DE69821246T2

DE69821246T2 - Testverfahren für collagenpeptid

Info

Publication number: DE69821246T2
Application number: DE69821246T
Authority: DE
Inventors: M. Steven KRANE; H. Michael BYRNE; J. Hsin-Shan JU; D. Scott LEIGH
Original assignee: General Hospital Corp; Metra Biosystems Inc
Current assignee: General Hospital Corp; Metra Biosystems Inc
Priority date: 1997-07-31
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2018-08-01
Also published as: WO1999006840A1; DE69821246D1; EP1010007B1; ATE258310T1; AU8688898A; CA2297555A1; US5972623A; AU752227B2; ES2214722T3; EP1010007A1; JP2001512143A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung bestimmter Kollagenfragmente in biologischen Flüssigkeiten. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung des Spiegels des Kollagenabbaus bei Säugerindividuen, insbesondere bei Menschen, sowie die Diagnose und Überwachung von medizinischen Zuständen, die mit abnormalem Kollagenstoffwechsel assoziiert sind.
Literatur
Alberts, B., et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL. 2. Ausg., Garland Publishing, Inc., New York, NY, S. 808–815 (1959).
Baylink, PCT-Veröffentlichung WO 94/14844 (1994).
Bergman, R., et al., Anal. Chem 35: 1961 (1963).
Campbell, A., MONOCLONAL ANTIBODY AND IMMUNOSENSOR TECHNOLOGY. Elsevier (1991).
Cerelli, M. J., et al., PCT-Veröffentlichung WO 94/03814 (1994).
Eyre, D., METH. ENZYMOL. 144: 115 (1987).
Eyre, D., PCT-Veröffentlichung WO 89/04491. (1989).
Gosling, J, Clin. Chem. 36: 1408 (1990).
Harlow, E., et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, NY (1988).
Krane, S. M., et al., Science 157: 713 (1967).
Krane, S. M., et al., J. Clin Invest. 49: 716 (1970)
Kung, V. T., et al., PCT-Veröffentlichung WO 94/14072 (1994).
Miller, E., and Rhodes, R., "Preparation and Characterization of Invertebrate Callagens" in Methods Enzymol. 82: 1 Teil A, S. 33–64 (1982).
Risteli, J., EP-Patent-Veröff. 505210 A2 (1942).
Robins, S. P., PCT-Veröffentlichung WO 91/10141 (1991).
Segel, I., BIOCHEMICAL CALCULATIONS, John Wiley and Sons, Media, PA (1976).
Taylor, A. K., et al., Rheum Dis Clin. North Am. 20: 589 (1994)
van der Rest, M., et al., EUR. J. BIOCHEM. 125: 491 (1982).
Wong, S. S., CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING, CRC Press, Boca Raton, Florida (1991).
Hintergrund der Erfindung
Es gibt zahlreiche Krankheitszustände bei Menschen, die durch einen hohen Knochenresorptionsspiegel und/oder ein abnormales Gleichgewicht zwischen der Knochenbildung und Knochenresorption charakterisiert sind. Zu denjenigen, die stärker verbreitet sind, gehören Osteoporose, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis und Erkrankungen, die mit dem Fortschreiten benigner und maligner Knochentumoren sowie metastatischen Krebszellen zusammenhängen, die in die Knochenzellen von irgendeiner anderen Stelle im Körper gewandert sind, z. B. Prostata- oder Brusttumore im Anfangsstadium. Andere Erkrankungen, die mit Änderungen im Kollagenstoffwechsel assoziiert sind, schließen osteomalaziale Erkrankungen, Rachi tis, abnormales Wachstum bei Kindern, renale Osteodystrophie und Arzneistoff-induzierte Osteopenie ein. Ferner sind Abnormitäten im Knochenstoffwechsel häufig Nebenwirkungen der Schilddrüsenbehandlung und Schilddrüsenerkrankungen an sich, wie primärer Hyperparathyroidismus und Thyrotoxikose sowie das Cushing-Syndrom.
Die organische Matrix des Knochens besteht aus etwa 90% Typ I-Kollagen, das zwei α1- und eine α2-Kette enthält, die umeinander gewunden sind, so dass eine Dreifachhelix erzeugt wird. Vor der helikalen Domäne jeder Kette befindet sich ein kurzes N-Telopeptid, auf das ein kurzes C-Telopeptid folgt. Die biosynthetischen Wege, die zur Bildung und Reifung von Typ I-Kollagen führen, wurden beschrieben (z. B. Alberts et al., 1989; Eyre, 1987). Die Kollagenketten werden anfangs als Prokollagenketten synthetisiert, die assoziieren, so dass trimere dreifachhelikale Komplexe erzeugt werden. Nach der Sekretion in den extrazellulären Raum werden die trimeren Moleküle gespalten, um die Propeptide aus den N- und C-Termini freizusetzen, so dass Kollagenmoleküle (auch als Tropokollagen bekannt) erzeugt werden. Die Kollagenmoleküle assoziieren, so dass stäbchenförmige Fibrillen erzeugt werden, in denen die Moleküle in parallelen, gestapelten Anordnungen gepackt sind. Die Bildung verschiedener intra- und intermolekularer Quervernetzungen innerhalb und zwischen benachbarten Kollagenmolekülen verleiht erhöhte Stabilität.
Bei Säugern versteht man die Bildung und Erhaltung der Knochenkollagengewebe als dynamischen Prozess, der durch die knochenbildenden Zellen (Osteoblasten) und knochenabbauenden Zellen (Osteoclasten) vermittelt wird. Ein Ungleichgewicht zwischen den Raten der Knochenbildung und des Knochenabbaus und insbesondere die Erhöhung des Knochenabbaus können zu schwerwiegenden pathologischen Zuständen führen, die gesundheitsschädigend sind.
Während der letzten Jahrzehnte wurden verschiedene Verfahren zur Diagnose und Überwachung von Abnormitäten des Knochenkollagenabbaus vorgeschlagen. Beispielsweise wurde vor vielen Jahren Hydroxyprolin, ein Hauptbestandteil der Kollagenpolypeptide als möglicher Marker im Urin vorgeschlagen. Es gibt jedoch bei der Verwendung der Messung von Hydroxyprolin als Marker mehrere Nachteile, die beinhalten, dass ein langwieriger Säure-Hydrolyse-Schritt erforderlich ist, dass es einen Mangel an Spezifität für Typ I-Kollagen (aus dem Knochen) und den beträchtlichen Stoffwechsel des freien Hydroxyprolins in der Leber gibt. Kurz gesagt, wurde Hydroxyprolin als klinischer Marker für Knochenresorptionserkrankungen abgelehnt.
Hydroxylysin und bestimmte glycosylierte Formen davon wurden vorgeschlagen, aber die Verwendung dieser Marker war aufgrund des Mangels an einem praktischen, für die allgemeine klinische Verwendung geeigneten Testverfahrens sowie aufgrund des Bedarfs an einem Säurehydrolyse-Vorbehandlungsschritt wie bei Hydroxyprolin begrenzt.
Bestimmte Endfragmente von Kollagen wurden ebenfalls nach möglichen diagnostischen Anwendungen untersucht. Vor der vorliegenden Erfindung der Anmelder glaubte man im Fachgebiet allgemein, dass von den helikalen Kollagenbereichen stammende Peptide aufgrund der beträchtlichen Abbaus, der durch endogene Proteasen im extrazellulären Raum, im Blutkreislauf und im Urin verursacht wird, nicht als Indikatoren der Knochenresorption verwendet werden könnten. Folglich konzentrierte sich der Fachmann darauf, die Fragmente der Telopeptidbereiche von Kollagen zu messen, die Quervernetzungsarten wie Pyridinolin-Quervernetzungen enthalten, die vermutlich assoziierte Kollagenkettenbereiche vor dem proteolytischen Abbau schützen (z. B. Risteli, 1992 und US 5538853 ). Verfahren zur Messung derartiger Telopeptidfragmente wurden beispielsweise in WO 89/04491 (Eyre), WO 95/08115 (Qvist) und WO 94/14844 (Baylink) beschrieben. Es wurden auch Verfahren zur Messung der Telopeptid-Quervernetzungen selbst ohne gebundene Kollagenketten beschrieben (vgl. Robins, WO 91/10141; Cerelli et al., WO 94/03814 und Kung et al., WO 94/14072).
Es wurde berichtet, dass Telopeptidfragmente in Verbindung mit Knochenresorptionserkrankungen nützlich sind. Jedoch wurde berichtet, dass die Prokollagen-Peptidarten zur Messung der Knochenbildung nützlich sind (z. B. Taylor, 1994), ein Vorgang, der bei den meisten mit der Resorption im Zusammenhang stehenden Erkrankungen irrelevant ist. EP 0 401 370 offenbart einen Enzymimmuntest zur Bestimmung der zentralen Dreifachhelixeinheit des menschlichen Typ-IV-Kollagens zur Diagnose von Lebererkrankungen.
Folglich besteht weiterhin ein Bedarf, neue Marker zu entwickeln, die für die Diagnose und Überwachung abnormaler Knochenresorptionszustände nützlich sind. Idealerweise sollten derartige Marker in biologischen Flüssigkeiten wie Urin und Serum praktischerweise durch einen Immuntest messbar sein. Der Marker sollte bei der Diagnose nützlich sein, dass Knochenresorptionsstörungen vorliegen, die durch über dem Normalspiegel liegenden Spiegel des Knochenabbaus charakterisiert werden. Zusätzlich sollte der Marker zum Nachweis von Änderungen beim Status des Knochabbaus des Individuums im Laufe der Zeit nützlich sein, insbesondere als Reaktion auf therapeutische Behandlung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung eines Immuntestverfahrens durch den Anmelder zur Messung von Peptidfragmenten, die bestimmte Bereiche aus der helikalen Domäne der α1(I)-Ketten von Typ I-Kollagen in einer Körperflüssigkeit enthalten, das zur Bestimmung oder Überwachung des Knochenkollagenspiegelabbaus in einem Säugerindividuum besonders nützlich ist.
Die vorliegende Erfindung schließt in einem Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung des Spiegels von Typ I-Kollagenfragmenten in einer flüssigen Probe ein. In dem Verfahren wird die Probenflüssigkeit mit einem Antikörper, der für ein Epitop immunspezifisch ist, das in einem der folgenden Peptidsequenzen enthalten ist: (1) Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1) oder (2) Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NR: 2)unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die bewirken, dass ein Komplex zwischen den Antikörper- und den Polypeptidfragmenten in der Probe erzeugt wird, die das Epitop enthalten. Der Spiegel des gebildeten Komplexes wird bestimmt und daraus wird der Spiegel der Polypeptidfragmente bestimmt, die das Epitop enthalten. Der in dem Verfahren verwendete Antikörper kann polyclonal oder monoclonal sein und ist vorzugsweise monoclonal. Die Probe, die getestet wird, ist vorzugsweise Urin oder Blut, obwohl andere Flüssigkeitsproben ebenfalls in Erwägung gezogen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um den Spiegel des Knochenkollagenabbaus bei einem Säugerindividuum, insbesondere bei Menschen, zu beurteilen. Somit schließt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Spiegels des Knochenkollagenabbaus bei einem Säugerindividuum ein. In dem Verfahren wird eine Körperflüssigkeitsprobe von dem Individuum mit einem Antikörper, der für ein Epitop immunspezifisch ist, das in einem der vorstehend angegebenen Polypeptidsequenzen enthalten ist, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die bewirken, dass ein Komplex zwischen den Antikörper- und den Polypeptidfragmenten in der Probe erzeugt wird, die das Epitop enthalten. Aus dem Spiegel des gebildeten Komplexes wird der Spiegel der Polypeptidfragmente in der Probe bestimmt, die das Epitop enthalten. Ein gemessener Fragmentspie gel, der relativ zum Normalspiegel erhöht ist, ist eine Indikation dafür, dass das Individuum an einer Knochenresorptionsstörung leidet.
Das Verfahren ist bei der Durchmusterung nützlich, ob durch einen erhöhten Knochenkollagenresorptionsspiegel charakterisierte Knochenerkrankungen vorliegen. In einer Reihe der Ausführungsformen kann das Verfahren verwendet werden, um zu durchmustern, ob eine Knochenerkrankungen vorliegt, ausgewählt aus einer oder mehreren Erkrankungen aus der Gruppe, bestehend aus Osteoporose, Osteoarthritis, Hyperparathyroidismus, rheumatoider Arthritis, Paget-Krankheit oder einer metastatischen Knochenkrebserkrankung.
