KR100204738B1 - 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질 저해 펩티드 및 이를 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 아미노산 서열을 갖는 3 kDa의 CETP 저해 펩티드 및 이의 단편에 관한 것으로, 이들은 돼지 혈장으로부터 분리 또는 화학적 합성이 가능하며, CETP가 HDL 의 CE를 VLDL 혹은 LDL로 이송하는 것을 막아줌으로써 CE를 HDL에 모이게 하여 간으로 수송 및 배출을 용이하게 해줄 뿐 아니라 말단조직으로 콜레스테롤의 유입을 차단하므로 혈중 콜레스테롤이 농도 저하 및 동맥경화증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CETP) 저해 펩티드 및 이를 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료제

제1도는 콜레스테롤 역수송 경로에서 CETP의 역할과 그 저해제와의 관계를 도식적으로 나타낸 도면.

제2도는 사람혈장과 돼지혈장의 HDL 분획의 전기영동사진.

제3도는 돼지혈장으로부터 분리가 완료된 본 발명의 3kDa 펩티드의 전기영동 사진.

제4도는 본 발명의 3kDa 펩티드에 의한 CETP 저해 활성을 보여주는 그래프.

제5도는 반응 기질의 특이성에 따른 서열 1 펩티드의 CETP 저해효과 양상을 보여주는 그래프.

제6도는 토끼의 체내에서 서열 1 및 서열 3의 펩티드가 CETP 활성도에 미치는 영향을 나타낸 그래프.

제7도는 토끼의 체내에서 서열 1 및 서열 3의 펩티드가 혈중 총콜레스테롤에 미치는 영향을 나타낸 그래프.

제8도는 토끼의 체내에서 서열 1 및 서열 3의 펩티드가 혈중 HDL-콜레스테롤에 미치는 영향을 보여주는 그래프.

제9도는 본 발명의 서열 1의 펩티드에 대한 특이적 항체의 생성을 보여주는 그래프.

제10도는 서열 3의 펩티드에 대한 변형 펩티드 3종이, 서열 3 펩티드와 항체의 결합을 억제하는 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 콜레스테릴 에스테르 전달단백질(Cholesteryl Ester Transfer Protein; 이하 CETP로 약칭) 저해 펩티드 및 이를 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

동맥경화증은 특히 선진 서구국가에서 많이 발생하는 성인병의 일종으로, 식생활 패턴 및 환경의 변화에 따라 우리나라에서도 그 환자수가 급격히 증가하고 있는데, 최근에는 어린이나 청소년에게서도 그 환자가 증가하고 있어 국민 건강상 매우 심각한 문제로 되고 있다.

동맥경화증의 발병 및 진행의 원인이 되는 위험인자들은 유전적 및 환경적 요인, 흡연과 같은 개인적 습관 등 여러가지 보고되고 있으나, 혈중 콜레스테롤이 가장 관련되는 위험인자로 알려짐에 따라 콜레스테롤의 생합성 및 수송과 배출에 많은 관심이 모아지고 있다. 이러한 연구에서 가장 관심을 끄는 것은 혈중 지단백질(lipoproteins) 및 지질(lipids)의 농도와 관상동맥질환의 진전과의 상관관계이다. 즉, 고밀도 지단백질(high-density lipoproteins; HDL)과 저밀도 지단백질(low-density lipoproteins; LDL)은 혈중에서 콜레스테롤을 운반하는 역할을 하는데, 이 때 콜레스테롤은 주된 콜레스테릴 에스테르(cholesterylester; CE)의 형태로 운반된다. 특히 HDL은 말단 조직에서 사용하고 남은 콜레스테롤을 간으로 수송함으로써 콜레스테롤이 간에서 분해 및 배출되도록 하는 작용을 한다. 즉, 혈중 콜레스테롤은 가능한한 HDL에 위치하여야 쉽게 제거되므로, HDL의 콜레스테롤이 다른 지단백질로 전달되는 것을 억제한다면 혈중 콜레스테롤 농도를 효과적으로 낮출 수 있을 것이다.

CETP는 HDL의 CE를 LDL 혹은 초저밀도 지단백질(very low-density lipoproteins; VLDL)로 전달하는 단백질로서, 이의 기능과 관련된 많은 연구가 수행되었다. 특히, 드레이나 등의 인간 CETP의 cDNA 서열을 결정하고 이를 클로닝 하였으며(Drayna et al., Nature, 327: 6123(1987)), 왕 등은 CETP의 cDNA를 벡터에 삽입하여 인간 CEPT를 생산하였음을 보고하였다(Wang et al., DNA, 8: 753-758(1989)). CETP가 없는 일부 동물은 HDL-콜레스테롤이 높고 LDL-콜레스테롤이 낮으며 그 결과 동맥경화증 발병율도 낮은 것으로 밝혀졌는데, 이러한 사실은 CETP와 콜레스테롤의 농도, 동맥경화증이 상당한 상관관계를 갖고 있음을 시사하는 것이라 할 수 있다(kushwaha et al., J. of Lipid Research, 34: 1285-1297(1993)). 또한, 일본에서 발견된 CETP 결핍 가계의 구성원에서는 HDL의 크기가 큰 것이 관찰되었으며, 모든 구성원에게서 심장질환이 발생하지 않고 장수한 사실도 보고되었다(Koizumi et al., Atherosclerosis, 58: 175-186(1986)). 이밖에도 최근 CETP가 발현되지 않은 생쥐에 CETP 유전자를 이전 발현시킨 결과, 정상 생쥐군보다 심각한 동맥경화 현상을 관찰할 수 있었음이 알려졌다(Marotti et al., Nature, 364: 73-75(1993)). 이러한 선행기술상의 여러 발견은, CETP가 결핍되거나 그 활성이 억제되면 콜레스테롤의 HDL을 통한 이동 및 배출이 촉진되고, 이에 따라 콜레스테롤의 축적에 기인한 동맥경화증 등의 질환을 예방 및 치료할 수 있다는 가정을 뒷받침하고 있다.

