KR100263164B1 - Ii형 콜라겐의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 콜라겐 관절염 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 II힝 콜라겐(type II co1lagen)의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 콜라겐 유도성 관절염(co1lagen-induced arthritis)의 치료제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 T세포 항원결정기를 포함하는 Ⅱ형 콜라겐 펩티드 또는 그의 유도체(analog)를 유효성분으로 함유하는 콜라겐 유도성 관절염의 치료제 및 그를 콜라겐 유도성 관절염의 포유동물에 경구투여하여 콜라겐 유도성 관절염을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 Ⅱ형 콜라겐 펩티드 또는 그의 유도체는 경구면역관용을 유도하여 포유동물의 콜라겐 유도성 관절염을 효과적으로 억제한다.

Description

Ⅱ형 콜라겐의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 콜라겐 관절염 치료제

본 발명은 Ⅱ형 콜라겐의 팹티드를 유효성분으로 함유하는 콜라겐 관절염의 치료제에 관한 것으로, 특히, T세포 항원결정기를 포함하는 Ⅱ형 콜라겐 펩티드 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 콜라겐 관절염 치료제및 그 치료방법에 관한 것이다.

일반적으로, 면역은 생체가 자기 외의 이물질, 즉 병원미생물, 이종단백질, 다당류, 지질, 이형수혈, 동종조직이식 등을 배제하기 위해 일으키는 반응을 일컫는 것으로, 이러한 면역에는 항체의 합성에 의한 비자기 배제를 체액성 면역, 세포에 의한 배제를 세포성 면역이 있다.

상기와 같은 면역응답에서 외래항원에 대해 면역계가 응답할 수 없는 불응답의 원인에는 다음의 두 가지를 들 수 있는데, 이를 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

그 하나는, 결정기 선별이론(determinant selection theory)으로, 항원펩티드와 MHC분자와의 복합체 형성이 순조롭게 진행되지 않기 때문에, T세포수용체와의 결합이 일어나지 않고, 결국 T세포에 의한 항원인식이 불가능하다는 사실에 의거한다. 여기에는, MHC분자, 펩티드 분자의 구조상 문제로 인하여 복합체가 생기지 않는 경우와, 불응답계 동물에 MHC분자 발현의 유전적 결손이 있는 경우가 있다.

이때, 상기 주요조직적합 유전자복합체(MHC: Major histocompatibility complex) 단백질에는 클래스 I과 클래스Ⅱ의 두 가지 형태가 있다. 상기 클래스 I MHC 단백질은 실질적으로 모든 조직에서 존재하는데 반해, 클래스 Ⅱ MHC 단백질은 활성화된 T-세포, 매크로파지 및 기타 면역계 세포에 존재한다. 상기 MHC는 사람에는 HLA(histocompatibility antigen), 마우스에는 H-2가 이에 해당하는 것으로, 이를 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

"클래스 I MHC 항원"은 핵을 가진 모든 세포의 표면에 존재하는 막 당단백질로 정의되며, CD8+ 세포독성 T-세포에 의한 항원 인지에서 중요한 역할을 수행한다.

"클래스 Ⅱ MHC 항원"은 MHC의 일부를 이루는 막 당단백질로, 면역반응의 개시에서 매우 중요하다. 상기 클래스 Ⅱ MHC 항원은 주로 B-세포를포함하는 면역계 세포, 매크로파지, 뇌의 성상세포, 표피 랑게르한스 세포, 수지상 세포, 흉선 상피 및 헬퍼 T-세포에서 발견되는 것으로, 여러 현상에서 조직이식 거부에서의 면역반응 조절, 항체생산 자극, 및 자기항원의 인식에 관련된다. 상기 MHC 항원은 클래스 I 및 클래스Ⅱ의 조합 또는 단독으로 포함된다.

다른 하나는, 클론소거 이론(c1onal deletion theory)으로, 펩티드 항원에 대응하는 T세포의 제거에 의거한다. 즉, 자기(self) 성분 중에 항원팹티드-MHC분자 복합체와 동일(교차하는)한 구조물이 있기 때문에, 그 항원에 반응하는 T세포가 자기관용 상태에 들어간 경우이다(참조:Vidovic, D. and Matzinger ; P., Nature, 336:222(1988); Pullen, A.M. et al., Nature, 335:796(1988)). 한편, 항원에는 그 구조의 일부에 생체의 면역반응을 유도하고 생산된 항체와 특이적으로 결합하는 부위를 항원결정기라 하며, 특히, 그 구조를 알고 있는 항원결정기를 에피토프(epitope)라 한다.

한편, 상술한 경우 이외에 외래항원에 대하여 후천적으로 항원 특이적 면역 불응답, 즉 면역관용(immuno1ogical tolerance)이 유도되는 경우가 알려지고 있다. 이러한 종류의 면역관용유도는 항원의 투여경로, 투여량 등에 의존한다. 이 중에서, 항원을 경구투여하면, 그 항원에 대하여 면역관용이 유도되는, 즉 그 항원에 특이적인 면역반응이 억제되는 경구면역관용(경구관용)이 알려지고 있다.

