CN112608368B

CN112608368B - Vista亲和肽及其应用

Info

Publication number: CN112608368B
Application number: CN202011513264.9A
Authority: CN
Inventors: 李国栋; 牛潇爽; 高艳锋; 赵文珊; 翟文杰
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112608368A

Abstract

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种VISTA的亲和肽及其抗肿瘤应用。该亲和肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。该亲和肽能够亲和VISTA从而阻断VISTA与其配体之间的相互作用，进而起到抗肿瘤效果，因此有望在抗肿瘤免疫治疗的药物或者在制备抗肿瘤相关药物中得到应用。

Description

VISTA亲和肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种VISTA蛋白胞外段的亲和肽C1及其应用。

背景技术

近年来，随着肿瘤病发率的日渐提升，肿瘤治疗成为医学界乃至全人类亟需攻克的一关。值得一提的是，肿瘤免疫治疗与化疗、放疗、手术和其他“靶向治疗”一样，现在被认为是肿瘤治疗的第五大支柱。这种治疗方式可以有效防止肿瘤复发与转移，延长患者生存期，是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一。免疫疗法机制可以通过多种途径行使其抗肿瘤功能，在肿瘤免疫治疗过程中，负性免疫检查点分子主要介导免疫耐受和逃逸，肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳也是目前在肿瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战。因此，强效免疫检查点阻断(ICB)治疗抑制剂的迅速发展，使得机体打破原有的免疫耐受和逃逸平衡显得尤为重要。2018年诺贝尔生理学或医学奖颁给了美国免疫学家詹姆斯·艾利森以及日本免疫学家本庶佑，以表彰他们“发现负性免疫调节治疗癌症的疗法”方面的贡献。

免疫检查点抑制剂用于肿瘤治疗已经显现出卓越优势，美国食品和药物管理局(FDA)已批准多种靶点抗体用于临床治疗。例如美国首个获得监管部门批准的抗PD-1治疗药物Pembrolizumab用于治疗癌症。

VISTA是2011年发现的负性免疫检查点分子，它是PD-1同源物，又名PD-1H，是迄今为止发现最早的T细胞耐受性的免疫检查点调节因子，其潜力正在被积极研究。

VISTA在TME中的活性对抗肿瘤免疫很重要，而VISTA阻断可能是一种很有前途的免疫治疗策略。VISTA同时具有配体和受体的功能，既可以作为配体抑制T细胞的活化，也可以作为T细胞上的受体，接受抑制信号在体内外直接抑制T细胞活化。因此，VISTA可能成为免疫治疗的潜在靶标，是治疗癌症和炎性疾病的理想免疫治疗靶点。

发明内容

本发明提供了一种VISTA蛋白胞外段的亲和肽C1，并经过实验证明了该亲和肽C1具有抗肿瘤活性。

本发明采取的详细技术方案如下：

一种VISTA蛋白胞外段的亲和肽C1，该亲和肽各个氨基酸的构型独立地选自D型或L型(尽管甘氨酸不分D、L型，本专利为使对各氨基酸构型的描述简洁，亦将甘氨酸任意定义为：D型或L型)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；如，所有氨基酸的构型均为D型或L型。

需注意的是，本专利的亲和肽，可应成药需要变换形式，可以游离形式存在，也可以其药学上可接受的盐的形式存在，也可对前述亲和肽进行化学修饰以延长半衰期，比如环化修饰、乙酰化修饰、PAS修饰、PEG修饰、脂肪酸修饰、白蛋白修饰、白蛋白亲和肽偶联、肿瘤归巢肽偶联、穿膜肽偶联、纳米载体偶联；基于本专利思路的简单变形，均构成对本专利的等同侵权。

本发明还公开了所述VISTA蛋白胞外段的亲和肽C1在制备药物或试剂盒中的应用，所述试剂盒可用于检测待测物对VISTA蛋白的亲和或阻断能力，或者用于检测样品中VISTA蛋白表达与否、表达位置或表达含量；所述药物的应用可包括：

1)抗肿瘤，所述肿瘤为结直肠癌肿瘤，所述抗肿瘤为抑制肿瘤生长或消除肿瘤

2)阻断VISTA蛋白与其配体的结合

3)增强CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力。

本文所述VISTA蛋白可为人或小鼠的VISTA蛋白。

本发明通过细胞筛选法进行噬菌体展示十二肽库高通量技术筛选时获得了VISTA蛋白胞外段亲和肽C1。针对该肽进一步的体外亲和力实验、体外T细胞活化实验、细胞水平MTT实验和小鼠荷瘤实验表明，亲和肽C1的抑瘤效果明显，且无明显毒副作用，因而具有较好的医疗应用前景，为肿瘤免疫治疗提供了新的选择。

