CN102333789A - 抗单纯疱疹病毒抗体及其使用方法 - Google Patents

抗单纯疱疹病毒抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了特异性结合单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白D的抗体和多肽及所述抗体和多肽用于治疗或诊断HSV感染的用途。

Description

抗单纯疱疹病毒抗体及其使用方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2009年1月5日提交的美国专利申请流水号12/348,550的优先权，通过述及将其完整收入本文。
发明背景
单纯疱疹病毒(HSV)是疱疹病毒科的一个成员，其在人类中引起感染。HSV感染导致多种独特的医学病症，这取决于感染部位。口、面、手、和繁殖器中的感染一般不引起严重的并发症。然而，眼、中枢神经系统、和脑中的感染能危及生命。具有不成熟的或受遏制的免疫系统的患者(诸如新生儿、移植物接受者、和HIV携带者)倾向于来自HSV感染的严重并发症。
当前有数种办法来治疗HSV感染，包括抗病毒药疗和疫苗。然而，仍然需要开发预防或治疗HSV感染的药。
发明概述
本发明基于在抑制HSV繁殖中展现出高功效的人抗HSV抗体的鉴定。本发明的抗体结合HSV-1和HSV-2糖蛋白D(gD)上的构象表位。
在一个方面，本发明提供了一种分离的特异性结合单纯疱疹病毒-1(HSV-1)和单纯疱疹病毒-2(HSV-2)gD的抗体(例如人抗体)或多肽，其中该抗体或该多肽结合糖蛋白D上的构象表位，且该表位包含SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸Y38、D215、P221、和R222或gD上与SEQ IDNO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸Y38、D215、P221、和R222对应的氨基酸。在一些实施方案中，所述抗体结合SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222对应的氨基酸或与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222对应的氨基酸相互作用。
在另一个方面，本发明的特征在于一种特异性结合HSV的gD的抗体(例如一种特异性结合HSV-1和HSV-2的gD的抗体)。此抗体含有(1)分别包括与单链抗体scFv E317的VH(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的氨基酸3-124)和VL(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的氨基酸1-108)至少80％(例如至少85％、90％、95％、99％、或100％任一)相同的氨基酸序列的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，(2)包括与单链抗体scFv E425的VH(SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：3的氨基酸3-124)和VL(SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的氨基酸1-108)至少80％(例如至少85％、90％、95％、99％、或100％任一)相同的氨基酸序列的VH和VL，或(3)包括分别与单链抗体scFv Y571的VH(SEQ ID NO：41)和VL(SEQ ID NO：42)至少80％(例如至少85％、90％、95％、99％、或100％任一)相同的氨基酸序列的VH和VL。在一个例子中，本发明的抗HSV抗体含有scFv E317、scFv E425、或scFv Y571的所有互补决定区(CDR)。
本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含本文所述抗体(包括其抗原结合片段)或多肽和药学可接受载体。
本发明的另一个方面涉及一种分离的核酸，其包含编码本文所述抗体、该抗体的片段或区的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码任何上文所述VH和VL区的核酸。在一个例子中，此核酸包括编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的氨基酸3-124、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：2的氨基酸1-108、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：3的氨基酸3-124、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：4的氨基酸1-108、SEQ ID NO：41、或SEQ ID NO：42的核苷酸序列。优选地，所述核酸包括编码SEQ ID NO：1和2二者、编码SEQ ID NO：1的氨基酸3-124和SEQ ID NO：2的氨基酸1-108二者、编码SEQ ID NO：3和4二者、编码SEQ IDNO：3的氨基酸3-124和SEQ ID NO：4的氨基酸1-108二者、或编码SEQ IDNO：41和42二者的核苷酸序列。本发明还提供了一种载体(诸如表达载体)或一种宿主细胞，其包含一种或多种本文所述核酸。
本发明还提供了用于生成抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养生成该抗体或该片段的本文所述宿主细胞，并自该细胞培养物回收该抗体或该片段。哺乳动物细胞(诸如COS、HeLa、和CHO细胞)和非哺乳动物细胞(诸如大肠杆菌)和酵母可作为宿主细胞用于生成该抗体。
在又一个方面，本发明的特征在于一种用于治疗或预防HSV感染的方法，其通过对有此需要的受试者施用有效量的本发明抗体或其编码核酸来进行。所述抗体或所述核酸也可用于制造用于治疗HSV感染的药物。如本文中使用的，术语“治疗”指对感染有HSV或处于HSV感染的风险的受试者应用或施用包括一种或多种活性剂的组合物，目的是治愈(cure，heal)、减轻(alleviate，relieve)、改变(alter)、补救(remedy)、改善(ameliorate，improve)、或影响(affect)感染、感染的症状、或对感染的素因。如本文中使用的，“有效量”指单独的或与一种或多种其它活性剂组合的，每一种活性剂对受试者赋予治疗效果所需要的量。正如本领域技术人员公认的，有效量随施用路径、赋形剂选择、和与其它活性剂的共使用而变化。所述抗体可以在暴露于HSV(诸如HSV-1或HSV-2)之前或之后施用。
本发明的范围之内还有一种用上文所述抗HSV抗体在受试者中诊断HSV感染的方法。此方法包括(a)使所述抗体与自怀疑含有HSV病毒颗粒或蛋白的受试者获得的生物学样品接触，并(b)测定抗原抗体反应。检测出此类反应指示所述样品中存在HSV。
下文描述列出了本发明的一个或多个实施方案的详情。根据下面的对数个实施方案的详述及还根据所附权利要求，本发明的其它特征或优点会是显然的。
附图简述
图1显示了HSV1感染的SCID小鼠中通过剂量为1.5mpk、5mpk、或15mpk的多次mAb E317剂量施用免于HSV致死的保护的结果。mAb E317以五天间隔施用五次，始于病毒接种前24小时。
图2显示了HSV1感染的SCID小鼠中通过剂量为1.5mpk、5mpk、或15mpk的单次mAb E317注射免于HSV致死的保护的结果。mAb E317于病毒接种前24小时施用。
图3显示了HSV1感染的SCID小鼠中通过于病毒接种前24小时、病毒接种当天、或病毒接种后24小时15mpk的单次mAb E317注射免于HSV致死的保护的结果。