예를 들어, 중국에서는 옻을 섭취함으로서 옻에의 접촉과민반응을 예방하였다고 하는 얘기가 전해져 오는데, 현대적으로는 이것이 경구면역관용에 근거하고 있다고 이해할 수 있다. 실험적으로는, 1911년 웰(Well)이 난백알부민(ovalvumin:OVA)으로 몰모트(mormot)를 감작(感作)하기 전에, OVA를 경구투여하면, OVA에 의한 아나필락시성(anaphylactic) 반응이 억제된다고 보고한 이래(참조: Wel1s, H.G., J. Infect. Dis., 9:147(1911)), 이 현상의 기작에 대하여 많은 연구가 이루어져 왔다.

한편, 경구투여되어 장관으로 유입된 항원은 소화효소의 작용에 의하여 아미노산이나 짧은 펩티드 등으로 분해되어 체내로 흡수되지만, 일부는 항원성을 가지는 펩티드 또는 폴리펩티드로서도 흡수된다. 이와 같이 완전소화를 피한 항원이 면역관용의 발현에 중요한데, 이러한 경구면역관용에서 항원반응 클론의 소거(c1onal deletion), 면역불반응(아네르기, anergy), 능동적 면역억제(active suppression)라는 세 가지 기작이 중요하게 작용하고 있다. 이와 같은 경구 관용기구를 적극적으로 이용하면, 알레르기나 자기면역질환의 원인이 되는 면역반응, 장기이식에 따른 거부반응 등 과잉의 면역응답을 특이적으로 부작용없이 억제할 수 있을 것으로 예측되어, 현재 여러 가지 시도가 이루어지고 있다.

장관으로 유입된 항원은 소화효소에 의해 아미노산이나 짧은 펩티드로 분해되어 체내에 흡수되는 반면, 일부는 항원성을 가지는 펩티드 또는 폴리펩티드로서도 흡수되는 것으로, 이와 같이 완전소화를 피한 항원이 면역관용발현에 중요하게 된다. 상술한 바와 같이 면역계가 교묘하게 자기관용을 유지하고 있는 경우와는 달리, 어떠한 원인으로 자기 성분에 대한 면역응답이 야기되고, 이를 원인으로 생체에 유해한 각종 반응이 야기되는 경우가 있는데, 이를 자기면역성질환이라 한다.

자기면역성 질환에는 표적항원과 조직장해가 하나의 장기에만 국한되는 장기 특이적 자기면역질환과, 생체에 널리 분포되어 있는 항원, 예를 들면 핵내 항원에 대한 반응이 전면에 나타나, 다장기에 걸쳐 장해가 나타나는 전신성 자기면역질환이 있다. 어떠한 경우라도, 자기면역질환은 특정 자기항원에 대해서만 집중되어 있으며, 다양한 자기성분에 대한 반응이 동시에 똑같이 일어나는 것은 아니다.

상기 장기 특이적 자기면역질환은 본래 면역관용이 되어 있는 어떤 장기에 특유의 자기 항원에 대한 면역관용이 파괴되고, 이에 대해 면역계가 적극적으로 반응한 결과 나타나는 현상인 것으로 생각되고 있다. 아울러, 전신성 자기면역질환에서 검출된 자기항체의 표적항원은 대부분이 핵내 물질이나 세포질분자로서, 자기항체 자체가 직접 장기장해를 일으키지는 않는다(참조:Tan, E.M., Adv.Immuno1., 44:93(1989)). 전신성 자기면역질환에서는 폴리클로날 B세포의 활성화, T세포 서브세트의 이상, 각종 사이토카인의 이상, 단구,대식세포의 이상 등 여러 면역담당세포의 항원 특이적이 아닌 기능 이상이 지적되고 있다.

사람의 자기면역질환에는 만성관절류마티스, 다발성경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 중증근무력증 등이 있지만, 거의 모든 경우 근본적인 치료법이 없다.

상술한 후천적 면역관용 유도기구인 경구면역관용은 항원특이적으로 면역응답을 억제할 수 있기 때문에, 자기면역질환의 새로운 예방, 치료법으로서 주목받고 있다.

웨이너(Weiner)와 휘타크러(Whitacre) 등은 실험적 알레르기성 뇌척추막염(EAE: experimental allergic encephalomyelitic)이 마이엘린 염기성 단백질(MBP:myelin basic protein) 항원의 경구투여에 의해 억제된다는 것을 관찰하였고, 투여량의 차이에 따라 억제성 조절T세포의 유도와 T세포 아네르기가 발생한다는 것을 명백히 하였다(참조:Higgins, P. and Weiner, H.L., J.Immunol., 140:445(1988)). 또한, 항원을 감작 전에 경구투여한 경우뿐만 아니라, 이미 발병하고 있는 동물에 경구투여하여도 발병이 억제되었다고 보고하고 있다.

자연 발병의 당뇨병 마우스(NOD마우스)에 인슐린을 경구투여하여 당뇨병의 발병을 억제한 보고(참조:Zhang, J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:10252(1991))와, 기타 실험적 포도막염, 실험적 근무력증에 각각 원인 항원인 s항원, 아세틸콜린 수용체 항원을 경구투여하여 발병을 예방한 보고도있다(참조: Nussenblatt, R.B. et a1., J.Immuno1., 144:1689(1990); Wang, Z,-Y. et a1., J. Neuroimmuno1., 44:209(1993)).

만성관절 류마티스(rheumatoid arthritis: RA)는 연골의 파괴와 뼈의 침식을 수반하는 관절의 만성염증성 질환으로서, 면역계가 깊이 관여하는 자기면역질환의 하나이다. 마우스나 랫트를 Ⅱ형 콜라겐으로 면역하여 콜라겐 유도성 관절염(collagen-induced arthritis, 이하, 편의상 'CIA'라 칭함)을 유도하고서 그를 사람 RA의 동물 실험모델로 사용하고 있다.

