DE69836679T2

DE69836679T2 - Peptide zur behandlung des systemischen lupus erythematosus

Info

Publication number: DE69836679T2
Application number: DE69836679T
Authority: DE
Inventors: Yaakov Naparstek
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2018-03-21
Also published as: EP0972032B1; JP4459307B2; IL131950A; ES2279567T3; AU734444B2; JP2001524826A; IL120503A0; DE69836679D1; US6228363B1; PT972032E; CA2283792A1; EP0972032A2; DK0972032T3; WO1998042737A2; AU6306598A; WO1998042737A3; NZ337953A; ATE348885T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Laminin-Peptiden, einschließlich des R38-Peptids, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und zum Nachweis von systemischem Lupus erythematodes.
Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunkrankheit, von der zahlreiche Organe betroffen sind. Die Lupus-Glomerulonephritis ist durch die Beteiligung der Nieren am entzündlichen Autoimmunprozess eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei dieser Krankheit (Alarcon-Segovia, D., in: Primer on the Rheumatic Diseases, Hrsg. Schurnascher, H. R., Arthritis Foundation, Atlanta, Georgia, (1988), S. 96-100).
Die Krankheit ist serologisch durch das Auftreten einer Vielfalt von Autoantikörper im Serum gekennzeichnet, von denen die wichtigsten die anti-DNA-Autoantikörper sind (Naparstek, Y., et al., Annu. Rev. Imunol. (1993), 11: 79-104). Zwar können niedrige Titer von anti-DNA-Antikörpern bei verschiedenen Entzündungs- und Autoimmunkrankheiten auftreten, hohe Spiegel werden jedoch hauptsächlich bei SLE gefunden, und die Kombination von hohen anti-DNA-Antikörpern mit niedrigen Komplementspiegeln bedeutet im Grunde genommen eine Diagnose von SLE (Wallace, D. J., et al., in: Dubois' Lupus erythematosus, Lea und Febiger, Philadelphia, 1993).
Die Bindung von Immunglobulinen an die Glomerulum-Basalmembran (GBM) wurde durch die Färbung von Nieren gezeigt, die von Lupus-Patienten oder von Lupus-Stämmen von Mäusen stammten (Wallace, D. J., et al., vorstehend). Außerdem wurde gezeigt, dass anti-DNA-Antikörper, die aus den Nieren eines Lupus-Patienten und auch aus MRL/1pr/1pr-Mäusen eluiert wurden, mit sulfatierten Glycosaminoglycanen kreuzreagieren, wohingegen die Serum-anti-DNA-Antikörper diese Kreuzreaktivität nicht zeigen (Naparstek, Y., et al., Arthritis Rheum. (1990), 33: 1554-1559). Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) in der Pathogenese von Lupus eine Rolle spielt, indem sie das Ziel für die nephritogenen Autoantikörper darstellt.
Termmat, R. M., et al., J. Autoimmun. (1990), 3: 531-545, offenbaren die Kreuzreaktion von Komponenten der ECM wie Laminin und Heparin mit murinen monoclonalen anti-DNA-Antikörpern.
Die EP-Patentanmeldung EP 670 495 offenbart das Vorliegen von anti-ECM-Antikörpern im Urin von Patienten mit aktivem Lupus. Weiterhin offenbart diese Patentanmeldung die Kreuzreaktion dieser Antikörper mit einer 200 kDa-Laminin-Komponente der ECM und einen Test für SLE, der auf dem Nachweis dieser anti-ECM/Laminin-Antikörper im Urin beruht.
R38 ist eine Peptidsequenz, die aus der C-terminalen Region der α-Kette von Laminin der Maus isoliert wurde (Reste 2890 bis 2910 gemäß Skubitz et al., J. Cell Biol. (1991), 115: 1137-1148, oder Reste 2851 bis 2871 gemäß Sasaki, M., et al., J. Biol. Chem. (1988), 263: 16 536-16 544). Sie liegt am Übergang der globulären Domänen der vierten und fünften Schleifen (Peptid GD-2 in Skubitz et al., J. Cell. Biol. (1991), 115: 1137-1148) und besteht aus der folgenden Aminosäuresequenz:
KEGYKVRLDLNITLEFRTTSK
Die derzeitige SLE-Therapie ist auf Corticosteroide beschränkt, welche das überreaktive Immunsystem unterdrücken. Diese Therapie ist nicht spezifisch, und ihre unvermeidlichen Nebenwirkungen können selbst tödlich sein. Weiterhin ist eine immunsuppressive Therapie kompliziert, und begonnen wird eine solche Behandlung aufgrund einer Kombination von klinischen Symptomen, serologischen Bluttests und einer Nierenbiopsie. Somit besteht ein Bedarf für eine spezifischere Therapie für SLE, die nicht mit den Nebenwirkungen der Immunsuppressiva behaftet ist, und außerdem für einen spezifischeren und weniger invasiven Test, mit dem die Krankheitsaktivität bestimmt werden kann. Tatsächlich wurde in einem kürzlichen Übersichtsartikel (The Lancet (1995), 310: 1257-1261) festgestellt, dass Bluttests zwar geeignet sind, die Diagnose von SLE zu bestätigen, dass sie jedoch „weniger geeignet sind, die Aktivität der Krankheit zu überwachen".
WO 95/22979 offenbart die Verwendung von Peptiden, die von Laminin stammen, wobei sie von der carboxyterminalen globulären Domäne der A-Kette von Laminin hergeleitet sind, für die Behandlung von Krankheiten oder Zuständen des Auges. Das R38-Peptid ist als eines dieser Peptide erwähnt.