图4显示了经由免疫沉淀测定法，糖蛋白D(“gD”)中对于mAb E317的表位识别重要的区域的鉴定的结果。“+”指示检测出所述抗体对所述突变型gD的结合；“-”指示未检测出所述抗体对所述突变型gD的结合。
图5显示了经由免疫沉淀测定法，糖蛋白D(“gD”)中对于mAb E317的表位识别重要的氨基酸的鉴定的结果。“+”指示检测出所述抗体对所述突变型gD的结合；“-”指示未检测出所述抗体对所述突变型gD的结合。
发明详述
本发明提供了结合HSV-1和HSV-2糖蛋白D且中和HSV-1和HSV-2的抗体和多肽。这些抗体和多肽结合gD上的非线性构象表位，其中该表位包含SEQID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸D215、P221、和R222或gD上与SEQID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸D215、P221、和R222对应的氨基酸。在一些实施方案中，所述表位进一步包含氨基酸Y38或gD上与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示Y38对应的氨基酸。在一些实施方案中，所述抗体结合SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222对应的氨基酸或与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222对应的氨基酸相互作用。
一般认为HSV进入细胞要求gD与数种潜在进入受体之一相互作用：(a)疱疹病毒进入介导物(HVEM)，TNF受体家族的一个成员；(b)nectin-1，免疫球蛋白超家族的一个成员；和(c)3-O-硫酸化硫酸类肝素。参见Reske et al.，Rev.Med.Virol.17：205-215，2007。HSV-1gD是一种I型膜糖蛋白，由369个氨基酸组成，包括一个N端胞外域(316个氨基酸)。该蛋白质的胞外域核心是免疫球蛋白折叠的V样域(残基56-184)。在通向核心的N端延伸内，一个发夹结构(37个残基，于残基21处弯曲)形成接触受体HVEM的完整位点。在没有HVEM的情况中，N端采取延伸的且柔性的构象。不希望束缚于理论，本文所述抗体可结合gD中当gD的发夹结构形成时与N端序列相互作用的氨基酸，而且所述抗体对gD的结合可阻止发夹结构形成。已证明特异性结合gD此部分的抗体在体外和在体内在抑制HSV繁殖中展现出高功效。
本文所述抗体或多肽可具有一项或多项下述特征：(a)特异性结合HSV-1和HSV-2gD；(b)结合gD的非线性构象表位；(c)结合至少包括SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸D215、P221、和R222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸残基D215、P221、和R222对应的氨基酸的表位；(d)结合包括SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸Y38、D215、P221、和R222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸残基Y38、D215、P221、和R222对应的氨基酸的表位；(e)结合SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222对应的氨基酸或与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222对应的氨基酸相互作用；(f)所述抗体或多肽对gD的结合是二硫键依赖性的；(g)若SEQ ID NO：44或45中所示氨基酸224-240或gD上与SEQ ID NO：44或45中所示氨基酸224-240对应的氨基酸被删除的话，不结合gD；(h)若SEQ ID NO：44或45中所示氨基酸27-43或gD上与SEQ ID NO：44或45中所示氨基酸27-43对应的氨基酸被删除的话，不结合gD；(i)在噬斑减少测定法中在抑制HSV-1和/或HSV-2繁殖中具有介于约1nM至约10nM之间的IC50；和(j)在受试者中预防或治疗HSV感染。
HSV-1和HSV-2的不同株的糖蛋白D可具有氨基酸序列中的变异。下文显示了来自KOS(HSV-1的一种株)的gD(SEQ ID NO：44)和来自HG52(HSV-2的一种株)的gD(SEQ ID NO：45)的氨基酸序列比对。本领域技术人员能容易地鉴定糖蛋白D中与SEQ ID NO：44或45中所示位置对应的氨基酸残基。
                10        20        30        40        50
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gD-HG52RLPHIRDDDAPPSHQPLFY  (SEQ ID NO：45)
术语“抗体”意图包括完整的天然存在抗体及其片段(例如Fab和F(ab’)2)和遗传修饰抗体(例如scFv抗体、嵌合抗体、双抗体、和双可变域免疫球蛋白)。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。
“分离的”分子或材料(例如抗体和核酸)指已经鉴定且与/自其天然环境的成分分开和/或回收的分子或材料。在一些实施方案中，该分子或材料是纯化的。例如，该材料可以是至少90％纯的(即不含污染物)、至少95％纯的、或至少99％纯的。
除非上下文另有明确说明，如本文中和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“所述/该”包括复数所指物。要理解，本文所述发明的各方面和变型包括“由...组成”和/或“基本上由...组成”的各方面和变型。
本文中还公开了特异性结合单纯疱疹病毒1(HSV-1)和单纯疱疹病毒2(HSV-2)二者(特别是它们的糖蛋白D)的人抗体，例如E317、E425和Y571。
E317抗体含有：VH片段，其或其一部分具有SEQ ID NO：1的残基3-124中所示氨基酸序列；和VL片段，其或其一部分具有SEQ ID NO：2的残基1-108中所示氨基酸序列。下文显示了这两种氨基酸序列：
E317VH片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
MAQVTLKQSGAEVKKPGSSVKVSCTASGGTLRTYGVSWVRQAPGQGLEWLGRTIPLFGKTDYAQKFQGRVTITADKSMDTSFMELTSLTSEDTAVYYCARDLTTLTSYNWWDLWGQGTLVTVSS
[*上文序列中标有下划线的区指互补决定区(CDR)。]
E317VL片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSQLAWYQQKPGQAPRLLISG ASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPTFGGGTKVEIKRAA
[*上文序列中标有下划线的区指CDR。]
E425抗体含有：VH片段，其或其一部分具有SEQ ID NO：3的残基3-124中所示氨基酸序列；和VL片段，其或其一部分具有SEQ ID NO：4的残基1-108中所示氨基酸序列。下文显示了这两种序列：
E425VH片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)
MAQVQLQQSGAGVKKPGSSVRVSCSASGGTLRTYALSWVRQVPGQGFEWMGRIIPMFGKTDYAQKFQGRLSITADKSMDTGFMELTSLTSEDTAVYYCARDLTTLT SYNWLDIWGQGTLVTVSS
[*上文序列中标有下划线的区指CDR。]
E425VL片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)
ETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQKKPGQAPRLLIYG ASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTINRLEPEDFAVYYCQQYGRSPTFGQGTKVEIKRAA
[*上文序列中标有下划线的区指CDR。]
Y571抗体含有：VH片段，其或其一部分具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列；和VL片段，其或其一部分具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列。下文显示了这两种序列：
Y571VH片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：41)
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTLRTYGVSWVRQAPGQGLEWLGGTIPLFGKTDYAQKFQGRVTITADKSMDTSFMELTSLTSEDTAVYYCARD LTTLTSYNWWDLWGQGTLVTVSS
[*上文序列中标有下划线的区指CDR。]
Y571VL片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：42)
ETTLTQSPGILSLSPGDRATLSCRASQSVGSVNLAWYQQRPGQAPRLLIHG ASNRATGIPDRFSGVGSGTDFTLTINRLEPDDFAVYYCQQYGTSPITFGQGTRLEIKR
[*上文序列中标有下划线的区指CDR。]
本发明还提供了与抗体scFv E317、scFv E425、和/或scFv Y571竞争对HSV-1和/或HSV-2gD的结合的抗体和多肽。在如下情况中认为一种抗体或多肽与另一种抗体或多肽竞争，即一种抗体或多肽对gD的结合因浓度渐增的第二种抗体或多肽的存在而被显著抑制。例如，抑制可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。在一些实施方案中，所述抗体和多肽能够以实质性等同的效力中和HSV-1和HSV-2。效力可以在体外或在体内测量。例如，所述抗体或多肽可以在实施例3所述噬斑测定法中具有约1nM至约10nM(诸如约1nM至约6nM，或约1nM至约5nM)的IC50。
本文中还公开了E317、E425、和Y571抗体的功能性等同物。此类功能性等同物是特异性结合HSV糖蛋白D且具有如下VH片段和VL片段的抗体，该VH片段或其一部分与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：41至少70％(例如75％)相同，该VL片段或其一部分与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：42至少70％(例如75％)相同。
如本文中使用的，两种氨基酸序列的“百分比同源性”使用Karlin andAltschul，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990中记载的，如Karlinand Altschul，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 5873-5877，1993中所述改良的算法来确定。此类算法被掺入Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990的NBLAST和XBLAST程序。用XBLAST程序实施BLAST蛋白质搜索(得分＝50，词长＝3)以获得与参照多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带缺口的比对，如Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997中所述利用Gapped BLAST。在利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
本发明的抗体可仅含有上文所述E317、E425、或Y571的VH和VL片段。它可以是单链抗体(scFv)，其中VH和VL片段直接地或经接头(例如肽接头)地连接。在一个例子中，所述抗体是scFv E317，下文显示了它的氨基酸序列：
scFv E317的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)
QVTLKQSGAEVKKPGSSVKVSCTASGGTLRTYGVSWVRQAPGQGLEWLGRTIPLFGKTDYAQKFQGRVTITADKSMDTSFMELTSLTSEDTAVYYCARDLTTLTSYNWWDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSQLAWYQQKPGQAPRLLISGASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPTFGGGTKVEIKR
(*标有下划线的区指连接VH和VL片段的肽接头。)
在另一个例子中，所述抗体是scFv E425，其具有下文所示SEQ ID NO：6的氨基酸：
scFv E425的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)
QVQLQQSGAGVKKPGSSVRVSCSASGGTLRTYALSWVRQVPGQGFEWMGRIIPMFGKTDYAQKFQGRLSITADKSMDTGFMELTSLTSEDTAVYYCARDLTTLTSYNWLDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQKKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTINRLEPEDFAVYYCQQYGRSPTFGQGTKVEIKR
(*标有下划线的区指连接VH和VL片段的肽接头。)
在另一个例子中，所述抗体是scFv Y571，其具有下文所示SEQ ID NO：43的氨基酸：
scFv Y571的氨基酸序列SEQ ID NO：43)
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTLRTYGVSWVRQAPGQGLEWLGGTIPLFGKTDYAQKFQGRVTITADKSMDTSFMELTSLTSEDTAVYYCARDLTTLTSYNWWDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSETTLTQSPGILSLSPGDRATLSCRASQSVGSVNLAWYQQRPGQAPRLLIHGASNRATGIPDRFSGVGSGTDFTLTINRLEPDDFAVYYCQQYGTSPITFGQGTRLEIKR
(*标有下划线的区指连接VH和VL片段的肽接头。)
本发明还提供了包含如下重链可变区和/或轻链可变区的抗体或多肽，该重链可变区包含一个、两个、或三个来自SEQ ID NO：1的CDR，该轻链可变区包含一个、两个、或三个来自SEQ ID NO：2的CDR。本发明还提供了包含如下重链可变区和/或轻链可变区的抗体或多肽，该重链可变区包含SEQ IDNO：1中所示氨基酸残基3-124，该轻链可变区包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸残基1-108。本发明还提供了包含如下重链可变区和/或轻链可变区的抗体或多肽，该重链可变区包含一个、两个、或三个来自SEQ ID NO：3的CDR，该轻链可变区包含一个、两个、或三个来自SEQ ID NO：4的CDR。本发明还提供了包含如下重链可变区和/或轻链可变区的抗体或多肽，该重链可变区包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸残基3-124，该轻链可变区包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸残基1-108。本发明还提供了包含如下重链可变区和/或轻链可变区的抗体或多肽，该重链可变区包含一个、两个、或三个来自SEQ ID NO：41的CDR，该轻链可变区包含一个、两个、或三个来自SEQ ID NO：42的CDR。本发明还提供了包含如下重链可变区和/或轻链可变区的抗体或多肽，该重链可变区包含SEQ ID NO：41中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ IDNO：42中所示氨基酸序列。本发明还提供了包含SEQ ID NO：5、6、或43中所示氨基酸序列的抗体或多肽。
