TW202043263A - Ｇｐｒｃ５ｄ嵌合抗原受體及表現其之細胞 - Google Patents

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拉傑庫瑪 甘尼尚
弗朗索瓦 高迪
布拉德利 海德里希
卡門巴卡 瓊斯
約翰 李
黎穎哲
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Abstract

本揭露提供特異性靶向G蛋白偶聯受體(G蛋白偶聯受體C家族5組成員D(GPRC5D))之嵌合抗原受體(CAR)、及包含此類CAR之免疫反應性細胞，以用於治療癌症。

Description

GPRC5D嵌合抗原受體及表現其之細胞
本發明係關於靶向GPRC5D之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)，其包含GPRC5D單鏈可變片段；及表現該等CAR的經工程改造之靶向GPRC5D之免疫細胞。亦提供編碼該等CAR之核酸及表現載體、含有該等載體之重組細胞、及包含表現該等靶向GPRC5D之CAR的經工程改造之免疫細胞的組成物。亦提供製造該等CAR、及經工程改造之免疫細胞的方法、及使用該等經工程改造之免疫細胞治療包括癌症之病況的方法。
T細胞療法利用已經基因修飾之經單離T細胞，以增強彼等對於特定腫瘤相關抗原之特異性。基因修飾可涉及嵌合抗原受體(CAR)或外源性T細胞受體之表現，以在T細胞上提供新的抗原特異性。表現嵌合抗原受體之T細胞(CAR-T細胞)可誘導腫瘤免疫反應性。需要更好的利用CAR-T細胞之癌症療法。
本文中所揭示者係嵌合抗原受體(CAR)(例如靶向G蛋白偶聯受體(G蛋白偶聯受體C家族5組成員D(GPRC5D))之CAR)、包含該等CAR之 細胞、編碼該等CAR之載體(例如重組表現載體)、及編碼該等CAR之核酸分子、製造該等CAR、組成物、多肽、蛋白質、核酸、宿主細胞、細胞群之方法、及使用所揭示之CAR治療病症(例如癌症)的方法。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的重鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的重鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的重鏈CDR3；或
具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR3；
其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個實施例中：
胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列 的重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：71之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：49之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或
胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、 具有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(light chain variable region,LCVR)，其包含選自由SEQ ID NO：73、65、1、3、及5所組成之群組的胺基酸序列；或重鏈可變區(heavy chain variable region,HCVR)，其包含選自由SEQ ID NO：72、64、2、4、及6所組成之群組的胺基酸序列；或包含選自由SEQ ID NO：73、65、1、3、及5所組成之群組的胺基酸序列之LCVR、與包含選自由SEQ ID NO：72、64、2、4、及6所組成之群組的胺基酸序列之HCVR的組合。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含：
包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈可變區；
包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈可變區；
包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區；
包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈可變區；或
包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含單鏈可變片段(single-chain variable fragment,scFv)。在一些實施例中，scFv包含在輕鏈可變區與重鏈可變區之間的連接子多肽(linker polypeptide)。
在一個實施例中，連接子多肽包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
