CN101883780B - 人类cd154结合合成肽和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含长度七个残基的氨基酸序列的合成肽，优选的在两个末端侧翼是2个半胱氨酸残基，其能够特异性地识别人类CD154并阻断CD40：CD154相互作用，从而抑制依赖于这样的相互作用的生物学效应。优选地处于环状形式的本发明的肽，适用于诊断和治疗应用，特别是用于肿瘤、炎症性疾病和移植排斥的诊断和治疗。

Description

人类CD154结合合成肽和其用途
本发明涉及能够结合人类CD40配体(CD40L或CD154)的合成肽。特别地，本发明涉及具有氨基酸序列的合成肽，其能够特异性结合CD154的活性位点、从而抑制CD154与它的天然配体CD40之间的相互作用以及依赖于这种相互作用的生物学效应。本发明还涉及所述肽在具有炎性、免疫或血液学来源的疾病的诊断和治疗中的用途。 
CD40是在B细胞的表面组成型表达的分子，在B细胞上它在成熟过程期间起到决定性的作用。CD40还在许多进一步的细胞类型的表面上表达，包括单核细胞、成纤维细胞、树突状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和上皮细胞(van Kooten et al，J.Leukoc.Biol.2000)。它的配体CD154(也称为CD40L)在活化时在T细胞、巨噬细胞、血小板、单核细胞、NK细胞和内皮细胞的表面上短暂地表达。特别地，在B细胞的表面表达的CD40与在活化的T细胞的表面表达的CD154之间的相互作用导致B细胞的克隆性扩增和同种型转换，使得它们转变成浆细胞。 
CD40:CD154相互作用在有效免疫反应的发生中的重要性由以下事实证明，在CD154编码基因中的突变对一种严重的人类免疫缺陷形式，高IgM综合征(HIM)负责，其特征在于IgM的过量产生但是缺乏IgG、IgA和IgE，并伴有严重的复发性的感染(Aruffo A.et al，Cell 1993)。 
近几年，许多研究已经展现了在许多具有炎性病因的过程中牵涉CD40:CD154相互作用，例如动脉粥样硬化、自身免疫疾病、移植后排斥、移植物抗宿主疾病，等等(Schonbeck U.et al，Circ.Res.2001；Henn V.et al，Nature 1998；Biancone L. et al，Int.J.Mol.Med.1999；Buchner K.et al，J.Pathol.2003)。CD40或它的配体CD154的表达或两个分子的共表达，也在许多肿瘤中展现了，表明这种信号传导途径在肿瘤发展中的牵涉(Bussolati B.et al，Int.J.Cancer2002；Biancone L. et al，J.Immunol.1999；Cantaluppi V.et al，Int.J.Immunopathol.Pharmacol.2006；Hill S.C.et al，J.Immunol.2005； Melichar B.et al，Gynecol.Oncol.2007；Eliopoulos A.G.et al，Curr.Opin.Pharmacol.2004)。特别地，CD40:CD154信号传导途径被认为在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的发展中涉及，因为已经显示了它促进肿瘤细胞存活和内皮细胞的促血管生成性质(Dicker F.et al，Blood 2006)。 
已经发展了针对抑制CD40:CD154相互作用的许多方法以提供新的治疗可能性。特别地，在自身免疫疾病、动脉粥样硬化和移植排斥的不同的实验模型中获得了有希望的结果。通过基于抗CD154单克隆抗体的方法的CD40:CD154相互作用的抑制提供了许多自身免疫疾病模型中的临床改善，例如全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、银屑病和Crohn’s病(Boumpas D.T.et al，Arthritis Rheum.2003；Liossis S.N.et al，Bio Drugs 2004；Daoussis D.et al，Clin.Diagn.Lab.Immun.2004)。在专利文献中也公开了抗CD154抗体。WO 2005/003175公开了无糖基抗CD154抗体；WO 2006/033702公开了抗CD154抗体和肽，特别是抗体的轻链和重链可变区。此外，许多文献展现了在小鼠中在胰岛、皮肤、骨髓、心脏和肾脏移植之后单克隆抗体的使用引起了移植的器官的延长的存活(Molano R.D.et al，Diabetes 2001；Quezada S.A.et al，Blood 2003；Elster E.A.et al，Transpl.Immunol.2004；Xu H.et al，J.Clin.Investig.2006；Snanoudj R.et al，Transpl.Int.2006；Nanji S.A.et al，Diabetes 2006)。共刺激阻断可以用针对共刺激分子的单克隆抗体、Fab片段或融合蛋白来实现。然而，这些方法的结果常常被免疫原性作用和促血栓形成副作用的风险损害，这是由于Fc部分的识别(Henn V.et al，Nature1998)，以及被不良的组织穿透和免疫抑制损害。为了降低固有的免疫原性，开发了人源化的和微型抗体，但是令人遗憾地是以亲和力为代价的。 