In einer weiteren allgemeinen Ausführungsform kann das Verfahren verwendet werden, um die Knochenresorption im Laufe der Zeit, insbesondere als Reaktion auf eine therapeutische Behandlung zu überwachen.
In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung einen Antikörper ein, der mit einem der vorstehend definierten antigenen Peptide immunreagiert.
Die Erfindung schließt auch einen Kit zur Messung des Spiegels von Typ I-Kollagenfragmenten in einer flüssigen Probe ein. Der Kit schließt einen Antikörper der Art, wie vorstehend beschrieben, und vorzugsweise auch einen immunogenen Standard ein, der das Peptid enthält, für das der Antikörper immunspezifisch ist. Typischerweise schließt der Kit Anweisungen und andere Reagenzien ein, die für eine erfolgreiche Durchführung des Tests notwendig sind.
Vorzugsweise schließen die in dem Verfahren oder in dem Kit verwendeten Nachweismittel ein Reporterenzym ein, das wirksam ist, um ein colorimetrisches Signal zu produzieren, obwohl andere Formate verwendet werden können.
In einer allgemeinen Ausführungsform schließt der Kit einen Festphasen-Träger ein, an den die Antikörper zum Einfangen der in der Probe nachzuweisenden Kollagenfragmente gebunden sind. In einer zweiten Ausführungsform wird ein Peptid oder ein Polypeptid, das das nachzuweisende Epitop enthält, direkt oder indirekt an einen Festphasen-Träger gebunden, um mit den in der Probe nachzuweisenden Kollagenfragmenten zu konkurrieren.
Ein Verfahren zur Herstellung monoclonaler Antikörper, die in dem vorstehenden Verfahren und Kit nützlich sind, schließt die Bildung eines Hybridoms, das aus dem Fusionsprodukt von (a) Milzzellen aus einem Tier, das mit einem das ausgewählte Epitop enthaltenden Peptid immunisiert wurde, das wie vorstehend definiert ist und vorzugsweise an eine Trägersubstanz gebunden wurde und (b) einem immortalisierenden Fusionspartner besteht, sowie die Auswahl von mit dem gewählten Epitop immunspezifischen Hybridomen ein.
Polyclonale Antikörper, die in dem vorstehenden Verfahren und Kit nützlich sind, werden hergestellt, indem ein Tier mit einem Immunogen, wie hier beschrieben, immunisiert wird, ein Antiserum gesammelt wird, das als Folge der Immunisierung hergestellt wird, und Antikörper ausgewählt werden, die eine durchschnittliche Bindungsaffinität von mindestens 10⁷/molar für ein Epitop besitzen, wie hier beschrieben.
Ein Immunogen zur Verwendung der Herstellung eines Antikörperreagenzes, wie vorstehend beschrieben, besteht im Wesentlichen aus einer der vorstehend erwähnten Peptidsequenzen oder einer kürzeren, an einen geeigneten Träger gekoppelten Sequenz. Ein bevorzugter Träger ist KLH ("keyhole limpet hemocyanin").
In einem Verfahren zur Beurteilung der Auswirkung einer gewählten Substanz wie einem Arzneistoff auf das Expressionsniveau oder die Sekretion von Typ I-Kollagen und/oder Fragmenten davon durch eine Zell- oder Gewebepräparation wird eine gewählte Zelle oder ein gewähltes Gewebe einer Substanz ausgesetzt, nachdem ein flüssiger Kulturüberstand oder ein Extrakt der Zelle oder des Gewebes mit einem Antikörper, der für ein Epitop spezifisch ist, wie vorstehend beschrieben, unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die bewirken, dass ein Komplex zwischen den Antikörper- und den Polypeptidfragmenten in der Probe erzeugt wird, die das Epitop enthalten. Anhand der gebildeten Menge an Komplex wird der Spiegel der das Epitop enthaltenden Polypeptide bestimmt, so dass ein Anstieg beim gemessenen Spiegel relativ zu dem beobachteten Spiegel ohne Exposition gegenüber den Substanzen anzeigt, dass die Substanz die Produktion derartiger Polypeptide verstärkt, und eine Erniedrigung anzeigt, dass die Substanz die Produktion derartiger Polypeptide verringert. Das Verfahren ist beispielsweise nützlich, um Substanzen zu identifizieren und/oder zu charakterisieren, die die osteoclastischen (resorptiven) Aktivitäten in den Kollagen enthaltenden Zellen und Geweben erniedrigen.
Der vorstehend beschriebene Immuntest kann in einem Verfahren zur Beurteilung der Wirkung einer ausgewählten Substanz wie ein Arzneistoff auf die Helicopeptidspiegel in einer Körperflüssigkeit eines Tiermodells wie Ratten, Mäuse, Katzen, Hunde, Affen etc. verwendet werden. Das Verfahren ist beispielsweise nützlich, um Substanzen und Therapien zu identifizieren und/oder zu charakterisieren, die den Knochenresorptionsspiegel erniedrigen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die erste chromatographische Trennung der Hydroxyprolin (Hyp) enthaltenden Fraktionen aus dem Urin von Patienten mit der Paget-Krankheit;
2 zeigt eine chromatofokussierende Trennung von vereinigten Hyp-Fraktionen aus der vorhergehenden chromatographischen Trennung;
3 zeigt die Ergebnisse der letzten auf HPLC basierenden Trennung von vereinigten Hyp-Fraktionen mit einem pI-Wert von ~6,2, was die Isolierung von Kollagen-Helicopeptid (I) zeigt (Beispiel 2).
4 zeigt eine Standardkurve für einen Immuntest der vorliegenden Erfindung und
5 zeigt die Urinspiegel eines Typ-I-Kollagen-Helicopeptids, wie er unter Verwendung eines Immuntests nach der vorliegenden Erfindung bei normalen, osteoporotischen Individuen, Individuen mit der Paget-Krankheit und postmenopausalen Individuen gemessen wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Die nachstehenden Begriffe und Formulierungen haben, wenn nicht anders angeben, folgende Bedeutungen.
„Blutprobe" soll Blut in jeder für die Analyse geeigneten Form wie Serum oder Plasma umfassen, das durch Standardverfahren hergestellt wurde.
„Biologische Flüssigkeit", wie hier verwendet, umfasst jede biologische Flüssigkeit, die gemeinhin in klinischen Proben, einschließlich Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel und Schweiß, sowie in Extrakten und Überständen von Zellen und/oder Geweben getestet wird.
„Polypeptid" bedeutet ein Polymer mit mindestens zwei aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, das mindestens eine Peptidbindung enthält.
„Peptid" bedeutet ein Polypeptid mit 50 oder weniger aufeinanderfolgenden Aminosäureresten.
Der Begriff „Antikörper" schließt monoclonale und polyclonale Antikörper sowie Fragmente davon ein. Bei der Verwendung im Zusammenhang mit einem Verfahren zur Messung oder Bestimmung von Kollagenfragmenten soll „Antikörper" generell jeden Analyt-spezifischen Bindungspartner umfassen, egal wie er hergestellt wird.
Der Begriff „Epitop" bezieht sich auf eine minimale Aminosäuresequenz in einem Polypeptid, die von einem Antikörper erkannt wird, der ein derartiges Epitop in einem Polypeptid bindet, und somit die Immunspezifität eines Antikörpers bestimmt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein Epitop so kurz wie drei nebeneinander liegende Aminosäurereste sein und noch typischer vier oder mehr nebeneinander liegende Reste einschließen. Die tatsächliche Länge des Epitops, für das ein Antikörper spezifisch ist, kann empirisch durch Durchführung von Bindungsstudien mit Peptiden bestimmt werden, die verschiedene Kandidatenepitope enthalten, die von nicht Epitopresten begrenzt werden.
„Säuger" soll seine Standardbedeutung haben, einschließlich beispielsweise Mäuse, Kaninchen, Schafe, Hunde, Katzen, Pferde und Menschen.
II. Herstellung von Antikörpern
A. Immunogen
Das zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antikörpers verwendete Immunogen schließt vorzugsweise eine Peptidsequenz ein, die SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2, wie sie vorstehend identifiziert sind, oder einer kürzeren davon ausgewählten Sequenz entspricht, die kovalent an einen geeigneten Träger gekoppelt werden kann. Typischerweise enthält das Immunogen ein Epitop, das mindestens drei aufeinander folgende Reste von SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 enthält. Derartige Peptide können durch herkömmliche chemische oder rekombinante Verfahren oder aus natürlichen Quellen durch aus dem Fachgebiet bekannte oder hier beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Fragmente, die die vorstehend definierten Sequenzen enthalten, wurden von den Anmeldern aus menschlichem Urin isoliert und sequenziert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Aminosäuresequenz des als SEQ ID NR: 1 bezeichneten ersten Peptids entspricht den Resten 620–633 der Kollagen-α1(I)-Kette und wird hier als „Helicopeptid II" oder „Helicopeptid/α1(I)^620–633" bezeichnet. Die Aminosäuresequenz des zweiten Peptids SEQ ID NR: 2 entspricht den Resten 253–261 der Kollagen-α1(I)-Kette und wird hier als „Helicopeptid I" oder „Helicopeptid/α1(I)^253–261" bezeichnet. Synthetische Peptide mit dieser Sequenz wurden hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Ein Epitop enthaltendes Peptid zur Verwendung als Immunogen kann zusätzlich zum Epitop von Interesse zusätzliche Reste oder angehängte Anteile einschließen, die dazu dienen, das Peptid an den Träger zu binden. In einem bevorzugten Ansatz wird ein Cysteinrest in das Peptid an dessen N- oder C-Terminus eingebaut, um die kovalente Bindung an den Träger zu erleichtern, wie in Beispiel 2 veranschaulicht.
Der Träger für das Immunogen kann jedes Protein wie Rinderserumalbumin (BSA) oder KLH sein, das selbst eine niedrige Immunogenität besitzt und das, wenn es an ein Peptid von Interesse gebunden wird, eine immunologische Reaktion gegen das Peptid erleichtert. Alternativ können eines oder mehrere der gewählten Peptide von Interesse an ein molekulares Gerüst wie Polyamin gebunden werden, das zur Präsentation des Peptids dem Immunsystem eines Tieres geeignet ist. Eine Reihe geeigneter Trägermoleküle sind im Fachgebiet bekannt.
Die Kopplung des Peptidimmunogens an das Trägermolekül erfolgt durch Standard-Kopplungsverfahren, wobei typischerweise ein bifunktionales Kopplungsmittel verwendet wird, dessen reaktive Gruppen mit den funktionalen Gruppen auf dem Träger bzw. Peptid reagieren. Beispielsweise kann zur Kopplung eines Cystein enthaltenden Peptids an die Aminogruppen von KLH SPDP (N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat) oder Sulfo-SMCC (Sulfo-N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat) verwendet werden (Wong, 1991). Dieses Reagenz enthält eine aktivierte Estergruppe, die mit den Aminogruppen von KLH reagieren kann, so dass Amidbindungen und ein aktiviertes Disulfid erzeugt werden, die mit einer Cysteinthiolgruppe des Peptidimmunogens reagieren können, so dass ein neues Disulfid erzeugt wird. Ein anschauliches Verfahren zur Bindung eines Trägerproteins an Peptideantigene wird in Beispiel 3A bereitgestellt.
Alternativ kann das Peptidimmunogen auch nach Standardverfahren direkt an den Träger gekoppelt werden, z. B. in Gegenwart eines wasserlöslichen Carboxylgruppen aktivierenden Mittels wie EDC (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid). Allgemeine Kopplungsreaktionen zur Derivatisierung eines Trägerproteins mit einem Peptidantigen werden in Harlow, et al. (1988), S. 77–87, und in Wong (1991) aufgeführt.
B. Monoclonale Antikörper
Um ein erfindungsgemäßes monoclonales Antikörperreagenz herzustellen, wird ein wie vorstehend beschriebenes Immunogen verwendet, um ein Tier wie eine Maus zu immunisieren, von dem antigenspezifische Lymphocyten für die Immortalisierung erhalten werden können. Zahlreiche geeignete Mauslinien wurden für diesen Zweck entwickelt, einschließlich der bekannten Balb/c-Maus sowie Mauslinien, die erhöhte Immunantworten aufweisen wie die „Autoimmun"-MRL/MpJ-lpr-Maus, die vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) erhältlich ist.