US 5 266 328 offenbart die Verwendung von Peptiden, die von Laminin stammen, wobei sie von der großen globulären terminalen Domäne der A-Kette von Laminin hergeleitet sind, einschließlich R38, für verschiedene medizinische Anwendungen.
WO 96/04926 offenbart Peptidantagonisten, die von der Domäne III der γ1-Kette von Laminin hergeleitet sind und die geeignet sind, die Laminin-Bindung an Nidogen zu hemmen, für die Behandlung verschiedener Krankheiten wie des systemischen Lupus.
Keine der vorstehend erwähnten Referenzen offenbart die Behandlung von systemischem Lupus erythematodes durch die Verabreichung des R38-Peptids oder von Analoga davon. Außerdem offenbart keine der vorstehend erwähnten Referenzen die Verwendung des R38-Peptids in einem diagnostischen Test für die Krankheit oder zum Überwachen der Aktivität der Krankheit.
Deshalb ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines von Laminin stammenden Peptids, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Aminosäuresequenzen
KEGYKVRLDLNTTLEFRTTSK, AEGYAVALDLNITLEFATTSA,
KEGYKVELDLNITLEFETTSK, KEGYKVELDLNITLEFRTTSK,
KEGYKVRLDLNITLEFETTSK, KAGYKVRLALNITLAFRTTSK,
KEGYKVRLALNITLEFRTTSK und KEGYKVRLDLNITLAFRTTSK
besteht.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Arzneimittels, das mindestens ein von Laminin stammendes Peptid und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, wobei das mindestens eine von Laminin stammende Peptid aus den wie vorstehend erwähnten Peptiden ausgewählt ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von mindestens einem von Laminin stammenden Peptid für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von systemischem Lupus erythematodes, wobei das mindestens eine von Laminin stammende Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus R38, welches KEGYKVRLDLNITLEFRTTSK ist, und den Peptiden, wie vorstehend erwähnt, besteht.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines diagnostischen Tests für die Krankheit unter Verwendung des R38-Peptids oder des von Laminin stammenden Peptids, wie vorstehend erwähnt.
Der hier verwendete Begriff „R38-Peptid" wird so verwendet, dass er das R38-Peptid selbst und das von Laminin stammende Peptid, wie vorstehend erwähnt, einschließt.
1 zeigt die direkte Bindung des murinen anti-DNA-Antikörpers C72 an Laminin-Peptide;
2 zeigt die Hemmung der Bindung von C72 an das R38-Analogon 5200 (das hier manchmal als R38' bezeichnet wird) durch R38, 5200, DNA, DNase und Heparin;
Die 3 und 4 zeigen die Bindung der menschlichen monoclonalen Lupus-anti-DNA-Antikörper (DIL6 und B3) an Laminin-Peptide und Derivate davon;
Die 5, 6 und 7 zeigen die Korrelation zwischen der Lupus-Aktivitätsbewertung und dem anti-R38-Spiegel im Urin von drei Lupus-Patienten;
8 zeigt die Wirkung einer Behandlung mit 5200 (R38') auf die Verlängerung der Überlebenszeit von Lupus-Mäusen;
9 zeigt die Wirkung einer Behandlung mit R38 (das hier auch als 5100 bezeichnet wird) auf die Verlängerung der Überlebenszeit von Lupus-Mäusen; und
10 zeigt die Hemmung der Bindung von C72 an R38 (5100) durch DNA und durch R38-Analoga.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Peptiden, die von Laminin stammen, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von sytemischem Lupus erythematodes.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass das R38-Peptid, das ein Peptid ist, welches von der C-terminalen Region der α-Kette von Laminin der Maus hergeleitet ist, durch pathogene Lupus-Antikörper erkannt wird und deshalb möglicherweise ein therapeutisches Potential in der Behandlung von systemischem Lupus erythematodes besitzt, indem es um die Bindung an die Lupus-Antikörper kompetiert.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Gemisches aus mindestens zwei oder mehreren verschiedenen Peptiden, die von Laminin stammen, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von systemischem Lupus erythematodes. In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eines der Peptide R38.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Überwachen der Krankheitsaktivität von Patienten, die an SLE leiden, umfassend das Nachweisen der Fähigkeit der Antikörper im Urin, an die R38-Komponente des Laminin zu binden. Diese Bindung kann in einer direkten Korrelation zur Krankheitsaktivität stehen, die durch eine Kombination von verschiedenen Laborparametern ermittelt wird.
Eine Zunahme der Menge von Antikörpern, die an R38 binden, zeigt möglicherweise eine herannahende aktive Phase der Krankheit und ein abnehmender Spiegel von Antikörpern eine sich nähernde Remission an. Deshalb stellt dieses Verfahren einen Test zum Nachweisen von Veränderungen des Spiegels von Laminin-spezifischen Antikörpern bereit und kann es ermöglichen, dass mit einer Therapie begonnen wird, bevor eine aktive Phase der Krankheit ausbricht.
