ES2327812T3 - Nuevos metodos y composiciones para inhibir la angiogenesis utilizando bases antagonistas de mmp-9 y/o integrinas beta-1. - Google Patents

Abstract

Un antagonista que inhibe la angiogénesis modificando las interacciones proteína-proteína entre la metaloproteinasa 9 (MMP-9) de matriz y una integrina conteniendo Beta1, en donde dicho antagonista comprende un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido constando de la secuencia ID SEC Nº 1.

Description

Nuevos métodos y composiciones para inhibir la angiogénesis utilizando bases antagonistas de MMP-9 y/o integrinas \beta1.

Campo de la invención

La invención se refiere, en general, al campo de la medicina, y tiene que ver específicamente con métodos y composiciones para inhibir la angiogénesis en un tejido o detectar la angiogénesis utilizando antagonistas de secuencias especificadas encontradas dentro de la MMP-9 y/o integrinas \beta1.

Antecedentes

El crecimiento tumoral y la metástasis afectan a un gran número de gente cada año. De hecho, se estima que se diagnosticarán por encima de 600.000 nuevos casos de cáncer en el año que viene, sólo en los Estados Unidos [Varner, J. A., Brooks, P. C., and Cheresh, D. A. (1995) Cell Adh. Commun. 3, 367-374]. Numerosos estudios han indicado que el crecimiento de todos los tumores sólidos requiere el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos para la expansión continuada de los tumores más allá de un tamaño mínimo [Varner y col., 1995; Blood, C. H. and Zetter, B. R. (1990), Biochim. Biophys. Acta 1.032: 89-118; Weidner, N. y col., (1992), J. Natl. Cancer Inst. 84: 1.875-1.887; Weidner, N. y col., (1991), N. Engl. J. Med. 324: 1-7; Brooks, P. C. y col., (1995), J. Clin. Invest. 96: 1.815-1.822; Brooks, P. C. y col., (1994), Cell 79: 1.157-1.164; Brooks, P. C. y col., (1996), Cell 85, 683-693; Brooks, P. C. y col., (1998), Cell 92: 391-400].

Circulation, 98 (17), 1998, pág. 4.166, enseña que la expresión de la integrina \alpha5\beta1 está regulada al alza en los vasos sanguíneos en los tumores humanos. La integrina \alpha5\beta1 se colocaliza con la expresión de fibronectina en células vasculares. Los inhibidores de la \alpha5\beta1 inhiben la angiogénesis inducida por tumores y el crecimiento tumoral en un modelo en ratones. Como inhibidores sirven los anticuerpos, péptidos y moléculas orgánicas.

WO-A-95/14714 se refiere a péptidos de unión a la integrina \alpha5\beta1 que se utilizan en un método terapéutico para inhibir la metástasis de células tumorales (ver páginas 3-4, ejemplo VII, reivindicaciones 64-69).

Nature Biotechnology, vol. 17, agosto de 1999, 768-774, revela inhibidores péptidos cíclicos de MMP-9 (ver resumen). El péptido CTTHWGFTLC se utiliza en un método para retrasar la formación del carcinoma de mama y aumentar la supervivencia de animales soportando tumores (ver pág. 770, columna derecha, quinto párrafo y pág. 771, columna derecha, último párrafo).

Cancer Research, marzo de 1999, 59 (5), 1.252-1.258, revela el inhibidor KB-R7785 de la MMP-9, basado en el ácido hidroxámico. La administración intraperitoneal, dos veces al día, produce la supresión del 88'2% del crecimiento tumoral en un modelo tumoral en ratones (ver resumen). El KB-R7785 interfiere con las etapas tempranas de la angiogénesis (ver pág. 1.257).

WO-A-99/58139 [que entra dentro de los términos del Art. 54 (3) EPC] revela un método para inhibir la angiogénesis, poniendo en contacto el tejido de interés con un antagonista de la integrina \alpha5\beta1. El antagonista es un anticuerpo anti-integrina \alpha5\beta1, un péptido comprendiendo la secuencia CRRETAWAC o una molécula orgánica no peptídica. También describe y reivindica ensayos de escrutinio para la detección de antagonistas adicionales de la integrina \alpha5\beta1, así como aplicaciones terapéuticas y diagnósticas del antagonista de interés.

Una amplia variedad de otras enfermedades humanas está también caracterizada por el desarrollo no regulado de vasos sanguíneos, incluyendo enfermedades oculares tales como la degeneración macular y la retinopatía diabética. Además, numerosas enfermedades inflamatorias están asociadas también con una neovascularización incontrolada, tales como la artritis y la psoriasis (Varner y col., 1995).

Los nuevos vasos sanguíneos se desarrollan a partir de vasos preexistentes mediante un proceso fisiológico conocido como angiogénesis (Varner y col., 1995; Blood and Zetter, 1990; Weidner y col., 1992). Este complejo proceso requiere la cooperación de varias moléculas incluyendo factores de crecimiento, receptores de adherencia celular, enzimas degradadoras de la matriz y componentes de la matriz extracelular (Varner y col., 1995; Blood and Zetter, 1990; Weidner y col., 1992). De este modo, las terapias diseñadas para bloquear la angiogénesis pueden afectar al crecimiento de los tumores sólidos. De hecho, se ha proporcionado la clara evidencia de que el bloquear la neovascularización tumoral puede inhibir el crecimiento tumoral en diversos modelos animales, y los datos clínicos en humanos están empezando a apoyar también esta contienda [Varner, J. A., Brooks, P. C., y Cheresh, D. A. (1995), Cell Adh. Commun. 3, 367-374].

También se ha propuesto que la inhibición de la angiogénesis puede ser efectuada mediante (1) la inhibición de la liberación de "moléculas angiogénicas" tales como el \betaFGF (factor de crecimiento de fibroblastos), (2) la neutralización de moléculas angiogénicas, tal como mediante el empleo de anticuerpos anti-\betaFGF; y (3) la inhibición de la respuesta de las células endoteliales a los estímulos angiogénicos. Esta última estrategia ha recibido atención, y Folkman y col., Cancer Biology, 3: 89-96 (1992), han descrito varios inhibidores de la respuesta de las células endoteliales, incluyendo los inhibidores de la colagenasa, los inhibidores del recambio de la membrana del basamento, esteroides angiostáticos, inhibidores de la angiogénesis derivados de hongos, el factor 4 plaquetario, la trombospondina, fármacos para la artritis tales como la D-penicilamina y el tiomalato de oro, análogos de la vitamina D_{3}, interferón alfa y otros que pudiesen ser utilizados para inhibir la angiogénesis. Para inhibidores propuestos adicionales de la angiogénesis, ver Blood and Zetter, 1990; Moses y col., (1990), Science 248: 1.408-1.410; Ingber y col., (1988), Lab. Invest., 59: 44-51; y los Nº^{s} de Pat. U.S. 5.092.885, 5.112.946, 5.192.744 y 5.202.352.

Para bloquear la angiogénesis, muchos investigadores también se han concentrado en los factores de crecimiento y las citoquinas que inician la angiogénesis (Varner y col., 1995; Blood and Zetter, 1990; Weidner y col., 1992; Weidner y col., 1991; Brooks y col., 1995; Brooks y col., 1994; Brooks y col., 1997). Sin embargo, existe un gran número de diferentes factores de crecimiento y citoquinas que tiene la capacidad de estimular la angiogénesis. El beneficio terapéutico de bloquear una única citoquina puede tener solamente un beneficio limitado debido a esta redundancia. Por consiguiente, lo que se necesita es otras dianas antiangiogénicas para inhibir la angiogénesis y la proteólisis.

Sumario

Las células invasivas utilizan la interacción proteína-proteína, implicando a enzimas y receptores de integrinas, para localizar la actividad proteolítica en la superficie celular y favorecer el comportamiento celular invasivo. La presente invención contempla inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral utilizando antagonistas que elijan como diana la adherencia celular y la proteólisis de la matriz extracelular (MEC). Específicamente, la presente invención contempla inhibir la angiogénesis basado en el descubrimiento de un único mecanismo mediante el cual las células invasivas localizan la actividad proteolítica, la cual contribuye en la superficie celular.

Un aspecto de esta invención proporciona usos de un antagonista para la fabricación de un medicamento, para inhibir la angiogénesis, comprendiendo antagonistas que modifican las interacciones proteína-proteína que involucran a ciertas secuencias encontradas dentro de la enzima proteolítica MMP-9 y/o receptores de la integrina \beta1. Tales antagonistas pueden incluir, pero no se limitan a, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, que inmunorreacciona con la MMP-9 y el receptor de la integrina \beta1.

Todavía, otro aspecto de la invención contempla inhibir la angiogénesis, comprendiendo el poner en contacto un tejido con antagonistas de la adherencia celular y proteólisis de la matriz extracelular (MEC), tales como, pero no se limitan a, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, que inmunorreacciona con la MMP-9 y el receptor de la integrina \beta1.

Otro aspecto de la intención contempla inhibir un estado de enfermedad o angiogénesis en un tejido mediante, por ejemplo, administrar al tejido una composición constando de una cantidad, inhibidora de la angiogénesis, de un antagonista de la localización de la enzima proteolítica MMP-9 en la superficie celular. El estado de enfermedad al que se aplica la invención puede ser el crecimiento tumoral o la metástasis, la degeneración macular, la psoriasis, la restenosis en un tejido, etc.

El tejido a tratar puede ser cualquier tejido en el que sea deseable la inhibición de la angiogénesis, tal como un tejido enfermo donde esté ocurriendo neovascularización. Los tejidos ejemplares incluyen un tejido inflamado, tumores sólidos, metástasis, tejidos sufriendo restenosis, y otros.

También se proporcionan usos de un antagonista para la fabricación de un medicamento para detectar la angiogénesis, un tejido tumoral, metástasis, e invasión tumoral en un tejido, poniendo en contacto un antagonista de la invención con un tejido.

La invención también proporciona métodos para escrutar antagonistas de la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra los resultados de la purificación de la integrina \beta1, \alpha5\beta1, a partir de lisados de placenta utilizando el dominio de unión celular a fibronectina de 110 kD.

Figura 2: muestra los resultados del análisis zimográfico de la integrina \beta1, \alpha5\beta1, cuando \alpha5\beta1 y \alpha\mu\beta1 purificadas son separadas en geles de SDS-PAGE al 10% copolimerizados con gelatina.

Figura 3: muestra los resultados del análisis Western Blot de la integrina \beta1, \alpha5\beta1, cuando se separan integrinas \alpha5\beta1 y \alpha\mu\beta1 (1 \mug) purificadas.

Figura 4: muestra los resultados del ensayo de unión para MMP-9 recombinante uniéndose a la integrina \beta1, \alpha5\beta1, o proteína de control \beta-caseína.

Figura 5: muestra los resultados de experimentos en los que se incuba MMP-9 recombinante con células positivas y negativas a \alpha5\beta1.

Figura 6: muestra los resultados de experimentos para determinar la colocalización de la MMP-9 y la integrina \beta1, \alpha5\beta1, en vasos sanguíneos de tumores melanoma humanos.

Figura 7: muestra los resultados de experimentos para identificar péptidos sintéticos que se unen a la MMP-9. FRIP-1 es la ID SECUENCIA Nº 1, y AAA es el péptido AAA, el cual es la ID SECUENCIA Nº 2.

Figura 8A/8B: muestran los resultados de experimentos en los que el péptido FRIP-1 fue inyectado en embriones de pollo en los que se había inducido la angiogénesis.