如本文中使用的，“互补决定区”或“CDR”包括任何定义的CDR，诸如Kabat CDR(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))、Chothia CDR(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))、和组合CDR。在一些实施方案中，CDR是缩短的CDR，其包括如下的CDR残基区段，该区段包括所有特异性决定残基(SDR)(Kashmiri et al.，Methods 36：25-34，2005)。在一些实施方案中，本发明提供了包括来自抗体ScFv E317、scFvE425、或ScFv Y571的所有SDR的抗体。
本发明的抗体也可以是完整免疫球蛋白分子，其中VH和VL片段分别连接免疫球蛋白(例如人IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgD、IgA1、和IgA2)的重链恒定区和轻链恒定区。
本文所述抗体可使用本领域已知的和本文中描述的方法通过筛选抗体文库(诸如噬菌体展示文库)并鉴定具有期望结合特性的抗体来生成。参见例如实施例1-5。
任何上文所述抗体可使用常规重组技术来制备。例如，可以通过表达编码抗体的核酸在宿主细胞中生成抗体，并自细胞培养物回收抗体。例如，E317、E425、或Y571抗体可通过在宿主细胞中自一种或两种含有编码下述多肽的核苷酸序列的表达盒表达含有SEQ ID NO：1的残基3-124、SEQ IDNO：3的残基3-124、或SEQ ID NO：41(用于VH)和/或SEQ ID NO：2的残基1-108、SEQ ID NO：4的残基1-108、或SEQ ID NO：42(用于VL)的多肽来制备。VH和VL片段可作为两种分开的多肽来制备，然后一起重折叠以形成抗体。或者，这两种片段作为单一多肽的各部分来生成。
E317、E425、或Y571的功能性等同物可通过在它们的VH和VL片段中(优选在框架区(FR)中)引入突变来生成。公知抗体的CDR决定它的抗原特异性。如此，E317、E425、或Y571的FR中的突变(特别是保守突变)通常不会影响它对HSV的结合活性。如此制备的功能性等同的抗原特异性可使用本领域已知方法(例如ELISA、免疫沉淀、或Western印迹分析)来确认。
本文所述抗体及其编码核酸二者在需要治疗的人类受试者(诸如感染有HSV的患者或具有削弱的免疫系统的患者，例如处于先天性HSV感染的风险的婴儿、孕妇、器官移植物接受者、癌症患者、白血病患者、和HIV携带者)中在治疗HSV感染或降低HSV繁殖中都是有用的。
为了实施上文所述治疗，可将任何本发明抗体或编码核酸在药学可接受载体(例如生理盐水)中悬浮以形成药物组合物并经常规路径施用。在与组合物中的活性组分相容且优选能够使活性组分稳定且对要治疗的受试者无害的意义上，药物组合物中含有的载体必须是“可接受的”。药物组合物可口服或通过静脉内输注来施用，或者皮下、肌肉内、鞘内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内、或肺内注射或植入。在使用编码核酸时，它可经活的载体(诸如沙门氏菌属、BCG、腺病毒、痘病毒或痘苗)来投递。
上文所述药物组合物可利用常规方法基于预定施用路径配制成剂量形式。例如，它可在胶囊剂、凝胶封(gel seal)、或片剂中配制供口服施用。胶囊剂可含有任何标准药学可接受材料，诸如明胶或纤维素。片剂可依照常规规程来配制，通过将组合物与固体载体和润滑剂的混合物压片来进行。固体载体的例子包括淀粉和糖膨润土。胶囊剂或片剂可进一步含有粘合剂(例如乳糖或甘露醇)、常规填充剂、和压片剂以形成硬壳胶囊剂或片剂。
药物组合物也可配制成活性剂的胃肠外剂量形式，包括水性溶液、等张盐水或5％葡萄糖，或其它公知药学可接受赋形剂。可利用熟悉本领域的人公知的环糊精或其它增溶剂作为药物赋形剂来投递治疗剂。
含有抗体或其编码核酸的可注射组合物可含有各种载体，诸如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇、和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇、等等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可通过滴注法来施用，由此输注含有抗体和生理学可接受赋形剂的药物配制剂。生理学可接受赋形剂可包括例如5％右旋糖、0.9％盐水、Ringer氏溶液或其它合适赋形剂。肌肉内制剂(例如抗体合适可溶性盐形式的无菌配制剂)可在药物赋形剂(诸如注射用水、0.9％盐水、或5％葡萄糖溶液)中溶解和施用。
为了便于投递，本发明的抗体或其编码核酸可缀合伴侣剂。如本文中使用的，“缀合”意味着两个实体联合，优选以足够亲和力联合，使得两种实体之间的联合的治疗好处得以实现。缀合包括共价或非共价结合以及其它联合形式，诸如在一种实体上或内捕获另一种实体或在第三种实体(例如微团)上或内捕获这两种实体任一或二者。
伴侣剂可以是天然存在物质，诸如蛋白质(例如人血清清蛋白、低密度脂蛋白、或球蛋白)、碳水化合物(例如右旋糖酐(dextran)、芽霉菌糖(pullulan)、甲壳质(chitin)、壳聚糖(chitosan)、菊糖(inulin)、环糊精或透明质酸)、或液体。它也可以是重组或合成分子，诸如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的例子包括聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯共乙交酯)共聚物、二乙烯基醚马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、和聚磷腈(polyphosphazine)。
在一个例子中，伴侣剂是微团、脂质体、纳米颗粒、或微球体，其中封装寡核苷酸。用于制备此类微团、脂质体、纳米颗粒、或微球体的方法是本领域公知的。参见例如美国专利5,108,921；5,354,844；5,416,016；和5,527,5285。
在另一个例子中，伴侣剂充当供一种或多种融合或缩合剂附着的基质。
融合剂能响应局部pH。例如，在遭遇内体内的pH时，它能引起其直接环境的物理变化，例如渗透特性的变化，其破坏内体膜或提高内体膜的渗透性，由此推动抗体或核酸释放入宿主细胞的胞质。一种优选的融合剂改变电荷，例如在低于生理范围的pH(例如在pH 4.5-6.5)变成质子化。融合剂可以是含有能够在暴露于特定pH范围时发生电荷变化(例如质子化)的氨基的分子。此类融合剂包括具有聚氨基链的聚合物(例如聚乙烯亚胺)和膜破坏剂(例如mellittin)。其它例子包括聚组氨酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙烯亚胺、和聚缩醛(polyacetal)物质(例如阳离子聚缩醛)。
缩合剂与抗体/核酸相互作用，引起它缩合(例如缩小寡核苷酸的尺寸)，如此保护它免于降解。优选地，缩合剂包括经例如离子相互作用与寡核苷酸相互作用的模块(例如带电荷的模块)。缩合剂的例子包括聚赖氨酸、精胺、亚精胺、多胺或其季盐、假肽多胺、拟肽多胺、树状聚物多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、和α螺旋肽。