本发明的一个目的是提供一种试剂，其能够抑制CD40:CD154相互作用并阻断依赖于这样的相互作用的生物学效应，并且其克服了现有技术的局限性和缺点，特别是与单克隆抗CD154抗体的使用相关的那些。 
这个目的通过合成肽来实现，所述合成肽优选的处于环状形式，其能够特异性结合人类CD154(也称为人类CD40L)的活性位 点。 
本发明的肽包含序列表中SEQ ID NO：13所指定的epta-氨基酸CD154结合序列。 
根据优选的实施方式，本发明的肽长度是从7个到30个氨基酸。 
根据再更优选的实施方式，本发明的肽由序列表中SEQ ID NO：6所指定的nona-氨基酸序列组成，由在SEQ ID NO：13所指定的epta-氨基酸CD154结合序列的两个末端添加侧翼半胱氨酸残基产生。这个实施方式是特别有益的，因为SEQ ID NO：6能够通过两个末端半胱氨酸之间的二硫键的形成而经历环化。 
根据本发明的肽具有的优点是，它不会在施用它的患者中诱导不需要的免疫反应。 
根据进一步的实施方式，本发明的肽以包含复数个所述肽的拷贝的多聚肽结构的形式提供，每个所述肽拷贝处于线性或处于环状形式。所述多聚的肽结构优选地是四聚结构。所述多聚肽结构优选地由复数个所述肽的拷贝组成，其中每个拷贝通过至少一个氨基酸间隔区结合至少一个其他拷贝，所述氨基酸间隔区优选地是G(Gly)残基，其中每个所述肽拷贝直接地或间接地结合于氨基酸核心，所述氨基酸核心优选地由三个K(Lys)残基组成。 
根据本发明的特别优选的多聚肽结构在以下表示： 
其中L是Leu，P是Pro，T是Thr，R是Arg，H是His，M是Met，A是Ala，G是Gly以及K是Lys。 
上文例举的多聚结构显示了在60μM浓度下发挥了与肽4.10相同的、对通过重组可溶性CD154的CD40刺激的抑制活性，虽然它含有线性形式的CD154结合序列SEQ ID NO：13。此外，四聚结构，如肽4.10，在阈值下剂量时(0.3U/ml)在与凝血酶一起活化人类血 小板聚集时结果是无活性的。这些结果表明，CD154结合序列(SEQID NO：13)能够结合CD154，并能在它处于环状形式时或处于线性形式时发挥它的生物学功能。虽然环状肽具有保护氨基酸序列免于蛋白水解作用(例如，在血浆中)的优点，设计肽的多聚形式的可能性容许调节分子大小、清除的速率和因此调节半衰期。 
如上文所提及的，本发明的范围还包括根据本发明的肽或多聚结构在诊断和治疗应用中的用途。 
本发明的范围进一步包括缀合物，其中本发明的肽或多聚肽结构连接到诊断试剂(例如，用于体内或体外分析的可检测的分子)或治疗试剂(例如，抗炎药物、抗肿瘤药物、能够对活化的内皮细胞、肿瘤细胞或任何其他能够在活化时在细胞表面表达CD154的细胞发挥细胞毒性效应的细胞毒性试剂)以允许体内或体外检测，和用于治疗与CD40:CD154相互作用相关的许多疾病或病症的药物的制备。这些疾病或状况的实例有炎性疾病(例如，动脉粥样硬化、自身免疫疾病、移植排斥、与关节炎、接触性皮炎、高IgE综合征、炎症性肠病、变态反应，包括过敏性哮喘、自发性炎性疾病相关的炎症)、肿瘤疾病(例如，慢性淋巴细胞性白血病)、移植物抗宿主疾病。自身免疫疾病的实例有全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、Crohn’s病、银屑病。本发明的肽或多聚结构或缀合物还适用于免疫耐受性的诱导。 
合成肽代表了对mAb的替代途径，以抑制分子之间的相互作用。使用合成肽的理论是，蛋白质仅通过小的外部区域发挥它们的生物学效应，其中仅少数氨基酸对适当的受体功能是关键的。因而，与这些区域相应的序列可以以保持了必需氨基酸残基的更短的、构象正确的形式来合成。照这样，有可能获得特异性识别目标受体的活性位点的短肽，但是其是生物学无活性的，并且提供了空间位阻，从而防止受体与天然蛋白质之间的相互作用。能够模拟激动剂和受体之间的相互作用的这些肽的主要理论优点是它们有限的大小，这使得它们容易溶于水中和是非免疫原性的，容许它们施用更长的时间段(Allen S.D.et al，J.Peptide Res.2005；Ladner R.C.et al，DDT 2004)。 
然而，能够有效地抑制CD40:CD154相互作用的氨基酸序列的鉴 定不是显而易见的结果。如将在下文更详细地说明的，即使是本发明的肽序列(SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：6)的单个氨基酸残基的修饰，实际地引起了结合人类CD154的活性位点的能力的丧失，因而，引起所述肽的抑制能力的丧失。 
如上文提及的，根据本发明的肽包括序列表中SEQ ID NO：13指定的氨基酸序列或SEQ ID NO：6指定的肽序列。这样的肽显示了对人类CD154的活性位点的非常高的结合特异性。它能够识别和结合CD154的活性位点，结果，能够在体内和体外有效地阻断受体，从而抑制由这样的相互作用引起的生物学效应。在以下的说明书中，由SEQ ID NO：6组成的根据本发明的肽将被称为“肽4.10”。 