제1도는 콜레스테롤 역수송 경로에서 CETP의 역할과 그 저해제와의 관계를 도식적으로 나타낸 도면이다. 여기에서 보면, HDL중에 CE의 형태로 운반되는 콜레스테롤은 CETP에 의해 LDL로 전달되는데, LDL 중의 CE는 말초부위로 이동되어 세포중에 축적되고 HDL 중의 CE는 간으로 수송되어 분해 및 배출된다. CE의 양이 HDL의 수송 능력을 초과하게 되면 CE는 세포중에 축적된 상태로 있는데, 동맥 혈관벽과 같은 장소에 축적된 후 CE의 과부하가 계속되면 세포의 기능손상과 괴사로 이어지고 세포 파괴물이 혈관벽에 축적되어 아테롬성 동맥경화를 유발하게 된다. 이 때 CETP의 작용을 억제하거나 차단하면 HDL 중의 CE는 LDL로 전달되지 않고 간으로 이송되므로 CE의 혈관벽 등의 축적을 막을 수 있고 동맥경화증의 발생도 억제할 수 있게 된다.

이러한 관점에서, 미국 특허 제5,279,540호에서는 콜레스테롤에 기인하는 동맥경화증을 치료하기 위하여 환자의 혈액을 항-CETP 컬럼을 통과시켜 혈중 CETP의 농도를 감소시키는 방법을 제시하고 있다.

한편, PCT 국제공개 WO 1993/11782에서는 원숭이(baboon)의 혈장으로부터 CETP의 저해 활성을 갖는 펩티드를 분리하고 그 아미노산 서열을 결정한 다음, 이에 따라 화학합성된 펩티드가 동일한 CETP 저해 활성을 갖는 것을 개시하고 있다.

본 발명자는 돼지 혈장으로부터 CETP 저해 활성을 갖는 펩티드를 분리하여 분석한 결과, 상기 선행 특허출원에서 제시한 것과는 전혀 다른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 이의 단편이 우수한 CETP 저해 활성을 갖는 것으로 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 새로운 아미노산 서열을 가지는 CETP 저해 펩티드, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라서, 하기 서열 1의 펩티드, 이의 유사서열의 펩티드, 이의 변형체, 이의 단편 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질의 저해 활성을 갖는 펩티드, 이를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질, 이에 대하여 특이성을 갖는 항체가 제공된다 :

본 발명의 다른 목적에 따라 돼지 혈장으로부터 상기 펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 상기 펩티드의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 목적에 따라 상기 펩티드와 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 동맥경화증의 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명에 따라 제공되는 CETP 저해 활성을 갖는 펩티드는 제1도에서 보듯이, CE가 HDL로부터 LDL, VLDL 등으로 전달되는 것을 저해하여 HDL로 모이게 함으로써 간으로 수송되도록 해줄 뿐 아니라 말단조직으로 콜레스테롤의 유입을 차단하기 때문에 혈중 콜레스테롤의 농도를 낮추게 되고, 따라서 동맥경화증의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 돼지 혈장으로부터 분리된 분자량 약 3,000의 펩티드(3kDa)는 시험관내 시험결과 매우 높은 CETP 저해 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 이 펩티드의 아미노산 서열을 분석한 결과 상기 아미노산 서열 1을 얻을 수 있었는데, 본 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 화학적으로 합성된 상기 아미노산 서열을 갖는 펩티드도 돼지 혈장유래의 펩티드와 마찬가지로 높은 CETP 저해 활성을 갖는다.

이와 같은 서열 1의 펩티드를 아미노산 서열 데이터 뱅크와 비교 조사한 결과 돼지의 아포지방단백질 CIII(Apolipoprotein CIII : Apo-CIII)의 아미노 말단과 높은 유사성을 갖는 것으로 나타났다. 돼지의 Apo-CIII는 주로 간에서 합성되며 소장에서도 일부 합성되기도 하는 73개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드인데, VLDV 및 HDL을 구성하는 미량의 단백질중 하나이다. 돼지의 Apo-CIII가 갖는 본래의 기능에 대해서는 알려진 바가 없으며, 인체 Apo-CIII는 지단백질 리파제와 간 리파제의 활성을 저해하고 간세포의 킬로미크론 흡수를 감소시키는 기능을 갖는다고 보고된 바 있다. 돼지 Apo-CIII의 아미노 말단 서열은 하기 서열 2와 같다 :

즉, 서열 1과 서열 2의 펩티드는 아미노 말단으로부터 5번째 및 6번째 아미노산이 치환된 것을 제외하고는 아미노산 서열이 서로 동일하다는 것을 알 수 있다.

상기 서열 2을 갖는 펩티드 역시 CETP 저해 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 본 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 화학적으로 합성된 상기 아미노산 서열을 갖는 펩티드도 천연에서 분리된 펩티드와 동등한 CETP 저해 활성을 나타낸다.

인간 Apo-CIII는 79개의 아미노산으로 구성되며 74번 위치의 Thr에 탄수화물 잔기가 결합되어 있는 분자량 약 8,700의 당단백질로서, 돼지의 Apo-CIII와는 전혀 다른 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 인간 Apo-CIII 아미노산 서열의 N-말단으로부터 13개의 아미노산으로 이루어진 하기 서열 2'로 표시되는 펩티드 단편도 CETP 저해 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

이와 같은 서열 1, 서열 2 및 2'의 펩티드는 그 전체 서열을 갖는 것 뿐 아니라, 이중 일부의 아미노산 서열만을 포함하는 펩티드 단편도 CEPT 활성을 갖는 것이 밝혀졌는데, 이들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

