PT972032E

PT972032E - Péptidos para o tratamento do lúpos eritematoso agudo disseminado

Info

Publication number: PT972032E
Application number: PT98907114T
Authority: PT
Inventors: Yaakov Naparstek
Original assignee: Hadasit Medical Res Services D
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2007-03-30
Also published as: CA2283792A1; IL120503A0; US6228363B1; EP0972032B1; AU734444B2; IL131950A; DE69836679D1; AU6306598A; WO1998042737A3; WO1998042737A2; ES2279567T3; JP2001524826A; NZ337953A; ATE348885T1; EP0972032A2; DK0972032T3; JP4459307B2; DE69836679T2

Description

DESCRIÇÃO

PÉPTIDOS PARA O TRATAMENTO DO LÚPUS ERITEMATOSO

AGUDO DISSEMINADO A presente invenção tem por objecto a utilização de péptidos de laminina, incluindo o péptido R38, para produzir um medicamento para o tratamento e a detecção de lúpus erite-matoso agudo disseminado. 0 lúpus eritematoso agudo disseminado (LEAD, SLE na terminologia inglesa) é uma doença auto-imune que envolve múltiplos órgãos. Através do envolvimento dos rins no processo inflamatório auto-imune, a glomerulonefrite do lúpus é uma das causas principais da morbidez e da mortalidade nesta doença (Alarcon-Segovia D. em: Primer on the Rheumatic diseases. Ed Schumascher H. R. Arthritis Foundation, Atlanta, Georgia, (1988) pp. 96-100).

Serologicamenre a doença caracteriza-se pela ocorrência de uma variedade de auto-anticorpos no soro, dos quais os mais proeminentes são os auto-anticorpos anti-ADN (Naparstek Y, et al. Annu. Rev. Immunol. (1993) 11 79-104). Embora possam aparecer títulos baixos de auto-anticorpos anti-ADN em várias doenças inflamatórias e auto-imunes, encontram-se níveis elevados principalmente no LEAD e a combinação de um elevado teor de anticorpos anti-ADN com níveis complementares baixos é virtualmente o diagnóstico de LEAD (Wallace D. J. et al em: Dubois' Lupus erythematosus. Lea and Febiger, Filadélfia, 1993) . A ligação de imunoglobulinas à membrana de base do glomérulo (MBG) tem sido evidenciada pela coloração dos rins derivada de pacientes com lúpus ou estirpes de lúpus de ratos 1 (Wallace D. J. et al supra) . Também leia sido evidenciado que os anticorpos anti-ADN eluidos dos rins de um paciente com lúpus, assim como os resultantes do cruzamento de ratos MRL/lpr/lpr reagem com glicosaminoglícanos sulfatados enquanto os anticorpos anti-ADN do soro nãc exibem esta reactívidade cruzada (Naparstek Y. et al Arthritis Rheum. (1990) 33 1554-1559). Estes resultados sugeriram que a matriz extracelular (MEC) desempenha um papel na patogénese do lúpus como o alvo para os auto-anticorpos nefritogénicos.

Termmat R. M. et al., J. Autoimmun. (1990) 3 531-545, descrevem a reacção cruzada de componentes da MEC, tal como a lamínina e a. heparina, com anticorpos anti-ADN, monoclonais de murino. 0 pedido de patente de invenção europeia EP 670.495 descreve a presença de anticorpos anti-MEC na urina de pacientes com lúpus activo. Além disso, este pedido de patente de invenção descreve a reacção cruzada destes anticorpos com um componente de laminína de 200 kDa da MEC e um ensaio para o LEAD com base na detecçâo destes anticorpos anti-MEC/lamínina na urina. O R38 é uma sequência de péptidos isolada da região da terminação C da cadeia a da laminína de ratos (resíduos 2890-2910 de acordo com Skubitz et al., J. Cell Biol (1991) 115 1137-1148 ou dos resíduos 2851-2871, de acordo com Sasakí M. et al., J. Biol. Chem. (1988) 263, 16.536-16.544). Está localizado na junção dos domínios globulares dos quartos e quinto anéis (péptido GD-2 em Skubitz et al. J Cell Biol