Figura 9: muestra los resultados de experimentos para generar Mabs dirigidos contra el péptido sintético FRIP-1 (ID SECUENCIA Nº 1).

Figura 10: muestra los resultados de experimentos en los que se permitió que MMP-9 humana recombinante
(2 \mug/ml) se uniese en presencia o ausencia de Mabs FM155 o LM609.

Figura 11: muestra los resultados de experimentos para determinar los efectos de la administración sistémica de FM155 en el crecimiento de tumores melanoma.

Descripción detallada de la invención

Conforme a la presente invención, se ha descubierto que las interacciones proteína-proteína, que implican a ciertas secuencias dentro de la enzima proteolítica MMP-9 y/o receptores de la integrina \beta1, contribuyen a la angiogénesis y/o crecimiento tumoral localizando la actividad proteolítica en la superficie celular. De este modo, modificando tales interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias encontradas dentro de la MMP-9 y/o receptores de la integrina \beta1, se puede inhibir la angiogénesis y/o el crecimiento tumoral.

La interacción entre la MMP-9 y la integrina \beta1

En el estado fisiológico, la síntesis de tejidos conjuntivos está en equilibrio dinámico con la degradación de la matriz extracelular. Esa degradación es debida, en parte, a metaloproteinasas de matriz ("MMPs"), una familia de proteasas (enzimas) involucrada en la degradación y remodelación de tejidos conjuntivos. Los miembros de esta familia de enzimas endopeptidasas son secretadas como proenzimas por diversos tipos celulares que residen en o están asociados con el tejido conjuntivo, tales como fibroblastos, monocitos, macrófagos, células endoteliales, y células tumorales invasivas o metastáticas. La expresión de MMP es estimulada por factores de crecimiento y citoquinas en el entorno local de los tejidos, donde estas enzimas actúan para degradar específicamente los componentes proteicos de la matriz extracelular, tales como el colágeno, los proteoglicanos (núcleo proteico), la fibronectina y la laminina. Estos componentes ubicuos de la matriz extracelular están presentes en los revestimientos de las articulaciones, en los tejidos conjuntivos intersticiales, en las membranas del basamento y en el cartílago. Las MMPs comparten algunas propiedades, incluyendo la dependencia del zinc y calcio, la secreción como zimógenos, y una homología de secuencia de aminoácidos del 40-50%.

La excesiva degradación de la matriz extracelular por las MMPs está implicada en la patogénesis de muchas enfermedades de naturaleza tanto crónica como severa. Por ejemplo, numerosos estudios, como los evaluados en Exp. Opin. Invest. Drugs, 5, 323-335, (1996), han establecido que la expresión y activación de las MMPs son sucesos críticos en el crecimiento tumoral, invasión y metástasis. Además, se ha descubierto que la actividad de las MMPs es necesaria para la angiogénesis, la cual es necesaria para el crecimiento tumoral así como para otros estados patológicos tales como la degeneración macular.

Los miembros de esta familia de enzimas incluyen, pero no se limitan a, colagenasas (MMP-1), gelatinasas o colagenasas de tipo IV (MMP-2, MMP-9), matrilisina (MMP-7, PUMP-1) y estromelisinas (MMP-3).

De interés particular aquí, la gelatinasa MMP-9 es una enzima de 92 kD liberada por fagocitos mononucleares, neutrófilos, células epiteliales corneales, células tumorales, citotrofoblastos y queratinocitos.

Muchos procesos fisiológicos requieren que las células lleguen a estar en contacto directo con otras células y/o matriz extracelular. Tales acontecimientos de adherencia pueden ser necesarios para la activación celular, la migración, la proliferación y la diferenciación. Las interacciones célula-célula y célula-matriz están mediadas mediante varias familias de moléculas de adherencia celular (MACs) que incluyen las selectinas, las integrinas, las caderinas y las inmunoglobulinas. Las MACs juegan un papel esencial en los procesos tanto normales como patofisiológicos. Por lo tanto, la elección de MACs específicas y relevantes en ciertos estados de enfermedad, sin interferir con las funciones celulares normales, es esencial para un agente terapéutico eficaz y seguro que inhiba las interacciones célula-célula y célula-matriz.

De las diversas MACs discutidas antes, la superfamilia de integrinas se encuentra en diversas combinaciones en casi todos los tipos de células mamíferas [para revisiones ver: E. C. Butcher, Cell, 67, 1.033 (1991); T. A. Springer, Cell, 76, 301 (1994); D. Cox y col., "The Pharmacology of the Integrins", Medicinal Research Rev. 145 (1994) y V. W. Engleman y col., "Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets" en Ann. Repts. in Medicinal Chemistry, vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, pág. 191].

Las integrinas representan una de las superfamilias de receptores de adherencia mejor caracterizadas. Las integrinas son heterodímeros de glicoproteína que contienen una subunidad alfa (\alpha) y una beta (\beta) asociadas no covalentemente. Las subunidades de integrina son proteínas transmembranales que contienen un dominio extracelular para interaccionar con una matriz extracelular o componente extracelular, un dominio transmembranal extendiéndose sobre la membrana celular y un dominio citoplasmático para interaccionar con uno o más componentes citoesqueletales.

Existen catorce subunidades \alpha y ocho subunidades \beta conocidas que se pueden emparejar para formar al menos veinte moléculas de integrina diferentes. Varias cadenas \alpha de integrinas son capaces de emparejarse con un tipo de cadena \beta para formar una subfamilia de cadena \beta.

De interés particular aquí es la subfamilia beta sub-1 (\beta1), la cual incluye siete miembros (conocidos también como las proteínas VLA: \alpha1\beta1-\alpha7\beta1). Como muestran los ejemplos de abajo, se puede inhibir la angiogénesis y los estados de enfermedad utilizando antagonistas para modificar las interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias de aminoácidos de las integrinas \beta1, siendo la integrina \alpha5\beta1 un ejemplo de tales integrinas. Por toda esta especificación, los términos integrinas \beta1 e integrinas conteniendo \beta1 son utilizados intercambiablemente.

Antagonistas de la invención

Los ejemplos proporcionados aquí establecen que la MMP-9 se une directamente con la integrina \beta1, integrina \alpha5\beta1. De este modo, las células que carezcan del gen para fabricar integrinas \beta1 tienen una capacidad considerablemente reducida para unirse a la MMP-9. Los ejemplos también sugieren que la MMP-9 y la integrina \alpha5\beta1 pueden colocalizarse en la superficie de una célula y vasos sanguíneos, porque indican que la MMP-9 y la integrina \alpha5\beta1 están íntimamente asociadas dentro del compartimento vascular humano así como en las mismas células tumorales.

Además, un análisis de las secuencias de aminoácidos de la MMP-9 e integrina \alpha5\beta1 conduce a un polipéptido identificado como FRIP-1 (ID SECUENCIA Nº 1) para mediar la interacción entre estas dos proteínas. El FRIP-1 se une a la MMP-9, pero un péptido de control AAAA (ID SECUENCIA Nº 3) se une con una afinidad sustancialmente reducida a la MMP-9. Se encontró que el FRIP-1 inhibe la angiogénesis.

Más aun, como muestran los ejemplos, el FRIP-1 se puede utilizar para identificar antagonistas para modificar las interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias de aminoácidos dentro de la MMP-9 y/o integrina \alpha5\beta1. De este modo, el Mab FM155 fue identificado inyectando a ratones con FRIP-1 conjugado a una proteína soporte. Se encontró que el Mab FM155 tenía una alta especificidad por el FRIP-1, pero no reaccionaba con el péptido de control AAAA: ID SECUENCIA Nº 3.

Los ejemplos ilustran que el Mab FM155 pueden inhibir potencialmente el crecimiento tumoral in vivo. De este modo, el Mab FM155 modifica las interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias de aminoácidos dentro de la MMP-9 y/o integrina \alpha5\beta1.

Los antagonistas de la invención pueden ser cualquier tipo de molécula, incluyendo, pero no se limitan a, péptidos, polipéptidos, moléculas no peptídicas, por ejemplo moléculas orgánicas y oligonucleótidos, proteínas, enzimas, anticuerpos monoclonales y policlonales, etc.

Los antagonistas de la invención se unen al FRIP-1, pero se unen al péptido de control AAAA con una afinidad sustancialmente reducida. Se pueden determinar las afinidades aparentes mediante métodos tales como un ensayo inmunoabsorbente por unión enzimática (ELISA) o cualquier otra técnica familiar para uno especializado en la técnica. Se pueden medir afinidades auténticas mediante técnicas conocidas por un especializado en la técnica.

Además, como conocería uno con habilidad normal en la técnica, otros antagonistas dirigidos específicamente hacia el epítopo definido por el Mab FM155 pueden tener actividades antiangiogénicas y antitumorales similares. Tales antagonistas incluyen Mabs bloqueadores de funciones adicionales, Mabs humanizados, Mabs quiméricos, Mabs conjugados con toxinas, anticuerpos policlonales, antagonistas peptídicos pequeños dirigidos hacia este epítopo, así como miméticos orgánicos y no peptídicos del epítopo definido por el FM155. Además, los epítopos definidos por el anticuerpo monoclonal FM155 pueden funcionar ellos mismos como potentes compuestos antiangiogénicos y/o antitumorales. Más aun, se pueden utilizar los mismos péptidos conteniendo epítopos identificados por un antagonista. De este modo, la invención puede aceptar varias formas de realización.

Por ejemplo, una forma de realización de la invención es un antagonista que modifica específicamente las interacciones proteína-proteína, en donde las interacciones proteína-proteína comprenden interacciones entre al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una primera proteína y al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una segunda proteína. La primera proteína de tal antagonista puede ser MMP-9 o puede ser una integrina conteniendo \beta1. Alternativamente, la primera proteína puede ser MMP-9 y la segunda proteína puede ser una integrina conteniendo \beta1. Además, en tal caso, las interacciones proteína-proteína pueden ser tales que originen que la MMP-9 se una a la integrina conteniendo \beta1.

Alternativamente, cuando la primera proteína sea una integrina conteniendo \beta1, esta puede ser la integrina \alpha5\beta1, o cuando la segunda proteína sea una integrina conteniendo \beta1, ésta puede ser la integrina \alpha5\beta1.

En una forma de realización, el antagonista es tal que la interacción proteína-proteína origine la colocalización de la primera proteína y la segunda proteína en una superficie celular o en un vaso sanguíneo.

Un antagonista de la invención es un antagonista que inhibe la angiogénesis, el crecimiento tumoral, o la metástasis. En el caso general, puede ser un antagonista que inhiba una enfermedad. Ejemplos de tales enfermedades son la psoriasis, la degeneración macular, una enfermedad neurológica, y la restenosis en un tejido.

En otra forma de realización, el antagonista de la invención es un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, puede ser el Mab FM155, puede ser un anticuerpo monoclonal teniendo la especificidad de unión para al menos una diana del anticuerpo monoclonal FM155, un anticuerpo monoclonal humanizado o modificado químicamente, o un fragmento de un anticuerpo monoclonal. Alternativamente, podría ser un anticuerpo policlonal.

En una forma de realización, el antagonista de la invención está conjugado a agentes citotóxicos o citostáticos.

En otra forma de realización, la invención es un antagonista que se une específicamente con la ID SECUENCIA Nº 1, pero se une a la ID SECUENCIA Nº 3 con una afinidad sustancialmente reducida. Tal antagonista inhibe la angiogénesis y el crecimiento tumoral. En esta forma de realización, el antagonista es un polipéptido, por ejemplo una proteína, o es un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la cual consta la ID SECUENCIA Nº 1. El polipéptido puede ser un anticuerpo monoclonal, por ejemplo el FM155.