Dieses Verfahren stellt auch einen einfachen Test bereit, der von den Patienten selbst eingesetzt werden kann, da er unter Verwendung von Urin durchgeführt wird und keine Venenpunktion erforderlich macht. Er kann als diagnostischer Test, ein Routinetest für die Bewertung der Krankheitsaktivität, für eine frühe Identifizierung eines Ausbruchs der Krankheit und für eine frühe therapeutische Intervention bei Lupus nephritis verwendet werden.
Das R38-Peptid, wie vorstehend definiert, kann in einem solchen Test unter Verwendung der in EP 670 495 beschriebenen Verfahren eingesetzt werden. So kann das R38-Peptid an eine Festphase gebunden und mit dem Urin eines Patienten inkubiert werden. Wenn von dem Patienten angenommen wird, dass er an SLE leidet, wird, wenn er an SLE leidet oder sich eine aktive Phase der Krankheit nähert, der Spiegel von R38-bindenden Antikörpern im Urin ansteigen.
Der Nachweis von R38-bindenden Antikörpern kann durch ein beliebiges, dem Fachmann bekanntes Verfahren erfolgen. Beispiele solcher Nachweisverfahren schließen ELISA und Variationen davon, Chemilumineszenz-Techniken usw. ein. Das tatsächlich verwendete Nachweisverfahren ist für den Erfolg des Tests nicht kritisch. Anschließend kann der festgestellte Spiegel von R38-bindenden Antikörpern mit den in einer Kontrollgruppe festgestellten Werten verglichen werden. Die Kontrollgruppe kann aus gesunden Freiwilligen bestehen, oder der Patient kann als innere Kontrolle dienen, d.h. der festgestellte Wert wird mit einem früheren Wert von demselben Patienten verglichen. Auf diese Weise kann ein Profil des Krankheitszustands des Patienten aufgestellt und als Indikator für weitere aktive Phasen oder Stadien der Remission der Krankheit verwendet werden.
Pharmazeutisch verträgliche Salze des R38-Peptids schließen sowohl Salze der Carboxygruppen als auch die Säureadditionssalze der Aminogruppen des Peptidmoleküls ein. Salze der Carboxygruppen können durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gebildet werden und schließen anorganische Salze wie Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen(III)- oder Zinksalze und dergleichen und Salze mit organischen Basen, wie diejenigen, die gebildet werden mit Aminen wie Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und dergleichen ein. Säureadditionssalze schließen Salze mit Mineralsäuren wie Salzsäure und Schwefelsäure und Salze von organischen Säuren wie Essigsäure oder Oxalsäure ein.
Das Arzneimittel kann von Laminin stammende Peptide wie das R38-Peptid als einzelne Peptide oder in polymerisierten oder konjugierten Formen, angeheftet an makromolekulare Träger oder Polymere, enthalten. Die Zusammensetzung kann gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Excipienten enthalten. In einer alternativen Ausführungsform kann die Zusammensetzung das P38-Peptid alleine enthalten.
Die Verabreichungsroute kann eine orale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intraartikuläre, intranasale, intrathekale, intradermale, transdermale Verabreichung oder eine Verabreichung durch Inhalation einschließen.
Eine wirksame Dosis des R38-Peptids für die Verwendung zur Behandlung von SLE kann bei etwa 1 μg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro einzelne Verabreichung liegen, wobei sie durch einen Fachmann einfach bestimmt werden kann. Die Dosierung kann vom Alter, Geschlecht, Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers, von der Art der gleichzeitigen Therapie, sofern vorhanden, und der Häufigkeit der Behandlung abhängen.
Die Peptide
Die Peptide R26, R28, R30, R31, R35, R37 und R38 (hier auch als „5100" bezeichnet), hergeleitet vom C-Terminus der α-Kette von Laminin der Maus, und das R18-Peptid, hergeleitet vom N-Terminus der α-Kette von Laminin der Maus, wurden getestet. Die Peptide sind synthetische 17 bis 22-mer-Peptide und wurden durch die F-moc-Technik hergestellt (Carpino, L. A., und Han, G. Y., (1972), J. Org. Chem. 37: 3404). Diese Peptide könnten auch durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann der Biotechnologie bekannt sind. Z.B. können die gewünschten Peptide unter Verwendung einer Nucleinsäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die DNA, RNA, cDNA, genomische, synthetische DNA, mRNA, Gesamt-RNA, hnRNA, synthetische RNA einschließt, in lebenden Zellkulturen hergestellt und geerntet werden.
Die Sequenz der Peptide ist in Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1: Von Laminin stammende Peptide

