DE69233673T2

DE69233673T2 - Protein S polypeptide und deren Verwendungen

Info

Publication number: DE69233673T2
Application number: DE69233673T
Authority: DE
Inventors: John H. Del Mar Griffin; Jose A. La Jolla Fernandez
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1991-07-02
Filing date: 1992-07-02
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2012-07-03
Also published as: ES2279598T3; EP0592600B1; DE69230614D1; DE69233673D1; CA2112701C; AU674496B2; DK0972781T3; EP0592600A1; ATE189232T1; ATE350398T1; AU2323092A; ES2142317T3; EP0592600A4; EP0524737A3; PT592600E; WO1993001209A1; DK0592600T3; DE69230614T2; EP0524737A2; CA2112701A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide und Anti-Peptid-Antikörper, die für therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen für die Inhibition der Protein S-Bindung an das C4b-Bindungsprotein geeignet sind. Zusätzlich sind die Polypeptide und Antikörper bei diagnostischen Verfahren für den Nachweis von freiem Protein S in flüssigen Proben geeignet.
HINTERGRUND
Das Vitamin K-abhängige Protein S (PS) ist ein einzelkettiges Glycoprotein mit einer Molekularmasse von 75000 Dalton. Es dient als Kofaktor für aktiviertes Protein C bei der Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa. Die Konzentration von PS in menschlichem Plasma beträgt ungefähr 25 mg/l. Das Protein S wird in mit Citrat versetztem Plasma in mindestens zwei Formen gefunden, nämlich freiem PS(PS_F), das ungefähr 40 % des gesamten PS umfasst, und gebunden an das C4b-Bindungsprotein (C4BP), das ungefähr 60 % des gesamten PS umfasst. C4BP ist ein regulatorisches Protein des klassischen Weges des Komplementsystems. Nur die freie Form von PS unterstützt die Kofaktor-Aktivität für das aktivierte Protein C. Das Protein S bildet in Gegenwart von Ca⁺⁺ und EDTA Komplexe mit C4BP und die Dissoziationskonstante (Kd) für die Interaktion ist in Gegenwart von Ca⁺⁺ (6 × 10^–10 M) sehr viel geringer als in Gegenwart von EDTA (10^–9 M). Diese niedrige Bindungskonstante legt nahe, dass das Protein S, das im Blut zirkuliert, entweder vollständig an C4BP gebunden ist oder dass eine andere Komponente, die das Gleichgewicht zwischen dem Protein S und C4BP verändert, beteiligt ist. Diese dritte Komponente, die Protein S-Bindungsprotein (PSBP) genannt wird, wurde in bovinem Plasma beschrieben, jedoch in menschlichem Plasma nicht nachgewiesen.
Die physiologische Relevanz von Protein S wird durch das beobachtete erhöhte Risiko von venösen Thromboembolien bei Individuen mit einer kongenitalen Protein S-Defizienz demonstriert. Zusätzlich zeigen 30 % der Patienten, die eine arterielle Thrombose zeigen, eine Abnahme der Plasmaniveaus von PS. Daher sind Assays für die Messung von Plasmaniveaus von PS und insbesondere für das Niveau von freiem PS ein wichtiges Handwerkszeug für den Kliniker. Die Komplexbildung von PS mit C4BP entfernt die Antikoagulations-aktive Form von PS(PS_f) aus dem Blutkreislauf.
Frühere Assays für die Messung von Plasmaniveaus von PS umfassten die Verwendung von gepooltem normalem Plasma als Referenzstandard, der Gesamt-PS enthielt, umfassend freies (PS_F) und komplexiertes (PS:C4BP) PS. So musste der Assay freies PS von komplexiertem PS trennen, um die Menge von PS_F, das im Blut zur Verfügung stand, zu bestimmen. Edson et al., Am. J. Clin. Path., 94: 176–186 (1990), betrachtet labordiagnostische Verfahren für den Nachweis von freiem Protein S, einschließlich dem zweidimensionalen Rocket-Kreuz-Immunoelektrophorese (CIEP) Standardverfahren von Laurell et al., Anal. Biochem. 10: 358–361 (1985), und dem zweistufigen Präzipitationsverfahren von Comp et al., Blood. 67: 504–508 (1986), das Polyethylenglycol verwendet um den PS:C4BP-Komplex selektiv von freiem PS zu trennen, bevor das PS gemessen wird.
Antikörper, die für freies PS immunospezifisch sind, wurden nicht beschrieben. Versuche, Antikörper zu entwickeln, die an die Region von PS binden, die an der Bindung von C4BP beteiligt ist, und die daher die Bindung von PS an C4BP inhibieren würden, waren ebenfalls nicht erfolgreich. Dahlback et al., J. Biol. Chem., 265: 8127–8135 (1990). Daher existiert zum gegenwärtigen Zeitpunkt kein direktes Mittel um freies PS von dem PS:C4BP-Komplex immunologisch zu unterscheiden. Da momentan kein direkter Assay für freies PS zu Verfügung steht, benötigen die Assays auf freies PS einen Trennschritt um die immunologisch nicht unterscheidbaren Arten von freiem PS und PS-C4BP zu unterscheiden.
Malm et al., beschreiben einen monoklonalen Antikörper, der mit dem Protein S eine Immunreaktion eingeht (Eur. J. Biochem., 165: 39–45, 1987). Der beschriebene Antikörper bindet freies Protein S und bindet Protein S, das an C4b Bindungsprotein (C4BP) komplexiert ist, bindet jedoch nicht Thrombin-gespaltenes Protein S und es wird daher vorgeschlagen, dass er an ein Epitop bindet, das nahe der gla-Domäne von Protein S lokalisiert ist.
Walker (J. Biol. Chem. 1989, 264(30): 17645–17648) beschreibt die Charakterisierung eines synthetischen Peptids, welches imstande ist, die Wechselwirkung zwischen Prote in S und C4b Bindungsprotein zu inhibieren. Dieses Peptid wurde verwendet, um die Kaninchen-Protein S-Antikoagulations-Kofaktor-Aktivität in vivo durch Modulieren der Aktivität des Protein S zu erhöhen (Weinstein & Walker, J. Clin. Invest. 1990, 86(8): 1928–1935).
EP 0 271 810 beschreibt ein Verfahren zum immunologischen Bestimmen des Vorhandenseins von freiem menschlichen Protein S oder C4 Bindungsprotein-Protein S-Komplex in einer Assayprobe, während EP 0 315 447 ein Verfahren zum immunologischen Testen auf das Vorhandensein von freiem menschlichen Protein S unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, welcher freies, aber nicht gebundenes Protein S nachweisen kann, beschreibt.
Tombesi et al. (Curr. Studies in Hematology and Blood Transfusion, 1991, 58: 205–210) beschreibt die Bewertung eines Verfahrens zum Protein S Nachweis unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern.
Suzuki et al. (Chemical Abstracts, 1990, 112(17), 156574 g, Seite 574, Spalte 1) offenbart die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Protein S und ihre Verwendung zum Reinigen von Protein S und Herstellen von Protein S-freiem Serum.
Kürzlich wurde das synthetische Peptid GVQLDLDEAI (SEQ ID NO 6: 3–17) beschrieben, das von der carboxyterminalen Region des Protein S abgeleitet ist (Reste 605 bis 614 des reifen PS) und das die Interaktion des Protein S mit C4BP in vitro inhibiert. Walker et al., J. Biol. Chem., 264: 17645–17648 (1989); und Weinstein et al., J. Clin. Invest. 86: 1928–1935 (1990). Diese Berichte legen nahe, dass diese Region des Protein S für die Bindung an C4BP wichtig ist. Für andere Protein S Polypeptide, die mit den Resten 608–616 und 616–624 korrespondieren, wurde nachgewiesen, dass sie eine messbare Wirkung auf die Bindung von PS an C4BP aufweisen.
Zusätzliche Fragmente von Protein S, die durch proteolytische Spaltung erzeugt werden, sind in der Literatur beschrieben worden. Dahlback et al., J. Biol. Chem. 261: 5111–5115 (1986) und Stenflo et al., Natl. Acad. Sci. USA 84: 368–372 (1987). Keines dieser Fragmente wurde jedoch in dem Sinne identifiziert, dass es eine Fähigkeit zur Inhibition der Protein S-Bindung an C4BP aufweisen würde.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurden nun Regionen von Protein S entdeckt, die die Stelle der Bindung zwischen dem Protein S (PS) und dem C4b-Bindungsprotein (C4BP) definieren und die geeignet sind, PS Polypeptide und anti-Peptid-Antikörper zu erzeugen, die die Bindungs-Wechselwirkung zwischen PS und C4BP inhibieren. Zusätzlich stellen die PS-Polypeptide und die Antikörper nützliche diagnostische Reagenzien für die Messung von freiem PS in den Körperproben bereit.
Auf diese Weise beschreibt die vorliegende Erfindung ein PS-Polypeptid mit einer Aminosäurerestsequenz, die mit der Sequenz eines Teils der reifen Protein S-Aminosäuresequenz korrespondiert und die die Protein S-Bindung an C4BP inhibiert.
Ebenfalls umfasst sind Antikörper und monoklonale Antikörpermoleküle, die mit einem PS-Polypeptid der vorliegenden Erfindung und mit dem nativen PS-Protein eine Immunreaktion eingehen. Bevorzugte Antikörper inhibieren die Protein S-Bindung an C4BP.
Die Erfindung beschreibt auch diagnostische Systeme und Verfahren in einer Vielzahl direkter oder kompetitiver Immunoassayformate zum Nachweis der Gegenwart von freiem Protein S in einer vaskulären Flüssigkeit durch die Verwendung der PS-Polypeptide und Antikörpermoleküle dieser Erfindung. Die Assays basieren auf der spezifischen Bindungswechselwirkung, wie hier beschrieben, zwischen einem PS-Polypeptid oder einem Antikörper mit dem freien Protein S.
Außerdem sind therapeutische Zusammensetzungen und Verfahren für die Inhibition von Protein S-Bindung an C4BP unter Verwendung der PS-Polypeptide und Antikörper der Erfindung umfasst.
Andere Ausführungsformen beschreiben die Verwendung der Antikörper zur Reinigung von freiem Protein S aus flüssigen Proben, insbesondere die Verwendung von immobilisierten Antikörpermolekülen.
Andere Ausführungsformen werden sich dem Fachmann offensichtlich ergeben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 illustriert die Ergebnisse des Peptid-Inhibitions-Assays, der in Beispiel 5Aii beschrieben ist. Variierende Konzentrationen der aufgeführten Peptide wurden mit dem Protein C4BP inkubiert, das auf Mikrotitervertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen geschichtet worden war. Darauf folgend wurde biotinyliertes Protein S (b-PS) den Vertiefungen zugegeben und die Menge des b-PS, die an das C4BP gebunden hatte, wurde wie beschrieben in Beispiel 2C nachgewiesen. Andere Peptide, die in den 1–3 dargestellt sind, jedoch nicht in der Tabelle 1 aufgeführt sind, umfassen:
PSP-287 (1: 287–301); PSP-314 (1: 314–328); PSP-393 (1: 393–407); PSP-48 (1: 48–62); PSP-57 (1: 57–71); PSP-172 (1: 172–186); PSP-19 (1: 621–635); und PSP-425 A (1: 425–433). Die SEQ ID Nr und die korrespondierenden Aminosäurerest-Stellungen sind in den Klammern angegeben.
Die 2, 3 und 4 zeigen auch die Ergebnisse des Peptid-Inhibitionsassays, der in Beispiel 5Aii sowie in der Legende für 1 beschrieben ist.
5 illustriert die Ergebnisse des Antikörper-Inhibitionsassay, der in Beispiel 5Aiii beschrieben ist. Variierende Konzentrationen von anti-PSP-12 (auch bezeichnet als anti-PS(420–434)) und anti-PSP-13 (auch bezeichnet als anti-PS(603–616))Antikörper wurden mit Protein C4BP inkubiert, das vorher auf Mikrotitervertiefungen geschichtet worden war. Danach wurde biotinyliertes Protein S (b-PS) den Vertiefungen zugefügt und die Menge des b-PS, das an C4BP gebunden hatte, wurde wie beschrieben in Beispiel 2C, nachgewiesen.
6, illustriert in den beiden Teilen A und B die Ergebnisse der 2-D-Elektrophorese, die in dem Assay für freies Protein S durch Adsorption unter Verwendung von MAb 56, wie beschrieben in Beispiel 6B, beschrieben werden. Die 6A zeigt die Ergebnisse der Kontrolle, einer normalen Plasmaprobe, wobei die große Laurell-Rocket den C4BP: PS-Komplex darstellt und wobei die kleine Laurell-Rocket das freie Protein S darstellt.
6B zeigt die Ergebnisse einer Plasmaprobe, adsorbiert mit MAb 56, wobei die einzelne Laurell-Rocket den C4BP:PS-Komplex darstellt.
7 illustriert die Ergebnisse des SDS-PAGE, beschrieben in dem Assay auf freies Protein S durch Adsorption unter Verwendung von anti-PS(420–434)-polyklonalen Antikörpern, wie beschrieben in Beispiel 6B. Spur 1 korrespondiert zu dem Ausgangsmaterial, das sowohl freies PS als auch den PS:C4BP-Komplex enthält. Spur 2 korrespondiert zu dem Durchfluss des Ausgangsmaterials nach Passage über eine Säule, die anti-PS(420–434)-polyklonalen Antikörper in der festen Phase enthält. Spur 3 korrespondiert zu der Fraktion des Ausgangsmaterials, die aus der Säule mit 3 M Thiocyanat eluierte. Der Pfeil zeigt die Stellung der Bande an, die zu freiem Protein S korrespondiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. DEFINITIONEN
Aminosäurerest: Eine Aminosäure, die nach chemischem Verdau (Hydrolyse) eines Polypeptids an seinen Peptidbindungen gebildet wird. Die Aminosäurereste, die hier identifiziert werden, befinden sich vorzugsweise in der natürlich „L" isomeren Form. Es können jedoch Reste in der „D" isomeren Form gegen jeden L-Aminosäurerest ausgetauscht werden, solange das Polypeptid seine gewünschte funktionelle Eigenschaft beibehält. NH₂ bezieht sich auf die freie Aminogruppe, die am Aminoterminus eines Polypeptids vorliegt. COOH bezieht sich auf die freie Carboxygruppe, die am Carboxyterminus eines Polypeptids vorliegt. In Übereinstimmung mit der Polypeptid-Standardnomenklatur, J. Biol. Chem., 243: 3552–59 (1969) und angepasst an 37 CFR § 1.822 (b) (2), sind die Abkürzungen für die Aminosäurereste in der folgenden Korrespondenztabelle dargestellt:
Korrespondenztabelle
Es sollte festgehalten werden, dass alle Aminosäurerestsequenzen (auch bezeichnet als Aminosäuresequenzen) hier durch Formeln dargestellt werden, deren linke oder rechte Orientierung in der konventionellen Richtung des Aminoterminus zum Carboxyterminus ist. Zusätzlich ist die Bezeichnung „Aminosäurerest" so definiert, dass modifizierte und ungewöhnliche Aminosäuren wie die in CFR § 1.822 (b) (4) aufgeführten umfasst sind. Es sollte ferner festgehalten werden, dass ein Gedankenstrich am Beginn oder am Ende einer Aminosäurerestsequenz anzeigt, dass entweder eine Peptidbindung an eine weitere Sequenz mit einer oder mehreren Aminosäureresten oder eine kovalente Bindung an eine Carboxyl- oder Hydroxyl-Endgruppe vorliegt.
Aktiviertes Protein C: Aktiviertes Protein C bezieht sich auf Protein C, das proteolytisch durch Thrombin gespalten wurde, um ein aktiviertes Protein C (APC) zu ergeben, das die Koagulationsfaktoren Va und VIIIa inaktiviert, wodurch die Koagulation inhibiert wird.
Antikörper: Die Bezeichnung Antikörper in ihren unterschiedlichen grammatikalischen Formen wird hier verwendet um sich auf Immunoglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunoglobulinmolekülen zu beziehen, d. h. Moleküle, die eine Antikörperbindungsstelle oder ein Paratop enthalten. Beispielhafte Antikörpermoleküle sind intakte Immunoglobulinmoleküle, im Wesentlichen intakte Immunoglobulinmoleküle und Teile eines Immunoglobulinmoleküls, einschließlich der Teile, die auf dem Fachgebiet als Fab, Fab', F(ab')₂ und F(v) bekannt sind.
Antikörperbindungsstelle: Eine Antikörperbindungsstelle ist der strukturelle Anteil eines Antikörpermoleküls, der aus schweren und leichtkettigen variablen und hypervariablen Regionen besteht, die spezifisch ein Antigen binden (mit diesem eine Immunreaktion eingehen). Die Bezeichnung eine Immunreaktion eingehen in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen bedeutet die spezifische Bindung zwischen einem eine antigene Determinante enthaltenden Molekül und einem Molekül, das eine Antikörperbindungsstelle enthält, wie z. B. einem gesamten Antikörpermolekül oder einem Teil davon.
Faktor V: Faktor V ist ein Protein mit einem hohen Molekulargewicht, das, wenn es durch Thrombin aktiviert wird, die Konversion von Prothrombin zu Thrombin durch den Faktor Xa, der die Koagulation unterstützt, beschleunigen kann. Aktivierter Faktor Va wird durch aktiviertes Protein C inaktiviert um den Koagulationsablauf zu inhibieren.
Faktor VIII: Faktor VIII, der als antihaemophiler Faktor bei der Blutkoagulation bezeichnet wird, ist ein Protein mit einem hohen Molekulargewicht, das an der Aktivierung von Faktor X zusammen mit Faktor Xa beteiligt ist. Aktivierter Faktor VIIIa wird durch aktiviertes Protein C inaktiviert um den Koagulationsablauf zu inhibieren.
Faktor X: Faktor X ist ein Zymogen einer Serin-Protease, das ein Molekulargewicht von 55000 hat. Wenn er aktiviert wird, löst Faktor Xa zusammen mit Faktor Va die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin aus, das die Koagulation unterstützt.
Monoklonaler Antikörper: Die Bezeichnung monoklonaler Antikörper in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen bezieht sich auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Art einer Antikörperbindungsstelle enthält, die in der Lage ist, mit einem bestimmten Antigen eine Immunreaktion einzugehen. Ein monoklonaler Antikörper zeigt auf diese Weise im typischen Fall eine einzelne Bindungsaffinität für irgendein Antigen, mit dem es eine Immunreaktion eingeht. Ein monoklonaler Antikörper kann daher ein Antikörpermolekül mit einer Vielzahl von Antikörperbindungsstellen enthalten, wobei jede für ein unterschiedliches Antigen immunspezifisch ist, z. B. ein bispezifischer monoklonaler Antikörper.
Polypeptid und Peptid: Polypeptid und Peptid sind Bezeichnungen, die hier austauschbar verwendet werden um eine lineare Reihe von Aminosäureresten zu bezeichnen, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und Carboxygruppen benachbarter Reste verbunden sind.
Protein C: Protein C (PC) ist ein von Vitamin K abhängiges Serin-Protease-Zymogen und teilt sich mit anderen bekannten Vitamin K-abhängigen Serin-Proteasen eine Sequenzhomologie. In Gegenwart von endothelialem Zell-Thrombomodulin und Thrombin wird Protein C zu einer Serin-Protease, APC, aktiviert und wird zu einem wirkungsvollen Inhibitor der Blutkoagulation durch Inaktivierung des Faktors Va und des Faktors VIIIa.
Protein S: Protein S (PS) ist ein von Vitamin K abhängiges Plasmaprotein, das als Kofaktor für aktiviertes Protein C bei der Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa wirkt.
Serin-Proteasen: Serin-Proteasen sind eine Familie von Protein-spaltenden (proteolytischen) Enzymen, wobei aktiviertes Protein C ein Mitglied dieser Familie ist.
Synthetisches Peptid: Synthetisches Peptid bezieht sich auf eine chemisch erzeugte Kette von Aminosäureresten, die miteinander über Peptidbindungen verbunden sind, und die frei von natürlich auftretenden Proteinen und Fragmenten davon ist.
B. Polypeptide
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "PS Polypeptid" auf ein Polypeptid mit einer Aminosäurerestsequenz, die eine Aminosäurerestsequenz umfasst, die mit einem Teil des Protein S-Moleküls korrespondiert und vorzugsweise mit diesem Teil identisch ist. Die Aminosäurerestsequenz des reifen Protein S Proteins wird als SEQ ID NO. 1 in dem Sequenzprotokoll aufgeführt. Ein PS-Polypeptid der vorliegenden Erfindung weist die Fähigkeit auf, die Bindung von Protein S (PS) an das C4b-Bindungsprotein (C4BP) zu inhibieren.
Somit stellt die Erfindung bereit:
Protein S-Polypeptid mit einer Länge von nicht mehr als 100 Aminosäureresten und eine Aminosäurerestsequenz umfassend, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammem gezeigt sind, die repräsentiert wird durch eine Formel, ausgewählt aus:
-QEKQNKH- und (1: 427–433)
-SGIKKIIQEK- (12: 1–10),
und wobei das Polypeptid die Bindung des Proteins S an ein C4b-Bindungsprotein hemmt.
Die SEQ ID NO. und die korrespondierenden Reste einer beschriebenen Aminosäurerestsequenz sind hier in geeigneter Weise in Klammern beschrieben, wobei die erste Zahl die SEQ ID NO. ist und der dem Doppelpunkt folgende Bereich die Restzahlen der angegebenen Aminosäurereste in dem Sequenzprotokoll darstellt. „(1: 423–427)" bezieht sich z. B. auf die Sequenz KEIIQ, die in SEQ ID NO. 1 dargestellt ist von dem Rest 423 bis zu dem Rest 427.
In einer ähnlichen Ausführungsform stellt die Erfindung ein PS Polypeptid bereit, das eine Länge von nicht mehr als 100 Aminosäureresten aufweist, das eine Aminosäurerestsequenz enthält, die durch die Formel -SGIKKIIQEKQNKC- (12: 1–14) dargestellt wird. Bei dieser Ausführungsform weist ein beispielhaftes und bevorzugtes Polypeptid eine Aminosäurerestsequenz auf, die durch die Formel SGIKKIIQEKQNKC (12: 1–14) dargestellt wird. Dieses PS-Peptid wurde ohne den Histidin (H) Rest synthetisiert, der normalerweise in dem nativen PS-Protein an der Aminosäurestellung 433 vorliegt, die zu der Aminosäurestellung zwischen 13 und 14 in der SEQ ID NO. 12 korrespondiert.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein PS-Polypeptid mit einer Länge von nicht mehr als ungefähr 100 Aminosäureresten bereit, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die Formel: -QEKQNKHX- (1: 427–434) dargestellt wird, wobei X C oder S ist. In dieser Ausführungsform hat ein beispielhaftes und bevorzugtes Polypeptid die Aminosäuresequenz, die durch die Formel QEKQNKHS (2: 8–15) dargestellt wird.
Zur Information sind andere PS-Polypeptide, ihre Bezeichnungen und ihre PS Aminosäurestellungen in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

¹ Ein unterstrichener Aminosäurerest und das Sternchen an der Polypeptid-Bezeichnung zeigen beide eine Substitution relativ zu der Aminosäuresequenz des nativen PS an. Die Aminosäuresequenz des Polypeptids ist dargestellt, zusammen mit den Klammem, die die SEQ ID NO. und eine Aminosäurenummer-Bezeichnung angeben. Für Aminosäuresequenzen, die als SEQ ID NO. 1 ausgewiesen sind, zeigt die Restnummerspalte die Positionsnummern der Peptidsequenz an. Für Peptide mit den SEQ ID NO. 2–8 und 11–13 zeigt der erste Bereich hinter dem Doppelpunkt die Aminosäurerestnummer-Bezeichnung an, so wie sie in dem Sequenzprotokoll auftritt. Der zweite Bereich, der dem Schrägstrich folgt, zeigt die Aminosäurerestposition an, korrespondierend zu den relativen Positionen in der nativen PS-Sequenz in der SEQ ID Nr. 1.