몇몇 연구자들은 콜라겐 유발 관절염의 마우스나 랫트에 미리 Ⅱ형 콜라겐(type Ⅱ collagen, 이하, 편의상 'CⅡ'라 함)을 경구투여하여 관절염의 발병을 억제하였다고 보고하였다(참조:Thompson, H.S.G. and Staines, N.A., Clin. E.xp. Immunol., 64:581(1986); Thompson, H.S.G. et al., Clin. Exp. Immunol., 72:20(1988); Nagler-Anderson; A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:7443(1986)). CIA에서는 CⅡ에 대한 강한 세포성 면역(T세포응답)과 체액성 면역(항체)이 수반되는데, 이들 면역반응의 협동작용이 CIA의 발병에 중요한 것으로 알려져 있다(참조: Stuart, J.M. et a1., J. Clin. Invest., 69:673(1982); Trentham, D.E. et al., J. Clin. Invest., 81:89(1978)).

그러나, 위에서 언급한 자료들은 아미노산 잔기의 어느부분이 T세포 항원결정기(antigenic determinant)로서 인식되는 부분인가에 대한 정보를 제시하지 못하므로 포유동물의 관절염을 치료하는데 T세포를 활성화시키기 위한 CⅡ의 사용을 개시하지는 않는다.

또한, 상기 CIA의 경구면역관용에 대한 지금까지의 보고들은 CIA를 유발하는 항원과 동일한 항원 CⅡ를 경구투여하기 때문에, 감작의 위험성에 대한 문제점이 있었다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 종래의 문제점을 해소하기 위한 것으로, 특히, 감작의 위험성을 최소한으로 하면서 경구면역관용을 유도할 수 있도록 하는 콜라겐 관절염 치료제 및 그 치료방법을 제공함을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명 Ⅱ형 콜라겐의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 콜라겐 관절염의 치료제는 Ⅱ형 콜라겐의 245번∼270번 아미노산을 포함하는 팹티드 또는 그 일부 아미노산 잔기가 치환된 유도체롤 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명 콜라겐 관절염의 치료방법은 상기 치료제를 CIA의 포유동물에 경구투여하여 CIA를 예방 및 치료하는 것을 특징으로 한다.

제 1도는 Ⅱ형 콜라겐으로 면역하기 전에 Ⅱ형 콜라겐 펩티드를 5회 투여한 마우스에서의 CIA 발병경과를 보인 것으로,

제 1a도는 발병정도를 보인 그래프도이고,

제 1b도는 발병빈도를 보인 그래프도이다.

제 2도는 소 CⅡ245-270 또는 소 CⅡ316-333을 Ⅱ형 콜라겐으로 면역하기 선에 5회, 면역 후에 3회 투여한 마우스에서의 CIA 발병경과를 보인 것으로,

제 2a도는 발병빈도를 보인 그래프도이고,

제 2b도는 발병정도를 보인 그래프도이다.

제 3도는 1회당 1mg의 Ⅱ형 콜라겐 팹티드를 5회 투여한 마우스에서의 CIA 발병경과를 보인 것으로,

제 3a도는 발병정도를 보인 그래프도이고,

제 3b도는 발병빈도를 보인 그래프도이다.

제 4도는 Ⅱ형 콜라겐 펩티드에 의한 경구면역관용의 유도과정을 개략적으로 보인 절차도.

제 5도는 소 CⅡ245-?70 또는 소 CⅡ316-333을 Ⅱ형 콜라겐으로 면역하기 전에 5회, 면역 후에 3회 투여한 마우스의 혈청 내에 존재하는 항체의 생산량을 보인 그래프도서,

제 5a도는 IgG₁항체의 생산량을 보인 것이고,

제 5b도는 IgG_2a항체의 생산량을 보인 것이고,

제 5c도는 IgG_2b항체의 생산량을 보인 것이다.

제 6도는 1mg의 Ⅱ형 콜라겐 펩티드로 미리 경구면역하고, Ⅱ형 콜라겐으로 콜라겐 관절염을 유도한 마우스의 혈청 내에 존재하는 항체의 생산량을 보인 그래프도로,

제 6a도는 IgG₁항체의 생산량을 보인 것이고,

제 6b도는 IgG_2a항체의 생산량을 보인 것이고,

제 6c도는 IgG_2b항체의 생산량을 보인 것이다.