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Antagonistas anticuerpo

La presente invención contempla antagonistas en forma de anticuerpos que, en el caso general, modifican las interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias de aminoácidos dentro de la MMP-9 y/o integrina \beta1. Tales anticuerpos podrían abarcar anticuerpos que se unen a un péptido con una secuencia polipeptídica, ID SECUENCIA Nº 1, pero no se unen a una secuencia peptídica de control de ID SECUENCIA Nº 3. Tales antagonistas anticuerpo también pueden inhibir la angiogénesis.

Los anticuerpos de la invención pueden ser monoclonales o policlonales. En una forma de realización, los anticuerpos utilizados son monoclonales. Un anticuerpo monoclonal de esta invención consta de moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionan con la MMP-9 y la integrina \alpha5\beta1.

Los anticuerpos monoclonales preferidos, que se unen preferencialmente al FRIP-1, incluyen anticuerpos monoclonales mencionados como FM155.

Los antagonistas anticuerpo de la invención pueden ser generados según algunos métodos conocidos por un especializado en la técnica. Por ejemplo, un animal puede ser inmunizado con FRIP-1 o un fragmento del mismo. Los anticuerpos así generados pueden ser seleccionados tanto por su capacidad para unirse a FRIP-1 (ID SECUENCIA Nº 1) como por no unirse al control ID SECUENCIA Nº 3.

El término "anticuerpo o molécula de anticuerpo", en las diversas formas gramaticales, es utilizado aquí como nombre colectivo que se refiere a una población de moléculas de inmunoglobulina y/o porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, esto es, moléculas que contengan un sitio de combinación del anticuerpo o paratopo.

Un "sitio de combinación del anticuerpo" es esa porción estructural de una molécula de anticuerpo compuesta de regiones variables e hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras que se unen específicamente al antígeno.

Anticuerpos ejemplares para su uso en la presente invención son moléculas de inmunoglobulinas intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contengan el paratopo, incluyendo aquellas porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')_{2} y F(v), y mencionadas también como fragmentos de anticuerpo.

En otra forma de realización preferida, la invención contempla una molécula de inmunoglobulina truncada comprendiendo un fragmento Fab derivado de un anticuerpo monoclonal de esta invención. El fragmento Fab, careciendo del receptor Fc, es soluble y proporciona ventajas terapéuticas en la vida media en suero, y ventajas diagnósticas en los modos de utilizar el fragmento Fab soluble. La preparación de un fragmento Fab soluble es conocida generalmente en las técnicas inmunológicas, y se puede realizar mediante varios métodos.

Por ejemplo, las porciones (fragmentos) Fab y F(ab')_{2} de anticuerpos se preparan mediante la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, sobre anticuerpos sustancialmente intactos por métodos que son bien conocidos. Ver, por ejemplo, la Patente U.S. Nº 4.342.566 según Theofilopolous y Dixon. Las porciones de anticuerpo Fab son también bien conocidas, y son producidas a partir de porciones F(ab')_{2}, seguido por reducción de los enlaces disulfuro que unen las dos porciones de la cadena pesada con mercaptoetanol, y seguido por alquilación del resultante mercaptano de las proteínas con un reactivo tal como yodoacetamida. Se prefiere un anticuerpo que contenga moléculas de inmunoglobulina intactas, y se utilizan aquí como ejemplo ilustrativo.

La frase "anticuerpo monoclonal", en sus diversas formas gramaticales, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen únicamente una especie de sitio de combinación del anticuerpo, capaz de inmunorreaccionar con epítopo concreto. Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener una molécula de anticuerpo teniendo una pluralidad de sitios de combinación del anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un epítopo diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico.

Un anticuerpo monoclonal está compuesto, típicamente, de anticuerpos producidos por clones de una única célula llamada hibridoma que secreta (produce) solamente una clase de molécula de anticuerpo. La célula hibridoma se forma fusionando una célula productora de anticuerpos y un mieloma u otra línea celular autoperpetuadora, La preparación de tales anticuerpos fue descrita primero por Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). Están descritos métodos adicionales por Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987). Los sobrenadantes del hibridoma así preparados pueden ser escrutados para la presencia de moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionen con la MMP-9 y/o la integrina \alpha5\beta1.

Brevemente, para formar el hibridoma a partir del que se produce la composición de anticuerpo monoclonal, se fusiona un mieloma, u otra línea celular autoperpetuadora, con linfocitos obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con FRIP-1.

Se prefiere que la línea celular de mieloma utilizada para preparar un hibridoma sea de la misma especie que los linfocitos. Típicamente, un ratón de la cepa 129 GIX^{+} es el mamífero preferido. Los mielomas de ratón apropiados para su uso en la presente invención abarcan las líneas celulares P3X63-Ag8.653 y Sp2/0-Ag14, sensibles a la hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), que están disponibles por la American Type Culture Collection, Rockville, Md., bajo las denominaciones CRL 1580 y CRL 1581, respectivamente.

Los esplenocitos se fusionan típicamente con células de mieloma utilizando polietilenglicol (PEG) 1500. Los híbridos fusionados son seleccionados por su sensibilidad a un medio de cultivo selectivo, tal como medio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de esta invención son identificados utilizando el ensayo inmunoabsorbente por unión enzimática (ELISA) descrito en los Ejemplos.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención también puede ser producido iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal comprendiendo un medio nutriente que contiene un hibridoma que secrete moléculas de anticuerpo de la especificidad apropiada. El cultivo se mantiene bajo condiciones, y durante un tiempo suficiente, para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo en el medio. Después, se recoge el medio conteniendo el anticuerpo. Luego, las moléculas de anticuerpo pueden ser aisladas adicionalmente por técnicas bien conocidas.

Los medios útiles para la preparación de estas composiciones son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente, e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones endogámicos y otros. Un medio sintético ejemplar es el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM); Dulbecco y col., Virol. 8: 396, 1959) complementado con 4'5 g/l de glucosa, 20 nM de glutamina, y 20% de suero de ternero fetal. Una cepa de ratón endogámico ejemplar es la Balb/c.

También se conocen bien otros métodos para producir un anticuerpo monoclonal, una célula hibridoma, o un cultivo celular de hibridoma. Ver, por ejemplo, el método para aislar anticuerpos monoclonales, a partir de un repertorio inmunológico, descrito por Sastry y col., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5.728-5.732; y Huse y col., (1989), Science, 246: 1.275-1.281.

También contemplada es la célula hibridoma, y cultivos conteniendo células hibridoma que producen anticuerpos monoclonales de esta invención. Particularmente preferida es una línea celular de hibridoma que secrete el anticuerpo monoclonal FM155.

También se contempla un anticuerpo monoclonal que tenga las características de inmunorreacción del FM155.

Un especializado en la técnica sabrá cómo determinar si un anticuerpo monoclonal tiene una especificidad equivalente (características de inmunorreacción) como un anticuerpo monoclonal de esta invención, averiguando si aquel evita que éste se una a una molécula diana preseleccionada. Si el anticuerpo monoclonal a ensayar compite con el anticuerpo monoclonal de la invención, como se demuestra por una disminución en la unión del anticuerpo monoclonal de la invención en ensayos de competición estándar para unirse a la molécula diana cuando está presente en la fase sólida, entonces es probable que los dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo epítopo o a uno estrechamente relacionado.

Una manera adicional de determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la invención es determinar la secuencia de residuos de aminoácidos de las regiones CDR de los anticuerpos en cuestión. Las moléculas de anticuerpo que tengan secuencias de residuos de aminoácidos idénticas, o funcionalmente equivalentes, en sus regiones CDR tienen la misma especificidad de unión. En la técnica se conocen métodos para secuenciar polipéptidos. Esto no insinúa que anticuerpos con regiones CDR diferentes no se puedan unir al mismo epítopo.

La inmunoespecificidad de un anticuerpo, su capacidad de unión a la molécula diana, y la afinidad acompañante que el anticuerpo manifiesta por el epítopo, están definidos por el epítopo con el que el anticuerpo inmunorreacciona. La especificidad de epítopo está definida, al menos en parte, por la secuencia de residuos de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina anticuerpo, y en parte por la secuencia de residuos de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera.

El empleo del término "teniendo la especificidad de unión de" indica que los anticuerpos monoclonales equivalentes compiten por la unión a un epítopo diana preseleccionado.

Los anticuerpos monoclonales humanizados ofrecen ventajas particulares sobre los anticuerpos monoclonales murinos, particularmente con tal que se puedan utilizar terapéuticamente en humanos. Específicamente, los anticuerpos humanos no son eliminados de la circulación tan rápidamente como los antígenos "extraños", y no activan el sistema inmune de la misma manera que los antígenos extraños y los anticuerpos extraños. En la técnica se conocen bien, en general, métodos para preparar anticuerpos "humanizados", y pueden ser aplicados fácilmente a los anticuerpos de la presente invención.

De este modo, la invención contempla, en una forma de realización, un anticuerpo monoclonal de esta invención que es humanizado por inserción para introducir componentes del sistema inmune humano, sin interferir sustancialmente con la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno.

El anticuerpo de la invención también puede ser un anticuerpo completamente humano, tal como aquellos generados, por ejemplo, por selección a partir de una librería de anticuerpos, desplegados en fagos, expresando anticuerpos humanos de cadena sencilla o cadena doble tales como los descritos en de Haard, H. J. y col., (1999), J. Biol. Chem. 274: 18.218-30, y en Winter, G. y col., (1994), Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55.

Antagonistas peptídicos/polipeptídicos

Los antagonistas del método de la invención también pueden ser polipéptidos o péptidos. El término polipéptido se refiere a una secuencia de 3 o más aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos entre el grupo alfa-amino y el grupo carboxi de residuos de aminoácidos contiguos, e incluye dentro de su significado la clase de compuestos conocidos como proteínas. El término péptido, como se utiliza aquí, se refiere a una serie lineal de dos o más conectados entre sí como en un polipéptido.

En una forma de realización, el método de la invención contempla antagonistas en forma de polipéptidos. Un antagonista polipeptídico de la localización de la MMP-9 en la superficie celular puede ser cualquier péptido o polipéptido capaz de romper la localización de la MMP-9 en la superficie celular o, más en general, de modificar las interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias de aminoácidos dentro de la MMP-9 y/o integrina \beta1.

La identificación de péptidos antagonistas preferidos, que tengan selectividad por la MMP-9 o integrinas \beta1, puede ser fácilmente hecha en una típica inhibición de ensayo de unión, tal como el ensayo ELISA descrito en los Ejemplos.

Los antagonistas peptídicos y polipeptídicos pueden ser generados por varias técnicas conocidas por un especializado en la materia. Por ejemplo, un sistema de dos híbridos [por ejemplo, Fields, S. (1989), Nature 340: 245-6] puede utilizar un fragmento de MMP-9 como "cebo" para seleccionar antagonistas proteicos a partir de una librería que se una al FRIP-1. La librería de antagonistas potenciales puede ser obtenida, por ejemplo, a partir de una genoteca de ADNc. En otra forma de realización, los antagonistas potenciales pueden ser variantes de proteínas de unión a MMP-9 conocidas. Tales proteínas pueden ser mutagenizadas aleatoriamente o sometidas a recombinación genética u otras técnicas disponibles para generar diversidad de secuencias.