(1991) 115 1137-1148) e é constituída pela seguinte sequência de aminoácidos: KEGYKVRLDLNITLEFRTTSK A terapia corrente do LEAD está limitada a corticoes-teróides que suprimem o excesso de reactividade do sistema imunitário. Esta terapia não é especifica e os seus efeitos colaterais inevitáveis podem eles próprios ser fatais. Além disso, a terapia imunossupressora é complicada e o seu início baseia-se na combinação de sintomas clínicos, ensaios serológicos do sangue e biópsia do rim. Há por isso uma necessidade de uma terapia mais específica para o LEAD que não esteja associada aos efeitos colaterais dos agentes imunossupressores, assim como um ensaio mais específico e menos invasivo para a avaliação da actívídade da doença. Na verdade, uma revisão recente (The Lancet (1995) 310 1257-1261) estabeleceu que as análises do sangue, embora úteis para confirmar o diagnóstico do LEAD, são "menos úteis para monitorizar a actividade da doença". A patente de invenção WO 95/22979 descreve a utilização de péptídos derivados de laminina obtidos do domínio globular do terminal carboxi da cadeia A de laminina, para o tratamento de doenças ou condições do olho. O péptido R38 é mencionado como um desses péptidos. A patente de invenção norte-americana US 5.266.328 descreve a utilização de péptidos derivados de laminina obtidos do domínio globular grande do terminal da cadeia A da laminina, incluindo R38 para várias aplicações medicinais. A patente de invenção WO 96/04926 descreve antagonistas de péptidos derivados do domínio III da cadeia γΐ de laminina e apropriados para inibir a ligação da laminina ao azoto para o tratamento de várias doenças tais como o lúpus agudo disseminado. 3

Nenhuma das referências mencionadas antes descreve o tratamento do lúpus eritematoso agudo disseminado por meio da administração do péptido R38 ou dcs seus análogos. Além disso, nenhuma das referências mencionadas antes descreve a utilização do péptido R38 num ensaio de diagnóstico para a doença ou na monitorização da actividade da doença.

Constitui por isso um objecto da presente invenção providenciar um péptido derivado de laminina seleccionado no grupo que consiste nas sequências de aminoácidos: KEGYKVRLDLNTRLEFRTTSK, AEGYAVALDLNTTLEFATTSA. KEGYKVELDLNITL FETISK, KEGYKVELDLNTTLEFRTTSK, KEGYKVRLDLNRMEFETISK, KAGYKVRLALNITLA FRTT SK, KEGYKVRLALNTTLEFRTTSK, e KEGYKVRLDLNTTLAFRTTSK.

Um outro objecto da presente invenção é providenciar uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um péptido derivado de laminina e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em que pelo menos um dos péptidos referidos, derivados de laminina, se selecciona entre os péptidos mencionados antes.

Um outro objecto da presente invenção é a utilização de pelo menos um péptido derivado de laminina para produzir um medicamento para o tratamento de lúpus eritematoso agudo disseminado, em que pelo menos um dos péptidos referidos, derivados de laminina, se selecciona no grupo que consiste em R38, representado por KEGYKVRLDLNITLEFRTTSK e os péptidos conforme mencionados antes.

Um outro objecto da presente invenção é providenciar um ensaio de diagnóstico para a doença utilizando o péptido R38 ou o péptido derivado de laminina conforme mencionado antes.

Tal como se utiliza aqui, a expressão "péptido R38" utiliza-se. como incluindo o próprio péptido R38 e o péptido derivado de laminina conforme mencionado antes. A figura 1 mostra a ligação directa do anticorpo anti-ADN de murino C72 aos péptidos de laminina? A figura 2 mostra a inibição da ligação de C72 ao análogo de R38, 5200 por meio de R38, 5200, DNA, DNase e heparina (algumas vezes referido aqui como R38');

As figuras 3 e 4 mostram a ligação dos anticorpos anti-ADN mcnoclonais de lúpus humano (DIL6 e B3) aos péptidos de laminina e os seus derivados;

As figuras 5, 6 e 7 mostram a correlação entre a pontuação da actividade do lúpus e o nivel de anti-R38 na urina em três pacientes com lúpus; A figura 8 mostra o efeito do tratamento com 5200 (R38') no prolongamento da sobrevivência de ratos com lúpus; A figura 9 mostra o efeito do tratamento com R38 (também referido aqui como 5100) no prolongamento da sobrevivência de ratos com lúpus; e A figura 10 mostra a inibição da ligação de C72 a R38 (5100) por meio de ADN e por meio de análogos de R38.

De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto a utilização de péptidos derivados de laminina para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de lúpus eritematoso açudo disseminado. 5 A presente invenção baseia-se nd observação de que o péptído R38, que é um péptido derivado da região do terminal C da cadeia a de laminina de rato, é reconhecido por anticorpos patogénicos do lúpus e pode por isso possuir potencial terapêutico no tratamento de lúpus eritematoso agudo disseminado por competição com a ligação aos anticorpos do lúpus.

Além disso, a presente invenção tem por objecto a utilização de uma mistura de pelo menos dois ou mais péptidos diferentes derivados de laminina para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de lúpus eritematoso agudo disseminado. Num enquadramento preferido, pelo menos um dos péptidos é R38, A presente invenção tem também por objecto um processo para monitorizar a activídade da doença de pacientes que sofrem de LEAD compreendendo a detecção da capacidade dos anticorpos na urina para se ligarem ao componente R38 da laminina. Esta ligação pode ter uma correlação directa com a activídade da doença avaliada por uma combinação de vários parâmetros laboratoriais.