Das gewählte Tier wird typischerweise unter Verwendung einer Reihe von Injektionen eines Immunogens nach den aus dem Fachgebiet bekannten Vorschriften immunisiert. Beispielsweise kann jede Immunisierung intraperitoneal mit Aliquoten von Immunogen (z. B. 100 μg) in einem geeigneten Adjuvans erfolgen (z. B. Ribi(CWS), das von RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, Montana erhältlich ist). Eine beispielhafte Immunisierungsvorschrift wird in Beispiel 4 beschrieben.
Milzzellen werden gewöhnlich etwa 8 Wochen nach der ersten Immunisierung geerntet und mit einer unsterblichen Zelllinie wie der P3X63Ag8.653-Myelom-Zelllinie fusioniert. Die Selektion auf erfolgreiche Fusionsprodukte kann in HAT in konditioniertem S-DMEM-Medium nach den veröffentlichten Verfahren durchgeführt werden (vgl. allgemein Harlow, et al., S. 196–212, 1988). Ein nützliches ergänztes Medium ist DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium, das von Gibco, NY erhältlich ist), ergänzt nach der Formulierung: DMEM (80%), NCTC-109 (10%), Rinder-FetalClone-Serum (10%), Oxalessigsäure, (1 mM), L-Glutamin (2 mM), Gentamicin (50 μg/ml) und Insulin (10 μg/ml).
Konditioniertes, ergänztes DMEM („konditioniertes S-DMEM") kann durch Züchtung der IL-1 sekretierenden Mausmonocyten-Zellline P388D1 oder austauschbar der Zelllinie J774A.1 in S-DMEM hergestellt werden, wobei zweimal in der Woche eine 1 : 4-Aufteilung erfolgt. Alle 3 Tage werden die Gewebekulturüberstände durch einen 0,2 Micron-Filter gefiltert und dann mit 4 mM L-Glutamin ergänzt. Das sich ergebende konzentrierte, konditionierte S-DMEM kann dann als Ergänzung für nicht konditioniertes S-DMEM (z. B. nicht konditioniertes S-DMEM wird zu 20 Vol.-% mit P388D1 konditioniertem Medium oder zu 10% mit J774A.1 konditioniertem Medium ergänzt) verwendet werden, um Hybridomzellen zu züchten. Als Nährzellen dienende Milzzellen können auch dem S-DMEM zugegeben werden, um das Wachstum der Hybridomzellen zu unterstützen.
Erfolgreiche Fusionsprodukte werden dann nach Immunreaktivität mit dem Immunogen durchmustert, indem typischerweise ein kompetitives Immuntestformat verwendet wird. Zelllinien, die eine hohe Affinitätsbindung zum Immunogen zeigen, werden durch limitierende Verdünnung subcloniert und werden nach der Produktion von Antikörpern mit hoher Bindungsaffinität für das Epitop von Interesse weiter durchmustert.
Um das Antikörperreagenz herzustellen, wird die Hybridom-Zelllinie in einem geeigneten Medium (Harlow, et al., S. 247-270, 1988) wie Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) gezüchtet, das, wie in den Beispielen beschrieben, ergänzt wurde. Monoclonale Antikörper („Mak") werden aus dem Medium geerntet und können nach den veröffentlichten Verfahren konzentriert und gelagert werden (Harlow, et al., S. 271–318, 1988).
Durchmusterungsexperimente, die als Unterstützung der Erfindung durchgeführt wurden (Beispiel 4), führten zur Identifizierung eines hohen Prozentsatzes erfolgreicher Fusionsprodukte für die KLH-Immunogene (3) und (4), wobei das Immunogen (3) die vorstehende Helicopeptid-I-Sequenz enthält und das Immunogen (4) die Helicopeptid-II-Sequenz enthält. Nach der Identifizierung der Antikörper produzierenden Hybridomclone wurde ein kompetitiver reverser ELISA verwendet, um die Clone zu wählen, die sowohl eine hohe Sensitivität als auch Spezifität gegenüber dem Immunogen zeigen. Basierend auf diesem Selektionsvorgang wurde Clon 10B1, der monoclonale Antikörper produziert, die spezifisch für SEQ ID NO: 1 sind, für die weitere Veranschaulichung der Erfindung ausgewählt.
C. Polyclonale Antikörper
Die polyclonale Antikörperherstellung erfolgt durch herkömmliche Verfahren, einschließlich der Injektion eines Immunogens in geeignete Säugerindividuen wie Kaninchen, Mäuse, Ratten oder Schafe nach den allgemein im Fachgebiet bekannten immunologischen Vorschriften, z. B. Harlow, et al., S. 93–115 (1988). Typischerweise injiziert man Kaninchen das Immunogen in einem Adjuvans subkutan und Booster-Immunisierungen erfolgen alle 2–3 Wochen durch subkutane oder intramuskuläre Injektionen; Mäuse können intraperitoneale Injektionen nach einem ähnlichen Zeitplan erhalten. Das Blut wird in Intervallen gesammelt, z. B. 1–2 Wochen nach jeder Immunisierungsinjektion. Antiseren können titriert werden, um die Antikörperbildung in Bezug auf das Peptidimmunogen nach einem Standard-ELISA oder Immunpräzipitationsverfahren zu bestimmen (Harlow, et al., S. 423–470, 1988). In Beispiel 5 wird ein Verfahren beschrieben, das verwendet wird, um polyclonale Antikörper gegen Helicopeptid I zu produzieren.
D. Bindungsaffinität
Die Bindungsaffinität der Antikörper für das Peptidimmunogen, sei es, dass die Antikörper monoclonal oder polyclonal sind, können durch bekannte Verfahren, z. B. durch Scat chard-Analyse unter Verwendung einer Immunpräzipitation oder eines ELISA-Tests (z. B. Campbell, 1991; Segel, 1976), bestimmt werden.
Im Falle der polyclonalen Antikörper repräsentiert die gemessene Affinität gewöhnlich eine durchschnittliche Bindungsaffinitätskonstante für ein Antikörpergemisch, das in Antiseren vorliegt, die für das gewählte Immunogen spezifisch sind. Deshalb können polyclonale Antikörper durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von gebundenem Antigen durch aus dem Fachgebiet bekannte Verfahren weiter gereinigt werden, um Antikörper mit hoher Spezifität und Affinität für das Immunogen anzureichern.
Wie vorstehend angemerkt, wird der erfindungsgemäße Antikörper im Allgemeinen so ausgewählt, dass er für ein Epitop immunspezifisch ist, das im vorstehenden Helicopeptid I oder II enthalten ist. Vorzugsweise wird der Antikörper durch eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften charakterisiert, einschließlich jeder möglichen Permutation davon.
Vorzugsweise besitzt der Antikörper eine Bindungsaffinitätskonstante für das Immunogen von etwa 1 × 10⁷/molar oder höher, vorzugsweise etwa 1 × 10⁸/molar und stärker bevorzugt mindestens 1 × 10⁹/molar. Beispielsweise beträgt die Bindungsaffinitätskonstante des monoclonalen Antikörpers 10B1 für das Helicopeptid I etwa 1 × 10⁸/M (Beispiel 4C).
Vorzugsweise gibt es keine signifikante Kreuzreaktion des endungsgemäßen Antikörpers mit intaktem (dreifachhelikalem) Kollagen, insbesondere den Kollagentypen I bis V. Die relative Kreuzreaktivität des Antikörpers für jede dieser Kollagenarten kann durch Standardverfahren, wie vorstehend angemerkt, bestimmt werden, indem durch bekannte Verfahren hergestellte Kollagene (z. B. Miller & Rhodes, 1982) oder Kollagene von kommerziellen Quellen verwendet werden (z. B. Sigma Chem. Co. oder Heyl GmbH & Co., Berlin, Deutschland). Beispielsweise bindet der monoclonale Antikörper 10B1 stark das Helicopeptid I in der einzelsträngigen Form, aber es erfolgt keine Kreuzreaktion mit intaktem Kollagen von irgendeinem der Typen I bis V. Offensichtlich ist der Peptidepitopbereich auf eine besondere dreidimensionale Konformation begrenzt, die von der Bindungsstelle des Antikörpers nicht erkannt wird.
Folglich ist in einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäße Antikörper spezifisch für ein Epitop im Helicopeptid I oder Helicopeptid II in Monopeptidform und reagiert nicht in beträchtlichem Maße mit den entsprechenden Epitopsequenzen in intaktem, dreifachhelikalem Kollagen (z. B. besitzt der Antikörper eine Bindungsaffinität für die Epitopsequenz in dreifachhelikalem Kollagen, die mindestens um das 10-Fache niedriger und beson ders bevorzugt um mindestens das 100-Fache niedriger ist als die Affinitätskonstante des Antikörpers für die Monopeptidform von Helicopeptid I oder II bei Verwendung der Vorschrift in Beispiel 8C).
Der Antikörper kann auch so gewählt werden, dass er eine Bindungsaffinität für die entsprechende Sequenz in der α1-Kette des Typ-II-Kollagens besitzt, die mindestens um das 10-Fache niedriger ist als die Affinität des Antikörpers für das entsprechende vorstehend identifizierte Typ-I-α1-Helicopeptid (I oder II).
Noch allgemeiner sollte der Antikörper ausreichend spezifisch für das gewählte Helicopeptid sein, um falsche Ergebnisse aufgrund der Bindung mit anderen Bestandteilen der Probe zu vermeiden. Eine ausreichende Spezifität zum Testen eines bestimmten Typs einer flüssigen Probe kann typischerweise durch Studien zur Wiederfindungsrate für zugesetztes Peptid etabliert werden, wie in den Beispielen 9 und 12 veranschaulicht.
III. Immuntestverfahren
Das erfindungsgemäße Immuntestverfahren stellt einen Weg zur Bestimmung des Spiegels von Helicopeptid I oder II in biologischen Flüssigkeiten bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren nützlich, um den Abbau von Knochenkollagen bei einem Säugerindividuum, insbesondere bei Menschen, zu messen oder zu überwachen. Das Verfahren schließt typischerweise die Schritte ein (a) Inkontaktbringen der biologischen Flüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der für ein gewähltes Peptidepitop immunspezifisch ist, wie vorstehend diskutiert, (b) durch das Inkontaktbringen Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Antikörper und den Kollagenfragmenten in der Probe, die das gewählte Epitop enthalten, (c) Messung der Menge des gebildeten Immunkomplexes und (d) durch die Messung die Bestimmung des Spiegels von immunreaktiven Kollagenfragmenten in der Probe. Der bestimmte Spiegel wird mit einem Spiegel verglichen, der für normale Individuen spezifisch ist, wobei ein über dem Normalspiegel liegender Spiegel bezeichnend für eine über dem Normalspiegel liegende Knochenresorption ist und somit anzeigt, dass das Individuum an einer Knochenresorptionsstörung leidet.
In dem Fall, in dem die getestete Probenflüssigkeit Urin ist, kann der Spiegel der gemessenen Kollagenfragmente unter Verwendung eines gemessenen Spiegels von Kreatin in oder irgendeinem Äquivalent davon durch herkömmliche Verfahren normalisiert werden. Das Sammeln des Urins kann nach den Standardsammelvorschriften wie Sammeln von 24- Stundenurin, Urin der ersten Leerung und Urin der zweiten Leerung erfolgen. Vorzugsweise wird dieselbe Weise der Probensammlung für alle Proben verwendet, um Variation bei den Ergebnissen zu verringern.
Blutproben können in Serum oder Plasma durch bekannte Verfahren überführt werden und können auf Wunsch weiteren Vorbearbeitungen unterzogen werden. Beispielsweise kann Serum durch einen Spinfilter mit einem definierten Molekulargewichtsausschluss (z. B. ≥ 20.000 MG) gegeben werden, um vor dem Test Proteine einer ausgewählten Größe aus der Probe zu entfernen.
Herkömmliche Verfahren können für jede andere Art von zu testender biologischer Flüssigkeitsprobe verwendet werden.
Die Probenstabilität kann häufig verbessert werden, indem ein oder mehrere Proteaseinhibitoren eingeschlossen werden, um den proteolytischen Abbau des Helicopeptids zu verringern. Es sind verschiedene Proteaseinhibitoren im Fachgebiet bekannt, einschließlich im Handel erhältlicher Inhibitor-„Cocktails" (z. B. von Sigma Chemical Co.), wie in den Beispielen 1 und 12 veranschaulicht.