Aufgrund der dreidimensionalen Struktur eines nativen gefalteten Protein S-Moleküls wurde in der vorliegenden Erfindung bestimmt, dass multiple Regionen des Protein S bei der Kontaktierung von C4BP beteiligt sind, wenn ein PS:C4BP-Komplex gebildet wird, wobei die multiplen und verschiedenen Regionen durch die oben beschriebenen verschiedenen PS-Polypeptide definiert sind. Die Fähigkeit der oben beschriebenen Polypeptide, die PS-Bindung an C4BP zu inhibieren, wird hier in den Beispielen gezeigt.
So umfasst die Erfindung in einer anderen Ausführungsform PS Polypeptid-Zusammensetzungen, die eines oder mehr der verschiedenen PS-Polypeptide umfassen, die oben beschrieben sind, gemischt in Kombinationen um die simultane Inhibition von multiplen Kontaktstellen bereitzustellen, die in einem PS:C4BP-Komplex gebildet werden.
Vorzugsweise ist ein PS-Polypeptid der Erfindung weiter durch seine Fähigkeit gekennzeichnet, ein Epitop (antigene Determinante), die durch PS exprimiert wird, immunologisch nachzuahmen. Ein solches Polypeptid ist hier geeignet als ein Bestandteil in einem Inokulum für die Erzeugung von Antikörpern, die mit nativem PS-Protein eine Immunreaktion eingehen und die vorzugsweise mit freiem PS eine Immunreaktion eingehen.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „immunologisch nachahmen" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen die Fähigkeit eines PS-Polypeptids dieser Erfindung mit einem Antikörper der vorliegenden Erfindung, der ein konserviertes natives Epitop des PS, wie hier definiert, erkennt, eine Immunreaktion einzugehen.
Es sollte verstanden werden, dass ein betroffenes Polypeptid nicht mit der Aminosäuresequenz des PS identisch sein muss, solange es die benötigte Sequenz enthält und in der Lage ist, die PS-Bindung an C4BP, wie hier beschrieben, zu inhibieren.
Ein betroffenes Polypeptid enthält jedes Analog, Fragment oder chemische Derivat eines Polypeptids, dessen Aminosäuresequenz hier dargestellt ist, solange das Polypeptid in der Lage ist, die Protein S-Bindung an C4BP zu inhibieren. Daher kann das vorliegende Polypeptid verschiedenen Veränderungen, Substitutionen, Insertionen und Deletionen unterliegen, solange solche Veränderungen bestimmte Vorteile für seine Verwendung bieten. In diesem Hinblick korrespondiert ein PS-Polypeptid dieser Erfindung zu der Sequenz des Protein S, anstatt mit dieser identisch sein zu müssen, wenn eine oder mehrere Veränderungen durchgeführt wurden, und es behält seine Fähigkeit, die Protein S-Bindung an C4BP in einem oder mehreren der Assays, wie hier definiert, zur Bestimmung der Inhibition der PS:C4BP-Komplexbildung, zu inhibieren.
Die Bezeichnung „Analog" umfasst jedes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen mit der hier spezifisch gezeigten Sequenz identisch ist, wobei einer oder mehrere Reste mit einem funktionell ähnlichen Rest konservativ substituiert wurden, und das die Fähigkeit aufweist, einen PS:C4BP-Komplex zu bilden, wie hier beschrieben. Beispiele für konservative Substitutionen umfassen die Substitution eines nicht polaren (hydrophoben) Restes, wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen, die Substitution eines polaren (hydrophilen) Restes durch einen anderen, wie z. B. zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin und Asparagin, zwischen Glycin und Serin, die Substitution eines basischen Restes, wie z. B. Lysin, Arginin oder Histidin durch einen anderen oder die Substitution eines sauren Restes, wie z. B. Asparaginsäure oder Glutaminsäure durch einen anderen. Beispielhafte Substitutionen können in verschiedenen der inhibitorischen PS-Polypeptide, die hier beschrieben werden und die Sequenzen aufweisen, die mit der Sequenz des nativen PS nicht identisch sind, gesehen werden.
Die Bezeichnung „konservative Substitution" umfasst auch die Verwendung eines chemisch derivatisierten Restes anstelle eines nicht derivatisierten Restes, vorausgesetzt, dass ein solches Polypeptid die benötigte Bindungsaktivität aufweist.
„Chemisches Derivat" bezieht sich auf ein betroffenes Polypeptid mit einem oder mehr Resten, die chemisch durch Reaktion einer funktionellen Seitengruppe derivatisiert sind. Solche derivatisierten Moleküle umfassen z. B. diejenigen Moleküle, bei denen freie Aminogruppen derivatisiert wurden um Aminhydrochloride, p-Toluolsulfonylgruppen, Carbobenzoxygruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen, Chloracetylgruppen oder Formyl gruppen zu bilden. Freie Carboxylgruppen können derivatisiert werden, um Salze, Methyl- und Ethylester oder andere Arten von Estern oder Hydraziden zu bilden. Freie Hydroxylgruppen können derivatisiert werden um O-Acyl- oder O-Alkylderivate zu bilden. Der Imidazolstickstoff von Histidin kann derivatisiert werden um N-im-benzylhistidin zu bilden. Auch enthalten als chemische Derivate sind diejenigen Peptide, die ein oder mehr natürlich auftretende Aminosäurederivate der zwanzig Standardaminosäuren enthalten. Zum Beispiel kann Prolin durch 4-Hydroxyprolin ersetzt werden; Lysin kann durch 5-Hydroxylysin ersetzt werden; Histidin kann durch 3-Methylhistidin ersetzt werden; Serin kann durch Homoserin ersetzt werden und Lysin kann durch Ornithin ersetzt werden. Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthalten auch jedes Polypeptid, das ein oder mehr Additionen und/oder Deletionen oder Reste relativ zu der Sequenz eines Polypeptids aufweist, dessen Sequenz hier dargestellt ist, solange die benötige Aktivität aufrechterhalten bleibt.
Die Bezeichnung „Fragment" bezieht sich auf jedes betroffene Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die kürzer ist als die eines Polypeptids, dessen Aminosäuresequenz hier dargestellt ist.
Wenn ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Sequenz aufweist, die mit der Sequenz von PS nicht identisch ist, ist es typisch, da ein oder mehr konservative oder nicht konservative Substitutionen durchgeführt wurden, wobei in der Regel nicht mehr als ungefähr 30 zahlbezogene Prozent, insbesondere nicht mehr als 20 zahlbezogene Prozent und besonders bevorzugt nicht mehr als 10 zahlbezogene Prozent der Aminosäurereste substituiert sind. Zusätzliche Reste können auch an jedem Terminus hinzugefügt werden um einen „Linker" bereitzustellen, durch den die Polypeptide dieser Erfindung in geeigneter Weise mit einem Markierungsmittel oder einer festen Matrix oder einem Träger verbunden werden können. Vorzugsweise bilden die Linker-Reste keine PS Epitope, d. h. sind in ihrer Struktur dem PS nicht ähnlich.
Markierungsmittel, feste Matrizes und Träger, die mit den Polypeptiden dieser Erfindung verwendet werden können, werden unten beschrieben.
Aminosäurerest-Linker weisen in der Regel mindestens einen Rest oder auch 40 oder mehr Reste auf, besonders häufig 1 bis 10 Reste, bilden jedoch keine PS-Epitope.
Typische Aminosäurereste, die für die Verbindung verwendet werden, sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure oder ähnliche. Zusätzlich kann das betroffene Polypeptid variieren, falls dies nicht anders festgelegt ist, und zwar von der natürlichen Sequenz von PS, indem die Sequenz durch eine terminale -NH₂ Acylierung, z. B. Acetylierung oder eine Thioglycolsäureamidierung, durch eine terminale Carboxylamidierung, z. B. mit Ammoniak, Methylamin und ähnlichen verändert wurde.
Wenn ein PS-Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit einem Träger gekoppelt wird um etwas zu bilden, was auf dem Fachgebiet als Träger-Hapten-Konjugat bekannt ist, ist es in der Lage, Antikörper zu induzieren, die mit PS eine Immunreaktion eingehen. Im Hinblick auf das wohlbekannte Prinzip der immunologischen Kreuzreaktivität umfasst die vorliegende Erfindung daher antigenisch verwandte Varianten der in der Tabelle 1 dargestellten Polypeptide. Eine „antigenisch verwandte Variante" ist ein betroffenes Polypeptid, das in der Lage ist, Antikörpermoleküle zu induzieren, die mit einem Polypeptid aus Tabelle 1 und mit PS eine Immunreaktion eingehen.
Jedes Peptid der vorliegenden Erfindung kann in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes verwendet werden. Geeignete Säuren, die in der Lage sind, Salze mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung zu bilden, umfassen anorganische Säuren, wie Salzsäure, Hydrobromsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphoressigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxasäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure oder ähnliche.
Geeignete Basen, die in der Lage sind, Salze mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung zu bilden, umfassen anorganische Basen, wie Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid und ähnliche; und organische Basen, wie z. B. Mono-, Di- und Trialkyl- und Arylamine (z. B. Triethylamin, Diisopropylamin, Methylamin, Dimethylamin und ähnliche) und optional substituierte Ethanolamine (z. B. Ethanolamin, Diethanolamin und ähnliche).
Ein PS-Polypeptid der vorliegenden Erfindung, auf das hier auch als betroffenes Polypeptid Bezug genommen wird, kann durch jedes dem Fachmann auf dem Gebiet der Polypeptide bekannte Verfahren hergestellt werden, einschließlich durch rekombinante DNA Verfahren. Synthetische chemische Verfahren, wie z. B. die Festphasensynthese vom Merrifield-Typ, werden aufgrund der Reinheit, der antigenen Spezifität, der Freiheit von unerwünschten Nebenprodukten, der einfachen Produktion und ähnlichem bevorzugt. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der vielen Verfahren, die zur Verfügung stehen, kann J. M. Steward und J. D. Young, „Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky, et al., „Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, Zweite Ausgabe, 1976 und J. Meienhofer, „Hormonal Proteins and Peptides", Bd. 2, S. 46, Academic Press (New York), 1983 für die Festphasen-Peptidsynthese und E. Schroder und K. Kubke „The Peptides", Bd. 1, Academic Press (New York), 1965 für die klassische Lösungssynthese entnommen werden. Geeignete Schutzgruppen, die bei einer solchen Synthese verwendbar sind, sind in den obigen Texten beschrieben sowie in J. F. W. McOmie, „Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973.
Im Allgemeinen umfassen die betrachteten Festphasen-Syntheseverfahren die sequentielle Addition von ein oder mehr Aminosäureresten oder geeignet geschützten Aminosäureresten an eine wachsende Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Amino- oder die Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerestes durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine andere, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für die Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitengruppe aufweisen, wie z. B. Lysin.
Unter Verwendung der Festphasensynthese als Beispiel wird die geschützte oder derivatisierte Aminosäure an einen inerten festen Träger über ihre ungeschützte Carboxyl- oder Aminogruppe angehaftet. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann selektiv entfernt und die nächste Aminosäure in der Sequenz mit einer komplementären (Amino oder Carboxyl) Gruppe, die in geeigneter Weise geschützt ist, wird zugemischt und unter geeigneten Bedingungen für die Bildung der Amidbindung mit dem bereits an dem festen Träger befestigten Rest umgesetzt. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann von diesem neu hinzugefügten Aminosäurerest entfernt und die nächste Aminosäure (in geeigneter Weise geschützt) wird dann hinzugefügt und so weiter. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Sequenz miteinander verbunden wurden, werden alle verbleibenden die terminalen und Seitengruppen schützenden Gruppen (und der feste Träger) sequentiell oder gleichzeitig entfernt um das endgültige Polypeptid zu ergeben.
Ein PS-Polypeptid kann inter alia für diagnostische Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung verwendet werden um PS, das in einer Körperprobe vorliegt, nachzuweisen oder es kann verwendet werden um ein Inokulum herzustellen, wie hier beschrieben, für die Herstellung von Antikörpern, die mit den konservierten Epitopen auf PS eine Immunreaktion eingehen.
Zusätzlich kann ein PS-Polypeptid dieser Erfindung für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Thrombose verwendet werden.
C. Antikörper und monoklonale Antikörper
Die Bezeichnung „Antikörper" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier als kollektives Substantiv verwendet, das sich auf eine Population von Immunglobulinmolekülen und/oder immunologisch aktive Teile der Immunglobulinmoleküle bezieht, d. h. Moleküle, die eine Antikörperbindungsstelle oder ein Paratop aufweisen.
Eine „Antikörperbindungsstelle" ist derjenige strukturelle Anteil eines Antikörpermoleküls, der aus schweren Ketten und leichten Ketten aufgebaute variable und hypervariable Regionen umfasst, die spezifisch ein Antigen binden.
Die Bezeichnung „Antikörpermolekül" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen, wie hier verwendet, umfasst sowohl ein intaktes Immunglobulinmolekül als auch einen immunologisch aktiven Teil eines Immunglobulinmoleküls.
Beispielhafte Antikörpermoleküle zur Verwendung für diagnostische Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung sind intakte Immunglobulinmoleküle, im Wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und diejenigen Anteile eines Immunglobulinmoleküls, die das Paratop enthalten, einschließlich derjenigen Teile, die auf dem Fachgebiet als Fab, Fab', F(ab')₂ und F(v) bekannt sind.
Fab und F(ab')₂ Teile der Antikörper werden durch die proteolytische Reaktion von Papain bzw. Pepsin an im Wesentlichen intakten Antikörpern durch wohlbekannte Verfahren hergestellt. Siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,342,566 für Theofilopolous und Dixon. Fab' Antikörperteile sind ebenfalls wohlbekannt und werden aus den F(ab')₂ Teilen hergestellt, gefolgt von einer Reduktion der Disulfidbindungen, die die beiden schweren Ket tenteile verbinden, wie mit Mercaptoethanol und gefolgt von einer Alkylierung des resultierenden Proteinmercaptans mit einem Reagenz, wie z. B. Iodacetamid. Antikörper, die intakte Antikörpermoleküle enthalten, werden bevorzugt und werden hier illustrativ verwendet.
Somit stellt die Erfindung bereit: einen Antikörper, der die Bindung von Protein S an das C4b Bindungsprotein hemmt, und der eine Immunreaktion zeigt mit:

(a) Protein S und
(b) einem Polypeptid mit einer Aminosäurerestsequenz, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: SGIKKIIQEKQNKC (12: 1–14), der aber keine Immunreaktion mit dem Polypeptid zeigt, das eine Aminosäurerestsequenz aufweist, welche durch die Formel CTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS (1: 103–131) repräsentiert wird.