(*) Bezeichnung der Reste gemäß Skubitz, vorstehend.
* Die Peptide sind lediglich zur Erläuterung angegeben.

Andere Laminin-Peptide, die in den Beispielen zum Vergleich verwendet wurden, schließen AS31 (umfassend die Reste YIGSR), AC15 und F9 (andere Laminin-Peptide) und R27, ein Peptid aus der vierten Schleife der globulären Region der α-Kette von Laminin, ein.
Zusätzliche Peptide, die Fragmente von R38 oder nahe, hergeleitete Analoga davon sind, wurden konstruiert und sind in der nachstehenden Tabelle 2 dargestellt. Die in Tabelle 2 offenbarten Peptide 5200 und 5101 bis 5111 wurden in gleicher Weise wie die Peptide der vorstehenden Tabelle 1 hergestellt. Die Peptide der Tabelle 2 umfassen R38 (5100), menschliches R38 (5300), Fragmente von R38, ein von 5300 stammendes Fragment 5111 oder Analoga von R38, in denen eine oder mehrere Punktsubstitutionen gemäß Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt wurden. Diese Peptide wurden konstruiert, um u.a. die Wirkung auf die anti-DNA-Antikörper-bindende Aktivität zu untersuchen, die durch eine Änderung der Nettoladung des R38-Peptids verursacht wird. Tabelle 2: Synthetische Peptide, die zu dem R38-Peptid der Maus analog sind

As. = Aminosäure
* Diese Peptide sind lediglich zur Erläuterung angegeben.