本发明方法中要求的抗体或编码核酸剂量取决于：施用路径的选择；配制剂的性质；受试者的疾病的性质；受试者的体型、重量、表面积、年龄、和性别；正在施用的其它药物；和主治医师的判断。合适的剂量在0.01-100.0mg/kg的范围中。鉴于有多种组合物可用及各种施用路径的不同效率，预期所需剂量有较宽变化。例如，预期口服施用会要求比通过静脉内注射的施用要更高的剂量。可使用标准经验惯例来调整这些剂量水平的变化来进行优化，正如本领域完全理解的。在合适投递媒介(例如聚合微粒或可植入装置)中封装组合物可提高投递效率，特别是对于口服投递。
本发明的抗体用于治疗HSV感染的功效既可在体外又可在体内评估。简言之，可在体外对所述抗体测试其抑制病毒蛋白生成或病毒繁殖的能力。对于体内研究，可将所述抗体注射入动物(例如小鼠模型)，然后评估其治疗效果。基于所述结果，能确定适宜的剂量范围和施用路径。
本发明的范围之内还有一种用本发明抗体在人类受试者中诊断HSV感染的方法。在此方法中，自怀疑具有HSV感染的人类受试者获得测试样品(例如血液样品或口腔或繁殖组织样品)，然后使用本发明的抗体经适合于检测抗体抗原反应的免疫测定法检查HSV病毒蛋白的存在。例如，可将测试样品与本文所述抗HSV抗体一起在适合于抗体抗原复合物形成的条件下温育，并通过常规免疫测定法(例如ELISA、免疫沉淀、和免疫组织化学)来检测复合物，如果形成的话。
本发明还提供了包含本文所述抗体或抗原结合片段的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个包含本文所述抗体或片段的容器和依照本文所述任何本发明方法的用法说明。在一些实施方案中，所述说明包含施用所述抗体或片段以在受试者中预防或治疗HSV感染的描述。在一些实施方案中，所述说明包含施用所述抗体或片段来检测样品中HSV的存在的描述。
无需进一步推敲，认为基于上文描述，本领域技术人员能以其最完整的程度利用本发明。因此，下面的具体实施方案仅仅解释为例示而非以任何无论什么方式限制公开内容的剩余部分。通过述及完整收录本文中引用的所有出版物。
实施例1：自一个混合噬菌体scFv文库分离人抗HSV scFv抗体
遵循Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)中记载的规程，使用自50名健康亚洲裔成人分离的RNA生成了一个scFv噬菌体展示文库。简言之，自50名健康亚洲裔成人分离B淋巴细胞，自B淋巴细胞纯化mRNA。使用下述引物经RT-PCR自这些mRNA扩增与蛋白质免疫球蛋白的VH域对应的cDNA：
V H back：
HuVH1abacksfi：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG-3’(SEQ ID NO：7)
HuVH2abacksfi：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：8)
HuVH3abacksfi：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGKTGGAGWCY-3’(SEQ ID NO：9)
HuVH4abacksfi：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG-3’(SEQ ID NO：10)
HuVH5abacksfi：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC-3’(SEQ ID NO：11)
HuVH6abacksfi：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3’(SEQ ID NO：12)
HuVH14abacksfi：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTG-3’(SEQ ID NO：13)
HuVH16abacksfi：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGG-3’(SEQ ID NO：14)
JHfor：
HuJH1-2for：5’-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3’(SEQ ID NO：15)
HuJH3for：5’-TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3’(SEQ ID NO：16)
HuJH4-5for：5’-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3’(SEQ ID NO：17)
HuJH6for：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3’(SEQ ID NO：18)
使用下文所示引物扩增与免疫球蛋白的VL域对应的cDNA。
V K back：
HuVK1a back：5’-GACATCCAGATGACCCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO：19)
HuVK2a back：5’-GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO：20)
HuVK3a back”5’-GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO：21)
HuVK4a back：5’-GACATCGTGATGACCCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO：22)
HuVK5a back：5’-GAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO：23)
HuVK6a back：5’-GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO：24)
J K  for Not：
HuJK1forNot：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3’(SEQ ID NO：25)
HuJK2forNot：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’(SEQ ID NO：26)
HuJK3forNot：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3’(SEQ ID NO：27)
HuJK4forNot：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3’(SEQ ID NO：28)
HuJK5forNot：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’(SEQ ID NO：29)
V λ back：
HuVL1 back：5’-CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC-3’(SEQ ID NO：30)
HuVL2 back：5’-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC-3’(SEQ ID NO：31)
HuVL3a back：5’-TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC-3’(SEQ ID NO：32)
HuVL3b back：5’-TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3’(SEQ ID NO：33)
HuVL4 back：5’-CACGTTATACTGACTCAACCGCC-3’(SEQ ID NO：34)
