CN1774259B - 治疗系统性红斑狼疮的肽的胃肠道外制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种药物组合物，其包括：一种水性载体，0.1mg/ml-20mg/ml的肽的药用盐的组合物，a)所述肽包括至少12个并且至多30个连续氨基酸，其具有的序列相应于：(i)在人类单克隆抗-DNA16/6 Id抗体的重或轻链的互补决定区(CDR)中发现的氨基酸的序列，或(ii)在病原抗-DNA单克隆抗体的重或轻链的互补决定区(CDR)中发现的氨基酸的序列，所述单克隆抗体在小鼠中诱导类系统性红斑狼疮(SLE)的疾病反应，或b)所述肽包含连续氨基酸，其具有由SEQ ID NOS.8-17任何一个显示的序列，或c)所述肽包含连续氨基酸，其具有a)和b)的任何一个序列，或在(a)(i)、(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中的至少两个序列；或d)所述肽包含连续氨基酸，其具有的序列包含在(a)(i)、(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中包括的至少两个相同序列；和溶解度增强剂，其中所述肽和溶解度增强剂溶解在水性载体中；并且其中所述组合物具有介于4和9之间的pH，以及本发明提供一种通过施用有效量的组合物来缓和人类SLE症状的方法。

Description

治疗系统性红斑狼疮的肽的胃肠道外制剂
本申请要求提交于2003年1月14日的美国临时申请号60/439,918的优先权，特此将其全部内容并入作为参考。
在整个申请中，将各种出版物全文引用作为参考。特此，将这些出版物全部内容并入本申请作为参考从而更充分地描述在本文描述和要求的本发明的日期之前的所属本领域那些技术人员已知的技术状态。
发明背景
系统性红斑狼疮(SLE)，或狼疮是一种使人衰弱的(debilitating)自身免疫病，其特征在于一批自身抗体的存在，所述抗体包括针对dsDNA的抗体，针对核抗原的抗体和针对核糖核蛋白的抗体。大约2000人中要有1人受到SLE的侵袭(美国，700个妇女中有1人)。该疾病主要侵袭年轻妇女，并且女性与男性的比率约为9∶1。
系统性狼疮可以侵袭几乎身体的任何器官或系统。系统性狼疮可以包括即便有，也是极少症状是明显的(“减轻”)的时期和当疾病变得更加活跃(“突发”)的其它时期。大多数时候，当人们提到“狼疮”，他们是指该疾病的系统性形式。
皮质类固醇是治疗系统性自身免疫疾病的主要依靠。用高剂量的糖皮质激素(1-2mg/kg/天)治疗威胁生命、具有严重致残表现形式的SLE。慢性糖皮质激素的不理想效应包括一批显著有害效应诸如类库欣综合征体型，中枢肥胖症，高血压，感染，毛细血管脆性，多毛症，加速的骨质疏松症，白内障，糖尿病，肌病和精神病。除了皮质类固醇的毒性外，患者对剂量方案的依赖也引起了一个严重的问题。
还将细胞毒性试剂用于控制活动的疾病，减缓疾病突发的速度和减少对类固醇的需求。后者不理想的副作用包括骨髓阻抑，增加的条件性的生物的感染，不可逆的卵巢衰竭，脱发和增加恶性肿瘤的风险。
SLE是一种炎性疾病，迄今尚没有对其确定有效的治疗或疗法。该疾病导致急性和慢性的并发症。仅有的可利用的治疗方法是姑息剂，其目标在于减轻急性症状和预防慢性并发症，经常伴随深刻的副作用。因此，在这个领域有未满足的需要，并且医师和患者都将欢迎新的治疗方法，其可以潜在消除或减少该疾病有害的表现。
尽管对SLE的诱导机制进行了广泛研究，关于该疾病的病原学信息是非常有限的。直到最近，在不同临床阶段和各种处理方案下，使用患者的外周血淋巴细胞(PBL)进行SLE研究。或者，将呈现自发的类-SLE疾病的小鼠品系作为SLE的模型进行研究。这种分析导致了不彻底的和使人迷惑的关于各种免疫学和非免疫学因子在诱导或维持疾病上的作用的解释，这主要是一方面由于患者的异种性和另一方面在小鼠SLE品系中难于控制疾病的诱导阶段。
几年前，建立了SLE的动物模型。基于遗传型网络的概念的这种模型，开发了狼疮相关的自身抗体和临床表现形式的广泛谱系(Mendlovic，S.等Proc.Natl.Acad Sci.USA 85：2260(1988))。通过用具有称为16/6Id的常见遗传型的人类抗-DNA单克隆抗体(mAb)对没有呈现任何自发的自身免疫疾病的小鼠品系的免疫来进行诱导(Shoenfeld，Y等，J.Exp.Med.158：718(1983))。
人类mAB 16/6是抗-DNA抗体，其起初是IgM同种型的，并且在培养物中被转变为IgG1。该mAB来自患者并且表达常见遗传型，16/6Id(Shoenfeld等，1983；Mendlovic等，1988)。分泌这种mAB的杂交瘤细胞一般生长在培养物中，并且使用与SepharoseTM偶联的蛋白质G的亲和柱来从培养物上清液中分离这种抗体。将人类16/6抗-DNA mAB(IgGl/к)描述于Shoenfeld，Y.等，J.Clin.Invest.70：205-208(1982)和Waisman，A等，Int.Immunol.7：689-696(1995)中。
免疫后，这些小鼠产生了特异于16/6Id的抗体，具有16/6Id的抗体和直接针对不同核抗原(dsDNA，ssDNA，Sm，核糖核蛋白(RNP)，Ro，La和其它)的抗体。血清学观察所见与白细胞减少，增加的红细胞沉降速度，蛋白尿，肾中免疫络合物的丰度和小球的硬化相关(Mendlovic等，1988)，这些是典型的SLE表现形式。还显示鼠的抗-16/6Id mAb(Mendlovic，S等，Eur.J.Immunol.19：729，(1989))和小鼠抗-抗16/6Id(16/6Id+)mAb(Waisman，A等，Internatl.Immunol.5：1293(1993)；Waisman，A和Mozes，E.Eur.J.Immunol.23：1566，(1993))可以诱导实验的疾病。这种疾病的诱导是通过基因控制的，并且因此是品系依赖型的(Mendlovic，S.等，Immunology69：228(1990))。这种实验的SLE诱导的独特模型提供了适当的工具来清楚地仔细分析不同的步骤和涉及SLE诱导和发展的连锁的免疫参数。
SLE是一种系统性自身免疫病，其特征在于形成针对自身抗原，诸如DNA、Sm、Ro、La、RNP、心磷脂和组蛋白的自身抗体。尚不清楚SLE的病原学，对这些自身抗体出现的机制的理解提供了洞察力。发现能够激发具有16/6Id或与其反应的抗体的单克隆自身抗体是病原性的并且因此能够诱导实验性SLE(Fricke，H等，Internatl.Immunol.2：225(1990)；Sthoeger，Z.M.等，J.Clin.Immunol.13：127(1993))。对9个结合DNA或者HeLa核提取物(NE)的自身抗体的可变(V)区进行测序，所述自身抗体分离自具有实验性SLE的C3H.SW小鼠(Waisman和Mozes，1993)。分析具有不同特异性的单克隆抗体以尝试确定不同自身抗体之间的关系。发现三个结合DNA的mAb并且其显示了病原性抗-DNA抗体的序列特性。这些mAb的其中一个，称为2C4C2，显示使用重(H)链(V)区基因(VH)，其与分离自其它倾向狼疮的小鼠，名称为(NZB xNZW)F1的抗-DNA mAb的VH相同。mAb 2C4C2的轻(L)链V区基因(VL)与也分离自(NZB xNZW)F1小鼠的另一个抗-DNAmAb的VL具有98％的同源性。称作5G12-4和5G12-6的其它两个抗-DNAmAb的VH序列与mAb 2C4C2的具有93％的同源性。六个mAb结合HeLa NE的蛋白。所述9个mAb使用总共5个VH和4个VL种系基因，说明了具有实验性SLE的小鼠中诱导的自身抗体不是起源自一个B细胞克隆。9个VH和VL中的3个在序列上与种系基因相同，而至少三个其它的具有体细胞突变。后者提示这些抗体通过使用存在的(免疫前)的B细胞，和通过一种抗原引发的过程出现在小鼠中。而且，看来在具有实验性SLE的小鼠中发现的自身抗体使用与mAb所用的那些相似的遗传元件，所述遗传元件分离自自发呈现狼疮的小鼠品系。
T细胞在诱导和发展实验性SLE中起着重要的作用。因此，特异于16/6Id的T细胞系和克隆显示与16/6抗体相似的在同系受体中诱导实验性SLE。因此，在接种该谱系的活化细胞后，小鼠发展了对SLE是典型的血清学和肾的损伤(Fricke，H.等，Immunology 73：421(1991))。而且，在用16/6Id或抗-16/6Id mAb注射后，C3H.SW起源的特异于16/6Id的T细胞谱系在显示对该疾病的诱导具有抗性的C57BL/6小鼠中诱导了SLE(Mendlovic等，1990)。
在鉴定16/6Id的病原区的尝试中，制备了16/6Id mAb的(Fab′)2片段，并且发现所述片段保留了完整16/6Id分子的特异性和病原能力(Ruiz，P.J.等，Immun.Let.41：79(1994))。
分离自具有实验性SLE的小鼠并且显示结合DNA以及具有16/6Id的mAb 5G12能够在小鼠中诱导实验性SLE(Waisman，A等，Internatl.Immunol.5：1293(1993))。通过增殖与mAb特异性反应的T细胞可能与具有来自它们的互补决定区(CDR)的序列的肽反应。非常可能的是所述T细胞识别上述抗体的V区，原因在于它们不与其它携带相同的不变区但是具有不同的特异性的抗体反应。在可变区中，最可能被识别的区域是CDR，因为在各种抗体之间它们是差异最大的区域。上述9个诱导小鼠中SLE的病原小鼠的mAb的VH序列的CDR区域在Waisman和Mozes，1993的图1中加框表示，其中表示了9个mAb的VH的完全核苷酸和推导的氨基酸序列。
在实验性SLE模型中-Balb/c小鼠和倾向SLE的小鼠，即(NZBxNZW)F1小鼠-用基于mCDR的肽或化合物1的处理明显减少与SLE相关的观察所见、肾中的显著免疫络合物沉积(ICD)、蛋白尿和白细胞减少症。该治疗方法对16/6Id的特异性抗体应答没有影响(Waisman，A等.“Modulation of murine systemic lupus erythematosus with peptides basedon complementarity determining regions of pathogenic anti-DNA monoclonalantibodies.”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1997)，94(4)：620；Eilat，E等，“Prevention of systemic lupus erythematosus-like disease in(NZBxNZW)F1mice by treating with CDR1-and CDR3-based peptides of pathogenicautoantibody”J.Clin.Immunol.(2000)，20：268；Eilat，E等“The mechanismby which a peptide based on complementarity determining region-1 ofpathogenic anti-DNA antibody ameliorates experimental SLE”(2001)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：1148)。
显示于图1的人类CDR1、化合物1，是一种基于表示为16/6Id的人类抗-dsDNA mAb的互补决定区1(CDR1)的19个氨基酸的合成肽(Waisman，A等.“Modulation of murine systemic lupus erythematosus withpeptides based on complementarity determining regions of pathogenicanti-DNA monoclonal antibodies.”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1997)，94(4)：4620-4625)。
这些肽，象许多肽一样，是不易溶解的。因此，本文提供了提高这些肽的溶解度的制剂。
发明概述
本发明提供一种药物组合物，其包括：
水性载体；
0.1mg/ml-20mg/ml的肽的药用盐的组合物，
a)所述肽包括至少12个和至多30个连续氨基酸，所述氨基酸具有相应于如下序列的序列
(i)在人类单克隆抗-DNA 16/6Id抗体的重或轻链的互补决定区(CDR)中发现的氨基酸的序列，或
(ii)在病原性抗-DNA单克隆抗体的重或轻链的互补决定区(CDR)中发现的氨基酸的序列，所述单克隆抗体在小鼠中诱导类系统性红斑狼疮(SLE)的疾病反应，或
b)所述肽包括连续氨基酸，所述氨基酸具有如下序列：
(i)TGYYX1X2X3X4X5QSPEKSLEWIG(SEQ ID NO：11)
其中X1是甲硫氨酸，丙氨酸或缬氨酸；X2是谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸或精氨酸；X3是色氨酸或丙氨酸；X4是缬氨酸或丝氨酸；和X5是赖氨酸，谷氨酸或丙氨酸；
(ii)EINPSTGGX6X7X8X9X10X11X12KAKAT(SEQ ID NO：12)
其中X6和X7每个是苏氨酸，缬氨酸或丙氨酸；X8是酪氨酸或苯丙氨酸；X9是天冬酰胺或天冬氨酸；X10是谷氨酰胺或谷氨酸；X11是赖氨酸或谷氨酸，和X12是苯丙氨酸或酪氨酸；
(iii)YYCARX13X14X15X16PYAX17X18YWGQGS(SEQ ID NO：13)
其中X13是苯丙氨酸，苏氨酸或甘氨酸；X14是亮氨酸，丙氨酸或丝氨酸；X15是色氨酸或丙氨酸；X16是谷氨酸或赖氨酸；X17是甲硫氨酸或丙氨酸，和X18是天冬氨酸，赖氨酸或丝氨酸；
(iv)GYNX19X20X21X22X23X24SHGX25X26LEWIG(SEQ ID NO：14)
其中X19是甲硫氨酸或丙氨酸；X20是天冬酰胺，天冬氨酸或精氨酸；X21是色氨酸或丙氨酸；X22是缬氨酸或丝氨酸；X23是赖氨酸或谷氨酸；X24是谷氨酰胺或丙氨酸；X25是赖氨酸或谷氨酸，和X26是丝氨酸或丙氨酸；
(v)YYCARX27X28X29YGX30X31X32GQTL(SEQ ID NO：15)
其中X27是丝氨酸或苯丙氨酸；X28是甘氨酸或丙氨酸；X29是精氨酸，丙氨酸或谷氨酸；X30是天冬酰胺或天冬氨酸；X31是酪氨酸或苯丙氨酸，和X32是色氨酸，组氨酸或丙氨酸；
(vi)X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG(SEQ ID NO：16)
其中X33是甘氨酸或苏氨酸甘氨酸；X34是精氨酸或赖氨酸；X35是脯氨酸或丝氨酸；X36是甘氨酸或谷氨酸；X37是赖氨酸或天冬氨酸；和X38是谷氨酸，亮氨酸或丝氨酸；
(vii)YYCARX39LLX40X41X42X43X44DVDYX45GX46DV(SEQ IDNO：17)
其中X39是甘氨酸或苯丙氨酸；X40是精氨酸或丙氨酸；X41是甘氨酸或丙氨酸；X42是甘氨酸或丙氨酸；X43是色氨酸或丙氨酸；X44是天冬酰胺或丙氨酸；X45是酪氨酸或色氨酸；X46是甲硫氨酸或谷氨酰胺；
(viii)FSGYYWS(SEQ ID NO：8)；
(ix)EINHSGSTNYKTSLKS(SEQ ID NO：9)；或
(x)GLLRGGWNDVDYYYGMDV(SEQ ID NO：10)，或
c)所述肽包括连续氨基酸，其具有a)和b)任何一个的序列，或在(a)(i)，(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中的序列的至少两个，或
d)所述肽包括连续氨基酸，其具有的序列包括在(a)(i)，(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中的至少两个相同序列；和
溶解度增强剂，其选自由下列组成的组中：二甲基-乙酰胺，聚乙二醇，聚氧化的(polyoxylated)蓖麻油，N-甲基-2-吡咯烷酮，1-乙烯基-2-吡咯烷酮，聚氧乙烯山梨糖醇酯，和取代的β-环糊精，
其中所述肽和溶解度增强剂都溶解在水性载体中；和其中所述组合物具有介于4-9之间的pH。
本发明还提供一种缓和人类受试者系统性红斑狼疮(SLE)症状的方法，其包括以缓和人类受试者SLE症状的有效量向人类受试者施用任何本发明的药物组合物。
附图简述
图1.作为乙酸盐的人类CDR1(化合物1)-显示hCDR1的分子式和结构式、氨基酸序列和物理参数
图2.取自用化合物1和Captisol
Figure 200480006987210000210003_0
溶液处理的小鼠的细胞在随后用化合物1的PBS溶液激活后的IL-2分泌。
-■-化合物1(RS)50μg/小鼠
-▲-化合物1(RS)200μg/小鼠
-□-DP50μg/小鼠
-△-DP200μg/小鼠
-○-12％Captisol
Figure 200480006987210000210003_1
ampulized
图3.取自用化合物1溶液处理的小鼠的细胞在随后用化合物1的EM-1溶液激活后的IFN-γ分泌(2.5×106细胞/孔)。
-◆-安慰剂
-●-化合物1 50μg/小鼠(处理剂量)
-△-化合物1 100μg/小鼠(处理剂量)
-×-化合物1 200μg/小鼠(处理剂量)