Um aumento na quantidade de anticorpos que se ligam a R38 pode indicar uma aproximação da fase activa da doença e uma diminuição do nível de anticorpos, a aproximação de uma remissão. Por isso, este processo providencia um ensaio para a detecção de alterações no nível de anticorpos específicos da laminina e pode permitir o início da terapia antes do início de uma fase activa da doença. requer punção da veia. Pode

Este processo também providencia um ensaio fácil que pode ser utilizado pelos próprios pacientes dado que se realiza utilizando urina e não ser utilizado como um ensaio de diagnóstico, um ensaio de rotina para avaliação da actividade da doença, para a identificação precoce da exacerbação da doença e para a intervenção terapêutica precoce na nefrite de lúpus. 0 péptido R38, tal como se definiu antes, pode ser utilizado nesse ensaio utilizando os processos descritos na patente de invenção europeia EP 670.495. Assim, o péptido R38 pode ligar-se a uma fase sólida e ser incubado com a urina de um paciente. Se se suspeitar que o paciente sofre de LEAD, ou se sofre de LEAD ou se se aproxima uma fase activa da doença, o nível de anticorpos que se ligam ao R38 na urina vai aumentar. A detecção de anticorpos de ligação a R38 pode ser realizada por qualquer processo conhecido por um especialista na matéria. Exemplos desses processos de detecção incluem ELISA e as suas variações, técnicas de quimioluminescência, etc. O processo actual de detecção não é crucial para o sucesso do ensaio. O nível de anticorpos de ligação a R38 observada pode então ser comparado com os valores observados num grupo de controlo. O grupo de controlo pode consistir em voluntários saudáveis ou o paciente pode actuar como um controlo interno, isto é, o valor observado é comparado com um valor anterior do mesmo paciente. Desta forma pode-se traçar um perfil do estado de doença do paciente e utilizado como um indicador de mais fases activas ou estados de remissão da doença.

Os sais aceitáveis sob c ponto de vista farmacêutico do péptido R38 incluem tantos sais dos grupos carboxi como sais de adição de ácidos dos grupos amíno da molécula do péptido. Os saís dos grupos carboxi podem ser formados por processos conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos tais como zinco ou sais férricos e amónio, sais de sódio, cálcio, similares e sais com bases orgânicas tais como as de aminas tais como trietanolamina, arginína ou lisina, piperidina, procaína e similares. Os sais de adição de ácidos incluem sais com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico e ácido sulfúrico e sais de ácidos orgânicos tais como ácido acético ou ácido oxálico. A composição farmacêutica pode conter péptidos derivados de laminina tal como péptidos de R38 como péptidos únicos ou em formas polimerizadas ou conjugadas ligadas aos veículos macromoleculares ou polímeros. A composição pode eventualmente conter excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Num enquadramento alternativo, a composição pode conter apenas o péptido R38. A vía de administração pode incluir a oral, intravenosa, intra-peritoneal, intra-muscular, subcutânea, intra-articu-lar, intra-nasal, intra-tecal, intra-dérmica, transdérmica ou por inalação.

Uma dose efectiva do péptido R38 para ser utilizada no tratamento de LEAD pode ser de cerca de 1 pg até 100 mg/kg de peso do corpo, por administração única, que pode ser facilmente determinada por um especialista na matéria. Ά dosagem pode depender da idade, do sexo, da saúde e do peso do receptor, tipo de terapia concorrente, se existir e frequência do tratamento.

Os péptidos

Os péptidos R26, R28, R30, R31, R35, R37 e R38 (também aqui referido a seguir como "5100'''; derivados da terminação C da cadeia α de laminina e o péptido R18 derivado do terminal N da cadeia α de laminina de rato foram ensaiados. Os péptidos são os péptidos sintéticos 17-22-mer e foram preparados pela técnica de F-moc (Carpino LA & Han GY (1972) J Org Chem 32 3404). Estes péptidos podiam também ser produzidos por processos bem conhecidos de um especialista na técnica da biotecnologia. Por exemplo, utilizando um ácido nucleico seleccionado no grupo que inclui ADN, ARN, ADNc, genómico, ADN sintético, ARNm, ARN total, ARNnh, ARN sintético, podem produzir-se os péptidos desejados em culturas de células vivas e colhê-los.

Apresenta-se a sequência dos péptidos no quadro 1:

Quadro 1: Péptidos derivados de laminina PÉPTIDOS RESÍDUOS (*) SEQUÊNCIA R18 * 42-63 RPVRHAQCRVCDGNSTNPRERH R. 26 * 2443-2463 KNLEISR3TFDLLRNSYGVRK R35 * 2547-2565 TSLRKALLHAPTGSYSDGQ R37 * 2615-2631 KAT PMLKMRTS FHGCIK R28 * 2779-2795 DGKWHTVKTBYIKRKAF R38 * 2890-2910 KEGYKVRLDLNITLIeFRTTSK R30 * 3011-3032 KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (*) Designações dos resíduos por Skubitz supra. * os péptidos estão listados apenas a título ilustrativo

Outros péptidos de laminina utilizados para fins comparativos nos exemplos incluem AS31 (compreendendo os resíduos YIGSR), AC15 e F9 (outros péptidos de laminina) e R27 um péptido do 4o anel da região globular de uma cadeia a de laminina.