以下的实验小节说明的结果显示了，本发明的肽4.10能够防止被人类CD154的重组可溶性形式(重组人类可溶的CD154，或rhsCD154)刺激所诱导的B细胞上的CD40的活化。对CD40:CD154相互作用所发挥的干扰阻止了B细胞活化和产生的免疫反应。发明人已经展现了，肽4.10能够抑制B细胞上其他共刺激分子，例如CD80和CD86的诱导，以及免疫球蛋白的同种型转换。此外，肽4.10能够在体外阻断内皮细胞的rhsCD154诱导的活化，评估为细胞迁移和形成血管样结构的能力。肽4.10的这样的抗血管生成活性在SCID小鼠中的鼠血管生成Matrigel模型中在体内是更为明显的，这在下文更详细地描述。最后，发明人获得的初步数据显示了，肽4.10能够诱导来自CLL患者的B细胞中的急剧的细胞凋亡。 
关于包含短肽的缀合物和药物组合物的制备和施用技术的进一步的细节是现有技术中已知的；其详细说明在此不是必需的，因为这对于理解本发明不是必不可少的。 
如将在以下的实验小节中说明的，本说明书说明了特异性针对人类CD154的7个氨基酸序列的鉴定。特别是，选择和表征了能够结合人类CD154的七个环状的epta-肽。采用包含人类CD154的N-末端结构域的融合蛋白来选择所述肽。在七个选择和表征的epta-肽之中，被实际证明能够抑制CD40:CD154相互作用的唯一一个是本发明的肽4.10。此外，通过1或2个氨基酸残基的突变来修饰肽4.10的氨基酸序列，试图选择肽4.10的有用的备选形式。然而，备选形式都没有保持抑制CD40:CD154相互作用的能力，也没有保持与这种相互 作用相关的生物学效应。 
参考附图和以下提供的表格，仅通过举例的方式提供了以下的详细说明，其中： 
附图1的直方图显示了选定的噬菌体克隆对J558L细胞的结合，J558L细胞是被转染用于人类CD154在细胞表面上表达的鼠骨髓瘤细胞系。通过流式细胞术、通过J558L细胞与噬菌体的孵育、然后与抗M13单克隆抗体的孵育，展现了选定的噬菌体与细胞的结合。对于每种实验条件，分析了10,000个事件，数值是3个不同实验的平均值和标准偏差。所有12个选定的克隆结合J558L细胞。 
表I显示了从人类CD154结合克隆获得的肽插入物的7个氨基酸序列。称为4.1、4.5和4.9的克隆的插入物由于重组而丧失了，而称为4.2和4.3的克隆的插入物，以及称为4.7和4.12的克隆的插入物被证明是相同的。 
附图2表现了用6组氨酸尾部(-His6)标签化的、从人类CD154结合克隆获得的七种肽与J558L CD154+细胞的结合。通过流式细胞术展现了肽与细胞的结合。细胞与每种His6标签化的肽孵育，然后与特异于His6尾部的藻红素缀合的二级抗体孵育。打点的直方图是同位素对照，而黑色的线条是CD154特异性肽的结合强度[4.2＝4.3＝CPSGHTKAC(SEQ ID NO.1)，4.4＝CGTHSSRIC(SEQ ID NO.2)，4.6＝CLGTQNKEC(SEQ ID NO.3)，4.7＝4.12＝CTPGKPHSC(SEQ ID NO.4)，4.8＝CKAASANIC(SEQ ID NO.5)，4.10＝CLPTRHMAC(SEQ ID NO.6)和4.11＝CLSAVHNMC(SEQ ID NO.7)]。对于每种实验条件，分析了10,000个事件，数值是3个不同实验的平均值和标准偏差。所有的肽能够特异性结合J558L CD154+细胞上的CD154，不能够结合对照J558细胞。 
附图3A显示了抗CD154肽与特异于CD154的活性位点的抗人类CD154荧光素缀合的抗体之间的竞争。用人类CD154转染的鼠骨髓瘤细胞J558L，与用6组氨酸尾部(-His6)标签化的七种抗CD154肽的每一种孵育，然后与抗CD154荧光素缀合的抗体孵育。作为与阳性对照相比的荧光强度的降低，所述阳性对照由与抗人类CD154荧光素缀合的抗体单独孵育的细胞所代表，通过流式细胞术来评估所述肽与抗CD154抗体竞争对J558L细胞表面上表达的CD154分子的结合的能力。根据所述附图明显的是，肽4.10(SEQ ID NO：6)是能 够与抗人类CD154抗体竞争并显著地替换它的结合的唯一一个。附图3B显示了肽4.10(SEQ ID NO：6)和用作对照的肽4.10-ala(SEQID NO：8)之间的比较。对照肽的氨基酸序列与肽4.10的氨基酸序列不同在于在氨基酸位置5的精氨酸残基被替换为丙氨酸残基。精氨酸残基明显是关键的，因为它的缺乏导致了肽与抗CD154荧光素缀合的抗体竞争人类CD154的能力的完全失活，如附图3B清楚地显示的。 
附图4A的直方图显示了抗CD154肽和对照肽4.10-ala对可溶的重组人类CD154分子(rhsCD154)刺激所诱导的活化B细胞的影响。在不存在和存在阻断性抗人类CD154抗体或七种选定的肽之一的情况下，B细胞用rhsCD154刺激48小时。作为共刺激分子CD80和CD86的膜表达，通过流式细胞术评估外周B细胞活化。如附图4A清楚地显示的，用人类可溶的CD154(rhsCD154)刺激B细胞48小时诱导了在细胞表面上CD80和CD86的强表达。相反地，当rhsCD154与阻断性抗人类CD154抗体、或与肽4.10(SEQ ID NO：6)组合使用时，活化被阻止了。其余的肽都不能显著地抑制rhsCD154诱导的B细胞活化。附图4B显示了细胞计量术分析的细节。 