图4.取自用化合物1溶液处理的小鼠的细胞在随后用化合物1的EM-1溶液激活后的IFN-γ分泌(5×106细胞/孔)。
-◇-安慰剂
-□-化合物1 25μg/小鼠
-△-化合物1 50μg/小鼠
-×-化合物1 100μg/小鼠
-*-化合物1 200μg/小鼠
图5.用在Captisol
Figure 200480006987210000210003_2
中的化合物1注射10次后，在(NZBxNZW)F1小鼠中的抗-dsDNA抗体[OD＝光密度；化合物1(C)＝化合物1溶解在Captisol
Figure 200480006987210000210003_3
中]
-□-安慰剂
-◇-化合物150μg/小鼠
-○-化合物125μg/小鼠
图6.来自(NZBxNZW)F1小鼠的肾切片，其显示免疫络合物沉积物的强度。上行切片来自用Captisol处理的小鼠，中行切片来自用50μg/小鼠的化合物1处理的小鼠，下行切片来自用25μg/小鼠的化合物1处理的小鼠。
放大：左：100倍，右：400倍。FITC免疫组织学。
图7.通过测试它们的血清与肽Ia，IIa和IIIa，或mAb 5G12或对照肽结合的能力，显示的SLE患者和健康人对照的血清的抗体滴度。
图8.对于SLE患者和健康对照的PBL最佳刺激所需的人类抗-DNA16/6Id mAb的浓度。用各种16/6Id mAb浓度(0.1-40μg/孔)刺激PBL。将产生最高刺激指数的浓度定义为起动增殖应答的最理想的浓度。
图9.在缺乏或存在hCDR1或hCDR3时，用促细胞分裂剂植物凝集素(PHA)刺激一个SLE患者的PBL的增殖。
图10.在存在或缺乏人类肽hCDR1或hCDR3或小鼠肽mCDR3时，用人类16/6I mAb刺激一个SLE患者的PBL增殖。
图11.在缺乏或存在人类肽hCDR1或hCDR3肽或小鼠反向肽revmCDR1和revmCDR3时，用人16/6I mAb刺激一个SLE患者的PBL增殖。
图12.在缺乏或存在hCDR1或hCDR3时，由人类16/6Id mAb起动的SLE患者的PBL中的IL-2分泌的抑制。
图13.在缺乏或存在hCDR1或hCDR3时，用人16/6Id mAb刺激一个代表性SLE患者的PBL中的TGF-β分泌的上调。
图14.显示SLE患者和健康对照者血清中的MMP-2和MMP-9的活性的典型凝胶。通过凝胶信号识别蛋白体的受体，分析40个个体SLE患者和25个健康对照的血清(5μl)以得知他们的MMP-2或MMP-9活性。
该图显示两组的血清样品的代表性结果。
图15.显示SLE患者(黑柱)和健康对照者(白柱)血清的MMP-2和MMP-9活性的定量分析的图表。使用特异性活性分析试剂盒测试了SLE患者的36个血清样品和健康对照者的15个血清样品的MMP-2或MMP-9的活性。将结果表示为平均值±s.e.m.*p＝0.0302。
图16A-B.显示具有SLE的患者的MMP-9的活性水平和疾病活性指数(SLEDAI)的图表。通过特异性活性分析试剂盒测试了8个男性(图16A)和27个女性(图16B)SLE患者的35个血清样品的MMP-9的活性。按照这些患者的SLEDAI给出了MMP-9活性的分布。虚线表示健康对照者中的MMP-9的活性。
图17A-B.在疾病的4-6年过程中，显示两个作为样本的SLE患者的血清中的MMP-2(白圈)和MMP-9(黑圈)的活性的模型的图表。通过特异性活性分析试剂盒测试血清的MMP-2或MMP-9的活性。重复进行分析。
发明详述
本发明提供一种药物组合物，其包括：
水性载体；
0.1mg/ml-20mg/ml的肽的药用盐的组合物，
a)所述肽包括至少12个和至多30个连续氨基酸，其具有的序列相应于
(i)在人类单克隆抗-DNA16/6Id抗体的重或轻链的互补决定区(CDR)中发现的氨基酸的序列，或
(ii)在病原性抗-DNA单克隆抗体的重或轻链的互补决定区(CDR)中发现的氨基酸的序列，所述抗体在小鼠中诱导类系统性红斑狼疮(SLE)的疾病反应，或
b)所述肽包括连续氨基酸，其具有如下序列：
(i)TGYYX1X2X3X4X5QSPEKSLEWIG(SEQ ID NO：11)
其中X1是甲硫氨酸，丙氨酸或缬氨酸；X2是谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸或精氨酸；X3是色氨酸或丙氨酸；X4是缬氨酸或丝氨酸；和X5是赖氨酸，谷氨酸或丙氨酸；
(ii)EINPSTGGX6X7X8X9X10X11X12KAKAT(SEQ ID NO：12)
其中X6和X7每个是苏氨酸，缬氨酸或丙氨酸；X8是酪氨酸或苯丙氨酸；X9是天冬酰胺或天冬氨酸；X10是谷氨酰胺或谷氨酸；X11是赖氨酸或谷氨酸，和X12是苯丙氨酸或酪氨酸；
(iii)YYCARX13X14X15X16PYAX17X18YWGQGS(SEQ ID NO：13)
其中X13是苯丙氨酸，苏氨酸或甘氨酸；X14是亮氨酸，丙氨酸或丝氨酸；X15是色氨酸或丙氨酸；X16是谷氨酸或赖氨酸；X17是甲硫氨酸或丙氨酸，和X18是天冬氨酸，赖氨酸或丝氨酸；
(iv)GYNX19X20X21X22X23X24SHGX25X26LEWIG(SEQ ID NO：14)
其中X19是甲硫氨酸或丙氨酸；X20是天冬酰胺，天冬氨酸或精氨酸；X21是色氨酸或丙氨酸；X22是缬氨酸或丝氨酸；X23是赖氨酸或谷氨酸；X24是谷氨酰胺或丙氨酸；X25是赖氨酸或谷氨酸，和X26是丝氨酸或丙氨酸；
(v)YYCARX27X28X29YGX30X31X32GQTL(SEQ ID NO：15)
其中X27是丝氨酸或苯丙氨酸；X28是甘氨酸或丙氨酸；X29是精氨酸，丙氨酸或谷氨酸；X30是天冬酰胺或天冬氨酸；X31是酪氨酸或苯丙氨酸，和X32是色氨酸，组氨酸或丙氨酸；
(vi)X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG(SEQ ID NO：16)
其中X33是甘氨酸或苏氨酸甘氨酸；X34是精氨酸或赖氨酸；X35是脯氨酸或丝氨酸；X36是甘氨酸或谷氨酸；X37是赖氨酸或天冬氨酸；和X38是谷氨酸，亮氨酸或丝氨酸；
(vii)YYCARX39LLX40X41X42X43X44DVDYX45GX46DV(SEQ ID NO：17)
其中X39是甘氨酸或苯丙氨酸；X40是精氨酸或丙氨酸；X41是甘氨酸或丙氨酸；X42是甘氨酸或丙氨酸；X43是色氨酸或丙氨酸；X44是天冬酰胺或丙氨酸；X45是酪氨酸或色氨酸；X46是甲硫氨酸或谷氨酰胺；
(viii)FSGYYWS(SEQ ID NO：8)；
(ix)EINHSGSTNYKTSLKS(SEQ ID NO：9)；或
(x)GLLRGGWNDVDYYYGMDV(SEQ ID NO：10)，或
c)所述肽包括连续氨基酸，其具有a)和b)任何一个的序列，或在(a)(i)，(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中序列的至少两个，或
d)所述肽包括连续氨基酸，其具有的序列包括在(a)(i)，(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中的至少两个相同序列；和
溶解度增强剂，其选自由下列组成的组中：二甲基-乙酰胺，聚乙二醇，聚氧化的蓖麻油，N-甲基-2-吡咯烷酮，1-乙烯基-2-吡咯烷酮，聚氧乙烯山梨糖醇酯，和取代的β-环糊精，
其中所述肽和溶解度增强剂都溶解在水性载体中；和其中所述组合物具有介于4-9之间的pH。
在一个实施方案中，至少0.5mg/ml的组合物是肽的药用盐。
在另一个实施方案中，所述肽具有选自由下列组成的组中的序列：
NH2-Thr Gly Tyr Tyr Met Gln Trp Val Lys Gln Ser Pro Gln Lys Ser Leu Glu-Trp Ile Gly-COOH(SEQ ID NO：1)；
NH2-Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ala Lys AlaThr-COOH(SEQ ID NO：2)；
NH2-Tyr Tyr Cys Ala Arg Ple Leu Trp Glu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln GlySer-COOH(SEQ ID NO：3)；
NH2-Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly-COOH(SEQ ID NO：4)；
NH2-Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Thr Leu-COOH(SEQ ID NO：5)；
NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH(SEQ ID NO：6)；
NH2-Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp Tyr Tyr GlyMet Asp Val-COOH(SEQ ID NO：7)；
NH2-Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser-COOH(SEQ ID NO：8)；
NH2-Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Ser Leu Lys Ser-COOH(SEQ IDNO：9)；和
NH2-Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val-COOH(SEQ ID NO：10)。
在一个实施方案中，肽包括连续氨基酸，其具有如下序列：
X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG(SEQ ID NO：16)
其中X33是甘氨酸或苏氨酸甘氨酸；K34是精氨酸或赖氨酸；X35是脯氨酸或丝氨酸；X36是甘氨酸或谷氨酸；X37是赖氨酸或天冬氨酸；和X38是谷氨酸，亮氨酸或丝氨酸。
在上述任一个药物组合物的另一个实施方案中，溶解度增强剂是取代的β-环糊精。
在一个实施方案中，取代的β-环糊精是羟丙基、磺基丁基醚或磺基丙基醚取代的β-环糊精。
在另一个实施方案中，取代的β-环糊精是取代的磺基丁基醚β-环糊精。
在上述任一个组合物的另一个实施方案中，肽在溶液中的浓度至少是1mg/ml。
在另一个实施方案中，肽在溶液中的浓度至少是2.5mg/ml。
在一个实施方案中，肽的盐的浓度是0.5mg/ml-10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是0.5mg/ml-2.5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是2.5mg/ml-5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是5mg/ml-7mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是7mg/ml-8.5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是8.5mg/ml-10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是9mg/ml-10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是10mg/ml-15mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是15mg/ml-20mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是1.0mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是2.5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是15mg/ml。
在另一个实施方案中，所述盐的浓度是0.1mg/ml-0.5mg/ml。
在另一个实施方案中，所述盐的浓度是0.1mg/ml-0.2mg/ml。
在另一个实施方案中，所述盐的浓度是0.2mg/ml-0.3mg/ml。
在另一个实施方案中，所述盐的浓度是0.3mg/ml-0.4mg/ml。
在另一个实施方案中，所述盐的浓度是0.4mg/ml-0.5mg/ml。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于6.5和8.5之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于7.5和8.5之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于4和5之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于5和6之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于6和7之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于7和8之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于8和9之间的pH。
在上述任一个药物的另一个实施方案中，所述药用盐是乙酸盐。
在另一个实施方案中，药用盐是乙酸盐，并且取代的β-环糊精是七-(磺基丁基醚)-β-环糊精。
在另一个实施方案中，所述组合物还包括药用缓冲剂，所述缓冲剂的量和类型适合于使所述药物组合物的pH在4-9的范围内。所述缓冲剂可以是乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂或碳酸钠。
本发明还提供一种缓和人类受试者系统性红斑狼疮(SLE)症状的方法，其包括以有效缓和人类受试者SLE症状的量向人类受试者施用任何上述药物组合物。
本发明还提供任何上述药物组合物在治疗人类受试者的SLE中的应用。
本发明还提供一种制备任何上述药物组合物的方法，其包括如下步骤：
a)以预定浓度在水性载体中，制备二甲基-乙酰胺，聚乙二醇，聚氧化的蓖麻油，N-甲基-2-吡咯烷酮，1-乙烯基-2-吡咯烷酮，聚氧乙烯山梨糖醇酯或取代的β-环糊精的溶液。
b)加入预定量的肽的药用盐
1)所述肽包括至少12个和至多30个连续氨基酸，其具有的序列相应于：
(i)在人类单克隆抗-DNA16/6Id抗体的重或轻链的互补决定区
(CDR)中发现的氨基酸的序列，或
(ii)在病原性抗-DNA单克隆抗体的重或轻链的互补决定区(CDR)
中发现的氨基酸的序列，所述单克隆抗体在小鼠中诱导类系统性红斑狼疮(SLE)的疾病反应，
2)所述肽包括连续氨基酸，其具有如下序列：
(i)TGYYX1X2X3X4X5QSPEKSLEWIG(SEQ ID NO：11)
其中X1是甲硫氨酸，丙氨酸或缬氨酸；X2是谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸或精氨酸；X3是色氨酸或丙氨酸；X4是缬氨酸或丝氨酸；和X5是赖氨酸，谷氨酸或丙氨酸；
(ii)EINPSTGGX6X7X8X9X10X11X12KAKAT(SEQ ID NO：12)
其中X6和X7每个是苏氨酸，缬氨酸或丙氨酸；X8是酪氨酸或苯丙氨酸；X9是天冬酰胺或天冬氨酸；X10是谷氨酰胺或谷氨酸；X11是赖氨酸或谷氨酸，和X12是苯丙氨酸或酪氨酸；
(iii)YYCARX13X14X15X16PYAX17X18YWGQGS(SEQ ID NO：13)
其中X13是苯丙氨酸，苏氨酸或甘氨酸；X14是亮氨酸，丙氨酸或丝氨酸；X15是色氨酸或丙氨酸；X16是谷氨酸或赖氨酸；X17是甲硫氨酸或丙氨酸，和X18是天冬氨酸，赖氨酸或丝氨酸；
(iv)GYNX19X20X21X22X23X24SHGX25X26LEWIG(SEQ ID NO：14)
其中X19是甲硫氨酸或丙氨酸；X20是天冬酰胺，天冬氨酸或精氨酸；X21是色氨酸或丙氨酸；X22是缬氨酸或丝氨酸；X23是赖氨酸或谷氨酸；X24是谷氨酰胺或丙氨酸；X25是赖氨酸或谷氨酸，和X26是丝氨酸或丙氨酸；
(v)YYCARX27X28X29YGX30X31X32GQTL(SEQ ID NO：15)
其中X27是丝氨酸或苯丙氨酸；X28是甘氨酸或丙氨酸；X29是精氨酸，丙氨酸或谷氨酸；X30是天冬酰胺或天冬氨酸；X31是酪氨酸或苯丙氨酸，和X32是色氨酸、组氨酸或丙氨酸；
vi)X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG(SEQ ID NO：16)
其中X33是甘氨酸或苏氨酸甘氨酸；X34是精氨酸或赖氨酸；X35是脯氨酸或丝氨酸；X3是甘氨酸或谷氨酸；X37是赖氨酸或天冬氨酸；和X38是谷氨酸，亮氨酸或丝氨酸；
(vii)YYCARX39LLX40X41X42X43X44DVDYX45GX46DV(SEQ ID NO：17)
其中X39是甘氨酸或苯丙氨酸；X40是精氨酸或丙氨酸；X41是甘氨酸或丙氨酸；X42是甘氨酸或丙氨酸；X43是色氨酸或丙氨酸；X44是天冬酰胺或丙氨酸；X45是酪氨酸或色氨酸；X46是甲硫氨酸或谷氨酰胺；
(viii)FSGYYWS(SEQ ID NO：8)；