Die Reaktion der Probe mit dem Antikörperreagenz kann unter Verwendung einer aus einer Vielfalt von im Fachgebiet bekannten Immuntestkonfigurationen, einschließlich homogener und heterogener Testformate, erfolgen. Repräsentative Testformate werden in den Beispielen 8–12 beschrieben.
Das Testformat für den Nachweis kann durch beliebige Mittel erfolgen, einschließlich Radiotracers (RIA), gekoppelter Enzyme, Absorptionsverfahren, Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder EMIT-Konfiguration (Gosling, 1990). Ein bevorzugter Reporter ist alkalische Phosphatase, die mit p-Nitrophenylphosphat-Substrat reagieren kann, so dass ein farbiges Produkt mit einem starken Absorptionspeak bei 405 nm produziert wird. Eine beispielhafte Vorschrift zur Herstellung eines alkalischen Phosphatase-Immunogen-Konjugats wird in Beispiel 3B beschrieben. Man ist sich bewusst, dass verschiedene andere Nachweisverfahren wie ein zweiter Biotin markierter Antikörper in Kombination mit einem Reporter markierten Streptavidin verwendet werden können. Ein repräsentatives Verfahren zur Herstellung eines Helicopeptidimmunogen-Streptavidin-Konjugats wird in Beispiel 3C bereitgestellt.
In einer beispielhaften Ausführungsform des Testverfahrens wird ein bekanntes Volumen, typischerweise 10–50 μl, einer Probe einem Immunogen beschichteten festen Träger, z. B. den Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte, zugegeben und auf die Probenzugabe folgt die Zugabe eines bekannten Volumens, typischerweise 50–200 μl, eines immunogenspezifischen Antikörpers mit bekannter Verdünnung. Das Gemisch auf der Oberfläche des festen Trägers wird dann inkubiert, vorzugsweise unter Bedingungen, die ein Gleichgewicht zwischen der Antikörperbindung an die Probenkollagenfragmente und dem oberflächengebundenen Immunogen bewirken (z. B. über Nacht bei 2–8°C oder bei Raumtemperatur mehrere Stunden).
Nach der Inkubation wird der feste Träger mehrmals gewaschen, um unspezifisch an den Träger gebundene Antikörper zu entfernen, und dann mit einem enzymmarkierten anti-IgG-Antikörper inkubiert, der wirksam ist, spezifisch an den trägergebundenen Antikörper zu binden. In dem Fall, in dem der immunogenspezifische Antikörper beispielsweise ein polyclonaler Kaninchenantikörper ist, kann der enzymmarkierte Antikörper ein mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG sein. Für ein monclonales Maus-Antikörperreagenz kann der enzymmarkierte Antikörper ein mit alkalischer Phosphatase derivatisiertes Ziegen-anti-Maus-IgG sein.
Nach einer kurzen Inkubationszeit wird der Träger wiederum gewaschen, um unspezifisch gebundenes Material zu entfernen, und der an den Träger gebundene Enzymspiegel wird mit der spektrophotometrischen Bestimmung von umgewandeltem Substrat durch Zugabe von Enzymsubstrat bestimmt.
Zur Kalibrierung des Tests werden einigen Vertiefungen Standards in doppelter Ausführung zugegeben, die einen Immunogenkonzentrationsbereich enthalten, um eine Standardkurve zu erzeugen. Dann werden den verbleibenden Vertiefungen bis zu 40 Proben in doppelter Ausführung zugegeben, und die Vertiefungen werden dann wie vorstehend getestet.
Noch allgemeiner ist das Testformat vorzugsweise ein kompetitives „heterogenes" Immuntestformat, bei dem der Reporterspiegel zum Nachweis des Immunkomplexes direkt entweder an das konkurrierende Immunogen oder an den immunogenspezifischen Antikörper gebunden ist.
Somit werden in einer bevorzugten Konfiguration die immunogenspezifischen Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert und das enzymmarkierte Immunogen wird zugegeben, um mit den Kollagenfragmenten in der Probe um die Bindung an die immobilisierten Antikörper zu konkurrieren. Die Enzymmarkierung kann beispielsweise alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase sein.
In einer zweiten bevorzugten Konfiguration ist das Immunogen auf einem festen Träger immobilisiert, um mit den Kollagenfragmenten in der Probe um die Bindung an die nicht immobilisierten enzymmarkierten Antikörper zu konkurrieren.
Experimente, die zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt werden, zeigen, basierend auf den hier beschriebenen Helicopeptidmarkern, sowohl bei den Urin- als auch bei den Serum-basierenden Tests (z. B. Beispiele 9 und 12) eine gute allgemeine Leistungsfähigkeit. Tests für biologische Flüssigkeiten von anderen Quellen können sofort von der hier diskutierten Methodik adaptiert werden.
II. Nützlichkeit
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Beurteilung der Spiegels der knochenresobierenden Aktivität in menschlichen Individuen bereit, das in einer Reihe von Anwendungen nützlich ist. Das Verfahren kann in einer Ausführungsform zur Durchmusterung verwendet werden, oder um nicht invasiv nachzuweisen (zu diagnostizieren), ob eine Knochenkollagenstörung vorliegt, die durch über den normalen Spiegel liegenden Spiegel der Knochenresorption charakterisiert ist. Beispielhafte Knochenerkrankungen, für die die vorliegende Erfindung nützlich sein kann, schließen Osteoporose, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis und Erkrankungen ein, die mit dem Fortschreiten benigner und maligner Knochentumoren sowie metastatischen Krebszellen zusammenhängen, die in die Knochenzellen von irgendeiner anderen Stelle im Körper gewandert sind, z. B. Prostata- oder Brusttumore im Anfangsstadium. Andere Erkrankungen schließen osteomalaziale Erkrankungen, Rachitis, anormales Wachstum bei Kindern, renale Osteodystrophie und Wirkstoff-induzierte Osteopenie ein. Ferner sind Abnormitäten im Knochenstoffwechsel häufig Nebenwirkungen einer Schilddrüsenbehandlung und von Schilddrüsenerkrankungen an sich, wie primärer Hyperparathyroidismus und Thyrotoxikose sowie das Cushing-Syndrom.
Experimente, die zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt werden, zeigen, dass Serum- und Urintests, die auf den hier beschriebenen Helicopeptidmarkern basieren, erhöhte Knochenresorptionsspiegel in verschiedenen Populationen nachweisen können (Beispiele 10 und 12).
Das Verfahren kann auch verwendet werden, um das Fortschreiten einer andauernden Knochenkollagenstörung im Laufe der Zeit zu überwachen oder die Reaktion eines Individuums auf therapeutische Behandlung zu überwachen. Zahlreiche antiresorptive Therapien, für die die Erfindung nützlich ist, sind derzeit in der Entwicklung oder stehen bereits zur Verfügung. Dies ist in Beispiel 11 für die bekannten antiresorptiven Arzneistoffe Pamidronat und Alendronat und in Beispiel 13 für die Pamidronat-Behandlung nach Schilddrüsenkrebs veranschaulicht. Auf ähnliche Weise kann das Verfahren im Zusammenhang mit metastatischen Krebserkrankungen verwendet werden, um zu bestimmen, ob sich ein primärer Krebs im Knochengewebe des Individuums ausgebreitet hat oder ob ein Individuum auf die Behandlung reagiert.
Man ist sich bewusst, dass das Verfahren auch mit anderen diagnostischen Verfahren wie Radiographieverfahren, Ultraschall und Tests, die auf andere Indikatoren des Knochenresorptionsstatus gerichtet sind, verwendet werden kann, um ein vollständigeres Bild des Status des Individuums bereitzustellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Antikörper sind auch nützlich für die Beurteilung der Effekte von ausgewählten Substanzen wie Arzneistoffe oder Kandidaten für Arzneistoffe auf das Expressionsniveau oder die Sekretion von Typ-I-Kollagen und/oder Fragmenten davon durch eine Zell- oder Gewebepräparation. Somit kann das Verfahren mit Zellen, die mit Knochen im Zusammenhang stehen, wie Osteoclasten und/oder Osteoblasten in Zell- oder Gewebekulturen zur Studie von osteogenen Substanzen und dergleichen verwendet werden. Die Helicopeptidmessungen können bei Kulturüberständen oder Extrakten, die nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden, durchgeführt werden.
Ein Verfahren zur Beurteilung der Wirkung einer ausgewählten Substanz wie ein Arzneistoff auf die Helicopeptidspiegel in einer Körperflüssigkeit eines Tiermodells wie Ratten, Mäuse, Katzen, Hunde, Affen etc. unter Verwendung eines Immuntests, wie vorstehend beschrieben, ist nützlich zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Substanzen und Therapien, die den Spiegel der Knochenresorption erniedrigen.
Ferner kann das erfindungsgemäße Antikörperreagenz auch in einer Affinitätschromatographiematrix nach Standard-Affinitätschromatographieverfahren zur Bindung und Sammlung von Peptiden und Kollagenfragmenten aus biologischen Flüssigkeiten verwendet werden, indem z. B. vereinigtes Blut oder Urin durch eine derartige Matrix gegeben wird.
Aus dem Vorstehenden geht hervor, wie verschiedene Ziele und Merkmale der Erfindung erfüllt werden. Die Erfindung stellt ein einfaches nicht invasives Verfahren zur Messung bestimmter Kollagenfragmente in biologischen Flüssigkeiten bereit, die nützliche Indikatoren der Knochenresorptionsspiegel sind. Das Verfahren erlaubt auch die Überwachung von Änderungen des Krankheitsstatus während oder nach therapeutischer Behandlung.
Folgende Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen.
BEISPIELE
Material und Methoden
Zelllinien. Nicht sekretierender Maus-Myelom-Fusionspartner P3X63Ag8.653 (ATCC# CRL1580), Maus-Monocyten-Makrophagen-Zellinie P388D1 (IL-1) (ATCC# TIB63) und J774A.1 (ATCC# TIB67) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, erworben.
Medien. Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) (Kat# 320-1995AJ), NCTC-109 (Kat# 320-1340AJ), L-Glutamin und Gentamicin wurden von Gibco, Grand Island, NY, erworben. FetalClone-Rinderserumprodukt wurde von HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah, erhalten. Oxalessigsäure und Insulin wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, erworben. S-DMEM wurde formuliert, so dass folgendes enthalten war: 80% DMEM, ergänzt mit 10% NCTC-109, 10% FetalClone-Rinderserumprodukt, 1 mM Oxalessigsäure, 2 mM L-Glutamin, 50 μg/ml Gentamicin und 10 μg/ml Insulin, wobei sich die Prozentsätze auf die Prozentsätze im Endvolumen des Mediums beziehen.
Makrophagen oder Milzzellen konditionierte Medien. Die Mausmonocyten-Zelllinien P388D1 (IL-1) and J774A.1 wurden in S-DMEM-Medien gezüchtet, wobei zweimal in der Woche eine 1 : 4-Teilung erfolgte. Die Gewebekulturüberstände wurden durch einen 0,2 μm-Filter gefiltert und mit 4 mM L-Glutamin ergänzt. Diese konzentrierten konditionierten Medien wurden als 20%-ige Ergänzung von S-DMEM verwendet, um Hybridomzellen herzustellen. Sigma J774A.1-konditioniertes Medium (Kat# M-8782) wurde als 10%-ige Ergänzung von S-DMEM für die begrenzende Verdünnungsclonierung verwendet. Milzzellen wurden S-DMEM für die begrenzende Verdünnungsclonierung zugegeben.
Platten. Gewebekulturplatten mit 96, 48, 24 und 6 Vertiefungen mit flachem Boden und T-25-, T-75-, T-225-Gewebekulturkolben wurden von Costar, Cambridge, MA, erhalten. EIA-Platten wurden von Costar (#3590) und Nunc (#AS-72090) erworben.
Medien zum Einfrieren. Steriles DMSO (Dimethylsulfoxid) wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) oder Sigma Chemical Co. erworben. Die Medien zum Einfrieren wurden so formuliert, dass 40 ml S-DMEM, 5 ml fötales Rinderserum und 5 ml DMSO enthalten waren.
Mäuse. Weibliche 5 Wochen alte MRL/MpJ-lpr-Autoimmun-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, erworben. Balb/c-Mäuse wurden von den Charles River Laboratories, Hollister, CA, erworben.