在一個實施例中，scFv包含選自由SEQ ID NO：78、77、75、76、8、9、10、24、25、及26所組成之群組的胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含信號多肽。在一些實施例中，信號多肽包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞內信號傳導域包含選自由下列所組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9(CD137)組分、T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分、分化簇(CD27)組分、分化簇超家族成員(諸如例如CD28或誘導性T細胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator,ICOS))組分、及其組合。
在一個實施例中，CD137組分包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在一個實施例中，CD3z組分包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。
在一個實施例中，跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽。在一些實施例中，CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
在一個實施例中，CAR進一步包含將跨膜域連接至胞外抗原結合域之鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區係CD8a鉸鏈區。在一些實施例中，CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO：82、81、80、79、17、18、19、20、21、及22所組成之群組的胺基酸序列。
在一個實施例中，本揭露之CAR包含選自由SEQ ID NO：86、85、83、84、27、28、29、30、31、及32所組成之群組的胺基酸序列。
在一個態樣中，本揭露提供表現如本文中所述之CAR的經單離淋巴球。在一些實施例中，淋巴球係T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球係初始T細胞(naïve T cell)。在一些實施例中，T淋巴球係幹細胞樣記憶T細胞(memory stem T cell)。在一些實施例中，T淋巴球係中央記憶T細胞(central memory T cell)。在一些實施例中，T淋巴球係CD4+。在一些實施例中，T淋巴球係CD8+。在一些實施例中，T淋巴球係CD4+及CD8+。
在一個態樣中，本揭露提供編碼本文中所述之CAR中任一者的經單離核酸分子。在一些實施例中，核酸分子包含選自由SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、及38所組成之群組的核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、或38之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一個實施例中，本揭露提供一種包含該核酸分子之載體。在一個實施例中，本揭露提供一種表現該核酸分子之細胞。
在一個態樣中，本揭露提供組成物(例如醫藥組成物)，其包含有效量的表現一或多種所述CAR的淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。
在一個態樣中，本揭露提供治療患有癌症之對象的方法，該等方法包含向有需要之對象投予治療有效量的表現一或多種所述CAR的淋巴球，藉此該淋巴球誘導殺滅該對象之癌細胞。在一個實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：膀胱癌、轉移性膀胱癌、食道癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、前列腺癌、泌尿上皮癌、小細胞肺癌、子宮內膜癌、膽管癌、肝細胞癌、肉瘤、起源於鱗狀細胞之實體腫瘤、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌(bladder urothelial carcinoma)、轉移性黑素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)、急性淋巴球性白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)、慢性骨髓性白血病(myelogenous leukemia,CML)、燜燃型多發性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma,SMM)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)、及其組合。在一個實施例中，對象正接受治療的癌症係多發性骨髓瘤。
在一個態樣中，揭示一種靶向殺滅癌細胞之方法，該方法包含使該癌細胞與表現一或多種所述CAR的淋巴球接觸，藉此該淋巴球誘導殺滅該癌細胞。在一些實施例中，癌細胞係選自由下列所組成之群組：肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、肝細胞癌細胞、腎細胞癌細胞、膀胱泌尿上皮癌細胞、轉移性黑色素瘤細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞、子宮頸癌細胞、頭頸癌細胞、胰腺癌細胞、神經膠質瘤細胞、神經膠質母細胞瘤細胞、及非霍奇金氏淋 巴瘤(NHL)細胞、急性淋巴球性白血病(ALL)細胞、慢性淋巴球性白血病(CLL)細胞、慢性骨髓性白血病(CML)細胞、燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)細胞、多發性骨髓瘤(MM)細胞、急性骨髓性白血病(AML)細胞、及其組合。在一個實施例中，癌細胞係多發性骨髓瘤細胞。