(ix)EINHSGSTNYKTSLKS(SEQ ID NO：9)；或
(x)GLLRGGWNDVDYYYGMDV(SEQ ID NO：10)，或
3)所述肽包括连续氨基酸，其具有a)和b)任何一个的序列，或在(a)(i)，(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中序列的至少两个，或
4)所述肽包括连续氨基酸，其具有的序列包括在(a)(i)，(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中的至少两个相同序列；和
c)调节步骤b)的溶液的pH直到所述肽溶解在溶液中；和
d)如果必要，调节步骤c)的溶液的pH到4-9，由此制备所述药物组合物。
在一个实施方案中，肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度至少是0.1mg/ml的量。
在另一个实施方案中，肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度至少是0.5mg/ml的量。
在另一个实施方案中，肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度是2.5mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml或0.1mg/ml的量。
在另一个实施方案中，肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度是5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的量。
该方法的一个实施方案中，得到的取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是70mg/ml-170mg/ml。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是80mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是90mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是100mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是110mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是120mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是130mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是140mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是150mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是160mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是120mg/ml的浓度。
在另一个实施方案中，步骤b)还包括混合溶液1小时。
在另一个实施方案中，在步骤c)中，使用HCl或NaOH 1.0N来调节pH。
在另一个实施方案中，该方法还包括经过乙酸纤维素滤器来过滤步骤d)的溶液。
在另一个实施方案中，
肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度是2.5mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml或0.1mg/ml的量。
步骤b)还包括混合溶液1小时；和
在步骤c)中，使用HCl或NaOH 1.0N来调节pH，还包括经过乙酸纤维素滤器来过滤步骤d)的溶液。
本发明还提供通过任何上述方法制备的组合物。
本发明还提供冷冻干燥的药物组合物，其包括0.1mg/ml-20mg/ml的如下肽的药用盐的组合物：
a)所述肽包括至少12个和至多30个连续氨基酸，其具有的序列相应于
(i)在人类单克隆抗-DNA16/6Id抗体的重或轻链的互补决定区(CDR)中发现的氨基酸的序列，或
(ii)在病原性抗-DNA单克隆抗体的重或轻链的互补决定区(CDR)中发现的氨基酸的序列，所述单克隆抗体在小鼠中诱导类系统性红斑狼疮(SLE)的疾病反应，或
b)所述肽包括连续氨基酸，其具有如下序列：
(i)TGYYX1X2X3X4X5QSPEKSLEWIG(SEQ ID NO：11)
其中X1是甲硫氨酸，丙氨酸或缬氨酸；X2是谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸或精氨酸；X3是色氨酸或丙氨酸；X4是缬氨酸或丝氨酸；和X5是赖氨酸，谷氨酸或丙氨酸；
(ii)EINPSTGGX6X7X8X9X10X11X12KAKAT(SEQ ID NO：12)
其中X6和X7每个是苏氨酸，缬氨酸或丙氨酸；X8是酪氨酸或苯丙氨酸；X9是天冬酰胺或天冬氨酸；X10是谷氨酰胺或谷氨酸；X11是赖氨酸或谷氨酸，和X12是苯丙氨酸或酪氨酸；
(iii)YYCARX13X14X15X16PYAX17X18YWGQGS(SEQ ID NO：13)
其中X13是苯丙氨酸，苏氨酸或甘氨酸；X14是亮氨酸，丙氨酸或丝氨酸；X15是色氨酸或丙氨酸；X16是谷氨酸或赖氨酸；X17是甲硫氨酸或丙氨酸，和X18是天冬氨酸，赖氨酸或丝氨酸；
(iv)GYNX19X20X21X22X23X24SHGX25X26LEWIG(SEQ ID NO：14)
其中X19是甲硫氨酸或丙氨酸；X20是天冬酰胺，天冬氨酸或精氨酸；X21是色氨酸或丙氨酸；X22是缬氨酸或丝氨酸；X23是赖氨酸或谷氨酸；X24是谷氨酰胺或丙氨酸；X25是赖氨酸或谷氨酸，和X26是丝氨酸或丙氨酸；
(v)YYCARX27X28X29YGX30X31X32GQTL(SEQ ID NO：15)
其中X27是丝氨酸或苯丙氨酸；X28是甘氨酸或丙氨酸；X29是精氨酸，丙氨酸或谷氨酸；X30是天冬酰胺或天冬氨酸；X31是酪氨酸或苯丙氨酸，和X32是色氨酸，组氨酸或丙氨酸；
(vi)X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG(SEQ ID NO：16)
其中X33是甘氨酸或苏氨酸甘氨酸；X34是精氨酸或赖氨酸；X35是脯氨酸或丝氨酸；X36是甘氨酸或谷氨酸；X37是赖氨酸或天冬氨酸；和X38是谷氨酸，亮氨酸或丝氨酸；
(vii)YYCARX39LLX40X41X42X43X44DVDYX45GX46DV(SEQ ID NO：17)
其中X39是甘氨酸或苯丙氨酸；X40是精氨酸或丙氨酸；X41是甘氨酸或丙氨酸；X42是甘氨酸或丙氨酸；X43是色氨酸或丙氨酸；X44是天冬酰胺或丙氨酸；X45是酪氨酸或色氨酸；X46是甲硫氨酸或谷氨酰胺；
(viii)FSGYYWS(SEQ ID NO：8)；
(ix)EINHSGSTNYKTSLKS(SEQ ID NO：9)；或
(x)GLLRGGWNDVDYYYGMDV(SEQ ID NO：10)，或
c)所述肽包括连续氨基酸，其具有a)和b)任何一个的序列，或在(a)(i)，(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中序列的至少两个，或
d)所述肽具有连续氨基酸，其具有的序列包括在(a)(i)，(a)(ii)和(b)(i)-(b)(x)中的至少两个相同序列；和
溶解度增强剂，其选自由下列组成的组中：二甲基-乙酰胺，聚乙二醇，聚氧化的蓖麻油，N-甲基-2-吡咯烷酮，1-乙烯基-2-吡咯烷酮，聚氧乙烯山梨糖醇酯，和取代的β-环糊精。
在冷冻干燥的药物组合物的一个实施方案中，至少0.5mg/ml的组合物是肽的药用盐。
本发明还提供一种冷冻干燥上述任何药物组合物的方法，其包括如下步骤：
e)将药物组合物的温度降到-40℃；
f)在预定时间内保持温度在-40℃；
g)将溶液的温度升高到20℃；
h)在预定时间内保持温度在20℃；和
i)减小压力并且在预定时间内保持温度在20℃，由此冷冻干燥所述药物组合物。
在一个实施方案中，步骤a)在2个小时内进行。
在另一个实施方案中，步骤b)在3小时内进行。
在另一个实施方案中，步骤c)进行13个小时。
在另一个实施方案中，步骤c)在110μbar的压力下进行。
在另一个实施方案中，步骤d)进行13个小时。
在另一个实施方案中，步骤d)是在110μbar的压力下进行。
在另一个实施方案中，在步骤e)中，将压力减到10μbar。
在另一个实施方案中，步骤e)进行5个小时。
在另一个实施方案中，
步骤a)在2个小时内进行；
步骤b)在3个小时内进行；
步骤c)进行13个小时，并且在110μbar压力下进行；
步骤d)进行13个小时并且在110μbar压力下进行；和
步骤e)进行5个小时并且压力被减到10μbar。
本发明还提供通过上述任何方法制备的冷冻干燥的药物组合物。
本发明还提供一种冷冻干燥上述任何药物组合物的方法，其包括如下步骤：
a)将药物组合物的温度降到-45℃；
b)在预定时间内保持温度在-45℃；
c)将溶液的温度升高到-20℃；
d)将溶液的温度升高到25℃；和
e)在预定时间内保持温度在25℃，由此冷冻干燥所述药物组合物。
在一个实施方案中，步骤a)在6个小时内进行。
在另一个实施方案中，步骤b)在3个小时内进行。
在另一个实施方案中，步骤c)进行19个小时。
在另一个实施方案中，步骤c)在150μbar的压力下进行。
在另一个实施方案中，步骤d)进行13个小时。
在另一个实施方案中，步骤d)在150μbar的压力下进行。
在另一个实施方案中，步骤e)进行8个小时。
在另一个实施方案中，步骤e)在150μbar的压力下进行。
在另一个实施方案中，
步骤a)在6个小时内进行；
步骤b)在3个小时内进行；
步骤c)进行19个小时并且在150μbar压力下进行；
步骤d)进行13个小时并且在150μbar压力下进行；
步骤e)进行8个小时并且在150μbar压力下进行。
本发明还提供通过任何上述方法制备的冷冻干燥的药物组合物。
本发明还提供上述冷冻干燥的药物组合物，其中所述组合物的水含量少于5％。
在一个实施方案中，所述组合物的水含量少于4.0％。
在另一个实施方案中，所述组合物的水含量少于3.5％。
本发明还提供包装的药物组合物，其包括：
包装材料；和
预定量的任何上述冷冻干燥的药物组合物。
在另一个实施方案中，所述肽具有如下结构：
NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Tri Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu TrpIle Gly-COOH(SEQ ID NO：6)。
本发明的合成肽是基于分离自具有实验性SLE的小鼠的单克隆病原性自身抗体的CDR。这些单克隆抗体从杂交瘤的上清液中获得，所述杂交瘤通过，例如用抗-16/6Id mAb免疫的C3H.SW小鼠的脾细胞和X63.653浆细胞瘤细胞融合产生(Waisman和Mozes，1993)。
这些肽的实例是分别基于mAb 5G12的重链的CDR1，CDR2和CDR3区和mAb 2C4C2(Waisman和Mozes，1993)的重链的CDR1和CDR3区的本文的式Ia-Va的那些，以及它们的类似物。
本发明的肽意欲包括肽Ia-Va的类似物，其包括本文所述的置换、缺失和添加类似物。置换类似物在不同的位点具有氨基酸置换，这些置换是基于所述氨基酸的大小、疏水-亲水模型和电荷进行的。
氨基酸可以按照大小、疏水-亲水模型和电荷排列进行分类。至于大小，那些本领域普通技术人员理解最大的氨基酸是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸，而那些最小的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和脯氨酸，其它的介于两者之间。
至于疏水-亲水模型，众所周知的是氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸是疏水性的，而所有其它氨基酸是亲水性的。在这些亲水性氨基酸中，丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸不带电，而精氨酸、赖氨酸、组氨酸和天冬酰胺具有正电荷以及天冬氨酸和谷氨酸具有负电荷。
在选择肽来测试它们在抑制小鼠T-淋巴细胞的增殖应答的潜能时，其中T淋巴细胞是SLE-诱导的自身抗体的高度效应器，重要的是从附加地不会在实质上改变未置换的亲本肽相应部分的大小、疏水-亲水模型和电荷的那些中选择置换。因此，只要总体效应没有实质上改变对应的未置换的亲本肽的大小、疏水-亲水模型和电荷，可以用亲水残基置换疏水残基，反之亦然。
应该理解，本发明还意图所述肽的其它修饰。因此本发明的肽意欲包括它的“化学衍生物”，其保留了所述肽的至少一部分功能，所述功能允许将其用于预防或者抑制T细胞增殖应答和自身免疫病。
本发明的肽的“化学衍生物”包含附加的化学部分，其不是肽的正常部分。将所述肽的共价修饰包括在本发明范围内。通过使肽的靶向氨基酸残基与有机衍生试剂反应，可以将这些修饰引入分子，所述衍生试剂能够与选定的测链或末端残基反应。许多这些化学衍生物和制备它们的方法为本领域所熟知。
将本发明的肽的盐也包括在本发明范围内。用于本文时，术语“盐”指肽分子的羧基基团的盐和肽分子的氨基基团的酸加成盐。羧基基团的盐可以通过本领域已知的方法形成，并且包括无机盐，例如，钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，以及具有有机碱的盐，诸如，例如，与胺，诸如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等形成的那些。酸加成盐包括，例如具有无机酸诸如，例如盐酸或硫酸的盐，和具有有机酸诸如，例如乙酸或草酸的盐。将这些化学衍生物和盐优选地用于修饰关于稳定性、溶解度等的肽的药学特性。
按照本发明的合成肽及其类似物可以选自由具有本文的I-V序列的肽组成的组，其中：
(i)序列I的肽具有下式(SEQ ID NO：11)：
T G Y Y X1X2X3X4X5Q S P E K S L E W I G[I]
其中X1是甲硫氨酸、丙氨酸或缬氨酸；X2是谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸；X3是色氨酸或丙氨酸；X4是缬氨酸或丝氨酸；和X5是赖氨酸、谷氨酸或丙氨酸。
在一个实施方案中，序列I的肽具有下式(Ia)(SEQ ID NO：1)
T G Y Y M Q W V K Q S P E K S L E W I G  (Ia)
(ii)II序列的肽具有下式(SEQ ID NO：12)：
E I N P S T G G X6X7X8X9X10X11X12K A K A T[II]
其中X6和X7每个是苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸；X8是酪氨酸或苯丙氨酸；X9是天冬酰胺或天冬氨酸；X10是谷氨酰胺或谷氨酸；X11是赖氨酸或谷氨酸，以及X12是苯丙氨酸或酪氨酸。
在一个实施方案中，序列II的肽具有下式(IIa)(SEQ ID NO：2)：
E I N P S T G G T T Y N Q K F KA K A T(IIa)
(iii)序列III的肽具有下式(SEQ ID NO：13)
Y Y C A R X13X14X15X16P Y A X17X18Y W G Q G S[III]
其中X13是苯丙氨酸、苏氨酸或甘氨酸；X14是亮氨酸、丙氨酸或丝氨酸；X15是色氨酸或丙氨酸；X16是谷氨酸或赖氨酸；X17是甲硫氨酸或丙氨酸，和X18是天冬氨酸、赖氨酸或丝氨酸。
在一个实施方案中，序列III的肽具有下式(IIIa)的肽(SEQ ID NO：3)：
Y Y C A R F L W E P YA M D Y W G Q G S(IIIa)
(iv)序列IV的肽具有下式(SEQ ID NO：14)：
G Y N X19X20X21X22X23X24S H G X25X26L E W I G[IV]
其中X19是甲硫氨酸或丙氨酸；X20是天冬酰胺、天冬氨酸或精氨酸；X21是色氨酸或丙氨酸；X22是缬氨酸或丝氨酸；X23是赖氨酸或谷氨酸；X24是谷氨酰胺或丙氨酸；X25是赖氨酸或谷氨酸，并且X26是丝氨酸或丙氨酸。
在一个实施方案中，序列IV的肽具有下式(IVa)(SEQ ID NO：4)：
G Y N M N W V K Q S H G K S L E W I G  (IVa)
(v)序列V的肽具有下式(SEQ ID NO：15)：
Y Y C A R X27X28X29Y G X30X31X32G Q T L  [V]
其中X27是丝氨酸或苯丙氨酸；X28是甘氨酸或丙氨酸；X29是精氨酸，丙氨酸或谷氨酸；X30是天冬酰胺或天冬氨酸；X31是酪氨酸或苯丙氨酸，和X32是色氨酸、组氨酸或丙氨酸。
在一个实施方案中，序列V的肽具有下式(Va)(SEQ ID NO：5)：
Y Y C A R S G R Y G N Y W G Q T L(Va).