이하, 상기와 같이 구성된 본 발명을 도면을 참고로 하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 도 1은 Ⅱ형 콜라겐으로 면역하기 전에 Ⅱ형 콜라겐 펩티드를 5회 투여한 마우스에서의 CIA 발병경과를 보인 것이고, 도 2는 소CⅡ245-270 또는 소 CⅡ316-333을 Ⅱ형 콜라겐으로 면역하기 전에 5회, 면역후에 3회 투여한 마우스에서의 CIA 발병경과를 보인 것이고, 도 3은 1회당 1mg의 Ⅱ형 콜라겐 펩티드를 5회 투여한 마우스에서의 CIA 발병경과를 보인 것이고, 도 4는 Ⅱ형 콜라겐 펩티드에 의한 경구면역관용의 유도과정을 개략적으로 보인 절차도이고, 도 5는 소 CⅡ245-270 또는 소 CⅡ316-333을 Ⅱ형콜라겐으로 면역하기 전에 5회, 면역 후에 3회 투여한 마우스의 혈청 내에 존재하는 항체의 생산량을 보인 그래프도이고, 도 6은 1mg의 Ⅱ형 콜라겐 펩티드로 미리 경구면역하고, Ⅱ형 콜라겐으로 콜라겐 관절염을 유도한 마우스의 혈청 내에 존재하는 항체의 생산량을 보인 그래프도이다. 본 발명자는 실험에 의하여 감작의 위험성을 최소한으로 하면서 CIA의 경구면역관용을 유도할 수 있는 투여항원을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, T세포 항원결정기를 포함하는 CⅡ 펩티드 또는 그 일부 아미노산 잔기가 치환된 유도체를 경구투여함으로써 CIA를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

그 결과, CⅡ상의 T세포 항원결정기를 포함하는 펩티드, 바람직하게는 CⅡ 245번∼270번 아미노산을 포함하는 팹티드를 CIA의 자가면역반응을 나타내는 포유동물 또는 그의 포유동물 모델에 경구투여함으로써, CIA 증상을 경감시길 수 있음을 확인하였다. 또한, 전기 CⅡ 팹티드 중에서 CⅡ특이적 T세포의 반응에 중요한 잔기들, 가장 바람직하게는 260번, 261번, 263번 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환한 펩티드 유도체에 의해서도 CIA가 경감되는 것을 알 수 있었다. 상기에서, 아미노산의 번호는 寺戶國昭의 체계에 기초한다(참조:寺戶國昭, 臨床免疫,26(9):1050(1994))).

아울러, CⅡ 펩티드를 경구투여한 마우스에 있어서의 CⅡ 팹티드에 대한 면역응답을 항체생산응답, T세포증식응답을 중심으로 조사한 결과, CIA의발병에 관여하는 IgG_2a, IgG_2b이소타입의 응답을 포함하여 CⅡ 펩티드에 대한 항체생산응답이 대조군에 비해 유의적으로 저하되고 있으며, CⅡ 펩티드에대한 T세포증식응답이 거의 확인되지 않았다. 이러한 사실로부터 CⅡ 펩티드의 경구투여에 의한 CIA 억제현상에는 전술한 면역응답의 저하가 수반되어 면역관용이 유도됨을 알 수 있었다.

즉, CⅡ 팹티드 또는 그 유도체의 치료 및 예방효과를 확인하기 위하여 류마티스성 관절염의 동물실험 모델인 CIA 실험으로 대조군과 비교하여 관절염이 생긴 부위의 부종이 빠지는 속도가 빠르고, 희생시키기 전까지의 최종부종의 빠진 정도로 상당한 차이를 보이는 효과가 있어 상기 CⅡ 팹티드 또는 그 유도체의 경구투여로 CIA가 억제됨을 확인하였다.

상기에서, 전술한 CⅡ 펩티드나 그 유도체를 일회 또는 수회 나누어 1일 체중 ㎏당 1㎍∼1㎎, 바람직하게는 약 125㎍∼1㎎의 범위로, CIA의 자가면역반응을 나타내는 포유동물 또는 그의 포유동물 모델에게 경구적으로 투여한다. 투여량과 투여빈도는 질병의 상태 및 포유동물의 건강상태에 따라 매우 달라질 수 있다. 따라서, 최적화는 여러 케이스에 기초를 두고 실험적으로 결정될 필요가 있다.

한편, 전술한 CⅡ 펩티드는 약제학적으로 허용가능한 담체를 첨가한 조성물 형태로 경구 투여할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분이외에 희석제(예:락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예:실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예:마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]:

CⅡ 부분 펩티드의 경구투여에 의한 CIA의 억제

CⅡ 부분 펩티드를 이용하면 감작의 위험성을 최소한으로 하면서 경구면역을 유도 할 수 있다고 생각하고, CⅡ 부분 펩티드의 경구투여에 의한 CIA억제롤 실험하였다.

CIA 유도 및 그 억제에는 CⅡ를 CNBr처리하여 얻은 단편 중 아미노산 잔기 124-402에 해당하는 CBl1이 중요한 것으로 알려져 있다(참조:寺戶國昭, 臨床免疫, 26(9):1050.(1994))). 이러한 CBl1은 DBA/1마우스에 대하여 관절염을 유발하는 작용이 있을 뿐만 아니라 상기 단편을 주사하면 CIA에 대한 저항성을 나타내게 된다. 따라서, 상기 CBl1상의 관절염유도성 및 면역관용유도성 에피토프의 존재가 관심의 대상이 되었으며, 그에 대한 연구 결과 CB11상에서는 적어도 5개의 T세포 에피토프가 존재하고, 이 중에서도 우세한 T세포 항원결정기는 CⅡ의 245번 잔기부터 270번 잔기내에 존재함을 발견하였다. 또한, 상기 T세포 항원결정기를 포함한 펩티드는 MHC분자(이 경우 I-A^q분자)와 선택적으로 결합하지만, 상기 CⅡ245-270 펩티드와 경합적으로 MHC분자에 결합하여 Ⅱ형 콜라겐에 대한 면역응답을 억제하는 펩티드를 실험적으로 발견하였는데, 상기 팹티드는 CⅡ245-270의 260, 261, 263의 아미노산 잔기를 치환하여 얻었다(CⅡ245-270[S260,261,263]).