Puffer. Verschiedene in den nachstehenden Vorschriften verwendete Puffer wurden wie folgt hergestellt.
PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung): 10 mM oder 100 mM Natriumphosphat und 150 mM NaCl, pH = 7,0.
Waschpuffer mit hohem Detergenzgehalt: 0,005% NaN₃ und 0,3% Tween 20 in 10 mM Kalium-PBS (Kalium wird anstelle von Natrium verwendet).
ELISA-Waschpuffer: 0,005% NaN₃ und 0,05% Tween 20 in 10 mM Kalium-PBS (Kalium wird anstelle von Natrium verwendet).
ELISA-Testpuffer: 0,05% NaN₃, 0,05% Tween 20 und 0,1% BSA (Rinderserumalbumin) in 100 mM PBS.
ELISA-Substratpuffer: 0,05% NaN₃, 1 M Diethanolamin und 1 mM MgCl₂.
PSA (Schweineserumalbumin)-Blockierlösung: 1 mg/ml Schweinealbumin (Sigma Cat#A-4414) in 10 mM PBS.
Sonstiges. Immunglobulin Isotyping Kit-IsoStrip^TM (Kat# 1493 027) wurde von Boehringer Mannheim erworben. Kaninchen-anti-Maus-IgG + A + M (Kat# 61-6500) wurde von Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA, erworben. Synthetische Peptide wurden vom Beckman Center, Stanford University, Palo Alto, CA, erhalten. PNPP (p-Nitrophenylphosphat) wurde von Sigma Chemical Co. erhalten.
Ribi-Adjuvans (MPL + TDM-Emulsion) mit CWS-Ergänzung wurde von RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, Montana erworben. Der BCA-Protein-Testkit (Kat# 23225) wurde von Pierce, Rockford, IL, erworben. PEG 1500 (Polyethylenglycol 1500) wurde von Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, erworben. HAT- und HT-Medien wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erworben. IFA (Inkomplettes Freundsches Adjuvans, Kat# 77146G) wurde von Pierce erhalten.
Beispiel 1
Isolierung und Charakterisierung von nativen Helicopeptiden
Der Urin von einem Patienten mit schwerer Paget-Krankheit (alkalische Phosphatase > ~1000 IE) wurde mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail kombiniert, bestehend aus 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 100 mM N-Ethylmaleimid, 50 mM Tris pH 11 in 25% Ethanol (20 ml Cocktail pro 2 l Probe), und bis zur Analyse bei 4°C aufbewahrt. Der Urin wurde unter Verwendung eines Amicon-UM-2-Filters mit einem Reservoir und einem automatischen Ausschlussgerät konzentriert, das eine Konzentration von bis zu 2,5 Litern zuließ. Das Konzentrat wurde dann bei 2°C unter Verwendung von Spectra/Por^®-Dialysemembranen mit einer molekularen Gewichtsgrenze von 3500 dialysiert und dann gefriergetrocknet. Die Anteile wurden dann in 1 M CaCl₂/50 mM Tris-HCl/0,2% Natriumazid/1% Proteaseinhibitor-Cocktail gelöst und im selben Puffer auf Sephadex G-75 einer Chromatographie unterzogen. Die Fraktionen wurden bei OD₂₈₀ überwacht und Aliquote wurden durch Säurebehandlung hydrolisiert und auf Hydroxyprolin (Hyp) analysiert. Tritium-markiertes Wasser wurde verwendet, um das Ende der Trennung zu markieren. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Die Fraktionen, die Hyp enthielten (Fraktionen 50–70), wurden gesammelt, vereinigt, dialysiert, um Pufferbestandteile zu entfernen, und gefriergetrocknet. Die Peptide in diesen Fraktionen wurden für die Trennung nach dem isoelektrischen Punkt durch Chromatofokussierung weiter gereinigt (Pharmacia-PBE 94-Medien in 0,9 × 10 cm-Säule auf pH 7,4 mit 0,025 M Imidazol-HCl äquilibriert). Ein Polypufferampholyt mit einem pH-Wert von 7,5–4,0 (Pharmacia-Polybuffer 74, 110 ml-Gradient mit einer Flussrate von 21 ml/h) wurde für die Chromatofokussierung verwendet, der dann von den eluierten Peptiden durch Passage durch eine Sephadex P-10-Säule (113 cm) entfernt wurde.
Die eluierten Peptide wurden nach dem Hydroxyprolin-Testverfahren von Bergmann & Loxley (1963) unter Verwendung von Aliquoten von bis zu 100 μl getestet. Etwa 39% des aufgetragenen Hydroxyprolins eluierte unmittelbar in das Totvolumen, worauf die Elution von drei aufgetrennten Peaks erfolgte, die pI-Werten von 4,8, 5,3 und 6,2 entsprachen, wie in 2 dargestellt.
Fraktionen, die mit einem pI-Wert von ~6,2 eluierten (angezeigt durch den Pfeil in 2), wurden durch HPLC auf einer C18 Vydac TP201-Säule unter Verwendung einer Beckman-HPLC-Einheit mit einer Kombination zweier wässriger linearer Acetonitril-Gradienten nach dem Verfahren von van der Rest (1982) aufgetrennt. Die verwendeten Acetonitril-Gradienten waren (i) Heptafluorbuttersäure (4–32% Acetonitril, 90 min) und (ii) 0,009 M Trifluoressigsäure (0–32% Acetonitril, 1 h) bei einer Flussrate von 1 ml/min (3). Den Peaks entsprechende Proben wurden gesammelt und die Aminosäuresequenzierung wurde an einem ABI-470-Aminosäure-Sequeziergerät unter Verwendung des Edman-Abbauverfahrens durchgeführt. Mehrere Peaks wurden aufgrund blockierter N-Termini nicht sequenziert. Zwei Fragmentsequenzen wurden erfolgreich bestimmt. (1) Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1) und (2) Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NR: 2).
Die vorstehenden Peptide entsprechen den Resten 620–633 bzw. 253–261 der helikalen Domäne der α1-Kette des menschlichen Typ-I-Kollagens.
Beispiel 2
Synthetische Peptide
Die synthetischen Peptide (1) und (2), die den nativen Sequenzen SEQ ID NR: 1 bzw. 2 entsprechen (Beispiel 1), wurden durch Standard-Peptidsyntheseverfahren zur Verwendung als Standards in Tests und Kits und zur Konjugation an alkalische Phosphatase hergestellt. Für die Konjugatherstellung wurden auch die synthetischen Peptide (1) und (2) modifiziert, um einen zusätzlichen Cysteinrest an ihren N-Termini einzuschließen, wie nachstehend dargestellt: (1a) Cys-Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NR: 3) und (2a) Cys-Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NR: 4).
Die Reinheit der sich ergebenden synthetischen cysteinylierten Peptide (1a) und (2a) wurde durch Umkehrphasen-HPLC bestätigt. Die molekularen Massen wurden durch Massenspektrometrie bestätigt.
Beispiel 3
Helicopeptid-Konjugate
A. KLH-Helicopeptid-Konjugate
Die Immunogene zur Erzeugung von Antikörpern gegen die Peptide (1) und (2) wurden durch Bindung der Cys-Helicopeptide aus Beispiel 2 an Maleimid modifiziertes KLH unter Verwendung von Sulfo-SMCC (Sulfo-N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat) wie folgt hergestellt.
KLH (IMJECT, Pierce Chemical, 20 mg, 2,50 × 10^–6 mMol) wurde in 2,0 ml Wasser rekonstituiert, was zu einer 10 mg/ml KLH-Lösung führte, enthaltend 83 mM Natriumphosphat, pH 7,2, mit 0,9 M NaCl. Zu dieser trüben blauen kolloidalen Lösung wurde ein 500-facher molarer Überschuss (wobei ein Molekulargewicht von 1 Million für KLH angenommen wurde) Sulfo-SMCC (Pierce Chemical, 6,55 mg in 200 μl DMSO) zugegeben. Die sich ergebende Lösung wurde dann 1,5 bis 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde 2 Std. bei Raumtemperatur gegen 1,8 Liter 100 mM Natriumphosphat, pH 6,8, mit 150 mM Natriumchlorid mit einem Pufferaustausch dialysiert.
Jeweils ein 1000-facher molarer Überschuss von den cysteinylierten Peptiden (1a) und (2a) wurde in 300 μl 100 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 150 mM NaCl gelöst. Jedem dieser gelösten Peptide wurde die Hälfte der dialysierten KLH-SMCC enthaltenden Lösung zugegeben. Man ließ das sich ergebende Gemisch 2 Std. bei Raumtemperatur stehen. Die sich ergebenden KLH-Konjugate wurden durch eine gründliche Dialyse über Nacht bei 4°C in PBS, pH 7,1, mit einem Pufferaustausch gereinigt.
Die Aminosäureanalyse der Konjugate KLH-SMCC-N-Cys-Helicopeptid (1) und KLH-SMCC-N-Cys-Helicopeptid (2) (bezeichnet als Immunogene (3) bzw. (4)) zeigte, dass eine beträchtliche Menge an Hydroxyprolin in den Konjugaten und kein Hydroxyprolin in KLH alleine vorlag, was eine starke Derivatisierung des Träger-KLH mit jedem der immuno genen Peptide zeigte. Die genauen Konjugationsverhältnisse wurden aufgrund der Heterogenität des Trägers nicht bestimmt.
B. Helicopeptid-Alkalische Phosphatase-Konjugate
Zur Durchmusterung monoclonaler Antikörper wurden alkalische Phosphatase-Konjugate (Konjugate (5) bzw. (6)) unter Verwendung von jeweils Peptid (1a) und (2a) sowie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) als Kupplungsmittel hergestellt.
Zu 3 mg alkalischer Phosphatase (Scripps) wurde ein 10-facher molarer Überschuss an SPDP (Pierce, 6 mg/ml Stammlösung in DMSO) gegeben, so dass sich eine Lösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml Protein ergab. Nach 1-stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4°C gegen 1,5 Liter 100 mM Natriumphosphat, pH 6,0, mit einem Pufferaustausch dialysiert.
Die dialysierte, SPDP-derivatisierte alkalische Phosphataselösung wurde zwischen zwei Reaktionsbehältern aufgeteilt, wobei jeder einen 20-fachen molaren Überschuss an synthetischem Helicopeptid (1a) oder (2a) enthielt. Nach 4-stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden die Reaktionen gestoppt, indem N-Ethylmaleimid bis zu einer Endkonzentration von 75 mM (1 M Stammlösung in Methanol) zugegeben wurde und man ließ die Lösung 1 Std. stehen.
Die sich ergebenden Konjugate, alkalische Phosphatase-SPDP-Peptid (5) und alkalische Phosphatase-SPDP-Peptid (6) wurden durch eine gründliche Dialyse über Nacht bei 4°C gegen 1,5 Liter PBS, pH 7,1 mit einem Pufferaustausch gereinigt.
Die alkalische Phosphatase-Konjugate wurden auf alkalische Phosphatase-Aktivität getestet, indem die Absorption A405 nach einer Behandlung mit p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin-Substratpuffer beobachtet wurde.
Um die entsprechenden Konjugationsverhältnisse zu bestimmen, wurde die in den Konjugaten vorliegende Menge an Hydroxyprolin durch Aminosäureanalyse gemessen. Die Konjugationsverhältnisse waren für beide Konjugate dieselben (sechs Peptide pro alkalisches Phosphatase-Dimer).
In einem alternativen Ansatz können die alkalische Phosphatase-Konjugate wie folgt hergestellt werden: 12,5 mg gegen 10 mM PBS (pH 7) dialysierte alkalische Phosphatase werden mit 3,2 mg Peptid (1a) oder (2a) in 150 μl 100 mM PBS (pH 7 bis 7, 5) gemischt. Nach der Einstellung der alkalischen Phosphatase-Konzentration auf 5 mg/ml mit 100 mM PBS, werden 2,3 mg Bis(succinimidyl)suberat (Pierce) als Pulver zugegeben und anschließend verwirbelt. Man lässt die Reaktion 1,5 Std. bei Raumtemperatur ablaufen. Die Reaktion wird mit 1 M Glycin in 100 mM PBS gequencht und gegen 2 Liter 10 mM PBS mit fünf Pufferaustauschen über drei Tage hinweg dialysiert.