肽Ia-IIIa分别基于mAb5G12的VH链的CDR1，CDR2和CDR3区，并且肽IVa和Va分别基于mAb 2C4C2的VH链的CDR1和CDR3区(Waisman和Mozes，1993)。
按照本发明的肽一旦生产出来，那些本领域普通技术人员可以使用试验诸如本文描述的那些，而无需过度的实验来容易地确定所述肽抑制小鼠的作为对SLE诱导的自身抗体高度效应器的T淋巴细胞的增殖应答。可以容易地进行一个试验来测定置换的肽体外抑制某些特异于SLE诱导的自身抗体的T细胞品系和克隆的增殖应答的能力。所述T细胞品系和克隆可以，例如是特异于16/6Id mAb的T细胞品系和克隆(Fricke等，1991)，其通过以前描述的方法由免疫的小鼠的淋巴结细胞建立(Axelrod，O.和Mozes，E.Immunobiology 172：99(1986))。在存在丰富培养基时，每两个星期将细胞暴露于出现在被辐射的同源脾细胞上的刺激的抗体。通过标准有限稀释技术克隆T细胞品系。例如，通过本文材料和方法中所述的方法来测试这些T细胞品系和克隆的增殖应答。
用为了选择具有所需活性的肽而进行的另一个实验，测试了置换的肽抑制T细胞品系和克隆的能力从而在存在亲本肽时，对肽特异性的B细胞提供帮助。还可以在生物素化后，测试置换的肽直接与有关品系的抗原呈递细胞的MMC II类产物结合的能力。出于这个目的，在水性溶液中于0℃用过量的生物素-N-羟基琥珀酰亚胺进行有关肽的N-端生物素化(Mozes，E.等，EMBO J.8：4049(1989))。用包含0.1％的牛血清白蛋白的在PBS中的生物素化的肽(PBS/BSA)于37℃培养小鼠脾贴壁细胞或人类外周血淋巴细胞(PBL)-贴壁细胞(1×106/样品)20小时，随后在4℃用藻红蛋白-链霉抗生物素蛋白培养30分钟。在每次培养后，用上述溶液洗涤细胞两次。其后，使用FACScan通过流式细胞术分析该细胞。在每次分析中，分析最少为5000的细胞(对于上述方法，见，例如，Mozes等，1989；Zisman等，1991)。
可以进行另一个测试来测定所述肽抑制小鼠的T细胞品系或T淋巴细胞的细胞因子分泌的能力，所述T淋巴细胞是SLE-诱导的自身抗体的高度效应器。如下检测细胞因子：使用一对捕获和检测抗体通过ELISA(如下面关于IL-4，IL-6，IL-10的描述)，或使用LBRM-33(1A5)分析(Conlon，P.J.J.Immune.134：1280(1983))来评价IL-1的活性，在所述LBRM-33(1A5)分析中，在植物凝集素(PHA)存在情况下，用各种浓度的上清液或重组IL-1刺激1A5细胞分泌IL-2。过夜培养后，将1A5细胞的上清液转移到IL-2依赖型的细胞毒性T淋巴细胞(CTLL)品系中。24小时后，通过3[H]-胸苷的掺入来测量IL-2对CTLL品系的刺激。使用IL-2依赖型CTLL品系或通过ELISA来直接检测IL-2。按照厂商说明书使用各种细胞因子的抗体(Phamingen，San Diego，Ca.，USA)通过ELISA来检测上清液中的IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ和TNFα水平。
在一个或多个这些体外试验中测试为阳性的肽将提供体内活性的合理预期。但是，还可以不使用过度的实验进行体内测试。因此，例如，可以使用候选肽在-3天或0天注射成年鼠。然后，使用疾病-诱导自身抗体或所述肽免疫该小鼠。10天后，测试小鼠淋巴结细胞对免疫原增生的能力从而发现候选肽的抑制能力。
另一个这样的体内动物测试包括直接在鼠的模型中体内测试如上所述的SLE的产物的治疗活性。可以将所述肽注射到小鼠中，在所述小鼠中以不同剂量和不同时间进度表通过不同路径诱导实验性SLE。为了测定所述肽的药物代谢动力学参数，其包括分布的大小，在抗原-呈递细胞中的吸收和清除，可以使用肽的生物素化的衍生物。使用抗生物素蛋白包被的板和特异性抗-肽抗体，通过ELISA可以测定各种体液中的肽的可溶解部分的浓度。使用荧光染料结合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，通过FACS，可以分析细胞结合肽。而且，可以周期性地测试处理的小鼠从而测定所述肽对在小鼠中被SLE诱导的自身抗体所激发自身抗体应答和疾病表现的影响。
另一个体内方法包括用候选肽tolerizing新生小鼠，随后用病原性的自身抗体，诸如16/6Id+，或用相同的肽免疫所述小鼠，之后是疾病表现诸如，与白细胞减少、升高的红细胞沉降速率、蛋白尿、肾中的免疫络合物的丰度和小球的硬化关联的血清学观察所见。因此可见，除了已经在本文实施例中显示是可实施的优选的实施方案之外，那些本领域普通技术人员将能够测定另外的肽，所述另外的肽按照本文给出的指导不需过度的实验也是可实施的。
还可以进行相对简单的体外试验从而测定任何给定的置换的肽对任何给定的SLE患者的预期的治疗功效。为了评价生产的肽的最终目标，其将高亲和地与适当的MHCII类分子结合但是将不会导致T细胞的进一步活化从而在SLE患者上具有治疗效应，在生物素化后，可以对所述肽进行分析，测定它们与SLE患者外周血淋巴细胞中的抗原呈递细胞上的HLAII类产物直接结合的能力。可以将健康对照供者和对照肽用于这些分析中来检验它们的特异性。
在一个实施方案中，本发明的治疗试剂是选自本文式I-V的肽的组的肽，其包括Ia-Va肽和它们的置换和/或缺失类似物。
在另一个实施方案中，按照本发明的治疗试剂是多表位单肽的形式。因此，在一个优选的实施方案中，由选自本文式I-V的肽的组的两个不同的肽组成的双肽，诸如通过丙氨酸残基的一段短序列或由组织蛋白酶通过蛋白水解的推断位点来彼此共价地连接。关于这些位点见，例如，美国专利号5,126,249和欧洲专利号495,049。这将诱导将优选的形式位点特异的蛋白水解成两个所需的类似物。或者，可以将许多相同的或不同的本发明的肽形成肽的聚合物，诸如，例如，所述肽与适当的聚合试剂，诸如0.1％的戊二醛(Audibert等(1981)，Nature 289：593)的聚合。所述聚合物将优选地包含5-20个肽残基。这些肽聚合物还可以通过肽的交联或将多个肽与大分子载体连接而形成。适当的大分子载体是，例如，蛋白质，诸如破伤风类毒素，和氨基酸的直链或支链共聚物，诸如L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-赖氨酸的直链共聚物以及L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸(T.G)-A-L-支链共聚物或多链的聚DL丙氨酸(M.Sela等1955，J.Am.Chem.Soc.77：6175)。例如，通过首先使肽与水溶性的碳二亚胺，诸如1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸偶联，然后进行与大分子载体的缀合，所述大分子载体描述于Muller，G.M.等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：569。与单独载体的组合物比较，每个缀合物中的偶联的肽的含量通过氨基酸分析确定。
按照本发明的一个实施方案，可以将一个或多个活性肽与适当的大分子载体连接或可以在存在戊二醛的情况下聚合。
所述肽，它们的聚合物或它们与适当大分子载体的缀合物，将以确保它们的生物有效度，使它们适合于治疗的形式施用给患者。如果发现多于1个的肽具有明显的抑制活性，这些肽将以包含所述肽的混合物的制剂形式向患者给药。
本发明还包括药物组合物，其包括至少一个按照本发明的合成肽，它们与适当的大分子载体的缀合物或它们任选与药用载体的聚合物。
任何适当的施用路径为本发明所涵盖，包括口服的、静脉内的，皮下的、动脉内的、肌内的、吸入的、鼻内的、鞘内的、腹腔内的、真皮内的、经皮肤的路径或其它已知路径，包括肠内的路径。
本发明的组合物的施用的剂量范围应该足够大从而产生所需的效果，由此，例如，基本上预防或抑制了对SLE-诱导的自身抗体的免疫应答，如通过体外T细胞增殖所测量的，以及进一步地明显地治疗了疾病。
所述剂量应该不会大到会导致副作用，诸如不希望的交叉作用、全身性的免疫抑制、过敏性反应等
用于治疗SLE的本发明的肽的有效剂量在1pg/kg-1mg/kg体重范围内。施用的剂量将取决于年龄、性别、健康和受者的重量，并行治疗的种类，如果有的话，治疗的频率，以及所需效应的性质。
本发明的合成肽，特别是本文序列I-V的那些，旨在抑制或阻抑SLE患者的特异性抗原应答，而不会影响所有其它免疫应答。这种方法至关重要，因为大多数诊断的患者是不得不治疗许多年的年轻妇女并且目前接受的SLE的治疗方法包括施用非特异性的并且具有多重副作用的免疫抑制剂，诸如皮质类固醇和/或细胞毒性药物，
本发明的制剂可以通过胃肠道外地，局部地或直肠地给药。当然，它们以适合于每种给药途径的形式施用。例如，它们可以通过注射剂，吸入剂，软膏，栓剂等进行施用，通过注射剂，浸剂或吸入剂投药；通过洗剂或软膏局部给药；和通过栓剂直肠给药。
在用于本文时，短语“肠胃外的施用”和“经肠胃外施用”表示除肠内的和局部施用以外的通常通过注射的施用模型，包括但不局限于，静脉内的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、和胸骨内的注射和灌输。
在用于本文时，短语“全身给药，”“通过全身给药，”“外周给药”和“通过外周给药”表示化合物、药物或其它物质除直接向中枢神经系统给药之外的给药，从而上述物质进入患者身体系统，并由此经历代谢，以及其它类似方法，例如皮下给药。
关于一般制剂方法和另外的赋形剂的信息的细节可以见于Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版。
合成肽可以如在PCT国际公开号WO02/067848或在PCT国际公开号WO96/30057中所描述的进行制备。
从随后的实验细节将更好地理解本发明。但是，本领域技术人员将容易地理解具体方法和讨论的结果仅是对本发明的举例说明，所述发明在随后的权利要求更充分的描述。
实验详述
肽I-V的合成以及显示用于治疗动物模型中SLE的合成肽的效果的测试描述于PCT国际公开号WO96/30057。另外的动物测试描述于PCT国际公开号WO02/067848中。
实施例1：开发化合物1的制剂
本申请的肽描述于2002年9月6日公开的PCT国际公开号WO02/067848中，并且可以通过本领域熟知的方法进行制备。(见，例如，Peptides：Synthesis，Structure and Applications，B.Gutte编辑，AcademicPress，1995；Peptide Synthesis Protocols，M.Pennington和B.Dunn编辑，Humana Press，1994；Schnolzer，M等，“In situ neutralization inBoc-chemistry solid phase synthesis.Rapid，High yield assembly of difficultsequences.”Int.J.Pept.Protein Res.(1992)40：180-193)。
化合物1是由19个氨基酸组成的合成的多肽。其作为乙酸盐提供。已经确定了该肽的水溶解度少于0.5mg/ml。图1显示作为乙酸盐的化合物1。
为了开发具有超过2mg/ml，优选地高达10mg/ml的肽浓度的制剂，进行了关于一些溶解度增强剂的实验。初步实验显示不容易获得2mg/ml的浓度。为了开发进行皮下注射的制剂，pH在4-9的范围内和所述溶液是等渗的也是理想的。
基于广泛的文献调查，采取了一些主要方法从而产生具有最大溶解度的制剂。考虑的因素是：
·pH调节和缓冲剂
·溶剂
·共-溶剂
·溶解剂
方法
将化合物1单独或与其它赋形剂组合溶解在选定的溶解度增强剂的溶液中，并且将所述溶液搅拌至少一小时。如果需要，调节pH。肉眼观察该溶液以估计溶解度并进行分析试验测定。对于一些选定的制剂，还测试了其生物学活性。
结果
表1表示了用于制剂开发的溶解度增强剂的类型。表2和表3总结了用各种溶解度增强剂进行的实验。表2总结了用在5-10mg/ml范围内的肽浓度进行的最初筛选。然后以较低剂量重复用较高肽浓度进行的实验工作(见表3)。
最初的实验显示化合物1在理想的pH水平，酸性和碱性二者限定下，是更易溶解的，但是在碱性pH范围内稳定性较低。因此，测试了一些缓冲剂和pH调节剂，包括乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和碳酸钠。最初测试的缓冲剂都没有获得理想的肽溶解度水平。只有在超过pH9.2和低于pH3.0时，观察到了2mg/ml的溶解度水平。但是，在起始阶段，选择了具有乙酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂(以甘露醇作为张力试剂)的制剂进行最初的毒性研究。对这些制剂进行了生物学活性测试并且证明它们是有活性的。
测试了非水性溶剂(见表1)诸如乙醇、丙三醇、丙二醇、Chremophore和它们的组合，但是它们没有增加化合物1的溶解度。30％的DMA(二甲基-乙酰胺)溶液产生了在理想范围内的溶解度(5-9mg/ml)，但是由于它的毒性特征而不适合于药物制剂。使用30％的(w/w)PEG 400也观察到了提高的溶解度(5-9mg/ml)。选择后种制剂进行毒性研究，但是已经证明了两者在生物学实验中都是没有活性的，并且可能已经是小鼠毒性研究中的一些不利效果的原因。因此，决定不继续进行这种制剂的研究。考虑到最初的实验，没有将非水性溶剂用在本制剂中。
测试了一些氨基酸(见表1)，包括L-精氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸和L-赖氨酸以提高所述蛋白质的溶解度。L-精氨酸中的肽的溶解度在理想的水平上，但是得到的pH超过9。减少pH或使用精氨酸HCl盐的尝试导致了该肽的沉淀。还测试了人血清白蛋白并且其在低肽浓度上(1mg/ml)提高了该肽的溶解度(见表3)。但是，由于其潜在的免疫原性和较低的肽溶解度，没有将其使用在另外的实验中。
单独和与其它赋形剂组合一起测试了包括甘露糖醇，山梨糖醇和葡聚糖的填充剂(见表1)，但是它们没有提高肽在溶液中的溶解度。
单独和与其它赋形剂一起测试了包括聚山梨酯(Polysorbate)20和聚山梨酯80的共溶剂(见表1)。然而聚山梨酯的较低浓度(高达6％)没有提高肽的溶解度，而更高的浓度(高达10％-见表2)提高了肽的溶解度到2mg/ml。但是，认为这些高浓度的聚山梨酯不适合于药物制剂。
还测试了两种类型的环糊精：羟丙基-β-环糊精和磺基丁基醚-β-环糊精(Captisol)，它们都被认可用在出售的胃肠道外产品中。两者都显著增加了肽的溶解度(对于羟丙基-β-环糊精，浓度在10mg/ml水平，对于Captisol为2.5)。测试了两种环糊精制剂的生物学活性并且发现其与单独肽的活性相等。
CAPTISOL
Figure 200480006987210000210003_5
是可以商购的聚阴离子β-环糊精衍生物，所述衍生物具有被丁基醚间隔基团从疏水空腔隔离的磺酸钠盐，或磺基丁基醚(SBE)。CAPTISOL是CyDex Inc.的七-取代的磺基丁基醚β-环糊精(SBE7-β-CD)制剂的商品名(www.captisol.com)。CAPTISOL
Figure 200480006987210000210003_7
的结构容许药物分子适合在疏水空腔中，由此从水性溶剂中分离该药物分子。因为CAPTISOL的外部表面是亲水的，因此增加了络合的药物分子的溶解度。环糊精提高药物分子的溶解度的应用公开于美国专利号5,134,127和5,376,645中，特此将其全部内容并入作为参考。
按照CyDex Inc.的文献，当通过胃肠道外进行施用时，CAPTISOL
Figure 200480006987210000210003_9
是安全的并且没有显示与β-环糊精关联的肾中毒性。与β-环糊精比较，CAPTISOL提供可比较的或更高的络合物特性以及超过90g/100ml的优越的水溶解度-50-倍的提高。
结论
发现几种溶解度增强剂适合理想的溶解度范围：DMA，PEG-400，二甲基-乙酰胺，聚乙二醇，聚氧化的(polyoxylated)蓖麻油，N-甲基-2-吡咯烷酮，1-乙烯基-2-吡咯烷酮，聚山梨酯20，聚山梨酯80，羟丙基-β-环糊精和磺基丁基醚-β-环糊精(Captisol
Figure 10003_11
)。在这些溶解度增强剂中，已经证明了两种环糊精就溶解度、生物学活性和稳定性来说都是优越的。因此，决定选择Captisol
Figure 10003_12
作为溶解度增强剂使用在实施例5的制剂中，和进一步研究两种环糊精制剂。实施例5临床研究的最终制剂由下列组成：具有所需量的肽(0.5，1.0或2.5mg/ml)的120mg/ml的CAPTISOL水溶液，以及调节pH的HCl和NaOH。
表1：使用在化合物1制剂开发中的溶解度增强剂
  溶解度增强剂分类  溶解度增强剂
  溶剂  Cremophor，EL，CMC，乙醇，DMA，丙三醇，丙二醇，PEG 400，Monotioglycerol
  共溶剂  聚山梨酯20，聚山梨酯80
  溶解剂  精氨酸，HSA，甘氨酸，肌酸酐，谷氨酸，赖氨酸(乙酸盐和游离碱)，Captisol，羟丙基-β-环糊精，
  填充剂  甘露糖醇，山梨糖醇，右旋糖，乳糖葡聚糖
  pH调节剂  柠檬酸盐缓冲剂，乙酸盐缓冲剂，碳酸钠
Figure G04806987219960327D000321
Figure G04806987219960327D000331