前述內容由下列例示實施例之更具體描述將顯而易見，如附圖所示。
〔圖1〕顯示將初代人類泛T細胞在沒有mRNA情況下電穿孔(模擬物)或電穿孔導入10μg的表現α-GPRC5D scFv CAR或同型對照CAR之mRNA的流式細胞分析。電穿孔後24小時，在用生物素化L-蛋白及經鏈黴親和素接合之PE染色之後，藉由流式細胞術測量CAR表面表現。空心直方圖係模擬物，實心灰色直方圖係CAR-T族群。
〔圖2〕顯示將經暫時轉染之泛T細胞與多發性骨髓瘤細胞系共培養的流式細胞分析。在暫時轉染之後二十四小時，將初代泛T細胞用Cell Trace Violet(CTV)螢光增生染料標示，然後與多發性骨髓瘤細胞系H929共培養。共培養後四天，預先圈選在CD8+CD4-族群上之細胞，並將CAR-T上的活化標記CD25及CD71之表面表現與單獨培養之T細胞或在α-CD3/CD28珠粒存在下培養之T細胞進行比較。
〔圖3〕顯示將初代泛T細胞用表現CAR之mRNA暫時轉染並與各種骨髓瘤細胞系共培養的細胞介素概況分析。將先用表現CAR之mRNA暫時轉染24小時之初代泛T細胞以1：1比率與各種骨髓瘤細胞系共培養，該等骨髓瘤細胞系以高 (+++)、中(++)、低(+)、或陰性(-)水平表現目標抗原GPRC5D。共培養後十六小時，收集上清液，並藉由Meso Scale Discovery(MSD)執行來自共培養物之上清液的細胞介素概況分析。
〔圖4〕顯示將初代泛T細胞用表現CAR之mRNA暫時轉染並與自體周邊血液單核細胞(PBMC)及多發性骨髓瘤細胞系共培養的細胞介素概況分析。在用表現CAR之mRNA暫時轉染之後二十四小時，將初代泛T細胞與自體PBMC及多發性骨髓瘤細胞系H929共培養(以1：1：1比率)。共培養後十六小時，收集上清液。將藉由MSD之來自含有所有三個族群(CAR-T、H929、自體PBMC)之共培養物之上清液的細胞介素概況分析與缺少CAR-T細胞、PBMC、或H929之對照共培養物、與單獨培養的各細胞群進行比較。
〔圖5〕顯示CAR-T細胞在表現GPRC5D之骨髓瘤細胞上之細胞毒性潛力的流式細胞分析。將初代泛T細胞(如前述暫時表現三種CAR中之一者)以所指示之效應：目標(E：T)比與經螢光標示之骨髓瘤細胞系(MM1R、H929、及K562)共培養八小時，於此時將共培養物用活力染料(viability dye)染色。殺滅百分比係共培養物中剩餘之活(活力染料呈陰性)目標(CTV呈陽性)細胞的絕對數目相對於沒有與CAR-T細胞培養之活目標細胞的數目之比率。
〔圖6〕顯示CAR-T細胞在表現GPRC5D之骨髓瘤細胞上之細胞毒性潛力的流式細胞分析。將初代多發性骨髓瘤患者T細胞(如前述暫時表現兩種CAR中之一者)以所指示之效應：目標(E：T)比與經螢光標示之骨髓瘤細胞系MM.1S或對照GPRC5d陰性細胞系KG-1共培養48小時，於此時將共培養物用活力染料染色。細胞毒性百分比係判定為對活力染料染色呈陽性(指示細胞死亡)的經螢光標示之細胞的百分比。
〔圖7〕顯示α-GPRC5D-CAR-T細胞之增生能力的流式細胞分析結果。將經螢光標示之泛T細胞(暫時表現α-GPRC5D CAR或同型CAR對照)以1之E：T比與H929共培養四天。增生係測量為具有經稀釋之螢光標示(CTV)之活(活力染料呈陰性)CAR-T細胞的絕對數目。在四天的α-CD3/CD28珠粒刺激及CAR-T單獨培養(無刺激對照)之後，將回應於H929之增生與CAR-T增生進行比較。
〔圖8〕顯示描繪在健康捐贈者T細胞上GPRC5D-CAR表現之百分比的長條圖，如藉由流式細胞術測量。灰色陰影長條表示在未經轉導(模擬物)之細胞中之CAR偵測背景。黑色長條顯示經轉導之CAR-T細胞中的GPRC5D GC5B680-N68S-LH。所顯示之值表示6位健康捐贈者的平均值±SD。
〔圖9A至圖9F〕描繪顯示CD4、CD8、及記憶標記在GPRC5D CAR-T細胞上之表現的數據。圖9A至圖9C顯示長條圖，其中數據共同展示藉由流式細胞術在CD4及CD8 T細胞中皆偵測到GPRC5D GC5B680-N68S-LH CAR，且CD4/CD8比例與未經轉導之族群差異不大。圖9A顯示由CD8+及CD4+細胞之各者組成的模擬物(未經轉導)細胞群之百分比。圖9B至圖9C各自分別顯示由CD8+及CD4+細胞之各者組成的CAR-細胞(未表現GPRC5D CAR之經轉導細胞)之百分比及由CD8+及CD4+細胞之各者組成的CAR+細胞(表現GPRC5D CAR之經轉導細胞)之百分比。圖9D繪示自一位捐贈者製備之流式細胞圖，其繪示使用表面標記(CD45RA及CD62L)選擇在CAR-T族群中不同的指示記憶族群之圈選策略。圖9E及圖9F描繪顯示GPRC5D GC5B680-N68S-LH大多在已顯示具有高增生能力、存活率、及治療療效之TN/SCM及TCM上表現的長條圖。在圖9A至圖9C及圖9E至圖9F中所顯示之值均表示6位健康捐贈者的平均值±SD。
〔圖10A至圖10B〕顯示展示出GPRC5D CAR-T毒性之散佈圖。將GPRC5D GC5B680-N68S-LH或未經轉導(模擬物)之T細胞以各種E：T比添加至含有螢光素酶轉殖基因之GPRC5D+ MM.1S細胞或GPRC5D- K562細胞中。CAR-T係自六位健康捐贈者製得。值係以6小時(圖10A)或24小時(圖10B)之平均值±SD表現。特異性裂解百分比係(i)藉由將在CAR-T存在下在6或24小時在腫瘤細胞中測得之螢光素酶信號除以在相同時間點在單獨腫瘤細胞中之螢光素酶信號，並將其乘以100，然後(ii)用100減去該數字來計算。方程式係：100-[(CAR-T+腫瘤發光/平均單獨腫瘤發光)×100]。虛線表示等於零之特異性裂解百分比。負的裂解指示細胞生長。