Los antagonistas peptídicos y polipeptídicos del método de la invención también pueden ser generados por técnicas de evolución molecular. Se pueden generar bibliotecas de proteínas por mutagénesis, recombinación genética u otras técnicas disponibles para generar diversidad molecular. Se pueden seleccionar combinaciones de proteínas, que representen numerosas variantes, por su capacidad para unirse al FRIP-1, por ejemplo pasando tales combinaciones de proteínas sobre una matriz sólida a la que se ha unido FRIP-1. La elución con gradientes de sal, por ejemplo, puede proporcionar la purificación de las variantes con afinidad por el FRIP-1. También se puede incluir una etapa de selección negativa, por lo que tales combinaciones son pasadas sobre una matriz sólida a la que se ha unido el péptido de control AAAA (ID SECUENCIA Nº 3). El filtrado contendrá aquellas variantes dentro de la combinación que tengan una afinidad reducida por el AAAA.

Los antagonistas peptídicos y polipeptídicos del método de la invención también pueden ser generados por despliegue en fagos. Un péptido o proteína aleatorios pueden ser expresados en la superficie de una partícula de fagómido como fusión con una proteína de cubierta del fago. Están ampliamente disponibles técnicas de despliegue monovalente en fagos [ver, por ejemplo, Lowman H. B. y col., (1991), Biochemistry 30: 10.832-8]. Las bibliotecas de péptidos o de proteínas aleatorios que expresan fagos pueden ser separadas con una matriz sólida a la que se ha unido la molécula AAAA. El fago que queda no se une a AAAA, o se une a AAAA con una afinidad sustancialmente reducida. Luego, el fago es separado frente a una matriz sólida a la que se ha unido FRIP-1. Los fagos unidos son aislados y separados de la matriz sólida mediante un cambio en las condiciones de la solución o, para una construcción diseñada adecuadamente, mediante escisión proteolítica de una región conectora que conecta la proteína de cubierta del fago con la biblioteca de péptidos o proteínas aleatorios. El fago aislado puede ser secuenciado para determinar la identidad del antagonista seleccionado.

En otra forma de realización, un polipéptido incluye cualquier análogo, fragmento o derivado químico de un polipéptido cuya secuencia de residuos de aminoácidos sea mostrada aquí, con tal que el polipéptido sea un antagonista de FRIP-1 pero no del péptido de control de ID SECUENCIA Nº 3. Por lo tanto, un polipéptido presente puede ser sometido a diferentes cambios, sustituciones, inserciones y supresiones, donde tales cambios proporcionen ciertas ventajas en su uso. Con respecto a esto, un polipéptido antagonista del FRIP-1 se corresponde, más bien es idéntico a, con la secuencia de un péptido referido donde se hacen uno o más cambios y mantiene la capacidad para funcionar como antagonista en uno o más de los ensayos definidos aquí.

De este modo, un polipéptido puede estar en cualquiera de varias formas de derivados peptídicos que incluyen amidas, conjugados con proteínas, péptidos ciclados, péptidos polimerizados, análogos, fragmentos, péptidos modificados químicamente, y derivados semejantes.

Otros antagonistas

Los antagonistas del método de la invención también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, tales como esos productos naturales, o aquellos compuestos sintetizados mediante síntesis orgánica convencional o síntesis orgánica combinatoria. Los compuestos se pueden ensayar por su capacidad para modificar las interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias de aminoácidos dentro de la MMP-9 y/o integrina \beta1. Los compuestos también son seleccionados por su reducida afinidad por el péptido de control AAAA, ID SECUENCIA Nº 3.

Los antagonistas del método de la invención también pueden ser compuestos no peptídicos. Los compuestos no peptídicos apropiados abarcan, por ejemplo, oligonucleótidos. Oligonucleótidos, como se utiliza aquí, se refiere a cualquier materia heteropolimérica conteniendo purina, pirimidina y otras bases aromáticas. Los oligonucleótidos de ADN y ARN son apropiados para su uso con la invención, como lo son oligonucleótidos con modificaciones en el azúcar (por ejemplo, ribosas 2'-alquiladas) y en el esqueleto (por ejemplo, oligonucleótidos fosforotioato). Los oligonucleótidos pueden presentar frecuentemente bases purina y pirimidina tales como adenina, timina, guanina, citidina y uridina, así como bases modificadas dentro de la porción del anillo heterocíclico (por ejemplo, 7-deazaguanina) o en posiciones exocíclicas. Los oligonucleótidos también abarcan heteropolímeros con distintas estructuras que también presentan bases aromáticas, incluyendo ácidos nucleicos de poliamida y otros.

Un antagonista oligonucleotídico del método de la invención puede ser generado mediante algunos métodos conocidos por un especializado en la técnica. En una forma de realización, se genera una combinación de oligonucleótidos conteniendo un gran número de secuencias. Las combinaciones se pueden generar, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida utilizando mezclas de monómeros en una etapa de elongación. La combinación de oligonucleótidos es clasificada pasando una solución, conteniendo la combinación, sobre una matriz sólida a la que se ha fijado FRIP-1 o fragmento del mismo. Las secuencias de la combinación que se unen a la MMP-9 son retenidas en la matriz sólida. Estas secuencias son eluídas con una solución de concentración salina o pH diferentes. Las secuencias seleccionadas son sometidas a una segunda etapa de selección. La combinación seleccionada es pasada sobre una segunda matriz sólida a la que se ha fijado la ID SECUENCIA Nº 3. La columna retiene aquellas secuencias que se unen a la ID SECUENCIA Nº 3; enriqueciendo de ese modo la combinación con secuencias específicas para FRIP-1. La combinación puede ser amplificada y, si fuese necesario, mutagenizada y repetido el proceso hasta que la combinación muestre las características de un antagonista de la invención. Los antagonistas individuales pueden ser identificados secuenciando miembros de la combinación oligonucleotídica, normalmente después de clonar dichas secuencias dentro de un organismo huésped tal como E. coli.

Ensayos de unión para identificar antagonistas

La invención también proporciona métodos de ensayo para identificar antagonistas candidatos para su uso conforme a la invención. En estos métodos de ensayo, los antagonistas candidatos son evaluados por su capacidad para unirse tanto al FRIP-1 como al péptido de control AAAA, y además pueden ser evaluados por su potencia en inhibir la angiogénesis en un tejido.

Elisa

El primer ensayo mide la unión de los antagonistas al FRIP-1 y al péptido de control AAAA en la fase sólida mediante ELISA. El ensayo también se puede utilizar para identificar compuestos que manifiesten especificidad para el FRIP-1 pero no para el péptido de control AAAA. El ensayo de especificidad se conduce ejecutando ELISAs en paralelo, donde se escruta en la actualidad en cámaras de ensayo independientes para la capacidad para unirse al FRIP-1 y al péptido de control AAAA.

Los antagonistas que rompen la interacción entre la MMP-9 y la integrina \alpha5\beta1 también pueden ser identificados por su capacidad para competir por la unión con un antagonista de la invención. Por ejemplo, se pueden escrutar supuestos antagonistas monitorizando su efecto en la afinidad de un antagonista conocido, tal como el FM155, en un ensayo de unión tal como un ELISA. Tales antagonistas tienen probablemente la misma especificidad que el FM155, y reconocen el mismo epítopo críptico. Los supuestos antagonistas seleccionados mediante tal método de escrutinio pueden unirse a la MMP-9 o a la integrina \alpha5\beta1 o al antagonista. Los antagonistas se pueden seleccionar, a partir de los supuestos antagonistas, mediante ensayos de unión convencionales para determinar aquellos que se unen al epítopo de la MMP-9 o de la integrina \alpha5\beta1, pero no al antagonista conocido.

A continuación están algunas formas de realización de la invención que se pueden utilizar para identificar antagonistas candidatos.

En una forma de realización, la invención es un método para escrutar antagonistas de la MMP-9 comprendiendo: a) proporcionar un supuesto antagonista; b) medir una primera afinidad de dicho supuesto antagonista por su unión a la MMP-9; c) medir una segunda afinidad de la ID SECUENCIA Nº 3 por su unión a la MMP-9; y d) seleccionar dicho supuesto antagonista como antagonista de la MMP-9 si dicha segunda afinidad es sustancialmente menor que dicha primera afinidad. En una versión de esta forma de realización, el supuesto antagonista es un compuesto no peptídico, por ejemplo un compuesto orgánico pequeño o un oligonucleótido. En otra versión, el supuesto antagonista es un polipéptido, un péptido lineal o un péptido cíclico. Alternativamente, el supuesto antagonista es un anticuerpo, el cual podría ser un anticuerpo monoclonal o policlonal.

En una forma de realización preferida de este método, dicha primera y dicha segunda afinidades son medidas mediante un ensayo inmunoabsorbente por unión enzimática.

En una forma de realización particular, la segunda afinidad es aproximadamente 3 veces menor que la primera afinidad. Alternativamente, la segunda afinidad es aproximadamente 5 veces menor que la primera afinidad. En una forma de realización adicional de la invención, la segunda afinidad es aproximadamente 10 veces menor que la primera afinidad.

En una forma de realización, la invención es un método para escrutar antagonistas de la integrina \beta1 comprendiendo: a) proporcionar un supuesto antagonista; b) medir una primera afinidad de dicho supuesto antagonista por su unión a una integrina \beta1; c) medir una segunda afinidad de la ID SECUENCIA Nº 3 por su unión a dicha integrina \beta1; y d) seleccionar dicho supuesto antagonista como antagonista de la integrina \beta1 si dicha segunda afinidad es sustancialmente menor que dicha primera afinidad. En una versión de esta forma de realización, el supuesto antagonista es un compuesto no peptídico, por ejemplo un compuesto orgánico pequeño o un oligonucleótido. En otra versión, el supuesto antagonista es un polipéptido, un péptido lineal o un péptido cíclico. Alternativamente, el supuesto antagonista es un anticuerpo, el cual podría ser un anticuerpo monoclonal o policlonal.

En una forma de realización preferida de este método, dicha primera y dicha segunda afinidades son medidas mediante un ensayo inmunoabsorbente por unión enzimática.

En una forma de realización particular, la segunda afinidad es aproximadamente 3 veces menor que la primera afinidad. Alternativamente, la segunda afinidad es aproximadamente 5 veces menor que la primera afinidad. En una forma de realización adicional de la invención, la segunda afinidad es aproximadamente 10 veces menor que la primera afinidad.

Ensayos de angiogénesis

Los antagonistas de la invención también se pueden ensayar por su capacidad para modular al angiogénesis en un tejido. Para monitorizar tales efectos, se puede utilizar cualquier ensayo apropiado conocido por un especializado en la técnica. Aquí, se describen varias de tales técnicas.

Por ejemplo, un ensayo mide la angiogénesis en la membrana corioalantoidea (MCA) de pollo, y es mencionado como ensayo MCA. El ensayo MCA ha sido descrito detalladamente por otros, y además ha sido utilizado para medir la angiogénesis y la neovascularización de tejidos tumorales. Ver Ausprunk y col., Am. J. Pathol., 79: 597-618 (1975), y Ossonski y col., Cancer Res., 40: 2.300-2.309 (1980).

El ensayo MCA es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo porque está ocurriendo la neovascularización del tejido total, y están creciendo vasos sanguíneos reales del embrión de pollo dentro de la MCA o dentro del tejido cultivado sobre la MCA.