Construíram-se mais péptidos que são fragmentos ou análogos derivados muito próximos de R38 e apresentam-se no quadro 2 aqui a seguir. Os péptidos 5101-5111 descritos no quadro 2 foram preparados da mesma maneira que os péptidos do quadro 1 anterior. Os péptidos do quadro 2 compreende R38 (5100), R38 humano (5300), fragmentos de R38, um fragmento de 5111, derivados de 5300 ou de análogos de R38 em que se fez um ou mais substituições pontuais de acordo com técnicas que são bem conhecidas dos especialistas nesta técnica. Estes péptidos foram construídos para investigar, entre outras coisas, o efeito da activídade de ligação do anticorpo antí-ADN por alteração da carga líquida do péptído R38. QUADRO 2 - Péptidos sintéticos análogos do péptido R38 de rato Péptido# SEQOÊNCTA DE AMINOÁCIDOS DESCRIÇÃO Carga liquida 5100* KEGYKVRLDLNITLEFRTTSK R38 de rato +2 5200 KEGYKVRLD1NTTIEFRTTSK Análogo de R38 de rato +2 5300* KEGYKV0 S DVNITLEFRTSSQ R38 Humano 0 5101* KEGYKVRLDLNITLEF Res. 1-16 de 5100 0 5102* VRLDLNITLEFR Res. 6-17 de 5100 0 5103* LDLNITLEFRTTSK Res. 8-21 de 5100 0 5104 AEGYAVALDLNITLEFATTSA Ssubst. de Ala cie 5100 em todos os a.a. positivos -3 5105 KEGYKVELDLNITLEFETTSK Subst.de carga para neg. em 5100 a.a. 7 e 17 -2 510fi KEGYKVE 1.DLN ITLF. FRTTSK Subst.de carga para neg. em 5100 a.a. 7 0 5107 KEGYKVRLDLNIT LEFETT SK Subst.de carga para neg. am 5100 a.a. 17 0 5108 KAGYKYRLALNITLAFRTTSK Subst. de Ala de 5100 em todos os a.a. negativos +5 5109 KEGYKVRLALN ITLE FRTT SK Subst. de Ala de 51 00 a.a. 9 13 5110 KEGYKVRLOLNITLAFRTTSK Subst. de Ala de 5100 a.a. 15 +3 5111 VOSDVNITLEFR Res. 3-17 de 5300 “1 a.a. Aminoácido * Estes péptidos são listados apenas a titulo ilustrativo

Anticorpos monoclonais 0 anticorpo anti-ADN de murino C72 derivou de lúpus (NZBxNZW)F1 de rato por técnicas de hibridoma tal como descrito em Eilat D. et al J. Immunol. (1991) 147 361-368. Os anticorpos mcnoclonais anti-ADN DIL6 e B3 derivaram de pacientes com lúpus por técnicas de hibridoma tal como descrito em Ehrenstein M.R et al J. Clin. Invest. (1994) 9_3 1787-1799 e Ehrenstein M. R. et al Kidney Inter. (1995) £8 705-711.

Deve entender-se que a descrição que se segue contempla a utilização de anticorpos específicos para as lamininas e os péptidos aqui descritos. Os processos para a produção de péptidos específicos dos péptidos derivados de lamínina, tal como mencionado antes e para a produção de R38 são bem conhecidos dos especialistas na matéria. A este respeito podem fazer-se referências específicas ao texto "Antibodies, A Laboratory Manual," Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Publishing, 1988. Esta referência descreve processos que podem ser utilizados para a obtenção de anticorpos mono--específicos, isto é, anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais dirigidos contra os péptidos de lamínina. ELISA do anti-péptido (ligação directa):

Revestiram-se os micro-tubos com 10 yg/mL dos péptidos, bloquearam-se com ASB (albumina de soro bovino) a 1 % no seio de SBF (a pH 7,4), fez-se reagir com amostras de soro ou de urina diluídos apropriadamente ou anticorpos monoclonais, incubou-se com enzima e imunoglobulina anti-bumano ou anti--rato conjugadas com fosfatase alcalina e detectaram-se por adição de substrato (comprimidos de substrato de fosfatase Sigma 100) e desenvolvimento da cor utilizando um espectro- metro com um sistema de microtubos da Organon Teknika com um comprimento de onda de 405 nm.