Monoclonale Antikörper
Der murine anti-DNA-Antikörper C72 wurde von (NZBxNZW)F1-Lupus-Mäusen durch die Hybridomtechnik, wie in Eilat, D., et al., J. Immunol. (1991), 147: 361-368, beschrieben, hergeleitet. Die monoclonalen anti-DNA-Antikörper DIL6 und B3 wurden von Lupus-Patienten durch Hybridomtechnik, wie in Ehrenstein, M. R., et al., J. Clin. Invest. (1994), 93: 1787-1799, und Ehrenstein, M. R., et al., Kidney Inter. (1995), 48: 705-711, beschrieben, hergeleitet.
Es ist so zu verstehen, dass die folgende Beschreibung die Verwendung von Antikörpern betrifft, die für die Laminine und die hier offenbarten Peptide spezifisch sind. Verfahren zum Herstellen von Peptiden, die für die von Laminin stammenden Peptide, wie vorstehend erwähnt, und für R38 spezifisch sind, sind dem Fachmann bekannt. In dieser Hinsicht kann spezifisch auf den Text „Antibodies, A Laboratory Manual", Ed Harlow und David Lane, Cold Spring Harbor Publishing, 1988, verwiesen werden. Diese Referenz offenbart Verfahren, die zum Herstellen monospezifischer Antikörper, d.h. monoclonaler Antikörper und polyclonaler Antikörper, die gegen Laminin-Peptide gerichtet sind, eingesetzt werden können.
Anti-Peptid-ELISA (direkte Bindung):
Vertiefungen wurden mit 10 μg/ml der Peptide beschichtet, mit 1 % BSA (Rinderserumalbumin) in PBS (pH 7,4) blockiert, mit geeignet verdünnten Serum- oder Urinproben oder monoclonalen Antikörpern umgesetzt, mit anti-Mensch- oder anti-Maus-Immunglobulin, Enzym-konjugiert an alkalische Phosphatase, inkubiert und durch Zugabe eines Substrats (Sigma 100 Phosphatase Substrate Tablets) und anhand der Farbentwicklung unter Verwendung eines Organon Teknika Microwell System-Spektrometers bei einer Wellenlänge von 405 nm nachgewiesen.
Kompetitive Hemmtests:
In kompetitiven Hemmtests wurden die Antikörper mit verschiedenen Konzentrationen des Inhibitors (z.B.: Peptid, DNA, Heparin) oder mit DNase 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die verbleibende Bindung wurde sodann durch ELISA, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Die prozentuale Hemmung (% Hemmung) wurde berechnet als: O.D. Bindung ohne Inhibitor – O.D. Bindung mit Inhibitor × 100 = % Hemmung O.D. Bindung ohne Inhibitor
Beispiel 1: Bindung von Laminin-Peptiden an SLE-Antikörper
A: Murine SLE-Antikörper binden an C-terminale Peptide der α-Kette von Laminin
Die Wechselwirkung des murinen anti-DNA-Antikörpers C72 mit von Laminin stammenden Peptiden wurde durch ELISA, wie vorstehend beschrieben, analysiert. Das C72-konditionierte Medium wurde in PBS in verschiedenen Verdünnungen verdünnt. Die Ergebnisse sind in 1 zusammengefasst, welche die Bindung des murinen anti-DNA-Antikörpers C72 an die 5200-, R37- und R30-Peptide, nicht jedoch an R28- oder R18-Peptide der α-Kette von Laminin zeigt. Der murine Kontrollantikörper, anti-HEL Hy5, band nicht an das Peptid 5200 (Daten nicht dargestellt).
B. Hemmung der Bindung von C72 an 5200 wird durch DNA und Heparin gehemmt
Die Bindung von C72 an 5200 wurde vor und nach der Inkubation mit 5200, R38, R18, Heparin, DNA und DNase getestet. Die Ergebnisse sind in 2 zusammengefasst, welche die Hemmung der Bindung von C72 an 5200 durch die R38- oder 5200-Peptide der vorliegenden Erfindung, durch DNA und durch Heparin, nicht jedoch durch ein Kontrollpeptid oder eine Behandlung mit DNase zeigt. Die prozentuale Hemmung ist die prozentuale Verringerung der O.D. nach Inkubation mit dem hemmenden Mittel.
Beispiel 2: Polyclonale murine Antikörper binden an das 5200-Peptid
Die Analyse der Wechselwirkung von MRL/1pr/1pr-Urin-Antikörpern mit dem 5200-Peptid durch einen direkt-bindenden ELISA zeigte eine spezifische Bindung. So wurde gepoolter Urin von mindestens fünf Mäusen (entweder MRL/1pr/1pr oder Kontrollmäusen, z.B. BALB/c) zu Vertiefungen, die mit R38' (5200), R18 oder DNA beschichtet waren, wie vorstehend beschrieben, zugegeben und gebundenes 5200 durch ELISA getestet.
Bindung von murinen Urin-Immunglobulinen an 5200
Jede Gruppe besteht aus gepooltem Urin