HuVL5 back：5’-CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC-3’(SEQ ID NO：35)
HuVL6 back：5’-AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3’(SEQ ID NO：36)
J λ for Not：
HuJL 1forNot：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3’(SEQ ID NO：37)
HuJL2-3forNot：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3’(SEQ ID NO：38)
HuJL4-5forNot：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC-3’(SEQ ID NO：39)
通过PCR  反应经具有核苷酸序列5’-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-3’(SEQ ID NO：40)的接头随机连接VH cDNA与VL cDNA以形成编码scFv抗体的片段。将这些片段克隆入pCANTAB 5E噬菌粒载体以生成scFv噬菌体展示文库。
遵循上文所述规程使用自一名印度患者的B淋巴细胞、一名具有重度急性呼吸综合征的患者的B淋巴细胞、和一名台湾患者的脾细胞分离的mRNA构建另三个scFv噬菌体展示文库。将这三个文库与上文所述文库组合以形成一个混合scFv噬菌体展示文库，使用它来筛选抗HCMV scFv抗体。如下对此混合文库(具有1 x 1013pfu/ml的噬菌体滴度)筛选表达对HSV特异性的scFv抗体的克隆。
第一，通过五轮如下所述的生物淘选富集展示抗HSV抗体的噬菌体。将免疫管用在包被缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH9.6)中稀释(5 x 105/ml)的HSV-1病毒粒于4℃包被过夜，用含有0.1％Tween的PBS清洗三次，用含有2％脱脂奶的PBS封闭，并再次用含有0.1％Tween的PBS清洗三次。在含有2％脱脂奶的PBS中稀释一小份混合噬菌体文库，并添加至经HSV-1包被的免疫管。温育2小时后，将免疫管用含有0.1％Tween的PBS清洗十次，然后用PBS清洗十次以除去未结合的噬菌体。使用100mM三乙胺洗脱结合的噬菌体，用1MTris pH7.4中和，并用于将TG1细菌于37℃感染30分钟。然后将噬菌体感染的TG1细胞在含有补充有氨苄青霉素和葡萄糖的2xYT培养基(2YT/氨苄青霉素/葡萄糖培养基)的板上涂板并于30℃培养过夜。在板上添加补充有甘油的2YT/氨苄青霉素/葡萄糖培养基并使用玻璃刮刀将TG1细胞分散入培养基。将如此收集的TG1细胞接种入2YT/氨苄青霉素/葡萄糖培养基并于37℃、250rpm培养直至TG1培养物的OD600值达到0.5。与5 x 1010pfu M13KO7辅助噬菌体混合后，将TG1培养物于37℃温育30分钟，此后于室温以2,000xg离心10分钟。在10ml补充有氨苄青霉素和卡那霉素的2xYT培养基中重悬浮如此形成的细胞团粒并于30℃、250rpm温育过夜。将培养物于4℃以10,000g离心20分钟以收集所得上清液。然后将PEG/NaCl添加至上清液。1小时后，离心上清液以收集含有噬菌体颗粒的团粒。在PBS中悬浮团粒并离心以除去残余的细菌碎片。再次自PBS中悬浮如此收集的噬菌体颗粒以形成富集表达抗HSV抗体的克隆的第1轮scFv噬菌体文库。
遵循上文所述规程对一小份此第1轮富集文库进行另四轮生物淘选以生成进一步富集表达抗HSV抗体的噬菌体克隆的噬菌体文库。遵循下文所述过程对此噬菌体文库进行ELISA筛选以鉴定表达抗HSV单链抗体的噬菌体克隆个体。
稀释一小份噬菌体文库并在补充有氨苄青霉素和葡萄糖的2xYT培养基上涂板并于37℃温育过夜。挑取376个单菌落并在补充有氨苄青霉素和葡萄糖的2xYT培养基中于37℃、250rpm分开温育过夜。将如此获得的每份培养物的一小份接种入新鲜的补充有氨苄青霉素和葡萄糖的2xYT培养基，然后与109pfu M13KO7辅助噬菌体混合。将混合物于37℃、250rpm培养1-2小时，然后于室温以14,000rpm离心5分钟。将在补充有氨苄青霉素和卡那霉素的2xYT培养基中悬浮的细胞团粒于30℃、250rpm温育过夜，然后于室温以2000g离心30分钟。如下对上清液进行ELISA筛选。
用HSV-1感染的TG1细胞的裂解物包被测试多孔微量板并用载体pET-22b转染的大肠杆菌细胞的裂解物包被对照微量板。将上清液(各自含有上文所述376个噬菌体克隆之一的颗粒)添加至测试和对照微量板。将这两微量板于室温温育2小时并用含有0.05％Tween的PBS清洗三次。然后将在含有0.05％Tween和2％脱脂奶的PBS中稀释的HRP缀合的抗M13抗体添加至这两微量板。将板于室温温育1小时，用含有0.05％Tween的PBS清洗三次，并将HRP底物添加至微量板。然后于室温温育板直至形成蓝色。使用ELISA仪测定每个孔的OD450和OD650值。
发现了71个噬菌体克隆在上文所述ELISA筛选测定法中呈阳性(HSV/对照＞8)。扩增编码在这些克隆中表达的scFv的cDNA并测定它们的核苷酸序列。一个阳性噬菌体克隆表达scFv E317(SEQ ID NO：5)而另一个表达scFvE425(SEQ ID NO：6)。还分离出表达scFv Y571的噬菌体克隆。
实施例2：制备scFv E317、E425和Y571
将编码scFv E317、E425、和Y571的cDNA克隆入pET27b(+)表达载体并导入大肠杆菌进行表达。将携带编码scFv E317、scFv E425、或scFv Y571的cDNA的大肠杆菌克隆在补充有卡那霉素的Luria Bertani(LB)培养基中于37℃温育过夜。将70ml过夜培养物接种入新鲜的LB/卡那霉素培养基并于37℃培养2小时。然后将异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加至培养基至终浓度1mM并进一步将培养物于30℃温育5小时。经离心收获大肠杆菌细胞，在缓冲液A(50mM磷酸钠，1M氯化钠，pH8.0)中重悬浮，用微量流化仪裂解，并再次于4℃以14,000rpm离心20分钟以获得含有scFv E317、scFv E425、或scFv Y571的上清液，将其融合His标签。经亲和柱层析遵循常规规程纯化His-scFv融合蛋白。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的蛋白质检查纯度和量。
通过下文所述免疫沉淀测定法检测scFv E317和scFv E425的抗原特异性。用4μg pLPCX-KOS-gD转染293T细胞(2 x 105个)来表达HSV糖蛋白D。在合适条件下培养48小时后，收获转染的细胞并使用含有PBS、1％NP40、1mM PMSF、和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解。将2μg His-scFv E317或His-scFv E425与His标签珠一起温育1小时。用磷酸盐缓冲液清洗后，收集His标签珠并与10μl细胞裂解物一起温育1小时。然后将珠用含有5mM EDTA和1％脱氧胆酸钠的RIPA缓冲液清洗数次；洗脱附着至His标签珠的蛋白质并使用商品化抗HSV糖蛋白D抗体(1∶20000)进行Western印迹分析。如此获得的结果指示scFv 317和scFv 425二者结合HSV糖蛋白D。使用类似的实验，显示了scFv Y571结合HSV糖蛋白D。
实施例3：用scFv E317和scFv E425抑制HSV繁殖
