モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３は、ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ。

Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏから入手可能であり、あるいは、免疫処理にお ける抗原としてスヮームラット軟骨肉腫プロテオグリカンコアタンパクを用いて 調製することもできる。これは、本発明のモノクローナル抗体として望ましい。

理論に縛られることなく、我々は、モノクローナル抗体Ｓ／６／３−Ｂ−３が、 プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸鎖の非還元性末端で、Ｎ−アセチルガラ クトースアミン−６−硫酸に隣接する末端グルクロン酸残基を検出すると確信し ている。

モノクローナル抗体８／２５／７−Ｄ−４は、１７日令のニワトリ胚骨髄プロテ オグリカンを抗原として用いて作成することができる。モノクローナル抗体５１ ５／３−Ｂ−３とは異なり、鎖を短くするための、フンドロイチン硫酸／デルマ タン硫ｅ、＃Ｊｌの酵素的（コンドロイチナーゼまたはヒアルロニダーゼ）切断 は、この抗体に認識されたエピトープを削除する。理論に縛られることなく我々 は、モノクローナル抗体８／２５／７−Ｄ−４が、５７６／３−８−３とは異な るコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖のエピトープを検出すると確信してい る。しかし、このエピトープの特異な生化学的性質は、まだ確認されていない。

モノクローナルバイブリド−７Ｂ／２５／７−Ｄ−４のサンプルは、Ｉｎ　Ｖｉ ｔｒ。

Ｉｎｔｅｒｎ’ａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、、　６１１　Ｐ、　Ｈａｔｍｔｎｏｎ ｄｓ　Ｆｅｒｒｙ　Ｒｏａｄ。

Ｌｉｎｔｈｉｃｕ＋ｍ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２１０９０．　に１９８８年６月 １６日に寄託され、受託番号はＩＶＩ　１０１７３となった。

変形性関節症の初期段階の診断に用いられる本発明の他の抗体は、Ｃａｔｅｒｓ ｏｎら、「プロテオグリカン構造と機能を解明するためのプクーブとしてのモノ クローナル抗体Ｊ　Ｂｊｏｌｏｇｙｏｆ　Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ、　Ｔ、 　ｆｉｇｈｔ　ａｎｄ　Ｒ，Ｍｅｃｈａｍｍ、　ｐｐ、１−２６゜Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、　（１９８７）に示されている標準（従来の） 免疫手順における抗原として、変形性関節症を発症した哺乳類かり採取した軟骨 抽出物のプロテオグリカンを用いて、上記のように調製することが望ましい。次 に、本発明の抗体は、これらの抗原に対して作成されたモノクローナル抗体の中 から、以下の条件でスクリーニングを行うことにより選択する。

（１）変形性関節症を発症した哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカ ンを選択的に認識する（抗体作成に用いられた抗原を採取した哺乳類と同じであ ることが望ましい）、（２）変形性関節症を発症していない哺乳類から採取した 軟骨抽出物のプロテオグリカンを認識しない（最初のスクリーニングに使用した 哺乳類と同じであることが望ましく、さらに抗原を採取哺乳類と最初のスクリー ニングを行った哺乳類とが同じであることがより望ましい）、（３）変形性関節 症を発症した哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカンからであって、 フンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖を酵素的にあるいは化学的処理によって 完全に除去したものを認ａｆｉしない（さらに、抗体作成に用いられた抗原を採 取した哺乳類と同じであり、および最初と２回目のスクリーニングに用いられた 哺乳類が同じであることが最も望ましい）。

本発明の方法に従うと、本発明の抗体は、哺乳類の変形性関節症を、その軟骨組 織、滑液、または血清を用いて診断するのに使用し得る。しかし、この疾患に特 徴的なマーカーとして発見した郭定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖は 、全身に平衡を保って存在しているため、他の体組織および体液、例えば尿中に 見いだされる。

上記組成物は、変形性関節症の診断または経過のモニターのための種々のアッセ イに有用である。このようなアッセイの原理は、周知であり、従来技術である。

それらは、それらを特徴とする本発明のモノクローナル抗体の特異性のために、 本発明の種々の実施態様に有用である。

本発明の診断アッセイは、体液または組織の分析物中の郭定型コンドロイチン硫 酸／デルマタン硫酸の増加量を検出することによっている。本願において用いら れているように増加量は、少なくとも正常組織や体液の２倍である。通常は、こ の増加量は、２〜１５０倍の間である。そして、この増加量が２〜１５倍である ことがより望ましい。

本発明の組成物を、変形性関節症の進行または治療の影響や経過をモニターする うえで用いる場合、このアッセイは、体液または組織の分析物中の郭定型コンド ａイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖の存在および量の追跡に依存する。この発明の 実施態様において、このような鎖の相対的な量は、疾患や治療の方法を決定する ために、正常な組織または体液の量と、発症した組織または体液の治療前、すな わち発症初期におけるサンプル中の量との比較である。