U.D. = Nicht nachgewiesen
(*) O.D. bei 405 nm

Beispiel 3: Menschliche monoclonale Lupus-Antikörper binden an das 5200-Peptid
Die menschlichen monoclonalen anti-DNA-Antikörper DIL 6 und B3 wurden von Lupus-Patienten durch die Hybridomtechnik hergeleitet. Wie in den 3 und 4 dargestellt, wurde gefunden, dass diese Antikörper an das 5200-Peptid, nicht jedoch an andere getesteten Laminin-Peptide binden. In den 3 und 4 sind die Peptide, wie vorstehend angegeben oder wie folgt bezeichnet: AS30 ist R27, AS19 ist R35, AS35 ist R26, AS17 ist R28 und AS6 ist R18.
Beispiel 4: Wirkung von R38 (5100) und R38' auf den klinischen Verlauf von murinem SLE
Um zu testen, ob R38-Peptide den Verlauf von SLE beeinflussen können, testeten wir ihre Wirkung auf die Krankheit von MRL/1pr/1pr-Mäusen. 60 μg von 5200 (R38' alleine oder in Peptidkombinationen, jeweils 30 μg) in 0,1 ml PBS wurden in sechs Wochen alte weibliche MRL/1pr/1pr-Mäuse einmal die Woche für 16 Wochen i.p. injiziert und die Mäuse sodann hinsichtlich Überlebenszeit (8) und Nieren-Histologie bewertet.
50 μg von 5100 (R38) oder 5300 (menschliches R38) in 0,1 ml PBS wurden in sechs Wochen alte MRL/1pr/1pr-Mäuse dreimal die Woche i.p. injiziert und die Mäuse sodann hinsichtlich Überlebenszeit (9) und Nieren-Histologie bewertet. Kontrollmäuse erhielten 0,1 ml Phosphatpufferlösung. Jede Test- und Kontrollgruppe enthielt 12 bis 15 Mäuse.
Die Überlebenszeit von MRL/1pr/1pr-Mäusen, die mit 5100, 5200 oder 5300 behandelt wurden, wurde mit derjenigen von PBS-behandelten Mäusen verglichen. Wie in den 8 und 9 dargestellt, war die Überlebenszeit von mit 5100 oder 5200 behandelten Mäusen signifikant länger als diejenige von Kontrollmäusen. In den 8 und 9 bezieht sich die auf der x-Achse dargestellte Zeit in Tagen auf das Alter der Mäuse. Zwei Mäuse in jeder Gruppe wurden nach fünf Monaten getötet und ihre Nieren durch Lichtmikroskopie bewertet. Die Nieren der Kontrollmäuse zeigten eine starke diffuse proliferative Glomerulonephritis mit Halbmonden und Sklerose, wohingegen die mit 5100 oder 5200 behandelten Mäuse schwache proliferative Veränderungen ohne Halbmonde und ohne Sklerose zeigten.
Beispiel 5: Analyse der Korrelation zwischen anti-R38-Antikörpern und der Krankheitsaktivität
Urin von Lupus-Patienten mit und ohne Nierenerkrankung in einem aktiven und inaktiven Stadium wurde wiederholt gesammelt und durch ELISA auf das Vorliegen von anti-R38-Antikörpern getestet. Außerdem wurde die Aktivität der Krankheit durch anerkannte klinische und serologische Parameter ermittelt (Lockshin, M. D., et al., Am. J. Med. (1984), 77: 893-898) und ihre Korrelation mit anti-R38-Spiegeln verglichen.
103 Urinproben von 37 SLE-Patienten wurden durch ELISA, wie vorstehend beschrieben, auf anti-R38-Aktivität getestet. 23 der Proben stammten von Patienten ohne Nierenkrankheit und 80 Proben von Patienten mit Nierenkrankheit. Außerdem wurden weitere zwölf Proben von Patienten mit einer Nierenkrankheit, die nicht mit SLE zusammenhing, aufgenommen.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