Ensaios de inibição comparativos:

Nos ensaios de inibição comparativos, incubaram-se os anticorpos com várias concentrações do inibidor (por exemplo: péptido, ADN, heparina) ou cora DNase durante 45 minutos, à temperatura ambiente e avaliou-se a restante ligação por ELISA conforme descrito aqui antes. A percentagem de inibição foi tratada em computador como:

Ligação da D.O. sem inibidor - ligação da D.O. com inibidor x 100 » % de inibição Ligação da D.O. sem inibidor EXEMPLO 1: Ligação dos péptidos de laminina aos anticorpos de

LEAL A: Anticorpos de LEAD de murino ligados aos péptidos do terminal C da cadeia oc de laminina

Analisou-se a interacção do anticorpo anti-ADN de murino C72 com péptidos derivados de laminina por ELISA tal como se descreveu antes. 0 meio condicionado de C72 foi diluído no seio de SBF em várias diluições. Os resultados estão resumidos na figura 1 que mostra a ligação do anticorpo anti-ADN de murino C72 aos péptidos 5200, R37 e R30, mas não aos péptidos R28 ou R18 da cadeia α da laminina. 0 anticorpo de controlo de murino, o Hy5 anti-HEL nâo se ligou ao péptido 5200 (dados não mostrados). B: A inibição da ligação de C72 a 5200 é inibida por ADN e heparina A ligação de C72 a 5200 foi ensaiada antes e depois da incubação com 5200, R38, R18, Heparina, ADN e DNase. Os resultados estão resumidos na figura 2 o que moscra a inibição da ligação de C72 a 5200 por meio dos péptídos R38 cu 5200 da presente invenção, por meio de ADN e de heparina, mas não por um péptido de controlo ou por tratamento com DNase. A percentagem de inibição é a percentagem de redução da D.O. depois da incubação com o agente de inibição. EXEMPLO 2: Anticorpos policlonais de murino ligados ao péptido 5200

As análises da interacção dos anticorpos da urina de MRL/lpr/lp com o péptido 5200, por meio de um ensaio de ELISA de ligação directa revelou a ligação específica. Assim, o conjunto da urina reunida de pelo menos 5 ratos (quer MRL/lpr/lp, quer ratos de controlo, por exemplo, BALB/c) foi adicionado a microtubos revestidos com R38' (5200), R18 ou ADN tal como descrito antes e o 5200 ligado foi ensaiado por meio de ELISA.

Ligação de imunoglobulinas urinárias de murino a 5200

Cada grupo é constituído por uma grupagem de urina. RATOS ΑΝΤΙGÉNIO ADN 5200 RI 8 BALB/c N.D. N.D. N.D. MRL/pr/lpr N.D. 0,26 (*) N.D. N.D. - Não detectado (*) D.O. a 405 nm. 13 EXEMPLO 3: Anticorpos monoclonais humanos de lúpus, ligados ao péptido 5200

Os anticorpos monoclonais humanos DIL 6 e B3 derivaram de pacientes com lúpus por meio da técnica do hidroma. Tal como se mostra nas figuras 3 e 4, verificou-se que estes anticorpos se ligam ao péptido 5200 mas não aos outros péptidos de laminina ensaiados. Nas figuras 3 e 4, os péptidos são referidos tal como se definiu antes ou como se segue: AS30 representa R27, AS 19 representa R35, AS35 representa R26, AS17 representa R28 e AS6 representa R18. EXEMPLO 4: Efeito de R38 (5100) & R38' no decurso clinico de LEAD de murino

Para verificar se os péptidos R38 podem afectar o curso do LEAD, os requerentes ensaiaram o seu efeito na doença de ratos MRL/lpr/lp. Injectou-se, i.p., 60 pg de 5200 (R381, isolado ou em combinações de péptidos, 30 pg de cada) no seio de 0,1 mL de SBF, a ratos fêmeas MRL/lpr/lp com 6 semanas de idade, uma vez por semana durante 16 semanas e avaliaram-se os ratos quanto à sobrevivência (fig. 8) e quanto à histologia renal.

Injectou-se, i.p., 50 pg de 5100 (R38) ou 5300 (R38 humano) no seio de 0,1 mL de SBF a ratos MRL/lpr/lp com 6 semanas de idade, três vezes por semana e avaliaram-se os ratos quanto à sobrevivência (fig. 9) e quanto à histologia renal. Os ratos de controlo receberam 0,1 mL de uma solução de tampão de fosfato. Cada grupo de ensaio e de controlo continha 12-15 ratos.

Comparou-se a sobrevivência aos ratos MRL/lpr/lp tratados com 5100, 5200 ou 5300 com a dos ratos tratados com SBF. Tal como se mostra nas figuras 8 e 9, a sobrevivência dos ratos tratados com 5100 ou 5200 foi significativamente mais elevada do que a dos ratos de controlo. Nas figuras 8 e 9 o tempo em dias mostrado no eixo dos x refere-se à idade dos ratos. Sacrificaram-se dois ratos em cada grupo passados 5 meses e avaliaram-se os seus rins por mícroscopia luminosa. Os rins dos ratos de controlo mostraram uma severa glomerulonefrite proliferativa difusa com crescentes e esclerose enquanto os ratos tratados com 5100 cu 5200 mostraram alterações proliferativas suaves sem crescentes e sem esclerose. EXEMPLO 5: Análise da correlação entre anticorpos anti-R38 e a actividade da doenga

Recolheu-se, repetidamente, urina de pacientes com lúpus com e sem doenças renais no estado activo e inactivo e analisou-se a presença de anticorpos anti-R38 por ELISA. Avaliou-se a actividade da doença também pelos parâmetros clínicos e serológicos aceites (Lockshin M. D. et al Am. J. Med. (1984) 11_ 893-898) e comparou-se a sua correlação com níveis anti-R38.