Die Bezeichnung „im Wesentlichen frei" bedeutet, dass die Antikörpermoleküle nicht mit dem genannten Antigen in einer Menge im Bereich der einfachen Größenordnung und vorzugsweise im Bereich der zweifachen Größenordnung der Menge der Immunreaktion bei einer Art des zitierten Antigens, das mit dem Antikörpermolekül eine Immunreaktion eingeht, eine Immunreaktion eingehen, wenn die Immunreaktion als eine Gleichgewichtskonstante zwischen gebundenem ("immun-reagiertem") und nichtgebundenem Antigen ausgedrückt wird.
Basierend auf den vorliegenden Lehren wurde entdeckt, dass Antikörpermoleküle, die mit einem PS-Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Immunreaktion eingehen, die Fähigkeit aufweisen, mit einer Stelle auf dem PS eine Immunreaktion einzugehen, die für eine Immunreaktion nicht zugänglich ist, wenn das PS in einem Komplex mit C4BP vorliegt. Auf diese Weise gehen die Antikörpermoleküle der vorliegenden Erfindung keine Immunreaktion mit dem PS:C4BP-Komplex ein, binden jedoch an PS_F.
Ein anti-PS-Antikörper, der mit PS eine Immunreaktion eingeht, jedoch keine Immunreaktion mit PS in einem PS-C4BP-Komplex eingeht, wird hier auch als eine Immunreaktion mit freiem PS", das hier auch als PS_F bezeichnet wird, eingehend bezeichnet. Ein solcher Antikörper, der hier auch als ein anti-PS_F-Antikörper bezeichnet wird, ist ein Antikörper, der mit PS_F eine Immunreaktion eingeht und ist ein Antikörper, der immunspezifisch für PS_F ist, d. h. der nicht an einen PS:C4BP-Komplex bindet. Ein solcher Antikörper ist besonders geeignet, wie unten beschrieben, zur Verwendung in diagnostischen Assays zur Messung von PS_F in flüssigen Proben.
Zusätzlich weist ein bevorzugter anti-PS-Antikörper, der für PS_F immunspezifisch ist, die Fähigkeit auf, die Protein S-Bindung an das C4b-Bindungsprotein zu inhibieren.
Die Antikörper-Immunreaktivität mit den PS-haltigen Antigenen kann durch eine Vielzahl von immunologischen Assays, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gemessen werden. Eine beispielhafte Immunreaktion eines anti-PS-Antikörpers mit einem PS-Polypeptid wird in Beispiel 2 beschrieben. Die direkte Bindung mit isoliertem PS (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 2c) und mit PS-Polypeptiden kann mindestens durch die Verfahren überprüft werden, die in Beispiel 2 beschrieben sind.
Ein Antikörper der vorliegenden Erfindung wird im typischen Fall hergestellt, indem ein Säugetier mit einem Inokulum immunisiert wird, das ein PS-Polypeptid dieser Erfindung enthält, wodurch in dem Säugetier Antikörpermoleküle induziert werden, die eine Immunspezifität für das immunisierte PS-Polypeptid aufweisen. Die Antikörpermoleküle werden dann von dem Säugetier gesammelt und zu dem gewünschten Ausmaß durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Verfahren isoliert, wie z. B. unter Verwendung von DEAE Sephadex um eine IgG-Fraktion zu erhalten. Beispielhafte Antikörper-Präparationsverfahren unter Verwendung von PS-Polypeptiden in dem Immunogen sind hier in Beispiel 2 beschrieben.
Die Präparation von Antikörpern gegen Polypeptide ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt [siehe Staudt et al., J. Exp. Med. 157: 687–704 (1983)]. Kurz gefasst wird zur Erzeugung einer Peptid-Antikörper-Zusammensetzung dieser Erfindung einem Laborsäugetier eine immunologisch effektive Menge eines PS-Polypeptids inokuliert, das im typischen Fall in einem Vakzin der vorliegenden Erfindung vorliegt. Die anti-PS-Polypeptid-Antikörpermoleküle, die dadurch induziert werden, werden dann von dem Säugetier gesammelt und diejenigen, die für sowohl das PS-Polypeptid als auch das isolierte PS immunspezifisch sind, werden durch die bekannten Verfahren, wie z. B. durch eine Immunoaffinitätschromatografie, zu dem gewünschten Ausmaß isoliert.
Um die Spezifität des Antikörpers zu erhöhen werden die Antikörper vorzugsweise durch Immunoaffinitätschromatografie unter Verwendung eines an eine feste Phase gebundenen immunisierenden Polypeptids gereinigt. Der Antikörper wird mit dem an die feste Phase gebundenen immunisierenden Polypeptid für eine ausreichende Zeitspanne in Kontakt gebracht, damit das Polypeptid mit den Antikörpermolekülen eine Immunreaktion eingehen kann um einen an die feste Phase gebundenen Immunkomplex zu bilden. Die gebundenen Antikörper werden durch Standardverfahren von dem Komplex getrennt. Beispielhafte Immunoaffinitätsreinigungsverfahren für die Herstellung eines durch Immunoaffinität gereinigten anti-PS-Antikörpers dieser Erfindung sind in Beispiel 3 beschrieben.
Das Wort „Inokulum" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier verwendet um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein PS-Polypeptid dieser Erfindung als aktiven Bestandteil enthält, der für die Herstellung von Antikörpern gegen ein PS-Polypeptid verwendet wird. Wenn ein Polypeptid in einem Inokulum verwendet wird um Antikörper zu induzieren, sollte verstanden werden, dass das Polypeptid in verschiedenen Ausführungsformen, z. B. allein oder gebunden an einen Träger als ein Konjugat, oder als ein Polypeptidpolymer verwendet werden kann. Zum Zwecke der einfachen Ausdrucksweise und im Zusammenhang mit einem Polypeptid Inokulum werden die verschiedenen Ausführungsformen der Polypeptide dieser Erfindung hier kollektiv mit der Bezeichnung „Polypeptid" und dessen verschiedenen grammatikalischen Formen bezeichnet.
Für ein Polypeptid, das weniger als ungefähr 35 Aminosäurereste enthält, ist es vorzuziehen, das es an einen Träger gebunden wird, um die Produktion der Antikörper zu induzieren.
Ein oder mehr zusätzliche Aminosäurereste können den Amino- oder Carboxytermini des Polypeptids hinzugefügt werden um bei der Bindung des Polypeptids an einen Träger zu assistieren. Es hat sich herausgestellt, dass Cysteinreste, die den Amino- oder Carboxytermini des Polypeptids hinzugefügt wurden, besonders geeignet für die Bildung von Konjugaten über Disulfidbindungen sind. Es können jedoch auch andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden.
Die Techniken der Polypeptid-Konjugation oder der Kopplung durch aktivierte funktionelle Gruppen, die zur Zeit auf dem Fachgebiet bekannt sind, sind insbesondere anwendbar. Siehe z. B. Aurameas et al., Scand. J. Immunol. Bd. 8 Suppl. 7: 7–23 (1978), und U.S.-Patent Nr. 4,493,795, Nr. 3,791,932 und Nr. 3,839,153. Zusätzlich kann eine stellungsgerichtete Kopplungsreaktion durchgeführt werden, so dass jeder Aktivitätsverlust aufgrund der Polypeptidorientierung nach der Kopplung minimiert werden kann. Siehe z. B. Rodwell et al., Biotech. 3: 889–894 (1985) und U.S.-Patent Nr. 4,671,958.
Beispielhafte zusätzliche Verbindungsverfahren umfassen die Verwendung von Michael Additions-Reaktionsprodukten, Dialdehyden wie z. B. Glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147: 318–326 (1983) und ähnliche oder die Verwendung der Carbodiimid-Technologie wie bei der Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids zur Bildung von Amidbindungen an den Träger. Alternativ kann der heterobifunktionelle Vernetzer SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) verwendet werden, um Peptide zu konjugieren, bei denen ein carboxyterminales Cystein eingeführt wurde.
Geeignete Träger sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind in der Regel selbst Proteine. Beispielhaft für solche Träger sind Keyhole-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH), Edestin, Thyroglobulin, Albumine, wie Rinderserumalbumin (BSA) oder menschliches Serumalbumin (HSA), rote Blutzellen, wie z. B. Schaferythrozyten (SRBC), Tetanus-Toxoid, Cholera-Toxoid, wie auch Polyaminosäuren, wie z. B. Poly D-Lysin D-Glutaminsäure und ähnliche.
Die Wahl des Trägers ist stärker von der endgültigen Verwendung des Inokulums abhängig und basiert auf Kriterien, die nicht besonders an der vorliegenden Erfindung beteiligt sind. Es sollte z. B. ein Träger gewählt werden, der keine ungeeignete Reaktion bei dem bestimmten Tier, das inokuliert wird, erzeugt.
Das vorliegende Inokulum enthält eine effektive immunogene Menge eines Polypeptids dieser Erfindung, im typischen Fall als ein Konjugat, verbunden mit einem Träger. Die effektive Menge eines Polypeptids pro Einheitsdosierung, die ausreicht um eine Immunantwort auf das immunisierende Polypeptid zu induzieren, hängt unter anderen Dingen von der Art des inokulierten Tieres, dem Körpergewicht des Tieres und der gewählten Inokulations-Behandlungsvorschrift ab, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Inokula enthalten im typischen Fall Polypeptidkonzentrationen von ungefähr 10 Mikrogramm (μg) bis ungefähr 500 Milligramm (mg) pro Inokulation (Dosis), vorzugsweise ungefähr 50 Mikrogramm bis ungefähr 50 Milligramm pro Dosis.
Die Bezeichnung „Einheitsdosis" bezieht sich, wenn sie sich auf die Inokula bezieht, auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einzelne Dosierungen für Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine bestimmte Menge des aktiven Materials enthält, berechnet, um den gewünschten immunogenen Effekt in Assoziation mit dem benötigten Verdünnungsmittel zu erzeugen; d. h. Träger oder Vehikel. Die Spezifikationen für die neue Einheitsdosis eines Inokulums dieser Erfindung werden durch (a) die einzigartigen Eigenschaften des aktiven Materials und die besondere immunologische Wirkung, die erzeugt werden soll und (b) die Begrenzungen, denen die Herstellung von Zusammensetzungen eines solchen aktiven Materials für die immunologische Verwendung bei Tieren, wie hier im Detail offenbart, unterliegen, bestimmt und sind direkt von diesen abhängig, wobei diese Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.
Inokula werden im typischen Fall aus getrocknetem festem Polypeptid-Konjugat durch Dispersion des Polypeptid-Konjugats in einem physiologisch tolerierbaren (akzeptablen) Verdünnungsmittel, wie z. B. Wasser, Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zur Bildung einer wässrigen Zusammensetzung hergestellt.
Inokula können auch ein Adjuvans als Teil des Verdünnungsmittels enthaften. Adjuvantien, wie das komplette Freund's Adjuvans (CFA), das inkomplette Freund's Adjuvans (IFA) und Alaun sind Materialien, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind und die kommerziell von verschiedenen Quellen erhältlich sind.
Der so hergestellte Antikörper kann inter alia für die diagnostischen Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von freiem PS (PS, das nicht an C4BP gebunden ist) verwendet werden, das in einer Probe, wie z. B. einer Körperflüssigkeitsprobe, vorliegt. Siehe z. B. die zumindest in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren. Anti-PS-Antikörper, die die Protein S-Bindung an C4BP inhibieren, können ebenfalls in vivo für therapeutische Verfahren als ein Antikoagulans und ein antithrombotisches Mittel verwendet werden. Assays für die Messung der Kapazität zur Inhibition von PS-Bindung an C4BP sind in Beispiel 5 beschrieben.
Ein bevorzugter anti-PS-Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper und wird hier als beispielhaft für einen anti-PS-Antikörper verwendet.
Die Bezeichnung „monoklonaler Antikörper" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen bezieht sich auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Art einer Antikörperbindungsstelle enthält, die in der Lage ist, mit einem bestimmten Epitop eine Immunreaktion einzugehen. Ein monoklonaler Antikörper zeigt so im typischen Fall eine einzige Bindungsaffinität für jedes Epitop, mit dem er eine Immunreaktion eingeht. Ein monoklonaler Antikörper kann daher ein Antikörpermolekül mit einer Vielzahl von Antikörperbindungsstellen sein, wobei jede für ein anderes Epitop immunspezifisch ist, z. B. ein bispezifischer monoklonaler Antikörper.
Ein monoklonaler Antikörper dieser Erfindung umfasst Antikörpermoleküle, die die Protein S-Bindung an das C4b-Bindungsprotein inhibieren, wie hier beschrieben. Ein monoklonaler Antikörper dieser Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass er in der Lage ist, mit 1) isoliertem Protein S und 2) einem PS-Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Immunreaktion einzugehen, wie beschrieben für die anti-PS-Antikörper dieser Erfindung.
Ein monoklonaler Antikörper besteht im typischen Fall aus Antikörpern, die durch Klone einer einzelnen Zelle erzeugt werden, die Hybridom genannt wird, das nur eine Art eines Antikörpermoleküls sezerniert (produziert). Die Hybridomzelle wird durch Fusion einer Antikörper-erzeugenden Zelle und eines Myeloms oder einer anderen sich selbst vervielfältigenden Zelllinie gebildet. Die Präparation solcher Antikörper wurde zuerst von Kohler und Milstein, Nature, 256: 495–497 (1975) beschrieben. Die Hybridom-Überstände, die so hergestellt werden, können auf die Gegenwart von Antikörpermolekülen hin untersucht werden, die mit einem PS-Polypeptid eine Immunreaktion eingehen oder auf die Inhibition von PS-Bindung an C4BP wie hier weiter beschrieben.
Kurz gefasst, wird ein Myelom oder eine andere sich selbst vervielfältigende Zelllinie mit Lymphozyten fusioniert, die aus der Milz eines Säugetiers gewonnen wurden, das mit einem PS-Antigen hyperimmunisiert wurde, wie einem, das in einem PS-Polypeptid dieser Erfindung vorliegt, um das Hybridom zu bilden, von dem die monoklonale Antikörper-Zusammensetzung gebildet wird. Die Polypeptid-induzierte Hybridom-Technologie wird von Niman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4949–4953 (1983) beschrieben.
Es wird bevorzugt, dass die Myelomzelllinie, die verwendet wird um ein Hybridom herzustellen, von derselben Art wie die Lymphozyten stammt. Im typischen Fall ist eine Maus des Stammes 129 GIX⁺ das bevorzugte Säugetier. Geeignete Mausmyelome zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-sensiblen (HAT) Zelllinien P3X63-Ag8.653 und Sp2/0-Ag14, die von der American Type Culture Collection, Rockville, MD unter den Bezeichnungen CRL 1580 bzw. CRL 1581 zu erhalten sind.
Splenozyten werden im typischen Fall mit den Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) 1500 fusioniert. Fusionierte Hybride werden durch ihre Sensibilität gegenüber HAT selektioniert. Die Hybridome, die einen monoklonalen Antikörper dieser Erfindung erzeugen, werden unter Verwendung des Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assays (ELISA), wie beschrieben in Beispiel 4, identifiziert.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung kann auch durch Initiation einer monoklonalen Hybridomkultur erzeugt werden, die ein Nährmedium umfasst, enthaltend ein Hybridom, das Antikörpermoleküle der geeigneten Polypeptidspezifität erzeugt und sezerniert. Die Kultur wird unter Bedingungen und einer Zeitspanne, die ausreichen, damit das Hybridom die Antikörpermoleküle in das Medium sezernieren kann, gehalten. Das Antikörper-haltige Medium wird dann gesammelt. Die Antikörpermoleküle können dann weiter durch die wohlbekannten Verfahren isoliert werden.
Medien, die für die Präparation dieser Zusammensetzungen geeignet sind, sind sowohl auf dem Fachgebiet wohlbekannt als auch kommerziell erhältlich und umfassen synthetische Kulturmedien, Inzucht-Mäuse und ähnliche. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist Dulbecco's Minimal – Essential Medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8: 396 (1959)), supplementiert mit 4,5 g/l Glucose, 20 mm Glutamin und 20 % fötalem Kälberserum. Ein beispielhafter Inzucht-Mausstamm ist der Balb/c.
Andere Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers, einer Hybridomzelle oder einer Hybridomzellkultur sind ebenfalls wohlbekannt. Siehe zum Beispiel das Verfahren zur Isolierung von monoklonalen Antikörpern aus einem immunologischen Repertoire, wie beschrieben von Sastry et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728–5732 (1989) und Huse et al., Science 246: 1275–1281 (1989).
Die monoklonalen Antikörper dieser Erfindung können in derselben Weise wie hier offenbart für Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der monoklonale Antikörper kann z. B. für medizinische Verwendungen, diagnostische oder in vitro-Verfahren verwendet werden, wie hier offenbart, wobei die Inhibition der Protein S-Bindung an das C4b-Bindungsprotein gewünscht wird.
Ebenfalls mit umfasst durch diese Erfindung sind die Hybridomzelle und Kulturen, die eine Hybridomzelle enthalten, die einen monoklonalen Antikörper dieser Erfindung erzeugen.
Ein solcher monoklonaler Antikörper ist der monoklonale Antikörper, der durch das Hybridom LJS 56 (MAb 56) erzeugt wird, der mit PS_F eine Immunreaktion eingeht und das PS Polypeptid PSP-12, das die Aminosäuresequenz SGIKEIIQEKQNKHC (1: 420–434) aufweist. Das Hybridom geht auch mit dem PS Polypeptid eine Immunreaktion ein, das als PS-loop bezeichnet wird und das die Aminosäuresequenz CIRSWNLMKQGASIKEIIQEKQNKHC (11: 1–26) aufweist. MAb 56 wurde wie in Beispiel 4 unter Verwendung von PS-Polypeptid PSP-12 als Immunogen erzeugt. Ein zweiter monoklonaler Antikörper, funktionell äquivalent zu MAb 56, wurde durch dieselben Verfahren isoliert und wird als MAb 418 bezeichnet.
Das Hybridom LJS 56 wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD am 26. Juni 1991 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer HB 10818.
Ein anderer monoklonaler Antikörper, der durch das Hybridom LJS S-7 (MAb S-7) erzeugt wurde, geht mit PS eine Immunreaktion ein, wenn es in einem PS:C4BP-Komplex vorliegt, und wird hier als Fang-Antikörper verwendet, der mit dem „gesamten PS", auch bezeichnet als PS_T, eine Immunreaktion eingeht. MAb S-7 wurde wie in Beispiel 6 beschrieben unter Verwendung von isoliertem PS als Immunogen hergestellt.
Das Hybridom LJS S-7 wurde gemäß den Anforderungen des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, am 26. Juni 1991 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer HB 10819.
Die Hybridome LJS 56 und LJS S-7 wurden bei einer Hinterlegungsstelle hinterlegt, die die Dauer der Hinterlegung und einen unproblematischen Zugriff darauf durch die Öffentlichkeit nach Erteilung eines Patents sicherstellt, unter den Bedingungen, die sicherstellen, dass der Zugriff auf die Hybridome während der Anhängigkeit der Patentanmeldung gewährleistet ist, für diejenigen Personen, die der Commissioner für einen solchen Zugriff für geeignet erachtet, und wobei alle Restriktionen im Hinblick auf die Verfügbarkeit der hinterlegten Hybridome für die Öffentlichkeit bei Erteilung des Patentes unwiderruflich entfernt werden. Die hinterlegten Hybridome werden von der ATCC für die Zeitdauer des Patents oder 30 Jahre ab Datum der Hinterlegung, je nachdem welche Zeitspanne länger ist, und jedenfalls mindestens fünf Jahre nach dem Datum des letzten Antrags auf Zugriff aufbewahrt.
D. Diagnostische Systeme
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein diagnostisches System, vorzugsweise in Kit-Form, für die Untersuchung auf die Gegenwart von freiem Protein S (PS_F) in einer flüssigen Probe, wie z. B. Blut, Plasma oder Serum, wobei es wünschenswert ist, die Gegenwart und vorzugsweise die Menge von PS_F in einer Probe gemäß den hier beschriebenen diagnostischen Verfahren nachzuweisen. Das diagnostische System umfasst in einer ausreichenden Menge für die Durchführung von mindestens einem Assay ein betroffenes PS-Polypeptid und/oder einen betroffenen Antikörper oder monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, als ein separat verpacktes Reagenz. Beispielhafte diagnostische Systeme für den Nachweis von PS_F in einer Körperprobe und die Verwendung eines PS-Polypeptids oder eines Antikörpers dieser Erfindung sind in Beispiel 6 beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform wird ein diagnostisches System, vorzugsweise in Kit-Form, vorgestellt, um auf die Gegenwart eines PS-Polypeptids oder eines anti-PS-Antikörpers in einer Körperflüssigkeitsprobe zu prüfen, z. B. um das Schicksal von therapeutisch verabreichtem PS-Polypeptid oder anti-PS-Antikörper zu verfolgen. Das System umfasst in einer für mindestens einen Assay ausreichenden Menge ein betroffenes PS-Polypeptid und/oder einen betroffenen Antikörper als ein separat verpacktes immunochemisches Reagenz.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein diagnostisches System, vorzugsweise in Kit-Form, vorgestellt, das gemäß den vorliegenden Verfahren auf die Gegenwart von C4b-Bindungsprotein (C4BP) prüfen kann, das in der Lage ist, mit PS zu binden (kompetent für eine Bindung) und zwar in einer Körperflüssigkeitsprobe, wie z. B Blut, Plasma oder Serum. Ein solche Art von C4BP wird hier als kompetentes C4BP bezeichnet. Im Hinblick auf die Gegenwart verschiedener Formen von C4BP in den vaskulären Flüssigkeiten, von denen einige nicht in der Lage sind, PS_F zu binden, da sie bereits in einem Komplex mit PS vorliegen, oder da sie Arten von C4BP darstellen, die zu einer Bindung mit PS nicht in der Lage sind, ist der Nachweis der Gegenwart und vorzugsweise der Menge von kompetentem C4BP in einer vaskulären Flüssigkeit wünschenswert. Das System umfasst in einer für mindestens einen Assay ausreichenden Menge, ein betroffenes PS-Polypeptid und/oder einen betroffenen Antikörper als ein separat verpacktes immunochemisches Reagenz. Beispielhafte Systeme werden in Beispiel 7 beschrieben.
Instruktionen für die Verwendung des verpackten Reagenzes (der verpackten Reagenzien) sind im typischen Fall ebenfalls enthalten.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Verpackung" auf eine feste Matrix oder ein Material wie Glas, Kunststoff (z. B. Polyethylen, Polypropylen oder Polycarbonat), Papier, Folie oder ähnliches, das in der Lage ist ein Polypeptid, einen polyklonalen Antikörper oder einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung in festgelegten Grenzen zu halten. Die Verpackung kann so z. B. ein Glasröhrchen sein, das verwendet wird, um Milligramm-Mengen eines bestimmten Polypeptids oder Antikörpers zu enthalten, oder es kann sich um eine Mikrotiterplatte handeln, an die Mikrogramm-Mengen eines bestimmten Polypeptids oder Antikörpers operativ befestigt wurden, d.h. so verbunden, um in der Lage zu sein, durch einen Antikörper bzw. ein Antigen immunologisch gebunden zu werden.
„Instruktionen für die Anwendung" umfassen im typischen Fall eine greifbare Ausdrucksweise, die die Reagenzienkonzentration oder mindestens ein Assay-Verfahrensparameter so beschreibt, dass die relativen Mengen von Reagenz und Probe, die vermischt werden sollten, die Halteperioden für die Mischungen aus Reagenz und Probe, die Temperatur, die Pufferbedingungen und ähnliches beschrieben werden.
Ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise auch ein Markierungsmittel oder einen Indikator, der in der Lage ist, die Bildung eines Immunkomplexes zu signalisieren, der ein Polypeptid oder ein Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung enthält.
Das Wort „Komplex", wie hier verwendet, bezieht sich auf das Produkt einer spezifischen Bindungsreaktion, wie z. B. einer Antikörper-Antigen- oder Rezeptor-Liganden-Reaktion. Beispielhafte Komplexe sind Immunreaktionsprodukte.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Bezeichnungen „Markierungsmittel" und „Indikator" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen auf einzelne Atome und Moleküle, die direkt oder indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals zur Anzeige der Gegenwart eines Komplexes beteiligt sind. Jedes Markierungsmittel oder jeder Indikator kann mit einem exprimierten Protein, Polypeptid oder Antikörpermolekül, das Teil eines Antikörpers oder einer monoklonalen Antikörper-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist, verbunden oder in dieser inkorporiert werden, und es kann getrennt verwendet werden, und diese Atome oder Moleküle können allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien verwendet werden. Solche Markierungsmittel sind selbst in der klinischen diagnostischen Chemie wohlbekannt und bilden nur insofern einen Teil dieser Erfindung, als sie mit ansonsten neuen Proteinverfahren und/oder Systemen verwendet werden.
Die Markierungsmittel können fluoreszierende Markierungsmittel sein, die chemisch an die Antikörper oder Antigene binden, ohne sie zu denaturieren, um ein Fluorochrom (Farbstoff) zu bilden, der als Immunofluoreszenz-Tracer geeignet ist. Geeignete fluoreszente Markierungsmittel sind die Fluorochrome, wie z. B. Fluoresceinisocyanat (FIC), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), 5-Dimethylamin-1-naphthalinsulfonylchlorid (DANSC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), Lissamin, Rhodamin 8200 Sulfonylchlorid (RB 200 SC) und ähnliche. Eine Beschreibung der Immunfluoreszenz-Analysetechniken findet sich in DeLuca, "Immunofluorescence Analysis" in Antibody As a Tool, Marchalonis et al., Hrgs, John Wiley & Sons, Ltd. S. 189–231 (1982).
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Indikatorgruppe ein Enzym, wie z. B. Meerrettichperoxidase (HRP), Glucoseoxidase oder ähnliche. In solchen Fällen, in denen die Hauptindikatorgruppe ein Enzym, wie HRP oder Glucoseoxidase ist, werden zusätzliche Reagenzien benötigt um die Tatsache zu visualisieren, dass ein Rezeptor-Liganden-Komplex (Immunoreaktant) gebildet wurde. Solche zusätzlichen Reagenzien für HRP umfassen Wasserstoffperoxid und einen Vorläufer für einen Oxidationsfarbstoff wie z. B. Diaminobenzidin. Ein zusätzliches Reagenz, das für Glucoseoxidase geeignet ist, ist 2,2'-Amino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-G-sulfonsäure) (ABTS).
Radioaktive Elemente sind ebenfalls geeignete Markierungsmittel und werden hier illustrativ verwendet. Ein beispielhaftes Radiomarkierungsmittel ist ein radioaktives Element, das Gammastrahlenemissionen erzeugt. Elemente, die selbst Gammastrahlen emittieren, wie z. B. ¹²⁴I, ¹²⁵I,¹²⁸I, ¹³²I und ⁵¹Cr stellen eine Klasse einer radioaktiven Element-Indikatorgruppe dar, die Gammastrahlen emittiert. Besonders bevorzugt wird ¹²⁵I. Eine andere Gruppe geeigneter Markierungsmittel sind diejenigen Elemente, wie ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O und ¹³N, die selbst Positronen emittieren. Die Positronen, die so emittiert werden, erzeugen nach Auftreffen auf Elektronen, die in dem Körper des Tiers vorliegen, Gammastrahlen. Ebenfalls geeignet ist ein Beta-Emittierer, wie z. B. ¹¹¹Indium oder ³H.
Die Verbindung von Markierungsmitteln, d.h. die Markierung von Polypeptiden und Proteinen, ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Die Antikörpermoleküle, die von einem Hybridom erzeugt werden, können z. B durch metabolische Inkorporation der radioisotophaltigen Aminosäuren, die als Bestandteil im dem Kulturmedium bereitgestellt werden, markiert werden. Siehe z. B. Galfre et al., Meth. Enzymol, 73: 3–46 (1981). Die Techniken der Protein-Konjugation oder Kopplung durch aktivierte funktionelle Gruppen sind insbesondere anwendbar. Siehe z. B. Aurameas et al., Scand. J. Immunol. Bd. 8, Suppl. 7: 7–23 (1978), Rodwell et al., Biotech. 3: 889–894 (1984) und U.S.-Patent Nr. 4,493,795.
Die diagnostischen Systeme können auch, vorzugsweise in separater Verpackung, ein spezifisches Bindemittel enthalten. Ein „spezifisches Bindemittel" ist eine molekulare Einheit, die in der Lage ist, selektiv eine Reagenzart der vorliegenden Erfindung oder einen Komplex, der eine solche Art enthält, zu binden, das jedoch selbst nicht ein Polypeptid oder eine Antikörper-Molekül-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist. Beispielhafte spezifische Bindungsmittel sind zweite Antikörpermoleküle, Komplementproteine oder Fragmente davon, S. aureus Protein A und ähnliche. Vorzugsweise bindet das spezifische Bindemittel die Reagenzspezies, wenn diese Spezies als Teil eines Komplexes vorliegt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das spezifische Bindemittel markiert. Wenn jedoch das diagnostische System ein spezifisches Bindemittel enthält, das nicht markiert ist, wird das Mittel im typischen Fall als ein Vervielfältigungsmittel oder als Reagenz verwendet. Bei diesen Ausführungsformen ist das markierte spezifische Bindemittel in der Lage, das Vervielfältigungsmittel spezifisch zu binden, wenn das Vervielfältigungsmittel an einen eine Reagenzart enthaltenden Komplex gebunden ist.
Die diagnostischen Kits der vorliegenden Erfindung können in einem „ELISA" Format verwendet werden um die Quantität von PS_F oder von kompetentem C4BP in einer vaskulären Flüssigkeitsprobe, wie z. B. Blut, Serum oder Plasma nachzuweisen. „ELISA" bezieht sich auf einen enzymgebundenen Immunosorbent-Assay, der einen Antikörper oder ein Antigen, gebunden an eine feste Phase, und ein Enzym-Antigen- oder Enzym-Antikörper-Konjugat verwendet um die Menge eines Antigens, die in einer Probe vorliegt, nachzuweisen und zu quantifizieren. Eine Beschreibung der ELISA Technik findet sich in Kapitel 22 der 4. Ausgabe von Basic and Clinical Immunology von D. P. Sites et al., veröffentlicht von Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1982 und in den U.S.-Patenten Nr. 3,654,090; Nr. 3,850,752; und Nr. 4,016,043.
Auf diese Weise können in einigen Ausführungsformen ein PS-Polypeptid, ein Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung an eine feste Matrix gebunden werden, um einen festen Träger zu bilden, der eine Verpackung in den betroffenen diagnostischen Systemen umfasst.
Ein Reagenz wird im typischen Fall durch Adsorption aus einem wässrigen Medium an eine feste Matrix angehaftet, obwohl andere Befestigungsweisen, die für Proteine und Polypeptide verwendbar sind, verwendet werden können und dem Fachmann wohlbekannt sind. Beispielhafte Adsorptionsverfahren werden hier beschrieben.
Geeignete feste Matrizes sind ebenfalls auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Solche Materialien sind wasserunlöslich und umfassen das vernetzte Dextran, das unter der Marke SEPHADEX von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) erhältlich ist; Agarose; Kügelchen von Polystyrol, wobei die Kügelchen einen Durchmesser von ungefähr 1 Mikron (μ) bis ungefähr 5 Millimeter (mm) aufweisen und von Abbott Laboratories, North Chicago, IL, erhältlich sind; Polyvinylchlorid, Polystyrol, vernetztes Polyacrylamid, auf Nitrocellulose oder Nylon basierende Netze, wie z. B. Blätter, Streifen oder Paddel; oder Rohre, Platten oder die Vertiefungen von Mikrotiterplatten, wie z. B. denjenigen, die aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid hergestellt werden.
Die Reagenzart, das markierte spezifische Bindemittel oder das Vervielfältigungsmittel von jedem hier beschriebenen diagnostischen System kann in einer Lösung, wie in einer flüssigen Dispersion oder als im Wesentlichen trockenes Pulver, z. B. in lyophilisierter Form, bereitgestellt werden. Wenn der Indikator ein Enzym ist, kann das Substrat des Enzyms ebenfalls in einer getrennten Verpackung eines Systems bereitgestellt werden. Ein fester Träger, wie die vorher beschriebene Mikrotiterplatte und ein oder mehrere Puffer können ebenfalls als getrennt verpackte Elemente in diesem diagnostischen Assaysystem enthalten sein.
Die hier diskutierten Verpackungsmaterialien im Verhältnis zu den diagnostischen Systemen sind diejenigen, die normalerweise für diagnostische Systeme verwendet werden.
E. Assayverfahren
Die Vorliegende Erfindung umfasst verschiedene Assayverfahren für die Bestimmung der Gegenwart und vorzugsweise der Menge von freiem Protein S (PS_F) in einer wässrigen Zusammensetzung, wie einer biologischen Flüssigkeitsprobe unter Verwendung eines Polypeptids, eines polyklonalen Antikörpers oder eines monoklonalen Antikörpers dieser Erfindung als ein immunochemisches Reagenz zur Bildung eines Immunreaktionsproduktes, dessen Menge entweder direkt oder indirekt in Beziehung zu der Menge von PS_F in der Probe steht.
Der Fachmann wird verstehen, dass es vielfältige wohlbekannte klinisch-diagnostische Chemieverfahren gibt, bei denen ein immunochemisches Reagenz gemäß dieser Erfindung verwendet werden kann, um ein Immunreaktionsprodukt zu bilden, dessen Menge in Beziehung zu der Menge von PS_F, das in der Körperprobe vorliegt, steht. Obwohl hier also beispielhafte Assayverfahren beschrieben werden, ist die Erfindung nicht dadurch begrenzt.
Verschiedene heterogene und homogene Protokolle, entweder kompetitiv oder nicht kompetitiv, können bei der Durchführung eines Assayverfahrens dieser Erfindung verwendet werden.
1. Fang-Immunoassay-Formate
Eine Ausführungsform umfasst zum Beispiel ein Verfahren für die Überprüfung der Menge von PS_F in einer Körperflüssigkeitsprobe, das einen ersten Fang-Antikörper verwendet um das PS in der festen Phase zu fangen und zu immobilisieren und einen zweiten Indikator-Antikörper, um die Gegenwart des gefangenen PS-Antigens anzuzeigen. Bei dieser Ausführungsform geht ein Antikörper eine Immunreaktion mit PS_F ein um einen PS_F-Antikörper-Immunreaktionskomplex zu bilden und der andere Antikörper ist in der Lage, mit PS eine Immunreaktion einzugehen, während PS in dem PS_F-Antikörper-Immunreaktionskomplex vorliegt. Diese Ausführungsform kann in zwei Formaten ausgeführt werden, wobei der immobilisierte Fang-Antikörper einer der beiden oben identifizierten Antikörper ist und wobei der Indikator-Antikörper der andere der beiden Antikörper ist.
a. Fang-Immunoassay unter Verwendung von immobilisiertem Anti-PS_F-Antikörper
Ein Fang-Immunoassayverfahren unter Verwendung eines immobilisierten anti-PS_F-Antikörpermoleküls zur Überprüfung der Menge von freiem PS in einer vaskulären Flüssigkeitsprobe umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bildung einer Immunreaktionsmischung durch Vermischen einer Flüssigkeitsprobe mit einem anti-PS-Antikörper der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise einem monoklonalen Antikörper. Der Antikörper liegt als Teil eines festen Trägers vor, d.h. operativ mit einer festen Matrix verbunden, so dass die Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist und der Antikörper wirkt als ein Fang-Reagenz.