〔圖11A至圖11F〕繪示展示以指示E：T比添加的GPRC5D CAR-T細胞之細胞毒性的散佈圖，其係使用GPRC5D+ H929、MM.1S、MM.1R、MOLP-2、及EJM細胞、或GRRC5D- K562細胞評估。GPRC5D CAR-T細胞顯示對所有GPRC5D+ 細胞系具有細胞毒性。
〔圖12〕顯示描繪未經轉導(模擬物)之細胞或GC5B680-N68S-LH細胞在K562細胞存在下在3：1之E：T比下之表面CD25表現(% CD25)水平的長條圖。CAR-T係自六位健康捐贈者製得。數據係以平均值±SD表現。
〔圖13〕繪示展示GC5B680-N68S-LH在GPRC5D+目標細胞(H929或MM.1S)或陽性對照組(促效劑CD3/CD28珠粒)存在下特異性增生且不會在目標細胞不存在或在GPRC5D-細胞(K562)存在下特異性增生的流式細胞圖。使用CELLTRACE Violet(CTV)測量細胞增生(X軸)。使用抗獨特型抗體(anti-idiotype antibody)偵測CAR+事件(Y軸)。
〔圖14〕顯示展示在與GPRC5D+細胞系H929培養24小時之CAR-T(GC5B680-N68S-LH)細胞中裂解凋亡蛋白酶3/7水平之水平與對照組(星形孢菌素(staurosporine)、GPRC5D-K562細胞、或單獨CAR-T)相比保持不變的長條圖。針對H929及K562細胞使用E：T比1：2。CAR-表示未表現GPRC5D CAR之經轉導細胞。CARs+表示表現GPRC5D CAR之經轉導細胞。
〔圖15〕顯示根據實例15展示GPRC5D定向CAR-T細胞對NSG-B2M小鼠中所建立之MM.1S人類MM異種移植物之效應的圖。GC5B680-N68S-LH、GC5B680-N68S-HL、GC5B83-N24T-N31S-LH、及GC5B83-N24T-N31S-HL(GPRC5D定向CAR-T)、模擬物(未經轉導之CAR-T)、PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)、NSG(非肥胖糖尿病嚴重複合型免疫缺乏症γ(non-obese diabetic severe combined immunodeficiency gamma))、B2M(β-2微球蛋白)、MM(多發性骨髓瘤)。群組腫瘤體積係以平均值±SEM圖示。在第0天植入腫瘤細胞，在第13天植入1×106個CAR+ T細胞。符號「*」表示在第26天相對於PBS對照組之顯著差異(p
Figure 109101459-A0202-12-0012-49
0.05，n=10/組)。
〔圖16〕顯示根據實例16展示GC5B680-N68S-LH對帶有散播性(disseminated)H929人類MM異種移植物的NSG小鼠存活率之效應的圖。GC5B680-N68S-LH、GC5B680-N68S-HL、GC5B83-N24T-N31S-LH、及GC5B83-N24T-N31S-HL(GPRC5D定向CAR-T)、模擬物(未經轉導之CAR-T)、PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)、NSG(非肥胖糖尿病嚴重複合型免疫缺乏症γ)、MM(多發性骨髓瘤)。在第0天植入腫瘤細胞；在第9天植入1×106個CAR+T細胞。符號「*」表示在第111天相對於PBS對照組之顯著差異。
例示實施例說明如下。
本揭露提供靶向G蛋白偶聯受體(G蛋白偶聯受體C家族5組成員D(GPRC5D))之嵌合抗原受體(CAR)、包含此類CAR之細胞、及使用本文中所述之CAR治療癌症(例如惡性血液疾病及實體腫瘤)的方法。
本發明之CAR對GPRC5D(例如具有SEQ ID NO：57之胺基酸序列的人類GPRC5D多肽、或其片段)具有抗原特異性。如本文中所使用，片語「具有抗原特異性(have antigen specificity)」及「誘發抗原特異性反應(elicit antigen-specific response)」意指CAR可與抗原特異性結合並免疫辨識該抗原，使得該CAR與該GPRC5D抗原之結合誘發免疫反應。測試CAR之抗原特異性及辨識目標細胞之能力的方法在所屬技術領域中係已知的。
本揭露亦提供相關核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群、抗體或其抗原結合部分、及與本發明之CAR相關之醫藥組成物。
以下參照實例並僅出於說明之目的描述本發明之數個態樣。應理解的是，闡述許多具體細節、關係、及方法以提供對本發明之完整理解。然而，所屬技術領域中具有通常知識者將輕易瞭解到，本發明可在沒有一或多個具體細節之情況下實踐，或用其他方法、規程、試劑、細胞系、及動物來實踐。本發明不受限於所說明之動作或事件的順序，因為一些動作可能以不同順序發生且/或與其他動作或事件同時發生。此外，並非所有說明之動作、步驟、或事件都是實施根據本發明之方法所需的。許多本文中所描述或參考之技術及程序係所屬技術領域中具有通常知識者充分理解並使用習知方法普遍採用的。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術用語、符號、及其他科學用語或術語係意欲具有與本發明有關之技術領域中具有通常知識者所 共同理解之意義。在一些情況下，出於清晰及/或易於參考之目的，本文中定義具有共同理解之意義的用語，且本文中包括此類定義不一定要被解讀為表示與所屬技術領域中所通常理解的有實質差異。將進一步理解的是，諸如在常用字典中定義的用語應被解釋為具有與其在相關技術領域的背景中及/或如本文中另外定義之意義一致的意義。