이에, 본 실시예에서는, 표 1에 도시된 바와 같이, T세포 항원결정기를 포함하는 닭 CⅡ245-270의 소 유래 동족체(homo1ogue)인 소 CⅡ245-270 및 그 유도체 CⅡ245-270[S260,261,263]을 DBA/1 마우스에 경구투여하여 경구면역관용을 유도함과 아울러 CIA의 억제효과를 검토하였다. 또한, 사람 CⅡ245-270 및 자기항원에 해당하는 마우스 CⅡ245-270의 효과에 대해서도 검토하였다.

[표 1]

합성 펩티드의 아미노산 배열

아미노산은 단문자 코드로 표시되었고; B는 하이드록시프롤린, -는 야생형 펩티드 CⅡ 245-270과 비교하여 CI에서 결실된 아미노산을 나타내며; 아미노산의 일렬번호는 寺戶國昭의 체계에 의한 천연형(native) CⅡ의 배열에 기초한다(참조:寺戶國昭, 臨床免疫,26(9):1050(1994))).

[실험예 1]:

1) 포유류 실험대상

일본 찰즈리버사에서 구입한 DBA/1J 마우스(6∼7주령, 자성)로 실험대상군을 구성하였다.

2) Ⅱ형 콜라겐

상기 감작용의 소 CⅡ는 트렌쌈(Trentham) 등의 방법(참조:Trentham, D.E. et al., J. Exp. Med., 170:1999(1989))으로 다음과 같이 제조되었다. 먼저, 소 대퇴골에서 연골 약 10g을 채취하여 냉증류수로 세척하고, Polytron(Kinematica) 호모지나이저(homogenizer)로 균질화시킨 다음, 이것을 1M의 NaCl/50mM Tris-HCl(pH7.6, 2 리 터 )에 현탁(懸濁)하여, 4℃ 에 서 3일간 교반하였다. 이어, 10,000×g, 50분,4℃ 온도의 조건으로 원심하고, 침전을 불용성 CⅡ로서 회수하였다. 이렇게 얻은 불용성 CⅡ를, 0.5M 초산(1 리터)에 펩신(Sigma, USA) 200mg을 넣은 용액에 현탁하여, 3일간 4℃에서 교반한 다음, NaOH를 가하여 pH 8.5로 조정함으로써 팹신을 실활(失活)시켰다. 이때 겔화한 가용성 CⅡ를 10,000×g, 50분, 4℃ 온도의 조건으로 원심하고, 그 침전을 회수하였다. 이것을 0.5M 초산(100㎖)에 용해시키고, 10,000×g,50분, 4℃온도의 조건으로 원심하여 상청액을 회수한 다음, 탈이온수에 대하여 투석하고, 동결건조하여 4℃에서 보존하였다. 소 연골 10g에서 50mg의 소CⅡ를 얻었고, 그의 순도는 6% SDS-PAGE로 확인하였다.

3) CⅡ 부분펩티드의 화학합성

소 CⅡ245-270, CⅡ316-333, 마우스 CⅡ245-270(참조:Seyer, J.M. et al., Eur. J. Biochem., 181:159(1989)), 사람 CⅡ245-270(참조:Klnre, S.D. et al., J. Immunol., 155:3653(1995)), 및 닭 CⅡ245-270의 260,261,263번째 아미노산 잔기를 I형 콜라겐의 아미노산으로 치환한 펩티드 유도체 CⅡ245-270[260,261,263]은 각각 펩티드 합성기(Applied Biosystems 430A, USA)를 이용하여 fmoc법으로 화학합성하였으며, 상기 합성된 팹티드는 역상계 ODS칼럼을 이용한 고속액체크로마토그라피로 정제하였다. 이때, 칼럼은 MERCH(GERMANY)사 MANU-FIX(cat.16350)를 사용하였고, 용출은 0.1% 트리플루오르초산에 아세토니트릴 농도구배를 통하여 행하였다. 또한, 아미노산 배열은 자동 아미노산배열분석기(PSQ-1)를 이용하여 확인하였으며, 이상의 화학합성된 각 팹티드의 아미노산 배열은 상기 표 1에 나타내었다.

4) CⅡ 부분펩티드의 경구투여

상기와 같이 합성된 각각의 펩티드는 0.01% 초산, 또는, 물에 용해시켜 2∼3일 간격으로 200㎕씩 경구 존데(zonde)를 이용하여 투여하였다.

5) CIA 유도

DBA/1 마우스를 에테르로 마취시켜 실험대 위에 엎드리도록 눕힌 후, CFA(완전 프로인드 보조액;Difco, USA)를 동량 넣어 w/o형 에멀션화시킨 소 CⅡ를 마우스 꼬리 시작 부분에 1마리당 100㎍ 피내(皮內)투여하였다. 초기감작 후 21일째에 IFA(불완전 프로인드 보조액;Difco, USA)와 함께 1마리당 100㎍의 CⅡ를 마우스의 꼬리 시작부분에 투여하는 추가면역으로 CIA를 유도하였으며, 초기감작 후 25일째쯤부터 2,3일 간격으로 CIA의 발병을 관찰하였다.