このようなアッセイの１つを例として示すと、Ｒａｔｃｌｉｆｆｅａｎｄ　Ｈａ ｒｄｉｎｇｈａｍ、ｒ軟骨プロテオグリカンの結合部分と結合タンパクＪ　、Ｂ ｊｏｃｈｅｍ　Ｊ、、　２１３．　ｐｐ、　３７１−７８　（１９８３）の示す ラジオイムノアッセイがあげられている。この特殊なアッセイ系では、滑液サン プルは、標識した抗原として本発明のモノクローナル抗体により特異的に認識さ れるエピトープを含む１２５１−標識プロテオグリカンと、免疫沈降剤として熱 変性ホルマリン固定黄色ブドウ球菌を用いた競合的ラジオイムノアッセイにより 分析され得る。それ力）ら、我々は、標準プロテオグリカン抗原の検量線を用い て、この結果を定量化することができる。本発明の望ましい実施態様として、モ ノクローナル抗体が５／６／３−Ｂ−３である場合、フンドロイチナーゼで前処 理したヒト関節軟骨プロテオグリカンが放射標識される。モノクローナル抗体８ ／２５／７−Ｄ−４を用いる場合、１７日令のニワトリ胚骨髄プロテオグリカン が放射標識される。

変形性関節症診断の他のアッセイは、アガロース／アクリルアミドの混合物の平 板ゲル上に軟骨抽出物のサンプルの電気泳動により特徴づけられる。この軟骨抽 出物とアガロース／アクリルアミド混合ゲルは、例として、ｃａｒｎｅｙら、「 ポリアクリルアミド−アガロース混合ゲル上の３５ｓｆ！１識プロテオグリカン の電気泳動およびその蛍光間接撮影法による視覚化」Ａｎａｌ　ｔ、Ｂｉｏｅｈ ｅｍ、、　１５６．　ｐｐ、３Ｂ−４４（１９８６＞に従って、１．２％（Ｖ／ Ｖ）ポリアクリルアミドと０．６％（ｗ／ｖ）アガロースの混合ゲルを用いて調 製することができる。電気泳動後、このプロテオグリカンは、電気泳動的にナイ ロンシートの上に移され、そして本発明の変形性関節マーカーの出現は、ペルオ キシダーゼが結合された２番目の抗体を検出用に用いて、５／６／３−Ｂ−３ま たは８／２５／７−Ｄ−４等の本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的位 置確認により検出される。

エンザイムリングドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）および免疫放射測 定アッセイ等の他の種々のアッセイも、本発明の抗体を用いて、本発明の方法に 代わって使用できることを述べておく必要がある。

我々は、変形性関節症のマーカーとしての非定型構造を初めて発見したため、Ｈ ＰＬＣ分析やＧＣ−Ｍａｓｓ分光分析等の他の従来の生化学的技術は、これらの 非定型構造を検出し、さらに、変形性関節症を診断したり、あるいはこの疾患と それに対する治療の経過をモニターするためにも用いることができる。

例えば、これらの非定型構造は、従来のグリコサミノグリカン鎖の化学的または 酵素的切断、得られたオリゴサツカライドのＨＰＬＣゲル濾過および／またはイ オン交換法による分画化、ＧＣ＝ＭＳＳＳ分光分析または他の分析法を用いた化 学的分析の後に、検出することができた。

本発明のもう１つの実施態様では、本発明のモノクローナル抗体が、薬剤と結合 され、薬学的に受け入れられる投与法により変形性関節症損傷部分へ直接投与す ることができる治療法と組成物が提供される。この望ましい薬剤は、治療上の応 用の意図される方法に依存している。例えば、これらの薬剤には、細胞増殖因子 、細胞毒素、サイトカインレセブターあるいは細胞外プロテイナーゼの阻害物質 を含み得る。用量設定および投与方法は、患者の健康状態、担当医師の判断等の 因子に依存する。

本発明をより理解するために、以下にその実施例を示す。

これらの実施例は、例示することのみが目的であり、本発明の範囲にいかなる制 限を加えるものではない。

（以下余白） 叉１■引Ｌ Ａ、抗原の調製、免疫処理および 胞ハイブリダイゼーション モノクローナル抗体Ｓ／６／３−ｂ−３は、スワームラット軟骨肉ｌｉｔプロテ オグリカンコアタンパクを免疫処理の抗原として用いて作成した。このプロテオ グリカンコアタンパクは、プロテオグリカンモノマーであるＡＩＤＩ分画を、Ｃ ｈｒｉｓｔｎｅｒら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ、、　２５５．７１０２−Ｏ５ （１９８０）の示す条件下において、フンドロイチナーゼＡＢＣで切断すること により得られた。モノクローナル抗体８／２５／７−Ｄ−４は、１７日令ニニワ トリ前髄プロテオグリカンを抗原として作成した。この骨髄プロテオグリカンモ ノマーは、５ｏｒｒｅｌｌら、Ｃｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、、２５２．５２３ −３１（１９８８）の記載に従って調製した。各抗原の保存用溶液（８００μｇ ／＋１　滅菌ダルベツコリン酸緩衝生理食塩水、その０．５ｍ１Ｘ　５）を調製 し、−２０℃で保存した。