附图5A的图形显示了分别在没有刺激的基础条件下、在用IL4和CD154刺激72小时之后、在用IL4和CD154与阻断性抗人类CD154抗体组合刺激72小时之后、或在用IL4和CD154与肽4.10(SEQ ID NO：6)组合刺激72小时之后，经历了同种型转换并表达IgG的首次用于实验的B细胞的百分比。正如抗CD154抗体一样，肽4.10(SEQ ID NO：6)能够强烈地抑制rhsCD154和IL4刺激所诱导的免疫球蛋白同种型转换。附图5B显示了细胞计量术分析的细节。 
附图6显示了在不存在或存在肽4.10(SEQ ID NO：6)、或对照肽4.10-ala(SEQ ID NO：8)、或阻断性抗人类CD154抗体的情况下，CD 154诱导的刺激对HUVECS(HUVEC＝人类脐静脉内皮细胞)的运动性的影响。特别地，附图6A显示了在各种实验条件下在4小时的时间内细胞迁移的时间推移的动力学；附图6B显示了在上述实验条件下刺激30分钟之后在细胞迁移速度方面观察到的差异；附图6C显示了时间推移的分析的代表性的图像。与肽4.10-ala(SEQ ID NO：8)相反，肽4.10(SEQ ID NO：6)抑制rhsCD154诱导的内皮细胞的运 动性。 
附图7A显示了在没有刺激的基础条件下、或在存在/不存在阻断性抗人类CD154抗体、或肽4.10(SEQ ID NO：6)、或对照肽4.10-ala(SEQ ID NO：8)的情况下用rhsCD154刺激之后，Matrigel平板接种的HUVEC形成血管样细胞索带的能力。附图7B-F显示了在上述的各种实验条件下在Matrigel上细胞索带形成能力的代表性的图像(B＝未刺激的对照；C＝rhsCD154；D＝rhsCD154+4.10肽；E＝rhsCD154+4.10-ala肽；F＝rhsCD154+阻断性抗CD154抗体)。与对照肽4.10-ala(SEQ ID NO：8)相反，本发明的肽4.10(SEQ ID NO：6)抑制rhsCD154诱导的内皮细胞形成细胞索带的能力。 
附图8显示了在存在/不存在肽4.10(SEQ ID NO：6)的情况下rhsCD154诱导的刺激，对与250μl Matrigel组合地皮下地接种到SCID小鼠的髋部的内皮HUVEC细胞的体内影响。接种后7天，杀死小鼠，采集移植物，固定在10％甲醛溶液中，包埋在石蜡中，准备用于组织学分析。附图8A显示了在苏木色素-伊红染色的组织切片上，在基础条件下和在上述的其他实验条件下血管化的区域的定量。附图8B和8C是在分别使用单独的rhsCD154、或使用与肽4.10(SEQ ID NO：6)组合的rhsCD154的内皮细胞刺激时所获得的血管生成的两个代表性的图像。六只SCID小鼠用于每种实验条件。肽4.10在体内完全地抑制rhsCD154诱导的血管生成。 
附图9显示了本发明的肽4.10(SEQ ID NO：6)抑制IL-4刺激所诱导的CLL细胞的存活的能力。 
附图10显示了在用单独的ADP 0.5μM刺激之时，或在37℃用rhsCD154、或用与肽4.10(SEQ ID NO：6)组合的rhsCD 154、或用与由rhsCD154和抗人类CD154抗体组成的免疫复合物组合的rhsCD154刺激10分钟、之后用ADP 0.5μM刺激之时的人类血小板聚集。作为与对照相比的光透过的提高，用集合度计测量血小板聚集。使用与rhsCD154组合的抗人类CD154抗体的人类血小板的预处理(Priming)提高了在用ADP 0.5μM刺激时的血小板聚集。相比之下，单独的rhsCD154，或与肽4.10组合的rhsCD154，不影响用ADP 0.5μM刺激时诱导的血小板聚集水平。这些结果显示了，本发明的肽4.10(SEQ ID NO：6)与CD154分子之间的相互作用不诱导血小板聚集， 相反地，其由与抗CD154抗体的相互作用所诱导。 
仅通过举例的方式提供以下的实验小节，它不意味着限制本发明的范围，本发明的范围由附随的权利要求定义。 
实验小节
在这项研究中，使用了在M13噬菌体中表达的、由遗传地融合到capside pIII噬菌体蛋白并在噬菌体表面随机表达的7个氨基酸残基的肽序列的组(肽变异性＜109)组成的肽文库，所述肽序列具有处于两个末端的2个侧翼半胱氨酸，其允许通过二硫键环化。噬菌体文库通过由本发明人从早先已知的模型开发的体外生物淘选模型来筛选(Hetian L.et al，J.Biol.Chem.2002)。噬菌体(在200μl TBS中的1x1011CFU)在室温下与早先附着于平板的人类重组CD154孵育1小时。噬菌体用TBS-T洗涤几次来除去未结合CD154的非特异性噬菌体，结合CD154的噬菌体通过用100μl的0.2M甘氨酸、pH2.2洗脱来收集，在10分钟后用15μl的1M Tris-HCl、pH9.1中和。噬菌体数量通过滴定，将洗脱物的连续稀释物添加到LB琼脂(琼脂糖7g/升，MgCl2·6H2O 1g；Sigma)上的宿主四环素-抗性大肠杆菌ER2738细胞(New England Biolabs，Hitchin，U.K.)