C. Helicopeptid-Steptavidin-Konjugate
Streptavidin-Konjugate (z. B. zur Bestimmung des Antikörperliters) wurden wie folgt hergestellt. Zu 3 mg Streptavidin (Scripps) wurde ein 10-facher molarer Überschuss an SPDP (Pierce, 6 mg/ml Stammlösung in DMSO) zugegeben und man ließ die sich ergebende Lösung 1 Std. bei Raumtemperatur stehen. Die Proteinkonzentration des sich ergebenden Reaktionsgemisches betrug 10 mg/ml. Das Reaktiongemisch wurde über Nacht bei 4°C gegen 1,5 Liter 100 mM Natriumphosphat, pH 6,0, mit einem Pufferaustausch dialysiert.
Die dialysierte SPDP-derivatisierte Streptavidin-Lösung wurde zwischen zwei Reaktionsbehältern aufgeteilt, wobei jeder einen 20-fachen molaren Überschuss an Cystein-Helicopeptid (1a) oder (2a) enthielt. Nach 4-stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden die Reaktionen gestoppt, indem N-Ethylmaleimid bis zu einer Endkonzentration von 75 mM (1 M Stammlösung in Methanol) zugegeben wurde, worauf eine 1-stündige Inkubation folgte.
Die sich ergebenden Konjugate, Streptavidin-SPDP-N-Cys-Helicopeptid (1) und Streptavidin-SPDP-N-Cys-Helicopeptid (2) (bezeichnet als Konjugate (7) bzw. (8)) wurden durch eine gründliche Dialyse über Nacht bei 4°C gegen 1,5 Liter PBS, pH 7,1, mit einem Pufferaustausch gereinigt. Die Aminosäureanalyse zeigte Konjugationsverhältnisse von etwa 4 Peptiden pro Streptavidin-Tetramer für beide Konjugatpräparationen.
Beispiel 4
Monoclonale Antikörper
A. Immunisierung
Balb/c- und MRL/MpJ-lpr-Mäuse wurden mit Immunogen (3) bzw. (4) unter Verwendung der nachstehenden Vorschrift immunisiert.
Tabelle 1A (Balb/c-Mäuse, Immunogen (3))
Beste Titer-Ergebnisse (Immunogen 3): Reverser Titer 37,912, vorwärts-indirekter Titer 50,930 (Bestimmt als der reziproke Wert der Verdünnung, der eine O.D. besitzt, die der 50%-igen maximalen O.D. äquivalent ist, die auf reversem oder vorwärts-indirektem ELISA basiert).
Tabelle 1B (MRL/MpJ-1pr-Mäuse, Immunogene
Beste Titer-Ergebnisse (Immunogen 4): Reverser Titer 128,477, vorwärts-indirekter Titer 54,314.
Blut aus der Schwanzvenen wurde gesammelt und der Serumtiter wurde etwa 10 Tage nach der dritten Immunisierung unter Verwendung einer vorwärts-indirekten Titer-Bestim mung und einem „reversen ELISA" bestimmt, wie nachstehend beschrieben. Bei den Mäusen mit dem besten Titer wurde 3 bis 7 Tage vor der Fusion intravenös mit 200 μg/ml Peptid-Immunogen in HBSS eine Auffrischung durchgeführt.
Die immunisierten Mäuse wurden dann durch CO₂-Erstickung getötet. Jede Maus wurde mit 70% Alkohol gespült, auf die rechte Seite auf ein Schneidebrett gelegt und in einen Abzug transferiert. Die Milz wurde in eine Petrischale gegeben, die 5 ml serumfreies DMEM-Medium enthielt. Die Milz wurde zweimal in serumfreiem DMEM-Medium gewaschen und dann in kleine Stücke geschnitten und in 7 ml serumfreiem DMEM in einem Zellhomogenisator in kleine Stücke geschnitten.
B. Fusionsvorschrift
Die Fusionen für Immunogen (3) wurden mit etwa 33 × 10⁶ Myelomzellen und 1 × 10⁸ homogenisierten Immunmilzzellen durchgeführt. Die Fusionen für Immunogen (4) wurden mit etwa 66 × 10⁶ Myelomzellen und 2 × 10⁸ homogenisierten Immunmilzzellen durchgeführt.
Für jede Fusion wurden Myelomzellen und homogenisierte Immunmilzzellen 10 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Das pelletierte Zellgemisch wurde dann in 10 ml serumfreiem DMEM-Medium (50 ml Zentrifugenröhrchen) resuspendiert und 10 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt und die Spitze des 50 ml-Zentrifugenröhrchens wurde angekopft, um das Zellpellet zu lockern. 2 ml 50%-iges PEG-1500-Fusogen wurden dem Zellpellet 90 Sekunden tropfenweise zugegeben und sanft mit einer Pipette vermischt. 2 ml serumfreies DMEM wurde dann 1 Minute tropfenweise zugegeben. 20 ml S-DMEM wurden langsam 2 Minuten zugegeben und man ließ das Zellgemisch weitere 2,5 Minuten unter leichtem Schütteln während des Vorganges stehen. Die Zellsuspension wurde dann 10 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert.
Nach Entfernen des Überstandes wurden die Zellen in 200 ml HAT in 20%-igem P388D1- oder J775-1- konditioniertem S-DMEM-Medium resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in zehn Costar-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen pipettiert. Die Platten wurden in 7% CO₂ bei 37°C inkubiert, um die Hybridomzellen zu züchten. Die Zellen wurden an Tag 3 und Tag 7 durch Herauspipettieren von 100 μl/Vertiefung altem Medium und anschließender Ergänzung mit 150 μl/Vertiefung HAT- (Tag 3) oder HT- (Tag 7) Medium gefüttert. Die Fusionsplatten waren typischerweise 7–10 Tage nach der Fusion zur Durchmusterung bereit.
In Fusionsexperimenten zur Herstellung monoclonaler Antikörper schienen von den 950 Vertiefungen für jedes der Immunogene (3) und (4), in die Zellen ausgesät wurden, alle Vertiefungen lebensfähige Hybridome zu enthalten.
B. Durchmustern der Hybridome
Erfolgreiche Fusionsprodukte wurden dann auf Immunreaktivität unter Verwendung des in Beispiel 8C beschriebenen reversen Testformats durchmustert.
Fusionen für Immunogen (3): Basierend auf reversem ELISA zeigten insgesamt 196 von 950 Vertiefungen gute, positive Ergebnisse für die Fusion (O.D. > 1,5) und 32 von 950 Vertiefungen zeigten sehr gute, positive Ergebnisse für die Fusion (O.D. > 2,0).
Fusionen für Immunogen (4): Basierend auf reversem ELISA zeigten insgesamt 911 von 950 Vertiefungen sehr gute, positive Ergebnisse für die Fusion (O.D. > 3,0), während 15 von 950 Vertiefungen gute, positive Ergebnisse für die Fusion (O.D. > 2,0) zeigten.
Nach der Bestimmung der Antikörper produzierenden Hybridomclone wurde eine kompetitive ELISA-Vorschrift verwendet, um Clone zu wählen, die sowohl Sensitivität als auch Spezifität gegenüber dem Immunogen zeigten. Der kompetitive reverse ELISA wurde gegen jedes der synthetischen Peptide (1) und (2) und gegen den Urin von Kindern als Quelle nativer Kollagenpeptide durchgeführt.
Vier gegen Immunogen (3) gerichtete Clone zeigten sowohl gegen das synthetische Peptid (1) als auch gegen den Urin von Kindern eine gute Immunreaktivität. Ein Clon, Clon 10B1, zeigte eine ausgezeichnete Immunreaktivität gegen Immunogen (3). Zwei der vier Clone überlebten die erste Runde der begrenzenden Verdünnungsclonierung (Einzelzellclonierung), von denen einer Clon 10B1 war. Basierend auf dessen Sensitivität und Spezifität wurde Clon 10B1 weiter charakterisiert.
Unter Verwendung der in Beispiel 8C beschriebenen Vorschrift wurde bestimmt, dass die Affinitätskonstante des monoclonalen Antikörpers 10B 1 etwa 1 × 10⁸/M betrug. Clon 10B1 (volle Bezeichnung: 10B1-5A6-1C9) wurde am 12. März 1998 bei der ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd, Manassas, VA, 20110-2209) als Hybridom-Hinterlegung HB-12480 gemäß des Budapester Vertrages hinterlegt.
Beispiel 5
Polyclonale Antikörper
Weiße Neuseeland-Kaninchen wurden mit 200 μg/Kaninchen Immunogen (3) oder (4) KLH-SMCC-Helicopeptid-Konjugaten aus Beispiel 3) mit dem Adjuvans Ribi(CWS) alle drei Wochen immunisiert. Das Antiserum wurde nach der dritten Immunisierung und 10 Tage nach jeder folgenden Immunisierung gesammelt. Die Titer wurden unter Verwendung des folgenden Verfahrens analysiert. Zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte wurden 100 μl 3 μg/ml Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Zymed) in 10 mM PBS gegeben, worauf eine Inkubation über Nacht bei 4°C folgte. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit 300 μl Waschpuffer gewaschen. 100 μl/Vertiefung von richtig verdünntem polyclonalem Kaninchenserum wurden zugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Vertiefungen mit 300 μl/Vertiefung Waschpuffer wurden Standards (50 μl/Vertiefung) und Urin (1 : 2 Verdünnung in Testpuffer) und anschließend (50 μl/Vertiefung) alkalische Phosphatase-Konjugate (5) und (6) (Beispiel 3B) in Testpuffer zugegeben. Die Gemische wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert, 3-mal mit 300 μl/Vertiefung Waschpuffer gewaschen, und es wurden 150 μl/Vertiefung 2 mg/ml PNPP-Substratlösung zugegeben. A₄₀₅-Werte wurden nach 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur gemessen.
Beispiel 6
Herstellung von Immunogen überzogenen Mikrotiterplatten
A. Biotin-PSA
Die Biotinylierung von Schweineserumalbumin (PSA) erfolgte durch Zugabe von 10 mg Biotin-X-2,4-dinitrophenol-X-L-lysin-succinimidylester (Molecular Probes, Eugene, OR) in 400 μl Dimethylformamid (DMF) zu 15 ml PBS-Lösung, enthaltend 150 mg Albumin. Man ließ das Gemisch zwei Stunden bei Raumtemperatur reagieren, worauf eine G-25-Säulenchromatographie folgte.
B. Beschichten mit Immunogen-Streptavidin-Konjugat
Die Konjugate (7) und (8) aus Beispiel 3C werden fakultativ durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephacryl S-300 HR (1,6 × 98 cm) gereinigt, und mit 50 mM PBS pH 7,5, enthaltend 0,05% Tween 20, bei 0,33 ml/min eluiert.
Jede der Vertiefungen in einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit Konjugat (7) oder (8) wie folgt beschichtet. Jeder Vertiefung wurden 150 μl Biotin-PSA-Lösung bei 3,8 μg/ml in PBS zugegeben, worauf eine Inkubation über Nacht bei 2–8°C folgte. Die Mikrotiterplatten wurden mit PBS, enthaltend 0,3% „TWEEN"-20, gewaschen und durch Zugabe von 200 μl Albumin zu 1 mg/ml blockiert, worauf eine Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur folgte. Die Mikrotiterplatten wurden dann zweimal mit PBS, enthaltend 0,05% „TWEEN"-20, gewaschen.
Jeder Biotin-PSA-beschichteten Vertiefung wurden 150 μl einer Lösung zugegeben, die Konjugat (7) oder (8) bei 100 ng/ml in PBS enthielt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten zweimal mit PBS, enthaltend 0,05% „TWEEN"-20, gewaschen, worauf eine 2-stündige Inkubation mit 200 μl/Vertiefung 10%-iger Saccharose in 100 mM PBS folgte, um die Stabilität des Trägers zu verbessern. Nach dem Absaugen der Vertiefungen wurde dann Restflüssigkeit aus der Mikrotiterplatte durch Trocknen über Nacht in einem Konvektionsofen bei 37°C entfernt.