Vorzugsweise ist die Flüssigkeitsprobe eine vaskuläre Flüssigkeitsprobe, wie z. B. Blut oder ein von Blut abgeleitetes Produkt, wie Serum oder Plasma.

(b) Die Immunreaktionsmischung wird unter biologischen Assaybedingungen für eine bestimmte Zeitspanne, wie z. B. ungefähr 10 Minuten bis ungefähr 16 bis 20 Stunden bei einer Temperatur von ungefähr 4°C bis ungefähr 45°C gehalten, wobei diese Zeit ausreicht, damit das in der Probe vorliegende PS mit dem Antikörper in der festen Phase eine Immunreaktion eingehen kann (immunologisch an diesen binden kann), um ein PS_F-haltiges Immunreaktionsprodukt (Immunkomplex) zu bilden.

Biologische Assaybedingungen sind solche Bedingungen, die die biologische Aktivität der immunochemischen Reagenzien dieser Erfindung und des zu überprüfenden PS aufrechterhalten. Diese Bedingungen umfassen einen Temperaturbereich von ungefähr 4°C bis ungefähr 45°C, einen pH-Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 9 und eine Ionenstärke, die von der von destilliertem Wasser zu der von ungefähr ein molarem NaCl variiert. Verfahren zur Optimierung solcher Bedingungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.

(c) Die Menge von PS_F-haltigem Immunreaktionsprodukt, das in Schritt (b) gebildet wurde, wird bestimmt, wodurch die Menge an freiem PS bestimmt wird, das in der Probe vorlag.

Die Bestimmung der Menge des Immunreaktionsprodukts, entweder auf direktem oder auf indirektem Wege, kann durch Assayverfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, erreicht werden und hängt im typischen Fall von der Art der verwendeten Indikators ab.
Vorzugsweise umfasst die Bestimmung von Schritt (c) die folgenden Schritte:

(i) Vermischung des Protein S-haltigen Immunreaktionsprodukts in der festen Phase mit einem zweiten Antikörper zur Bildung einer zweiten Immunreaktionsmischung mit einer flüssigen Phase und einer festen Phase, wobei das zweite Antikörpermolekül die Fähigkeit besitzt, mit dem PS_F-haltigen Immunreaktionsprodukt eine Immunreaktion einzugehen. Antikörper, die als zweiter Antikörper geeignet sind, umfassen polyklonale Antikörperpräparationen, die gegen das gereinigte PS gerichtet sind, die mit einer Vielzahl von Epitopen auf dem PS-Molekül eine Immunreaktion eingehen, oder monoklonale Antikörper, überprüft auf ihre Fähigkeit, PS nach einer Immunreaktion mit einem Antikörper, der für das hier beschriebene PS_F spezifisch ist, zu binden. Ein solcher Antikörper geht mit PS eine Immunreaktion ein, egal, ob es sich in seiner freien Form befindet oder komplexiert mit C4BP und ist daher für das gesamte PS(PS_T) immunspezifisch. Anti-PS_T-Moleküle inhibieren die Protein S-Bindung an C4BP nicht. Ein beispielhafter und bevorzugter monoklonaler Antikörper, der mit PS Molekülen eine Immunreaktion eingeht, wenn sie sich mit einem PS_F-spezifischen Antikörper in einem Immunkomplex befinden, ist der monoklonale Antikörper, der von dem Hybridom LJS S-7 gebildet wird (MAb S-7).
(ii) Erhaltung der zweiten Immunreaktionsmischung für eine ausreichende Zeitspanne, damit der zweite Antikörper einen Komplex mit dem Immunreaktionsprodukt bilden kann und ein zweites Immunreaktionsprodukt in der festen Phase bilden kann und
(iii) Bestimmung der Menge des zweiten Antikörpers, der in dem zweiten Immunreaktionsprodukt vorliegt und dadurch der Menge des Immunreaktionsproduktes, das in Schritt (c) gebildet wurde.

Gemäß einer Ausführungsform ist der zweite Antikörper ein markierter Antikörper, so dass die Markierung einen Indikator für den Nachweis der Gegenwart des gebildeten zweiten Immunreaktionsproduktes darstellt. Die Markierung wird in dem zweiten Immunreaktionsprodukt gemessen, wodurch die Gegenwart und vorzugsweise die Menge des zweiten Antikörpers in der festen Phase angezeigt wird.
Alternativ kann die Menge des zweiten Antikörpers durch Präparation einer zusätzlichen Reaktionsmischung bestimmt werden, die einen Indikator aufweist, der mit dem zweiten Antikörper spezifisch reagiert (an diesen bindet), wie wohlbekannt ist. Beispiele sind dritte Immunreaktionsmischungen mit einem markierten anti-Immunglobulin-Antikörpermolekül, das für den zweiten Antikörper spezifisch ist. Nach der dritten Immunreaktion wird das gebildete dritte Immunreaktionsprodukt durch die Gegenwart der Markierung nachgewiesen.
b. Fang-Immunoassay unter Verwendung von immobilisiertem anti-PS_T-Antikörper
Ein Fang-Immunoassayverfahren unter Verwendung von immobilisierten anti-PS_T-Antikörpermolekülen wird ebenfalls umfasst und ist mit dem oben beschriebenen Fang- Assayverfahren verwandt. Der Assay zum Nachweis von PS_F umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bildung einer ersten Immunreaktionsmischung durch Vermischen einer vaskulären Flüssigkeitsprobe mit einem ersten anti-Protein S-Antikörper, der Antikörpermoleküle enthält, die mit PS_T eine Immunreaktion eingehen. Der anti-PS_T-Antikörper ist operativ mit einer festen Matrix verbunden, so dass die erste Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist. Ein bevorzugter erster Antikörper ist der monoklonale Antikörper (MAb S-7), der von dem Hybridom LJS S-7 erzeugt wird.
(b) Die Immunreaktionsmischung wird für eine ausreichende Zeitspanne aufrechterhalten um ein Protein S-haltiges Immunreaktionsprodukt in der festen Phase zu bilden und zwar unter den oben beschriebenen Bedingungen.
(c) Eine zweite Immunreaktionsmischung wird dann durch Vermischen des Protein S-haltigen Immunreaktionsproduktes in der festen Phase aus Schritt (b) mit einem zweiten anti-Protein S-Antikörper gebildet, der für PS_F immunspezifische Antikörpermoleküle enthält, d. h. Antikörper der vorliegenden Erfindung. Ein beispielhafter zweiter Antikörper ist der monoklonale Antikörper (MAb 56), der von dem Hybridom LJS 56 gebildet wird.
(d) Die zweite Immunreaktionsmischung wird für eine ausreichende Zeitspanne erhalten, damit die PS_F-spezifischen Antikörpermoleküle mit dem Protein S in der festen Phase eine Immunreaktion eingehen können und ein zweites Protein S-haltiges Immunreaktionsprodukt in der festen Phase bilden können.
(e) Die Gegenwart und vorzugsweise die Menge des in Schritt (d) gebildeten Produktes wird dann bestimmt, wodurch die Menge von freiem Protein S in der vaskulären Flüssigkeitsprobe bestimmt wird.

Die Bestimmung der Gegenwart des zweiten Immunreaktionsproduktes kann gemäß den oben für den vorherigen Fang-Immunoassay beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Beispielhafte Fang-Immunoassays für den Nachweis von PS_F sind in Beispiel 6 beschrieben.
2. Kompetitive Immunoassay-Formate
Eine andere Ausführungsform für die Überprüfung der Menge von PS_F in einer Körperflüssigkeitsprobe verwendet eine Kompetitionsreaktion, bei der entweder ein PS-Polypeptid oder ein anti-PS_F-Antikörpermolekül dieser Erfindung in der festen Phase als immobilisiertes immunochemisches Reagenz vorliegt und wobei das andere der beiden Reagenzien in Lösung in der flüssigen Phase vorliegt, und zwar in Form eines markierten Reagenzes. Eine Flüssigkeitsprobe wird damit vermischt um eine Kompetitions-Immunreaktionsmischung zu bilden und die resultierende Menge der Markierung in der festen Phase ist entweder direkt oder indirekt zu der Menge von PS_F in der Flüssigkeitsprobe proportional.
So umfasst eine Version dieser Ausführungsform die folgenden Schritte:

(a) Bildung einer kompetitiven Immunreaktionsmischung durch Vermischen von einer vaskulären Flüssigkeitsprobe mit (1) einem anti-Protein S-Antikörper gemäß dieser Erfindung, der Antikörpermoleküle enthält, die mit PS_F eine Immunreaktion eingehen, wobei der Antikörper operativ mit einer festen Matrix verbunden ist, so dass die kompetitive Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige als auch eine feste Phase aufweist, und (2) einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das mit dem zugefügten Antikörper immunreaktiv ist. Das zugemischte Polypeptid wird operativ mit einem Indikator, wie hier beschrieben, verbunden.
(b) Die kompetitive Immunreaktionsmischung wird dann für eine ausreichende Zeitspanne erhalten, damit das Polypeptid und das PS_F, das in der flüssigen Phase vorliegt, um die Immunreaktion mit dem Festphasen-Antikörper kompetitieren können. Solche Immunreaktionsbedingungen wurden bereits beschrieben und führen zu der Bildung eines Indikator-haltigen Immunreaktionsproduktes, umfassend das markierte Polypeptid in der festen Phase.
(c) Die Menge des Indikators, der in dem in Schritt (b) gebildeten Produkt vorliegt, wird dann bestimmt, wodurch die Gegenwart und vorzugsweise die Menge von freiem Protein S in der vaskulären Flüssigkeitsprobe bestimmt wird.

Die Bestimmung des Indikators in der festen Phase wird dann durch die hier beschriebenen Standardverfahren durchgeführt.
Beispielhafte anti-PS_F-Antikörpermoleküle zur Verwendung in der kompetitiven Reaktion sind die MAb 56-Antikörpermoleküle. Ebenfalls bevorzugt und beispielhaft ist die Verwendung von biotinylierten Polypeptiden wie hier weiter beschrieben.
Eine andere Version dieser Ausführungsform umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bildung einer kompetitiven Immunreaktionsmischung durch Vermischen einer vaskulären Flüssigkeitsprobe mit: (1) einem anti-Protein S-Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, der Antikörpermoleküle enthält, die mit PS_F eine Immunreaktion eingehen; und (2) einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das mit dem Antikörper eine Immunreaktion eingeht und das mit einer festen Matrix operativ verbunden ist, so dass die kompetitive Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige als auch eine feste Phase aufweist. Ein beispielhafter Antikörper ist der monoklonale Antikörper MAb 56.
(b) Die kompetitive Immunreaktionsmischung wird dann für eine ausreichende Zeitspanne erhalten, damit alles freie PS in der vaskulären Flüssigkeit mit den zugemischten Antikörpermolekülen für die Immunreaktion mit den Festphasen-Polypeptiden kompetitieren kann und ein Antikörper-haltiges Immunreaktionsprodukt in der festen Phase bilden kann.
(c) Die Menge des Antikörpers, der in dem in Schritt (b) gebildeten Produkt vorliegt, wird dann bestimmt, wodurch die Gegenwart und/oder die Menge des freien Protein S in der vaskulären Flüssigkeitsprobe bestimmt wird.

Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper operativ mit einem Indikator verbunden, so dass die Bestimmung in Schritt (c) die Bestimmung der Menge des Indikators umfasst, der in dem in Schritt (b) gebildeten Produkt enthalten ist. Ein bevorzugter Indikator ist die Biotinylierung, wie hier beschrieben.
Vorzugsweise wird die vaskuläre Flüssigkeitsprobe einer kompetitiven Immunreaktionsmischung als eine bekannte Menge von Blut oder einem von Blut abgeleiteten Produkt, wie z. B. Serum oder Plasma, bereitgestellt. Weiterhin bevorzugt werden Ausführungsformen, bei denen die Menge des immunochemischen Reagenzes in der flüssigen Phase der Immunreaktionsmischung eine überschüssige Menge relativ zu der Menge des Reagenzes in der festen Phase ist. Im typischen Fall werden parallele Sets von kompetitiven Immunreaktionen unter Verwendung einer bekannten Menge an gereinigtem PS in einer Verdünnungsreihe aufgebaut, so dass eine Standardkurve entwickelt werden kann, wie wohlbekannt ist. Auf diese Weise wird die Menge des in Schritt (c) gebildeten Produkts, wenn eine vaskuläre Flüssigkeitsprobe verwendet wird, mit der Standardkurve verglichen, wodurch die Menge von PS_F, die in der vaskulären Flüssigkeit vorliegt, bestimmt wird.
Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung einen kompetitiven Reaktionsassay, der die Bindungswechselwirkung zwischen C4BP und einem PS-Polypeptid der vorliegenden Erfindung als Basis für einen diagnostischen Assay auf PS_F in der vaskulären Flüssigkeitsprobe nutzt. Diese Ausführungsform umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bildung einer kompetitiven Reaktionsmischung durch Vermischen einer vaskulären Flüssigkeitsprobe mit: (1) einem festen Träger, an den gereinigtes C4BP befestigt ist, so dass die kompetitive Reaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist und (2) einem PS Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das die Fähigkeit aufweist, an C4BP zu binden und die Protein S-Bindung an C4BP zu inhibieren. Das zugemischte Polypeptid ist operativ mit einem Indikator, wie hier beschrieben, verbun den. Ein bevorzugter Indikator ist biotinyliertes Polypeptid. Ein besonders bevorzugtes Polypeptid zur Verwendung hier sind die Polypeptide PSP-12 und PSP-loop aufgrund ihrer demonstrierten Bindung an C4BP, wie dargestellt in den Beispielen. C4BP kann wie hier beschrieben gereinigt werden und kann danach durch Adsorption aus einer Lösung wie hier beschrieben an einer festen Matrix befestigt werden.
(b) die kompetitive Reaktionsmischung wird dann für eine ausreichende Zeitspanne erhalten, damit das Polypeptid und das PS_F, die in der flüssigen Phase vorliegen, um die Bindung mit dem Festphasen-C4BP kompetitieren können. Solche Reaktionsbedingungen, die mit der Protein S-Bindung an C4BP in der festen Phase kompatibel sind, sind hier an anderer Stelle beschrieben und führen zu der Bildung eines Indikator-haltigen Reaktionsproduktes, umfassend das markierte Polypeptid, komplexiert mit C4BP in der festen Phase.
(c) Die Menge des Indikators, der in dem in Schritt (b) gebildeten Produkt vorliegt, wird dann wie vorher beschrieben bestimmt, wodurch die Gegenwart und vorzugsweise die Menge von freiem Protein S in der vaskulären Flüssigkeitsprobe bestimmt wird.

Kompetitive Reaktionen werden vorzugsweise mit Standardkurven, wie oben beschrieben, durchgeführt, um die Menge von PS_F in der vaskulären Flüssigkeitsprobe genauer bestimmen zu können.
In einer ähnlichen Ausführungsform kann die obige kompetitive Reaktion zum Nachweis von PS_F, die immobilisiertes C4BP verwendet, mit einem anti-PS_F-Antikörper der vorliegenden Erfindung anstelle eines PS-Polypeptids in der flüssigen Phase durchgeführt werden, da sowohl das zitierte PS-Polypeptid als auch der anti-PS_F-Antikörper an C4BP binden und so mit PS_F in der vaskulären Flüssigkeitsprobe um die Bindung an das immobilisierte C4BP kompetitieren können. Bei dieser Ausführungsform ist der Antikörper vorzugsweise operativ mit einem Indikator verbunden, wie vorher beschrieben um den Nachweis des kompetitiven Reaktionsproduktes zu erleichtern.
3. Kompetitive Immunoassays, die für kompetentes C4b-Bindungsprotein spezifisch sind
Die vorliegende Erfindung umfasst auch kompetitive Immunreaktionen, die den vorher beschriebenen ähnlich sind und die an die Bestimmung der Gegenwart und vorzugsweise der Menge von kompetentem C4b-Bindungsprotein (C4BP) in einer Flüssigkeitsprobe angepasst sind.
„Kompetentes C4BP" ist C4BP in einer Form, die die Fähigkeit aufweist, freies Protein S (PS_F) in Lösung zu binden. Formen von C4BP, die nicht in der Lage sind, PS_F zu binden, umfassen C4BP, das bereits als Komplex mit PS_F vorliegt, defektives C4BP aufgrund der ungeeigneten Anordnung seiner Untereinheiten oder der Gegenwart von genetisch defizienten Proteinuntereinheiten und ähnliche. Kompetente C4BP-Niveaus im Blut sind wichtig, da dies die Form von C4BP ist, die zu der Inaktivierung von PS_F durch Komplexbildung beiträgt und daher stellt die Bestimmung der Plasmamengen von kompetentem C4BP klinisch relevante Informationen bereit.
Der kompetitive Assay basiert auf der hier offenbarten Bindungswechselwirkung zwischen einem PS-Polypeptid der vorliegenden Erfindung und C4BP.
So umfasst die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren für die Bestimmung der Menge von C4BP in einer Flüssigkeitsprobe, vorzugsweise einer vaskulären Flüssigkeitsprobe, wie z. B. Plasma, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Bildung einer Bindungsreaktionsmischung durch Vermischen einer vaskulären Flüssigkeitsprobe mit einem Protein S-Polypeptid dieser Erfindung, wobei dieses Polypeptid mit einer festen Matrix operativ verbunden ist, so dass die Bindungsreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist;
(b) Erhalten der Bindungsreaktionsmischung für eine ausreichende Zeitspanne, damit alles kompetente C4-Bindungsprotein, das in der vaskulären Flüssigkeitsprobe vorhanden ist, an das Polypeptid binden und ein C4b-Bindungsprotein-haltiges Reaktionsprodukt in der festen Phase bilden kann; und
(c) Bestimmung der Menge des C4b Bindungsproteins, das in dem Festphasenreaktionsprodukt vorhanden ist. Typische Bindungsreaktionsbedingungen, die für die Verwendung geeignet sind, werden in den Beispielen beschrieben.

Bei bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Bestimmungsschritt für den Nachweis von Festphasen-C4BP die folgenden Schritte:

(i) Vermischen des in Schritt (b) gebildeten Reaktionsproduktes mit einem anti-C4b-Bindungsprotein-Antikörper, der Antikörpermoleküle enthält, die mit dem C4b-Bindungsprotein eine Immunreaktion eingehen, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden;
(ii) Erhalt der Immunreaktionsmischung für eine ausreichende Zeitspanne, damit der Antikörper mit jeglichem C4b Bindungsprotein reagieren kann, das in der festen Phase vorliegt und damit ein Festphasen-Immunreaktionsprodukt gebildet werden kann; und
(iii) Bestimmung der Menge des Antikörpers, der in dem in Schritt (ii) gebildeten Festphasen-Immunreaktionsprodukt vorliegt und dadurch der Menge von kompetentem C4b-Bindungsprotein in der vaskulären Flüssigkeitsprobe. Die Vermischung, der Erhalt und die Bestimmungsschritte können im Wesentlichen wie hier anderswo beschrieben durchgeführt werden.

Ein anti-C4BP-Bindungsprotein-Antikörper, der für die Verwendung in Schritt (i) geeignet ist, kann jeglicher Antikörper sein, der mit C4BP eine Immunreaktion eingeht, wenn dies mit PS komplexiert ist. Ein bevorzugter anti-C4BP-Antikörper ist ein polyklonales Antiserum, das durch Immunisierung von Kaninchen mit einer gereinigten C4BP-Präparation hergestellt wird. Besonders bevorzugt werden Antikörper, die Antikörpermoleküle enthalten, die mit der alpha-Untereinheit von C4BP eine Immunreaktion eingehen, die durch eine Immunisierung mit gereinigter alpha-Untereinheit hergestellt werden können, wie wohlbekannt ist, oder von einer Vielzahl von kommerziellen Quellen erhalten werden können. Verfahren für die Überprüfung auf ein anti-C4BP-Antikörpermolekül, das an C4BP bindet, wenn es in einem PS:C4BP-Komplex vorliegt, umfassen die hier beschriebenen Bindungsassays, folgend auf eine Routineherstellung eines monoklonalen Antikörpers unter Verwendung von C4BP als Immunogen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper in der festen Phase durch die Gegenwart eines Indikators in dem Immunreaktionsprodukt nachgewiesen, wie in dem Fall, in dem der Antikörper ein markierter Antikörper ist.
Bei einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Bestimmung der Menge von C4BP in einer Flüssigkeitsprobe, vorzugsweise einer vaskulären Flüssigkeitsprobe, wie z. B. Plasma, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Bildung einer Bindungsreaktionsmischung durch Vermischen einer vaskulären Flüssigkeitsprobe mit: (i) einem Protein S-Polypeptid der vorliegenden Erfindung und (ii) einem anti-C4b-Bindungsprotein-Antikörper, der Antikörpermoleküle enthält, die mit dem C4b-Bindungsprotein eine Immunreaktion eingehen, wobei der Antikörper operativ mit einer festen Matrix verbunden ist, so dass die Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist;
(b) Erhalt der Immunreaktionsmischung für eine ausreichende Zeitspanne, damit jegliches kompetente C4b-Bindungsprotein, das in der vaskulären Flüssigkeitsprobe vorliegt, an den Antikörper binden und ein Immunreaktionsprodukt in der festen Phase bilden kann und damit das Polypeptid an das Immunreaktionsprodukt binden kann und
(c) Bestimmung der Menge des Polypeptids, das in dem Festphasenreaktionsprodukt vorliegt, und dadurch der Menge des kompetenten C4b-Bindungsproteins.