6) CIA의 평가

CIA 증상의 평가는 각 마우스의 네 다리 모두에 대하여 0에서 3까지의 수치를 관절염 증상의 강약에 따라 부여하여 평가하였다. 즉, 수치 0은 건강한 상태, 수치 1은 약간 붉은 색을 띠면서 붓고 발병하기 시작한 상태이며, 수치 2는 완전히 붉어지고 붓는 등 발병하고 있는 상태, 그리고 수치 3은 그 붓기가 최고조에 달한 상태를 나타낸다. 각 마우스에 대하여 각각의 사지(四肢)에대한 평가치를 합계하여 관절염 배율(arthritis index:A.I.)로 한 것으로, 상기관절염 배율(A.I.) 수치가 클수록 CIA증상의 정도가 심한 것이다.

7) 실험결과

먼저, 관절염 유도를 위해 콜라겐을 주사하기 전에 소 CⅡ245-270을 상기 DBA/1 마우스에 1㎍, 25㎍씩 2-3일 간격으로 총 5회 경구투여하고, CⅡ면역 후의 CIA 발병경과를 관찰하였다. 이때, 상기 CIA 발병경과는 관절염 발병정도(배율)와 관절염 빈도로 조사되는 것으로, 상기 관절염 발병정도는 병증의 경감에 관계없이 전체 쥐에 대하여 관절염에 걸린 쥐의 백분율을 구한 것인 반면, 상기 관절염 빈도는 마우스의 다리, 발가락의 부어오른 정도에 따라 이를 세분화하여 평가한 후, 관절염이 발생된 마우스를 전체에 대해 백분율로 구한것이다.

그 결과, 상기 소 CⅡ245-270을 경구투여한 마우스는, 도 1에 도시된 바와 같이, 초산만을 투여한 대조군과 비교하여 상대적으로 발병시기가 늦어지고, 관절염 증상이 경감되는 것을 알 수 있는 반면, 다른 CⅡ유래 펩티드 소 CⅡ316-333(참조: Harald, B., Eur. J. Immuno1., 21:49(1991))에는 CIA 억제효과가 미약함을 알 수 있었다.

다음으로, 소 CⅡ245-270을 1㎍, 5㎍, 25㎍, 125㎍씩 CⅡ로 면역하기 전에 5회, 면역 후에 3회 투여한 경우의 CIA 발병 경과를 관찰하였다. 그 결과, 소 CⅡ245-270을 1㎍씩 경구투여한 마우스는, 도 2에 도시된 바와 같이, CⅡ 면역 후 38일까지 CIA 발병이 보이지 않고, 동량의 소 CⅡ316-333을 투여한 마우스와 비교하여 상대적으로 발병이 지연되었다. 또한, 1회의 투여량이 1㎍인 경우에는 CIA증상이 경감된 반면, 5㎍, 25㎍에서는 효과가 확인되지 않았고, 125㎍에서는 약간 CIA증상이 경감되었다.

이에, 각 동물의 CⅡ245-270 투여량을 1㎎/회로 증가시키고, 이와 상기 CⅡ260,261,263을 C I의 펩티드로 치환한 경우를 비교하여 CIA 발병 경과를 관찰하였다. 그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 소 CⅡ245-270, 마우스 CⅡ245-270, CⅡ245-270[S260,261,263]에 대하여 CIA증상의 억제효과가 관찰되었지만, 사람 CⅡ245-270에는 상기 마우스 CⅡ245-270과 2잔기, 소 CⅡ245-270과는 겨우 1잔기밖에 차이가 없음에도 불구하고 억제효과가 관찰되지 않았다. 즉, CIA 유발에 사용된 상기 소 CⅡ 유래의 팹티드와, 자기항원인 마우스 팹티드에는 효과가 있었지만, 다른 종류의 사람 CⅡ245-270에는 효과가 확인되지 않았다. 또한, 상기 결과에서 매우 특이한 점은 펩티드 유도체 245-270[S260,261,263]의 투여에 의하여 CIA 발병정도 및 빈도가 상대적으로 크게 저하하였다는 것으로, 이는 각 동물의 CⅡ245-270를 경구투여한 경우보다 CⅡ260,261,263을 C I의 팹티드(A, B, N)로 치환한 경우(검은 사각형)가 관절염의 발병을 가장 효과적으로 억제시킴을 보인 것이다.

이때, 상기 투여는 CⅡ면역 전에 5회 수행하였으며, 상기 각각의 펩티드는 소 CⅡ245-270 이외에, (1)같은 영역에 상당하는 마우스 유래 펩티드인 마우스 CⅡ245-270; (2)사람 유래 펩티드인 사람 CⅡ245-270; (3) 닭 CⅡ의260,261,263번째 잔기를 닭의 I형 콜라겐의 아미노산으로 치환하여 CⅡ에 특이적인 T세포의 반응을 야기하는 것은 불가능하지만, 항원제시세포(APC:antigen presenting cell)상의 MHC클라스Ⅱ분자(A^q분자)와 결합할 수 있는 펩티드 CⅡ245-270[S260 261 263]을 사용하였다.

8) 고찰

본 실시예 1에서는 CⅡ의 부분 펩티드의 경구투여에 의한 CIA의 억제를 실험하였다. 이상의 결과로부터, CⅡ상의 T세포 항원결정기를 포함한 펩티드의 경구투여로 CIA 증상을 경감시킬 수 있음을 확인하였고, 투여방법에 따라 효과적인 투여량이 존재한다는 것을 알 수 있었다.