* p < 0,001

Das positive Ergebnis der Proben von denjenigen Patienten mit einer Nierenkrankheit entsprach normalerweise der aktiven Krankheit gemäß einer Aktivitätsbewertung, die 19 klinische und Labor-Parameter einschloss (Lockshin, M. D., et al., vorstehend). Diese Parameter schlossen die Feststellung des Vorliegens/der Abwesenheit/des Zustands der folgenden klinischen Kriterien ein: Alopezie, Rash, Fieber, Serositis, Athralgie/Arthritis, Schleimhautulzera, neurologische Ereignisse, Unwohlsein, Fundus-Veränderungen, Knoten (Nodi), Milz und die folgenden Bluttests, einschließlich ESR (Erythrocyten-Sedimentationsrate), anti-DNA-Antikörper, Komplement (U/ml), Creatinin, Hämoglobin (g/dl), PLT-Thrombocyten (/mm²) oder Urinanalyse. Die Feststellung dieser Parameter erfolgt, wie in Lockshin, vorstehend beschrieben. Der angegebene gesamte Prozentsatz bezieht sich nur auf die festgestellten Parameter.
Von einigen Patienten wurden Urinproben häufiger als nur einmal getestet, dabei wurde eine gute Korrelation zwischen der klinischen Aktivität und dem Ausmaß der anti-R38-Bindung festgestellt. Drei repräsentative Beispiele von drei verschiedenen Lupus-Patienten sind in den 5, 6 und 7 dargestellt, wobei die x-Achse die Nr. von Krankenhauskonsultationen und die y-Achse die festgestellte Bindung (O.D. bei 405 nm) oder den Prozentsatz der Aktivitätsbewertung, wie vorstehend beschrieben, zeigt. Wie aus diesen Figuren ersichtlich ist, stellt der Test unter Verwendung des R38-Peptids eine verlässliche Methode zum Überwachen der Aktivität der Krankheit bereit.
Beispiel 6: Analyse der Korrelation zwischen anti-5200-(R38'-)Antikörpern und Krankheitsaktivität
In einem weiteren Experiment wurden 178 Urinproben von Lupus-Patienten, 24 mit und 22 ohne Nierenkrankheit in einem aktiven und inaktiven Stadium, gesammelt und durch ELISA, wie vorstehend beschrieben, auf das Vorliegen von anti-5200-Antikörpern getestet. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

* p < 0,001

Beispiel 7: Analyse der Korrelation zwischen anti-5100-(R38-)Antikörpern und der Krankheitsaktivität
45 Urinproben von 21 Lupuspatienten, einige mit und einige ohne Nierenkrankheit in einem aktiven und inaktiven Stadium, wurden gesammelt und durch direkten ELISA, wie vorstehend beschrieben, auf das Vorliegen von anti-5100-Antikörpern getestet.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