Vorzugsweise enthält der Antikörper Antikörpermoleküle, die mit der alpha-Untereinheit des C4b-Bindungsprotein wie vorher beschrieben eine Immunreaktion eingehen.
Ein bevorzugtes Mittel für die Bestimmung der Menge eines Festphasenreaktionsprodukts ist die Verwendung eines markierten PS-Polypeptids, gefolgt von dem hier beschriebenen Nachweismittel für andere markierte Produkte in der festen Phase. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von biotinylierten PS-Polypeptiden.
Beispielhafte Assayverfahren, die auf die vorliegenden Verfahren zum Nachweis von kompetentem C4BP anpassbar sind, sind mindestens hier in den Beispielen beschrieben.
Ebenfalls umfasst sind immunologische Assays, die in der Lage sind, die Gegenwart einer Immunreaktionsproduktbildung ohne die Verwendung einer Markierung nachzuweisen. Solche Verfahren verwenden ein „Nachweismittel", wobei solche Mittel in der klinisch-diagnostischen Chemie wohlbekannt sind und nur insoweit ein Teil dieser Erfindung bilden, als sie mit ansonsten neuen Polypeptiden, Verfahren und Systemen verwendet werden. Beispielhafte Nachweismittel umfassen Verfahren, die als Biosensoren bekannt sind, und umfassen Biosensorverfahren, die auf dem Nachweis von Veränderungen der Reflektion einer Oberfläche, Veränderungen der Absorption einer abklingenden Welle durch optische Fasern oder Veränderungen bei der Verbreitung von akustischen Oberflächenwellen basieren.
G. Therapeutische Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung umfasst therapeutische Zusammensetzungen, die für die hier beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind. Therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten einen physiologisch tolerierbaren Träger zusammen mit einem therapeutischen Reagenz dieser Erfindung, nämlich einem PS-Polypeptid, einem anti-PS-Antikörper oder einem monoklonalen Antikörper, wie hier beschrieben, gelöst oder dispergiert darin als ein aktiver Bestandteil. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die therapeutische Zusammensetzung nicht immunogen, wenn sie einem Säugetier oder einem menschlichen Patienten für therapeutische Zwecke verabreicht wird.
Wie hier verwendet werden die Bezeichnungen „pharmazeutisch akzeptabel", „physiologisch tolerierbar" und die grammatikalischen Variationen davon, sofern sie sich auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien beziehen, austauschbar verwendet und repräsentieren die Materialien, die einem Säugetier ohne Auslösung von unerwünschten physiologischen Nebenwirkungen wie Übelkeit, Schwindelgefühl, gastrischer Verstimmung und ähnlichen, verabreicht werden können.
Die Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzung, die aktive Bestandteile gelöst oder dispergiert darin enthält, wird auf dem Fachgebiet gut verstanden. Im typischen Fall werden solche Zusammensetzungen als Injektionslösungen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt, jedoch können auch feste Formen hergestellt werden, die für eine Lösung oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Verwendung geeignet sind. Die Präparation kann auch emulgiert werden.
Der aktive Bestandteil kann mit Exzipientien vermischt werden, die pharmazeutisch akzeptabel und kompatibel mit dem aktiven Bestandteil sind und in solchen Mengen, die für eine Verwendung in den therapeutischen Verfahren, die hier beschrieben werden, geeignet sind. Geeignete Exzipientien sind z. B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder ähnliche und Kombinationen davon. Zusätzlich kann die Zusammensetzung geringe Menge von Hilfssubstanzen enthalten, falls dies erwünscht ist, wie z. B. Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffer und ähnliche, die die Wirksamkeit des aktiven Bestandteils erhöhen.
Die therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann pharmazeutisch akzeptable Salze der Bestandteile darin enthalten. Pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptids), die mit anorganischen Säuren, wie z. B. Salz- oder Phosphorsäuren oder solchen organischen Säuren wie Essigsäure, Weinsäure, Mandelsäure und ähnlichen gebildet werden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen abgeleitet werden, wie z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und ähnlichen.
Physiologisch tolerierbare Träger sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Beispielhaft für flüssige Träger sind sterile wässrige Lösungen, die keine Materialien zusätzlich zu den aktiven Bestandteilen und Wasser enthalten oder die einen Puffer, wie Natriumphosphat bei einem physiologischen pH-Wert, physiologische Kochsalzlösung oder beides, wie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, enthalten. Außerdem können die wässrigen Träger mehr als ein Puffersalz, wie auch Salze, wie Natrium- und Kaliumchloride, Dextrose, Polyethylenglycol und andere gelöste Stoffe enthalten.
Flüssige Zusammensetzungen können auch flüssige Phasen zusätzlich zu und zum Ausschluss von Wasser enthalten. Beispielhaft für solche zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, pflanzliche Öle, wie z. B. Baumwollsamenöl und Wasser-Öl-Emulsionen.
Eine therapeutische Zusammensetzung enthält eine Menge eines PS-Polypeptids oder eines anti-PS_F-Antikörpermoleküls der vorliegenden Erfindung, die genügt, um die Protein S-Bindung an C4BP zu inhibieren. Im typischen Fall liegt diese Menge bei mindestens 0,1 Gewichtsprozent und besonders bevorzugt bei mindestens 1 Gewichtsprozent des Peptids oder des Antikörpers pro Gewicht der gesamten therapeutischen Zusammensetzung. Ein Gewichtsprozent ist ein Gewichtsverhältnis des Peptids oder Antikörpers zu der gesamten Zusammensetzung. Auf diese Weise ist z. B. 0,1 Gewichtsprozent 0,1 Gramm des PS-Polypeptids pro 100 Gramm der gesamten Zusammensetzung.
H. Therapeutische Verfahren
Es ist entdeckt worden, dass die PS-Polypeptide, Antikörper und monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung (d. h. PS-C4BP-Komplexbildungsinhibitoren) die Fähigkeit besitzen, die PS-Bindung an C4BP zu inhibieren. Im Hinblick auf die physiologische Rolle von C4BP bei der Komplexierung mit PS und dadurch der Inaktivierung ihrer antikoagulativen Wirkungen sind die gegenwärtigen PS:C4BP-Komplexbildungsinhibitoren geeignet für die Inhibition der Protein S-Bindung an C4BP in vivo.
So stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform die Verwendung eines Polypeptids von einem Antikörper der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Thrombose bereit. Das Polypeptid oder der Antikörper ist in dem Medikament in einer therapeutisch wirksamen Menge vorhanden.
Eine therapeutisch wirksame Menge des PS-Polypeptids ist eine bestimmte Menge, die so berechnet ist, dass sie die gewünschte Wirkung erreicht, d. h. die Inhibition der Protein S-Bindung an C4BP in vivo bei einem Patienten und dadurch die Erhöhung der effektiven vaskulären Konzentration von PS_F bei dem Patienten.
Die in vivo-Inhibition der PS-Bindung an C4BP unter Verwendung eines Medikaments dieser Erfindung ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform und ist in einer Vielzahl klinischer Umgebungen wünschenswert, wie z. B. wenn der Patient Symptome ei ner Koagulation zeigt oder ein Thromboserisiko aufweist. Im typischen Fall wird eine Therapie der Inhibition der Protein S-Bindung an C4BP unter Verwendung der PS-Polypeptide indiziert sein, wenn ein Patient erhöhte Plasmamengen von C4BP, eine disseminierte intravaskuläre Koagulation (DIC), septischen Schock, venöse oder arterielle Thrombose und ähnliche Zustände aufweist, die einer antikoagulierenden Intervention bedürfen.
Eine therapeutisch wirksame Menge eines PS-Polypeptids dieser Erfindung ist im typischen Fall eine Menge eines PS-Polypeptids, die genügt, um, wenn sie in einer physiologisch tolerierbaren Zusammensetzung verabreicht wird, eine Plasmakonzentration von ungefähr 0,1 mikromolar (μM) bis ungefähr 100 μM und vorzugsweise von ungefähr 0,5 μM bis ungefähr 10 μM zu erreichen.
Eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers dieser Erfindung ist im typischen Fall eine Menge eines Antikörpers, die genügt, wenn sie in einer physiologisch tolerierbaren Zusammensetzung verabreicht wird, eine Plasmakonzentration von ungefähr 0,1 Mikrogramm (μg) pro Milliliter (ml) bis ungefähr 100 μg/ml, vorzugsweise von ungefähr 1 μg/ml bis ungefähr 5 μg/ml und in der Regel ungefähr 5 μg/ml zu erreichen.
Das Niveau der Inhibition der Protein S-Bindung an C4BP, das bei einem Patienten vorliegt, ist indikativ für die Effizienz der vorliegenden Therapie und kann einfach durch routinemäßige klinische Analysen bestimmt werden, die die Plasmamengen von freiem Protein S nachweisen. Beispielhafte Assays zur Überwachung der Menge von PS_F sind hier beschrieben. Alternativ kann die Wirksamkeit der Therapie durch die Beobachtung der antikoagulativen Wirkungen der Therapie bestimmt werden.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, die PS-Polypeptid oder Antikörper dieser Erfindung enthalten, werden konventionell intravenös, wie durch Injektion einer Einheitsdosis, verabreicht. Die Bezeichnung "Einheitsdosis" bezieht sich, wenn sie im Hinblick auf eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einzelne Dosierungen für den Betroffenen geeignet sind, wobei jede Einheit eine bestimmte Menge des aktiven Materials enthält, so berechnet, dass die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem benötigten Verdünnungsmittel, d.h. einem Träger oder Vehikel, erreicht wird.
Die Zusammensetzungen werden in einer Weise verabreicht, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist und in einer therapeutisch effektiven Menge. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, von der Fähigkeit des Systems der Betroffenen, den aktiven Bestandteil zu verwerten und dem Grad der gewünschten therapeutischen Wirkung. Genaue Mengen des benötigten Bestandteils, der verabreicht werden soll, hängen von der Einschätzung des Arztes ab und sind für jedes Individuum unterschiedlich. Geeignete Dosierungsbereiche für die systemische Anwendung sind jedoch hier offenbart und hängen von dem Weg der Verabreichung ab. Geeignete Behandlungsvorschriften für die anfängliche Verabreichung und Booster-Gaben sind ebenfalls variabel, sind jedoch durch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von wiederholten Dosierungen in einem Abstand von einer oder mehreren Stunden durch aufeinander folgende Injektion oder andere Verabreichung gekennzeichnet. Alternativ ist auch eine kontinuierliche intravenöse Injektion umfasst, die ausreicht um die Konzentrationen im Blut in den Bereichen zu halten, die für die in vivo Therapien angegeben sind.
Als eine Hilfe für die Verabreichung von wirksamen therapeutische Mengen eines PS-Polypeptids, Antikörpers oder monoklonalen Antikörpers ist ein diagnostisches Verfahren dieser Erfindung für den Nachweis eines PS-Polypeptids, Antikörpers bzw. monoklonalen Antikörpers in dem Blut des Betroffenen geeignet um das Schicksal der verabreichten therapeutischen Zusammensetzung zu kennzeichnen.
I. Immunoaffinitäts-Reinigung von freiem Protein S
Die Spezifität eines anti-PS_F-Antikörpers der vorliegenden Erfindung für die Immunreaktion mit freiem PS und nicht mit PS:C4BP-Komplex stellt ein geeignetes Reagenz für die Reinigung von freiem PS aus einer wässrigen Lösung wie einer komplexen biologischen Flüssigkeit einschließlich Blut, Plasma, von Plasma abgeleiteten Flüssigkeiten und ähnlichen Quellen für freies PS bereit. Zusätzliche Quellen für freies PS, aus denen freies PS durch die vorliegenden Verfahren gereinigt werden kann, umfassen homogenisierte Gewebe, Zellkulturen und Expressionssysteme für die Erzeugung von PS unter Verwendung von rekombinanten DNA Verfahren für die Expression klonierter Gene, die PS kodieren.
Extrem reines PS_F kann unter Verwendung der Verfahren hier hergestellt werden und eine solche Präparation ist für die therapeutische Verabreichung eines „antikoagulativ aktiven" PS, nämlich PS_F, in Fällen einer Protein S-Defizienz und als Antikoagulans und Antithrombotikum geeignet. Insoweit die hier beschriebenen Reagenzien nicht an PS:C4BP binden, ermöglichen die vorliegenden Verfahren die Herstellung von PS_F, das in keiner Weise durch C4BP kontaminiert ist, das sich auf die günstigen antikoagulativen Wirkungen von PS_F durch Bindung und Inaktivierung von PS_F negativ auswirken könnte.
So umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren für die Reinigung von freiem Protein S (PS_F) aus einer wässrigen Lösung, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Vermischen einer wässrigen Lösung, die PS_F enthält, mit einem Antikörper der vorliegenden Erfindung, der Antikörpermoleküle enthält, die mit PS_F eine Immunreaktion eingehen, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden;
(b) Erhalten der Immunreaktionsmischung unter Immunreaktionsbedingungen für eine ausreichende Zeitspanne und unter geeigneten Bedingungen, damit das PS_F in der Lösung mit dem Antikörper eine Immunreaktion eingehen und ein Immunreaktionsprodukt bilden kann;
(c) Isolierung des Immunreaktionsproduktes aus dem Rest der Immunreaktionsmischung, wodurch das PS_F, das eine Immunreaktion eingegangen ist, von den Kontaminanten entfernt wird, die in der anfänglichen wässrigen Lösung enthalten sind, wodurch gereinigtes PS_F gebildet wird.