Figure G04806987219960327D000341
Figure G04806987219960327D000351
Figure G04806987219960327D000362
Figure G04806987219960327D000371
实施例2：化合物1在Captisol
Figure 10003_14
中的溶液的制备方案
标准溶解方法，诸如将干燥化合物1和干燥Captisol
Figure 10003_15
混合到水中或将化合物1添加到Captisol
Figure 10003_16
和水的制备溶液中，没有获得在所需浓度的彻底溶解。在各种pH水平上测试了一些不同浓度的化合物1和Captisol。但是，随后的产生化合物1在Captisol
Figure 10003_18
中的溶液的方法达到了在所需浓度的彻底溶解。
物质：Captisol，化合物1和水
方法：
1.称取适当量的Captisol
Figure 10003_20
从而得到120mg/ml的终浓度。
2.加入80％的最终量的水并且使用电磁搅拌器混合10分钟。
3.称取化合物1从而得到2.5mg/ml，2.0mg/ml，1.0mg/ml，0.5mg/ml或0.1mg/ml的最终浓度。
4.将肽加入Captisol
Figure 10003_21
溶液。混合1小时。
5.升高pH从而获得清液(在2.0mg/ml制剂中，pH可能需要升高到略高于9)。pH应该使用HCl1.0N和NaOH1.0N进行调节。混合10分钟。
6.如果需要，将pH校正在7.5-8.5的范围内(使用HCl或NaOH 1.0N)。
7.加水到最终体积。
8.通过0.2μ乙酸纤维素滤器过滤该溶液。
9.记录最终pH。
10.分配成等分试样并且在适当温度贮存。
实施例3：化合物1和Captisol
Figure 10003_22
溶液的冷冻干燥
本发明的冷冻干燥方法不同于其它冷冻干燥方法的地方在于在制剂中的固体百分比较高(12％)，而冷冻干燥的产品一般包含介于5％和10％之间的固体。
设备
使用的冷冻干燥器是Edwards lyophilizer Lyoflex 0.6。在方法开发前，操作设备IQ/OQ并且通过质量保证进行适应性的检查。
制备0.5mg/ml、1.0mg/ml和2.5mg/ml的浓度的化合物1的化合物1和Captisol
Figure 10003_23
溶液。将最终体积调节到1ml(1.05gr)。
主要方法步骤：
1.冷冻
2.保持(在低温)
3.分两个阶段在真空下进行干燥：
3.1初级干燥-将盘架加热到最高保持温度，控制盘架的温度在最高保持水平。
3.2次级干燥-在最高保持盘架温度上，将压力减到最小值。批次1-3
冷冻-在2小时内从室温冷冻到-40℃。将盘架保持在-40℃3小时。
干燥-在110μbar压力下进行干燥。在13小时内将盘架温度升高到20℃，并且在此温度再保持13小时。
整个过程时间是31小时。
结果：
水含量结果是：
批次1：3.8％
批次2：4.0％和
批次3：4.9％
批次4和5
由于产生批次1，2和3的方法的水含量结果比理想值要更高，决定在相同的温度上和低压下加入次级干燥步骤。
干燥-在110μbar压力下进行干燥。在13小时期间将盘架温度增加到20℃，并且在此温度再保持13小时(批次4)或8小时(批次5)。将压力减到10μbar，保持另外的5小时。
整个过程时间是36小时。
结果
水含量结果是
批次4：安慰剂：3.0％
1mg/ml：3.9％。
批次5：安慰剂：4.1％
结论
如所示，开发了令人满意的化合物1和Captisol
Figure 10003_24
的冷冻干燥方法。由于固体的高百分比和因而产生的凝缩块，开发的方法比目前可获得的肽的冷冻干燥方法的周期要长，并且其显示了附加的次级干燥阶段。
表4总结了开发的方法。
表4
  步骤  化合物1(肽)与Captisol
  装载  5℃
  冷冻  2小时到-40℃
  保持在低温  -40℃3小时
  初级干燥：加热到20℃保持在20℃ 压力110μbar 13小时压力110μbar 13小时
  次级干燥：保持在20℃ 10μbar压力5小时
  贮存在  -20℃
  过程的时间  36小时
实施例4
检查冷冻干燥的化合物溶液(DP，1mg/瓶，12％Captisol
Figure 10003_26
)的体内生物学活性
通过在两个浓度上用冷冻干燥的化合物溶液，即药物产品(DP)进行皮下(s.c.)给药后，化合物1参比标准(RS)特异性T-细胞的IL-2的分泌抑制来监测生物学活性。处理的结果与用磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的化合物1(RS)处理小鼠的那些结果进行比较。这些结果显示于下面的表和图2中。
实验设计：
1.免疫                                  第0天
(在所有四个脚垫，被CFA乳化的化合物1RS)
2.处理
(s.c.在颈背，在200μl溶液中)            第0天
3.体外活化，使用如下：                  第10天
a.在0；0.5；1；2.5；5；10；25；50和100g/ml浓度上的化合物1RS
b.化合物1的具有反向顺序的氨基酸的肽(阴性对照)。
c.Con A(阳性对照)。
4.培养物于37℃在加湿的5％CO2恒温箱中温育20小时。
5.通过ELISA测量IL-2。
实验组的表
Figure G04806987219960327D000411
Figure G04806987219960327D000421
Figure G04806987219960327D000431
实施例5：评价治疗的最佳剂量
将下面的缩写词使用在随后的描述中：
CFA                    完全弗氏佐剂
ConA                   伴刀豆凝集素A
DP                     药物产品
DS                     药物物质(drug substance)
EM-1                   富集的DCCM-1培养基
EM-3                   富集的RPMI-1640+胎牛血清培养基
FCS                    胎牛血清
IFN-γ                                     γ-干扰素
LN                     淋巴结
PBS                    磷酸缓冲盐溶液
RS                     参比标准
s.c.                   皮下的
TB                     锥虫蓝
TGF-β                                    转化生长因子-β
WFI                    注射用水
介绍
用50μg/小鼠的化合物1RS免疫一组20只鼠。将免疫过的小鼠如下分成5个处理组：安慰剂，25，50，100和200μg/小鼠的化合物1DP(皮下施用)。免疫和处10天后，抽提LN并且制备单细胞混悬液。然后测量由于响应用几种浓度的化合物1RS进行的活化，由培养细胞体外分泌的IFN-γ和TGF-β。
实验设计
1.免疫                                -第0天
2.用化合物1DP处理                     -第0天
3.来自处理的小鼠的LN细胞的体外活化    -第10天
4.收集培养基
(进行IFN-γ测定)                        -第12天
5.收集培养基
(进行TGF-β测定)                        -第13天
6.进行IFN-γ的ELISA
7.进行TGF-β的ELISA
表7：实验组
Figure G04806987219960327D000451
材料和试剂
动物
小鼠：20只雌性BALB/c小鼠，由Harlan动物饲养中心，Rehovot提供。
免疫的年龄(星期+天)：10
包括在本实验中的小鼠的平均重量：19.01gr。
材料
一般试剂
通过用纯化的水稀释96％的乙醇来制备70％的乙醇。
制备用于免疫的化合物1溶液
如下制备CFA-化合物1RS乳剂(500μg/ml，50μg/小鼠)：
1.将1.874mg的化合物1溶解在1.87ml的WFI中从而产生1mg/ml的溶液。
2.用pH指示条测试溶液，发现其pH为5。
3.用1.5ml CFA乳化1.5ml的溶液，得到的最终浓度为500μg/ml。
制备用于处理的溶液
通过皮下注射200μl的溶液来进行处理。
制备12％captisol溶液
将1.2gr的captisol
Figure 10003_28
溶解在10ml的WFI中从而产生12％captisol溶液。
实验程序
对小鼠进行称重
免疫前对小鼠进行称重。平均小鼠重：19.01±0.97gr。
免疫
通过注射100微升的免疫乳剂(每个后脚垫50微升)进行免疫。
处理
免疫步骤后，通过在小鼠的颈背皮下注射200μl的设计的化合物1DP或12％captisol
Figure 10003_30
的处理溶液对小鼠进行处理。
体外培养
通过颈脱位处死小鼠。从后腿中抽提LN并且将其转移到含约5mLRPMI灭菌培养皿中。通过对着200测微计网眼不锈钢网状物轻柔挤压组织来抽提细胞。收集细胞并且于室温在300G离心10分钟。
从每个实验组中的合并的LN中制备单细胞混悬液。
用在EM-1中的化合物1RS(0-100μg/ml)来培养2.5和5.0百万细胞/ml/孔的混悬液。
如细胞反应所指示，通过培养基的ELISA(IFN-γ，48小时和TGF-β，72小时)测定IFN-γ和TGF-β的分泌。
表8体外实验组
制备细胞混悬液
表9：细胞计算的结果和细胞混悬液(10×106/ml)的制备
Figure G04806987219960327D000473
  105   2   98.1   1.9
细胞混悬液的制备(5×106/ml)
通过将5ml的EM-1加入5ml的细胞混悬液中来1∶2的稀释10×106/ml的混悬液。
在48孔板中温育LN细胞培养物
制备3个组织培养板。将随后的加入每个板中。
背景对照(用培养基培养细胞)
0.5ml的细胞混悬液
0.5ml的培养基(EM-1)
系统阳性对照(用ConA刺激细胞)
0.5ml的细胞混悬液
0.5ml ConA(5ug/ml)的EM-1溶液(最终浓度2.5μg/孔)用化合物1活化溶液培养细胞(样品)
0.5ml的细胞混悬液
0.5ml化合物1RS 6.25-200μg/ml(最终浓度3.125-100μg/ml/孔)在96孔板中温育LN细胞培养物
在制备48孔板后，通过从细胞混悬液中应用100μl和从活化溶液中应用100μl来制备96孔板。
将培养板在加湿的5％CO2恒温箱中在37℃温育48或72小时。收集上清液
将培养板于室温在300g离心10分钟。将上清(每孔850μl)转移到镜像板(mirror plates)或导管中。然后，将上清液分成工作等分试样(其中两个等分试样是200μl，一个等分试样是450μl)，以避免样品的反复冻融。每个导管标记以如下细节：
1)实验编码和温育后的时间。
2)组和样品编号。
3)激活剂和浓度。
4)小量(sup)收集的日期。
将上清液贮存在-20℃直到用于ELISA。
结果
表10：组的总结
表11-A：最终细胞因子浓度
              最终细胞因子(pg/ml)(2.5百万个细胞/孔)
  化合物1浓度   安慰剂   50μg/M   100μg/M   200μg/M
  3.125μg/ml6.25μg/ml12.5μg/ml25μ/ml50μg/ml100μg/ml   321.3238.6397.1655.5573.9926.0   54.181.8123.1215.1292.5531.8   64.5116.1180.9262.8518.3582.7   103.9126.1129.0240.3378.1524.1
  ConA   322.6   356.2   337.4   BQL
表11-B：最终细胞因子浓度
                        最终细胞因子(pg/ml)(5百万个细胞/孔)
  化合物1浓度   安慰剂   25μg/M   50μg/M   100μg/M   200μg/M
  3.125μg/ml6.25μg/ml12.5μg/ml25μ/ml50μg/ml100μg/ml   522.3634.8962.8967.41338.82010.2   BQLBQL41.970.0104.2185.2   76.2109.2179.5277.9373.4547.0   90.8157.8257.1421.7739.7995.5   204.4244.1466.1660.5922.51006.2
  ConA   6839.8   2995.3   4837.0   10126.8   7722.8
这些结果还显示于图3-4中。
观察
IFN-γ分泌
1.在安慰剂组中，显示了化合物1体外激活后的线性剂量反应。该图表类似于由使用相同免疫剂量(50μg/小鼠)和培养基(EM-1)在来自体内的模型获得的图表。
2.在所有的测试组中，有化合物1体外激活后的剂量反应。
3.对于所有用于处理的剂量，显示了对IFN-γ的分泌的明显抑制(对于25μg/小鼠的处理剂量，平均95％的抑制)。可以发现在用于处理的剂量和抑制百分比之间的反向相关，主要地当使用5×106细胞/孔时。当使用2.5×106细胞/孔时，用50μg/小鼠对动物进行的处理显示了比100或200μg更好的抑制。25μg的点丢失(缺乏细胞)。
4.当使用5×106细胞/孔代替2.5×106细胞/孔时，观察到了更好的抑制。
5.在该图表的线性范围内，抑制百分比的SD较低。
6.当使用2.5×106细胞/孔时，关于ConA的技术性问题是显而易见的。
TGF-β分泌
1.在安慰剂组中，用化合物1进行体外活化后，没有观察到剂量反应。在所有的其它处理组中，TGF-β的分泌水平低于ELISA的检测限度。
实施例6：对用于注射的化合物1和Captisol(0，0.5，1.0和2.5mg/瓶)的冷冻干燥循环进行最优化
目标
本研究的目标是对用于注射的Captisol和化合物1的冷冻干燥循环进行最优化从而改进冷冻干燥块的形状和避免皱缩及裂解。因此决定对该冷冻干燥循环进行改进和最优化。将该循环转移到产品冷冻干燥器上进行I期的分批物的制备。
方法最优化
制备在0.5mg/ml 1.0mg/ml，2.5mg/ml浓度上的肽的分批物和安慰剂，并且进行几个冷冻干燥循环。使用的冷冻干燥器是Edwards lyophilizerLyoflex 0.6。
测试了溶解度，水含量和块的外观。
按照获得的结果，选择了对化合物1的新的冷冻干燥循环。由于固体的高百分比(12％)和因而产生的浓缩块，新方法比实施例3中的冷冻干燥循环要长并且显示了附加的初级干燥阶段。表12总结了这些方法之间的差异。
表12
  步骤   实施例3中的对化合物1和Captisol
Figure 10003_33
的冷冻干燥循环		   新的对化合物1和Captisol
Figure 10003_34
的冷冻干燥循环
  装载   5℃   5℃
  冷冻   2小时到-40℃   6小时到-45℃
  保持在低温   3小时到-40℃   3小时到-45℃
  初级干燥：I阶段II阶段保持在20℃(25℃)   到20℃13小时压力110μbar-13小时压力110μbar   到-20℃19小时压力150μbar到25℃13小时压力150μbar8小时压力150μbar
  次级干燥：保持在20℃ 5小时压力10μbar -
  贮存在   5℃   5℃
  过程时间   36小时   49小时
实施例7：化合物1(在Captisol
Figure 10003_35
中施用的)对倾向SLE(NZBxNZW)F1雌性小鼠的狼疮症状的影响
使用Captisols
Figure 10003_36
(磺基丁基醚β-环糊精钠)作为赋形剂，用化合物1对参与临床试验的受试者进行治疗。因为这个原因，重要的是确定在Captisols中给出的化合物1的制剂对(NZBxNZW)F1小鼠的处理与观察到的在用PBS中的化合物1对该品系小鼠的处理对狼疮症状是否将有着相同的有利影响。
为了这个目标，将(NZBxNZW)F1雌性小鼠(约8月龄)分成3组，单独用Captisol
Figure 10003_38
(n＝8)或用25μg/小鼠或50μg/小鼠在Captisols中的化合物1(分别地，n＝9和n＝10)对其进行皮下处理，1星期1次，共10星期。对这些剂量进行选择，因为以前的研究显示这个范围内的剂量在改善SLE症状上比测试的更高剂量(100和200μg/小鼠)更有效。将相同批次的药物物质使用在本研究和使用化合物1的初次I期临床研究中。
跟踪小鼠进行抗-dsDNA抗体和蛋白尿的观察。当将小鼠处死后，检测肾中的ICD强度。
如在图5可见的，进行10次注射处理后，在组之间没有观察到dsDNA-特异性抗体水平的明显不同。
表13还显示从第5次注射开始，可以观察到用化合物1处理的有利效果，并且其持续直到第10次注射。在Captisol
Figure 10003_40
对照组中的蛋白尿的平均水平持续高于化合物1-处理组。表13还显示在两个化合物1剂量组中的肾中都观察到ICD强度的减少。有一个整体趋势显示在减少这些小鼠中的SLE的临床症状上较低剂量(25μg/小鼠)比较高剂量(50μg/小鼠)更加有效。