* p < 0,03

Beispiel 8: Analyse der Korrelation zwischen anti-5200-(R38'-)Antikörpern und der Krankheitsaktivität
52 Urinproben von 21 Lupuspatienten, mit und ohne Nierenkrankheit in einem aktiven und inaktiven Stadium, wurden gesammelt und durch ELISA, wie vorstehend beschrieben, auf das Vorliegen von anti-5200-Antikörpern getestet.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Beispiel 9: Analyse der Korrelation zwischen anti-5108-, 5101-, 5109- und 5110-Antikörpern und der Krankheitsaktivität
24 Urinproben von einigen der Lupuspatienten der Beispiele 7 und 8, zwei mit und 22 ohne Nierenkrankheit in einem aktiven und inaktiven Stadium, wurden gesammelt und durch ELISA, wie vorstehend beschrieben, auf die Bindung an 5108-Peptide getestet.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Ähnliche Ergebnisse wurden für die Bindung der Peptide 5101, 5109 und 5110 erhalten.
Beispiel 10: Direkte Bindung von C72 und B3 an R38 und analoge Peptide
Die Peptide der vorliegenden Erfindung wurden gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren auf ihre Fähigkeit getestet, direkt an die murinen anti-DNA-Antikörper C72 und die menschlichen anti-DNA-Antikörper B3 zu binden. Die Ergebnisse der direkten Bindungsstudie sind in Tabelle 3 wiedergegeben: Tabelle 3: Direkte Bindung von C72 und B3 an R38 und analoge Peptide

* NT = Nicht getestet
✝ O.D. in einem direkt-bindenden ELISA-Test nach einer (1) Stunde
⧧ O.D. in einem direkt-bindenden ELISA-Test nach zwei (2) Stunden

Beispiel 11: Kompetitive Hemmung der Bindung von C72 an R38 mit analogen Peptiden
In einer kompetitiven Hemmstudie wurde verglichen, wie jedes der Peptide mit R38 (5100) um die Bindung an den anti-DNA-Antikörper C72 kompetiert. Die Studie wurde gemäß den hier vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt, die Ergebnisse der Studie sind in der nachstehenden Tabelle 4 angegeben und werden noch weiter durch Bezug auf 10 erläutert. Tabelle 4: Hemmung der Bindung von C72 an R38

* Konzentration des kompetitiven Inhibitors, die in einem ELISA-Test zu einer 50 Hemmung der Bindung des anti-DNA-Antikörpers C72 an das Peptid 5100 (R38) führte
** NI = Keine Hemmung

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein von Laminin stammendes Peptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen: KEGYKVRLDLNTTLEFRTTSK, AEGYAVALDLNITLEFATTSA, KEGYKVELDLNITLEFETTSK, KEGYKVELDLNITLEFRTTSK, KEGYKVRLDLNITLEFETTSK, KAGYKVRLALNITLAFRTTSK, KEGYKVRLALNITLEFRTTSK und KEGYKVRLDLNITLAFRTTSK.
Nucleinsäuresequenz, welche das Peptid nach Anspruch 1 codiert.
Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei die Nucleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA, cDNA, genomischer DNA, synthetischer DNA, mRNA, Gesamt-RNA, und hnRNA.
Arzneimittel, umfassend mindestens ein von Laminin stammendes Peptid und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das mindestens eine von Laminin stammende Peptid ausgewählt ist aus den Peptiden nach Anspruch 1.
Verwendung von mindestens einem von Laminin stammendem Peptid für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von systemischem Lupus erythematodes, wobei das mindestens eine von Laminin stammende Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus R38, welches KEGYKVRLDLNITLEFRTTSK ist, und den Peptiden nach Anspruch 1.
Verfahren zur Überwachung der Aktivität von systemischem Lupus erythematodes oder der Überwachung des Fortschritts von SLE in einem Patienten, umfassend: (a) Erhalt einer Urinprobe von dem Patienten; (b) Nachweis von R38-bindenden Antikörpern in der Probe, wobei die Antikörper spezifisch an ein R38-Antigen binden, unter Verwendung eines von Laminin stammenden Peptids, welches aus der Gruppe bestehend aus R38 und den Peptiden nach Anspruch 1 ausgewählt ist; und (c) Vergleich der Menge der R38-bindenden Antikörper oder von gebundenem R38-Peptid mit einem Kontrollwert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Kontrollwert frühere Ergebnisse des Patienten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, umfassend den Schritt der Inkubation der Urinprobe des Patienten mit einem Peptid, welches von Laminin stammt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R38 und den Peptiden nach Anspruch 1, wobei das Peptid an eine Festphase gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Antigen direkt oder indirekt auf einem Festphasenmaterial immobilisiert ist.