Bei bevorzugten Ausführungsformen sind die in Schritt (a) zugemischten Antikörpermoleküle immobilisierte Antikörpermoleküle, d.h. sie sind operativ mit einem festen Träger verbunden, wie hier im weiteren beschrieben. Wenn ein immobilisierter Antikörper verwendet wird, weist die Immunreaktionsmischung sowohl eine feste Phase als auch eine flüssige Phase auf und das resultierende Immunreaktionsprodukt wird in der festen Phase gebildet. Dies stellt einen besonders bevorzugten Vorteil der Reinigung dar, da der feste Träger in geeigneter Weise mit Puffern gewaschen oder gespült werden kann, die so formuliert sind, dass sie spezifisch Makromoleküle in der Matrix des festen Trägers und den Träger umgebend eluieren/entfernen, die nicht spezifisch eine Immunreaktion mit den immobilisierten Antikörpermolekülen eingegangen haben (gebunden sind). Nach dem Waschen zur Elution nicht spezifisch immunreagierter Makromoleküle, werden die immobilisierten Antikörpermoleküle mit einem Puffer in Kontakt gebracht, der so formu liert ist, dass er spezifisch das PS_F, das eine Immunreaktion eingegangen ist, entfernt (eluiert), wobei die eluierten freien PS Moleküle davon in einer im Wesentlichen reinen Form gesammelt (gewonnen) werden.
Gemäß einer Ausführungsform kann der Elutionspuffer ein Polypeptid in der flüssigen Phase enthalten, das mit dem Antikörper in der festen Phase eine Immunreaktion eingeht und als Konkurrent um die Immunreaktion mit PS_F wirkt. Gemäß einer anderen Ausführungsform kann der Freisetzungspuffer Salze enthalten, die mit der Bildung eines PS_F-Antikörper-Immunreaktionskomplexes inkompatibel sind. Die Reagenzbedingungen, die mit der Bildung des Immunreaktionsproduktes kompatibel sind, mit dem Waschpuffer oder mit dem Elutionspuffer können durch einen Fachmann einfach unter Verwendung der hier beschriebenen Assays und Reagenzien entwickelt werden.
Anders ausgedrückt beinhaltet das vorliegende Verfahren für die Erzeugung von gereinigtem PS_F zwei Schritte.
Der erste Schritt beinhaltet die Immunadsorption (Adsorption) von PS_F aus einer wässrigen Lösung. Das Adsorbens umfasst eine immobilisierte Antikörper-Zusammensetzung, nämlich einen Antikörper dieser Erfindung, gebunden an ein geeignetes Substrat, wie z. B. Agarosekügelchen oder einen ähnlichen festen Träger. Nachdem das PS_F an die immobilisierten Antikörper durch eine spezifische Immunreaktion gebunden hat, wird das adsorbierte Material extensiv mit einem Puffer gewaschen, um diejenigen Materialien, Makromoleküle, Proteine und ähnliches zu entfernen, die keine Immunreaktion eingegangen sind.
Der zweite Schritt beinhaltet einen Behandlungsschritt (Elution), um spezifisch das Material mit einem Puffer zu entfernen (zu eluieren), das eine Immunreaktion eingegangen ist (adsorbiert ist), wobei der Puffer so formuliert ist, dass er das Immunreaktionsprodukt in der festen Phase stört und eine Freisetzung des Antigens, das eine Immunreaktion eingegangen ist, in die flüssige Phase des Elutionspuffers bewirkt. Puffer, die für die Elution von Proteinen, die spezifisch eine Immunreaktion eingegangen sind, von immobilisierten Antikörpersäulen geeignet sind, sind allgemein wohlbekannt. Beispielhafte Puffer sind in Beispiel 6 beschrieben.
Verfahren für die Herstellung einer immobilisierten Antikörper-Molekül-Zusammensetzung, für die Immunreaktion spezifischer Proteine und für ihre Elution daraus zur Erzeugung gereinigter Proteine sind auf dem Fachgebiet allgemein wohlbekannt und werden auch hier im weiteren beschrieben. Siehe z. B. die Lehren von Zimmerman et al. in dem U.S.-Patent Nr. 4,361,509, der die Immunoaffinitätsreinigung von Faktor VIII aus Plasmaquellen unter Verwendung von immobilisierten monoklonalen Antikörpermolekülen beschreibt. Beispielhafte immobilisierte Antikörpermoleküle, ihre Verwendung und ihre Herstellung werden in Beispiel 6 beschrieben.
Gemäß einer ähnlichen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung auch eine Zusammensetzung zur Reinigung von PS_F aus wässrigen Lösungen gemäß den hier beschriebenen Verfahren. Die Zusammensetzung umfasst Antikörpermoleküle der vorliegenden Erfindung, die für PS_F immunspezifisch sind, und zwar in der Form von immobilisierten Antikörpermolekülen, d.h. operativ an einen festen Träger gebunden. Beispielhafte Zusammensetzungen sind in Beispiel 6 beschrieben, wobei Agarosekügelchen verwendet werden, die angehaftet (operativ verbunden) entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung aufweisen. Zu Beispielen gehören Antikörper-Moleküle, die mit den bevorzugten Polypeptiden PSP-12 und dem PSP-loop eine Immunreaktion eingehen, zum Beispiel der monoklonale Antikörper MAb 56.
Beispiele
Die folgende Beschreibung stellt Details der Art und Weise bereit, in der bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgeführt und verwendet werden können. Diese Beschreibung sollte nicht als die Erfindung begrenzend verstanden werden, obwohl sie für die vorliegenden Erfindung beispielhaft ist. Abwandlungen und Äquivalente, die derzeit bekannt sind oder später entwickelt werden, welche zum Wissen und zur technischen Kompetenz des Fachmanns gehören, sollen als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden.
1. Polypeptide
Sich überlappende synthetische Protein S-Peptide, die in der Tabelle 1 oben aufgeführt sind, wurden durch das simultane multiple Peptid-Syntheseverfahren unter Verwendung der bei Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131–5135 (1985) beschriebenen Festphasentechnik hergestellt. Die Peptide werden hiernach durch ihre Polypeptidbezeichnungen, wie aufgeführt in Tabelle 1, bezeichnet. Die Aminosäuresequenz und die korrespondierende SEQ ID NO. für jedes Peptid sind ebenfalls in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Peptide wurden in der carboxyterminalen Amidform synthetisiert. Die synthetisierten Peptide wurden dann durch die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatografie (HPLC) auf einer Vydac C-18 Säule (Alltech Associates, Inc., IL) mit einem 0–60 %igen linearen Acetonitrilgiadienten in 0,1 %iger Trifluoressigsäure analysiert. Die Peptide wurden dann zur Homogenität durch präparative HPLC unter Verwendung optimaler Bedingungen, die durch die analytische Chromatografie nahe gelegt werden, gereinigt. Um eine Disulfidbildung unter den Peptiden zu verhindern, wurde bei einigen Peptiden das ursprünglich auftretende Cystein durch einen Serin- oder einen Glycinaminosäurerest ersetzt, wie angegeben in Tabelle 1. Die Aminosäurezusammensetzungen und die Konzentrationen der isolierten Peptide wurden bestimmt, indem sie einer 24-stündigen Hydrolyse in 6 N HCl in evakuierten Röhrchen bei 110 °Celsius (110 °C) und einer darauf folgenden Analyse auf einem Beckman Modell 6300 Hochleistungsanalysator unterzogen wurden. Die Peptide PSP-loop, PSP-424K und PSP-428K wurden keiner HPLC-Reinigung unterzogen und waren daher nur 30 %ig rein.
Um das genaue Molekulargewicht zu bestimmen, wurden spektroskopische Analysen der Peptide PSP-12 (1: 420–434) und PS-605 (1: 605–614) unter Verwendung von FIB positiven Ionenmassenspektren, durchgeführt, erhalten auf einem VG-ZAB-VSE Doppelfokussierungs-Massenspektrometer, das mit einer Caesium-Ionenpistole ausgestattet war und dies ergab einen einzelnen Peak und das genau erwartete Molekulargewicht von 1755 für die einfach protonierte Form von PSP-12 und 1072 für die einfach protonierte Form von PSP-605.
Die gereinigten Peptide wurden getrennt in destilliertem Wasser resuspendiert, um eine gelöste Peptidlösung mit einer endgültigen Konzentration von 2,5 mM zu bilden. Darauf folgend wurde 1/10 Volumen eines 10fach konzentrierten Puffers, hier bezeichnet als TBS-Az, der 0,05 M Trishydroxymethylaminomethanhydrochlorid (Tris-HCl), bei einem pH von 7,4, 0,1 M Natriumchlorid (NaCl), 0,02 % Natriumazid (NaN₃) enthielt, hinzugefügt. Der pH der Lösung wurde überprüft und falls nötig auf pH 7,4 mit titrierten Mengen einer 1 M Tris-Base eingestellt. Für Peptide, die anscheinend nicht vollständig bei 2,5 mM in TBS-Az löslich waren, wurden die teilweise gelösten Peptidsuspensionen separat bei 13.000 × g zentrifugiert, um das unlösliche Material zu pelletieren. Die molaren Konzentrationen in den resultierenden individuellen Überständen wurden aus der Absorption (Extinktion) bei 280 nm bzw. 257 nm für die Peptidlösungen, die aromatische Aminosäuren enthielten, geschätzt, wobei ein molarer Extinktionskoeffizient von 5.600 M^–1cm^–1 für Tryptophan und 1400 M^–1cm^–1 für Tyrosin bei 280 nm verwendet wurde und unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 200 M^–1cm^–1 für Phenylalanin bei 257 nm.
2. Präparation von polyklonalen Antiseren zu synthetischen Polypeptiden
A. Präparation von Immunogen
Für die Präparation eines Peptidimmunogens wurde das synthetische Polypeptid PSP-12 wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert. Das synthetisierte Peptid PSP-12 wurde mit dem Keyhole-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) (Sigma, St. Louis, MO) unter Verwendung des heterobifunktionalen Vernetzungsmittels N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) (Pierce Biochemicals, Rockford, IL) gekoppelt. Für die Kopplungsprozedur wurden 80 Mikroliter (μl) von 10 Milligramm/Milliliter (mg/ml) SPDP, gelöst in Dimethylformamid, tröpfchenweise zu 400 μl 15 mg/ml KLH in 0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl bei einem pH von 8,5 unter kontinuierlichen Rührbedingungen für 30 Minuten bei 22°C hinzugefügt um ein SPDP-aktiviertes KLH zu bilden. Das resultierende SPDP-aktivierte KLH wurde dann extensiv bei 4°C gegen eine gepufferte Lösung aus 0,1 M Phosphat und 0,1 M NaCl bei einem pH von 7,4 dialysiert um nicht gekoppeltes SPDP zu entfernen. Sechs mg des hergestellten Peptids PSP-12 mit einem C-terminalen Cystein wurden zunächst in 2 ml 0,1 M Phosphat und 0,1 M NaCl bei einem pH von 7,4 gelöst und dann mit SPDP-aktiviertem KLH vermischt, das oben hergestellt wurde, und zwar unter kontinuierlichem Rühren. Der Grad der Kopplung von PSP-12 mit KLH wurde durch Verdünnung eines Aliquots der Mischung 1:100 zum Zeitpunkt Null überwacht und jede Stunde danach und die Freisetzung von Pyridin-2-thion wurde bei 343 nm in einem Spektrofotometer gemessen. Der Endpunkt der Kopplung wurde bestimmt als ein Anstieg von 0,2 bei der Absorption oder durch Sichtbarmachen des Präzipitats, zu welchem Punkt KLH-Konjugate-Peptid gebildet und als PSP-12-KLH-Immunogen bezeichnet wurde.
B. Immunisierung und Sammlung von polyklonalen Antiseren
Um anti-Peptid-Antikörper zu bilden, wurde das PSP-12-KLH-Immunogen, das in Beispiel 2a hergestellt wurde, unter Verwendung von Freund's komplettem Adjuvans (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) für die erste Injektion und Freund's inkomplettem Adjuvans (DIFCO) für alle folgenden Injektionen gemäß den Anweisungen des Herstellers emulgiert und das PSP-12-KLH-Immunogen wurde mit einer Konzentration von 2 mg/ml in die Emulsion inkorporiert. Ein halber Milliliter einer hergestellten Emulsion wurde subkutan in jedes von zwei weißen Neuseeland-Kaninchen injiziert, nachdem Serumproben vor der Immunisierung gesammelt worden waren. Die Kaninchen erhielten dreimal in wöchentlichen Intervallen Injektionen, folgend dem detaillierten Injektionsprotokoll. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurden Blutproben gesammelt, um den Antikörpertiter gegen das als Immunogen verwendete spezifische Peptid PSP-12 zu überprüfen, indem der unten in Beispiel 2C beschriebene ELISA-Assay verwendet wurde. Die gesammelten Blutproben wurden bei 4°C für 12 Stunden gelagert, wonach die Proben bei 3000 × g für 20 Minuten zentrifugiert wurden. Der resultierende Überstand, der die anti-Peptid-Antikörper enthielt, wurde gesammelt, als polyklonale anti-Peptid (anti-PS)-Antikörper bezeichnet und bei –20°C gelagert.
Peptide: PSP-54, PSP-561, PSP-418*, PSP-13* und PSP-14* wurden ebenfalls separat durch Konjugation mit KLH als Immunogen hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 2A. Die Immunisierung von separaten Kaninchen für die Herstellung von Antiseren gegen jedes der oben aufgeführten Peptide wurde wie hier beschrieben durchgeführt. Die resultierenden Antiseren wurden dann durch ELISA wie für anti-PSP-12 (auch bezeichnet als anti-PS(420–434))-Antiseren in Beispiel 2C überprüft.
C. ELISA für Überprüfung der Antiseren-Immunreaktivität
Die Peptid-Antikörpertiter und die Immunspezifität bei den von den Kaninchen in Beispiel 2B gesammelten Seren wurde in einem Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) wie unten beschrieben bestimmt. Die in dem ELISA verwendeten Antigene umfassten das immunisierende Peptid PSP-12 und gereinigtes menschliches Protein S (PS). Das gereinigte menschliche Protein S wurde wie von Schwarz et al., Blood, 64: 1297–1300 (1984) beschrieben hergestellt.
Um die Immunospezifität der in Beispiel 2B erhaltenen Kaninchen-Antiseren zu bestimmen, wurden ELISA-Assays durchgeführt. Kurz gefasst wurden 50 μl von 50 μM Konzentrationen der Peptide PSP-12, PSP-loop, PSP-24K und PSP-428K, wie hergestellt in Beispiel 1 und aufgeführt in Tabelle 1 oder 10 μg/ml des in Beispiel 2C hergestellten PS in einem Puffer, bestehend aus 0,05 M Natriumcarbonat (Na₂CO₃) und 0,02 % NaN₃ bei pH 9,0 separat in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten gemischt. Die Platten wurden 1 h bei 37°C erhalten, um den Antigenen zu ermöglichen, sich operativ an die Wände der Vertiefungen zu haften. Nach einem Waschen der mit Antigen beschichteten Vertiefungen mit TBS, wurden die Vertiefungen mit 250 μl/Vertiefung 10 %igem Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma) in TBS für eine Stunde bei 22°C blockiert. Die Blockierungslösung wurde dann entfernt und die Vertiefungen wurden darauf folgend fünfmal mit 250 μl/Vertiefung eines Erhaltungspuffers (0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,02 % NaN₃, 1 mg/ml BSA, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween 20 bei pH 7,4) gewaschen.
Fünfzig μl von nichtimmunem oder spezifischem Kaninchen-Antiserum, seriell in Erhaltungspuffer verdünnt, wurden dann den gewaschenen Vertiefungen zugefügt, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden, die für eine Stunde bei 37°C erhalten wurde, um eine Bildung eines Fest-Flüssigphasen-Immunreaktionsproduktes zu ermöglichen. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit Erhaltungspuffer gewaschen, gefolgt von einer Zumischung von 50 μl von 1,0 μg/ml eines sekundären Antikörpers (polyklonales biotinyliertes anti-Kaninchen-IgG von Ziegen) (Pierce Biochemicals), verdünnt in Erhaltungspuffer, zu jeder Vertiefung für den Nachweis von Immunreaktantenprodukten. Die Platten wurden 1 h bei 37°C gehalten, wonach die Lösung des zweiten Antikörpers entfernt wurde.
Nach einem Waschen der Vertiefungen wie oben beschrieben, wurden 50 μl von 1,0 μg/ml Streptavidin-alkalische Phosphatase (Pierce Biochemicals) in Erhaltungspuffer in jede Vertiefung gemischt und 30 Minuten bei 37°C erhalten. Der Nachweis der spezifischen Immunreaktionsprodukte wurde durch Zumischung von 150 μl/Vertiefung von 5 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (PNPP) (Pierce Biochemicals) in 0,1 M Diethanolamin und 0,02 % NaN₃ bei pH 9,0 erhalten, gefolgt von einer Messung der Veränderung der Absorption bei 405 nm über die Zeit unter Verwendung des EL 312 Mikroplatten-Bio-Kinetics-Reader und des KinetiCalc Software-Programms (Biotek Instruments, Inc., VT). Eine nicht spezifische Bindung wurde als die gemessene Absorption in 10 % BSA blo ckierten Vertiefungen betrachtet, die als negative Kontrollen dienten, ohne die vorherige Beschichtung mit einem spezifischen Protein oder Peptid. Unter den beschriebenen Bedingungen überstieg die nichtspezifische Bindung niemals mehr als 5 % der spezifischen Bindung. Die anti-Peptid-Antiseren aus Kaninchen, die eine Immunreaktivität aufwiesen, die eine optische Dichteveränderung bei 405 nm von mehr als 20 Delta pro Minute unter Verwendung des kinetischen Programms im Vergleich mit der Immunreaktivität von Prä-Immunsierungsserum gegen die Peptide PSP-12, PSP-loop, PSP-424K und PSP-428K erzeugte, und die ähnlich mit PS eine Immunreaktion eingingen, wurden ebenfalls zur Verwendung als anti-Peptid-Antikörper ausgewählt und wurden auch für die in Beispiel 3 beschriebene weitere Reinigung ausgewählt.
Kaninchen-Antiseren, die in Beispiel 2B gegen die Peptide PSP-54, PSP-561, PSP-418*, PSP-13* und PSP-14* erhalten worden waren, wurden auf ihre Immunreaktivität mit den jeweiligen Peptid-Immunogenen und PS, wie oben beschrieben, überprüft. Die Kaninchen-Antiseren, die eine signifikante Immunreaktivität im Vergleich mit den Prä-Immunisierungsseren gegen jedes der Peptid-Immunogene und PS aufwiesen, wurden weiter wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt und analysiert.
3. Reinigung von anti-PS-Antikörper, anti-PS(420–434) (anti-PSP-12)
Die Reinigung der IgG-Fraktion aus Kaninchen-Antiserum, das eine signifikante Reaktivität gegen das immunisierende Peptid PSP-12 und gegen die Peptide PSP-loop, PSP-424K und PSP-428K wie auch gegen gereinigtes PS zeigt, wurde durch eine Ammoniumsulfatpräzipitation (0–45 %) durchgeführt, gefolgt von einer Reinigung des IgG auf einer Ionenaustausch-Mono-Q-Säule (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ), verbunden mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatografie (FPLC)-System (Pharmacia). Die Immunaffinitätsreinigung der gesammelten immunreaktiven IgG-Fraktion wurde durchgeführt, indem ungefähr 100 mg des IgG über eine 5 ml Säule geführt wurden, die 3 mg des in Beispiel 2C hergestellten Protein S enthielt, gekoppelt an Sepharose 4B (Pharmacia), wie beschrieben in Beispiel 2A. Nach einer gründlichen Waschung der Säule mit 5 Säulenvolumen 0,05 M Tris-HCl und 1 M NaCl bei pH 7,4, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, wurde das gebundene IgG mit zwei Säulenvolumen 0,1 M Glycin-HCl bei pH 2,5 eluiert. Das eluierte Protein wurde durch Absorption bei 280 nm überwacht und die IgG-Konzentrationen aus dem Extinktionskoeffizienten von 13,5 bestimmt. Das eluierte IgG wurde sofort gegen TBS-Az dialysiert, gegen 50 % Saccharose für un gefähr 3 bis 4 Stunden konzentriert und nochmals extensiv gegen TBS-Az zu einer endgültigen Konzentration von 3–4 mg/ml dialysiert. Die Analyse durch 4–15 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von reduzierten und nicht reduzierten Proben ergab mehr als 95 % reines IgG. Dieser durch eine Immunoaffinität gereinigte anti-Peptid-Antikörper wird als anti-PS(420–434) bezeichnet.
A. Direkte Bindung von PS an anti-PS(420–434)-Antikörper
Die Affinität des durch Immunoaffinität gereinigten anti-PS(420–434)-Antikörpers zu PS wurde durch Messung der direkten Bindung in einem Festphasen-ELISA von biotinyliertem (b-PS) an immobilisierten anti-PS(420–434)-Antikörper gemessen. Für den ELISA-Assay wurden 50 μl des anti-PS(420–434)-Antikörpers, verdünnt zu einer Konzentration von 10 μg/ml in 0,05 M Na₂CO₃ und 0,02 % NaN₃ bei pH 9,0, Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zugemischt und für eine Stunde bei 37°C gehalten, um mit Antikörpern beschichtete Vertiefungen zu bilden. Folgend auf die Entfernung der Antikörperlösung am Ende der Erhaltungsperiode wurden 250 μl 10 %iges BSA in TBS-Az bei pH 7,4 in jede Vertiefung für eine Stunde bei 22°C zugemischt, um die nicht besetzten Stellen der Vertiefungen zu blockieren. Für die Vertiefungen, die als Negativkontrolle verwendet wurden, wurde der Antikörperbeschichtungsschritt vor dem Blockierungsschritt weggelassen. Die mit Antikörper beschichteten und blockierten Vertiefungen wurden dann dreimal mit Erhaltungspuffer gewaschen, der wie in Beispiel 2C beschrieben hergestellt wurde. Fünfzig μl b-PS, hergestellt durch Kombination von Biotin (Clontech, Palo Alto, CA) mit gereinigtem PS (Beispiel 2C), wobei den Anweisungen des Herstellers gefolgt wurde, verdünnt in Erhaltungspuffer auf Konzentrationen im Bereich von 0–10 μg/ml wurden den gewaschenen Vertiefungen zugefügt, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden, die eine Stunde bei 37°C erhalten wurde, um ein Immunreaktionsprodukt in der festen Phase zu bilden. Die Vertiefungen wurden danach fünfmal mit Erhaltungspuffer gewaschen. Der Nachweis und die Messung der spezifischen Immunreaktionsprodukte wurde durch Mischung von Streptavidin-alkalische Phosphatase, gefolgt von PNPP, wie vorher für den ELISA in Beispiel 2C beschrieben, erreicht.
Die Ergebnisse der ELISA-Analyse zeigen an, dass die anti-PS(420–434)-Antikörper natives PS mit einer Dissoziationskonstante (K_d) von 10 Nanomol (nM) banden.
Ein ähnlicher Assay, bei dem anti-PS(603–616) in der festen Phase adsorbiert wurde und b-PS in Konzentrationen im Bereich von 0–40 μg/ml zugemischt wurde, ergab eine einzige Klasse von Bindungsstellen mit einer Dissoziationskonstante (K_d) von 31 nM.
Auf diese Weise gingen die polyklonalen Antikörper, die gegen das besonders wirksame inhibitorische Peptid PSP-12 (1: 420–434), wie beschrieben in Beispiel 5, erzeugt worden waren, die auf einer PS-Sepharose-Säule durch Immunoaffinität gereinigt worden waren, eine Immunreaktion mit nativem PS ein. So waren mindestens Teile der Region, die durch dieses Peptid in PS dargestellt werden, exponiert und für eine Wechselwirkung mit anderen molekularen Arten der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche von PS zugänglich. Antikörper, die gegen kleine synthetische Peptide erzeugt worden waren, erwiesen sich als fähig, das native Protein zu erkennen.
4. Herstellung von monoklonalen Antikörpern
A. Präparation des Hybridoms LJS-56
Das als PSP-12 (1: 420–434) bezeichnete Polypeptid wurde als ein Immunogen gemäß Beispiel 2a hergestellt. Balb/c ByJ Mäuse (Scripps Clinic and Reserach Foundation Vivarium, La Jolla, CA) wurden intraperitoneal (i. p.) mit 50 μg des hergestellten PSP-12-KLH-Immunogens in komplettem Freund's Adjuvans (CFA), gefolgt von einer zweiten und dritten Immunisierung unter Verwendung desselben PSP-12-KLH-Immunogens, jeweils im Abstand von ungefähr drei Wochen, in inkomplettem Freund's Adjuvans (IFA) immunisiert. Die Mäuse erhielten eine Antigenaussetzung von 50 μg des hergestellten Peptids intravenös (i.v.) in normaler Kochsalzlösung vier Tage vor der Fusion und eine zweite, ähnliche Perfusionsantigenaussetzung einen Tag später.
Die so behandelten Tiere wurden geopfert und die Milz von jeder Maus wurde gewonnen. Eine Milzzellensuspension wurde dann hergestellt. Die Milzzellen wurden dann aus der Milzzellsuspension durch Zentrifugation für ungefähr 10 Minuten bei 1000 Upm bei 23°C extrahiert. Folgend auf die Entfernung des resultierenden Überstands wurde das Zellpellet in 5 ml kaltem Ammoniumchlorid (NH₄Cl) Lysepuffer resuspendiert und wurde so für ungefähr 10 Minuten erhalten.
Zehn ml Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM) (GIBCO) und HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperidinethansulfonsäure]-Puffer wurden der lysierten Zellsuspension zugemischt um eine Mischung zu bilden, und dann wurde die Mischung für ungefähr 10 Minuten bei 1000 Upm bei 23°C zentrifugiert.
Nachdem der resultierende Überstand dekantiert worden war, wurde das Pellet in 15 ml DMEM und HEPES resuspendiert und wurde für ungefähr 10 Minuten bei 1000 Upm bei 23 °C zentrifugiert. Das obige Verfahren wurde wiederholt.
Das Pellet wurde dann in 5 ml DMEM und HEPES resuspendiert. Ein Aliquot der Milzzellensuspension wurde dann für eine Zählung entfernt. Die Fusionen wurden in der folgenden Weise unter Verwendung der nichtsezernierenden Maus-Myelomzelllinie P3X63Ag 8.653.1, einem Subklon der Linie P3X63Ag 8,653 (ATCC 1580), bewirkt. Mit einem Myelom-zu-Milzzellen-Verhältnis von ungefähr 1 zu 10 oder ungefähr 1 zu 5 wurde eine ausreichende Quantität der Myelomzellen in ein Pellet zentrifugiert, zweimal in 15 ml DMEM und HEPES gewaschen und dann 10 Minuten bei 1000 Upm bei 23°C zentrifugiert.
Die Milzzellen und die Myelomzellen wurden in 15 ml Röhrchen mit Rundboden kombiniert. Die Zellmischung wurde 10 Minuten bei 1000 Upm bei 23°C zentrifugiert und der Überstand wurde durch Aspiration entfernt. Danach wurden 200 μl 50 %iges (Gewicht pro Volumen) wässriges Polyethylenglycol, Molekulargewicht 4000 (PEG); (ATCC Baltimore, MD) bei ungefähr 37°C dem Pellet unter Verwendung einer 1 ml Pipette unter kräftigem Rühren zum Zerstören des Pellets zugemischt. Die Zellen wurden dann vorsichtig für zwischen 15 und 30 Sekunden gemischt. Die resultierende Zellmischung wurde 4 Minuten bei 700 Upm zentrifugiert.
Ungefähr 8 Minuten nach dem Zeitpunkt der Zugabe von PEG wurden 5 ml DMEM plus HEPES-Puffer langsam dem Pellet zugefügt, ohne die Zellen zu stören. Nach 1 Minute wurde die resultierende Mischung mit einer 1 ml Pipette aufgebrochen und wurde für weitere 4 Minuten so erhalten. Diese Mischung wurde dann für 7 Minuten bei 1000 Upm zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde dekantiert, 5 ml HT (Hypoxanthin/Thymidin)-Medium wurden dem Pellet langsam zugemischt, und die Mischung wurde ungestört 5 Minuten so erhalten. Das Pellet wurde dann in große Brocken aufgebrochen und die endgültige Zellsuspension wurde in T75 Kolben (2,5 ml pro Kolben) platziert, in die vorher 7,5 ml HT-Medium gegeben worden waren. Die resultierende Zellsuspension wurde bei 37°C erhalten, um die fusionierten Zellen wachsen zu lassen. Nach 24 h wurden 10 ml HT-Medium den Kolben zugemischt, gefolgt von einer Zumischung von 0,3 ml 0,04 mM Aminopterin 6 Stunden später. Achtundvierzig Stunden nach der Fusion wurden 10 ml HAT (Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin)-Medium den Kolben zugemischt.
Drei Tage nach der Fusion wurden lebensfähige Zellen in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen mit ungefähr 2 × 10⁴ lebensfähigen Zellen pro Vertiefung (insgesamt 768 Vertiefungen) in HAT-Puffermedium wie beschrieben von Kennet et al., Cun. Top. Microbiol. Immunol. 81: 77 (1978) ausplattiert. Die Zellen wurden sieben Tage nach der Fusion mit HAT Medium mit Nahrung versorgt und in ungefähr 4–5 Tages-Intervallen danach, wie benötigt, mit HT-Medium. Das Wachstum wurde mikroskopisch überwacht und die Kulturüberstände wurden ungefähr zwei Wochen später gesammelt. Die Kulturüberstände von HAT-resistenten Kulturen wurden darauf folgend auf die Gegenwart von PSP-12 (1: 420–434) spezifischem Antikörper durch Festphasen-ELISA wie beschrieben in Beispiel 2C überprüft und als Hybridome selektiert, die einen Antikörper dieser Erfindung produzierten. Die Hybridomkulturen, die anti-PS(420–434)-monoklonale Antikörper produzierten, wurden dadurch identifiziert und ein Klon wurde als LJS 56 (oder MAb 56) bezeichnet.
B. Immunscreening von monoklonalen Antikörpern durch ELISA
Der monoklonale Antikörper 56 (MAb 56) wurde auf eine weitere Immunspezifität wie in Beispiel 2C unter Verwendung der Peptide PSP-12, PSP-loop, PSP-424K und PSP-428K in der festen Phase überprüft. Durch diese Verfahren wurde bestimmt, dass MAb 56 an alle Peptide band, sättigend in einer dosierungsabhängigen Weise. Die Bindung von MAb 56 an das PSP-loop-Peptid sättigte sich bei einer Antikörperkonzentration von ungefähr 0,6 μg/ml. Dies stand im Kontrast zu dem, was bei den Peptiden PSP-12, PSP-424K und PSP-428K beobachtet wurde, bei denen 1,2 μg/ml MAb 56 notwendig für die Sättigung der Bindungsstellen waren. MAb 56 band nicht an ein Peptid, das zu PSP-12 korrespondierte, das in einer umgekehrten Reihenfolge synthetisiert worden war. Zusätzlich konnte MAb 56 nicht an Peptide binden, die an einer der Aminosäurepositionen 423 und 432 der nativen Protein S-Sequenz eine negativ geladene Glutaminsäure-Aminosäuresubstitution anstelle eines normalerweise auftretenden positiv geladenen Lysins aufwiesen. So band MAb 56 an Peptide in einer Rest- und konformationsspezifi schen Weise. Zusätzlich erwies es sich auch, dass MAb 56 mit dem Festphasenprotein S in dem in Beispiel 2C beschriebenen Assay eine Immunreaktion einging.
Die Spezifität von gereinigtem MAb 56 gegen entweder freies Protein S oder gesamtes Protein S wurde weiter wie beschrieben in Beispiel 6 evaluiert. Für MAb 56, der für das Peptid PSP-12 spezifisch ist, wurde gezeigt, dass er mit freiem Protein S eine Immunreaktion eingeht und nicht mit dem PS:C4BP eine Immunreaktion eingeht.
Ein direkter Bindungsassay, bei dem MAb 56 in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte geschichtet worden war, wie in Beispiel 3 beschrieben, und mit nativem b-PS vermischt worden war, bestätigte, dass immobilisiertes MAb 56 an natives PS bindet.
Daher ist MAb 56, da es für das Peptid PSP-12 spezifisch ist und nur freies, nicht jedoch komplexiertes Protein S bindet, ein bevorzugter monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung. Es wurden jedoch andere monoklonale Antikörper erzeugt, die funktionell äquivalent zu MAb 56 sind, wobei das PSP-12-KLH-Konjugat als Immunogen verwendet wurde. Ein solcher MAb ist LJS-418 (MAb 418) und er zeigt eine Bindungsaffinität für Protein S, die der von MAb 56 ähnlich ist. Andere monoklonale Antikörper können ähnlich unter Verwendung anderer PS Polypeptide, die oben erwähnt wurden, erzeugt werden.
C. Reinigung der monoklonalen Antikörper
Hybridome, die anti-PS(420–434)-Antikörper sezernieren, wie beschrieben in Beispiel 4A, wurden in 10 Wochen alte Balb/c Mäuse wie unten beschrieben injiziert um Ascites-Flüssigkeit zu erzeugen.
Für diesen Zweck wurden separate Sets von 10 Wochen alten Balb/c Mäusen mit 0,3 ml Mineralöl geprimt und dann wurden ihnen intraperitoneal 5 × 10⁶ Hybridomzellen injiziert. Die durchschnittliche Zeit für die Entwicklung von Ascites betrug 9 Tage. Nach einer Klärung durch Zentrifugation bei 15000 × g für 15 Minuten bei 23°C wurde die durch die Hybridome erzeugte Ascites-Flüssigkeit gesammelt und bei –20°C eingefroren gelagert, um monoklonale Antikörper-Zusammensetzungen zu bilden.
Die durch Ascites erzeugten monoklonalen Antikörper wurden weiter durch schnelle Protein-Flüssigchromatografie (FPLC) unter Verwendung einer Pharmacia Mono Q HR5/5 Anionenaustauschsäule (Pharmacia) unter Verwendung eines 0–0,5 M NaCl Gradienten in 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0 gereinigt, wobei die der Säule beigefügten Anweisungen befolgt wurden. Die FPLC-behandelten MAbs wurden dann unter Verwendung einer Amicon gerührten Ultrafiltrationszelle (Amicon, Danvers, MA; PM 30 Membran) zu einer Konzentration von 1 mg/ml konzentriert, in TBS dialysiert und bei –70°C gelagert, um gereinigtes MAb zu bilden.
5. Inhibition der Protein S-Bindung an C4BP
A. Kompetitiver Bindungsassay unter Verwendung von C4BP in fester Phase
i) Reinigung von C4BP
Gereinigtes menschliches C4BP wurde aus 5 Litern (I) von menschlichem mit Citrat versehenem Plasma durch Ausfällung mit 80 mM Bariumchlorid in Gegenwart von Inhibitoren, Benzamidinhydrochlorid (10 mM), Diisopropylphosphorfluoridat (1 mM), Phenylmethansulfonylfluorid (1 mM) und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (50 mg/l) erhalten. Nach Rühren der Mischung für eine Stunde wurde das Bariumcitratpräzipitat durch Zentrifugation bei 5000 × g für 10 Minuten bei 4°C sedimentiert. Das Präzipitat wurde in 700 ml 0,2 M Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA), pH 7,4 resuspendiert und extensiv gegen TBS-Az mit 10 mM Benzamidinhydrochlorid dialysiert und durch eine Säule (1,5 × 40 cm) geführt, die 3 mg IgG/ml Gel von immungereinigten anti-C4BP-polyklonalen Antikörpern aus Kaninchen (CalBiochem, San Diego, CA), gekoppelt an CNBr aktivierte Sepharose 4B, enthielt, mit einer Flussrate von 35 ml/h. Die Kügelchen wurden mit 100 ml TBS gewaschen, das 1 M NaCl enthielt, gefolgt von 100 ml 20 mM EDTA in TBS. Das C4BP-Antigen wurde mit 100 ml 3 M Guanidinhydrochlorid in TBS eluiert und 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden auf die Gegenwart von C4BP durch SDS-PAGE wie unten beschrieben analysiert, wurden gesammelt (52 ml) und das Protein wurde unter Verwendung von PM 30-Diaflo-Ultrafiltern (Amicon) konzentriert. Der konzentrierte Pool (5 ml) wurde über eine Sepharose CL 6B-Säule (3 × 100 cm) mit einer Flussrate von 10 ml/h geführt, um PS Antigen von C4BP in einem laufenden Puffer von 0,05 M Tris-HCl, 3 M Guanidin, pH 6,0, abzutrennen. Der C4BP Proteinpeak (15 ml) wurde gegen TBS dialysiert und die Proteinkonzentration wurde durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm, wie beschrieben in Beispiel 1, gemessen. Das C4BP wurde als mehr als 95 %ig rein ohne nachweisbare Gegenwart von Protein S angesehen, wenn es durch SDS-PAGE analysiert wurde. Das gereinigte Material stellt ungefähr 10 % der gesamten Menge von C4BP in dem Ausgangsmaterial dar.
ii) Peptid-Inhibitionsassay
Jedes der wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten und in Tabelle 1 aufgeführten Peptide wurde auf seine Fähigkeit hin analysiert, die Bindung des nativen Protein S in flüssiger Phase an C4BP in fester Phase zu inhibieren.
Mikrotitervertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen wurden mit 50 μl von 10 μg/ml gereinigtem C4BP in Carbonatpuffer (0,02 M Na₂CO₃, pH 9,0, 02 % Na-Azid) geschichtet. Nach einer Blockierung mit 10 % BSA in TBS wurden 50 μl unterschiedlicher Konzentrationen von Peptiden in Waschpuffer (TBS, 0,2 % BSA, 5 mM CaCl, 0,02 % Tween 20) verdünnt und wurden separat zu C4BP-beschichteten Vertiefungen zugemischt. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurden 50 μl einer Lösung von biotinyliertem Protein S jeder Vertiefung zugemischt um eine zweite Bindungsmischung zu bilden, die eine endgültige Konzentration von 2 μg/ml aufwies. Die Platte wurde bewegt und die Proben wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden verworfen und die Vertiefungen wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurden 50 μl Streptavidin-alkalische Phosphatase (1 μg/ml Waschpuffer) zugemischt und man ließ 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Streptavidin-alkalische Phosphatase wurde dann verworfen und die Vertiefungen wurden sechsmal mit Waschpuffer gewaschen. Die resultierenden optischen Dichten der Reaktionslösungen wurden wie vorher in Beispiel 2C abgelesen.
Die Ergebnisse des Assays sind als Prozent Inhibition der C4BP-Bindung angegeben. Die Prozent Inhibition der C4BP-Bindung ist wie folgt definiert: I = 100 % – 100 × (deltaT/deltaC)wobei I als ein Prozent ausgedrückt ist; und
wobei 100 % = delta/Minute der Menge von b-PS ist, die spezifisch an C4BP beschichtete Vertiefungen in Abwesenheit von irgendwelchem kompetitierenden PS-Peptid gebunden hat; und
wobei delta_T = die Veränderung der Absorption (405 nm) in Gegenwart von kompetitierendem PS-Peptid ist und
wobei delta_C = die Veränderung der Absorption (405 nm) in Abwesenheit von kompetitierendem PS-Peptid ist.
Die Ergebnisse des kompetitiven Assays sind in Tabelle 2 und in den 1, 2, 3 und 4 dargestellt. Die Peptid-Bezeichnungen, die zu der SEQ ID NO. korrespondieren, sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen an, dass das Peptid PSP-12 der stärkste Inhibitor war, da er die PS:C4BP-Komplexbildung um 80 % bei einer Peptidkonzentration von 800 μM inhibierte. Die Peptide PSP-415* (4: 1–15), PSP-417A (1: 417–424) und PSP-430* (2: 8–15) inhibierten die Bildung des PS:C4BP-Komplexes um fast 80 % bei Peptidkonzentrationen von 800 μM. Die Peptide PSP-415*, PSP-417 (1: 413–422), PSP-417P (1: 413–424) und PSP-428* (2: 4–15) inhibierten jeweils die PS:C4BP-Komplexbildung um ungefähr 60 % bei einer Peptidkonzentration von 800 μM. Das Peptid PSP-424 (1: 421–427) inhibierte die PS:C4BP-Komplexbildung um 40 % bei einer Konzentration von 800 μM. Tabelle 2