附图说明

图1为亲和肽C1对接种CT26的BABL/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图，*表示P<0.05，***表示P<0.001。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该为限制本发明的范围。

如无特别说明，下面所用试剂、生物材料、培养基和溶液均为本领域常用、公众可以得到或市售的物品，部分示例如下：

主要试剂：

牛血清白蛋白(BSA)，索莱宝生物科技有限公司；

胎牛血清(FBS)，以色列BI公司；

培养基和溶液：

LB培养基、上层琼脂、LB/IPTG/X-gal平板、Protein A/G Mix Magnetic Beads、TBS缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.5)，含有150mMNaCl)、Tris-HCl(pH 9.1)中和液、PEG-8000/NaCl沉淀液、Tris-T缓冲液、洗脱液(0.2M Glycine-HCl[pH 2.2]，1mg/mL BSA)、中和液(1MTris-HCl[pH 9.1])、蛋白标记试剂盒Monolith NT^TMHis-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA、PBS 7.2、PBST、BSA、Tween-20、TBST洗涤液缓冲液，MTT均按照现有技术制备即可，不再详细描述。

主要仪器：

MST仪器，德国Nano Temper技术有限公司；

流式细胞仪，美国BD公司。

生物材料：

CT26细胞株由本实验室保种；

CHO-K1-hVISTA细胞(过表达hVISTA的细胞)实验室构建；

BABL/c小鼠，6-8周龄，雌性，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，购置后饲养于SPF级动物房。

实施例1

为便于本领域技术人员具体实施本发明，发明人对VISTA蛋白胞外段的亲和肽C1的筛选过程简要说明如下：

利用噬菌体展示十二肽库筛选人VISTA的亲和肽，简要步骤如下：

(1)采用细胞筛选法进行噬菌体展示十二肽库的筛选工作；

(2)经过数轮的筛选后，与靶蛋白人VISTA胞外段有亲和力的噬菌体单克隆逐轮得到富集；

(3)然后从中挑选阳性克隆进行测序，共得到多个插入十二肽序列，即亲和十二肽序列，其中1个具有重复克隆的为亲和肽C1(序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸构型均为L型)。

实施例2

本实施例主要以人VISTA蛋白胞外段亲和肽C1与人VISTA的亲和效果进行了体外MST实验(分子间相互作用分析技术)检测，结果表明亲和肽C1可以与人VISTA蛋白有效结合，相关实验情况介绍如下。

1、标记蛋白：用纯水将试剂盒中的5×PBST稀释成1×PBST，用50μL的1×PBST溶解染料，得到浓度为5μM的染料，将2μL染料与98μL的1×PBST混合，制成100nM染料溶液。将蛋白浓度调至200nM，体积为100μL，染料与蛋白按体积比1:1混合(100μL浓度为200nM的蛋白，100μL浓度为100μL的染料)，室温，避光孵育30min，标好的蛋白4℃15000g离心10分钟，保留上清，弃沉淀，蛋白标记完成；

2、样品准备：将多肽溶解至适当浓度，进行15次倍比稀释，得到16个浓度梯度样品，体系为5μL。每管加入5μL标记好的蛋白样品，混合均匀后离心排除气泡。冰上孵育5min后用MST专用毛细管吸取孵育后的液体，放置于仪器托；

3、上机检测：打开电脑启动MO.Control软件，选择(Red)通道Binding Affinity模式进行检测；

4、分析结果：使用NanoTemper分析软件MO.Affinity Analysis v2.2.4计算结合解离常数(K_D值)。

MST检测亲和肽C1与人VISTA蛋白亲和力实验结果显示，亲和肽C1与人VISTA蛋白结合的K_D值为3.09μM，证明了亲和肽C1可以有效地与人VISTA蛋白结合。

实施例3

1、选取健康志愿者的浓缩白细胞用无菌PBS7.2溶液按1:2的比例进行稀释。

2、在50mL离心管的底部先加入淋巴细胞分离液，再加入稀释后的浓缩白细胞，使其比例为1:2。

3、放入水平离心机中离心：20℃、2000rpm、30分钟。

4、离心期间，在生物安全柜中取新的50mL离心管中加入无菌PBS7.2溶液，时间到后小心抽取上述离心管中的白膜层加入此管中，PBS7.2溶液与白膜层细胞的比例为5:1，20℃、2000rpm、20分钟离心。