Como se demuestra aquí, el ensayo MCA ilustra la inhibición de la neovascularización basada en la cantidad y extensión del crecimiento de nuevos vasos. Además, es fácil monitorizar el crecimiento de cualquier tejido trasplantado sobre la MCA, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es particularmente útil porque es un control interno de la toxicidad en el sistema de ensayo. El embrión de pollo es expuesto a cualquier reactivo de ensayo y, por lo tanto, la salud del embrión es una indicación de la toxicidad.

Un segundo ensayo que mide la angiogénesis es el modelo del ojo de conejo in vivo, y es mencionado como el ensayo del ojo de conejo. El ensayo del ojo de conejo ha sido descrito detalladamente por otros, y además ha sido utilizado para medir la angiogénesis y la neovascularización en presencia de inhibidores angiogénicos tales como la talidomida. Ver D'Amato y col., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 4.082-4.085.

El ensayo del ojo de conejo es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo porque el proceso de neovascularización, ejemplificado por los vasos sanguíneos de conejo que crecen desde el borde de la córnea hacia la córnea, es fácilmente visualizado a través de la córnea del ojo transparente naturalmente. Adicionalmente, se puede monitorizar fácilmente, con el tiempo, la amplitud y cantidad de estimulación o inhibición de la neovascularización o regresión de la neovascularización.

Finalmente, el conejo es expuesto a cualquier reactivo de ensayo y, por lo tanto, la salud del embrión es una indicación de la toxicidad.

Un cuarto ensayo mide la angiogénesis en el modelo quimérico ratón/humano, y es mencionado como el ensayo de ratón quimérico. El ensayo ha sido descrito detalladamente por otros, y además ha sido descrito aquí para medir la angiogénesis, la neovascularización y la regresión de tejidos tumorales. Ver Yan y col., (1993), J. Clin. Invest. 91: 986-996.

El ensayo de ratón quimérico es un modelo de ensayo útil para la angiogénesis in vivo porque los injertos de piel trasplantados se parecen fielmente a piel humana normal histológicamente, y está ocurriendo la neovascularización del tejido total en donde los vasos sanguíneos humanos reales están creciendo desde la piel humana injertada hacia el tejido tumoral humano en la superficie de la piel humana injertada. El origen de la neovascularización dentro del injerto humano puede ser demostrado mediante tinción inmunohistoquímica de la neovasculatura con marcadores de células endoteliales específicos para humanos.

El ensayo de ratón quimérico demuestra la regresión de la neovascularización basado en la cantidad y amplitud de la regresión del crecimiento de nuevos vasos. Además, es fácil monitorizar los efectos en el crecimiento de cualquier tejido trasplantado en la piel injertada, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es útil porque es un control interno de la toxicidad en el sistema de ensayo. El ratón quimérico es expuesto a cualquier reactivo de ensayo y, por lo tanto, la salud del embrión es una indicación de la toxicidad.

Métodos para la inhibición de la angiogénesis

La invención proporciona el uso de un antagonista para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis en un tejido, y de ese modo, inhibiendo acontecimientos en el tejido que dependen de la angiogénesis. Generalmente, el uso comprende el administrar al tejido una composición constando de una cantidad, inhibidora de la angiogénesis, de un antagonista que modifique las interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias de aminoácidos dentro de la MMP-9 y/o integrinas \beta1.

Como se describió previamente, la angiogénesis abarca diversos procesos que implican la neovascularización de un tejido incluyendo el "brote", la vasculogénesis, o la ampliación de los vasos, todos los cuales procesos de la angiogénesis implican la rotura del colágeno de la matriz extracelular en los vasos sanguíneos. Con la excepción de la curación de heridas traumáticas, la formación del cuerpo lúteo y la embriogénesis, se cree que la mayoría de los procesos de la angiogénesis están asociados con procesos de enfermedad, y por lo tanto, los usos son selectivos para la enfermedad.

Existen varias enfermedades en las que se cree que es importante la angiogénesis, mencionadas como enfermedades angiogénicas, incluyendo, pero no se limitan a, trastornos inflamatorios tales como la inflamación inmune y no inmune, el reumatismo articular crónico y la psoriasis, trastornos asociados con la invasión inapropiada o inoportuna de los vasos tales como la retinopatía diabética, el glaucoma neovascular, la restenosis, la proliferación capilar en placas ateroscleróticas y la osteoporosis, y trastornos asociados con el cáncer tales como los tumores sólidos, la metástasis de tumores sólidos, los angiofibromas, la fibroplasia retrolental, los hemangiomas, el sarcoma de Kaposi y otros cánceres por el estilo que requieran neovascularización para mantener el crecimiento tumoral. Otros tumores apropiados abarcan el melanoma, el carcinoma, el sarcoma, el fibrosarcoma, el glioma y el astrocitoma.

De este modo, los métodos que inhiben la angiogénesis en un tejido enfermo mejoran los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, pueden contribuir a la curación de la enfermedad. En una forma de realización, la invención contempla la inhibición de la angiogénesis, per se, en un tejido.

Como se describe aquí, cualquier tejido u órgano compuesto de tejidos organizados puede soportar la angiogénesis en condiciones de enfermedad, incluyendo la piel, el músculo, el intestino, el tejido conjuntivo, las articulaciones, los huesos y tejido semejante en el que los vasos sanguíneos puedan invadir con los estímulos angiogénicos. Tejido, como se utiliza aquí, también abarca todos los fluidos corporales, secreciones y otros, tales como el suero, sangre, fluido cerebroespinal, plasma, orina, líquido sinovial, humor vítreo.

Así, en una forma de realización relacionada, un tejido a tratar es un tejido inflamado y la angiogénesis a inhibir es la angiogénesis del tejido inflamado donde existe una neovascularización del tejido inflamado. En esta clase, el uso de la invención contempla la inhibición de la angiogénesis en tejidos artríticos, tales como en un paciente con reumatismo articular crónico, en tejidos inflamados inmunes o no inmunes, en tejido psoriático y otros.

El paciente tratado es convenientemente un paciente humano, aunque se puede comprender que los principios de la invención indican que la invención es eficaz con respecto a todos los mamíferos, los cuales se pretende que estén incluidos en el término "paciente". En este contexto, se entiende que un mamífero incluya cualquier especie mamífera en la que sea deseable el tratamiento de enfermedades asociadas con la angiogénesis, particularmente especies mamíferas agrícolas y domésticas. Tal paciente puede ser, por ejemplo, un cerdo, una vaca, un caballo, una cabra, una oveja, un mulo, un burro, un perro, un gato, un conejo, un ratón y una rata.

En otra forma de realización relacionada, el tejido contemplado es un tejido retinal de un paciente con retinopatía diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular, y la angiogénesis a inhibir es angiogénesis del tejido retinal donde existe neovascularización del tejido retinal.

En una forma de realización relacionada adicional, el tejido es un tejido tumoral de un paciente con un tumor sólido, una metástasis, un cáncer de piel, un cáncer de mama, un hemangioma o angiofibroma y otro cáncer parecido, y la angiogénesis a inhibir es la angiogénesis del tejido tumoral donde existe neovascularización del tejido tumoral. Tejidos típicos de tumor sólido, tratables por los métodos presentes, incluyen tejidos de pulmón, páncreas, mama, colon, laríngeo, de ovarios, sarcoma de Kaposi y otros. En los Ejemplos se describe la angiogénesis de tejidos tumorales ejemplares, y la inhibición de la misma.

Se prefiere particularmente la inhibición de la angiogénesis de tejidos tumorales debido al importante papel que la neovascularización juega en el crecimiento tumoral. En ausencia de neovascularización del tejido tumoral, el tejido tumoral no obtiene los nutrientes necesarios, se ralentiza el crecimiento, cesa el crecimiento adicional, retrocede y, por último, se vuelve necrótico, produciéndose la muerte del tumor.

Explicado con otras palabras, la presente invención contempla inhibir la neovascularización tumoral inhibiendo la angiogénesis tumoral. De manera similar, la invención contempla inhibir el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la angiogénesis.

Por su habilidad para inhibir la neovascularización, los usos de la invención también son eficaces contra la formación de metástasis porque (1) su formación necesita la vascularización de un tumor primario a fin de que las células del cáncer metastático puedan salir del tumor primario, y (2) su establecimiento en un sitio secundario requiere neovascularización para mantener el crecimiento de la metástasis.

En una forma de realización relacionada, El uso de la invención está contemplado conjuntamente con otras terapias tales como quimioterapia convencional dirigida contra los tumores sólidos, y para el control del establecimiento de la metástasis. La administración de un inhibidor de la angiogénesis es conducida típicamente durante o después de la quimioterapia, aunque se prefiere inhibir la angiogénesis después de un régimen de quimioterapia en momentos donde el tejido tumoral estará respondiendo al asalto tóxico induciendo angiogénesis para recuperarse mediante la provisión de un suministro de sangre y nutrientes hacia el tejido tumoral. Además, se prefiere administrar los métodos de inhibición de la angiogénesis después de la cirugía donde se hayan extraído tumores sólidos como profilaxis contra la metástasis.

Con tal que los usos presentes se apliquen a la inhibición de la neovascularización tumoral, los usos también se pueden aplicar a la regresión de tumores establecidos.

La restenosis es un proceso de migración y proliferación de células del músculo liso (CML) en el sitio de angioplastia coronaria transluminal percutánea que impide el éxito de la angioplastia. La migración y proliferación de CML asociadas con vasos sanguíneos durante la restenosis está relacionada con el proceso de angiogénesis que es inhibido por los usos presentes. Por lo tanto, la invención también contempla la inhibición de la restenosis, inhibiendo los procesos relacionados angiogénicos en un paciente, después de los procesos de angioplastia. Para la inhibición de la restenosis, el antagonista de los usos de la invención es administrado típicamente después del procedimiento de angioplastia durante unos 2 hasta unos 28 días, y más típicamente durante aproximadamente los primeros 14 días después del procedimiento.

El presente uso para inhibir la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto también el uso para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, comprende el poner en contacto un tejido en el que está ocurriendo angiogénesis, o está en riesgo de que ocurra, con una composición terapéutica constando de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista que modifique las interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias de aminoácidos dentro de la MMP-9 y/o integrinas \beta1. De este modo, el uso contempla administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición, tolerable fisiológicamente, conteniendo un antagonista de la invención, el cual antagonista modifica las interacciones proteína-proteína que implican a ciertas secuencias de aminoácidos dentro de la MMP-9 y/o integrinas \beta1. Posteriormente, en la sección titulada "Composiciones Terapéuticas" se describen composiciones terapéuticas y cantidades terapéuticamente eficaces de antagonistas de la invención.

Los intervalos de dosificación para la administración del antagonista dependen de la forma del antagonista y su potencia, como se describe adicionalmente aquí, y son cantidades lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el que mejoren la angiogénesis y los síntomas de la enfermedad mediados por la angiogénesis. La dosificación no debería ser tan grande ya que origina efectos secundarios, tales como síndrome de hiperviscosidad, edema pulmonar, falo cardíaco congestivo, y otros. Generalmente, la dosificación variará con la edad, estado, sexo y alcance de la enfermedad en el paciente, y puede ser determinada por un especializado en la técnica. La dosificación también puede ser ajustada por el médico particular en el caso de cualquier complicación.

Los anticuerpos monoclonales de los usos de la invención pueden ser administrados parenteralmente mediante inyección, o mediante infusión gradual con el tiempo. Aunque el tejido a tratar puede ser accedido típicamente en el cuerpo por administración sistémica, y por lo tanto la mayoría de las veces tratado mediante la administración intravenosa de composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y medios de liberación donde exista la probabilidad de que el tejido elegido como diana contenga la molécula diana. De este modo, los antagonistas que incluyan anticuerpos monoclonales, polipéptidos y derivados de los mismos se pueden administrar intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracavidad, transdérmicamente, tópicamente, intraocularmente, oralmente, intranasalmente, y se pueden liberar por medios peristálticos.