本文中所使用的用語係僅用於描述特定實施例之目的，且不意欲為限制性。如本文中所使用，不定冠詞「一(a/an)」及「該(the)」應被理解為包括複數指稱，除非上下文另有明確指示。
嵌合抗原受體
本發明大致上係關於經基因修飾以穩定地表現所欲之嵌合抗原受體的T細胞之用途。嵌合抗原受體(CAR)係一種人工建構之雜交蛋白質或多肽，其含有連接至T細胞信號傳導域的抗體之抗原結合域(scFv)。CAR之特性可包括其利用單株抗體之抗原結合性質，以非MHC限制性(non-MHC-restricted)方式將T細胞特異性及反應性重定向至所選目標的能力。非MHC限制性抗原辨識給予表現CAR之T細胞辨識與抗原加工(antigen processing)無關之抗原的能力，因此繞過腫瘤逃逸(tumor evasion)之主要機制。此外，當在T細胞中表現時，CAR有利地不與內源性T細胞受體(TCR)α及β鏈二聚化。
本文中所述之CAR提供重組多肽建構體，其至少包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域(在本文中亦稱為「細胞質信號傳導域(cytoplasmic signaling domain)」)，該胞內信號傳導域包含衍生自如下文所定義之刺激分子的功能性信號傳導域。表現CAR之T細胞在本文中稱為CAR T細 胞、CAR-T細胞、或經CAR修飾之T細胞，且這些用語在本文中可互換使用。細胞可經基因修飾以在其表面上穩定地表現抗體結合域，從而賦予MHC非依賴性之新的抗原特異性。
在一些情況下，T細胞經基因修飾以穩定地表現CAR，其將特定抗體之抗原辨識域與CD3ζ鏈或FcγRI蛋白之胞內域組合成為單一嵌合蛋白。在一個實施例中，刺激分子係與T細胞受體複合物相連之ζ鏈。
如本文中使用之用語，「胞內信號傳導域(intracellular signaling domain)」係指分子之胞內部分。其係蛋白質之功能性部分，該功能性部分藉由在細胞內傳輸信息而作用，以經由已定義之信號傳導路徑藉由產生第二傳訊者或藉由回應於此類傳訊者來作用為效應子而調控細胞活性。胞內信號傳導域產生促進含CAR細胞(例如CAR-T細胞)的免疫效應功能之信號。免疫效應功能之實例(例如在CAR-T細胞中)包括溶細胞活性及輔助活性，其包括細胞介素之分泌。
在一實施例中，胞內信號傳導域可包含初級胞內信號傳導域。例示初級胞內信號傳導域包括衍生自負責初級刺激、或抗原依賴性刺激之分子者。在一實施例中，胞內信號傳導域可包含共刺激胞內域。例示共刺激胞內信號傳導域包括衍生自負責共刺激信號、或抗原非依賴性刺激之分子者。舉例而言，在CAR-T之情況下，初級胞內信號傳導域可包含T細胞受體之細胞質序列，且共刺激胞內信號傳導域可包含來自輔受體(co-receptor)或共刺激分子之細胞質序列。
初級胞內信號傳導域可包含已知為免疫受體酪氨酸活化基序或ITAM的信號傳導基序。含有初級細胞質信號傳導序列之ITAM的實例包括但不 限於衍生自下列者：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d DAP10、及DAP12。
初級胞內信號傳導域可衍生自下列之信號傳導域，例如CD3ζ、CD3ε、CD22、CD79a、CD66d、CD39 DAP10、DAP12、Fcε受體Iγ鏈(FCER1G)、FcRβ、CD3δ、CD3γ、CD5、CD226、或CD79B。
用語「ζ(zeta)」或替代地「ζ鏈(zeta chain)」、「CD3ζ(CD3-zeta)」、或「TCRζ(TCR-zeta)」係定義為以GenBank Acc.No.BAG36664.1提供之蛋白質或來自非人類物種(例如鼠類、兔、靈長類、小鼠、囓齒動物、猴、猿、及類似者)之等效殘基，且「ζ刺激域(zeta stimulatory domain)」或替代地「CD3ζ刺激域(CD3-zeta stimulatory domain)」或「TCRζ刺激域(TCR-zeta stimulatory domain)」係定義為來自ζ鏈之細胞質域的胺基酸殘基，其足以在功能上傳輸T細胞活化所必需之初始信號。在一個態樣中，ζ之細胞質域包含GenBank Acc.No.BAG36664.1之殘基52至164或來自其功能異種同源物的非人類物種(例如小鼠、囓齒動物、猴、猿、及類似者)之等效殘基。在一個態樣中，「ζ刺激域(zeta stimulatory domain)」或「CD3ζ刺激域(CD3-zeta stimulatory domain)」係以SEQ ID NO：13提供之序列。
用語「共刺激分子(costimulatory molecule)」係指T細胞上之同源結合伙伴(cognate binding partner)，其與共刺激配體特異性結合，從而藉由T細胞介導共刺激反應，諸如但不限於增生。共刺激分子係除抗原受體或其配體之外的細胞表面分子，其係有效免疫反應所需的。共刺激分子包括但不限於MHC 1類分子、BTLA、及鐸配體受體(Toll ligand receptor)、以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB (CD137)、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、BTLA、GITR、CD226、HVEM、及ZAP70。