Analisaram-se 103 amostras de urina de 37 pacientes com LEAD para pesquisar a actividade anti-R38 por meio de ELISA, tal como se descreveu antes. 23 das amostras eram de pacientes sem doenças renais e 80 amostras eram de pacientes com doenças renais. Outras 12 amostras de pacientes com doença renal não relacionada com LEAD foram também incluídas.

Obtiveram-se os seguintes resultados: LEAD Presente Presente Ausente Doenças Renais Ausente Presente Presente No. de amostras 23 80 12 D.0. de anti-R38 na urina (Média+D.P.) 0,035+ 0,003 0,229+0,03* 0,07±0,01 *p < C, 0 01

Quando as amostras são positivas nos pacientes com doenças renais, normalmente está correlacionado com a doença activa de acordo com a por.ruação da actividade que inclui 10 parâmetros clínicos e laboratoriais (Locksín M. D. et al supra). Estes parâmetros incluíram a avaliação da presença/ausência/condição dos seguintes critérios clínicos: alopécia, erupção cutânea, febre, serosite, atralgia/artrite, úlceras da mucosa, eventos neurológicos, mal estar, alterações funtíícas, nódulos, baço e as análises de sangue que se seguem incluindo a taxa de sedimentação dos eritrócitos (TSE, ESR na terminologia inglesa), anticorpos antí-ADN, complemento (U/mL), creatinina, hemoglobina {g/dL), plaquetas PLT (/mm2) ou análises de urina. A avaliação destes parâmetros faz-se medindo tal como descrito em Locksin M. D. et al supra. A percentagem global dada reflecte apenas os parâmetros avaliados.

Nalguns pacientes analisaram-se amostras de urina em um ma is do que uma ocasião e observou-se uma boa correlação entre a actividade clínica e o nível de ligação anti-R38. Três exemplos representativos de três pacientes diferentes com lúpus estão indicados nas figuras 5, 6 e 7 em que o eixo dos xx mostra o n° da visita ao hospital e o eixo dos yy a ligação observada (DO a 405 nm) ou a percentagem da pontuação da actividade descrita antes. Como se pode ver a partir destas figuras, o ensaio utilizando o péptido R38 dá processo fiável de monitorização da actividade da doença. EXEMPLO 6 - Análise da correlação entre os anticorpos anti-5200 (R38') e a actividade da doença

Numa experiência adicional, recolheram-se 178 amostras de urina de pacientes com lúpus, 24 com e 22 sem doença renal no estado activo e inactivo que foram colhidas e analisadas para despistar a presença de anticorpos anti-5200 pelo processo ELISA, conforme descrito antes. Obtiveram-se os seguintes resultados:

Doença Renal Ausente Presente No. de amostras 46 132 D.O. de anti-R38 na urina (Média+D.P.) 0,05+0,005 0,335+0,035* * p< 0,001 EXEMPLO 7 - Análise da correlação entre os anticorpos anti-5100 (R38) e a actividade da doença

Recolheram-se e analisaram-se 45 amostras de urina de 21 pacientes com lúpus, algumas com e outras sem doença renal no estado activo e inactivo, para despistar a presença de anticorpos anti-5100 pelo processo de ELISA directo, conforme descrito antes. Obtiveram-se os seguintes resultados:

Doença Renal Ausente Presente No. de amostras 6 39 D.O. de anti-5100 na urina (Média+D.P.} 0,058 +0,006 0,376 ±0,05* *p < 3,03 EXEMPLO 8 ~ Análise da correlação entre os anticorpos anti-5200 (R38') ea actividade da doença

Recolheram-se e analisaram-se 52 amostras de urina de 21 pacienres com lúpus, algumas com e outras sem doença renal no 17 estado activo e inactivo, para despistar a presença de anticorpos anti-5200 pelo processo de ELISA, conforme descrito antes.

Obtiveram-se os seguintes resultados:

Doença Renal Ausente Presente No. de amostras 6 46 D.0. de anti-5200 na urina (Média+D.P.) 0,052+0,03 0,431+0,09 EXEMPLO 9 - Análise da correlação entre os anticorpos anti-5108, 5101, 5109 e 5110 e a actividade da doença

Recolheram-se 24 amostras de urina de alguns pacientes com lúpus dos exemplos 7 e 8, 2 com e 22 sem doença renal no estado activo e inactivo que foram colhidas e analisadas para despistar a ligação aos péptidos 5108 pelo processo ELISA, conforme descrito antes.