¹ Die angezeigten Polypeptide wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert und auf ihre Fähigkeit zur Inhibition der PS-Bindung an C4BP, wie beschrieben in Beispiel 5Ai, überprüft.

Die Peptide PSP-347 (1: 347–361), PSP-32 (1: 32–46), PSP-7 (1: 187–200), PSP-417A (1: 417–424), PSP-12 (1: 420–434) und PSP-418* (4: 1–15) zeigten alle eine starke Inhibition der PS:C4BP-Komplexbildung relativ zu den PS-Peptiden aus anderen Regionen des Protein S. Zusätzliche PS-Peptide, die in Tabelle 1 dargestellt sind, wurden ebenfalls getestet und es wurde gezeigt, dass sie die PS-Bindung an C4BP inhibierten. In folgenden Experimenten zeigte sich, dass das PSP-loop Peptid (11: 1–26) die Bindung von PS an C4BP bei einer Peptidkonzentration von ungefähr 250 μM vollständig inhibierte, während PSP-12 nicht zu einer vollständigen Inhibition bei derselben Konzentration führte. Die Peptide PSP-424K und PSP-428K zeigten ähnliche Inhibitionsprofile zu denen von PSP-12.
Diese Daten zeigen an, dass die oben beschriebenen Peptide die Fähigkeit aufweisen, die PS-Bindung an C4BP an einer Stelle oder nahe der Stelle der PS:C4BP-Bindungs region zu inhibieren. Basierend auf diesen Ergebnisse wurden verschiedene minimale Regionen von PS als signifikante Stellen für den Kontakt zwischen PS und C4BP identifiziert und definieren daher ein PS-Polypeptid dieser Erfindung.
Ein alternativer Ansatz wurde verwendet, um die Fähigkeit der Peptide PSP-loop, PSP-424K und PSP-428K im Vergleich mit der bei dem PSP-12 Peptid beobachteten Fähigkeit zur Inhibition der Bindung von C4BP an PS zu untersuchen. Für diesen Assay wurden die Mikrotitervertiefungen mit gereinigtem PS, verdünnt zu einer Konzentration von 10 μg/ml in carbonathaltigem Puffer wie oben beschrieben, beschichtet. Die Vertiefungen wurden so erhalten, damit das PS an die Wände der Vertiefungen binden konnte. Nach dem Haltezeitraum wurden die Vertiefungen auch wie oben beschrieben blockiert. Die ausgewählten PSP-Peptide wurden getrennt mit unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 0–500 μM mit biotinyliertem C4BP (b-C4BP) bei einer Konzentration von 1 μg/ml zugemischt. Die Mischungen wurden auf einer Flüssigphasenplatte für zwei Stunden bei Raumtemperatur erhalten um die Peptid-C4BP-Komplexe zu bilden.
Fünfzig μl der komplexierten Mischungen wurden getrennt zu den vorbereiteten C4BP-beschichteten Vertiefungen zugemischt und 1 h bei Raumtemperatur erhalten. Danach wurde die Platte gewaschen und für die Entwicklung wie oben beschrieben verarbeitet.
Bei diesem Assay inhibierte das PSP-loop-Peptid die Bindung von b-C4BP an die PS-beschichteten Vertiefungen mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration von ungefähr 15 μM (IC₅₀ = 15 μM) und einer IC₉₀ von 50 μM. Die anderen Peptide PSP-12, PSP-424K und PSP-428K waren ebenfalls inhibitorisch, jedoch mit einer IC₅₀ von ungefähr 50 μM und einer IC₉₀ von ungefähr 250 μM. Daher war das PSP-loop-Peptid (11: 1–26) effizienter bei der Inhibition der Bindung von C4BP an PS als die anderen drei getesteten Peptide.
iii) Antikörper, die die Bindung inhibieren
Die Antikörper, die in Beispiel 2 hergestellt wurden, die mit ihren jeweiligen immunisierenden Peptiden immunoreaktiv sind und die eine Immunoreaktivität mit gereinigtem Protein S zeigten, wurden auf ihre Fähigkeit zur Inhibition der Protein S-Bindung an immobilisiertes C4BP unter Verwendung des in Beispiel 5A beschriebenen ELISA-Systems getestet, mit den folgenden Ausnahmen. Ein immungereinigter polyklonaler anti-Peptid- Antikörper (endgültige Konzentration von 0–200 μg/ml (oder 3,1 μM)) wurde mit 50 μl biotinyliertem Protein S (2 μg/ml) präinkubiert, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5Aii, und zwar für 1 h bei Raumtemperatur vor der Zugabe zu den C4BP-beschichteten Vertiefungen. Fünfzig μl gereinigtes C4BP (10 μg/ml), hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5Ai, wurde in die Vertiefungen geschichtet und blockiert wie beschrieben in Beispiel 5Aii. Der Rest des Assays wurde wie in Beispiel 5A beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse des Assays sind als Prozent Inhibition der C4BP Bindung dargestellt. Die Prozent Inhibition der C4BP-Bindung ist wie folgt definiert: I = 100 % – 100 × (deltaT/deltaC)wobei I als ein Prozent ausgedrückt ist; und
wobei 100 % = delta/Minute der Menge von b-PS ist, die spezifisch an C4BP-beschichtete Vertiefungen in Abwesenheit von irgendwelchem kompetitierenden Antikörper gebunden hat; und
wobei delta_T = die Veränderung der Absorption (405 nm) in Gegenwart von kompetitierendem Antikörper ist und
wobei delta_C = die Veränderung der Absorption (405 nm) in Abwesenheit von kompetitierendem Antikörper ist.
Die Ergebnisse der kompetitiven Antikörper-Assays sind in Tabelle 3 und 5 dargestellt. Die Daten aus der Tabelle 3 zeigen an, dass der polyklonale anti-PS(420–434)-Antikörper der einzige Antikörper war, der die Bildung des PS:C4BP-Komplexes wesentlich inhibierte. Anti-PS(420–434) inhibierte die Bindung von nativem Protein S an C4BP um mehr als 85 %, wenn er in einer Konzentration von 3,1 μM vorlag. Wenn die Konzentrationen von anti-PS(420–434) (anti-PSP-12) und anti-PS(603–616) (anti-PSP-13*) von 0–200 μg/ml variiert wurden, übertraf die anti-PS(420–434)-Inhibition des PS:C4BP-Komplexes die anti-PS(603–616)-Inhibition um ungefähr 60 %. Anti-PS (420–434) inhibierte die PS:C4BP-Komplexbildung um 70 % bei einer Konzentration von 200 μg/ml, wobei die Hälfte der gesamten Inhibition bei einer Konzentration von 5 μg/ml auftrat. Daher bindet anti-PS(420–434)-Antikörper natives PS und inhibiert die PS-Bindung an C4BP.
Tabelle 3
So weist ein bevorzugter anti-PS Peptid Antikörper dieser Erfindung die Fähigkeit auf, mit einem PS Peptid eine Immunreaktion einzugehen und die PS-Bindung an C4BP zu inhibieren. Das Screening auf die Inhibition der PS-Bindung an C4BP wird in geeigneter Weise durch den obigen Inhibitionsassay durchgeführt.
Ein alternativer Ansatz wurde verwendet, um die Fähigkeit der Peptide PSP-loop, PSP-424K und PSP-428K im Vergleich mit der bei PSP-12 festgestellten Fähigkeit zur Inhibition der Bindung von PS an C4BP zu überprüfen, wobei das Ergebnis dieses Tests auf polyklonalen antikörperbeschichteten Platten nachgewiesen wurde. Für diesen Assay wurden C4BP, biotinyliertes PS(b-PS) und PSP-Peptide zusammen mit den jeweiligen Konzentrationen von 3 μg/ml, 0,6 μg/ml und einem Bereich von 0–500 μM (V:V:V) vermischt. Die Mischungen wurden so für 2 h bei Raumtemperatur auf einer Flüssigphasenplatte erhalten um die Bindung und/oder die Inhibition von PS an C4BP durch die PS-abgeleiteten Peptide zu ermöglichen. Nach dem Haltezeitraum wurden 50 μl der Mischung separat den vorher mit 10 μg/ml anti-C4BP-IgG-polyklonalem Antikörper beschichteten Vertiefungen zugemischt. Die Mischungen wurden für 1 h bei Raumtemperatur erhalten, um die Bindung von C4BP an die C4BP-Antikörper-beschichteten Platten zu ermöglichen. Die Bindung von biotinylierten Komplexen an die Antikörperbeschichteten Platten wurde wie in Beispiel 5Aii beschrieben nachgewiesen.
Das PSP-loop-Peptid inhibierte die Bindung von b-PS an C4BP (nachgewiesen durch die Bindung oder Inhibition der Bindung an die C4BP-Antikörper-beschichteten Platten) mit einem IC₅₀ von ungefähr 40 μM und einem IC₉₀ von ungefähr 400 μM. Die Peptide PSP-12 und PSP-424K waren ebenfalls inhibitorisch wirksam, jedoch mit einer geringeren Effektivität. So wurde gezeigt, dass das PSP-loop-Peptid die Bindung von PS an C4BP in dem oben beschriebenen Antikörper-Assay mit vergleichbaren Ergebnissen zu den in Beispiel 5Aii in dem Peptid-Inhibitionsassay gezeigten inhibiert.
B. Epitop-Kartierung von immungereinigtem Anti-PS(420–434)
Um die Epitope von anti-PS(420–434)-Antikörper zu identifizieren, wurde ein ELISA-Assay unter Verwendung der in Tabelle 4 gezeigten Peptide durchgeführt. Die Peptide wurden auf Mikrotiterplatten geschichtet und blockiert und mit Konzentrationen von anti-PS(420–434) im Bereich von 0–5 μg/ml IgG gemäß den vorher beschriebenen ELISA-Protokollen inkubiert. Der Rest des Assays und die Aufzeichnung der Daten wurde wie in Beispiel 2C beschrieben durchgeführt.
Tabelle 4
Die Ergebnisse des Assays sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Daten zeigen an, dass anti-PS(420–434) mit der höchsten Affinität an Peptide band, die die Sequenz -KEIIQ- (1: 432–427) aufwiesen und eine Länge von mehr als 7 Aminosäureresten aufwiesen oder die die Sequenz -QEKQNKHS- (1: 427–434) aufwiesen.
C. Kompetitiver Bindungsassay unter Verwendung von PS in fester Phase
Monoklonale Antikörper, hergestellt wie in Beispiel 4, die mit ihren jeweiligen immunisierenden Peptiden immunreaktiv sind und die eine Immunreaktivität mit gereinigtem Protein S zeigten, wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die C4BP-Bindung an immobilisiertes PS zu inhibieren und zwar in dem in Beispiel 2C beschriebenen ELISA-System mit den folgenden Ausnahmen. Der immungereinigte anti-PS(420–434)-monoklonale Antikörper, bezeichnet als MAb 56, wurde in variierenden Mengen von 0–150 μg/ml mit immobilisiertem Protein S für 2 h bei Raumtemperatur präinkubiert. Biotinyliertes C4BP (b-C4BP), herstellt durch Kombination von Biotin (Clontech) mit C4BP und den Anweisungen des Herstellers folgend, wurde den Vertiefungen in einer endgültigen Konzentration von 1 μg/ml zugemischt und 1 h bei Raumtemperatur erhalten. Der Rest des Assays und die Aufzeichnung der Daten wurde wie in 2C beschrieben durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Abnahme bei der Bildung des b-C4BP:PS-Komplexes mit steigender Konzentration von MAb 56, verglichen mit dem nicht immunen Kontroll-IgG. Daher inhibiert MAb 56 die Bindung von C4BP an PS.
Ein alternativer Ansatz wurde verwendet, um die Fähigkeit der Peptide PSP-loop, PSP-424K und PSP-428K im Vergleich mit der bei PSP-12-Peptid gesehenen Fähigkeit zur Inhibition der Bindung von PS an C4BP zu überprüfen, wobei die Ergebnisse auf mit monoklonalen Antikörpern beschichteten Platten nachgewiesen wurden. Für diesen Assay wurden biotinyliertes C4BP (b-C4BP), PS und die PSP-Peptide miteinander in den jeweiligen Konzentrationen von 0,5 μg/ml, 1,0 μg/ml und in einem Bereich von 0–500 μM (V:V:V) vermischt. Die Mischungen wurden 2 h bei Raumtemperatur auf einer Flüssigphasen-Platte erhalten, um die Bindung und/oder ihre Inhibition von PS an C4BP durch die PS-abgeleiteten Peptide zu ermöglichen. Nach dem Haltezeitraum wurden 50 μl der Mischung getrennt zu Vertiefungen zugemischt, die vorher mit 10 μg/ml MAb S-7 (ATCC Nr. HB 80819) beschichtet worden waren. Die Mischungen wurden 1 h bei Raumtemperatur erhalten um die Bindung von C4BP an MAb 7-Antikörper-beschichtete Platten zu ermöglichen. Die Bindung der biotinylierten Komplexe an die Antikörper-beschichteten Platten wurde wie beschrieben in Beispiel 5Aii nachgewiesen.
Das PSP-loop-Peptid inhibierte die Bindung von b-PS an C4BP (nachgewiesen durch die Bindung oder Inhibition der Bindung an MAb S-7-Antikörper-beschichtete Platten) mit einem IC₅₀ von ungefähr 35 μM und einem IC₉₀ von ungefähr 100 μM. Die Peptide PSP-12 und PSP-424K waren ebenfalls inhibitorisch wirksam, jedoch mit einer geringeren Effektivität mit einem IC₅₀ von ungefähr 50 μM und einem IC₉₀ von ungefähr 250 μM. Auf diese Weise wurde gezeigt, dass das PSP-loop-Peptid effizient die Bindung von PS an C4BP in dem oben beschriebenen Antikörper-Assay mit vergleichbaren Ergebnissen zu den in Beispiel 5Aiii mit einem Assay unter Verwendung von anti-C4BP-polyklonalem Antikörper und wie in Beispiel 5Aii in dem Peptid-Inhibitionsassay inhibiert.
6. Immunoassays zum Nachweis von freiem Protein S (PS_F).
A. ELISA mit Anti-PS_T in der festen Phase
Für die unten beschriebenen Assays wird PS_T als das „gesamte" Protein S definiert, egal ob es sich in fester oder flüssiger Phase befindet. PS_T umfasst Protein S, das mit irgendeinem anderen Protein, einschließlich C4BP, komplexiert ist oder Protein S, das frei von anderem Protein ist. PS_F ist definiert als Protein S, das frei von einer Komplexbildung mit C4BP ist und das in der Lage ist, eine Komplexbildung mit C4BP einzugehen und dafür zur Verfügung steht.
Ein monoklonaler Antikörper wurde hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 4, wobei jedoch gereinigtes Protein S als Immunogen verwendet wurde. Der MAb wurde unter Verwendung der Verfahren gemäß Beispiel 4 auf seine Fähigkeit zur Bindung von Protein S in einem Komplex mit C4BP überprüft. Der resultierende MAb mit den gewünschten Eigenschaften wurde als LJS S-7 (oder MAb S-7) (ATCC Nr HB 10819) bezeichnet. Gereinigtes MAb S-7 wird auf die Vertiefungen von Mikrotiterplatten geschichtet und blockiert wie in Beispiel 3 beschrieben. Zu den MAb S-7-haltigen Vertiefungen wurden 50 μl/Vertiefung serielle Verdünnungen (1:500 bis 1:64000) des gereinigten Proteins S zugemischt, um eine Standardkonzentrationskurve zu erstellen. Zusätzlich wurden serielle Verdünnungen von 1:2000–1:4000 von Donorblut in Waschpuffer zu separaten Vertiefungen zugemischt, die ähnlich beschichtet waren. Nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Standards und die Probenverdünnungen entfernt. Als nächstes wurde biotinyliertes MAb S-7, das durch die in Beispiel 5A beschriebenen Verfahren gebildet wurde, jeder Vertiefung zugemischt und der Rest des Assays wird wie in Beispiel 2C beschrieben durchgeführt um die immunreagierenden Produkte nachzuweisen, die freies PS enthalten. Die normalen menschlichen Plasmakonzentrati onen von C4BP und PS_T wurden mit 155 μg/ ml (270 nM) bzw. 26 μg/ml (350 nM) gemessen.
Die Ergebnisse zeigen an, dass immobilisierter MAb S-7 gesamtes PS fängt und danach wird das PS_F in der gefangenen PS-Population durch die Verwendung des PS_F-spezifischen Antikörpers MAb 56 nachgewiesen. So ermöglicht diese Vorgehensweise den Nachweis von PS_F in flüssigen Proben.
B. Assay auf PS_F unter Verwendung von Anti-PS_F in fester Phase
Um zu zeigen, dass MAb 56 nur freies Protein S erkennt und für den selektiven Fang von freiem Protein S geeignet ist, wurde ein MAb 56 an fester Phase hergestellt und freies PS wurde aus normalem menschlichen Plasma immunoadsorbiert. Zu diesem Zweck wurde der in Beispiel 4 hergestellte monoklonale Antikörper MAb 56 mit aktivierter CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia) gekoppelt, wobei den Anweisungen des Herstellers gefolgt wurde (3 mg von IgG/ml Gel). Als nächstes wurden 400 μl normales menschliches Plasma (George King Inc., Overland KS) mit 100 μl feuchten Kügelchen, die den immobilisierten monoklonalen Antikörper MAb 56 in TBS Puffer enthielten, 90 Minuten bei 8°C mit kontinuierlichem Rühren erhalten. Die Plasma/Antikörper MAb 56-Mischung wurde bei 3000 Upm bei 8°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dann auf Aliquots verteilt und bei –70°C für die darauf folgende Analyse eingefroren. Zwei weitere Plasmaproben wurden als Kontrollen in dem obigen Adsorptionsverfahren verwendet, um die Spezifität der MAb 56-Behandlung zu analysieren. Für eine Probe wurde ein identisches 400 μl Aliquot von normalem Plasma unter denselben Bedingungen ohne Sepharose erhalten. Für eine andere Probe wurden 400 μl von normalem menschlichem Plasma mit 100 μl von MAb S-7 anti-PS_T, gekoppelt an Sepharosekügelchen, unter denselben Bedingungen inkubiert. Der MAb S-7 erkennt sowohl komplexiertes als auch freies Protein S und es wurde bereits früher gezeigt, dass er alles Protein S-Antigen aus dem Plasma adsorbiert.
Um freies und komplexiertes Protein S in den verschiedenen adsorbierten Fraktionen, die oben erzeugt wurden, visuell zu identifizieren, wurde eine zweidimensionale Rocket-Kreuz-Immunoelektrophorese (CIEP) durchgeführt, wie beschrieben von Laurell et al., Anal. Biochem. 10: 358–361 (1985). Zunächst wurden 30 μl entweder von behandeltem Plasma oder von Kontrollplasma, das nicht einer Sepharose ausgesetzt wurde, auf ein Gel geladen, das 1 % Agarose, 0,3 mM/l EDTA in Tris-Glycin-Puffer, pH 8,7, enthielt, Das Gel wurde auf einen Gel-Bond-Film gegossen, der teilweise mit einem Stück einer Metallvorrichtung abgedeckt war, um einen Bereich für die Agarose freizuhalten, die für die zweite Dimension der Elektrophorese verwendet wurde. Die Elektrophorese in der ersten Dimension wurde bei 4°C bei 1 mA/cm für 45 Minuten durchgeführt. Nach Abschluss der Elektrophorese in der ersten Dimension wurde das Gel für die zweite Dimension, enthaltend 5 mMol/l EDTA, 3 % Polyethylenglycol und anti-PS-Antiserum von Ziegen in einer Verdünnung von 1/400 aufgetragen. Die Elektrophorese in der zweiten Dimension wurde bei 22°C und 1,2 mA/cm für 18 h durchgeführt. Die Platten wurden gewaschen, getrocknet und gefärbt wie von Laurell et al., supra, beschrieben.
Die Ergebnisse der 2-D-Elektrophorese sind in 6 dargestellt und zeigten ein Fehlen der PS_F-Bande an der erwarteten Stellung für MAb 56-adsorbiertes Plasma (verglichen mit der Lokalisierung der PS_F-Bande bei unbehandeltem Plasma). Zusätzlich erzeugt der C4BP-PS-Komplex eine Bande an der erwarteten Stellung für das MAb 56-adsorbierte Plasma. Daher bindet MAb 56 spezifisch an Protein S-Arten, die nicht mit C4BP im Komplex vorliegen, d. h. freies PS.
Alternativ wurden zur Identifizierung von polyklonalen anti-PS(420–434)-Antikörpern von Kaninchen, die nur freies Protein S erkennen, 3 mg von durch Immunoaffinität gereinigtem anti-PS(420–434)-Antikörper, hergestellt gemäß Beispiel 3, mit 1 ml resuspendierter CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers gekoppelt. Nach einer Blockierung der Kügelchen mit 0,1 M Ethanolamin, pH 9,0, wurden die Kügelchen in eine Chromatografiesäule (1 × 1 cm) gegossen, die mit TBS-Puffer bei Raumtemperatur äquilibriert worden war.
Zu der anti-PS(420–434)-haltigen Säule wurden unterschiedliche Mischungen von komplexiertem und freiem Protein S, hergestellt wie in den Beispielen 2C und 5A beschrieben, durch einen Fluss von 1 ml/min geführt. Nach einem Waschen mit 50 ml TBS-Puffer wurde die Säule mit 10 ml von 3 M Thiocyanat in TBS-Puffer eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden in TBS-Puffer dialysiert und die resultierenden Proben wurden einer SDS-PAGE unter Verwendung von 4–15 % Gradienten-Gelen unterzogen. Die Gele wurden mit Silber gefärbt um die unterschiedlichen Banden der Proteine zu analysieren oder sie wurden auf Nitrocellulosepapier übertragen und einem Immunoblot mit einem spezifischen Antikörper gegen Protein S oder C4BP unterzogen. Als Kontrolle wurde eine andere Affinitätssäule mit unterschiedlichen polyklonalen anti-PS-Antikörpern von Ziegen, gekoppelt an Sepharose, verwendet, um das gesamte Protein S zu adsorbieren.
Die Ergebnisse, dargestellt in 7, zeigen, dass nur freies Protein S von der Säule eluiert wurde. Dies zeigt an, dass polyklonales anti-PS(420–434) nur an freies Protein S bindet und nicht an den PS:C4BP-Komplex binden wird.
Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die anti-PS_F-Antikörper dieser Erfindung geeignet sind, um freies PS aus komplexen biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Plasma und von Plasma abgeleiteten Produkten zu entfernen.
7. Immunoassay zum Nachweis von kompetentem C4BP unter Verwendung von PSP-12-Peptid
A. Bindung von C4BP an immobilisiertes PSP-12
Fünfzig μl des synthetischen Peptids PSP-12 (20 μM) oder des nativen Protein S (10 μg/ml), verdünnt in 0,02 M Na₂CO₃ Puffer, pH 9,0, wurden separat auf Mikrotitervertiefungen für 1 h bei 37°C geschichtet. Die Inkubationsprobe wurde verworfen und die Vertiefungen wurden mit 200 μl 10 % BSA in 0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,4 (TBS) blockiert und bei 4°C gelagert, bis sie verwendet wurden. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit 0,2 % BSA in TBS, 5 mM Ca⁺⁺ und 0,02 % Tween-20 (Waschpuffer) gewaschen. Nach dem Waschen wurden 50 μl serielle Verdünnungen von biotinyliertem C4BP (b-C4BP) in Konzentrationen im Bereich von 0–20 μg/ml jeder Vertiefung zugemischt. Die Lösung wurde 2 h bei Raumtemperatur aufrechterhalten, um dem C4BP zu ermöglichen, mit dem PS oder dem PSP-12 in den Vertiefungen einen Komplex zu bilden (an sie zu binden). Der Rest des Assays wurde wie in Beispiel 2C beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen an, dass das Peptid PSP-12 und das gereinigte PS C4BP in derselben Menge binden.
B. C4BP Immunofang-Assay
Um kompetentes C4BP in einer vaskulären Flüssigkeitsprobe nachzuweisen, werden Mikrotitervertiefungen mit dem Peptid PSP-12 beschichtet und wie in Sektion 7A beschrieben blockiert.