共刺激胞內信號傳導域可係共刺激分子之胞內部分。共刺激分子可以下列蛋白質家族表示：TNF受體蛋白、類免疫球蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)、及活化NK細胞受體。此類分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴球功能性抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及與CD83特異性結合之配體、及類似者。
胞內信號傳導域可包含分子(衍生出該胞內信號傳導域)的整個胞內部分或整個天然胞內信號傳導域、或其功能片段。
用語「4-1BB」係指具有以GenBank Acc.No.AAA62478.2提供之胺基酸序列、或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿、及類似者)之等效殘基的TNFR超家族成員。且「4-1BB共刺激域(4-1BB costimulatory domain)」係定義為GenBank登錄號AAA62478.2之胺基酸殘基214至255、或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿、及類似者)之等效殘基。在一個態樣中，「4-1BB共刺激域」係以SEQ ID NO：12提供之序列或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿、及類似者)之等效殘基。
在一個實施例中，使用天然與CAR中之一個域相連的跨膜域。在另一實施例中，跨膜域可經選擇或藉由胺基酸取代修飾，以避免此類域與相 同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合，以最小化與受體複合物之其他成員的交互作用。在一個例示實施例中，跨膜域係CD8α鉸鏈域。
在一些實施例中，細胞質信號傳導域進一步包含一或多個衍生自至少一種如本文中所定義之共刺激分子的功能性信號傳導域。在一個實施例中，共刺激分子係選自4-1BB(即CD137)、CD27、CD3ζ、及/或CD28。CD28係在T細胞共刺激中重要的T細胞標記。CD27係腫瘤壞死因子受體超家族成員且作用為共刺激免疫檢查點分子。4-1BB傳輸強共刺激信號至T細胞，促進分化並增強T淋巴球之長期存活率。CD3ζ與TCR相連以產生訊號，並含有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)。
在一個實施例中，CAR包含胞內鉸鏈域，其包含CD8及胞內T細胞受體信號傳導域，其包含CD28、4-1BB、及CD3ζ。
本文中所述之CAR提供重組多肽建構體，其至少包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域(在本文中亦稱為「細胞質信號傳導域」)，該胞內信號傳導域包含例如衍生自如下文所定義之刺激分子的功能性信號傳導域
在一個實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含胞外抗原辨識域、跨膜域、及包含衍生自刺激分子之功能性信號傳導域的胞內信號傳導域。在一個實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含胞外抗原辨識域、跨膜域、及胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自共刺激分子之功能性信號傳導域及衍生自刺激分子之功能性信號傳導域。在一個實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含胞外抗原辨識域、跨膜域、及胞內信號傳導域，該胞內 信號傳導域包含至少兩個衍生自一或多種共刺激分子之功能性信號傳導域及衍生自刺激分子之功能性信號傳導域。
本發明之CAR可經設計以單獨包含CD28及/或4-1BB信號傳導域，或與可用於本發明之CAR的背景中的任何其他所欲之(多種)細胞質域組合。在一個實施例中，CAR之細胞質域可進一步包含CD3ζ之信號傳導域。舉例而言，CAR之細胞質域可包括但不限於CD3ζ、4-1BB、及CD28信號傳導模組及其組合。因此，本發明提供CAR T細胞及其用於過繼性療法之方法。
本揭露進一步提供本文中所述之CAR、核酸、多肽、及蛋白質的變體，例如功能性變體。「變體(variant)」係指因一或多個修飾(例如取代、插入、或缺失)而不同於參考多肽或參考多核苷酸的多肽或多核苷酸。如本文中所使用，用語「功能性變體(functional variant)」係指具有與親本CAR、多肽、或蛋白質實質或顯著的序列同一性或相似性之CAR、多肽、或蛋白質，其中功能性變體保留就其而言為變體之CAR、多肽、或蛋白質的生物活性。功能性變體涵蓋例如本文中所述之CAR、多肽、或蛋白質(親本CAR、多肽、或蛋白質)的變體，其保留以與親本CAR、多肽、或蛋白質相似程度、相同程度、或更高程度辨識目標細胞的能力。參照親本CAR、多肽、或蛋白質，功能性變體在胺基酸序列上可與親本CAR、多肽、或蛋白質例如至少約30%、約40%、約約50%、約60%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或更高同一。
功能性變體可例如包含具有至少一個保守性胺基酸取代的親本CAR、多肽、或蛋白質之胺基酸序列。在另一實施例中，功能性變體可包含具 有至少一個非保守性胺基酸取代的親本CAR、多肽、或蛋白質之胺基酸序列。在此情況下，非保守性胺基酸取代不會干擾或抑制功能性變體之生物活性。非保守性胺基酸取代可增強功能性變體之生物活性，使得功能性變體之生物活性相較於親本CAR、多肽、或蛋白質增加。