，并在存在四环素(Kramel Biotech，Cramlington，U.K.)的情况下在IPTG/X-Gal LB琼脂上平板接种来评估。在37℃孵育12小时之后，对在平板上作为蓝色斑块可见的噬菌体菌落的数量进行计数。洗脱的噬菌体通过在存在四环素的情况下在IPTG/X-Gal LB琼脂平板上培养噬菌体来扩增，挑取，通过在3.3％polietilen乙二醇8.000/0.4M NaCl(Sigma)中离心来沉淀。然后如上所述的滴定噬菌体，在包被了人类重组CD154的新的平板上重新孵育。筛选和扩增过程重复四次以富集人类CD154特异性噬菌体克隆的文库。在第四个扩增轮次之后，随机选择12个噬菌体克隆，独立的扩增，测试它们识别细胞表面上CD154表达物的能力。单独的选定的克隆的特异性结合在体外通过流式细胞术，利用称为J558L的、为了人类CD154的表达被转染的鼠骨髓瘤细胞系作为参考细胞系来展现。在室温孵育30分钟后，噬菌体(1011cfu)与J558L细胞的结合通过流式细胞术、通过将细胞与针对噬菌体蛋白质M13的单克隆抗体(Pharmacia，Uppsala，Sweden)孵育、随后与抗小鼠藻 红素缀合的抗体(Sigma)孵育的间接免疫荧光来检测。如在附图1中所示的，所有12种噬菌体克隆能够特异性结合人类CD154表达细胞(J558L)，但是它们不结合对照的CD154阴性(J558)细胞。 
测序12个噬菌体克隆的肽插入物，获得了在表I中列出的7种不同序列。合成所述肽，并与生物素(-bio)或与6-组氨酸尾部(-his6)缀合，以允许体外和体内定位。同样地，肽与J558L细胞的结合，通过在室温下使细胞与-his6标签化的肽(-his6肽-60μM)孵育30分钟、随后在4℃与抗聚组氨酸-藻红素缀合的抗体(Sigma)孵育30分钟，通过流式细胞术来展现。所有七种选择的肽显示了针对J558LCD154+细胞的良好亲和力，然而它们不结合对照细胞J558(附图2)。此外，进行了肽与特异性识别CD154的活性位点的抗人类CD154荧光素缀合的抗体(Serotec)之间的竞争分析。J558L细胞在室温下与his6肽孵育30分钟，然后在室温下与抗人类CD154荧光素缀合的抗体孵育另外30分钟。附图3A显示了肽4.10是唯一一个能够显著地抑制抗人类CD154-荧光素缀合的抗体与J558L细胞之间的相互作用的。为了鉴定对于与CD154的结合关键的肽4.10的氨基酸序列的氨基酸残基，合成了三种不同的肽，每一种带有点突变，所述氨基酸序列与肽4.10不同在于分别在位置4、5、6的氨基酸残基用一个丙氨酸残基替换。 
突变的肽不能识别J558L细胞的表面表达的人类CD154(数据未显示)。最低反应性的肽，具有氨基酸序列CLPTAHMAC(SEQ ID NO：8)，称为4.10-ala，被选为对照肽(附图3B)。 
用具有表II中列出的氨基酸序列的四种修饰的肽4.101、4.102、4.103、4.104获得了类似的结果。这些肽都没有被证明能够结合CD154+J558L细胞的表面上表达的人类CD154(数据未显示)。 
已知B细胞在细胞膜上组成型地表达CD40分子(van Kooten C.etal，J.Leukoc.Biol.2000)。通过表达CD154的活化的T细胞的CD40的刺激，引起B细胞活化、增殖和同种型转换。本发明人采用了通过梯度-Ficoll离心和免疫磁性分离(MACS系统-Milteniy)从健康供体的完整外周血分离的B细胞。由此获得的静息的B细胞，然后用可溶形式的人类重组CD154(rhsCD154)刺激来诱导活化和共同刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)在细胞膜上的表达。在用rhsCD154 (100ng/ml)刺激48小时之后，观察到CD80和CD86在外周B细胞的细胞表面上膜表达的急剧提高。与基础水平相比，表达分别提高300％和274％。相比之下，在淋巴细胞刺激之前，在37℃下rhsCD154(100ng/ml)与肽4.10(SEQ ID NO：6)预孵育15分钟，阻断了B细胞刺激和CD80和CD86的相关的表达。肽4.10(SEQ IDNO：6)的抑制效果在60μM的浓度达到峰值，CD80和CD86的表达分别降低到107％和130％(附图4A和4B)。有可能在甚至更低的浓度(30μM)观察到这样的效果。相比之下，rhsCD154(100ng/ml)与相同浓度(60μM)的其他肽预孵育，不显著地影响由rhsCD154刺激诱导的CD80和CD86的表达。在更高的浓度(250μM)下，肽4.6(SEQ ID NO：3)和4.11(SEQ ID NO：7)也显示了B细胞活化的抑制作用：特别是，肽4.6(SEQ ID NO：3)降低了CD80的表达到117％以及CD86的表达到122％，而肽4.11(SEQ ID NO：7)的效果不是稳定地可重复的。相比之下，rhsCD154(100ng/ml)与对照肽4.10-ala(SEQ ID NO：8)甚至在250μM浓度下的预孵育，既没有影响rhsCD154刺激所诱导的CD80和CD86的表达，也没有显著地降低B细胞活化，也没有降低CD80和CD86的表达水平(附图4A)。