Obtiveram-se os seguintes resultados:

Doença Renal Ausente Presente No. de amostras 2 22 D.O. de anti-5108 na urina (Média+D.P.) li ) O O -H MD O O 0,67210,1

Observaram-se resultados semelhantes para a ligação dos péptidos 5101, 5109 e 5110. EXEMPLO 10 - Ligação directa de C72 e B3 ao péptido R38 e a péptidos análogos

Analisaram-se os péptidos da presente invenção quanto à sua capacidade para se ligarem directamente com anticorpos 18 antí-ADN de murino C72 e anticorpos anti-ADN humanos B3, de acordo com o processo descrito aqui antes. Os resultados do estudo de ligação directa estão referenciados no quadro 3:

Quadro 3: Ligação directa de C72 e B3 ao péptido R38 e a péptidos análogos

Péptido # Ligação de C72 t Ligação de B3 Φ 5100 2,57 0,9 5200 1,6 0,25 5300 0,03 0, 03 5101 1,11 0,1 5102 0,1 0,02 5103 0,03 0,02 5104 0,06 0, 02 5105 0,07 0, 02 5106 1/9 0,16 5107 0,05 0,01 5108 2,75 1,93 5109 2,72 1,94 5110 2,8 1,83 5111 0,01 0,01 R18 0,01 NE* R28 0,01 NE R30 0,75 NE R37 1,8 ME *NE - Não ensaiado t - D.O. num ensaio ELISA de ligação directa para uma (1) hora. 1 - D.O. num ensaio ELISA de ligação directa para duas (2) horas. 19 EXEMPLO 11 - Inibição comparativa da ligação de C72 a R38 com péptidos análogos

Um estudo comparativo da inibição comparou como é que cada um dos péptidos se compara com R38 (5100) quanto à ligação ao anticorpo anti-ADN C72. Realizado de acordo com os processos aqui descritos antes, os resultados do estudo estão descritos no quadro 4 a seguir e ficam melhor elucidados se nos reportarmos à fig. 10.

Quadro 4: Inibição da ligação de C72 a R38 Péptido # Inibição de 50 % da ligação de C72 a R38 de rato (5100) em pg/mL* 5100 10 5200 10 5300 85 5101 5 5102 30 5103 SI** 5104 SI 5105 SI 5106 2,5 5107 85 5108 2 5109 0,7 5110 0,7 5111 SI * - Concentração do inibidor concorrente que resultou numa inibição de 50 1 da ligação do anticorpo anti-ADN C72 ac péptido 5100 (R38) num ensaio de ELISA *+3I-Sem inibição 20

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: (A) NOME: Hadasit Medicai Research Services & Development Company Lud. (B) RUA: Kíryat Hadassah (C) CIDADE: Jerusalém (D) ESTADO: nenhum (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 91120 (ii) TITÚLO DA INVENÇÃO: Péptildos para o tratamento do lúpus eritematoso agudo disseminado (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 21 (iv) FORMA LISÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Floppy disk

(8) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-OOS/MS-DOS (0) SOFTWARE: Petent In Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Arg Prc Vai Arg His Ala Gin Cis A.rg Vai Cis Asp Gli Asn Ser Tre 15 10 15

Asn Pro Arg Glu Arg His 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 arainoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: T.is Asn Leu G.lu Tle Ser Arg Ser Tre Fen Asp Leu Leu Arg Asn Ser 15 10 15

Tir Gli Vai Arg Lis 20 (2) INFORMAÇÃO PAPA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 amincácidos o (B) TIPO: aminoácído (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi} DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Tre Ser Leu Arg Lis Ala Leu Leu His Ala Pro Tre Gli Ser Tir Ser 1 5 10 15

Asp Glí Gin (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácído (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(íi) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Lis Ala Tre Pro Met Leu Lis Met Arg Tre Ser Fen His Gii Cis Ile 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácído 2 3 simples (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Asp Gli Lis Trp His Tre Vai Lis Tre Glu Tir Ile Lis Arg Lis Ala 15 10 15

Fen (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 amlnoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Lis Glu Gii Tir Lis Vai A»rg Leu Asp Leu Asn Ile Tre Leu Glu Fen 15 10 15

Arg Tre Tre Ser Lis 20 (2) INFORMAÇÃO PARA Ã SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 amlnoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Lis Gin Asn Cis Leu Ser Ser Arg Ala Ser Fen Arg Gli Cis Vai k 1 5 10 15

Asn Leu Arg Leu Ser Arg 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 amínoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Tir Tle Gli Ser Arg 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 amínoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (0) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (íií) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

Lis Glu Grr Tir ris Vai Arg Leu Asp Leu Asn ' Tre Tre Leu Glu Fen 1 5 10 15 Arg ?re Tre Ser Lis 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 am.inoácidos (3) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