表13.使用25或50μg/小鼠的化合物1(在Captisol中)处理的(NZBxNZW)F1小鼠的SLE临床症状
Figure G04806987219960327D000531
aICD＝免疫络合物沉积物。ICD强度等级：0＝无；1＝中等；2＝重度；3＝重度/非常强。
b具有高水平蛋白尿的一只动物的死亡导致了较低的组平均值。
cp＜0.05(与Captisol处理的对照小鼠比较；Mann-Whitey)。
图6显示来自每个处理组的一个肾的代表性切片。上行切片来自Captisol
Figure 10003_43
处理小鼠，中行切片来自用50μg/小鼠的化合物1处理的小鼠，下行切片来自用25μg/小鼠的化合物1处理的小鼠。可见在使用任一剂量水平的化合物1(溶解在Captisol
Figure 10003_44
中)处理的小鼠的肾中观察到的免疫络合物沉积物的强度比在对照组中观察到的要低得多。
实施例8：I期临床研究
进行I期的、多中心的、随机的、双盲的、安慰剂控制的、单剂量的、四臂(four arm)的研究从而评估在SLE受试者中皮下注射在Captisol
Figure 10003_45
中的化合物1的耐受性和安全性。
这是在法国进行的，关于在Captisol中的化合物1在人类中的首次临床研究。其主要目标是评价在Captisol中的化合物1作为单一皮下注射施用到SLE受试者中的耐受性和安全性。其次要目标是在向这些受试者施用单一皮下剂量的在Captisol
Figure 10003_48
中的化合物1后，对免疫反应进行评价。
三十六(36)个受试者参与了该研究。要符合参与本研究的条件，SLE患者必须满足至少四个由美国Rheumatology大学使用的诊断狼疮的标准。患者必须还已经具有稳定的、轻微的/中等的疾病和在SLE疾病活性指数，SLEDAI上少于或等于10的得分。
按照如下组的分配，每个患者接受注射用重构的化合物1或其匹配的安慰剂(Captisol)的单一皮下注射：
·A组：安慰剂(Captisol
Figure 10003_50
)
·B组：在Captisol
Figure 10003_51
中的0.5mg化合物1
·C组：在Captisol
Figure 10003_52
中的1mg化合物1
·D组：在Captisol中的2.5mg化合物1
在筛选时，在给药日，在给药24小时后和在给药后2，4和8星期后，进行一组标准的安全测试，其包括收集血液和尿液进行实验室测试。在给药之前，和在预定的随访时，抽取血液样品进行SLE-相关的免疫学测试，抗-化合物1抗体和PBL增殖分析。进行如下的免疫学测试：
°库姆斯试验(直接和间接)
°C3，C4和CH50
°总IgG，IgM和IgA
°ANA，抗-dsDNA(Farr分析)，抗-ssDNA
°抗-ENA(包括抗-La，抗-Ro，抗-RNP，抗-Sm)
°抗-心磷脂抗体
°VDRL
·FTA抗体
·类风湿因子
在如下标准的基础上评价受试者群体中在Captisol中的化合物1的耐受性和安全性：
·AEs的发生，包括SLE的突发
·生命体征
·12-前导ECG
·身体检查中的变化
·常规临床实验室测试
·SLEDAI评分
·免疫学测试结果
Ia期临床实验详情
主要研究者和各自研究地点：
法国的六(6)个研究中心：Jean Charles Piette教授(La Pitie Salpetriere医院，巴黎)，Oliver Meyer教授(Bichat医院，巴黎)，Jean Revuz教授(HenriMondor医院，Creteil)，Loic Guillevin教授(Avicenne医院，Bobigny)，EricHachulla教授(Claude Huriez医院，Lille Cedex)，Xavier Mariette教授(Bicetre医院，Kremlin Bicetre)。
化合物1(在Captisol中)、安慰剂、注射安瓿用的水，施用剂量和方式：
将瓶装的在Captisol
Figure 10003_56
中的化合物1(120mg/瓶)作为单一剂量以如下剂量皮下注射到每个受试者中：
0.5mg在Captisol
Figure 10003_57
中的化合物1/瓶，1mg在Captisol
Figure 10003_58
中的化合物1/瓶和2.5mg在Captisol
Figure 10003_59
中的化合物1/瓶。
化合物1的安慰剂：120mg的Captisol
Figure 10003_60
/瓶(外观上与在Captisol
Figure 10003_61
中的化合物1的小瓶相同)
方法学
这是一个使用化合物1或安慰剂的单一皮下注射，多-中心、随机；双盲，安慰剂控制、四-臂(four-arm)的研究。在基准方法开始之前，对SLE患者的筛选多至21天。将每个合格的受试者随机分到4个处理组之一：皮下注射0.5，1或2.5mg的化合物1或其匹配的安慰剂。容许所有的受试者在给药日前进入临床。每个受试者接受上面列出的处理方法之一的单剂量。受试者在给药后24小时出院。在给药后的第2，4和8周对受试者进行进一步监测。在筛选时，在服药日(给药前)，在第2天(给药后)，在2，4和8周(终局访问)，抽取血液样品(血清和全血)进行安全性实验室测试。在筛选时，在服药日(给药前)，在第4和8周时，抽取血液样品进行免疫学测试。在服药日(服药前)和第2，4和8周评价外周血淋巴细胞(PBL)增殖。
受试者数量(总共的和每个处理组的)：将三十六(36)个受试者如下随机分配在本研究中；9个受试者在0.5mg处理组中，9个受试者在1mg处理组中，10个受试者在2.5mg处理组中，以及8个受试者在安慰剂处理组中。对参与的诊断和主要标准：
这项研究的合格的受试者是符合美国Rheumatology大学(ACR)的至少四个诊断标准的SLE患者。他们的疾病状况必需是稳定的，轻微到中度并且在2000年更新的SLE疾病活性指数(SLEDAI2K)上的得分等于或少于10。
被排除在外的SLE患者是据报道在研究筛选之前的6个月中病情是不稳定的或有严重哮喘，中风，急性心肌梗塞，不稳定的咽痛，脑出血和肺栓塞。将具有任何临床上明显或不稳定医学或外科状况，糖尿病，肝病(肝硬化、活动性肝炎、门静脉高血压，和/或腹水)，临床上显著的高血压，任何恶性肿瘤的医疗史，组织断离(dialysis)，或慢性阻碍性肺疾病(COPD)的SLE患者也排除在参与研究之外。
还将在筛选前的3个月中经历血浆取出或使用下列药物之一进行过治疗的SLE患者排除在外：泼尼松30mg/天或更多(或相等剂量的另一种皮质类固醇)，静脉内的皮质类固醇，静脉内的免疫球蛋白G(IgG)，口服抗凝药和任何细胞毒性试剂(例如，硫唑嘌呤，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，麦考酚酸吗乙酯，甲氨蝶呤(methothrexate)，他克莫司)。
此外，还将在筛选前最近3个月中，用皮质类固醇(超过±10mg/天的泼尼松或相等剂量的另一种皮质类固醇)和/或抗疟疾药开始治疗的SLE患者排除在外。
尽管努力在整个研究过程中保持基准SLE医学处理，但是研究者可以在研究中的任何时间改变参与者的医学处理从而维持患者的利益和对其进行最佳化。
评价标准
安全性：
在筛选中，住院治疗中和在包括终局访问的跟踪随访中评定如下的安全性参数：生命体征(收缩血压，舒张血压，脉搏，氧饱和，温度和体重)，12-导程ECG(12-lead ECG)，身体检查中的变化和临床常规实验室安全性测试。在服药日和以后的每次访问中记录不利的事件。
免疫：
在筛选中，住院治疗中和在包括随后的访问中进行SLE-相关的免疫学测试。
随后使用PBL增殖分析和抗-化合物1抗体分析在给药日和包括终局慰问的随后访问中进行药物-关联的免疫学反应。
疾病活动度：
在筛选中，住院治疗中和包括终局访问的随后访问中使用2000年更新的SLE疾病活性指数(SLEDAI2K)评分，来评定疾病活动度。
统计方法：
将SAS
Figure 10003_62
9.0版软件用于分析和表示在本研究中收集的数据。对于该Ia期的研究，没有进行能力计算(power calculation)和公式假说检验。
不利的体验
不利体验的发生率和频率由系统器官分类(System Organ Class)和按照MedDRA字典5.0版优选的术语学表示。按照处理组，将数据制成表格。
临床实验室数据
确定筛选、第一天(服药前)、第二天、第2周，第4周和第8周由处理组给出的实验室数值的描述统计，其包括观察的数量，平均值，标准偏差，最小值和最大值。每次访问的从基线到每个时间点/访问的变化也按照处理的指派给出。异常结果的百分比(在可应用处，低和高)由处理组和访问/时间点在参数基础上给出。进行从基线到给药后24小时和从基线到终局访问的变化分析。
生命体征
确定筛选、第一天(服药前和服药后，并且在每个时间点)、第二天，第2周，第4周和第8周的生命体征的描述统计，其包括观察的数量，平均值，标准偏差，中值，最小值和最大值，并按照指派的处理组制成表格。从基线到每个时间点/访问的变化由访问和处理的指派给出。
体重
由处理组给出在基线，终局和从基线的变化上的重量(kg)的描述统计。
ECG
给出了在基线，终局和从基线变化上的ECG参数的描述统计。将变化分析表示为在正常/异常或存在/缺乏ECG参数之间从基线到终止的变化表。按照以前阐述的标准来确定潜在地临床上地显著性(PCS)QTc(Bazett)测量。给出了在PCS和非-PCS绝对QTc(Bazett)之间的变化分析表以及在从基线到任何访问的QTc(Bazett)中的PCS变化的发生率表。
身体检查
通过在基线和终局访问上每个身体系统具有正常或异常发现的受试者的发生率来分析身体检查结果。还应用了在正常到异常或异常到正常之间的变化分析。当从基线开始没有发生变化时，将其定义为“其它”。与化合物1相关的免疫学测试
对于免疫学参数，由处理组和访问计算和给出了描述统计，其包括观察的数量，平均值，标准偏差，中值，最小值和最大值。从基线到每次随访的变化也由处理组给出。在可应用处，具有阴性/阳性结果的受试者的数量和百分比由处理组和访问给出。
SLEDAI2K
给出SLEDAI2K的描述统计，其包括平均值，标准偏差，中值，最小值和最大值。
Ia期临床研究的结果：
受试者素质和SLE特性
三十六(36)个研究受试者参加并且依照协议完成该项研究。在所有处理组中的大部分受试者(34)是女性(94.4％)，和高加索人(30，83.3％)。所有处理组的平均年龄是35.6岁(平均的范围从32岁-39岁)。大部分受试者(91.7％)具有在4-6之间的美国Rheumatology大学(ACR)的诊断标准和在2.1-4.1范围内的平均组SLEDAI2K评分。
安全性结果
在AEs的发生率中，在研究药物处理组和安慰剂组之间没有显著的差异。在所有组中，大部分常见的AEs是头痛，在性质上将其分成轻微或中度，以及注射部位反应，从性质上将其分成轻微的。没有观察到剂量反应。在研究过程中，没有发生严重的不利事件(SAE)或划分为严重的AE。
对于血液学、生物化学或尿液分析的评价，未见可归因于研究药物的临床上的显著影响。
对于生命体征参数(收缩血压，舒张血压，脉搏，氧饱和)而言，未见可归因于研究药物的临床上的显著影响。
对于温度和重量而言，未见可归因于研究药物的临床上的显著影响。
对于绝对ECG测量法和数字化的ECG参数而言，在化合物1处理组和安慰剂组之间，未见临床显著性的差异。没有来自基准＞60msec的PCSQTc绝对值和QTc的变化被记录。在化合物1处理组和安慰剂组中相似数目的受试者具有来自介于30和60msec之间基准的QTcB变化。
身体检查后，没有化合物1的临床上的显著效果被指出。
免疫学结果
对来自所有受试者的血清样品的评价显示以0.5，1和2.5mg/患者的剂量进行的化合物1的单一皮下施用没有诱导抗-化合物1的特异性抗体的发展。7个受试者具有超出截止的对化合物1的反应。这些提高水平的抗体在服药前已经存在。在本研究随后的阶段(2个月)，没有观察到抗体水平的增加。对这些受试者的血清进行反应性抗体的同种型分析。其中两个受试者的反应与IgM同种型相关联和两个其他受试者与IgG同种型相关联。这7个受试者都没有特异性IgE抗体。
外周血淋巴细胞(PBL)分析显示50％的受试者(18)被划分为在所有处理组中具有相似分布的反应者(SI＞2)。考虑仅施用了单一SC剂量的本研究药物，T细胞的应答相当低并且不能检测到用于分析的化合物1处理剂量或浓度与反应者/非反应者状况之间的关联。同样，随时间过去，没有观察到反应者状况的提高的发生率的迹象。用作安全性对照的破伤风类毒素(TTX)分析显示在所有的处理组中，在整个研究阶段中，对TTX的反应一直保持，这说明在captisol
Figure 10003_63
中的化合物1没有改变针对TTX记忆抗原的免疫学反应。
免疫学观察所见是仅施用单一剂量的本研究药物化合物1的结果。
疾病活动性结果
在研究过程中，除了在0.5mg处理组中的一个受试者被记录了其在显示脓尿的尿液分析基础上在基准和第4周之间2-10分的SLEDAI评分中的变化外，没有记录到化合物1在SLEDAI评分上的临床上显著影响(≥3，≤12分的变化)。按照方案定义，研究者没有证实将这种尿液分析观察所见结果作为狼疮突发，并且将其决定为不具有处理的变化。
结论
这种Ia期研究显示在120mg Captisol中的0.5，1或2.5mg的化合物1的单一皮下注射剂量是安全的并且可被较好的耐受，并且容许其延续到Ib期多剂量研究中。
实施例9
Ib期临床研究
进行I期的、多中心的、两个国家的、随机的、双盲的、四臂的、安慰剂控制的、多剂量的研究从而评估在SLE受试者中皮下注射在Captisol
Figure 10003_64
中的化合物1的耐受性和安全性。
进行该项研究是为了评价向SLE患者重复进行化合物1的皮下施用的安全性和耐受性。本研究的次要目标是在重复向SLE受试者进行在Captisol中的化合物1的皮下施用后评价免疫学反应。
以在Captisol
Figure 10003_66
中的0.5、1.0或2.5mg的剂量进行化合物1的给药。将研究产品每隔一天(排除周末)进行施用，总共12次皮下注射，即每星期3次剂量，总共4星期。开始给药后，在第2，4，8和12周按计划访问对受试者进行监控。使用与上述Ia期的临床研究中所述的那些相似的测试来评价安全性和耐受性。
结果
该Ib期研究显示多次皮下注射在120mg Captisol中的0.5、1或2.5mg剂量的化合物1是安全的，并且被较好的耐受。
实施例10.检测SLE患者和健康对照者血清中针对肽Ia、IIa和IIIa的抗 体，和抗-1616Id抗体
对人类SLE患者(32个患者)进行取血，并且通过ELISA测试他们的血清与肽Ia，IIa和IIIa，对照肽p195-212(描述于PCT公开号WO94/00148中的myasthogenic肽)或mAb 5G12结合的能力。
抗体的检测在板上进行2小时，所述板包被有10μg/ml的在PBS中的肽Ia、IIa、IIIa、p195-212或mAb 5G12，用在PBS中的1％的卵清蛋白洗涤和封闭另外2小时。封闭后，使用与过氧化物酶缀合的山羊抗-人IgG多克隆抗体，如PCT国际公开号96/30057的实施例2中所描述的那样继续ELISA。
如图7中显示，与健康对照者(肽Ia-健康的＝实心菱形；肽IIa-健康的＝闭合圆圈；肽IIIa-健康的＝倒空心三角形；5G12-健康的＝半封闭四方形)相比，SLE患者显示明显更高的抗体的水平，所述抗体与肽Ia(空心四方形)、IIa(空心菱形)、IIIa(空心圆圈)、或mAb 5G12(空心三角形)结合。当对患者或对照者的血清在包被有非相关的肽p195-212(p195-212-SLE＝闭合四方形；p195-212-健康的＝半封闭菱形)的板上进行测试时，不能观察到结合。这些结果说明整个抗体分子和基于CDR的肽在抗体滴度水平上的相关性。
实施例11.在存在人类16/6Id mAh和肽的情况下，来自SLE患者和健康 对照者的PBL的增殖
使用ficol梯度，从SLE患者或健康对照者的血液中分离外周血淋巴细胞(PBL)。此后，当取样品进行IL-2的测量时，在存在不同浓度的肽Ia，IIa或IIIa，或人类16/6Id mAb的情况下，将PBL温育24小时。分析继续进行共7天，在最后16小时，将3H-胸苷加入。通过读取参入细胞的DNA的放射性活度的量来检测增殖。
如在表14中所见，与健康对照者相比，取自SLE患者的较低比例的PBL与肽或16/6Id mAb反应。结果以反应者(34％在第一列)和实际患者的数量(32中的11，11/32)的百分比表示。
当在肽或16/6Id mAb存在情况下测定由PBL产生的IL-2的水平时，获得了相似的结果，如在下个实施例中所显示。
表14.在存在mAb 16/6Id和肽Ia-IIIa EMI 29.1的情况下来自SLE患者和健康对照者的PBL的增殖
Figure G04806987219960327D000631
实施例12.在存在人类mAb 16/6Id和肽的情况下，由SLE患者和健康对 照者的PBL产生IL-2
使用ficol梯度从SLE患者或健康对照者的血液中分离PBL，并且如实施例11对其进行温育。试验开始后24小时，移去50μl的样品，并且在存在IL-2敏感细胞(CTLD)情况下温育24小时，其后加入3H-胸苷16小时，收获这些板并且在β-计数器上计数。
如在表14中，从表15中还可见当与健康对照者相比时，较低比例的取自SLE患者的PBL与所述肽或16/6Id mAb反应，因此说明对肽的应答与患者的T细胞对病原性人类自身抗体的应答一致
表15.在存在mAb 16/6Id和肽Ia-IIIa的情况下由SLE患者和健康对照者的PBL产生
Figure G04806987219960327D000632
实施例13.