5、时间到后，弃上清，吸尽残余液体，用含10％胎牛血清的IMDM培养基重悬，细胞计数调其密度为2×l0⁶个/mL,加入24孔板中每孔1×10⁶个细胞。

6、同时处理培养的CHO-hVISTA细胞，离心洗涤2次，调整密度后备用。

7、铺好板后，将细胞孔进行分组。分组如下：PBMCs未刺激组为阴性对照组；PBMCs刺激组为阳性组(PHA刺激，100μL0.1 mg/mL，Transport Inhibitor:2μL/mL)；PBMCs刺激+CHO-hVISTA(PHA刺激的同时，加入CHO-hVISTA进行抑制，PBMCs：CHO-hVISTA＝1:5)；PBMCs+CHO-hVISTA+拮抗肽组。

8、刺激4～6h后，收取细胞做胞内因子染色，流式检测CD8⁺T细胞的INF-γ的含量。胞内因子染色步骤如下：

(1)收集细胞至1.5mL离心管中，离心弃去上清中的培养基，再用FACS buffer洗涤一次。

(2)孵育细胞表面抗体：4℃避光孵育30min；设单阳管调补偿用；

(3)洗涤：直接加入1mL FACS buffer离心洗涤，弃去上清；再加1mL FACS buffer离心洗涤，弃去上清(不需要用移液枪吸干，大概会残留50-100μL液体)。

(4)固定：先将离心后的细胞沉淀涡旋混匀，再加入100μL 1×Fixation buffer重悬细胞(注意一定要先将细胞沉淀悬起，否则容易出现细胞团块无法吹散的情况，固定后细胞变得脆弱吹打混匀时尽量轻柔)室温固定30min。

(5)破膜：固定结束不用洗涤，直接加入1mL 1×Permeab ilization buffer洗涤两次；。

(6)INF-γ染色：加入Anti-mouse-INF-γ-PE抗体或同型抗体(Rat IgG1 k-PE)，冰上避光孵育30min。

(7)抗体孵育结束后用稀释的1×Permeabilization buffer洗涤1次，3000rpm离心弃上清，400μL FACS buffer重悬细胞，上流式检测胞内IFN-γ。

由彩图结果可知，亲和肽C1能恢复CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的能力。

实施例4

为进一步检验亲和肽C1的抗肿瘤活性，发明人以亲和肽C1进一步做了抗肿瘤相关实验具体实验情况如下：

实验过程如下：

1、于每只小鼠的右侧背部接种2×10⁵个瘤细胞，待小鼠的瘤体积达到40～80mm³时按瘤体积大小S型分组，分为3组，分别为亲和肽C1低剂量组(0.5mg/kg)、亲和肽C1高剂量组(5mg/kg)和生理盐水组(阴性对照组)，每组6只。

亲和肽C1直接溶于生理盐水配成高低剂量的溶液。

2、瘤旁皮下给药的方式注射，亲和肽C1低剂量组按照0.5mg/kg/d，亲和肽C1高剂量组按照5mg/kg/d，共给药14天，生理盐水组(阴性对照组)同样采用瘤旁皮下注射的给药方式，注射量为0.2mL。实验期间小鼠自由进食和饮水。

3、隔日测量小鼠体重并记录，绘制曲线，以检验亲和肽C1毒副作用(结果显示无毒副作用)；隔日测量肿瘤的长(a)短(b)径及高(c)，并按公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，结果如图1所示，计算公示为：V＝1/2×a×b×c。

尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其他的更改和修改，因此，这意味着在所述权利要求中包括本发明范围的所有变化和修改均属于本发明保护范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> VISTA亲和肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Pro Gly Trp Ser Phe Gly Lys Leu His Ala Pro

1 5 10

Claims

1.亲和肽C1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述亲和肽所有氨基酸的构型均为L型。

2.含权利要求1所述亲和肽的药物组合物或试剂盒。

3.权利要求1所述亲和肽在制备药物或试剂盒中的应用，所述试剂盒用于检测待测物对VISTA蛋白的亲和或阻断能力，或者用于检测样品中VISTA蛋白表达与否、表达位置或表达含量；所述药物用于下述至少一种用途：

1）抗结直肠癌

2）阻断VISTA蛋白与其配体的结合

3）增强CD8⁺ T细胞分泌 IFN-γ的能力。

4.如权利要求3所述的应用，其特征是，所述VISTA蛋白为人或小鼠的VISTA蛋白。