作为阻断对照，rhsCD154(100ng/ml)在进行的所有实验中在B细胞刺激之前，在37℃与阻断性抗人类CD154抗体(Alexis)孵育15分钟，所述抗体完全地抑制CD40介导的B细胞活化并降低CD80和CD86的表达到基础水平(附图4A和4B)。结果是五个不同的实验的平均值±标准偏差。用分离自人类脾脏部分的B细胞也获得了类似的结果。此外，在首次用于实验的(naive)B细胞群体上进行的其他实验中，肽4.10显示了有效抑制CD40介导的B细胞Igs的同种型转换。这些实验在通过经由免疫磁性分离(MACS系统Milteniy)从B细胞库耗尽成熟淋巴细胞，通过阴性选择从外周血获得的CD27-首次用于实验的B细胞上进行。本发明人展现了，当首次用于实验的B细胞在低葡萄糖DMEM(Sigma)中在存在IL-4(0.4ng/ml)和rhsCD154(100ng/ml)的情况下培养96小时时，诱导了表达膜IgG的B细胞的数量的显著提高(25％)。相比之下，仅非常低比例的用与肽4.10(SEQ IDNO：6)组合的IL-4(0.4ng/ml)和rhsCD154(100ng/ml)刺激的B细胞经历同种型转换(附图5A和5B)。类似地，利用与阻断性抗人 类CD154抗体组合的IL-4(0.4ng/ml)和rhsCD154(100ng/ml)的首次用于实验的B细胞的刺激不诱导同种型转换(附图5A和5B)。 
已知的是炎症过程一旦被触发，可以通过免疫系统外部的、表达特定受体或淋巴细胞共同刺激分子如CD40和它的配体CD154的细胞，例如来自血管壁的内皮细胞被保留。因而，发明人展现了，肽4.10(SEQ ID NO：6)除了抑制淋巴细胞刺激和/或成熟之外，能够限制炎症，阻断在内皮细胞的细胞表面上表达的CD40分子的刺激。发明人实际上展现了，作为单细胞迁移和作为它们在基底基质(Matrigel)上形成血管样细胞索带的能力所体外评估的、通过施用rhsCD154(100ng/ml)的内皮CD40刺激所诱导的促血管生成效应，通过在37℃使rhsCD154(100ng/ml)与本发明的抗CD154肽4.10(SEQID NO：6)预孵育15分钟，被抑制了。特别地，细胞迁移实验用HUVEC细胞进行，所述HUVEC细胞在存在20％血清的情况下在完全内皮细胞培养基中以4x103的密度平板接种在明胶上。第二天，内皮培养基被替换为具有降低的血清浓度(5％)、存在或不存在rhsCD154(100ng/ml)的低葡萄糖DMEM(Sigma)。 
此外，为了评估抑制效果，rhsCD154(100ng/ml)在37℃与肽4.10(SEQ ID NO：6)、或与对照肽4.10-ala(SEQ ID NO：8)、或与阻断性抗人类CD154抗体预孵育15分钟。然后在装备有恒温室(在大约37℃)的相差倒置显微镜下，在10×放大率下观察烧瓶4小时的时间。用连接到所述显微镜的照相机，在4小时的整个时间中以每次15分钟的定期间隔对细胞照像。每种细胞的迁移速度利用图像分析软件，根据在每个单幅中每个细胞的核的位置来计算，结果，对每种实验条件计算平均细胞迁移速度(±标准偏差)。如在附图6A和6B中所示，rhsCD154(100ng/ml)对内皮CD40的刺激诱导了细胞的基础运动性(其总是低于12μm/h)的提高约350％(42μm/h)，而rhsCD154(100ng/ml)在37℃与肽4.10(SEQ ID NO：6)预孵育15分钟，以及与阻断性抗人类CD154抗体预孵育，激烈地降低了细胞的运动性到低于基础水平。相比之下，对照肽4.10-ala(SEQ IDNO：8)不影响内皮的CD40刺激(附图6A、6B、6C)。作为肽4.10阻止rhsCD154(100ng/ml)的人类内皮CD40刺激的能力的进一步确认，HUVEC(3.5X104)经历了体外血管生成分析。HUVECs在补充 有5％血清的基础RPMI培养基中平板接种到能够促进超细胞组织(super cellular organization)的形成的肿瘤基质(Matrigel，BD)上。在37℃在5％CO2下孵育4小时，在相差倒置显微镜下观察细胞。附图7A和7C显示了在4小时后，rhsCD154(100ng/ml)的刺激诱导了复杂的内皮网络的形成，而rhsCD154(100ng/ml)在37℃与肽4.10(SEQID NO：6)、以及与阻断性抗人类CD154抗体预孵育15分钟，完全地取消了刺激(附图7A、7D和7F)。相反地，rhsCD154(100ng/ml)在37℃与对照肽4.10-ala(SEQ ID NO：8)预孵育15分钟，不影响细胞形成血管样细胞索带的能力(附图7E)。其他抗人类CD154肽，例如不特异性地结合活性位点的4.6(SEQ ID NO：3)和4.11(SEQ IDNO：7)，不能显著地降低内皮CD40的刺激(数据未显示)。 