예를 들면 서열 1의 아미노 말단으로부터 10개의 아미노산으로 구성되는 하기 서열 3의 펩티드 단편이나, 24개의 아미노산으로 구성되는 서열 5, 20개의 아미노산으로 구성되는 서열 6, 14개의 아미노산으로 구성되는 서열 7, 8개의 아미노산으로 구성되는 서열 8의 펩티드 단편 및 서열 2의 아미노 말단으로부터 18개의 아미노산으로 구성되는 하기 서열 4의 펩티드 단편 역시, 서열 1, 서열 2 및 2'의 펩티드와 마찬가지로 CETP 저해 활성을 갖는다 :

상기 서열 1, 2 및 2'의 펩티드 또는 이들의 단편을 포함하는 펩티드에 있어서, 이들을 구성하는 아미노산의 적어도 하나가 일반적으로 알려진 아미노산 변형체로 치환되는 경우에도 CETP 저해 활성을 가질 수 있으며, 이들 역시 본 발명의 범위에 속한다. 이와 같은 아미노산 변형체의 예는 다음과 같다 :

Glu이 2-아미노아디프산, Asp 또는 C_a-메틸Glu으로 치환;

Asp이 Glu, C_a-메틸Asp 또는 β-카르복시Asp으로 치환;

Thr이 Ser 또는 C_a-메틸Thr으로 치환;

Ser이 Thr 또는 C_a-메틸Ser으로 치환;

Pro이 3,4-데하이드로Pro 또는 C_a-메틸Pro으로 치환;

Lys이 오르니틴, 시트룰린, Arg 또는 C_a-메틸Lys으로 치환;

Met이 C_a-메틸Met으로 치환;

Gln이 Asn, 시트룰린 또는 C_a-메틸Gln으로 치환;

Val이 이소Val, 노르Val, C_a-메틸Val 또는 Leu으로 치환;

Ala이 Gly, β-Ala, C_a-메틸Ala 또는 2-아민부티르산으로 치환;

Arg이 Lys, 호모Arg, C_a-메틸Arg 또는 시트룰린으로 치환;

및

Leu이 노르Leu, 이소Leu 또는 C_a-메틸Leu으로 치환.

또한, 상기 서열 1, 2 및 2'의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이들의 단편을 포함하는 펩티드는, 그 아미노산 결합에 있어서도 티오에스테르 결합(-CH₂-S-), 알킬 결합(-CH₂-CH₂-), 아미노 결합(-CH₂-NH₂-) 등과 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.

한편, 상기 서열 1, 2 및 2'의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이들의 단편을 포함하는 분자량이 더 큰 폴리펩티드 또는 단백질 역시 CETP 저해 활성을 나타낼 수 있으며, 이들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 상기 서열 1, 2 및 2'의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이들의 단편을 포함하는 펩티드에 특이성을 갖는 항체는 동맥경화증 등의 진단시약 또는 예방시약 등에 응용될 수 있으므로, 본 발명의 펩티드에 대한 특이적인 항체도 본 발명의 목적에 부합되는 것으로서 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 따른 펩티드는 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 콜레스테롤 저하, 동맥경화증 예방 및 치료용 약학적 조성물로 제형화되어 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 담체와 혼합된 조성물을 주사제로 제제화 할 경우에는 동결건조한 형태로 보관 또는 투여될 수 있다. 본 발명의 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물에 사용할 수 있는 담체로는 약제학적으로 허용되는 어떠한 것도 가능하며, 예를 들어 전분, 유당, 포도당, 과당, 만니톨, 탄산칼슘, 인산일수소칼륨, 염화나트륨, 미세결정성 셀룰로스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메틸셀룰로즈, 카올린, 콜로이드성 실리카겔, 히드록시프로필전분, 프로필렌글리콜, 카제인, 탄산수소나트륨, 젖산칼륨, 라놀린, 젤라틴, 글리세린, 벤토나이트, 스테아린산 칼슘, 폴리비닐알콜, 시트르산나트륨, 폴리옥시에틸렌솔비톨, 라놀린에스테르 등이 포함된다. 이밖에도 제제화의 필요에 따라 적절한 유제, 현탁제, 안정화제, 결합제, 활탁제 등을 혼합할 수 있다.

본 발명의 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 동맥경화의 예방 및 치료에 유효한 양을 매일 또는 정기적으로 투여할 수 있으며, 1일 1 내지 3000mg이 바람직하고, 20 내지 300mg이 더욱 바람직하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 만으로 한정되기 것은 아니다.

[참고 시험예 1 : CETP 저해 활성 역가를 측정하는 방법]

반응시료 :

① CE-공여체(HDL)와 CE-수용체(LDL)

모턴 등이 제시한 방법(Morton et al., J. Biol. Chem. 256: 11992-11995(1981)에 따라, [³H]-콜레스테릴 올리에이트로 표지된 HDL과 표지되지 않은 LDL을 합성하고 초원심분리기(모델명 : Beckman XL 70)를 사용하여 분리한 다음 CE-공여체(HDL)와 CE-수용체(LDL)로 한다.

② CETP 원(source)

헤슬러 등의 방법(Hesler et al., J. Biol. Chem. 262: 2275-82(1987))에 따라 사람의 혈장에 존재하는 CETP를 순수 분리하여 CETP 원으로 사용한다.

③ CETP 저해제(inhibitor)

상기 시료 ①(CE-공여체 0.05㎖, CE-수용체 0.3㎖), ②(CETP 원 0.05㎖) 및 ③(CETP 저해제 0.05㎖)을 1.5㎖ 튜브에 넣고 약 37℃에서 약 3시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 모턴 등이 제시한 방법(Morton et al., Biochim. Biophys. Acta, 663: 350-355(1981))에 따라 LDL을 침전시키고, 상징액의 일부를 취하여 반사능 섬광계수기(Packed Tricarb 1600 TR)를 사용하여 LDL로 전달된 동위원소의 양을 정량하고 CETP의 활성도로 환산한다.

이때, CETP 저해제가 첨가되지 않은 시료를 대조군으로 삼고 CETP 저해제가 첨가된 경우를 시험군으로 하여, CETP 저해제의 저해활성역가를 백분율로 환산한다.