Ｂａ１ｂ／ｃＪ系雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：　４ −８適合）に対し、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３のためのスワームラ ット軟骨肉腫プロテオグリカンコアタンパク（８００μｇ／ｍｌ）　アルイはモ ノクローナル抗体８／２５／７−Ｄ−４のための１７日令ニニワトリ前髄プロテ オグリカンモノマー（４００μｇ／ｍ　１　）のいずれかを用いて免疫処理した 。この抗原は、マウスの６箇所の注射部位（後肢足部、外側胸部、鼠径部）に、 Ｃａｔｅｒｓｏｎら、「プロテオグリカンの生物学Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　 ｔｈｅ　ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘ、　Ｔ、　Ｎｉｇｈｔ　ａｎ ｄ　Ｒ，Ｍｅｃｈａａ＋ｔｉ＆ｉ、ｐｐ、　１−２６．　ＡｃａｄｅｍｔｃＰｒ ｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、（２９８７）に記載の方法を用いて投与した。注射は、こ の注射の方法の１．　３．６．９．１２２回目行った。最初の注射（第１Ｅ目） では、抗原とＦｒｅｕｎｄ完全アジニバントとを１：ｌで混合し、２回目の注射 （第３Ｅ目）では、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジニパントを、そして続く３回の注射 （第６．９．１２２回目では、等張生理食塩水（０，１５Ｍ　ＮａＣ１）を投与 した。

抗原混合物の約５０μｍを、各注射部に、マウスの６箇所の注射部位それぞれに 対し注射した。ハイブリドーマ融合は、最後の注射の２日後に行った（第１４日 月）。

マウスの注射部位に最も近いトレーイニング（ｄｒａｊｎｊｎｇ）リンパ節（腋 窩、上腕、鼠径、腋窩リンパ節）は、ラミナー７０−フード（１ａａ＋１ｎａｒ 　ｆｌｏｗ　ｈｏｏｄ）の下で無菌的に切開され、バイブリドーマ作成のための リンパ球増殖の源として用いられた。リンパ球は、滅菌ダルベツコリン酸緩衝生 理食塩水２＋ｍｌを入れた２５ｍｍペトリ皿の中で、ビンセットでリンパ節をこ すり、最終的には、３ｔｔｒｌのシリンジを用いて１８ゲージの針により吸引と 吸い出しを繰り返すことにより、分散させた。このリンパ球は、バスツールビペ レット中の滅菌ガラスウールフィルタープラグに細胞懸濁液を通すことにより、 付着した結合組織と分離し、４℃で、培養液ＲＰＭＩ　１６４０　（ＰｌｏｗＬ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　４０ｍ１でこの細胞を２回洗浄した。

細胞融合は、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｊｎの開発した方法に従って 行った。約ｌＸＩＯ３個のリンパ球と５ＸＩＯ７個のｘ６３−Ａｇ８．６５３ミ エローマ細胞（アラバマ大学、Ｄｒ、Ｊｏｈｎ　Ｆ、　Ｋｅａｒｎｅｙから寄贈 、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　ＡＴＣＣ＃　ＣＬＲ１５８０）とを、２０％ポリエ チレングリコール（ＰＥＧ　４０００．　Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ）とを５％ジメチルスルフォキサイドを含むＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｆｌｏｗ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からなる融合培地１．５ｍｌを滴下することによ り融合した。

Ｂ、ハイブリドーマの　と 細胞融合の後、細胞を）ＩＡＴ培地（ヒポ牛サンチン、アミノプテリンおよびチ ミジン）で５％ＣＯ２存在下高湿度で、３７℃において培養した。１０日から１ ４日後、ハイブリドーマを含む培地から０．５ｍｌ培養液サンプルを採取し、元 のプロテオグリカン抗原に存在した抗体認識エピトープを、Ｃａｔｅｒｓｏｎら 、Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ、、　２５８．　ｐｐ、　８８４８−５４　（１９ ８３）の示すＥＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイ法を用いて分析した。注射 した抗原に存在するエピトープに特異的に反応する抗体を含むハイブリドーマ培 養物を選択しクローン化した。次に、このクローンは、飼育の終わったＢａ１ｂ ／ｃＪマウスに、２．６．１Ｏ１１４−テトラメチルペンタデカン（Ａｌａｄｒ ｉｃｈ　Ｃｈｅ＋＋１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を前投与したものに、得られた クローンの細胞１×１０７個（ダルベツコリン酸緩衝生理食塩水１．０＋ｍｌ） を腹腔内投与することにより移した。これらのマウスから採取した悪性の腹水を 、抗体の特異性の決定のために用いた。ハイブリッド抗体５／６／３−Ｂ−３と ８／２５／７−Ｄ−４は両方共、標準的手法により１ｇＭサブクラスであること が証明された。モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３はマウス１ｇＭサブクラ スとしては珍しいが、黄色ブドウ球菌プロティンＡに結合することも見いだされ た。