Las composiciones terapéuticas que contengan un anticuerpo monoclonal o un polipéptido de esta invención son convenientemente administradas intravenosamente, por ejemplo mediante inyección de una dosis unitaria. El término "dosis unitaria", cuando se utiliza en referencia a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades discretas físicamente, apropiadas como dosificación unitaria para el sujeto, cada unidad conteniendo un cantidad predeterminada de materia activa calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el diluyente necesario, esto es, soporte o vehículo.

En una forma de realización preferida como se muestra en los Ejemplos, el antagonista es administrado intravenosamente en una dosis única.

Las composiciones son administradas de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar y temporización dependen del paciente a tratar, la capacidad del sistema del paciente para utilizar el principio activo, y del grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades exactas de principio activo, necesarias para ser administradas, dependen del juicio del médico general y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, los intervalos de dosificación apropiados para aplicación sistémica están revelados aquí y dependen de la vía de administración. Los regímenes apropiados para administración también son variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida por dosis repetidas, a intervalos de una o más horas, mediante una inyección posterior u otra administración. Alternativamente, para las terapias in vivo se contempla una infusión intravenosa continua, suficiente para mantener concentraciones en sangre en los intervalos especificados.

Como ejemplos específicos de usos para inhibir la angiogénesis o estados de enfermedad, se ofrecen las siguientes formas de realización.

En una forma de realización, la invención es el uso de un antagonista para la fabricación de un medicamento para inhibir la angiogénesis en un tejido, comprendiendo el administrar un antagonista que modifique específicamente las interacciones proteína-proteína, en donde las interacciones proteína-proteína constan de interacciones entre al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una primera proteína y al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una segunda proteína. En este uso, dicho antagonista es administrado intravenosamente, transdérmicamente, intrasinovialmente, intramuscularmente, intratumoralmente, intraocularmente, intranasalmente, intratecalmente, tópicamente u oralmente. Además, el antagonista se puede administrar conjuntamente con quimioterapia o conjuntamente con radiación. Este método se utiliza cuando el tejido está inflamado y está ocurriendo la angiogénesis, cuando el tejido está presente en un mamífero, o cuando el tejido es artrítico, ocular, retinal o u hemangioma.

En otro uso conforme a la invención, el crecimiento tumoral o metástasis en un tejido es inhibido en un uso comprendiendo el administrar un antagonista que modifique específicamente las interacciones proteína-proteína, en donde las interacciones proteína-proteína constan de interacciones entre al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una primera proteína y al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una segunda proteína. En tal método, dicho antagonista es administrado intravenosamente, transdérmicamente, intrasinovialmente, intramuscularmente, intratumoralmente, intraocularmente, intranasalmente, tópicamente u oralmente. Además, el antagonista se puede administrar conjuntamente con quimioterapia o conjuntamente con radiación. Este uso sería aplicable cuando el tumor o metástasis es un melanoma, carcinoma, sarcoma, fibrosarcoma, glioma o astrocitoma. En otra forma de realización, la invención es un uso para inhibir la psoriasis, la degeneración macular o restenosis en un tejido, administrando un antagonista que modifique específicamente las interacciones proteína-proteína, en donde las interacciones proteína-proteína constan de interacciones entre al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una primera proteína y al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una segunda proteína. En este uso, dicho antagonista es administrado intravenosamente, transdérmicamente, intrasinovialmente, intramuscularmente, intratumoralmente, intraocularmente, intranasalmente, intratecalmente, tópicamente u oralmente. Además, el antagonista se puede administrar conjuntamente con quimioterapia o conjuntamente con radiación.

Tratamiento de las enfermedades

La presente invención se refiere en general al descubrimiento de que modificando las interacciones proteína-proteína, que implican a ciertas secuencias de aminoácidos dentro de la MMP-9 y/o integrinas \beta1, se inhibe los estados de enfermedad y la angiogénesis. Este descubrimiento es importante debido al papel que la angiogénesis juega en diversos procesos de enfermedad.

Cuando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos sea la causa de, o contribuya a, la patología asociada con una enfermedad, la inhibición de la angiogénesis reducirá los efectos nocivos de la enfermedad. Los ejemplos incluyen la psoriasis, la artritis reumatoide, la retinopatía diabética, las enfermedades inflamatorias, la restenosis, la degeneración macular y otras. Cuando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos sea necesario para mantener el crecimiento de un tejido nocivo, la inhibición de la angiogénesis reducirá el suministro de sangre al tejido y, de ese modo, contribuirá a la reducción de masa de tejido basada en las necesidades de suministro de sangre. Los ejemplos incluyen el crecimiento de tumores donde la neovascularización sea un requerimiento continuo para que el tumor crezca más allá de unos pocos milímetros de espesor, y para el establecimiento de la metástasis del tumor sólido.

Los usos de la presente invención son eficaces en parte debido a que la terapia es sumamente selectiva por la angiogénesis y no por otros procesos biológicos. Como se muestra en los Ejemplos, únicamente se inhibe el crecimiento de nuevos vasos por los antagonistas que rompen la localización de la MMP-9, y por lo tanto los usos terapéuticos no afectan adversamente a los vasos maduros. También, debido que algunos de los antagonistas de la invención afectan únicamente a la localización de la MMP-9, y no bloquean directamente la actividad proteolítica de la MMP-9 o las funciones de adherencia de las integrinas \beta1, es probable que estos compuestos tengan menos efectos secundarios porque la actividad proteolítica de la MMP-9 o las funciones de adherencia de las integrinas \beta1 pueden tener funciones fisiológicas normales.

Más aun, los antagonistas de la invención son sumamente potentes, sugiriendo que ellos puedan tener beneficios terapéuticos a bajas concentraciones.

Antes de los descubrimientos de la presente invención, no se sabía que la angiogénesis, y cualquiera de los procesos dependientes de la angiogénesis, podía ser inhibida in vivo mediante el uso de reactivos que antagonicen la interacción entre la MMP-9 y las integrinas \beta1.

Composiciones terapéuticas

La presente invención contempla composiciones terapéuticas útiles para los usos descritos aquí. Las composiciones terapéuticas contienen un soporte fisiológicamente tolerable junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista como se describe aquí, disuelto o dispersado allí como principio activo. En una forma de realización preferida, la composición de terapéutica de antagonista no es inmunogénica o tiene inmunogenicidad reducida cuando se administra a un paciente mamífero o humano con fines terapéuticos.

Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de antagonista de la invención suficiente para producir una inhibición medible de la angiogénesis en un tejido a tratar, esto es, una cantidad inhibidora de la angiogénesis. La inhibición de la angiogénesis se puede medir in situ mediante inmunohistoquímica, como se describe aquí, o mediante otros métodos conocidos por un especializado en la técnica.

La potencia de un antagonista de la invención se puede medir por diversos métodos, incluyendo la inhibición de la angiogénesis en el ensayo MCA, en el ensayo de ojo de conejo in vivo, en el ensayo quimérico ratón/humano in vivo y los ensayos.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de esta invención, en forma de anticuerpo monoclonal, es típicamente una cantidad tal que, cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable, sea suficiente para lograr una concentración en plasma desde aproximadamente 0'01 microgramos (\mug) por mililitro (ml) hasta aproximadamente 100 \mug/ml, preferentemente desde aproximadamente 1 \mug/ml hasta aproximadamente 5 \mug/ml, y normalmente unos 5 \mug/ml. Dicho diferentemente, la dosificación puede variar desde aproximadamente 0'1 mg/kg hasta aproximadamente 300 mg/kg, preferentemente desde aproximadamente 0'2 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/kg, muy preferentemente desde aproximadamente 0'5 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días.

Cuando el antagonista esté en forma de un fragmento de un anticuerpo monoclonal, la cantidad puede ser fácilmente ajustada basada en la masa de fragmento con respecto a la masa del anticuerpo entero. Una concentración en plasma preferida en molaridad es desde aproximadamente 2 micromolar (\muM) hasta aproximadamente 5 milimolar (mM), y preferentemente alrededor de 100\muM hasta 1mM de antagonista anticuerpo.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista en forma de polipéptido, o molécula pequeña, es típicamente una cantidad tal que, cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable, sea suficiente para lograr una concentración en plasma desde aproximadamente 0'1 microgramos (\mug) por mililitro (ml) hasta aproximadamente 200 \mug/ml, preferentemente desde aproximadamente 1 \mug/ml hasta aproximadamente 150 \mug/ml. Basada en un polipéptido que tenga una masa de aproximadamente 500 gramos por mol, la concentración en plasma preferida en molaridad es desde aproximadamente 2 micromolar (\muM) hasta aproximadamente 5 milimolar (mM), y preferentemente alrededor de 100\muM hasta 1mM de antagonista polipéptido. Dicho diferentemente, la dosificación por peso corporal puede variar desde aproximadamente 0'1 mg/kg hasta aproximadamente 300 mg/kg, y preferentemente desde aproximadamente 0'2 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días.

Como se utiliza aquí, los términos "farmacéuticamente admisible", "fisiológicamente tolerable", y variaciones gramaticales de los mismos, ya que se refieren a composiciones, soportes, diluyentes y reactivos, son utilizados intercambiablemente y representan que las materias son capaces de administración a o en un mamífero.

La preparación de una composición farmacológica que contenga principios activos disueltos o dispersados allí es bien comprendida en la técnica, y no necesita estar limitada basada en una formulación. Típicamente, tales composiciones se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas apropiadas para solución, o suspensiones, en líquido antes de utilizar. La preparación también se puede emulsionar.

El principio activo se puede mezclar con excipientes que sean farmacéuticamente admisibles y compatibles con el principio activo, y en cantidades apropiadas para su uso en los métodos terapéuticos descritos aquí. Los excipientes apropiados son, por ejemplo, el agua, salino, dextrosa, glicerina, etanol u otros, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH y otros que intensifiquen la eficacia del principio activo.

La composición terapéutica puede incluir sales farmacéuticamente admisibles de los componentes allí dentro. Las sales farmacéuticamente admisibles incluyen las sales por adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de un polipéptido) que se formen con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y otros. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden ser obtenidas a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y otras. Particularmente preferidas son las sales de TFA y ClH.

En la técnica se conocen bien los soportes fisiológicamente tolerables. Ejemplares de los soportes líquidos son soluciones acuosas estériles que no contienen materias además de los principios activos y agua, o contienen un tapón tal como fosfato sódico en un valor de pH fisiológico, salino fisiológico o ambos, tales como salino tamponado con fosfato. Aun más, los soportes acuosos pueden contener más de una sal tampón, así como sales tales como cloruros sódico y potásico, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos.

Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de, y con exclusión de agua. Ejemplares de tales fases líquidas adicionales son la glicerina, aceites vegetales tales como aceite de algodón, y emulsiones agua/aceite.

Una composición terapéutica contiene una cantidad, inhibidora de la angiogénesis, de un antagonista de la presente invención, típicamente formulada para que contenga una cantidad de al menos el 0'01 porciento en peso de antagonista por peso de la composición terapéutica total. Un porcentaje en peso es una relación en peso de inhibidor a la composición total. Así, por ejemplo, 0'01 por ciento en peso es 0'01 gramos de inhibidor por 100 gramos de composición total.