最后，在体内血管生成分析中测试了肽4.10的抗血管生成效果。重悬浮在200μl HANK’S溶液中的内皮HUVEC细胞(2X106)与含有rhsCD154(100ng/ml)的500μl的处于液态的Matrigel混合，分别在存在和不存在肽4.10(SEQ ID NO：6)的情况下，在髋部的右侧和左侧皮下地接种到SCID小鼠中。6天后，杀死小鼠，回收Matrigel栓塞并固定在10％甲醛溶液中至少24小时，然后处理用于免疫组织化学分析。HUVEC和rhsCD154移植物的苏木色素-伊红染色的组织切片显示了强的血管生成(附图8A和8B)，在sCD154与肽4.10(SEQ ID NO：6)预孵育的接种物中，这被显著地抑制或完全没有，其中大部分的细胞经历了细胞凋亡(附图8A和8C)。 
肽4.10(SEQ ID NO：6)还被证明能够抑制通过在存在IL-4的情况下培养而体内获得的CLL肿瘤细胞存活。CLL细胞的对细胞凋亡的抗性和增强的存活被认为对这些肿瘤细胞在慢性淋巴细胞性白血病患者中的体内扩增负责。这些结果表明，CD40和它的配体CD154之间的相互作用对于刺激CLL细胞存活是重要的，使用能够识别CD154的活性位点的肽对CD40:CD154相互作用的抑制可以抑制这些细胞的存活(附图9)。 
最后，肽4.10的一个主要优点是它缺乏对人类血小板的反应性。过去已知的是，测试有前途的抗CD154单克隆抗体而进行的许多临床试验由于显著的促血栓形成副作用而突然中止(Kelsoe G.et al，J.Clin.Invest.2003)。假说是，抗CD154抗体触发了表达Fc免疫球 蛋白部份的受体(FcR)、以及在活化后表达CD154分子的人类血小板的表面上的交叉反应。因而，发明人通过血小板聚集分析测试了肽4.10对血小板的作用。这种实验通过利用装备有磁性搅拌器和实时光密度计的恒温集合度计来进行。作为对比参考样品(空白)的光密度方面的改变，评估血小板聚集。实验在从采集到含有5U/ml肝素的试管中健康供体的外周全血提取的血小板上进行。特别地，血小板富集的血浆(PRP)通过在900rpm离心全血20分钟来获得，而用作参考样品的少血小板血浆(PPP)在3000rpm另外离心10分钟后采集上清液获得。如早先由Langer(Langer F.et al，Thromb.Haemost.2005)展现的，通过在37℃与由重组人类可溶CD 154和抗CD154单克隆抗体组成的免疫复合物孵育10分钟来预处理血小板，增强了由随后用ADP 0.5μM的刺激所诱导的血小板聚集(附图10)。相反地，用单独的CD154，或与肽4.10(60μM)组合的CD154来预处理不增强由ADP 0.5μM刺激所诱导的血小板聚集(附图10)。用0.3U/ml凝血酶诱导血小板聚集获得了类似的结果。 
由于内皮细胞常常在它们的表面表达CD40，特别是在炎症位点处，以及由于血管生成在几种炎症过程和疾病的发生中起到重要作用，本发明的4.10肽的上文说明的性质使得这样的肽成为用于潜在的抗炎方法的开发的非常有前途的分子。此外，4.10肽(SEQ IDNO：6)对淋巴细胞活化发挥的抑制作用，提供了这种分子作为针对移植的、或针对肿瘤疾病的免疫抑制疗法的潜在用途，在所述肿瘤疾病中，肿瘤细胞增殖由来自CD40的刺激的抗细胞凋亡作用所支持，例如，在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中。 
表Ⅰ 
  克隆  序列   SEQ ID NO：
  4.1  -   -
  4.2＝4.3  CPSGHTKAC   1
  4.4  CGTHSSRIC   2
  4.5  -   -
  4.6  CLGTQNKEC   3
  4.7＝4.12  CTPGKPHSC   4
  4.8  CKAASANIC   5
  4.9  -   -
  4.10  CLPTRHMAC(＊)   6
  4.11  CLSAVHNMC   7
(*)根据本发明的肽 
表Ⅱ 
  克隆   序列   SEQ ID NO：
  4.10-ala   CLPTAHMAC   8
  4.101   CIPTRHMAC   9
  4.102   CLPSRHMAC   10
  4.103   CIPTRHMVC   11
  4.104   CLPTRWMAC   12
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序列表
<110>FRESENIUS MEDICAL CARE DEUTSCHLAND GMBH
<120>人类CD154结合合成肽和其用途
<130>PC862EC
<160>13
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>随机选自在M13噬菌体中表达的肽文库
<400>1
Cys Pro Ser Gly His Thr Lys Ala Cys
1                5
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>随机选自在M13噬菌体中表达的肽文库
<400>2
Cys Gly Thr His Ser Ser Arg Ile Cys
1                5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>随机选自在M13噬菌体中表达的肽文库
<400>3
Cys Leu Gly Thr Gln Asn Lys Glu Cys