[참고 시험예 2 : 혈중 총콜레스테롤의 농도를 정량하는 방법]

동물 실험에 사용된 토끼의 혈중 총콜레스테롤의 농도를 정량하기 위해 알라인 등이 제시한 방법(Allain et al., Clinical Chemistry, 20, 470-475(1974))을 이용하였다. 먼저, 혈장 0.001㎖와 0.5㎖의 콜레스테롤 측정용 효소시약(Sigma 352-50)을 1.5㎖ 튜브내에서 교반시키고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 반응물 2㎖를 취하여 분광광도계를 사용하여 500nm에서의 흡광도를 측정한 다음 검량곡선과 비교하여 농도를 환산한다.

[참고 시험예 3 : 혈중 HDL-콜레스테롤의 농도 정량]

워닉 등이 제시한 덱스트란 설페이트-MnCl₂침전법(Warnick et al., Clinical Chemistry, 28 1385-1397(1982))을 이용하여 동물 실험에 사용된 혈중 고밀도 저단백질의 콜레스테롤의 농도를 정량하였다. 먼저 혈장 0.05㎖와 HDL-콜레스테롤 시약(Sigma 352-3) 0.01㎖를 섞어 반응시키고, 실온에서 5분간 방치한 다음, 3,000xg에서 5분간 원심분리하였다. 상등액 2㎖를 취하여 콜레스테롤 측정용 효소시약(Sigma 352-50) 0.5㎖와 혼합하고 교반한 다음, 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 반응물 2㎖를 취한 후 분광광도계를 사용하여 500nm에서의 흡광도를 측정한 다음 검량곡선과 비교하여 농도를 환산한다.

[실시예 1 : 돼지혈장으로부터의 CETP 저해 펩티드의 동정]

돼지 및 사람의 혈액으로부터 분리한 혈장을 각각 CETP 저해제로 사용하고, 참고 시험예 1의 ②에 따라 사람의 혈장에서 분리한 CETP를 CETP 원으로 사용하여, 상기 참고 시험예의 방법에 따라 돼지 및 사람 혈장의 CETP 저해활성 역가를 측정하였다.

그 결과 돼지 혈장은 사람 혈장에 비해 약 10%의 CETP 저해 역가가 있음이 확인되었다.

계속해서, 사람 혈장과 돼지 혈장을 초원심분리하여 HDL 분획을 채취하고 전기영동하였다.

제2도는 사람 혈장과 돼지 혈장의 HDL 분획의 전기영동사진으로, 제1열 및 제2열은 단백질 분자량 표준물질(97-14kDa 및 20-3kDa)이고, 제3열은 사람 혈장의 HDL 분획이고, 제4열은 돼지 혈장의 HDL 분획을 나타낸다. 여기에서 보면, 사람의 혈장에는 존재하지 않고 돼지의 혈장에만 존재하는 분자량 약 3,000의 단백질 분리대를 확인할 수 있다.

[실시예 2 : 돼지 혈장으로부터의 CETP 저해 펩티드의 분리]

돼지의 신선한 혈액으로부터 200g의 혈장을 채취하여 100% 황산암모늄 10.5g을 첨가한후 4,000rpm의 속도로 3분간 저속원심분리 하였다. 상징액(황산암모늄 침전후의 상등액)을 페닐-세파로즈 CL-4B컬럼(Pharmacia사 제품, 수웨덴)을 사용하여 분리 정제하였다. 모든 단백질 분획에 대하여 참고 시험예의 방법에 따라 CETP 저해 활성 역가를 측정하였다.

CETP 저해 활성 역가가 높은 분획을 수집하여 DEAE-세파덱스 컬럼으로 재정제한 후 각 분획의 CETP 저해 활성 역가를 확인하였다.

CETP 저해 활성 역가가 높은 분획을 수집하여 다시 하이드록실아파타이트(Hydroxylapatite; Bio-Rad사 제품, 미국) 컬럼으로 정제한 후 모든 단백질 분획에 대해 실험예 1의 방법에 따라 CETP 저해 활성 역가를 조사한 결과, 3kDa의 펩티드를 포함하는 분획에서 CETP 저해 활성 역가가 존재함을 확인하였다.

[실시예 3 : CETP 저해 펩티드의 저해 역가 측정]

상기 실시예 2의 전기영동 결과 얻어진 폴리아크릴아미드겔상의 3kDa 단백질 분리대를 수술용 칼로 잘라 다른 전기영동 장치의 H자 모양의 관에 넣고, 다시 전기영동함으로써 단백질을 용액속으로 이동시켜 3kDa 펩티드를 순수한 형태로 분리하였다(Electroelution; Hunkapiller et al., Meth. Enzymol., 91: 227-236(1986)).

제3도는 이와 같이 돼지혈장으로부터 분리가 완료된 본 발명의 3kDa 펩티드의 전기영동 사진으로, 제A 및 제B열은 단백질 분자량 표준물질(97-14kDa 및 20-3kDa)이고, 제1 및 제2열은 분리가 완료된 3kDa 펩티드를 나타내는데, 제1열은 환원제로서 이황화 결합(disulfide bond)을 절단하는 β-메르캅토에탄올을 0.2% 첨가하여 전기영동한 것이고, 제2열은 β-메르캅토에탄올을 처리하지 않고 전기영동한 것이다. 여기에서 보듯이, 돼지 혈장에서 분리한 순수한 3kDa(분자량 약 3,000)의 단백질 분리대를 확인할 수 있으며, 제1열과 제2열에서 동일한 분리대에 3kDa 단백질 분리대가 위치하는 것으로 보아, 단일 펩티드임을 알 수 있다.

이와 같이 순수하게 분리된 3kDa를 CETP 저해제로 하고 참고 시험예 1의 ②에 따라 사람혈장으로부터 분리한 CETP를 CETP 원으로 사용하여, 상기 참고 시험예 1의 방법에 따라 CETP 활성 저해 역가를 측정하였다. 이어서, 사람의 혈장을 그 자체로 CETP 원으로 사용하여 CETP 활성 저해 역가를 측정하였다. 대조실험으로서는 사람의 알부민 단백질을 CETP 저해제로 사용하여 같은 실험을 반복하고 그 결과를 제4도에 나타내었다.