Lis Glu Gli Tír Lis Vai Gin Ser Asp Vai Asn Ile Tre Leu Glu Fen 15 10 15

Arg Tre Ser Ser Gin 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

Lis Glu Gli Tir Lis Vai Arg Leu Asp Leu Asn Ile Tre Leu Glu Fen 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (O) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Val Arg Leu Asp Leu Asn Ile Tre Leu Glu Fen Arg 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 amincácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: 27

Leu Asp Leu Asn Ile Tre Leu Glu Fen Arg Tre Tre Ser Lis 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A 5EQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (R) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

Ala G.ln Gli Ttr Ala Vai Ala Leu Asp Leu Asn lie Tre Leu Glu Fen 1 5 10 15

Ala Tre Tre Ser Ala 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEO ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGAI: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (íii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEO ID NO: 15: L.i s GJu Gli Tir Lis Vai Glu Leu Asp Leu Asn Ile Tre Leu Glu Fen 15 10 15

Glu Tre Tre Ser Lis 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEO ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 amínoácidcs (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

Lis Glu Gli Tir Lis Vai Glu Leu Asp Leu Asn lie Tre Leu Glu Fen 15 10 15

Arg Tre Tre Ser Lis 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEO ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácídos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

Lis Giu Gii Tir Lis Vai Arg Leu Asp Leu Asn Ile Tre Leu Glu Fen 15 10 15

Glu Tre Tre Ser Lis 2 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (Â) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

Lis Ala Gli Tir Lis Vai Arg Leu Ala Leu Asn Ile Tre Leu Ala Fen 15 10 15

Arg Tre Tre Ser Lis 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 19: (i) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (OJ TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19:

Lis Glu Gli Tir Lis Vai Arg Leu Ala Leu Asn Ile Tre Leu Glu Fen 15 10 15

Arg Tre Tre Ser Lis 30 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEO ID NC: 20:

Ala Fen 15

Lis Glu Gli Tír Lis Vai Arg Leu Asp Leu Asn Ile Tre Leu 15 10

Arg Tre Tre Ser Lis 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEO ID NO: 21: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(i) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21:

Val Gin Ser Asp Vai Asn Ile Tre Leu Glu Fen Arg 15 10

Lisboa, 1 de Março de 2007 31

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Péptido de laminina, caracterizado peio facto de se seleccionar no grupo que consiste nas sequências de aminoácidos: KEGIKVRLDLNTTLEFRTRSK, AEGIAVALDLNTTLEFATTSA, KEGIKVELOLNITLEFETTSK, KEGIKVELDLNTTLEFRTTSK, KEGIKVRL DLNITL E FET T S K, KAGIKVRLALNIT LAFRTT S K, KEGIKVRLALNIT1EFRTTSK e KEGIKVR1D1NITLAFRTTSK.
2. Sequência de ácidos nucleicos caracterizada pelo facto de codificar o péptido de acordo com a reivindicação 1.
3. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de o referido ácido nucleico se seleccionar no grupo que consiste em ADN, ARN, ADNc, ADN genómico ADN sintético, ARNm, ARN total e ARNnh.
4. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender pelo menos um péptido derivado de laminina e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em que pelo menos um dos referidos péptidos derivados de laminina se selecciona entre os péptidos de acordo com a reivindicação 1.
5. Utilização de pelo menos um dos péptidos derivados de laminina caracterizada pelo facto de se destinar à produção de um medicamento para o tratamento de lúpus eritematoso agudo disseminado, em pelo menos um dos referidos péptidos derivados de laminina se selecciona no grupo que consiste em R38 que é 1 KEGIKVRLDLNIT1EFRTTSK e nos péptidos de acordo com a reivindicação 1.
6. Processo de monitorização da actividade do lúpus erite-matoso agudo disseminado ou de monitorização do progresso do LEAD num paciente, caracterizado pelo facto de compreender: (a) a obtenção de uma amostra de urina do paciente; (b) a detecção de anticorpos que se ligam a R38 na referida amostra em que os referidos anticorpos se ligam especificamente ao antigénio de R38, utilizando um péptído derivado de laminina escolhido no grupo constituído por R38 e péptidos de acordo com a reivindicação 1; e (c) a comparação da quantidades dos referidos anticorpos que se ligam ao péptido R38 ou do péptído R38 ligado, com um valor de controlo.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o valor de controle compreender resultados anteriores do referido paciente.
8. Processos de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizados pelo facto de compreenderem a etapa de incubação da amostra de urina do referido paciente com um péptido derivado de laminina escolhido no grupo constituído por R38 e os péptidos de acordo com a reivindicação 1, estando o referido péptido ligado a uma fase sólida.
9. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo facto de o referido antigénio estar imobilizado directamente ou indirectamente num material em fase sólida. Lisboa, 1 de Março de 2007 o