또한, CIA 유발에 사용된 소 CⅡ 펩티드 외에, 자기항원인 마우스 펩티드, 그리고 CⅡ특이적 T세포의 반응에 중요한 잔기를 치환한 펩티드 유도체에 의해서도 CIA가 경감되는 것을 알 수 있었다. 이때, 상기 치환된 펩티드 유도체로 DBA/1마우스를 CⅡ와 동시에 면역하면, MHC와의 경합으로 인한 억제기능으로 CIA의 발병이 억제되는 데, 이렇게 항원성이 저하된 펩티드 유도체에 의해 경구면역관용이 유도된 예는 없었다.

따라서, CⅡ 펩티드의 이용은 CⅡ 경구투여에 의한 만성관절 류마티스 치료에서 항원감작의 위험을 최소화하는 방법으로서 충분한 가치가 있음을 알 수 있었다.

[실시예 2]:

CⅡ 부분 펩티드의 경구투여에 의한 면역응답의 억제

상기 실시예 1에서 CⅡ 펩티드의 경구투여에 의하여 CIA가 효과적으로 억제되는 것을 알 수 있었는데, 이때의 CⅡ 펩티드에 대한 항체생산응답, T세포증식응답에 대하여 조사하였다.

[실험예 1]

1) 포유류 실험대상 및 항원

상기 실시예 1에 기재된 것과 동일

2) 펩티드의 경구투여, CIA 유도 및 평가

소 CⅡ245-270, 사람 CⅡ245-270, 팹티드유도체 CⅡ 245-270[S260,261,263] 및 CⅡ316-333을 마우스에 경구투여한 후, 도 4에 도시된 바와 같이, 소정의 스가쥴로 마우스를 소 CⅡ로 면역하였다.

3) CⅡ에 대한 경구면역관용의 유도(항체생산응답)

CⅡ 펩티드(소 CⅡ245-270, 마우스 CⅡ245-270, 사람 CⅡ245-270, 펩티드 유도체 CⅡ245-270[S260,261,263], 소 CⅡ316-333)를 마우스에 경구투여한 경우, 펩티드에 대한 면역관용이 항체생산응답에서 유도되는지를 도 4의 스케쥴에 따라 조사하였다. 소 CⅡ의 피내면역후 37일째에 채혈하여 얻은 항 혈청내 항체의 특이성 및 항체가를 다음과 같은 효소면역측정법(ELISA)에 의하여 조사하였다. 이때, 마우스 항체의 서브클래스는, 도 5에 도시된 바와 같이, 원반적으로 IgG₁이 가장 많은 반면, CIA계에 있어서는 서브클래스 IgG_2a, IgG_2b가 가장 많이 생산됨으로서 서브클래스 IgG_2a, IgG_2b함량도 측정하였다.

폴리스틸렌제 마이크로타이터플레이트(microtiter plate; Nunc)의 웰에 항원 100㎕와 인산완충식염수(PBS) 용액 100㎕을 분주(分住)하고, 실온에서 2시간(혹은 4℃에서 하룻밤) 정치하여 항원을 흡착시켰다. 그런 다음, 상기 각 웰을 PBS-Tween(Tween 20을 0.5㎖/l 함유한 PBS) 125㎕로 3회 세척하고, 항혈청의 PBS-Tween 희석액(400배 희석) 100㎕을 가하여, 실온에서 2시간 정치하였다. 이어, 세척 후, 알칼리 포스파타아제 표지를 한 염소 항마우스 Ig 항체의 PBS-Tween 희석액을 100㎕ 가하여 실온에서 2시간 정치하였다. 세척후, 0.1% 니트로페닐인산2나트륨/디에탄올아민-염산완층액(pH 9.8) 100㎕을 기질로서 첨가하여, 실온에서 30분 반응시킨 다음, 5N 수산화나트륨 수용액 20㎕을 가하여 반응을 정지시키고, 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

4) CⅡ에 대한 경구면역관용의 유도(T세포응답)

CⅡ 펩티드(소 CⅡ245-270, 마우스 CⅡ245-270, 사람 CⅡ245-270, 펩티드 유도체 CⅡ245-270[S260,261,263]를 마우스에 경구투여한 경우, 펩티드에 대한 면역관용이 T세포증식응답에서 유도되는지를 조사하였으며, 이때, T세포 증식응답은 다음과 같이 시험하였다.

마우스의 양 뒷다리 및 꼬리 기저부에 1마리당 100㎍의 CⅡ 펩티드를 Mycobacterium tubercu1osis H37Ra주(株 )의 사균(死菌)을 포함한 CFA(DIFCO)와 함께 투여하여, 1주일 후에 무릎 하부, 쥐 음부의 림프절을 떼어 림프구 현탁액을 제조하였다. 이를 96웰 배양 플레이트(culture plat는)에 CⅡ 펩티드 항원과 함께 1웰당 4.0∼4.5×10⁵개/200㎕ 분주(分注)하였다. 배지는 1% 마우스 정상 혈청, 5×10^-5M 2-머캅토메탄올을 가한 RPMI1640을 이용하였다. CO₂인큐베이터에서 2일 배양 후, 1웰당 37kBq³H-티미딘을 첨가하고, 12시간 후에 세포를 수득하였다. 이 세포 내에 투입된³H를 액체 신티레이션카운터로 계측하였다.