제4도는 본 발명의 3kDa 펩티드에 의한 CETP 활성의 저해도를 보여주는 그래프로서, A는 3kDa 펩티드와 순수분리된 CETP, B는 3kDa 펩티드와 사람의 혈장, 그리고 C는 대조실험으로서 사람의 알부민 단백질과 순수분리된 CETP를 사용한 각각의 경우에 있어서 CE 전달이 억제되는 정도를 나타낸다. 여기에서 보면, 대조실험(C)에서는 CETP의 저해효과가 거의 관찰되지 않는 반면에, 3kDa 펩티드와 순수분리된 CETP를 사용한 경우(A)는 상기 펩티드 1nmol 농도에서 100%의 저해율을, 3kDa 펩티드와 사람 혈장을 CETP 원으로 사용한 경우(B)는 상기 펩티드 1nmol에서 약 50%의 저해율을 나타내었다.

[실시예 4 : CETP 저해 펩티드의 아미노산 서열 분석]

실시예 2에서 얻어진 3kDa 펩티드 분획을 램리 등의 방법(Laemmli et al., Nature 227: 680-5(1970))에 따라, 4% SDS/0.25M Tris/10% 글리세롤 완충액에 녹인 후 37℃에서 12시간 반응시키고 15% 소디움도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔을 제조하여 15mA에서 전기영동을 실시하였다.

전기영동후 3kDa 펩티드를 마쯔다이라의 방법(Matsudaira, J. Biol. Chem. 262: 10035-10038(1987))에 따라 폴리비닐디플루오로라이드(PVDF) 멤브레인에 옮기고 70% 에탄올로 멤브레인을 세척한 다음, 자동 아미노산 분석기(모델명 : Protein Sequenator 470A, Applied Biosystem 제품)을 사용하여 아미노말단으로부터 15개까지의 서열을 결정하였다. 분석기의 분석 한계로 인하여 16번째 이후의 서열을 정확히 확인할 수 없었으나 3kDa 펩티드의 분자량적 관점에서 계산해 보았을 때 Apo-CIII의 16번째 서열에서 28번째 까지의 서열과 일치할 것으로 판단되었다.

[실시예 5 : CETP 저해 펩티드의 합성]

실시예 4에서 분석된 3kDa 펩티드의 아미노산 서열에 따라 아미노 말단으로부터 28개까지 고상결합(solid-phase bound) 방법을 이용한 자동아미노산 합성기를 이용하여 3kDa 펩티드(이하, P₂₈이라 한다)를 대량 합성하였다.

합성방법은 먼저 아미노기가 t-Boc기로 보호된 3kDa 펩티드의 카르복실 말단 아미노산을 폴리스티렌 수지에 결합시키고 t-Boc 기를 제거한 후, 노출된 아미노기에 다음 아미노산을 펩티드 결합으로 붙이는 방법으로 3kDa 펩티드의 카르복실 말단으로부터 아미노말단까지의 28개의 아미노산을 갖는 전체 서열을 합성하였다.

다음에는 합성된 펩티드를 폴리스티렌 수지로부터 떼어낸 분리 정제하고, HPLC(모델명 : GME 712, Gilson사 제품)을 사용하여 순수분리하였다.

별도로, 아미노 말단으로부터 20개의 아미노산을 갖는 서열 2의 펩티드(이하, P₂₀이라 한다)와 아미노 말단으로부터 13개의 아미노산으로 구성된 상기 서열 2'의 펩티드(이하, P₁₃이라 한다)도 같은 방법으로 합성하였다.

같은 방법으로, 상기 서열 1 및 서열 2의 단편인 서열 3 내지 서열 8도 같은 방법으로 합성하였다(이하, 각각 P₁₀, P₁₈, P₂₄, P₂₀, P₁₄ 및 P₈이라 한다).

[실시예 6 : 서열 1의 펩티드 및 이의 단편의 저해역가 분석]

순수한 CETP 및 사람의 혈장을 CETP 원으로 사용하고, 실시예 5에서 합성한 서열 1의 아미노산 28개의 펩티드 P₂₈을 CETP 저해제로 사용하고 상기 참고 시험예에 따라 CETP 저해역가를 측정하였다.

동일한 방법으로 실시예 5에서 합성한 P₁₀, P₁₈, P₂₄, P₂₀및 P₁₄펩티드 단편들에 대해서도 같은 시험을 반복하여 표 1에 나타내었다.

시험방법에 있어서 비특이적 저해 가능성을 배제하기 위하여, 대조군으로서 임의서열을 갖는 분자량 2000의 수용성 펩티드를 합성한 다음 이를 CETP 저해제로 사용하여 상기 시험을 반복하였다.

[실시예 7 : 대장균(E. coli)에서 발현된 서열 1 펩티드의 단편에 대한 CETP 저해역가 분석]

서열 1 펩티드의 카르복실 말단으로부터 일정잔기가 제거된 펩티드를 통상적인 유전자 조작 기술을 이용하여 대장균에서 발현시키고 펩티드를 분리하여 그 저해 역가를 시험예 1의 방법에 따라 조사하여 하기 표 2에 나타내었다.

표 2에서 보는 바와 같이, 서열 1 펩티드의 카르복실 말단으로부터 일정 간격으로 몇개의 아미노산이 제거된 P, P, P, P등도 서열 1의 펩티드와 같이 CETP 저해 역가를 갖는 것으로 나타났다.

상기 표 1 및 표 2에서 모든 수치들은 평균값으로 표시되며 평균±표준편차를 반영한 것이다. 이 수치들은 편차분석(Variance Analysis)을 하여 비교되었으며 심각한 오차가 발견되는 수치는 Duncan's Multiple Range Test (Duncan, D.B., Multiple Range and Multiple F Test, Biometrics, 11: 1-12(1955))를 통하여 비교한 후 표시하였다.