Un anticuerpo puede estar conjugado con citotoxinas, agentes citotóxicos, para su liberación a un tumor u otro tejido que padezca angiogénesis. Tales conjugados se pueden fabricar con una citolisina o una exotoxina, por ejemplo ricina A, toxina A de la difteria, o exotoxina de Pseudomonas y fragmentos de las mismas. El agente citotóxico puede ser marcado radiactivamente con un isótopo para liberar localmente una dosis tóxica de radiactividad en un tejido angiogénico.

Los antagonistas de la invención también pueden ser utilizados para liberar una enzima a una diana, en donde la enzima es capaz de convertir un profármaco en una forma activa del fármaco para su uso, por ejemplo, en terapia de profármaco activado por enzimas dirigida al anticuerpo (ADEPT) [ver, por ejemplo, Syrigos, K. N. (1999), Anticancer Res. 19: 605-13]. Brevemente, un antagonista de la invención es conjugado con una enzima, tal como una lactamasa, proteasa o esterasa, que pueda convertir un profármaco no tóxico o inactivo en un fármaco tóxico o activo. Debido a que el antagonista de la invención localiza sitios de angiogénesis, y particularmente sitios de tumores o metástasis, los fármacos tóxicos pueden ser dirigidos a tales sitios.

Métodos de detección

Los antagonistas de la invención también son apropiados para la detección de la angiogénesis en tejidos. Por ejemplo, cuando el antagonista sea un anticuerpo, el antagonista se puede utilizar en técnicas inmunohistoquímicas para teñir tejidos ex vivo. Las técnicas inmunológicas tales como la inmunotinción y el ELISA están descritas en, por ejemplo, Receptor Binding Techniques, Methods in Molecular Biology, 106, ed. M. Keen. Humana Press, 1999; Brooks y col., (1998), Cell 92: 391-400; Brooks y col., (1996), Cell 85: 683-693; y Brooks y col., (1993), J. Cell. Biol. 122: 1.351-1.359.

El antagonista de la invención, una vez unido al tejido diana, puede ser detectado directa o indirectamente. La detección directa se puede realizar con antagonistas que consten de un marcador detectable tal como un fluorocromo, un marcador radiactivo, un metal pesado paramagnético o un colorante para diagnóstico.

Alternativamente, la detección puede ocurrir mediante una interacción secundaria. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo marcado detectablemente, que reconozca al antagonista, para visualizar la ubicación del antagonista. Por ejemplo, si el antagonista es un anticuerpo monoclonal de origen de ratón, se puede utilizar un cabra anti-anticuerpo de ratón que esté adecuadamente marcado. Un especializado en la técnica puede determinar anticuerpos secundarios apropiados para su uso con diversos antagonistas.

Para la detección in vivo, se prefiere utilizar un antagonista marcado detectablemente. El antagonista marcado es administrado a un paciente intravenosamente, intramuscularmente, etc. Se prefieren particularmente los marcadores apropiados para la detección dentro de un paciente. Por ejemplo, los antagonistas marcados paramagnéticamente pueden ser detectados mediante imagen por resonancia magnética. También se pueden detectar antagonistas marcados radiactivamente.

Los ejemplos de formas de realización específicas de la invención, apropiados para la detección, son como sigue.

En una forma de realización, la invención es el uso de un antagonista para la fabricación de un medicamento para detectar la angiogénesis en un tejido, poniendo en contacto un antagonista que modifique específicamente las interacciones proteína-proteína, en donde las interacciones proteína-proteína comprenden interacciones entre al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una primera proteína y al menos una secuencia de aminoácidos dentro de una segunda proteína con dicho tejido. En este uso, por ejemplo, dicho tejido es ex vivo o dicho tejido es in vivo y dicho antagonista es administrado intravenosamente, transdérmicamente, intrasinovialmente, intramuscularmente, intratumoralmente, intraocularmente, intranasalmente, intratecalmente, tópicamente u oralmente. Alternativamente, en este uso dicho antagonista está conjugado a un fluorocromo, marcador radiactivo, metal pesado paramagnético, colorante para diagnóstico o enzima.

Ejemplos

Ejemplo 1

Purificación de \alpha5\beta1

Se purificó \alpha5\beta1, a partir de lisados de placenta, utilizando el dominio de unión celular a fibronectina de 110 kD. Las fracciones eluídas fueron concentradas y separadas mediante SDS-PAGE al 10%, seguido por tinción con plata. Copurifica una proteína de 90 kD con integrina \alpha5\beta1, con un peso molecular idéntico a la MMP-9 como se muestra en la Figura 1. En la figura, la Banda 1 corresponde a \alpha5\beta1 humana preparada comercialmente (1 \mug), y la Banda 2 a \alpha5\beta1 (50 \mul) purificada a partir de tejido placental humano. Observen la contaminación menor de 90 kD (flecha).

Basado en nuestro descubrimiento anterior de la interacción directa entre la MMP-2 y la \alphau\beta3, examinamos si esta proteína de 90 kD puede ser otro ejemplo de unión de la MMP a una integrina.

Ejemplo 2

Análisis zimográfico de \alpha5\beta1

\alpha5\beta1 y \alpha\mu\beta3 purificadas fueron separadas en geles de SDS-PAGE al 10% copolimerizados con gelatina. Se eliminó el SDS de los geles lavando en Triton X-100, y se incubaron los geles en tampón con colagenasa. Las bandas gelatinolíticas fueron visualizadas por tinción con azul Coomassie. La preparación de \alpha5\beta1 purificada contiene actividad gelatinolítica (90 kD) que migra en el mismo peso molecular que la MMP-9, como se muestra en la Figura 2. En la figura, la Banda 1 corresponde a pro-MMP-9 (1 \mug), la Banda 2 a MMP-9 activada con APMA (1 \mug), la Banda 3 a \alpha5\beta1 purificada de la preparación-1 a partir de tejido placental (1 \mug), la Banda 4 a \alphav\beta3 purificada a partir de tejido placental (1 \mug) (1 \mug), y la Banda 5 a \alpha5\beta1 purificada de la preparación-2 a partir de tejido placental (1 \mug).

Estos datos sugieren que la proteína contaminante de 90 kD, que copurifica con una \alpha5\beta1, puede ser MMP-9. Más aun, estos estudios sugieren que la MMP-9 puede unirse directamente a la integrina \alpha5\beta1.

Ejemplo 3

Análisis Western Blot de Integrinas \alpha5\beta1 purificadas

Integrinas \alpha5\beta1 y \alpha\mu\beta3 (1 \mug) purificadas fueron separadas en SDS-PAGE al 10% y transferidas a nitrocelulosa y bloteadas con un Mab anti-MMP-9. El análisis Western blot de la \alpha5\beta1 purificada, mostrado en la Figura 3, con un anticuerpo monoclonal dirigido contra MMP-9, confirma la existencia de MMP-9 dentro de la preparación de \alpha5\beta1. En la Figura 3, la Banda 1 corresponde a MMP-9 recombinante (1 \mug), la Banda 2 a \alpha5\beta1 purificada a partir de tejido placental (1 \mug), y la Banda 3 a \alpha5\beta1 purificada a partir de tejido placental (1 \mug).

Ejemplo 4

MMP-9 Recombinante se Une a \alpha5\beta1

Se inmovilizó \alpha5\beta1 o proteína de control \beta-caseína en pocillos de microtitulación (10 \mug/ml). Se dejó que MMP-9 humana recombinante (2 \mug/ml) se uniese a los pocillos recubiertos de control durante una hora. Se detectó la unión de MMP-9 con Mab anti-MMP-9. Como se puede ver en la Figura 4, la MMP-9 purificada se une directamente a la integrina \alpha5\beta1. Las barras de datos representan la densidad óptica media \pm desviaciones estándar de pocillos triplicados.

Ejemplo 5

Unión Reducida de MMP-9 a la Superficie de Células Negativas a \alpha5\beta1

Para evaluar si la \alpha5\beta1 puede estar implicada en facilitar la unión de la MMP-9 a la superficie celular, se realizaron ensayos de unión. Se incubaron células HT29 humanas, que expresan poco si hubiese MMP-9 endógena, con MMP-9 recombinante (0 a 100 ng/ml). Se eliminó la enzima no unida y se prepararon lisados celulares totales. Los lisados celulares (100 \mug por banda) fueron separados en un gel de SDS-PAGE al 10% copolimerizado con gelatina, y se visualizaron bandas gelatinolíticas mediante tinción con azul Coomassie. Los resultados mostrados en la Figura 5 sugieren que las células tumorales que carecen de \alpha5\beta1 tienen una capacidad significativamente reducida para unirse a MMP-9, proporcionando además la evidencia de que la \alpha5\beta1 puede jugar un papel importante para localizar la actividad proteolítica en la superficie celular. En la figura, la parte superior corresponde a HT29-30 expresando \alpha5\beta1, la parte inferior a HT29-1 negativas a \alpha5\beta1, NT a no tratamiento, 50 a células incubadas con 50 ng/ml de MMP-9, y 100 a células incubadas con 100 ng/ml de MMP-9.

Ejemplo 6

Colocalización de MMP-9 y \alpha5\beta1 en Vasos Sanguíneos de Tumor Melanoma Humano

Biopsias humanas de pacientes con melanoma fueron congeladas sobre placa enfriada sobre nieve carbónica, y las secciones de tejido fueron coteñidas con un anticuerpo policlonal dirigido contra la MMP-9 y un anticuerpo monoclonal dirigido contra \beta1, seguido por incubación tanto con cabra anti-ratón conjugado con rodamina como con cabra anti-IgGs de conejo conjugado con FITC. Se tomaron fotomicrografías a 200X. En la fotomicrografía, rojo indicaba expresión de integrina \beta1, verde indicaba expresión de MMP-9, amarillo indicaba colocalización de MMP-9 y \beta1. En la Figura 6, que es una reproducción en blanco y negro de la fotomicrografía, las regiones blancas representan amarillo, y las regiones negras representan rojo, verde, o las células tumorales. La Figura 6 muestra que la MMP-9 y las integrinas \beta1 se colocalizan en la superficie de las células tumorales y en los vasos sanguíneos dentro de las biopsias de tumor melanoma humano.

Estos descubrimientos sugieren que la MMP-9 y las integrinas \beta1 están estrechamente relacionadas con el compartimento vascular humano así como con las células tumorales mismas.

Ejemplo 7

Generación de Péptidos Sintéticos que se Unen a MMP-9

El análisis de las secuencias de aminoácidos de MMP-9 y \alpha5\beta1 sugirieron secuencias que pueden mediar la interacción entre estas dos proteínas. Por ejemplo, se generaron péptidos sintéticos y se analizaron por su actividad de unión a MMP-9. La habilidad de unión de los péptidos fue analizada mediante ensayos de unión en fase sólida.

Entre las secuencias analizadas, se encontraron péptidos que mostraban especificidad de unión por la MMP-9 o las integrinas \beta1. De este modo, como se muestra en la Figura 7, el péptido llamado FRIP-1 demostró unirse específicamente a MMP-9 en ensayos de unión en fase sólida. El péptido AAAA, que era idéntico al FRIP-1 excepto que se cambiaron 3 aminoácidos clave, mostró poca habilidad de unión. Estos descubrimientos sugieren que el péptido sintético FRIP-1 representa probablemente los aminoácidos clave implicados en mediar las interacciones MMP-9/\alpha5\beta1.

El péptido sintético FRIP-1 tiene la secuencia ID SEC Nº 1: CysArgLeuArgSerGlyGluProGlnCys.