本發明CAR之胺基酸取代可係保守性胺基酸取代。保守性胺基酸取代在所屬技術領域中係已知的，並包括將具有某些物理及/或化學性質之一個胺基酸交換為具有相同或類似化學或物理性質之另一胺基酸的胺基酸取代。舉例而言，保守性胺基酸取代可係酸性胺基酸取代另一酸性胺基酸(例如Asp或Glu)、具有非極性側鏈之胺基酸取代具有非極性側鏈之另一胺基酸(例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)、鹼性胺基酸取代另一鹼性胺基酸(Lys、Arg等)、具有極性側鏈之胺基酸取代具有極性側鏈之另一胺基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。
CAR、多肽、或蛋白質可基本上由本文中所述之一或多個指明的胺基酸序列所組成，使得其他組分(例如其他胺基酸)不會實質上改變功能性變體之生物活性。
本揭露之實施例的CAR、多肽、及蛋白質(包括功能性部分及功能性變體)可係任何長度，即可包含任何數目的胺基酸，前提為CAR、多肽、或蛋白質(或其功能性部分或功能性變體)保留其生物活性，例如與抗原特異性結合、偵測宿主中患病細胞(例如癌細胞)、或治療或預防宿主之疾病的能力等。舉例而言，多肽可係約50至約5000個胺基酸長，諸如長度為約50個、約70個、約75個、約100個、約125個、約150個、約175個、約200個、約225個、約250個、約275個、約300個、約325個、約350個、約375個、約400 個、約425個、約450個、約475個、約500個、約525個、約550個、約575個、約600個、約625個、約650個、約675個、約700個、約725個、約750個、約775個、約800個、約825個、約850個、約875個、約900個、約925個、約950個、約975個、約1000個、或更多個胺基酸。本發明之多肽亦包括寡肽。
本發明之實施例的CAR、多肽、及蛋白質(包括本發明之功能性部分及功能性變體)可包含合成胺基酸以代替一或多種天然存在的胺基酸。此類合成胺基酸在所屬技術領域中係已知的，並包括例如胺基環己烷羧酸、正白胺酸、α-胺基正癸酸、高絲胺酸(homoserine)、S-乙醯基胺基甲基-半胱胺酸、反3-及反4-羥脯胺酸、4-胺基苯基丙胺酸、4-硝基苯基丙胺酸、α-(2-胺基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二胺基丁酸、α,β-二胺基丙酸、高苯基丙胺酸、4-氯苯基丙胺酸、4-羧基苯基丙胺酸、β-苯基絲胺酸、β-羥基苯基丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、N'-苄基-N'-甲基-離胺酸、N',N'-二苄基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、α-胺基環戊烷羧酸、α-胺基環己烷羧酸、α-胺基環庚烷羧酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、及α-三級丁基甘胺酸。
本發明之實施例的CAR、多肽、及蛋白質(包括功能性部分及功能性變體)可經受轉譯後修飾。可將彼等醣基化、酯化、N-醯化、醯胺化、羧化、磷酸化、酯化、經由例如雙硫鍵環化、或轉變成酸加成鹽(acid addition salt)。在一些實施例中，彼等經二聚化、或聚合、或接合。
本發明之實施例的CAR、多肽、及/或蛋白質(包括其功能性部分及功能性變體)可藉由所屬技術領域中已知的方法獲得。從頭(de novo)合成多肽及蛋白質之適合方法係描述於參考文獻中，諸如Chan et al.,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000；Peptide and Protein Drug Analysis,ed.Reid,R.,Marcel Dekker,Inc.,2000；及Epitope Mapping,ed.Westwood et al.,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2001。同樣，多肽及蛋白質可使用標準重組方法使用本文中所述之核酸重組生產。參見例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；及Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,NY,1994。此外，本發明之一些CAR、多肽、及/或蛋白質(包括其功能性部分及功能性變體)可自來源(諸如植物、細菌、昆蟲、哺乳動物等)單離及/或純化。單離及純化之方法在所屬技術領域中係已知的。替代地，本文中所述之CAR、多肽、及/或蛋白質(包括其功能性部分及功能性變體)可經商業合成。在此方面，CAR、多肽、及蛋白質可係合成的、重組的、經單離、及/或經純化。
可用於產生用於生產本文中所述之多肽的重組核酸之經修飾核苷酸的實例包括但不限於5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、羧基甲基胺基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、N6-取代腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧確、β-D-甘露糖基Q核苷、5〃-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧化乙酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、偽尿嘧啶、Q核苷、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷(inosine)、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞 嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧化乙酸甲基酯、3-(3-胺基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、及2,6-二胺基嘌呤。