Ｃ１モノクローナル　、“　の、　′ モノクローナル抗体５／６／３−８−３は、コンドロイチナーゼＡＢＣで処理し たスヮームラット軟骨肉腫プロテオグリカンモノマーを抗原として作成した。５ ／６／３−Ｂ−３の抗原特異性は、フンドロイチナーゼＡＢＣ％ＡＣＩＩあるい は哺乳類ヒアルロニダーゼのいずれかで前処理した正常軟骨プロテオグリカンを 用いて明確にされた。Ｊ、　Ｒ，Ｃｏｕｃｈａ＋ａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、　３０ ？、　ｐｐ、　６５０−５２　（１９８４）　；　Ｂ、　Ｃａｔｅｒｓｏｎら、 「プロテオグリカン構造と機能を解明するためのプローブとしてのモノクローナ ル抗体」Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔ ｒｉｘ、　Ｔ、　Ｎｉｇｈｔ　ａｎｄ　Ｒ。

Ｍｅｃｈａｍ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、　１−２６　（１９ ８７）　ｏ　この前処理は、フンドロイチン硫酸鎖を短＜シ、６−硫酸Ｎ−アセ チルガラクトサミン残基に隣接する非還元性末端グルクロン酸残基の量を増加さ せる。このエピトープは、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３により認識さ れる。Ｓ／６／３−Ｂ−３を含むこれらの非還元性末端構造は、変形性関節症を 発症したヒトおよびイヌの軟骨プロテオグリカン中のコンドロイチン硫酸にみら れるが（フンドロイチナーゼまたはヒアルロニダーゼの前投与は行わない）、こ のエピトープは、正常または対照組織においては有意に認識の程度が低い。

モノクローナル抗体８／２５／７−Ｄ−４は、１７日令ニワトリ胚骨髄プロテオ グリカンを抗原として用いて作成した。この場合、フンドロイチナーゼを処理し ないプロテオグリカンを抗原として用いた。このモノクローナル抗体の特異性の 特性決定では、８７２５／７−Ｄ−４エピトープは、フンドロイチナーゼ前処理 により広範囲にわたり切断したコンドロイチン硫酸鎖を持たないプロテオグリカ ンだけに存在することが示された。フンドロイチナーゼで完全に切断すると、８ ／２５／７−Ｄ−４抗体により認識される抗原決定基が除去されるが、このこと は、このエピトープがコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン鎖に存在するこ とを示している。従って、８／２５／７−Ｄ−４エピトープは、非処理のコンド ロイチン硫酸グリコサミノグリカン鎖の構成構造である。

Ｌ胤匹呈 モノクローナル抗体５／６／３−８−３を用いたラジオイムノアッセイによる関 節滑液中のコンドロイチン、デルマ　ン　°の 我々は、成熟（３〜６年令）ピーグル大６頭に対し、Ｍ。

Ｐｏｎｄ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｎｕｋｆ、ｒイヌにおける実験的誘発変形性関節症」 幻阻」上鮎！、旦ム、、　３２．　ｐｐ、　３Ｂ’１−８８　（１９７３）の示 す方法を用いて、実験的変形性関節症を誘発させた。手術の３ケ月後、動物を殺 し、我々は、イヌの膝関節内へ滅菌生理食塩水５ｍｌを注射した。我々の動物モ デルでは、反対側の膝関節を対照とする。この関節を数回伸ばしたり曲げたりし た後、滑液を吸引し乾固した。次に我々は、５／６／３−８−３エピトープを含 む放射標識抗原を調製した。このエピトープは、ヒト関節軟骨から単離して、コ ンドロイチナーゼＡＢＣで消化したプロテオグリカンを１２５【−ヨード化する ことにより、我々のラジオイムノアッセイ（ｒＲＩＡＪ　）の標準とされたｏ　 Ａ、　Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ　ａｎｄ　Ｔ、　Ｅ。

Ｈａｒ＋Ｈｎｇｈａｍ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋　Ｊ、、　２１３．　ｐｐ、　３７ １−７８　（１９８３）　、モノクローナル抗体５／６／３−８−３により認識 されるエピトープを測定するための「非標識」標準抗原を調製するために、我々 は、ヒト関節軟骨から単離したプロテオグリカンをフンドロイチナーゼＡＢＣで 前処理した。この前処理により、グリコサミノグリカン鎖が短くなり、５／６／ ３−Ｂ−３により認識されたエピトープを含む多くの新しい糖鎖末端ができる。