상기 표 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, P및 P은 순수한 CETP에 대해서는 100%, 사람의 혈장에 대해서는 약 50%의 CETP 저해 역가를 나타내며, 대조군으로 사용된 펩티드는 HDL로부터 LDL로의 CE의 전달에 아무런 영향이 없음이 확인되었다. 또한, P및 기타 단편들의 경우는 순수한 CETP에 대해서 90% 사람의 혈장에 대해서는 약 40%의 저해 역가를 나타내었다. 이 결과에서 명백한 바와 같이 서열 1의 펩티드 및 이들 단편들은 모두 유의할 만한 CETP 저해도를 갖는 것으로 평가된다.

[실시예 8 : 아미노산 서열 3 펩티드(P)의 변형]

상기 실시예 6에서 CETP 저해활성이 확인된 서열 3 펩티드의 아미노산 서열중 CETP의 저해에 직접적인 영향을 주는 아미노산을 조사하기 위해 아미노 말단으로부터 순서대로 그 잔기를 알라닌 아미노산으로 치환하여 합성하여 아래 표 3과 같은 10종류의 서열 3 펩티드 유도체를 합성하였다. 합성된 10종류의 펩티드에 대해 시험예 1의 방법에 따라 CETP 저해 역가를 조사하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다. 표 3에서 보는 바와 같이, 서열 3 펩티드의 아미노산 서열 중 아미노 말단으로부터 첫번째부터 다섯번째의 아미노산이 CETP의 저해 활성에 중요한 영향을 끼치며, 아홉번째와 열번째 아미노산은 큰 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.

[실시예 9 : 반응 기질의 특이성에 따른 서열 1 펩티드(P₂₈)의 저해효과]

서열 1 펩티드(P₂₈)에 의한 CETP의 저해가 혈중에서 어떠한 양상으로 일어나는 지를 조사하기 위해 CE-수용체로 VLDL, LDL, HDL 또는 재합성된 LDL을 사용하여 각각 참고 시험예 1의 방법에 따라 CETP 저해 활성도를 측정하였다. 그 결과 반응물에서 최종 농도 2μM의 서열 1 펩티드(P₂₈)가 첨가된 조건에서, VLDL을 CE-수용체로 사용했을 경우 약 10%의 CE-전달 저해가 일어나며, LDL을 CE-수용체로 사용했을 경우 약 50%의 CE-전달 저해가 일어나며, HDL을 CE-수용체로 사용했을 경우에는 CETP의 저해가 일어나지 않음을 알 수 있었다. 제5도는 서열 1 펩티드의 반응기질 특이성에 따른 CETP 저해 효과를 나타낸 것으로, 여기에서 보듯이 서열 1 펩티드(P₂₈)는 CETP에 대해 HDL로부터 VLDL 또는 LDL로 전달되는 CE의 전달을 차단하며, HDL로부터 HDL로 교환되는 CE는 차단하지 않음을 알 수 있다.

[실시예 10 : 독성시험]

본 발명의 아미노산 서열 1 내지 8을 갖는 펩티드 P₂₈, P₂₈', P₁₃, P₁₈, P₁₀, P₂₄,P₂₀, P₁₄및 P₈을 사람의 섬유아세포 주A 431(ATCCCRL 1555)를 DMEM 배지(10% FBS 함유)에서 10%(w/v) 농도로 72시간 배양하였다. 시험 결과 펩티드를 첨가하지 않고 배양한 대조군과 비교하여 세포의 성장상태 및 형태적 변화에 아무런 영향이 없었다.

[실시예 11 : 동물체내에서의 저해 효과 검색]

본 발명에 따른 아미노산 서열 1 및 서열 3을 갖는 펩티드 P₂₈및 P₁₈을 고지혈증이 유발된 토끼의 체내에 주사하여 생체내 지단백질 대사에서 이들 펩티드의 효과를 조사하였다. 실험에 사용된 토끼는 뉴질랜드 화이트(New Zealand White) 종으로, 하기 표 4와 같이 4개 그룹으로 분리하였다.

상기 표 4와 같이 분리된 그룹에 대해 주사 직전 3주동안 그룹 B, C, D에 대해 0.3%의 콜레스테롤 식이를 제공하여 고지혈증을 유발하였으며, 그룹 A와 B에 생리 식염수를 1㎖씩 토끼 이정맥을 통해 주사하고 계속하여 그룹 C에 서열 1의 펩티드 20mg, 그룹 D에 서열 3의 펩티드 20mg씩 같은 방법으로 주사하였다. 정맥주사 직후 매 1시간 간격 또는 3시간 또는 6시간 간격으로 토끼의 이정맥을 통해 2㎖씩의 혈액을 72시간 동안 채혈하였다. 채취된 혈액은 상기 참고 시험예 2에 따라 혈장의 형태로 분리되어 분석실험 직전까지 영하 20℃의 냉동고에 보관하였다. 모든 그룹의 토끼들에 대한 채혈이 완료된 후 서열 1 및 3의 펩티드에 의한 효과를 다음과 같은 3개 항목으로 조사하였다.

1. 토끼의 체내에서 서열 1 및 3의 펩티드가 CETP의 활성도에 미치는 영향

각 그룹에 대하여 정맥 주사 직전부터 주사 직후 72시간 동안 1시간 간격으로 채혈하여 시험예 1의 방법에 따라 CETP의 활성도를 조사한 결과, 그룹 A, B의 경우 생리 식염수 주사후 72시간 동안 CETP의 활성도는 거의 변화지 않았으나, 그룹 C의 경우 주사 직후부터 30시간까지 대조군인 그룹 B와 비교하여 70% 이상의 저해효과를 보이며, 그룹 D의 경우 20시간까지 대조군인 그룹 B와 비교하여 60% 이상의 CETP 저해효과를 갖는 것을 알 수 있었다. 제6도는 토끼 체내에서의 서열 1 및 3 펩티드에 의한 CETP 활성도 변화를 나타낸 것으로, 여기에서 -●-는 정상 사료를 투여한 대조군이고, -■-는 콜레스테롤 첨가 사료를 투여한 대조군이며, -▲-는 P펩티드와 콜레스테롤 첨가 사료를 투여한 그룹이고, -×-는 P펩티드와 콜레스테롤 첨가 사료를 투여한 그룹이다.