采用噬斑减少测定法来检查scFv E317和scFv E425抑制HSV-1和HSV-2繁殖的能力。简言之，在12孔板的每个孔中接种1 x 105个Vero细胞并在MEM培养基中于37℃培养过夜。然后用含有1x PBS、MEM(不含FBS)、HSV-1KOS、HSV-1 00410(一种临床株)、HSV-2186、或HSV-2 00040(一种临床株)(每种病毒株5 x 102pfu/ml)、和抗体scFv E317和scFv E425之一的混合物(1ml/孔)替换培养基。在板中分配之前，将混合物于37℃预培养1小时。使用scFv E102作为阴性对照。将Vero细胞与混合物一起于37℃温育2小时，然后除去混合物。用1x PBS清洗一次后，给含有Vero细胞的板添加含有0.4％琼脂糖和10％FBS的MEM。琼脂糖凝固后，将板在37℃温箱中放置7天。在此期间，将500μl含有10％FBS的MEM添加至板中的每个孔。在第8天，自板中的每个孔除去培养基，然后添加500μl 1x PBS/甲醇(1∶1体积)。5分钟后，用500μl 100％甲醇替换1X PBS/甲醇以固定孔中含有的细胞。又5分钟后，除去甲醇并将细胞用250μl结晶紫染色10分钟。然后用水自板洗掉结晶紫并让板风干。然后在显微镜下对板中每个孔中含有的噬斑的数目计数。
自上文所述研究获得的结果指示scFv E317、E425、和Y571显著抑制HSV-1或HSV-2感染的Vero细胞中的噬斑形成。下文表1-3汇总了scFv E317、scFv E425、和scFv Y571的抑制效果。
表1：scFv E317对HSV-1和HSV-2的抑制效果
Figure BDA0000085845510000191
(*：临床株)
表2：scFv E425对HSV-1和HSV-2的抑制效果
Figure BDA0000085845510000192
(*：临床株)
表3：scFv Y571对HSV-1和HSV-2的抑制效果
Figure BDA0000085845510000193
在表1-3中，IC50指scFv E317、scFv E425、或scFv Y571对HSV感染的Vero细胞中的噬斑形成达到50％抑制所需要的浓度。抑制百分比是遵循下面的公式计算的：
％抑制＝100-(抗体存在下HSV感染的细胞中的噬斑数)/(抗体缺失下HSV感染的细胞中的噬斑数)
对照抗体scFv E102未能遏制HSV-1或HSV-2感染的Vero细胞中的噬斑形成。
实施例4：在体内免于HSV致死的保护
如下实施mAb E317对免于HSV-1的体内保护研究，即经由腹膜内注射用抗体mAb E317-103治疗接种有HSV-1的小鼠，接着检查受感染小鼠的存活率。特别地，实施该研究来分析mAb E317剂量和不同mAb E317剂量给药时间表(多剂对单剂)对免于HSV-1的保护的影响。用于这些研究的小鼠系是C.B-17SCID小鼠。这些研究中使用的mAb E317-103是包含两条重链和两条轻链的全长抗体。mAb E317-103的重链和轻链可变区来自抗体scFv E317，重链恒定区来自人IgG1重链，而轻链恒定区来自人κ轻链。
多剂施用mAb E317-103对免于HSV-1的保护的影响：在此研究中使用七周龄雄性小鼠。经由滴度为5x103PFU的腹膜内施用使用HSV-1(KOS)来接种小鼠。在第0天(D0)给小鼠接种HSV-1病毒。每五天经由腹膜内注射给小鼠施用mAb E317-103，即在病毒接种前24小时(第-1天或D(-1))、接种后4天(D4)、接种后9天(D9)、接种后14天(D14)、和接种后第19天(D19)进行施用。使用不同的mAb E317-103剂量实施该研究：1.5毫克抗体每千克小鼠体重(mpk)，5mpk，或15mpk。使用两个对照组，一个只接受磷酸盐缓冲液(PBS)(“假装/媒介(Sham/Vehicle)”)而另一个只接受HSV-1病毒(“疾病/媒介(Disease/Vehicle)”)。假装/媒介组中有4只动物。疾病/媒介对照组和每个施用抗体的组中有5只动物。给小鼠接种HSV-1后，有7周每天监测存活率。
结果显示了施用mAb E317-103显著改善受感染小鼠的存活(图1)。疾病/媒介组中的所有小鼠在感染后11天内死亡。存活率与施用的mAb E317-103剂量正相关，接受15mpk抗体的小鼠有100％存活率，接受5mpk抗体的小鼠有80％存活率，而接受1.5mpk抗体的小鼠有20％存活率，所述存活率是在感染后7周测量的。
单剂施用mAb E317-103对免于HSV-1的保护的影响：在此研究中使用六周龄雄性小鼠。经由滴度为5x103PFU的腹膜内施用使用HSV-1(KOS)来接种小鼠。在第0天(D0)给小鼠接种HSV-1病毒。在病毒接种前24小时(D(-1))给小鼠施用单剂mAb E317-103。使用不同的mAb E317-103剂量：1.5mpk，5mpk，或15mpk。使用两个对照组，一个只接受PBS(“假装/媒介”)而另一个只接受HSV-1病毒(“疾病/媒介”)。假装/媒介对照组中有5只动物。疾病/媒介对照组和每个施用抗体的组中有10只动物。给小鼠接种HSV-1后，有7周每天监测存活率。
结果显示了单剂mAb E317足以提供免于HSV-1的保护(图2)。疾病/媒介组中的所有小鼠在感染后10天内死亡。存活率与施用的mAb E317剂量正相关，在感染后约7周，接受15mpk抗体的小鼠有100％存活率，接受5mpk抗体的小鼠有60％存活率，而接受1.5mpk抗体的小鼠有50％存活率。因此，单剂施用mAb E317有效提供免于HSV-1的保护。
mAb E317-103施用时机对免于HSV的保护的影响：实施研究来分析为了产生保护是否需要在病毒攻击前施用抗体，或是否能在同一天或甚至在感染建立后施用抗体。在此研究中使用六周龄雄性小鼠。经由滴度为5x103PFU的腹膜内施用使用HSV-1(KOS)来接种小鼠。将给小鼠接种HSV-1病毒那天定为第0天(D0)。在病毒接种前24小时(D(-1))、在病毒接种当天(D0)、或在病毒接种后24小时(D1)以单个剂量15mpk给小鼠施用mAb E317-103。对于D0，首先注射病毒，然后马上注射抗体；而且病毒注射与抗体注射制剂的间隔为约1分钟。使用两个对照组，一个只接受PBS(“假装/媒介”)而另一个只接受HSV-1病毒(“疾病/媒介”)。假装/媒介对照组中有5只动物。疾病/媒介对照组和每个施用抗体的组中有10只动物。给小鼠接种HSV-1后，有至少9周每天监测存活率。
结果显示了病毒接种前24小时(D(-1))和在接种当天(D0)施用mAbE317-103提供完全保护(感染后约9周100％存活率)，而在病毒接种后24小时(D1)施用mAb E317-103提供强保护(感染后约9周70％存活率)(图3)。因此，mAb 317-103在感染前或感染后施用时都是有保护作用的。
实施例5：表征受mAb E317和mAb E425识别的糖蛋白D表位
mAb E317和E425对gD的结合是构象依赖性的：实施免疫沉淀测定法来确定mAb E317或E425的糖蛋白(“gD”)表位是否是构象依赖性的。该测定法使用本领域技术人员知道的现有方法来实施。简言之，用HSV-1gD重组DNA(来自KOS株)表达构建物转染293T细胞并在48小时后收获细胞。表达构建物通过将编码gD的cDNA以符合读码框的方式亚克隆入经XhoI和NotI消化的pLPCX(Clontech)来生成。将细胞在冰上在含有PBS、1％NP40、蛋白酶抑制剂、和1mM PMSF的缓冲液中裂解10分钟。离心后收集细胞裂解物并与带HIS标签的scFv E317或E425和HIS选择镍亲和凝胶珠(Sigma)一起在PBS中于4℃温育。收集珠并用RIPA缓冲液(50mM Tris HCl pH7.4，150mMNaCl，2mM EDTA，1％NP-40，0.1％SDS)清洗六次。通过12％SDS-PAGE凝胶或使用mAb E317或mAb E425的Western印迹分析清洗后的珠。对于由mAbE317免疫沉淀的细胞裂解物，在对凝胶上的蛋白质染色时，在SDS-PAGE凝胶上显示出gD，但是使用mAb E317或E425进行免疫印迹的Western印迹上没有。这指示mAb E317或E425不能结合Western印迹上变性的gD，而且受mAbE317或E425识别的gD表位不是线性表位而是构象依赖性的。