１２５Ｉ−放射標識で標準化した抗原は、抗体５／６／３−Ｂ−３の好適な滴定 で、競合釣餌Ａ分析での標識抗原として用いた。

ら得られた滑液の試験サンプルはすべて、コンドロイチナーゼの前処理を行わな いで分析したため、インビボにおいてコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鏡上 にみられる５／６／３−Ｂ−３エピトープの量のみが検出された。競合的ラジオ イムノア・ツセイ分析を行う前に、各吸引物質を、インキュベージコン緩衝液（ ０，５％　（ｗ／ｖ）　デオキシフール酸ナトリウム、０，１％　（ｖ／ｙ）　 Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０および０．１％　（ｖ／ｖ）牛血清アルブミンを含む 、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＩＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐｉ（７，４）を用い て連続希釈した。Ｓ／６／３−８−３抗体（１００μｌ）の希釈溶液を（１２Ｊ −標識ＲＩＡ標準化抗原の５０％が沈降するのに十分な溶液）　、　１．５ａ＋ １容量のプラスチック製のマイクロ遠沈管の中で、インキュベーション緩衝液で 希釈した変形性関節症サンプルおよび対照サンプル（５０μｌ）と　１２Ｊ−標 識フンドロイチナーゼＡＢＣで切断したヒト軟骨プロテオグリカン（２０，００ ０ｄｐｉ）とを混合し、２０℃で一晩インキュベートした。１０％（Ｗ／Ｖ）黄 色ブドウ球菌懸濁液３０μｍ（熱変性ホルマリン処理）を添加し、遠沈管を２５ 分間混合した後、遠心分離し、そのペレットをインキュベーション緩衝液で２回 洗浄した。このペレットと、上清と洗浄液を合わしたものとをそれぞれ別個にガ ンマ線カウンター（ＬＫＢ、スウェーデン）によりカウントした。１２５Ｉ−抗 原結合に対するサンプルの抑制作用は、抗原の既知濃度の標準曲線と比較し、そ の結果を抗原（フンドロイチナーゼにより消化されたヒトプロテオグリカン）の 濃度単位で表した。

第１表は、正常関節（反対側対照関節から得られた滑液）と変形性関節症（ｒＯ ＡＪ　）の関節との間での、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３工ピトープ 濃度を比較している。

各動物について、変形性関節症の関節から得られた滑液中の５７６／３−Ｂ−３ エピトープ量の増加が認められた。

（以下余白） １上表 実験的変形性関節症の関節から採取した滑液中の５／６／３−Ｂ−３のラジオイ ムノアッセイイヌＮｏ、　関節　抗原ｎｇ／ｍ１ ７４　正常　〈０．５ ＯＡ　４．４ ７５　正常　１．０ ＯＡ　２．０ ７６　正常　＜０．５ ０Ａ　５．７ ７７　正常　＜０．５ ＯＡ　６９．０ ５５８　正常　１．０ ＯＡ　１４２．０ ５６２　正常　５，０ ＯＡ　３６．０ （以下余白） 実施例３ モノクローナル抗体５／６／３−８−３および８／２５／７−ロー４を用いた、 関節軟骨プロテオグリカン中の非定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸構造 の検出　□ 我々は、Ｐｏｎｄ　ａｎｄ　Ｎｕｋｉの示すように、イヌに実験的変形性関節症 を誘発した。軟骨は、靭帯切断３ケ月後に、脛骨プラ）−１膝蓋骨溝、および大 腿骨顆から新たに切り出し、プロテイナーゼ阻害剤（０，１Ｍ　６−アミノヘキ サン酸、０．０１Ｍエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、塩酸ベンズアミジン および０．００１Ｍフェニルメタンスルフォニルフルオライド）ヲ含む１０倍量 の４Ｍ塩酸グアニジン、０．５Ｍ酢酸ナトリウムｐｉ（５，８の液により抽出し た。この抽出物は、８Ｍ尿素に対し、数回交換しながら透析し、そのプロテオグ リカン濃度は、Ｒ，Ｗ。

Ｆａｒｎｃｌａｌｅら、Ｃｏｎｎ、　Ｔｉ５ｓ　Ｒｅｓ、　９．　ＰＰ、　２４ ７−４８　（１９８２）　の示す色素結合アッセイにより測定した。我々は、対 照として、反対側の手術を行っていない関節から採取した軟骨を用いた。

異なる関節部分から採取した軟骨から抽出したプロテオグリカンは、次に、アガ ロース／アクリルアミド混合ゲル平板上の電気泳動により比較した。このゲルは 、ゲル緩衝液２２ｍ　ｌ（０，０４Ｍ　Ｔｒｉｓ酢酸／ｌｄ　Ｎａ、ＳＤ、　ｐ ）１６．８）中にアガロース　（０、２４ｇ）を懸濁することにより調製し、９ ０℃に加熱した。アクリルアミド（０，４５６ｇ）とビスアクリルアミド（０， ０２４ｇ）をゲル緩衝液（９，７ｍ１）に溶かし、これにβ−ジメチルアミノプ ロピオニトリル（０，４％、　ｗ／ｖＨ４，８ｍｌ＞を加え、この混合液を暖め た。アガロース溶液は、５２℃まで冷やし、過硫酸アンモニウム（０，３％（ｖ ／ｖ）；　３＋ｏｌ）をアクリルアミド溶液に加えた後、アガロースと完全に混 合し、あらかじめ５０℃に加熱したゲル鋳型に速やかに注ぎ込んだ。　（電気泳 動の間、混合ゲルを固定するために、ゲル支持部分の底に、深さ５０＋ｎｍのア クリルアミド（１０％ｗ／ｖ）の詰め物をした。重合中に空気を除くため、新し く注いだゲルの表面を、水飽和ｎ−ブタノールの層でおおった。このゲルは、冷 所（４℃）に１時装置いた後、４Ｍ尿素を含む緩衝液で一晩平衡化した。Ｍ衝液 （８Ｍ尿素および０．００１％（Ｗ／ν）ブＤ　％　７　ｘノールブルーを含む ０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ酢酸１０．２５ｍＭＮａｚＳＯａ、　ｐＨ６，８＞中に約 １０μｇのプロテオグリカンを含むサンプルは、各基線に負荷した。最初、ブロ モフェノールブルーがゲル内へ入るまでは６０Ｖで、次にそれが３Ｏｎ＋ｍ移動 するまでは１２０ｖとして、ゲルを４℃で電気泳動させた。別のゲルでもこの方 法で行った。１つのゲルは、プロテオグリカンのバンドを明瞭にするため、０． １Ｍ酢酸中のトルイジンブルー（０，２％（Ｗ／ｖ））で染色し、もう１つのゲ ルは、電気プロッティングのために染色しなかった。