1                5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>随机选自在M13噬菌体中表达的肽文库
<400>4
Cys Thr Pro Gly Lys Pro His Ser Cys
1                5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>随机选自在M13噬菌体中表达的肽文库
<400>5
Cys Lys Ala Ala Ser Ala Asn I1e Cys
1                5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>随机选自在M13噬菌体中表达的肽文库
<400>6
Cys Leu Pro Thr Arg His Met Ala Cys
1                5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>随机选自在M13噬菌体中表达的肽文库
<400>7
Cys Leu Ser Ala Val His Asn Met Cys
1                5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>随机选自在M13噬菌体中表达的肽文库
<400>8
Cys Leu Pro Thr Ala His Met Ala Cys
1                5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>SEQ ID NO：6的修饰物
<400>9
Cys Ile Pro Thr Arg His Met Ala Cys
1                5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>SEQ ID NO：6的修饰物
<400>10
Cys Leu Pro Ser Arg His Met Ala Cys
1                5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>SEQ ID NO：6的修饰物
<400>11
Cys Ile Pro Thr Arg His Met Val Cys
1                5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>从SEQ ID NO：6修饰的
<400>12
Cys Leu Pro Thr Arg Trp Met Ala Cys
1                5
<210>13
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>从SEQ ID NO：6修饰的
<400>13
Leu Pro Thr Arg His Met Ala
1                5

Claims (13)

1.一种能够选择性地结合CD154受体的活性位点并能够抑制CD40:CD154相互作用的肽，其由能与CD154结合的氨基酸序列SEQ IDNO：13或氨基酸序列SEQ ID NO：6组成。
2.多聚肽，其能够选择性地结合CD154受体的活性位点并能够抑制CD40:CD154相互作用，由以下结构组成：
其中L是Leu，P是Pro，T是Thr，R是Arg，H是His，M是Met，A是Ala，G是Gly以及K是Lys。
3.根据权利要求1的肽或根据权利要求2的多聚肽用于制备用于治疗与CD40:CD154相互作用相关的疾病或病症的药物的用途。
4.根据权利要求3的用途，其中所述疾病或病症是炎症。
5.根据权利要求4的用途，其中所述炎症是选自动脉粥样硬化、自身免疫疾病、移植排斥的炎性疾病。
6.根据权利要求5的用途，其中所述自身免疫疾病是全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、Crohn’s病或银屑病。
7.根据权利要求4的用途，其中所述炎症选自由与关节炎、接触性皮炎、高IgE综合征、炎症性肠病、变态反应、自发性炎性疾病相关的炎症构成的组。
8.根据权利要求7的用途，其中所述变态反应是过敏性哮喘。
9.根据权利要求5的用途，其中移植排斥涉及移植的胰岛细胞、皮肤、骨髓、肝脏、心脏和肾脏。
10.根据权利要求3的用途，其中所述疾病是肿瘤疾病。
11.根据权利要求10的用途，其中所述肿瘤疾病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
12.根据权利要求3的用途，其中所述疾病是移植物-抗-宿主疾病。
13.一种用于治疗与CD40:CD154相互作用相关的疾病或病症的药物组合物，包含有效量的根据权利要求1的肽或根据权利要求2的多聚肽，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
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