2. 토끼의 체내에서 서열 1 및 3의 펩티드가 혈중 총콜레스테롤에 미치는 영향

각 그룹에 대하여 정맥주사 직전부터 주사 직후 72시간 동안 1시간 간격으로 채혈하여 시험예 2의 방법에 따라 혈중 총콜레스테롤의 농도 변화를 관찰한 결과, 그룹 A의 경우 주사 직후 초기에 조금 감소하는 경향을 보이다가 20시간 이후부터 천천히 증가하는 경향을 보이다가 20시간 이후부터 천천히 증가하는 경향을 보였고, 그룹 B는 주사 직후에 약 5%의 감소를 보이나 7시간 이후부터 안정된 수치를 나타내었다. 그룹 C의 경우는 주사 직후부터 감소 경향을 보이다가 주사 직후 9시간 이후부터 초기 농도의 80%까지 감소하였으며, 그룹 D는 같은 감소 경향을 보이다가 12시간 이후부터 초기 농도의 70%까지 감소함을 보였다. 제7도는 토끼 체내에서의 서열 1 및 3 펩티드에 의한 혈중 총콜레스테롤 농도 변화를 나타낸 것으로, 여기에서 각 기호는 제6도에 나타낸 바와 같다.

3. 토끼의 체내에서 서열 1 및 3의 펩티드가 혈중 고밀도 지단백질 콜레스테롤에 미치는 영향

각 그룹에 대해 정맥주사 직전부터 주사 직후 72시간 동안 일정시간 간격으로 채혈하여 시험예 3의 방법에 따라 혈중 고밀도 지단백질 콜레스테롤의 농도 변화를 관찰한 결과, 그룹 A의 경우 주사 직후부터 천천히 감소하기 시작하였으며, 그룹 B의 경우는 계속 안정 농도를 유지하고, 그룹 C의 경우 정맥주사 30시간 이후부터 천천히 증가하기 시작하여 최초 농도의 113%까지 증가하였꼬, 그룹 D는 정맥주사 직후부터 천천히 증가하기 시작하여 57시간째에는 최초 농도의 135%까지 증가함을 알 수 있었다. 제8도는 토끼 체내에서의 서열 1 및 3 펩티드에 의한 혈중 HDL 콜레스테롤 농도 변화를 나타낸 것으로, 여기에서 각 기호는 제6도에 나타낸 바와 같다.

[실시예 12 : 서열 1 및 서열 3 펩티드의 항체 생산]

상기 서열 1 및 서열 3의 펩티드에 대한 항체를 다음과 같은 방법으로 생산하였다. 먼저, 펩티드의 면역성을 증대시키기 위하여 접합 키트(conjugation kit; Pierce사 제품 77101, 프랑스)를 사용하여 펩티드를 KLH(kehole limpet hemocyamin)와 결합반응시킨 다음, 같은 부피의 FCA(Freunds complete adjuvant; 프로인트 완전 보조액, Sigma 사 제품 F5881, 미국)와 완전히 혼합하여 토끼에 피하 주사하고, 2주 간격으로 면역 주사를 4회 추가 주사하였다. 추가 주사시에는 FIA(Freunds incomplete adjuvant; 프로인트 불완전 보조액, Sigma 사 제품 F5506, 미국)를 사용하였다. 최종 추가 주사후 토기의 이정맥에서 혈액을 채취하여 ELISA 시험법에 따라 적정하여 서열 1 및 3에 대한 항체가 토끼의 체내에서 생산됨을 확인하였다. 제9도는 서열 1 펩티드에 대해 특이적인 항체가 생성된 것을 나타낸 것으로, 여기에서 보는 바와 같이 서열 1 및 서열 3에 대해 특이적인 항체가 생산되는 것을 확인하고, 토끼로부터 30㎖의 혈액을 채취하여 서열 1 및 서열 3 펩티드에 대한 항혈청을 수득하였다. 이 항혈청을 단백질 A 컬럼(Pierce 사 제품 22811, 프랑스)에 적용하여 서열 1 및 서열 3에 특이적인 면역 글로불린 G(immunoglobulin G: IgG)를 얻었다.

[실시예 13 : 서열 3에 대한 변형 펩타이드의 제조]

서열 3의 펩티드를 탄산 완충용액(pH 9.5)에 1㎍/㎖의 양으로 녹여서 ELISA 플레이트(Nune 사, 미국)의 각 웰에 100㎕씩 가한 다음, 4℃에서 18시간 동안 반응시켜 펩티드를 플레이트에 고정시켰다. 고정이 완료된 플레이트를 인산 완충용액(pH 7.2)으로 3회 세척한 다음, 0.2% 젤라틴 용액 200㎕를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켜 펩티드가 고정화되지 않은 부분을 포화시켰다. 이 플레이트의 각 웰에 서열 3에 대한 항체를 인산 완충 생리 식염수 용액(pH 7.2)에 1:100,000배로 희석한 용액, 또는 이 희석용액과 서열 3에 대한 변형 펩타이드 3종, P+D10; P+A5 및 P+A10을 각각 1㎍씩 첨가한 용액 100㎕를 각 웰에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 플레이트를 인산완충용액(pH 7.2)으로 3회 세척하였다. 여기에서, 상기 변형 펩티드 P+D10은 P펩티드의 10번째 아미노산이 D-형인 것이고, P+A5는 P펩티드의 5번째 아미노산이 Ala로 치환된 것이며, P+A10은 P펩티드의 10번째 아미노산이 Ala로 치환된 것이다. 이 플레이트의 각 웰에 쥐에 대한 항체에 고추냉이 과산화효소 접합된 결합체(conjugate)를 인산 완충 생리 식염수 용액(pH 7.2)에 1:10,000배로 희석한 용액을 각각 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 플레이트를 인산완충용액(pH 7.2)으로 3회 세척하였다. 이 플레이트의 각 웰에 OPD(o-페닐렌 디아민; Sigma사, 미국) 용액 100㎕를 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켰다. 30분 후에 플레이트의 각 웰에 2N 황산 150㎕를 첨가하여 반응을 종료시킨 다음, ELISA 리더(Dynatech MR 5000, 미국)를 사용하여 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 제10도는 서열 3 펩티드의 변형 펩티드가 서열 3 펩티드에 그에 대한 항체가 결합하는 것을 억제하는 효과를 나타낸 것이다.