La secuencia de aminoácidos del FRIP-1 (ID SEC Nº 1) fue derivada de una región dentro del dominio C-terminal, parecido a la hemopexina, de la enzima MMP-9 humana.

El péptido de control AAA tiene la secuencia siguiente: ID SEC Nº 2: CysArgAlaAlaAlaGlyGluProGlnCys.

También se realizaron controles de unión con un péptido de control AAAA con la siguiente secuencia: ID SEC Nº 3: CysArgAlaAlaAlaAlaGluProGlnCys.

Ejemplo 8

El Péptido FRIP-1 Inhibe la Angiogénesis en el Embrión de Pollo

Se indujo angiogénesis en las MCAs de embriones de pollo, de 10 días de edad, con bFGF. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una única inyección IV con 100 \mug de FRIP-1 o péptido de control AAA. Tres días después, se cuantificó la angiogénesis contando el número de puntos de ramificación de vasos sanguíneos dentro del área del disco del filtro. La Figura 8A muestra ejemplos representativos de tejido de MCA de un experimento típico. La Figura 8B es una cuantificación de los experimentos de angiogénesis. Los resultados en la Figura 8B demuestran que el péptido sintético FRIP-1, que se une a la MMP-9, bloquea la angiogénesis en el Modelo de MCA de Embrión de Pollo. En la Figura 8B, la etiqueta "bFGF" corresponde a un experimento donde se indujo la angiogénesis mediante un tratamiento con bFGF, y no se siguió ningún tratamiento adicional. La etiqueta "Tratamiento con FRIP-1" se refiere a un tratamiento con el péptido FRIP-1 al que siguió una inducción de la angiogénesis mediante tratamiento con bFGF. La etiqueta "Control" se refiere a un experimento en el que, a un tratamiento con péptido de control AAA, le siguió una inducción de la angiogénesis mediante tratamiento con bFGF. Las barras de datos representan la media \pm los errores estándar de 5 a 10 embriones de pollo por condición.

Estos datos sugieren que la interacción MMP-9/\alpha5\beta1 puede jugar un papel importante en la angiogénesis.

Ejemplo 9

Generación de Mabs Dirigidos contra Péptidos Sintéticos

Se conjugó péptido FRIP-1 con la proteína soporte KLH, y se inyectó en ratones. Mediante ELISA, se analizaron medios acondicionados de 5 clones de hibridomas representativos, por su unión al péptido FRIP-1 o al péptido de control AAA. Los datos mostrados en la Figura 9 representan la unión relativa media (densidad óptica) \pm desviación estándar de pocillos triplicados.

Como se muestra en la Figura 9, se generaron algunos Mabs contra el péptido FRIP-1, y algunos de estos anticuerpos, por ejemplo el Mab FM155, mostraron alta especificidad por el péptido FRIP-1 pero no reaccionaron con el péptido de control AAA. De este modo, se eligió el Mab FM155 para su evaluación posterior.

Ejemplo 10

Efectos del Mab FM155 en las Interacciones MMP-9/\alpha5\beta1. Conclusiones

Se inmovilizó \alpha5\beta1 en pocillos de microtitulación (10 \mug/ml). Se dejó que MMP-9 humana recombinante (2 \mug/ml) se uniese en presencia o ausencia de Mabs FM155 o LM609. La unión de MMP-9 fue detectada con anticuerpo policlonal anti-MMP-9. En la Figura 10 se muestran los resultados. Las barras de datos representan la densidad óptica media \pm desviaciones estándar de pocillos triplicados. En la figura, la etiqueta "MMP-9" corresponde a la unión de MMP-9 en ausencia de anticuerpos FM155 y LM609. La etiqueta "MMP-9 + FM155" se refiere a la unión de MMP-9 en presencia de anticuerpo FM155. La etiqueta "MMP-9 + LM609" se refiere a la unión de MMP-9 en presencia de anticuerpo LM609. El FM155 es anti-FRIP-1 y el LM609 es Mab anti-\alphav\beta3.

La Figura 10 demuestra que el Mab FM155 bloqueó específicamente la habilidad de la MMP-9 para unirse a \alpha5\beta1 purificada, sugiriendo que el FM155 se puede utilizar para romper esta interacción in vivo.

Ejemplo 11

Efectos de la Administración Sistémica de FM155 en el Crecimiento Tumoral de Melanoma

Se inocularon células de melanoma CS-1 (5x10^{6}) en las MCAs de embriones de pollo de 10 días de edad. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una única inyección intravenosa de Mab FM155 purificado (2'0 \mug, 10'0 \mug, 50'0 \mug). Después de 7 días, los tumores fueron reseccionados y determinados los pesos en húmedo. La Figura 11 presenta la cuantificación del peso de los tumores. Las barras de datos representan la media \pm los errores estándar de 5 a 10 embriones por condición. NT representa datos para sin tratamiento.

La Figura 11 ilustra que el Mab FM155 inhibe potencialmente el crecimiento tumoral de melanoma CS-1 in vivo. Estos descubrimientos indican que el bloqueo de las interacciones de la MMP-9 y la \alpha5\beta1 puede jugar un papel significativo en regular la angiogénesis y el crecimiento tumoral in vivo.

También se aprecia que la anterior descripción de la invención ha sido presentada con fines de ilustración y explicación, y no pretende limitar la invención a la manera de práctica precisa aquí.

<110> University of Southern California

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Brooks, Peter C.

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Hassanieh, Loubna

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Rodríguez, Dorothy

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<120> NUEVO MÉTODO Y COMPOSICIÓN PARA LA INHIBICIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS UTILIZANDO ANTAGONISTAS BASADOS EN MMP-9 E INTEGRINAS BETA-1

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<130> 13761-734PCT

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<140> No asignada todavía

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<141>

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<150> US 60/143.581

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<151> 1999-07-13

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<150> US 60/152.495

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<151> 1999-09-02

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<160> 3

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintética, FRIP-1

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<223> Se une a MMP-9 y a integrinas beta-1

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintética, AAA

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<223> Se une a MMP-9 y a integrinas beta-1 con una capacidad de unión sustancialmente reducida comparada con la capacidad de unión del FRIP-1 a MMP-9 y a integrinas beta-1.

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<400> 2

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2

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<210> 3

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintética, AAAA

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<223> Se une a MMP-9 y a integrinas beta-1 con una capacidad de unión sustancialmente reducida comparada con la capacidad de unión del FRIP-1 a MMP-9 y a integrinas beta-1.

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<400> 3

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3

Claims (29)

1. Un antagonista que inhibe la angiogénesis modificando las interacciones proteína-proteína entre la metaloproteinasa 9 (MMP-9) de matriz y una integrina conteniendo \beta1, en donde dicho antagonista comprende un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido constando de la secuencia ID SEC Nº 1.

2. El antagonista de la reivindicación 1, en donde las interacciones proteína-proteína originan que la MMP-9 se una a la integrina conteniendo \beta1.

3. El antagonista de la reivindicación 1, en donde la integrina conteniendo \beta1 es la integrina \alpha5\beta1.

4. El antagonista de la reivindicación 1, 2 ó 3, en donde las interacciones proteína-proteína originan la colocalización de la MMP-9 y la integrina conteniendo \beta1 en la superficie celular de un vaso sanguíneo.

5. El antagonista de la reivindicación 1, en donde dicho antagonista es un anticuerpo monoclonal, o un anticuerpo monoclonal humanizado, o un fragmento funcional de los mismos, o un anticuerpo monoclonal modificado químicamente, o un fragmento funcional del mismo.

6. El antagonista de la reivindicación 5, en donde el fragmento funcional es un Fab, un Fab', un F(ab')_{2} o un F(v).

7. El antagonista de la reivindicación 1, en donde el antagonista es un anticuerpo policlonal.

8. El antagonista de la reivindicación 1, en donde dicho antagonista es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente con la ID SEC Nº 1, pero se une a la ID SEC Nº 3 con una afinidad sustancialmente reducida.

9. El antagonista de la reivindicación 1, en donde el antagonista está conjugado a agentes citotóxicos o citostáticos.

10. El uso del antagonista de la reivindicación 8, para la fabricación de un medicamento para inhibir la angiogénesis, el crecimiento tumoral, la metástasis, la psoriasis, la degeneración macular o la restenosis en un tejido.

11. El uso según la reivindicación 10, en donde dicho antagonista es administrado intravenosamente, transdérmicamente, intrasinovialmente, intramuscularmente, intratumoralmente, intraocularmente, intranasalmente, intratecalmente, tópicamente u oralmente.

12. El uso según la reivindicación 10, en donde dicho antagonista es administrado conjuntamente con quimioterapia o conjuntamente con terapia de radiación.

13. El uso según la reivindicación 10, en donde el tejido está inflamado y está ocurriendo la angiogénesis.

14. El uso según la reivindicación 10, en donde el tejido está presente en un mamífero.

15. El uso según la reivindicación 14, en donde el tejido es artrítico, ocular, retinal o un hemangioma.

16. El uso según la reivindicación 10, en donde el tumor o metástasis es un melanoma, carcinoma, sarcoma, fibrosarcoma, glioma o astrocitoma.

17. El uso de un antagonista de la reivindicación 8, para la fabricación de un medicamento para detectar la angiogénesis, tumores o la invasión tumoral en un tejido, poniendo en contacto dicho antagonista con dicho tejido.

18. El uso de la reivindicación 17, en donde dicho tejido es ex vivo.

19. El uso de la reivindicación 17, en donde dicho tejido es in vivo y dicho antagonista es administrado intravenosamente, transdérmicamente, intrasinovialmente, intramuscularmente, intratumoralmente, intraocularmente, intranasalmente, intratecalmente, tópicamente u oralmente.

20. El uso de la reivindicación 17, en donde dicho antagonista está conjugado a un fluorocromo, un marcador radiactivo, un metal pesado paramagnético, un colorante para diagnóstico o una enzima.

21. Un método para escrutar antagonistas para MMP-9 o integrinas \beta1, comprendiendo:

a) proporcionar un supuesto antagonista;

b) medir una primera afinidad de dicho supuesto antagonista por su unión con la MMP-9 o una integrina \beta1;

c) medir una segunda afinidad de la ID SEC Nº 3 por su unión con la MMP-9 o dicha integrina \beta1;

\newpage

d) seleccionar dicho supuesto antagonista como antagonista para MMP-9 o integrina \beta1 si dicha segunda afinidad es sustancialmente menor que dicha primera afinidad.

22. El método de la reivindicación 21, en donde dicho supuesto antagonista es un compuesto no peptídico.

23. El método de la reivindicación 22, en donde dicho compuesto no peptídico es un compuesto orgánico pequeño o un oligonucleótido.

24. El método de la reivindicación 21, en donde dicho supuesto antagonista es un polipéptido, un péptido lineal, un péptido cíclico, o un anticuerpo monoclonal o policlonal.

25. El método de la reivindicación 21, en donde dicha primera y dicha segunda afinidades son medidas mediante un ensayo inmunoabsorbente por unión enzimática.

26. El método de la reivindicación 21, en donde dicha segunda afinidad es aproximadamente 3 veces menor que dicha primera afinidad.

27. El método de la reivindicación 21, en donde dicha segunda afinidad es aproximadamente 5 veces menor que dicha primera afinidad.

28. El método de la reivindicación 21, en donde dicha segunda afinidad es aproximadamente 10 veces menor que dicha primera afinidad.

29. Un péptido constando de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 1, comprendiendo un epítopo reconocido por un antagonista de la reivindicación 5.