5) 실험결과

면역후 37일째의 결과를 살펴보면, 도 5에 도시된 바와 같이, 소 CⅡ245-270을 투여한 마우스에서는 투여량이 많을수록 CⅡ특이적 항체 IgG_l, IgG_2a의 생산량이 모두 저하되고 있는 반면, 소 CⅡ316-333을 투여한 마우스에 있어서도 투여량이 많아짐에 따라 약간 항체가가 저하하였지만, 투여량이 같은 경우 CⅡ245-270 투여군쪽이 항체가가 낮고, 특히 IgG_2a항체응답이 저하되고 있다.

또한, 소 CⅡ245-270, 마우스 CⅡ245-270, 사람 CⅡ245-270, 펩티드 유도체 CⅡ245-270[s260,261,263]을 1㎎씩 투여했을 경우, IgG_l, IgG_2a, IgG_2b항체생산응답을 조사하면, 도 6에 도시된 바와 같이, 소 CⅡ245-270, 마우스 CⅡ245-270 및 팹티드 유도체 CⅡ245-270[s260,261,263] 투여군에서는 CⅡ특이적 IgG_2a응답이 펩티드를 투여하지 않은 대조군과 비교하여 유의적으로 억제 되지 반면, 사람 CⅡ245-270에서는 차이가 확인되지 않았으며, 또한,IgG_l, IgG_2b에 대해서는 각군 모두 차이가 확인되지 않았다.

따라서, 관절염에 걸릴 경우 증가되는 항체인 IgG_2a의 생산정도가 소 CⅡ316-333보다 소 CⅡ245-270에서 급격히 감소됨을 알 수 있울 뿐만 아니라 유도체가 다른 종의 억제 단편을 투여했을 빼보다 상대적으로 상기 IgG_2a가 크게 감소되어 감작의 위험을 줄이면서 억제효과가 가장 크게 됨을 알 수 있다.

또한, 전기 CⅡ 펩티드를 경구투여함으로써 항체생산응답에 있어서도 경구관용이 유도되는 것을 알 수 있었다. 이때, 상기 대조구는 0.01% 초산 혹은 물을 투여한 마우스를 사용하였다.

또한, 상기 소 CⅡ245-270, 마우스 CⅡ245-270, CⅡ245-270[s260,261,263] 투여군에서는, 도 6에 도시된 바와 같이, CⅡ 펩티드에 대한 T세포응답이 가장 낮음을 알 수 있다. 따라서, 상기 CⅡ 펩티드를 경구투여함으로써 T세포응답에 있어서도 경구관용이 유도되는 것을 알 수 있게된다.

6) 고찰

본 실시예 2에서는 CⅡ의 부분 펩티드 또는 그 유도체의 경구투여에 의하여 CIA의 증상이 경감되는 것을 보인다. 이때, 소 CⅡ에 대한 항체생산응답을 분석하고, 이들 펩티드의 억제기구에 대하여 고찰하였다.

소 CⅡ245-270을 투여한 마우스에서는, 도 5에 도시된 바와 같이, 투여량이 많을 수록 CⅡ 특이.적 항체 IgG_l, IgG_2b의 생산량이 모두 저하되고 있다. 이에 대한 CIA 억제효과는 1회 투여량이 1, 125㎍인 경우 확인되었지만; 5, 25㎍에서는 확인되지 않았다.

또한, 소 CⅡ245-270, 마우스 CⅡ245-270, 사람 CⅡ245-270, 펩티드 유도체 CⅡ245-270[s260,261,263]을 1㎎씩 투여했을 경우, CIA 증상에 대한 억제효과 및 CⅡ에 특이적인 IgG_2a생산의 억제가 나타나게 된다. 따라서, 펩티드의 고투여량에서 확인할 수 있었던 CIA 증상의 억제는 항체생산응답의 저하를 동반하였지만, 저량투여에 의한 억제는 항체생산응답의 저하를 동반하지 않았다.

한편, 펩티드 유도체 CⅡ245-270[s260,261,263]은 CⅡ특이적 T세포의 반응을 유발하지는 않지만, 항원제시세포상의 MHC 클래스분자(A^q분자)와 결합할 수 있다. 이때, DBA/1 마우스를 상기 펩티드 유도체와 CⅡ의 혼합물로 면역하면, CIA가 억제된다. 이때, 상기 팹티드 유도체는 천연 CⅡ유래의 단편과 MHC 분자와의 결합을 경합적으로 억제하기 때문으로 사료된다.

[실험예 2]

급성독성 실험

본 발명의 CⅡ 펩티드에 대한 급성독성을 DBA/1 마우스로 시험한 결과, LD₅₀값은 500㎎/㎏ 체중이었다. 따라서, 상기 CⅡ 펩티드는 본 발명의 효과량 범위내에서 충분히 안전하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명 Ⅱ형 콜라겐의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 콜라겐 관절염 치료제 및 그 치료방법은 감작의 위험성을 최소한으로 하면서 경구면역관용을 유도할 수 있도록 함으로서 포유동물의 CIA를 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 이로 인해 관절염 치료의 신뢰성을 향상시키는 효과가 있게 되는 것이다.

Claims (1)

1. 콜라겐 관절염 치료제에 있어서,

   Ⅱ형 콜라겐의 245번∼270번 아미노산을 포함하는 팹티드의 260번, 261번, 263번 아미노산이 A, B., N으로 치환된 유도체를 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 콜라겐 관절염 치료제.

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