人类hCDR1和hCDR3的合成
人类hCDR1(SEQ ID NO：6)和hCDR3(SEQ ID NO：7)显示于下。
GYYWSWIRQPPGKGEEWIG(hCDR1)
YYCARGLLRGGWNDVDYYGMDV(hCDR3)
基本上如所述，通过使用制造厂商关于t-丁氧基羰基(t-Boc)、芴基甲氧基羰基(Fmoc)的方案或其它α-氨基酸保护基团的方法用自动合成仪通过化学固相或液相合成按照本领域已知的方法制备所述肽(见，例如，Peptides：Synthesis，Structure and Applications，B.Gutte编辑，AcademicPress，1995；Peptide Synthesis Protocols，M.Pennington和B.Dunn编辑，Humana Press，1994；Schnolzer M.等，In situ neutralization in Bocchemistrysolid phase peptide synthesis.Rapid，high yield assembly of difficultsequences.Int.J.Pept.Protein Res.40：180-193，1992)。
实施例14
肽hCDR1和hCDR3抑制SLE患者的PBL针对人类16/6Id mAb的增殖 性应答
具有SLE的62个患者，9个男性(14.5％)和53个女性(85.5％)参与了这项研究。诊断时的平均年龄是32.95±12.92(12-61范围)岁，并且平均跟踪时期是10.98±10.76年(1-32范围)。所有的患者满足至少4个美国Rheumatology大学(ACR)修正的SLE的的诊断标准(Tan E.M.等，ArthritisRheum 25：1271-77(1982))。患者从三个以色列医疗中心(Kaplan，Rehovot；Ichilov，Tel Aviv；Asaf-Harofeh，Rishon Lezion)招募。按照SLEDAI狼疮活性指数来确定疾病活动性(Bombardier C.等，Arthritis Rheum 35：630-40(1992))。一个对照组的36个性别-和年龄-匹配的健康对照志愿者与SLE患者一起进行研究。本研究由Ethical医疗中心委员会批准。
感兴趣的是研究调查基于人类16/6Id mAb的CDR1和CDR3的hCDR1和hCDR3肽是否能抑制SLE患者的PBL对人类16/6Id mAb的特异增殖性应答。出于这个目的，我们首先不得不鉴定其PBL能够被人类16/6Id mAb刺激增殖的患者(反应者)。
因此，在存在人类16/6Id的情况下，培养62个连续SLE患者的PBL并且确定它们的增殖应答和分泌IL-2的能力。测试的总共62个SLE患者中的24个的PBL(39％)和总共55个SLE患者中的23个的PBL(42％)分别通过增殖(SI≥2，范围2-5.6)和IL-2分泌(SI≥2，范围2-60)作出反应。在SLE患者组中的反应者的频率要低于作为对照测试的健康供体组中观察的频率。因此，总共36个健康供者中的21个(58％)的PBL通过增殖对16/6Id作出反应。对于对16/6Id作出反应的SLE患者和健康对照者来说，增殖的程度(SI水平)是相似的。但是，如图8所显示，在与SLE患者相比更高的16/6Id浓度上，观察到了对照供者的PBL的对16/6Id的最佳反应。
在对16/6Id作出反应的SLE患者和患者的非反应者组中的性别和年龄之间不能显示差异。但是，响应于16/6Id的PBL增殖的患者不舒服的时间周期要更短(对于反应者和非-反应者，分别是平均9.78±8.36对11.73±12.06年；p≤0.036)。表16总结了SLE患者的16/6Id反应者和非反应者组的临床特性。如在表中可见的，在大多数SLE相关临床表现形式中，两个组都是相似的。在两个组中，SLE疾病活动性评分(SLEDAI)和SLE诊断标准的数量也是相似的。然而，与非-反应者组相比，在患者的反应者组中记录了更高频率的神经(发作和精神病)以及血液学牵涉和较低比率的肾牵涉。但是，可能是由于在相应的亚组中的患者的低数量，上述差异并没有达到统计显著性。而且，在研究的时候，在用类固醇或细胞毒性试剂治疗的那些之间确定了相对较少的反应患者。值得注意的是，没有接受类固醇的患者中，对16/6Id作出反应的明显要比非反应者组多(54％对21％；P＝0.023)。
值得注意的是，基于CDR的肽抑制健康供者PBL对16/6Id增殖性应答的功效比在SLE患者的PBL中观察到的要低得多(没有显示)。
表16.SLE患者的临床和实验室特性
A：诊断标准*
                所有患者        反应者        非-反应者
患者的数量(％)  62(100)         24(39)        38(61)
颊皮疹          19/62(30.1)     8/24(33.3)    11/38(29)
盘形皮疹        9/62(15)         3/24(12.5)        6/38(16)
光敏感性        21/62(34)        9/24(37.5)        12/38(32)
黏膜溃疡        17/62(27.4)      8/24(33.3)        9/38(23.7)
关节炎          46/62(74.2)      19/24(79.2)       27/38(71)
浆膜炎          14/62(22.6)      5/24(20.8)        9/38(23.7)
神经疾病
Figure 10003_68
      5/62(8.1)        4/24(16.7)        1/38(2.7)
肾疾病
Figure 10003_69
        24/62(38.8)      7/24(29.2)        17/38(44.8)
血液疾病
Figure 10003_70
      44/62(71)        19/24(79.2)       25/38(65.8)
ANA             61/62(98.4)      24/24(100)        37/38(92.1)
A-dsDNA         54/62(87.1)      19/24(79.2)       35/38(92.1)
APLA            35/62(56.5)      12/24(50.0)       23/38(60.53)
B：疾病活动性
SLEDAI评分      6.65±5.12       7.29±1.06        6.24±0.84
ACR诊断标准的   5.44±1.39       5.54±0.33        5.34±0.2
数量
C：目前治疗方法
NSAIDS          17/62(27.4)      6/24(25)          11/38(29)
抗疟药
Figure 10003_71
        37/62(59.7)      15/24(62.5)       22/38(57.9)
类固醇        33/62(53.2)      11/24(45.8)       22/38(57.9)
细胞毒性的    10/62(16.1)      2/24(8.3)         8/38(21)
*按照ACR修正标准定义临床表现。分别通过Hep2细胞和Crithidia luciliae来确定抗核抗体(ANA)和抗-dsDNA抗体。在如下分析的一个或多个中：假阳性VDRL、狼疮抗-凝血剂(LAC)或抗心磷脂抗体的ELISA，将抗-磷脂抗体(APLA)定义为活性。
Figure 10003_74
以200-400mg/天的剂量使用抗疟药试剂，羟氯喹；将类固醇治疗限定为每日剂量：5mg的泼尼松；使用的细胞毒性试剂是环磷酰胺(0.75-1.0g/m2；每月一次)或硫唑嘌呤(100-150mg/天)。
Figure 10003_75
观察在反应者和非反应者SLE患者的两组之间关于差异的趋势的参数。
为了测试肽hCDR1和hCDR3抑制SLE患者的PBL对人类16/6IdmAb的增殖性应答的能力，在存在或缺乏肽hCDR1和hCDR3的情况(50或100μg/孔)下，以不同的浓度(0.1-20μg/孔)的人类16/6Id mAb对SLE患者的PBL(2×105/孔)进行体外刺激，重复三次。温育6天后，将3H-胸苷(0.5μCi的5Ci/mmol)加入每个孔中，再温育18小时。然后收获细胞，使用β-计数器来计算放射性活度。将结果表示为三次重复培养的平均每分钟的计数(cpm)。然后计算刺激指数(在16/6Id的最佳浓度上的平均cpm与没有16/6Id的平均cpm的比率)。认为刺激指数(SI)≥2为阳性。
发现总共62个SLE患者中的24个(39％)的PBL针对16/6Id mAb增殖。在19个反应者SLE患者的PBL上测试肽hCDR1和hCDR3抑制对16/6Id自身抗体的整个分子的增殖性应答的能力。
表17显示这些实验的结果。认为增殖能力的超过50％的抑制是阳性的。该表表示了每个肽的最高阳性抑制能力。可见人类hCDR1和hCDR3分别抑制了19个测试的反应者中16/19(84.2％)和15/19(78.9％)的PBL的增殖。两个肽都抑制了测试的反应者的18/19(95％)的PBL的增殖。还可见在该表中，对于两个肽而言，抑制的量是相似的。因此可以得出结论，基于人类16/6Id mAb的CDR1和CDR3的肽是SLE患者的PBL对人类16/6Id mAb的增殖的有效抑制剂。
表17
肽hCDR1和hCDR3对SLE患者的PBL的增殖的抑制
数量          抑制百分比
            hCDR1    hCDR3
1.          62       ＜50
2.          70       75
3.          69       ＜50
4.          ＜50     ＜50
5.          88.5     87.5
6.          80       80
7.          76       70.4
8.          58       56
9.          69.5     65
10.            68.2          71.8
11.            ＜50          72
12.            82            86
13.            63            64
14.            56            74
15.            63            69
16.            ＜50          68
17.            70.5          77.8
18.            51.5          ＜50
19.            63            60.8
平均值±SD    68.12±9.57    71.82±8.44
实施例15
hCDR1和hCDR3的抑制能力的特异性
重要的是证明基于hCDR的肽的抑制效应是特异于SLE关联的应答。出于这个目的，将肽hCDR1或hCDR3加入用促细胞分裂原植物凝集素(PHA，2μg/ml)刺激的SLE患者的PBL的培养物中。用一个SLE患者的PBL进行的这样的实验的结果显示于图9中。肽hCDR1和hCDR3不能抑制针对促细胞分裂原PHA的PBL的增殖性应答(以cpm表示)，并且在缺乏(黑柱)或存在hCDR1或hCDR3的情况下，所述增殖性应答是高度相似的。
在另一个实施方案中，用人类16/6Id mAb刺激SLE患者的PBL培养物，然后用人类hCDR1或hCDR3肽或用作对照的IIIa肽温育。用一个SLE患者的PBL进行的这样的实验的结果显示于图10中。如在图10中所显示的，其中基于人类自身抗体的肽hCDR1和hCDR3均有效抑制PBL针对人类16/6Id mAb的增殖性应答，基于鼠抗体的CDR3的mCDR3肽(即IIIa肽)没有抑制增殖。
将两个另外的对照肽用于这些实验中，也就是在Ia和IIIa肽的反向顺序上合成的肽，并且该结果显示于图11中。可见两个反向肽未能显著抑制SLE患者的PBL针对人类16/6Id mAb的增殖性应答而hCDR1和hCDR3肽确实有效抑制了增殖，这表明基于人类hCDR的肽对增殖的抑制是特异于所述肽和SLE关联的T细胞应答的。
实施例16
在存在肽hCDR1和hCDR3情况下，SLE患者的PBL的IL-2的分泌的下 调
感兴趣的是发现在用人类16/6Id mAb刺激后，hCDR肽是否能抑制SLE患者的PBL的IL-2的分泌。这样的抑制还可能提示基于人类CDR的肽至少部分通过下调IL-2的分泌来抑制针对16/6Id mAb的增殖性应答。出于这个目的，将SLE患者的PBL用人类16/6Id mAb在缺乏或存在肽hCDR1或hCDR3的情况下进行温育。温育48小时后，收集所述培养物的上清液。使用CTLL IL-2依赖系进行确定上清液中IL-2的水平的分析。简而言之，在存在不同上清液的情况下，将CTLL系细胞(2×104/孔)温育24小时，随后添加3H-胸苷再进行18个小时的温育时期。然后收获细胞，使用β-计数器计算放射性活度。基于用作标准的重组人类IL-2计算结果。检测了肽抑制由人16/6Id刺激的23个应答者PBL的IL-2分泌的能力。归纳于表18中的结果显示hCDR1和hCDR3分别抑制了21/23和19/23患者的PBL的IL-2的分泌。PBL的增殖性应答的抑制与基于CDR的肽的IL-2的抑制直接相关。因此，在所有的测定增殖的抑制的情况中，观察到了IL-2分泌的抑制。
在图12中表示的用一个SLE患者的PBL获得的结果(IL-2的分泌以pg/ml表示)显示hCDR1和hCDR3都100％抑制了由人类16/6Id mAb引发的SLE患者的PBL的IL-2分泌。
表18.hCDR1和hCDR3的IL-2分泌的抑制
*在单独存在16/6Id的情况下将IL-2的分泌视是100％。将50％或更多的抑制视为显著。
实施例17
基于CDR的肽对免疫抑制细胞因子TGF-β的分泌的上调
在阐明基于人类CDR的肽抑制针对人类单克隆抗-DNA16/6Id抗体的增殖性应答机制的尝试中，确定了在细胞培养物的上清液中的免疫抑制细胞因子TGF-β的水平。这些实验的基本原理是基于以前在用基于小鼠CDR的肽处理后，我们发现具有SLE的小鼠的脾细胞的培养物中提高水平的TGF-β，所述小鼠的SLE是用人类抗-DNA16/6Id mAb诱导的或是自发产生的{(NZBxNZW)F1小鼠}(Eilat，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98，1148(2001))。TGF-β水平的提高与在被处理的小鼠中的疾病表现形式的改善相关。
出于这个目的，在缺乏或存在肽hCDR1或hCDR3情况下，在用人类16/6Id mAb温育48小时后，将上清液从各种SLE患者的PBL的培养物中去除。按照制造厂商的指导，通过ELISA来确定TGF-β。简而言之，用稀释在PBS中的重组人类TGFβsRII/Fc嵌合体(R&D系统)(100ng/ml)包被Maxisorb板(Nunc)。封闭后，加入细胞上清液。在温育18小时后，加入检测的生物素化的抗-人类TGF-β抗体(R&D系统)。使用的底物溶液是TMB显色试剂(helix Diagnostics)并且使用570nm和630nm的滤器通过MRXELISA读数器来评估酶活性。将结果归纳于表19中。
在图13中显示的结果表明肽hCDR1和hCDR3引发了一个典型SLE患者的PBL的显著的TGF-β的分泌(以pg/ml表示)的上调，所述SLE患者是用人类病原性16/6Id mAb刺激的。
                          表19
hCDR1和hCDR3肽对用16/6Id诱导刺激的SLE患者的PBL的TGF-β分泌的上调
Figure G04806987219960327D000711
将在单独存在16/6Id(平均63625pg/ml)的情况下的分泌视为100％。将结果表示为超出在单独存在16/6Id情况下的分泌百分比。
实施例18
MMP-9(但不是MMP-2)的活性在SLE患者血清中的提高
在这个实施例中，我们在具有SLE的40个患者的血清中确定MMP-9和MMP-2的水平，并且我们证明了与健康对照者相比，MMP-9但不是MMP-2的活性在SLE患者的血清中显著提高。高MMP-9的活性与盘状风疹、雷诺现象、肺炎、粘膜溃疡和抗磷脂抗体(APLA)的存在相关。此外，提高水平的MMP-9与男性患者组中的SLE活动性相关。
材料与方法
患者.具有SLE的40个患者，32个女性和8个男性参与了这项研究。所有的患者显示至少4个美国Rheumatism大学(ACR)诊断SLE的修正诊断标准(Winchester RJ.Systemic lupus erythematosus pathogenesis.In：Koopman WJ，ed.Birmingham.Alabama：William和Wilkins，1361-91页(1996))。25个性别和年龄匹配的健康志愿者在我们的研究中作为对照组。诊断时，患者的平均年龄是29±9.7(范围15-48)岁，并且平均跟踪周期是11±10(范围1-32)年。按照SLEDAI狼疮活性指数(Bombardier等，1992)和BILAG指数确定疾病活性(Hay E.M.等，Q.J.Med.86：447-58(1993))。本研究通过Kaplan医疗中心，Rehovot，Israel的伦理委员会批准。通过活性测定试剂盒测量MMP-2和MMP-9。按照制造厂商的说明书通过特异性Biotrak MMP-2或MMP-9活性测定试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech UK Limited，UK)测量MMP-2和MMP-9的活性。对于MMP-2和MMP-9活性的测定，分别将血清稀释到1∶100和1∶32。将适当的标准物加入每次测定中。为了测量MMPs的总含量，使用p-氨基苯基汞乙酸酯(APMA)进行MMPs的原形式的活化。
通过凝胶信号识别蛋白体的受体测量MMP-2和MMP-9的活性。
通过凝胶信号识别蛋白体的受体测量MMP-2和MMP-9的活性。通过用1mg/ml白明胶聚合的8％SDS-PAGE凝胶来分离5μl的血清样品。凝胶在2.5％Triton X-100中洗涤一次，洗涤30分钟以去除SDS，并且在包含50mM的Tris-HCl，200mM的NaCl，10mM的CaCl2和0.02％(w/v)的Brij35(pH7.5)的反应缓冲液中洗涤一次，30分钟。将反应缓冲液换成新鲜的，并且将凝胶在37℃温育24小时。通过用0.5％的考马斯亮蓝对凝胶染色来显现液化明胶的活性，并且通过光密度测量法来进行定量。统计分析.使用x2测验法或Fisher精确检验、不成对的t-检验和两尾的p-值来计算数据。还使用了Pearson、Spearman和多变量分析。
实施例18(i)
在SLE中MMP-9而非MMP-2的活性得以提高
如上所述和在PCT国际公开号WO02/067848中，显示MMP-9在一些自身免疫病以及SLE的动物模型中被涉及。因此，我们有兴趣研究MMP-9是否也在SLE患者的血清中升高。出于这个目的，通过凝胶信号识别蛋白体的受体，我们调查了40个SLE患者和25个健康对照者的血清，其中MMP-9和MMP-2的活性都可以显现。典型的凝胶显示于图14中。如在该图中可见的，与健康对照者比较，SLE患者的血清中的MMP-9的水平升高。40个SLE患者和25个健康对照者的酶谱的光密度分析显示SLE患者的平均MMP-9活性是109±5.6光密度测量单位，以及健康对照者的平均MMP-9活性是76.5±4.2光密度测量单位(p＝0.0001)。认为上述85个光密度测量单位的活性值(健康对照者的平均值+2s.e.)为高。该结果表示了在68％的SLE患者中的MMP-9的高活性水平。仅有3％的健康对照者显示高MMP-9活性(P＝0.001)。在相同血清样品中的MMP-2水平的光密度分析显示在SLE患者的血清和健康对照者的血清之间的MMP-2活性差异并不明显。因此测定的健康对照者和SLE患者的值分别是109±7和123±5(平均活性光密度测量单位±s.e.)(P＝0.0531)。为了进一步对血清中的MMP-9和MMP-2的活性水平进行定量，我们使用了活性测定试剂盒。