[실시예 14 : 돼지와 사람의 Apo-CIII 단편의 CETP 저해활성 측정]

상기 실시예 6에서 확인된 서열 3 펩티드의 아미노산 서열이 돼지와 사람의 Apo-CIII 아미노산 말단 펩티드(각각 서열 2(P') 및 서열 2'(P)와 유사성이 높아 이 단백질들의 CETP 억제 효과를 조사하였다. 이들 단백질들의 아미노 말단의 펩티드들을 유전자 조작을 통해 대장균에서 발현시키고, 펩티드를 분리하였다. 이들을 CETP 저해제로 사용하고, 사람 혈장을 CETP 원으로 사용하고 참고 시험예의 방법에 따라 CETP 저해 역가를 측정하여 그 결과를 표 5에 나타내었다. 표 5에서 보듯이 사람 및 돼지의 Apo-CIII의 아미노 말단 펩티드가 CETP 저해효과를 가짐을 알 수 있다.

이상의 설명과 결과에서 명백한 바와 같이, 본 발명에 따른 서열을 갖는 펩티드, 이들의 단편 및 유도체를 포함하는 펩티드, 이들 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질은 현저한 CETP 저해활성을 갖는 것을 알 수 있다. 따라서 이들 모두는 본 발명의 범위에 포함되며, 환자에 투여되었을 때 CE를 HDL에 위치시켜 콜레스테롤의 배출을 촉진함으로써 혈중 콜레스테롤 저하 및 이에 따른 동맥경화증을 비롯한 각종 콜레스테롤 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 예를 들어 본 발명을 설명하였으나, 본 발명에서 개시된 범위내에서 이 분야의 당업자에게 자명한 치환, 변형 및 변경은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (13)

1. 하기 서열 1의 펩티드 :

   [서열 1]
2. 하기 서열 2의 펩티드 :

   [서열 2a]
3. 제1항의 펩티드를 구성하는 적어도 하나의 아미노산이 하기의 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 펩티드 :

   Glu이 2-아미노아디프산, Asp 또는 C_a-메틸Glu으로 치환;

   Asp이 Glu, C_a-메틸Asp 또는 β-카르복시Asp으로 치환;

   Thr이 Ser 또는 C_a-메틸Thr으로 치환;

   Ser이 Thr 또는 C_a-메틸Ser으로 치환;

   Pro이 3,4-데하이드로Pro 또는 C_a-메틸Pro으로 치환;

   Lys이 오르니틴, 시트룰린, Arg 또는 C_a-메틸Lys으로 치환;

   Met이 C_a-메틸Met으로 치환;

   Gln이 Asn, 시트룰린 또는C_a-메틸Gln으로 치환;

   Val이 이소Val, 노르Val, C_a-메틸Val 또는 Leu으로 치환;

   Ala이 Gly, β-Ala, C_a-메틸Ala 또는 2-아미노부티르산으로 치환;

   Arg이 Lys, 호모Arg, 시트룰린 또는 C_a-메틸Arg으로 치환; 및

   Leu이 노르Leu, 이소Leu 또는 C_a-메틸Leu으로 치환.
4. 제1항의 펩티드중의 적어도 하나의 결합이 티오에스테르 결합(-CH₂-S-), 알킬 결합(-CH₂-CH₂-) 또는 아미노 결합(-CH₂-NH₂-)으로 치환된 것을 특징으로 하는 펩티드.
5. 제1항의 펩티드를 아미노산 서열상의 일부로 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질
6. 하기 서열 1의 펩티드, 서열 2의 펩티드, 서열 1의 펩티드를 서열상의 일부로 포함하는 폴리펩티드 및 서열 9의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 서열 1의 펩티드의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드와 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 동맥경화증의 예방 및 치료용 조성물 :

   [서열 1]

   [서열 2a]

   [서열 9]
7. 돼지 혈장으로부터 제1항의 펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 제1항의 펩티드의 제조방법.
8. 제1항의 펩티드와 이의 항체와의 결합을 억제하는 펩티드로서, 서열 3으로부터 아미노산 치환된 것을 특징으로 하는 펩티드.
9. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 하기의 치환을 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드 : 서열 3 펩티드의 10번째 아미노산이 D-형 아미노산으로 치환 : 서열 3 펩티드의 5번째 아미노산이 Ala로 치환 ; 및 서열 3 펩티드의 10번째 아미노산이 10번째 아미노산이 Ala로 치환.
10. 하기 서열 9를 아미노산 서열상에 필수적으로 포함하는 제1항의 펩티드의 단편 :

    [서열 9]
11. 제10항에 있어서, 하기 서열 3, 5, 6, 7 또는 8인 단편 :

    [서열 3]

    [서열 5]

    [서열 6]

    [서열 7]

    [서열 8]
12. 하기 서열 4을 갖는 제2항의 펩티드의 단편 :

    [서열 4]
13. 제1항의 펩티드의 적어도 하나의 말단이 하기의 변형된 말단으로 치환된 것을 특징으로 하는 펩티드 : 아미노 말단이 아세틸화 ; 카르복시 말단이 아미드화.