受mAb E317或E425识别的表位的作图：通过经由免疫沉淀测定法检查突变型gD和mAb E317或E425之间的结合来对mAb E317识别的gD表位作图。免疫沉淀测定法使用本领域技术人员知道的现有方法来实施。简言之，用HSV-1gD重组DNA(来自KOS株)表达构建物转染293T细胞并在48小时后收获细胞。将细胞在冰上在含有PBS、1％NP40、蛋白酶抑制剂、和1mM PMSF的缓冲液中裂解10分钟。离心后收集细胞裂解物并与带HIS标签的scFv E317和HIS选择镍亲和凝胶珠一起在PBS中于4℃温育。收集珠并用RIPA缓冲液清洗六次。使用商品化抗HSV gD单克隆抗体H170(ViruSys，产品目录号P1103)作为印迹抗体通过实施Western印迹来分析清洗后的珠。
通过本领域技术人员知道的方法生成HSV-1gD突变体。使用截短型gD突变体的研究显示了gD中的数个区对于抗体识别是重要的(图4)。氨基酸218-235似乎对于抗体识别是重要的，因为显示了gD 1-235有结合但gD 1-218或具有氨基酸224-240删除的gD没有。氨基酸32-43似乎对于抗体识别是重要的，因为显示了具有氨基酸24-32删除的gD有结合但具有氨基酸27-43删除的gD没有。删除氨基酸125-161破坏抗体识别。不希望束缚于理论，删除氨基酸125-161大概破坏蛋白质构象，因为该删除破坏二硫键。使用经由氨基酸替代(例如丙氨酸对非丙氨酸氨基酸的氨基酸替代)生成的gD突变体实施对表位的进一步作图。发现了数个氨基酸对于抗体识别是至关重要的，包括Y38、D215、P221、和R222，因为替代这些氨基酸破坏mAb E317或E425的识别(图5)。
因此，受mAb E317或E425识别的表位不是线性表位而是构象依赖性的，而且氨基酸Y38、D215、P221和R222对于mAb E317和E425结合gD是重要的。
其它实施方案
所有此说明书中公开的特征可以以任一组合来组合。每一项此说明书中公开的特征可以用满足相同、等同、或相似目的的替代特征替换。如此，除非另有明确说明，每一项公开的特征只是一系列一般性等同或相似特征的一个例子。
根据上文描述，本领域技术人员能容易地确定本发明的本质特征，而且不背离其精神和范围，就能对本发明做出各种改变和修改，使其适应各种使用和条件。如此，其它实施方案也在权利要求之内。

Claims (26)

1.一种分离的特异性结合单纯疱疹病毒-1(HSV-1)和单纯疱疹病毒-2(HSV-2)糖蛋白D(gD)的人抗体，其中该抗体结合糖蛋白D上的构象表位，且该表位包含SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸Y38、D215、P221、和R222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示Y38、D215、P221、和R222对应的氨基酸。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222或gD上与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示氨基酸35-40和215-222对应的氨基酸相互作用。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体抑制HSV-1和/或HSV-2繁殖。
4.权利要求1的抗体其中所述抗体与抗体scFv E317、scFv E425、或scFvY571竞争对HSV-1和HSV-2的gD的结合，且能够以实质性等同的效力中和HSV-1和HSV-2。
5.一种特异性结合单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白D的抗体，其中该抗体含有(1)包括与SEQ ID NO：1至少80％相同的氨基酸序列的重链可变区(VH)，和包括与SEQ ID NO：2至少80％相同的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，或
(2)包含与SEQ ID NO：3至少80％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQID NO：4至少80％相同的氨基酸序列的VL。
6.权利要求5的抗体，其中所述抗体包含
(1)包括与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列的VH或包括与SEQID NO：2至少90％相同的氨基酸序列的VL；或
(2)包括与SEQ ID NO：3至少90％相同的氨基酸序列的VH或包括与SEQID NO：4至少90％相同的氨基酸序列的VL。
7.权利要求5的抗体，其中所述抗体含有
(1)包括与SEQ ID NO：1至少95％相同的氨基酸序列的VH或包括与SEQID NO：2至少95％相同的氨基酸序列的VL；或
(2)包括与SEQ ID NO：3至少95％相同的氨基酸序列的VH或包括与SEQID NO：4至少95％相同的氨基酸序列的VL。
8.一种分离的特异性结合HSV糖蛋白D的抗体，其中该抗体包含VH和/或VL，该VH包含scFv E317的VH的三个互补决定区(CDR)，该VL包含scFvE317的VL的三个CDR。
9.权利要求8的抗体，其中所述抗体包含VH和/或VL，该VH包含SEQ IDNO：1的氨基酸3-124，该VL包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-108。
10.权利要求8的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
11.一种分离的特异性结合HSV糖蛋白D的抗体，其中该抗体包含VH和/或VL，该VH包含scFv E425的VH的三个CDR，该VL包含scFv E425的VL的三个CDR。
12.权利要求11的抗体，其中所述抗体包含VH和/或VL，该VH包含SEQ IDNO：3的氨基酸3-124，该VL包含SEQ ID NO：4的氨基酸1-108。
13.权利要求11的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
14.一种分离的特异性结合HSV糖蛋白D的抗体，其中该抗体包含来自SEQID NO：41中所示重链氨基酸序列的三个CDR和/或来自SEQ ID NO：42中所示轻链氨基酸序列的三个CDR。
15.权利要求14的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：41中所示重链氨基酸序列和/或SEQ ID NO：42中所示轻链氨基酸序列。
16.权利要求14的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列。
17.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1-16任一项的抗体的核苷酸序列。
18.一种载体，其包含权利要求17的核酸。
19.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求17的核酸。
20.一种生成权利要求1-16任一项的抗体的方法，包括培养生成所述抗体的宿主细胞，并自所述细胞培养物回收所述抗体。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1-16任一项的抗体和药学可接受载体。
22.一种用于治疗或预防单纯疱疹病毒(HSV)感染的方法，包括对有此需要的受试者施用有效量的1-16任一项的抗体。
23.权利要求22的方法，其中所述受试者处于HSV感染的风险。
24.权利要求22的方法，其中所述HSV感染是HSV-1或HSV-2感染。
25.权利要求22的方法，其中所述方法进一步包括施用另一种抗HSV药。
26.一种在受试者中诊断HSV感染的方法，包括：
(a)使权利要求1-16任一项的抗体与自怀疑具有HSV病毒的受试者获得的生物学样品接触；并
(b)测定抗原抗体反应；
其中检测出抗原抗体反应指示所述样品中存在HSV。
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