Zu den mit PSP-12 beschichteten Vertiefungen werden 50 μl/Vertiefung serielle Verdünnungen von gereinigtem C4BP (1:500 bis 1:64000), hergestellt wie in Beispiel 5A oder NHP (1:2000–1:4000 Verdünnungen von unbekannten Proben) in Waschpuffer jeder der Vertiefungen zugemischt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur werden die Standards und die Probenverdünnungen entfernt und die Vertiefungen werden dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Als nächstes werden durch Immunoaffinität gereinigte anti-C4BP-polyklonale Antikörper von Kaninchen (10 μg/ml) jeder Vertiefung zugefügt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur werden die polyklonalen Antikörper durch Waschen mit Waschpuffer entfernt. Auf diesen Schritt folgt eine weitere Stunde der Inkubation mit 50 μl/Vertiefung von biotinyliertem anti-Kaninchen-IgG von Ziegen (1 μg/ml). Als nächstes wird 1 μg/ml alkalische Phosphatase-konjugiertes Streptavidin (SAAP) (50 μl/Vertiefung) jeder Vertiefung zugemischt und dies wird 30 Minuten bei Raumtemperatur so erhalten. Das SAAP wird entfernt und die Vertiefungen werden sechsmal mit Waschpuffer gewaschen. Fünf mg/ml PNPP (100 μl/Vertiefung) in 0,1 M Diethylamin/HCl Puffer, pH 9,0, werden dann jeder Vertiefung zugemischt. Die Veränderung der Absorption bei 405 nm wird unter Verwendung eines EL 312 Mikroplate Readers (BIO-TEK Instruments Inc., Winooski VT) gemessen und die Daten werden unter Verwendung einer kinetischen Programm-Software-Packung (Kinetiacalc, Bio-Tek) analysiert. Die Ergebnisse zeigen nur eine Bindung in den positiven Kontrollvertiefungen und auch bei den niedrigeren Verdünnungen von NHP, was einen Fang des C4BP anzeigt.
C. C4BP monoklonaler Immunofang-Assay
Gereinigte monoklonale Antikörper gegen die alpha-Kette von C4BP (erhältlich von Biodesign International Kennebunkport, ME) (10 μg/ml) in 50 μl 0,02 M Na₂CO₃ Puffer, pH 9,0, werden auf Vertiefungen von Mikrotiterplatten für 1 h bei 37°C geschichtet. Die Vertiefungen werden mit 200 μl 10 %igem BSA in TBS blockiert und bis zu ihrer Verwendung bei 4°C gelagert.
Vor ihrer Verwendung werden die Vertiefungen dreimal mit 0,2 % BSA in TBS, 5 mM Ca⁺⁺, 0,02 % Natriumazid und 0,02 % Tween-20 (Waschpuffer) gewaschen. Serielle Verdünnungen von 1:500 bis 1:64000 in 50 μl/Vertiefung von gereinigtem C4BP oder NHP werden zugemischt um eine Standardkonzentrationskurve zu erstellen. Zusätzlich werden serielle Verdünnungen von 1:2000–1:4000 von unbekannten normalen menschlichen Plasmaproben in Waschpuffer den Vertiefungen zugemischt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur werden die Standards und die Probenverdünnungen entfernt und die Vertiefungen werden dreimal mit Waschpuffer gewaschen.
Als nächstes wird das synthetische b-PSP-12 auf Konzentrationen (0–200 μM) in Waschpuffer verdünnt und wird in den Vertiefungen, die C4BP, gebunden an anti-C4BP-polyklonale Antikörper enthalten, 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Der Rest des Assays wird wie in Beispiel 2C beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen nur eine Bindung in den positiven Kontrollvertiefungen und in den niedrigeren Verdünnungen von NHP, was einen Fang von b-PSP-12 anzeigt.
Die vorstehende geschriebene Beschreibung wird als ausreichend angesehen, um einen Fachmann in die Lage zu versetzen, die Erfindung auszuführen. Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang nicht durch die hinterlegten Zelllinien begrenzt, da die hinterlegte Ausführungsform lediglich als eine einzelne Illustration eines Aspekts der Erfindung betrachtet werden sollte und jede Zelllinie, die damit funktionell äquivalent ist, in dem Umfang der Erfindung liegt. Die Hinterlegung von Materialien bildet kein Zugeständnis, dass die hier enthaltene schriftliche Beschreibung nicht adäquat ist, um die Durchführung irgendeines Aspekts der Erfindung zu ermöglichen, einschließlich deren bester Ausführungsform, noch sollten die Hinterlegungen als den Umfang der Ansprüche auf die spezifischen Illustrationen begrenzend angesehen werden, die sie darstellen. Tatsächlich sind verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen für den Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung offensichtlich.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein S Polypeptid mit einer Länge von nicht mehr als 100 Aminosäureresten und eine Aminosäurerestsequenz umfassend, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, die repräsentiert wird durch eine Formel, ausgewählt aus: -QEKQNKH- und (1: 427–433) -SGIKKIIQEK- (12: 1–10), und wobei das Polypeptid die Bindung des Proteins S an ein C4b Bindungsprotein hemmt.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, die repräsentiert wird durch eine Formel, ausgewählt aus: -QEKQNKHX- und (1: 427–434) -SGIKKIIQEKQNKC- (12: 1–14), wobei X C oder S ist.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Polypeptid eine Aminosäurerestsequenz umfasst, die einem Abschnitt der Aminosäurerestsequenz des Proteins S entspricht, die bei Sequenzidentifikationsnummer 1 gezeigt ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäurerestsequenz aufweist, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: QEKQNKHS (1: 427–434).
Antikörper, der die Bindung von Protein S an das C4b Bindungsprotein hemmt, und der eine Immunreaktion zeigt mit: (a) Protein S und (b) einem Polypeptid mit einer Aminosäurerestsequenz, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: SGIKKIIQEKQNKC (12: 1–14), der aber keine Immunreaktion mit dem Polypeptid zeigt, das eine Aminosäurerestsequenz aufweist, welche durch die Formel CTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS (1: 103–131) repräsentiert wird.
Antikörper nach Anspruch 5, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung eines Polypeptids entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 4 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombose bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid zur Verabreichung in einer ausreichenden Menge vorgesehen ist, um eine intravaskuläre Konzentration von Protein S Polypeptid im Blut des Patienten im Bereich von 0,1 bis 100 Mikromolar zu erzeugen.
Verwendung eines Antikörpers entsprechend Anspruch 5 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombose bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Antikörper zur Verabreichung in einer ausreichenden Menge vorgesehen ist, um eine intravaskuläre Antikörperkonzentration im Blut des Patienten im Bereich von 0,1 bis 100 μg/ml zu erzeugen.
Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Wirkstoffträger und ein Protein S Polypeptid umfasst, das aus der Gruppe von Polypeptiden entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 4 ausgewählt ist, und zwar in einer ausreichenden Menge, um die Bindung von Protein S an das C4b Bindungsprotein zu hemmen.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Menge zumindest 0,1 Gewichtsprozent an Protein S Polypeptid des Gewichts der gesamten Zusammensetzung ausmacht.
Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Wirkstoffträger und einen Antikörper entsprechend Anspruch 5 in einer ausreichenden Menge umfasst, um die Bindung von Protein S an das C4b Bindungsprotein zu hemmen.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die APC-hemmende Menge zumindest 0,1 Gewichtsprozent Antikörper des Gewichts der gesamten Zusammensetzung ausmacht.
In vitro Verfahren zur Hemmung der Bindung von Protein S an das C4b Bindungsprotein in einer wässrigen Zusammensetzung, welches ein In-Kontakt-Bringen der wässrigen Zusammensetzung mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Protein S Polypeptids umfasst, das aus der Gruppe von Polypeptiden entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 4 ausgewählt wird.
In vitro Verfahren zur Hemmung der Bindung von Protein S an das C4b Bindungsprotein in einer wässrigen Zusammensetzung, welches ein In-Kontakt-Bringen der wässrigen Zusammensetzung mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers entsprechend Anspruch 5 umfasst.
Verfahren zum Untersuchen der Menge an freiem Protein S in einer Probe vaskulärer Flüssigkeit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Herstellen einer Immunreaktionsmischung durch Mischen einer Probe vaskulärer Flüssigkeit mit einem Anti-Protein-S-Antikörper, welcher eine Immunreaktion zeigt mit: (i) Protein S und (ii) einem Polypeptid mit einer Aminosäurerestsequenz, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: SGIKKIIQEKQNKC (12: 1–14), der aber keine Immunreaktion mit dem Polypeptid zeigt, das eine Aminosäurerestsequenz aufweist, welche durch die Formel CTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS (1: 103–131) repräsentiert wird, und wobei der Antikörper in solcher Weise funktional mit einer festen Matrix verknüpft wird, dass die Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist; (b) Aufrechterhalten der Immunreaktionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, um ein PS_F enthaltendes Immunreaktionsprodukt in der festen Phase auszubilden, und (c) Bestimmen der Menge des in Schritt (b) gebildeten Produkts.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Bestimmung in Schritt (c) die folgenden Schritte umfasst: (i) Mischen des PS_F enthaltenden Immunreaktionsprodukts in der festen Phase mit einem zweiten Antikörper, um eine zweite Immunreaktionsmischung mit einer flüssigen Phase und einer festen Phase zu erhalten, wobei der zweite Antikörper die Fähigkeit aufweist, mit dem PS_F enthaltenden Immunreaktionsprodukt eine Immunreaktion zu zeigen; (ii) Aufrechterhalten der zweiten Reaktionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, damit der zweite Antikörper mit dem Immunreaktionsprodukt eine Immunreaktion zeigt und ein zweites Immunreaktionsprodukt in der festen Phase gebildet wird; und (iii) Bestimmen der in dem zweiten Immunreaktionsprodukt vorhandenen Menge an zweitem Antikörper und dadurch der Menge an in Schritt (b) gebildetem Immunreaktionsprodukt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der in Schritt (a) verwendete Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren zum Untersuchen der Menge an freiem Protein S in einer Probe vaskulärer Flüssigkeit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Bilden einer Konkurrenz-Immunreaktionsmischung durch Mischen einer Probe vaskulärer Flüssigkeit mit: (1) einem Anti-Protein-S-Antikörper, der eine Immunreaktion zeigt mit: (i) Protein S und (ii) einem Polypeptid mit einer Aminosäurerestsequenz, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: SGIKKIIQEKQNKC (12: 1–14), der aber keine Immunreaktion mit dem Polypeptid zeigt, das eine Aminosäurerestsequenz aufweist, welche durch die Formel CTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS (1: 103–131) repräsentiert wird, und wobei der Antikörper in solcher Weise funktional mit einer festen Matrix verknüpft wird, dass die Konkurrenz-Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist, und (2) einem Polypeptid, das eine Immunreaktion mit dem Antikörper zeigt, wobei das Polypeptid funktional mit einem Anzeigemittel verknüpft wird; (b) Aufrechterhalten der Konkurrenz-Immunreaktionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, um ein anzeigemittelhaltiges Immunreaktionsprodukt in der festen Phase auszubilden, und (c) Bestimmen der vorhandenen Menge an Anzeigemittel in dem in Schritt (b) gebildeten Produkt und dadurch der Menge an freiem Protein S in der Probe vaskulärer Flüssigkeit.
Verfahren zum Untersuchen der Menge an freiem Protein S in einer Probe vaskulärer Flüssigkeit, welches folgende Schritte umfasst: (a) Bilden einer ersten Immunreaktionsmischung durch Mischen einer Probe vaskulärer Flüssigkeit mit einem ersten Anti-Protein-S-Antikörper, der eine Immunreaktion mit Protein S zeigt, der aber nicht die Bindung von Protein S an das C4b Bindungsprotein hemmt, wobei der erste Antikörper funktional in solcher Weise mit einer festen Matrix verknüpft wird, dass die erste Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist; (b) Aufrechterhalten der ersten Immunreaktionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, um ein Protein S enthaltendes Immunreaktionsprodukt in der festen Phase auszubilden; (c) Bilden einer zweiten Immunreaktionsmischung durch Mischen des Protein S enthaltenden Immunreaktionsprodukts in der festen Phase mit einem zweiten Anti-Protein-S-Antikörper, der eine Immunreaktion zeigt mit: (i) Protein S und (ii) einem Polypeptid mit einer Aminosäurerestsequenz, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: SGIKKIIQEKQNKC (12: 1–14), der aber keine Immunreaktion mit dem Polypeptid zeigt, das eine Aminosäurerestsequenz aufweist, welche durch die Formel CTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS (1: 103–131) repräsentiert wird; (d) Aufrechterhalten der zweiten Immunreaktionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, damit der zweite Antikörper mit dem Protein S in der festen Phase eine Immunreaktion zeigt und ein zweites Protein S enthaltendes Immunreaktionsprodukt in der festen Phase gebildet wird; und (e) Bestimmen der Menge des in Schritt (d) gebildeten Produkts und dadurch der Menge an freiem Protein S in der Probe vaskulärer Flüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der erste Antikörper der durch das Hybridom LJS S-7 mit der ATCC-Zugangsnummer HB 10819 produzierte monoklonale Antikörper ist.
Verfahren zum Untersuchen der Menge an freiem Protein S in einer Probe vaskulärer Flüssigkeit, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Bilden einer Konkurrenz-Immunreaktionsmischung durch Mischen einer Probe vaskulärer Flüssigkeit mit: (1) einem Anti-Protein-S-Antikörper, der eine Immunreaktion zeigt mit: (i) Protein S und (ii) einem Polypeptid mit einer Aminosäurerestsequenz, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: SGIKKIIQEKQNKC (12: 1–14), der aber keine Immunreaktion mit dem Polypeptid zeigt, das eine Aminosäurerestsequenz aufweist, welche durch die Formel CTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS (1: 103–131) repräsentiert wird; und (2) einem Polypeptid, das eine Immunreaktion mit dem Antikörper zeigt, wobei das Polypeptid funktional in solcher Weise mit einer festen Matrix verknüpft wird, dass die Konkurrenz-Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist; (b) Aufrechterhalten der Konkurrenz-Immunreaktionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, um ein Antikörper enthaltendes Immunreaktionsprodukt in der festen Phase zu bilden; und (c) Bestimmen der Menge an Antikörpern, die in dem in Schritt (b) gebildeten Produkt vorhanden ist, und dadurch der Menge an freiem Protein S in der Probe vaskulärer Flüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Antikörper funktional mit einem Anzeigemittel verknüpft wird und das Bestimmen in Schritt (c) die Bestimmung der Menge an Anzeigemittel, die in dem in Schritt (b) gebildeten Produkt vorhanden ist, umfasst.
Verfahren zum Bestimmen der Menge an C4b Bindungsprotein in einer Probe vaskulärer Flüssigkeit, welches in der Lage ist, Protein S zu binden, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Bilden einer Bindungsreaktionsmischung durch Mischen einer Probe vaskulärer Flüssigkeit mit einem Protein S Polypeptid, das eine Länge von nicht mehr als 100 Aminosäureresten aufweist und eine Aminosäurerestsequenz umfasst, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: -SGIKKIIQEK- (12: 1–10), wobei das Polypeptid die Bindung von Protein 5 an das C4b Bindungsprotein hemmt und wobei das Polypeptid funktional in solcher Weise mit einer festen Matrix verknüpft wird, dass die Bindungsreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist; (b) Aufrechterhalten der Bindungsreaktionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, damit jedes in der Probe vaskulärer Flüssigkeit vorhandene kompetente C4b Bindungsprotein eine Bindung mit dem Polypeptid eingehen kann und ein C4b Bindungsprotein enthaltendes Reaktionsprodukt in der festen Phase gebildet wird; und (c) Bestimmen der Menge an C4b Bindungsprotein, die in dem Reaktionsprodukt in der festen Phase vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Bestimmen die folgenden Schritte umfasst: (i) Mischen des in Schritt (b) gebildeten Reaktionsprodukts mit einem Anti-C4b-Bindungsprotein-Antikörper, der eine Immunreaktion mit dem C4b Bindungsprotein zeigt, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden; (ii) Aufrechterhalten der Immunreaktionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, damit der Antikörper mit jedem C4b Bindungsprotein, das in der festen Phase vorhanden ist, eine Immunreaktion zeigt und ein Immunreaktionsprodukt in fester Phase gebildet wird; und (iii) Bestimmen der Menge an Antikörpern, die in dem in Schritt (ii) gebildeten Immunreaktionsprodukt in fester Phase vorhanden ist, und dadurch der Menge an kompetentem C4b Bindungsprotein in der Probe vaskulärer Flüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Antikörper eine Immunreaktion mit der Alpha-Untereinheit des C4b Bindungsproteins zeigt.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Polypeptid eine Aminosäurerestsequenz umfasst, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: -SGIKKIIQEKQNKC- (12: 1–14).
Verfahren zum Bestimmen der Menge an C4b Bindungsprotein in einer Probe vaskulärer Flüssigkeit, welches in der Lage ist, Protein S zu binden, welches folgende Schritte umfasst: (a) Bilden einer Konkurrenz-Immunreaktionsmischung durch Mischen einer Probe vaskulärer Flüssigkeit mit: (i) einem Protein S Polypeptid mit einer Länge von nicht mehr als 100 Aminosäureresten und umfassend eine Aminosäurerestsequenz, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: -SGIKKIIQEK- (12: 1–10), wobei das Polypeptid die Bindung von Protein S an das C4b Bindungsprotein hemmt, und (ii) einem Anti-C4b-Bindungsprotein-Antikörper, der eine Immunreaktion mit dem C4b Bindungsprotein zeigt, wobei der Antikörper funktional in solcher Weise mit einer festen Matrix verknüpft wird, dass die Immunreaktionsmischung sowohl eine flüssige Phase als auch eine feste Phase aufweist; (b) Aufrechterhalten der Immunreaktionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, damit jedes in der Probe vaskulärer Flüssigkeit vorhandene kompetente C4b Bindungsprotein eine Bindung mit dem Antikörper eingehen kann und ein Immunreaktionsprodukt in der festen Phase gebildet wird und damit das Polypeptid eine Bindung mit dem Immunreaktionsprodukt eingehen kann; und (c) Bestimmen der Menge an Polypeptid, die in dem Immunreaktionsprodukt der festen Phase vorhanden ist, und dadurch der Menge an kompetentem C4b Bindungsprotein.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Antikörper eine Immunreaktion mit der Alpha-Untereinheit des C4b Bindungsproteins zeigt.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Polypeptid eine Aminosäurerestsequenz aufweist, deren Sequenzidentifikationsnummer und entsprechende Reste in Klammern gezeigt sind, welche repräsentiert wird durch die Formel: SGIKKIIQEKQNKC (12: 1–14).
Verfahren zur Aufreinigung von freiem Protein S (PS_F) aus einer wässrigen Lösung, welches folgende Schritte umfasst: (a) Mischen einer wässrigen Lösung, die PS_F enthält, mit einem Antikörper entsprechend Anspruch 5, der spezifisch mit PS_F eine Immunreaktion zeigt, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden; (b) Aufrechterhalten der Immunreaktionsmischung unter Immunreaktionsbedingungen über eine ausreichende Zeitspanne hin, damit das PS_F in Lösung mit dem Antikörper eine Immunreaktion zeigt und ein Immunreaktionsprodukt gebildet wird; und (c) Rückgewinnen des Immunreaktionsprodukts aus der Immunreaktionsmischung und dadurch Bildung von aufgereinigtem PS_F.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Antikörper ein immobilisierter Antikörper ist, der funktional in solcher Weise an einen festen Träger gekoppelt wird, dass die Immunreaktionsmischung eine flüssige Phase und eine feste Phase aufweist und das gebildete Immunreaktionsprodukt in der festen Phase vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Rückgewinnung in Schritt (c) folgende Schritte umfasst: (i) Mischen des in Schritt (c) gebildeten Immunreaktionsprodukts mit einem Elutionspuffer, um eine Elutionsmischung zu bilden; (ii) Aufrechterhalten der Elutionsmischung über eine ausreichende Zeitspanne hin, um das PS_F in dem Immunreaktionsprodukt in fester Phase aus der festen Phase heraus und in die flüssige Phase zu eluieren; und (iii) Auffangen der flüssigen Phase und dadurch Zurückgewinnen des eluierten und aufgereinigten PS_F.
Immunoaffiniftätszusammensetzung zum Auf reinigen von freiem Protein S (PS_F) aus einer wässrigen Lösung, umfassend einen Antikörper entsprechend Anspruch 5, der funktional an einen festen Träger gekoppelt ist.