图15显示与健康对照者的血清相比，在SLE患者血清中的MMP-9的活性升高了三倍，并且这种升高具有统计显著性(P＝0.0302)。与此相反地，在两组之间的MMP-2的水平的差异是不显著的(P＝0.1254)。
由于我们，以及其他人(Ebihara I.等，Am J Kidney Dis 32：544-50(1998)；Ebihara I.等，Nephron 83：169(1999)发现在非-SLE慢性肾衰竭(例如，糖尿病、高血压)的病人血清中的高MMP-9水平可能是由于酶的保持力，我们分析了在MMP-9的水平和测试的SLE患者组的肾功能之间的相关性。在肌酐水平和MMP-9水平之间没有观察到相关性(r2＝0.01)，这说明由于肾损伤，在SLE患者中MMP-9水平的提高不是酶保持力的结果。
实施例18(ii)
MMP-9活性与临床和实验室参数之间的相关性
SLE患者血清中的MMP-9活性水平的提高促使我们寻找在临床和实验室参数与血清MMP-9水平之间可能的相关性。通过调查对于每个临床表现形式具有高和正常MMP-9水平的许多患者(表20)，以及通过考虑具有或不具有某种临床症状的患者的MMP-9的实际平均活性水平来进行统计分析(x2测验法或Fisher精确检验)。通过两种分析的结果是相似的。值得注意的是对于所有的临床症状而言，具有提高的MMP-9水平的患者百分比比在健康对照者组的要高得多。MMP-9的水平与性别、疾病的持续时间或其发作的年龄没有相关性(Pearson，Spearman)。
按照SLE患者的MMP-9活性水平(更低或等于健康对照者＝正常)，表20显示他们的临床和实验室特性。高水平的MMP-9与雷诺现象(P＝0.0138)和APLA(P＝0.041)的存在明显相关。可以观察到与肺炎、盘状皮疹、神经疾病和粘膜溃疡的强烈相关性。但是，具有后者表现形式的患者数量太少以至于不能进行统计分析。多元分析揭示雷诺现象和低补体水平(C3，C4)与高MMP-9水平明确具有相关性(分别是P＝0.0001和0.0137)。与此相反地，光敏感性、关节炎和血液疾病与MMP-9活性水平没有相关性(分别是P＝0.0381，0.0014和0.0065)。
表20
按照他们的MMP-9水平具有高和正常MMP-9活性的SLE患者的临床特性
                             MMP-9水平(％)
                             高        正常
患者的数量(％)    40(100)    27(68)    13(32)
光敏感性          13         8(62)     5(38)
粘膜溃疡          9          8(89)     1(11)
颊风疹            9          7(78)     2(22)
盘状风疹          5          5(100)    0(0)
雷诺现象          8          8(100)    0(0)
脉管炎            18         14(78)    4(22)
关节炎            31         21(68)    10(32)
浆膜炎            9          7(78)     2(22)
肺炎              4          4(100)    0(0)
神经疾病          4          4(100)    0(0)
肾疾病            16         11(69)    5(31)
血液疾病          29         18(62)    11(38)
ANA               40         27(68)    13(32)
ads-DNA           36         24(67)    12(33)
APLA              25         20(80)    5(20)
低补体(C3，C4)    30         21(70)    9(30)
按照ACR修订标准(Winchester，1996)来定义临床牵涉。通过分别使用Hep2细胞和Crithidia lucilie来确定抗-核抗体(ANA)和抗-dsDNA抗体。将抗磷脂抗体(APLA)限定为关于一个或多个如下试验的反应性：假阳性VDR、狼疮抗-凝血剂(LAC)或抗心磷脂抗体的ELISA。
我们还期待在男性患者(图16A)和女性患者(图16B)中SLEDAI和MMP-9活性之间的可能相关性。有趣的是，对于男性而言，相关系数是明显的和正的(r2＝0.6333)，但是对于女性而言则是可忽略的和负的(r2＝0.0571)。使用BILAG评分系统获得了相似的结果。因此，对于男性而言，观察到了在MMP-9活性和BILAG得分之间的正相关系数(r2＝0.6442)，而对于女性而言，则观察到可忽略的相关系数。
确定根据患者的各种治疗方法的应用与MMP-9活性之间是否存在相关性也是令人感兴趣的。如在表21(A)中可见的，在对患者目前的治疗方法和MMP-9活性之间没有明显的相关性。但是，当在患者的疾病过程中任何时候观察对他们的治疗方法(表21(B))时，高MMP-9水平与细胞毒性试剂的使用相关(82％)
表21
按照患者的MMP-9水平对SLE患者的治疗方法
                患者总数          MMP-9水平(％)
                                高           正常
A.目前的治疗方
法
细胞毒性试剂    8               6(75)        2(25)
类固醇          23              17(74)       6(26)
抗疟药          21              14(67)       7(33)
NSAID           7               5(71)        2(29)
B.根据跟踪时期
的治疗方法
细胞毒性试剂    17              14(82)       3(18)
类固醇          29              19(66)       10(34)
抗疟药          26              16(62)       10(38)
NSAID           18              12(67)       6(33)
以200-400mg/天的剂量使用抗疟药试剂，羟氯喹；将类固醇治疗限定为每日剂量≥mg的泼尼松；使用的细胞毒性试剂是环磷酰胺(0.5-1.0g/m2；每月一次)或硫唑嘌呤(100-150mg/天)。
实施例18(iii)
在不同时间点，取自个体SLE患者的血清样品中的MMP-9活性的变化
由于疾病活性随时间变化，我们测量了在跟踪的4-6年中取样的个体患者血清中的MMP-9和MMP-2活性水平。分析了取自不同时间点的9个患者的血清。患者和健康对照者之间的MMP-2水平没有明显变化。在测试的9个患者的其中5个中，可以观察到个体患者的血清样品中的MMP-9活性随时间变化。2个典型SLE患者的结果显示于图17A-B。如可观察到的，MMP-9活性而不是MMP-2的活性在相同患者中随时间已经发生变化。这些变化与通过SLEDAI或BILAG系统确定的疾病活动性指数是没有关联的。在不同取样时间点取的5个健康对照者血清样品中没有检测到MMP-9活性的变化(数据没有显示)。在4个其它的SLE患者中，没有观察到MMP-9或MMP-2活性随时间的实质变化，并且取决于个体患者，MMP-9活性水平保持高或低。
讨论
本研究首次阐明MMP-9涉及人类SLE。我们显示与健康对照者相比，是MMP-9而不是MMP-2的活性在68％的SLE患者中有明显升高。高MMP-9水平与雷诺现象、肺炎、神经疾病、盘状风疹和APLA的存在相关。在相同患者的疾病不同时期的血清中观察到了MMP-9活性的变化。在女性患者中，MMP-9活性水平与疾病活动性指数(SLEDAI，BILAG)没有相关性，但是在男性患者组中与SLE活动性具有相关性。
本研究显示MMP-2的活性水平在SLE患者的血清中没有明显升高。这些结果与那些以前报道的(Zucker，S.J Rheumatol.26，78(1999))在SLE中MMP-2的水平没有升高是一致的。MMP-2的水平在其它病理条件下(象视神经炎和多发性硬化)也是基本的和没有变化的，在所述其它病理条件中，与健康对照者相比MMP-9的水平是相对升高的(Gijbels K等，J.Neuroimmunol.41：29-34(1992).；Paemen，L.等，Eur.J.Neurol.1：55-63(1994))。
另外的MMP，即MMP-3也被提出涉及SLE的发病机理，因为在具有SLE的患者的血清中，其明显增加(Kotajima，L等，Clin.Exp.Rheum.16：409-415(1998))。显示在本实施例中的具有升高的MMP-9活性的SLE患者的频率(68％)与以前报道的在SLE(76％)和RA(82％)患者中的高MMP-3水平的频率是相似的。而且，显示MMP-3的转录物在(NZBxNZW)F1小鼠中，随肾炎进展明显增加。(Nakamura，T.等，Clin.Sci.85：295-301(1993))。
SLE患者血清中升高的MMPs的起因尚不清楚。已经显示MMP-9是由外周血细胞诸如T细胞、中性白细胞和巨噬细胞分泌的(对于评论，见Goetzl，E.J.等，J.Immunol.156：1-4(1996))。没有发现患者中MMP-9活性水平和外周血细胞数量具有相关性的事实可提示MMP-9不是由外周血免疫细胞分泌而是由SLE-侵袭的器官象肾或肺/胸膜分泌的。具有肺炎的所有SLE患者显示了高MMP-9活性水平的观察可表明患病的肺作为高MMP-9水平的来源。而且细胞毒疗法与血清中高水平的MMP-9的关联也可支持患病器官是SLE患者中MMP-9活性来源的观点，所述细胞毒疗法表示SLE相关的器官损伤严重性。但是，较少外周血淋巴细胞分泌较高活性水平的MMP-9的可能性仍旧存在。
显示TNF-α和IL-1在人类疾病(Dean G.S.等，Ann Rheum Dis 59：243-51(2000))和鼠模型(Segal R.等，J.Immunol 158：3009-16(1997)；Theofilopoulos A.N.等，Ann Rheum Dis 58(suppl)：149-55(1999)；Eilat等，2001)的SLE的发病机制中具有重要作用。已经显示在一些系统中，这些细胞因子诱导MMP-9的产生(Guedez，L.等，Crit.Rev.Oncogenesis 7：205-225(1996))，并且因此有可能后者MMPs的诱导是这些细胞因子在SLE中病原效应的部分。已经报道了由健康个体的外周血单核细胞自发分泌的MMP-9的水平在接触TNF-α和IL-1β后被上调(Saren P.等，JImmunol 157：4159-65(1996))。此外，通过裂解膜结合形式，T细胞和巨噬细胞的MMPs都促进了TNF-α的分泌(Gearing A.J.H.等，Nature370：555-7(1994))。因此，这些实施例证明了MMP在促炎细胞因子上的相互调节作用，并且反之亦然。但是，在跟踪过程中，在一些患者的血清中，MMP-9的活性水平保持在正常范围内，而在大多数患者血清中测量到了高活性水平的MMP-9的事实可表明遗传因子涉及后者的调节。
本文的结果指出MMP-9在SLE的发病机理中可起作用，并且当监控用干扰MMP-9活性的药物治疗的患者时，对这种金属蛋白酶的血浆/血清活性水平的测量可以提供重要信息。

Claims (46)

1.一种药物组合物，其包括：
水性载体；
0.1mg/ml-20mg/ml的肽的药用盐的组合物，
所述肽的氨基酸序列为X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG(SEQ ID NO：16)
其中X33是甘氨酸；X34是精氨酸或赖氨酸；X35是脯氨酸；X36是甘氨酸；X37是赖氨酸；和X38是谷氨酸；和
溶解度增强剂，其为七取代的磺基丁基醚β-环糊精，
其中所述肽和溶解度增强剂都溶解在水性载体中；和
其中所述组合物具有介于4-9之间的pH；
其中所述药物组合物用于治疗人类受试者的SLE。
2.权利要求1的药物组合物，其中至少0.5mg/ml的组合物是所述肽的药用盐。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中所述肽的氨基酸序列为：
NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp IleGly-COOH(SEQ ID NO：6)。
4.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中肽在溶液中的浓度至少是1mg/ml。
5.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中肽在溶液中的浓度至少是2.5mg/ml。
6.权利要求1-5任一项的药物组合物，其中所述组合物具有介于6.5和8.5之间的pH。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述组合物具有介于7.5和8.5之间的pH。
8.权利要求1-7任一项的药物组合物，其中药用盐是乙酸盐。
9.权利要求1-8任一项的药物组合物在制备用于缓和人类受试者系统性红斑狼疮(SLE)症状的药物中的应用。
10.一种制备权利要求1-8任一项的药物组合物的方法，其包括如下步骤：
a)以预定浓度在水性载体中制备七取代的磺基丁基醚β-环糊精的溶液，
b)加入预定量的肽的药用盐，
所述肽的氨基酸序列为X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG(SEQID NO：16)
其中X33是甘氨酸；X34是精氨酸或赖氨酸；X35是脯氨酸；X36是甘氨酸；X37是赖氨酸；和X38是谷氨酸；
c)调节步骤b)的溶液的pH直到所述肽溶解在溶液中；和
d)如果必要，调节步骤c)的溶液的pH到4-9，由此制备所述药物组合物。
11.权利要求10的方法，其中肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度至少是0.1mg/ml的量。
12.权利要求10的方法，其中肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度至少是0.5mg/ml的量。
13.权利要求10的方法，其中肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度是2.5mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml或0.1mg/ml的量。
14.权利要求10-13任一项的方法，其中步骤b)还包括混合溶液1小时。
15.权利要求10-14任一项的方法，其中在步骤c)中，使用HCl或NaOH 1.0N调节pH。
16.权利要求11-15任一项的方法，其还包括通过乙酸纤维素滤器过滤步骤d)的溶液。
17.权利要求10的方法，其中
肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度是2.5mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml或0.1mg/ml的量；
步骤b)还包括混合溶液1小时；和
在步骤c)中，使用HCl或NaOH 1.0N来调节pH，
还包括经过乙酸纤维素滤器来过滤步骤d)的溶液。
18.通过权利要求10-17的任一项的方法制备的组合物。
19.一种冷冻干燥的药物组合物，其包括0.1mg/ml-20mg/ml的肽的药用盐的组合物：
所述肽的氨基酸序列为X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG(SEQ IDNO：16)
其中X33是甘氨酸；X34是精氨酸或赖氨酸；X35是脯氨酸；X36是甘氨酸；X37是赖氨酸；和X38是谷氨酸；和
溶解度增强剂，其为七取代的磺基丁基醚β-环糊精；
其中所述药物组合物用于治疗人类受试者中的SLE。
20.权利要求19的冷冻干燥的药物组合物，其中至少0.5mg/ml的组合物是所述肽的药用盐。
21.一种冷冻干燥权利要求1-8任一项的药物组合物的方法，其包括：
a)将药物组合物的温度降到-40℃；
b)在预定时间内保持温度在-40℃；
c)将溶液的温度升高到20℃；
d)在预定时间内保持温度在20℃；和
e)减小压力并且在预定时间内保持温度在20℃，由此冷冻干燥所述药物组合物。
22.权利要求21的方法，其中步骤a)在2小时内进行。
23.权利要求21的方法，其中步骤b)在3小时内进行。
24.权利要求21的方法，其中步骤c)进行13小时。
25.权利要求21的方法，其中步骤c)在110μbar的压力下进行。
26.权利要求21的方法，其中步骤d)进行13小时。
27.权利要求21的方法，其中步骤d)在110μbar的压力下进行。
28.权利要求21的方法，其中在步骤e)中，压力被减到10μbar。
29.权利要求21的方法，其中步骤e)进行5小时。
30.权利要求21的方法，其中
步骤a)在2个小时内进行；
步骤b)在3个小时内进行；
步骤c)进行13个小时，并且在110μbar压力下进行；
步骤d)进行13个小时并且在110μbar压力下进行；和
步骤e)进行5个小时并且压力被减到10μbar。
31.通过权利要求21-30任一项的方法制备的冷冻干燥的药物组合物。
32.一种冷冻干燥权利要求1-8任一项的药物组合物的方法，其包括如下步骤：
a)将药物组合物的温度降到-45℃；
b)在预定时间内保持温度在-45℃；
c)将所述溶液的温度升高到-20℃；
d)将所述溶液的温度升高到25℃；和
e)在预定时间内保持温度在25℃，由此冷冻干燥所述药物组合物。
33.权利要求32的方法，其中步骤a)在6小时内进行。
34.权利要求32的方法，其中步骤b)在3小时内进行。
35.权利要求32的方法，其中步骤c)进行19小时。
36.权利要求32的方法，其中步骤c)在150μbar的压力下进行。
37.权利要求32的方法，其中步骤d)进行13小时。
38.权利要求32的方法，其中步骤d)在150μbar的压力下进行。
39.权利要求32的方法，其中步骤e)进行8小时。
40.权利要求32的方法，其中步骤e)在150μbar的压力下进行。
41.权利要求32的方法，其中
步骤a)在6小时内进行；
步骤b)在3小时内进行；
步骤c)进行19小时并且在150μbar的压力下进行；
步骤d)进行13小时并且在150μbar的压力下进行；和
步骤e)进行8小时并且在150μbar的压力下进行。
42.通过权利要求32-41任一项的方法制备的冷冻干燥的药物组合物。
43.权利要求42的冷冻干燥的药物组合物，其中所述组合物的水含量少于5％。
44.权利要求43的冷冻干燥的药物组合物，其中所述组合物的水含量少于4.0％。
45.权利要求44的冷冻干燥的药物组合物，其中所述组合物的水含量少于3.5％。
46.一种包装的药物组合物，其包括：
包装材料；和
预定量的权利要求31或42的冷冻干燥的药物组合物。
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