ナイロンシート（Ｇｅｌｍａｎ　Ｂｉｏｔｒａｃｅ　ＲＰ）への電気泳動的な移 動は、半乾性電気プロッター＜５ａｒｔｏｒｉｕｓ、　Ｂｅｌｍｏｔ、　ＵＫ） に緩衝液（０，ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ酢酸、０．２５℃Ｍ　Ｎａ２５Ｄ４．　Ｐ）１ ６．８＞の最小量を入れ、８０ｍＡで１時間損作することにより行った。このナ イロンシートは、水洗した後、フィルター紙の上で乾燥させた。

非定型フンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖の免疫学的位置確認のため、用い た方法は、ニトロセルロースシートについて示されているＡ、　Ｌ、　Ｄｅｈｌ ａｓ　ａｎｄ　Ｈ，Ｍ、Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ。

じ方法であった。このナイロンシートは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　（ ０，１４Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＩＭ　Ｎａ、）ＩＰＯ，、ｐＨ７，４）でしめら せ、タンパク吸着部位は、ＰＢＳ中の１％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ ）で１時間インキュベーションを行うことによりブロックした。次に、このシー トを、抗体５／６／３−Ｂ−３または８／２５／７−Ｄ−４（ＰＢＳによる１０ ００倍希釈）で１．５時間インキユンベーションし、その後ＰＢＳを６回交換し て５分間洗浄した。さらに、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス免疫グロブリ ン（ＳｉｇＩＸｌａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）　（１％（ Ｗ／Ｖ）　ＢＳＡを含むＰＢＳによる１０００倍希釈）と共に１時間インキュベ ーションし、ＰＢＳを６回交換して５分間洗浄した。次にこのシートを、ペルオ キシダーゼ基質（ジアミノベンジジン／塩化コバルト／ニッケル硫酸アンモニウ ム試薬）と暗所で１５分間インキュベーションし、その後染色するために８２０ □も含む新しい試薬でインキュベーションした（３０〜９０分間）。非定型コン ドロイチン硫酸／デルマタン硫酸エピトープは、染色されていない背景の上に濃 く染色されたバンドとしてあられれたナイロンシート上にふいて、抗体により位 置が確認された。バンドの分布と強さは、２重波長ＴＬＣスキャナーＣ５−９３ ０（島津、日本）上のデンジトメトリックスキャンを調製することにより記録し た。

これにより、同一条件下かつ同じナイロンシート上に検出されたＯＡアよび正常 サンプルの定量的比較を行うことができた。

第１図に示すように、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３により認識される 非定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸エピトープの発現は、変形性関節症 の誘発された３ケ月後のすべての領域の変形性関節症軟骨において、反対側の対 照に比べて増加している。この結果は、変形性関節症を３ケ月あるいは６ケ月前 に誘発した試験動物２３頭中２３頭でみられた。

我々は、上記と同じ方法を用いて、モノクローナル抗体５／６／３−８−３を８ ／２５／７−Ｄ−４に代えて行った。同様に、第２図は、８／２５／７−Ｄ−４ により認識される非定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸エピトープが、対 照関節に比べて変形性関節症を起こした軟骨のプロテオグリカンにおいて、より 強く発現したことを示している。

平行した基線の免疫プロッティングの定量的評価によれば、変形性関節症軟骨の プロテオグリカンにおいては、平均して、対照に対して４４％の増加が示された （第２表参照）。