Beispiel 7
IgG-Antikörper Alkalische Posphatase-Konjugat
Zehn Äquivalente von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) (Pierce Chemical; 0,22 mg, 6,92 × 10^–4 mMol) mit 4 mg/ml in wasserfreiem Ethanol wurden der alkalischen Phosphatase (Biozyme; 9,7 mg, 6,92 × 10^–5 mMol) mit 12,2 mg/ml in 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5, der 1 mM EDTA enthielt und mit Argongas desoxygeniert wurde, unmittelbar tropfenweise zugegeben. Man ließ dann das Gemisch bei Raumtemperatur 2,5 Stunden stehen. Das sich ergebende alkalische Phosphatase-Pyridyldithiopropionat-Produkt wurde durch Dialyse gegen 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6, der 1 mM EDTA enthielt und mit Argongas desoxygeniert wurde, gereinigt.
Die Umwandlung zum entsprechenden Thiol erfolgte durch 30-minütige Exposition des alkalischen Phosphatase-Pyridyldithiopropionat-Produktes gegenüber überschüssigem Dithiothreit (Molecular Probes; 2,3 mg, 0,02 mMol) bei 5 mM. Ein Aliquot wurde bei A₂₈₀ und A₃₄₄ gemessen und es wurde bestimmt, dass es 4,8 Thiolgruppen pro Enzym enthielt. Das Enzymethiol wurde durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 gereinigt.
Zehn Mole Sulfosuccinimidyl-4-(N-Maleimidomethylcyclohexan-1-carboxylat (Pierce Chemical; 0,087 mg, 2,00 × 10^–4 mMol) mit 2 mg/ml in wasserfreiem Methanol wurden dem Protein A gereinigten peptidspezifischen IgG-Antikörper (2,00 × 10^–5 mMol) mit 6,0 mg/ml in 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5, der 1 mM EDTA enthielt und mit Argongas desoxygeniert wurde, unmittelbar tropfenweise zugegeben, und dies ließ man bei Raumtemperatur 2,25 Std. stehen. Das sich ergebende IgG-Maleimid wurde durch Dialyse gegen 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6, der 1 mM EDTA enthielt und mit Argongas desoxygeniert wurde, gereinigt.
Das IgG-Maleimid wurde dann direkt 2,6 Mol dem alkalische Phosphatase-thiol, versiegelt unter Argongas, zugegeben und man ließ es 24 Std. bei 4°C stehen. Die restlichen Thiolgruppen wurden dann mit 50 mM einer N-Ethylmaleimidkappenstruktur versehen, indem man sie > 24 Std. bei 4°c reagieren ließ.
Das sich ergebende IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat wurde dann gereinigt, um das restliche nicht reagierende IgG, Enzyme und NEM durch Gelfiltration über Sephacryl S-300HR (1,6 × 98 cm) zu entfernen, wobei mit 50 mM PBS, pH 7,5, enthaltend 0,05% Tween 20, eluiert wurde. Die IgG-Enzym enthaltenden Fraktionen, relativ zum nichtkonjugierten Material, wurden zuerst durch Absorption bei A₂₈₀ bestimmt, die mit der Analyse von verdünnten Aliquoten auf Mikrotiterplatten kombiniert wurde.
Zuerst wurde die Aktivität des Enzyms getestet, indem die A₄₀₅-Absorption nach Behandlung mit p-Nitrophenylphosphat in Diethanolaminsubstratpuffer beobachtet wurde. Zweitens wurde das Konjugat durch Bindung an eine Kaninchen-anti-Mausantikörper beschichtete Mikrotiterplatte (mit 3 μg/ml), Waschen und Nachweis mit p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin-Substratpuffer identifiziert.
Zuletzt wurde das Konjugat durch Bindung an eine Peptidimmunogen beschichtete Platte (PSA-Biotin mit 3,75 μg/ml) über Nacht bei 4°C, Blockierung der Platte mit 1 mg/ml PSA-Lösung und anschließend mit Streptavidin-Peptid-Konjugat (Beispiel 3C) mit 3,8 μg/ml über Nacht bei 4°C, und Nachweis von jedem gebundenem IgG-Enzym mit 2 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin bestimmt. Die Fraktionen werden basierend auf diesen Ergebnissen vereinigt, um nur Fraktionen zu erhalten, die das IgG-AP-Konjugat enthalten.
Beispiel 8
Veranschaulichende Testkonfigurationen
A. Vorwärts-direktes Format
Folgende Schritte werden durchgeführt, um verschiedene Testkonfigurationen herzustellen:

(1) ELISA-Platten werden mit 150 μl/Vertiefung, 3,75 μg/ml Biotin-PSA bei 4°C über Nacht beschichtet.
(2) Die Platten werden mit 250 μl/Vertiefung Waschpuffer mit hohem Detergenzgehalt 2 Stunden eingeweicht.
(3) Die Platten werden mit 250 μl/Vertiefung 1 mg/ml PSA bei 4°C über Nacht blockiert.
(4) Die Platten werden zweimal mit Waschpuffer gewaschen.
(5) Streptavidin markiertes Konjugat (7) oder (8) (~2 μg/ml) wird den Platten zu 150 μl/Vertiefung bei 4°C über Nacht zugegeben.
(6) Die Platten werden dreimal mit Waschpuffer gewaschen.
(7) Der Platte werden 100 μl/Vertiefung Antikörper-AP-Konjugat (1 : 1000 Verdünnung, 84 ng/ml) in Testpuffer und 50 μl/Vertiefung Standards oder Proben zugegeben. Die Platte wird 1 Stunde oder länger inkubiert.
(8) Die Platten werden dreimal mit 300 μl/Vertiefung Waschpuffer gewaschen.
(9) 150 μl/Vertiefung 2 mg/ml PNPP in Substratpuffer werden den Platten zugegeben und bei Raumtemperatur 60 Minuten oder länger inkubiert. Die Farbentwicklung wird mit 3 N NaOH gestoppt. Die Absorption wird bei 405 nm gemessen.

B. Vorwärts-indirektes Format
Das Verfahren im vorstehenden Teil A wird wie folgt modifiziert. Die folgenden Modifizierungen werden anstelle der Schritte (7) und (8) durchgeführt:

(7) Der Platte werden 100 μl/Vertiefung Immunogen-spezifischer Antikörper (~10 bis 50 ng/ml) in Testpuffer und 50 μl/Vertiefung Immunogenstandard oder die Probe zugegeben. Die Platte wird 1 Stunde oder länger inkubiert.
(8) Die Platten werden dreimal mit 300 μl/Vertiefung Waschpuffer gewaschen.
(8,5) 150 μl/Vertiefung Pierce-Ziegen-anti-Maus-IgG + M(H + L)-alkalische Phosphatase Konjugat (1 : 1.000 Verdünnung in Testpuffer) werden der ELISA-Platte zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

C. Reverses Format

(1) Eine Costar- oder Nunc-ELISA-Platte wird mit 150 μl/Vertiefung 3 oder 4 μg/ml Zymed-Kaninchen-anti-Maus-IgG + A + M (H + L) in 10 mM PBS bei Raumtemperatur 1–24 Stunden beschichtet.
(2) Die Platte wird mit 300 μl/Vertiefung Waschpuffer mit hohem Detergenzgehalt bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert und dann zwei weitere Male gewaschen.
(3) Antikörper (z. B. monoclonale anti-Helicopeptid (I)- oder anti-Helicopeptid (II)-Antikörper) werden aus Zellkulturüberständen, Maus-Seren oder als gereinigte Antikörper in Testpuffer (z. B. 180 μl/Vertiefung 10B1-Antikörper mit 50 ng/ml) zugegeben und bei Raumtemperatur 16–24 Stunden inkubiert.
(4) Die Platten werden ein- bis dreimal mit 300 μl/Vertiefung Waschpuffer und anschließend mit 250 μl/Vertiefung einer Lösung mit 10% Saccharose, 1% BSA und 0,05% NaN₃ in 100 mM PBS mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur gewaschen.
(5) Nach dem Waschen wird die Platte mit 250 μl/Vertiefung 15%-iger Saccharose in 100 mM PBS 30 Minuten bis 1 Stunde inkubiert. Nach Entfernen der Saccharoselösung wird die Platte über Nacht bei 37°C in einem Inkubator getrocknet und mit einem Trocknungsmittel aufbewahrt.
(6) Man gebe 20 μl flüssige biologische Probe oder Standard in jede Vertiefung.
(7) Man gebe 150 μl geeignete Verdünnung des Peptid alkalische Phosphatase-Konjugates in Puffer, enthaltend 0,5 M K₂SO₄, 4 mM MgCl₂ und 0,4 mM ZnCl₂ zu. Man inkubiere 3 Stunden bei Raumtemperatur (auch akzeptabel: 1 Stunde bis über Nacht, Zimmertemperatur oder 4°C).
(8) Man wasche dreimal mit Waschpuffer.
(9) Man gebe 100–150 μl/Vertiefung 2 mg/ml PNPP in Substratpuffer zu den Platten und inkubiere bei Raumtemperatur 30–60 Minuten, wonach die Farbentwicklung mit 1 N NaOH gestoppt wird. Die Absorption wird bei 405 nm gemessen und anschließend eine Kurvenanpassung mit vier Parametern durchgeführt.

Beispiel 9
Urin-Peptidtest
Das reverse Formatverfahren in Beispiel 8C wurde verwendet, um die analytische Leistungsfähigkeit eines Beispieltests zu charakterisieren.
Einer anti-Helicopeptid (I)-monoclonaler Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte wurden 20 μl Kalibrator oder Urinprobe zugegeben (doppelter Ansatz) und anschließend erfolgte eine Zugabe von 150 μl Peptid-alkalische Phosphatase-Konjugat in 0,5 M K₂SO₄, enthaltend 4 mM MgCl₂ und 0,4 mM ZnCl₂. Die Platte wurde drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Der colorimetrische Nachweis erfolgte durch Zugabe von 150 μl PNPP-Substratlösung (2 mg/ml), worauf die einstündige Inkubation bei Raumtemperatur folgte. Ein Volumen von 100 μl 1 N NaOH Stopp-Lösung wurde dann jeder Vertiefung zugegeben. Die Absorption wurde dann bei 405 nm gemessen.
Präzision. Der ELISA zeigte eine gute analytische Leistungsfähigkeit mit einer Intra-Testkoeffizientenvariation (CV) von 4–7% und einer Inter-Testkoeffizientenvariation (CV) von 5–7%. Diese Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammengefasst.
Linearität. Die mittlere Linearität wurde als Durchschnitt von 8 Proben bestimmt, die unverdünnt oder 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 und 1 : 16 mit Testpuffer verdünnt gemessen wurden. Die mittlere Linearitäts-Wiederfindungsrate des Urins betrug 104 ± 8% über die Verdünnungen, wobei die % lineare Wiederfindungsrate = (beobachteter Wert/erwarteter Wert) × 100 ist.
Wiederfindungsrate für zugesetztes Peptid. Die mittlere Wiederfindungsrate für zugesetztes Peptid wurde bestimmt, indem verschiedene Mengen des synthetischen Peptids (I) (100 ng/ml, 300 ng/ml und 1000 ng/ml) 9 Urinproben zugesetzt wurden. Die mittlere Wiederfindungsrate für zugesetztes Peptid betrug 99 ± 4%.
Eine Standardkurve für den Urin-Typ-I-Kollagen-Test, der auf dem Nachweis von Helicopeptid (I) basiert, ist in 4 dargestellt.
Tabelle 2 Analytische Leistungsfähigkeit des Tests
Die Ergebnisse in Tabelle 2 veranschaulichen die gute allgemeine analytische Leistungsfähigkeit eines repräsentativen reversen ELISA, der monoclonale anti-Helicopeptid-Antikörper zum Nachweis des Helicopeptid-Markers der vorliegenden Erfindung beinhaltet.
Beispiel 10
Nachweis der Knochenresorption in verschiedenen Populationen
Unter Verwendung des in Beispiel 9 beschriebenen ELISA wurden Tests mit Urinproben der folgenden Populationen durchgeführt: (i) 73 gesunde prämenopausale Frauen, Alter 25–44; (ii) 20 gesunde Männer, Alter 25–44, (ii) 30 Patienten mit Paget-Krankheit und (iv) 47 osteoporotische Frauen.