（以下余白） 菓２表 実験的イヌ変形性関節症のプロテオグリカン中の８／２５／７−Ｄ−４エピトー プについての、７４　大腿骨　４２８ 脛骨　３４８　３２７ 膝蓋骨　２０４ ７５　大腿骨　３４８ 脛骨　３５９　３０５ 膝蓋骨　２０８ ７７　大腿骨　４７５ 脛骨　１１１５　６８８ 膝蓋骨　４７４ 実施例４ 変形性関節症ヒト関節軟骨中の 非定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖の検出底々は、関節置換で除去さ れた変形性関節症大腿骨頭１６個（６５〜８５才）および正常大腿骨頭または大 Ｂ穎サンプル１５個（０〜８０才）からヒト軟骨サンプルを入手し、デンジトメ トリックスキ丁ンを用いるところを除くと実施例１にホした方法と同じ方法を用 いて、モノクローナル抗体５／６／３−８−３により、非定型コンドロイチン硫 酸／デルマタン硫酸鎮の存在を比較した。我々は、変形性関節症サンプルのプロ テオグリカンの免疫プロット１６例中１１例において（第３図ａおよび第３図ｂ ）、さらに正常サンプル１５例中３例において（第４図ａおよびｖ４図ｂ）　、 ５／６／３−８−３により認識される非定型フンドロイチン硫酸／デルマタン硫 酸が陽性であることを見出した。後者の場合、我々は、これら３例の「正常」サ ンプル中２例が、変形性関節症損傷部位に隣接したみかけ上正常な軟骨から採取 したものであるために陽性であったと考えられている。この軟骨は、変形性関節 症の指標である非定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎮が含まれていると 予想される。我々は、非定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎮が、すべて の他の正常なサンプルにおいても低濃度存在することを見いだした。

本発明の範囲は、ここに実施例として示した特殊な実施態様よりも、以下に示す 特許請求の範囲により定義するものとする。

（以下余白） Ｆ／θ１ １ｉｌ　ｍｍ ＦＩＧ、２ Ｆｌθ３σ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１０国際出願番号 ＰＣＴ／υ５８９１０４７５２ ２、発明の名称 変形性関節症の初期段階の診断、モニタリングならびに治療の方法２よび組成物 ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　ノース　キャロライナ　２７５１４チヤペル　ヒル、グ レイ　ブラフ　トレイル　１４６４氏名　力ダーリン、ブルース　（ほか１名） ４、代理人 住所　〒５４０大阪府大阪市中央区域見−下目２番２７号５、補正書の提出年月 日 １９９１年２月１５日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 第２表 実験的イヌ変形性関節症のプロテオグリカン中の８／２５／７−Ω−４エビドー グについての、デンジトメトリックスキャン（第２図）による分析７４　大腿骨 　４２８ 脛骨　３４８　３２７ 膝蓋骨　２０４ ７５　大腿骨　３４８ 脛骨　３５９　３０５ 膝蓋骨　２０８ ７７　大腿骨　４７５ 脛骨　１１１５　６８８ 膝蓋骨　４７４ 実施例４ 変形性関節症ヒト関節軟骨中の 非定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖の検出我々は、関節置換で除去さ れた変形性関節症大腿骨頭１６個（６５〜８５才）および正常大腿骨頭または大 腿類サンプル１５個（０〜８０才）からヒト軟骨サンプルを入手し、デンジトメ トリックスキャンを用いるところを除くと実施例１に示した方法と同じ方法を用 いて、モノクローナル抗体５／６／３−８−３により、非定型コンドロイチン硫 酸／デルマタン硫酸鎖の存在を比較した。我々は、変形性関節症サンプルのプロ テオグリカンの免疫プロット１６例中１１例において（第４図ａおよび第４ＥＮ ｂ）　、さらに正常サンプル１５例中３例において（第３図ａおよび第３図ｂ） 　、５／６／３−Ｂ−３により認識される非定型コンドロイチン硫酸／デルマタ ン硫酸が陽性であることを見出した。後者の場合、我々は、これら３例の「正常 Ｊサンプル中２例が、変形性関節症損傷部位に隣接したみかけ上正常な軟骨から 採取したものであるために陽性であったと考えられている。この軟骨は、変形性 関節症の指標である算定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎮が含まれてい ると予想される。我々は、算定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎮が、す べての他の正常なサンプルにおいても低濃度存在することを見いだした。