Basierend auf dem Testergebnis betrug der mittlere Urinspiegel von Peptid/α1(I)^620–633 (I) bei normalen Populationen (i) und (ii) 30,0 ± 17,9 ng/nMol Kreatinin. Der mittlere Marker (I)-Spiegel bei Patienten mit Paget-Krankheit betrug bei 27 von 30 Proben 241,7, die > 60,0 ng/nMol Kreatinin (gg. normal P < 0,0001) enthielten. Der mittlere Marker (I)-Spiegel bei osteoporotischen Frauen (Population (iv)) betrug 40,4 ± 33,5 ng/nMol Kreatinin. Diese Ergebnisse werden graphisch in 5 und in der nachstehenden Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Vergleich der Populationen

P-Wert: ungepaarter t-Test nach Student;
T-Bewertung: Testmittelwert-Referenzpopulationsmittelwert/(Referenzpopulation SD ("standard deviation", Standardabweichung);
% Erhöhung: [(Testmittelwert-Referenzpopulationsmittelwert)-1] × 100%

Beispiel 11
Überwachung der therapeutischen Behandlung
Der in Beispiel 10 beschriebene ELISA wurde verwendet, um die Änderungen im Status des Knochenabbaus als Reaktion auf die therapeutische Behandlung mit Pamidronat und Alendronat zu überwachen.
Pamidronat-Therapie. Die Studie wurde mit insgesamt 24 Individuen durchgeführt. Die Dauer der Studie betrug 26 Wochen.
14 weibliche Patienten mit Osteoporose wurden in ein kontinuierliches Behandlungsschema mit 150 mg oralem Pamidronatdinatrium (ADP) eingebunden, das täglich über einen Zeitraum von 26 Wochen verabreicht wurde. 10 weitere Individuen erhielten ein wöchentliches Erhaltungstherapieschema von täglich 150 mg Pamidronat für eine 4-wöchige Belastungsdosisperiode, gefolgt von einer wöchentlichen Erhaltungsdosis von oralem Pamidronat (150 mg, verabreicht an einem Tag pro Woche), begleitet von einem geeigneten Pamidronat-Placebo, der 6 Tage in der Woche für den verbleibenden 22-wöchigen Verlauf der Studie verabreicht wurde.
Urinproben (vereinigte 24 Stunden-Proben) wurden vor der Behandlung zur Etablierung einer Basislinie und nach 6 Monaten im Anschluss an die Behandlung gesammelt.
Alendronattherapie. 11 weibliche Patienten mit einer niedrigen Knochenmasse (nicht unbedingt osteoporotisch) wurden täglich mit 10 mg oralem Alendronat behandelt. Urinproben der zweiten morgendlichen Leerung zur Analyse wurden an der Basislinie (vor der Behandlung), einen Monat (2 Patienten), 3 Monate (6 Patienten) und 6 Monate (3 Patienten), nachdem die Behandlung begonnen wurde, gesammelt.
Ergebnisse. Die Ergebnisse sind nachstehend in den Tabellen 4–6 zusammengefasst. Bei 24 osteoporotischen Patienten, die mit Pamidronat behandelt wurden (Tabelle 5), nahm die Exkretion des urinären Peptids/α1(I)^620–633 um einen Mittelwert von 69% ab und nahm bei 22 von 24 Patienten um mehr als 40% ab. Auf ähnliche Weise nahm die Exkretion des urinären Peptids/α1(I)^620–633 um einen Mittelwert von 80% bei 11 osteoporotischen Patienten, die mit Alendronat (Tabelle 6) behandelt wurden, ab und nahm bei 9 von 11 Patienten um mehr als 60% ab.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Messung der Urinexkretion von Peptid/α1(I)^620–633 mittels ELISA (i) einen guten Marker der Knochenresorption und (ii) einen sensitiven Indi kator für die Überwachung der Wirksamkeit verschiedener antiresorptiver Therapien bereitstellt.
Tabelle 4 Mittelwert, SD und % CV von 72 gesunden prämenopausalen Frauen
Tabelle 5 Mittlere Reaktion von 24 Patienten nach Pamidronat-Therapie
Tabelle 6 Mittlere Reaktion von 11 Patienten nach Alendronat-Therapie
Beispiel 12
Serumtests
Für die folgenden beiden Vorschriften wurde die Stabilität der Serumproben verbessert, indem ein Proteaseinhibitor-Cocktail (Sigma #P8340) bei einer Konzentration von 2 Vol.-% miteinbezogen wurde.
A. Vorschrift 1
Einer mit monoclonalem anti-Helicopeptid (1)-Antikörper (10B1) beschichteten Platte wurden 50 μl (oder 100 μl) Kalibrierungsstandard oder Serumprobe und anschließend 100 μl (oder 50 μl) Kollagenpeptid-alkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben. Die Platte wurde 3 Stunden (oder über Nacht) bei 4°C inkubiert und dreimal mit Waschpuffer gewaschen.
Der colometrische Nachweis erfolgte durch Zugabe von 150 μl PNPP-Substratlösung (2 mg/ml), gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur. Ein Volumen von 100 μl 1 N NaOH Stopp-Lösung wurde dann jeder Vertiefung zugegeben. Die Absorption wurde dann bei 405 nm gemessen.
B. Vorschrift 2
Einer mit monoclonalem Antikörper (10B1) beschichteten Platte, die, wie in Beispiel 8C (Schritte 1 bis 5) beschrieben, hergestellt wurde, wurden 50 μl/Vertiefung mit pH 2 behandeltes Gesamt (unspezifische)-Kaninchenserum-Antikörper in 2% DMSO-Testpuffer zugegeben (um die unspezifische Bindung zu reduzieren) und anschließend 50 μl Serumprobe oder Standard zugegeben. Peptid-alkalische Phosphatase-Konjugat (50 μl) in 0,5 M K₂SO₄, enthaltend 4 mM MgCl₂ und 0,4 mM ZnCl₂, wurde dann zugegeben und die Platte wurde 3 Stunden bis über Nacht bei 4°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Platte dreimal mit 300 μl/Vertiefung Waschpuffer gewaschen. Der colorimetrische Nachweis erfolgte durch Zugabe von 150 μl PNPP-Substratlösung (2 mg/ml) und anschließender einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur. Jeder Vertiefung wurde Stopp-Lösung (100 μl 1 N NaOH) zugegeben und die Absorption wurde bei 405 nm gemessen.
C. Ergebnisse
Präzision. Der serumbasierende ELISA zeigte eine hohe Präzision, wie durch folgende Parameter angezeigt.

1. Intra-Testkoeffizientenvariation (CV), (n = 26–28 Wiederholungen): 2,8% (bei 25 ng/ml); 7,74% (bei 13,4 ng/ml) und 8,4% (bei 8,14 ng/ml).
2. Inter-Testkoeffizientenvariation (CV) (n = 2 Wiederholungen pro Lauf. 7 Läufe, 2 Tage): 8% (bei 17.5 ng/ml) und 11% (bei 76 ng/ml).

Linearität. Die mittlere Linearität wurde als Durchschnitt von 5 Serumproben bestimmt, die unverdünnt oder 1 : 2, 1 : 4 und 1 : 8 mit Testpuffer verdünnt waren. Die mittlere Serumverdünnungswiederfindungssrate betrug 112 ± 6% über den Verdünnungen.
Wiederfindungsrate für zugesetztes Peptid. Die mittlere Wiederfindungsrate für zugesetztes Peptid, wurde bestimmt, indem 15 Serumproben mit 10 Vol.-% synthetischem Peptid (I) bei verschiedenen Konzentrationen (10 ng/ml, 30 ng/ml und 100 ng/ml) versetzt wurden. Die mittlere Wiederfindungsrate für zugesetztes Peptid betrug 93 ± 3%.
Klinische Leistungsfähigkeit des Serumstests zum Nachweis der Knochenresorption in verschiedenen Populationen. Die vorstehend beschriebenen Tests wurden verwendet, um die Menge an Helicopeptid (I) in Serumproben von verschiedenen Populationen zu bestimmen und die Wirksamkeit des Tests bei der Unterscheidung zwischen normalen und erkrankten Patienten zu beurteilen.
Serumproben von folgenden Populationen wurden gesammelt: (i) 24 gesunde prämenopausale Frauen: (ii) 35 gesunde Männer; (iii) 29 Patienten mit Paget-Krankheit.
Basierend auf den Ergebnissen des Tests betrug der mittlere Serumspiegel von Peptid/α1(I)^620–633 bei gesunden prämenopausalen Frauen 17,8 ± 4,6 ng/ml und 16,7 ± 7,2 ng/ml bei gesunden Männern. Auch 62% (18/29) der Paget-Patienten hatten Serumpeptidspiegel, die den normalen Mittelwert bei Frauen um mindestens das 2-fache überschritten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Helicopeptide der vorliegenden Erfindung (i) effektive Marker zur Bestimmung des Status der knochenresorptiven Prozesse sind, (ii) verwendet werden können, um spezifische mit den Knochen im Zusammenhang stehende Krankheiten zu erkennen und (iii) in einer Reihe von Testarten und Konfigurationen verwendet werden können, wobei verschiedene biologische Flüssigkeitsproben wie Urin und Serum verwendet werden können.
Beispiel 13
Pamidronat-Behandlung bei Schilddrüsenkrebs
42 Schilddrüsenkrebspatienten mit suppressiven Dosierungen von Thyroxin wurden 30 mg Pamidronat durch Infusion oder ein Placebo verabreicht. Die Serum- oder Urinproben wurden an der Basislinie (vor der Arzneistoffverabreichung) und 1, 2, 3 und 12 Monate nach Beginn der Arzneistoffverabreichung gesammelt und der Spiegel von Helicopeptid I wurde unter Verwendung der Testvorschriften der Beispiele 9 und 12B bestimmt. Eine minimale signifikante Änderung (MSC) wurde definiert als 2-fache langfristige infra-individuelle Variabilität (basierend auf den Spiegeln an der Basislinie, 1, 2 und 3 Monate auf Placebo). Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Spiegels an Typ-I-Kollagen-Fragmenten in einer Flüssigkeitsprobe in vitro, umfassend: Inkontaktbringen einer Flüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der für ein Epitop immunspezifisch ist, das in einer der folgenden Peptidsequenzen enthalten ist: (1) Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1)oder (2) Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NR: 2)unter Bedingungen, die wirksam sind zur Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und den Polypeptidfragmenten in der Probe, die das Epitop enthalten, Bestimmen des Spiegels an gebildetem Komplex, und ausgehend von dem bestimmten Spiegel an Komplex, Bestimmen des Spiegels an Polypeptidfragmenten in der Probe, die das Epitop enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Antikörper ein polyclonaler oder monoclonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die biologische Flüssigkeitsprobe eine Urinprobe, eine Blutprobe, ein Zellkulturüberstand oder ein Gewebekulturüberstand ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung in der Messung des Spiegels an Knochenkollagenresorption in einem Säuger-Individuum, wobei ein bestimmter Fragmentspiegel, der über einem Fragmentspiegel liegt, der characteristisch ist für ein normales Individuum, eine Indikation dafür ist, daß das Individuum eine Knochenresorptionsstörung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4 zur Verwendung beim Screenen auf das Vorhandensein eines Knochenresorptionszustandes ausgewählt aus Osteoporose, Osteoarthritis, Hyperparathyroidismus, rheumatoide Arthritis und einem metastatischen Knochenkrebszustand.
Verfahren nach Anspruch 4 zur Verwendung beim Aufzeichnen des Spiegels an Knochenkollagenresorption in einem Individuum als Reaktion auf eine therapeutische Behandlung.
Antikörper, der immunspezifisch für ein Epitop ist, das in einer der folgenden Peptidsequenzen enthalten ist: (1) Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1)oder(2) Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NR: 2).
Antikörper nach Anspruch 7, der ein monoclonaler oder polyclonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 8, wobei der Antikörper eine Bindungsaffinität für das Epitop von mindestens 1 × 10⁷/molar aufweist.
Testkit zur Messung des Spiegels an Kollagenfragmenten in einer biologischen Flüssigkeitsprobe, wobei der Kit umfasst: einen Antikörper, der immunspezifisch ist für eines der Epitope, wie in Anspruch 7 definiert, und einen Immunogen-Standard, der das Epitop enthält, für das der Antikörper immunspezifisch ist.
Isoliertes Peptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 entspricht.
Antigen, umfassend ein Peptid nach Anspruch 11 gebunden an einem Träger.
Antigen nach Anspruch 12, wobei der Träger für die Förderung der immunologischen Antwort gegen das Peptid wirksam ist.
Immortalisierte Zelllinie, die einen Antikörper nach einem der Ansprüche 8 oder 9 erzeugt.