用ａｔｅ喜親牛

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生体組織および体液中の非定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸グリコ サミノグリカン鎖の量の増加を検出する工程を含む、哺乳類の変形性関節症の初 期診断法であって；該非定型鎖が、モノクローナル抗体によって特異的に認識さ れるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖であり；該モノクローナル抗体が、 変形性関節症を発症した哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカンに対 してモノクローナル抗体を生じさせること、および以下の（１）、（２）ならび に（３）の抗体に対してスクリーニングすることのプロセスにより選択可能であ る：（１）変形性関節症発症哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカン を選択的に認識し、（２）変形性関節症非発症哺乳類から採取した軟骨中出物の プロテオグリカンを認識しないか、あるいはスクリーニング（１）よりも有意に 低い程度に認識し、かつ（３）変形性関節症発症哺乳類から採取した軟骨抽出物 のプロテオグリカンであり、酵素または化学的処理によりコンドロイチン硫酸／ デルマタン硫酸鎖を完全に取り除いたものを認識しない； 診断法。 ２．前記哺乳類が、ヒト、イヌ、モルモットからなる群から選択され、そして、 前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３および該モ ノクローナル抗体と免疫学的に交叉反応するモノクローナル抗体からなる群から 選択される、請求項１に記載の診断法。 ３．前記哺乳類が、ヒト、イヌ、モルモットからなる群から選択され、そして、 前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体８／２５／７−Ｄ−４および該 モノクローナル抗体と免疫学的に交叉反応するモノクローナル抗体からなる群か ら選択ざれる、請求項１に記載の診断法。 ４．変形性関節症発症哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカンに対し てモノクローナル抗体を生じさせること、および以下の（１）、（２）ならびに （３）の抗体に対してスクリーニングすることのプロセスにより選択可能である モノクローナル抗体であって：（１）変形性関節症発症哺乳類から採取した軟骨 抽出物のプロテオグリカンを選択的に認識し、（２）変形性関節症発症哺乳類か ら採取した軟骨抽出物のプロテオグリカンを認識しないか、あるいはスクリーニ ング（１）よりも有意に低い程度に認識し、かつ（３）変形性関節症発症哺乳類 から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカンであり、酵素または化学的処理によ りコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖を完全に取り除いたものを認識しない ； モノクローナル抗体５／５／３−Ｂ−３を除くモノクローナル抗体。 ５．前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体８／２５／７−Ｄ−４およ び該抗体と免疫学的に交叉反応するモノクローナル抗体からなる群から選択され る請求項４に記載のモノクローナル抗体。 ６．変形性関節症の治療に有用な薬剤の治療上有効な量を哺乳類に投与する工程 を含む、変形性関節症の治療法であって； 該薬剤がモノクローナル抗体に結合されていて、該モノクローナル抗体が、変形 性関節症発症哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカンに対してモノク ローナル抗体を生じさせること、および以下の（１）、（２）および（３）の抗 体に対してスクリーニングすることのプロセスにより選択可能である（１）変形 性関節症発症哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカンを選択的に認識 し、（２）変形性関節症非発症哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリカ ンを認識しないか、あるいはスクリーニング（１）よりも有意に低い程度に認識 し、かつ（３）変形性関節症発症哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオグリ カンであり、酵素または化学的処理によりコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸 を完全に取り除いたものを認識しない； 治療法。 ７．前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３、８／ ２５／７−Ｄ−４、および該抗体と免疫学的に交叉反応するモノクローナル抗体 からなる群から選択される、請求項６に記載の治療法。 ８．哺乳類の変形性関節症を検出し、モニタリングする検出キットであって； 該キットが少なくとも１つのモノクローナル抗体によって特徴づけられ；該モノ クローナル抗体が、変形性関節症発症哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオ グリカンに対してモノクローナル抗体を生じさせること；および以下の（１）、 （２）および（３）の抗体に対してスクリーニングすることのプロセスにより選 択可能である：（１）変形性関節症発症哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテ オグリカンを選択的に認識し、（２）変形性関節症非発症補乳類から採取した軟 骨抽出物のプロテオグリカンを認識しないか、あるいはスクリーニング（１）よ り有意に低い程度に認識し、かつ（３）変形性関節症発症哺乳類から採取した軟 骨抽出物のプロテオグリカンであり、酵素または化学的処理によりコンドロイチ ン硫酸／デルマタン硫酸を完全に取り除いたものを認識しない；検出キット。 ９．前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３、モノ クローナル抗体８／２５／７−Ｄ−４および該抗体と免疫学的に交叉反応するモ ノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項８に記載の検出キット。 １０．生体組織および体液中の非定型コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸グリ コサミノグリカン鎖の存在および相対的な量を追跡する工程を含む、変形性関節 症の進行およびそれに対する治療作用または経過モニタリングする方法であって ；該非定型鎖が、モノクローナル抗体によって特異的に認識され、該モノクロー ナル抗体が、変形性関節症を発症した哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテオ グリカンに対してモノクローナル抗体を生じさせること、および以下の（１）、 （２）および（３）の抗体に対してスクリーニングすることのプロセスにより選 択可能である：（１）変形性関節症発症哺乳類から採取した軟骨抽出物のプロテ オグリカンを選択的に認識し、（２）変形性関節症非発症哺乳類から採取した軟 骨抽出物のプロテオグリカンを認識しないか、あるいはスクリーニング（１）よ りも有意に低い程度に認識し、（３）変形性関節症発症哺乳類から採取した軟骨 抽出物のプロテオグリカンであり、酵素または化学的処理によりコンドロイチン 硫酸／デルマタン硫酸鎖を完全に取り除いたものを認識しない； モニタリング方法。 １１．前記哺乳類が、ヒト、イヌ、モルモットからなる群から選択され、そして 、前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体５／６／３−Ｂ−３および該 抗体と免疫学的に交叉反応するモノクローナル抗体からなる群から選択される請 求項１０に記載のモニタリング方法。 １２．前記哺乳類が、ヒト、イヌ、モルモットからなる群から選択され、そして 、前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体８／２５／７−Ｄ−４および 該抗体と免疫学的に交叉反応するモノクローナル抗体からなる群から選択きれる 請求項１０に記載のモニタリング方法。