核酸可包含編碼CAR、多肽、或蛋白質、或其功能性部分或功能性變體中任一者之經單離或純化的任何核苷酸序列。替代地，核苷酸序列可包含簡併成該等序列中任一者的核苷酸序列或簡併序列之組合。
本發明之一些實施例亦提供一種經單離或經純化之核酸，其包含與本文中所述之任何核酸的核苷酸序列互補之核苷酸序列、或在嚴格條件下與本文中所述之任何核酸的核苷酸序列雜交之核苷酸序列。
在嚴格條件下雜交之核苷酸序列可在高嚴格度條件下雜交。所謂「高嚴格度條件(high stringency condition)」意指核苷酸序列與目標序列(本文中所述之任何核酸的核苷酸序列)以可偵測地比非特異性雜交更強之量特異性雜交。高嚴格度條件包括能自恰巧具有少數小區域(例如3至12個鹼基)匹配核苷酸序列之隨機序列中區別出具有精確互補序列之多核苷酸、或僅含有少數零散不匹配之多核苷酸的條件。此類小區域互補性比14至17個或更多個鹼基之全長互補體更容易解鏈(melted)，且高嚴格度雜交使其可容易地區別出來。相對高嚴格度條件會包括例如低鹽及/或高溫條件，諸如由約0.02至0.1M NaCl或等效物在約50至70℃之溫度下所提供之條件。此類高嚴格度條件在核苷酸序列與模板或目標鏈之間容許少許的不匹配(若有的話)，且特別適用於偵測本文中所述之CAR中任一者之表現。一般認為，藉由添加增加量的甲醯胺可使條件變得更嚴格。
在一實施例中，本發明之核酸可併入重組表現載體中。本揭露提供包含本發明之核酸中任一者的重組表現載體。如本文中所使用，用語「重組表現載體(recombinant expression vector)」意指經基因修飾之寡核苷酸或多核苷酸建構體，當建構體包含編碼mRNA、蛋白質、多肽、或肽之核苷酸序列，且載體係在足以使mRNA、蛋白質、多肽、或肽在宿主細胞內表現之條件下與宿主細胞接觸時，建構體允許由宿主細胞表現該mRNA、蛋白質、多肽、或肽。本文中所述之載體整體上不是天然存在的；然而，載體之部分可係天然存在的。所述重組表現載體可包含任何類型的核苷酸(包括但不限於DNA及RNA)，其可係單股或雙股的、合成或部分自天然來源獲得的，且其可含有天然、非天然或經改變之核苷酸。重組表現載體可包含天然存在或非天然存在的核苷間鍵聯、或兩種類型的鍵聯。非天然存在或經改變之核苷酸或核苷間鍵聯不會阻礙載體之轉錄或複製。
在一實施例中，本發明之重組表現載體可係任何適合的重組表現載體，且可用於轉形(transform)或轉染任何適合的宿主。適合的載體包括經設計用於增殖及擴增、或用於表現、或兩者的載體，諸如質體及病毒。載體可選自由下列所組成之群組：pUC系列(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)、及pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。可使用噬菌體載體，諸如λGT10、λGT11、λEMBL4、及λNM1149、λZapⅡ(Stratagene)。植物表現載體之實例包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3、及pBIN19(Clontech)。動物表現載體之實例包括pEUK-Cl、 pMAM、及pMAMneo(Clontech)。重組表現載體可係病毒載體，例如反轉錄病毒載體，例如γ反轉錄病毒載體。
在一實施例中，本發明之重組表現載體係使用描述於例如上述Sambrook等人及上述Ausubel等人之標準重組DNA技術來製備。可製備環狀或線形表現載體的建構體，以在原核或真核宿主細胞中含有複製系統功能。複製系統可衍生自例如ColEl、SV40、2μ質體、λ、牛乳頭狀瘤病毒、及類似者。
重組表現載體可包含調控序列(諸如轉錄及轉譯起始密碼子及終止密碼子)，在適當時並考慮到載體是基於DNA或基於RNA，該調控序列係特定於引入該載體之宿主(例如細菌、植物、真菌、或動物)類型。
重組表現載體可包括一或多種標記基因，其允許選擇經轉形或經轉染宿主。標記基因包括殺生物劑抗性(例如對抗生素、重金屬等具有抗性)、在營養缺陷型宿主(auxotrophic host)有互補作用，以提供原養型(prototrophy)、及類似者。用於所述表現載體之適合標記基因包括例如新黴素/G418抗性基因、組胺醇x抗性基因、組胺醇抗性基因、四環素抗性基因、及安比西林(ampicillin)抗性基因。
重組表現載體可包含內源(native)或標準(normative)啟動子，其可操作地連接至編碼CAR、多肽、或蛋白質(包括其功能性部分及功能性變體)之核苷酸序列，或可操作地連接至與編碼該CAR、多肽、或蛋白質之核苷酸序列互補或雜交的核苷酸序列。選擇例如強、弱、組織特異性、誘導性、及發育特異性之啟動子係在技術人員之通常知識範圍內。類似地，將核苷酸序列與啟動子組合亦在技術人員之知識範圍內。啟動子可係非病毒啟動子或病毒啟 動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子、RSV啟動子、SV40啟動子、或存在於鼠類幹細胞病毒之長末端重複序列(long-terminal repeat)中的啟動子。
重組表現載體可經設計以用於暫時表現、或用於穩定表現、或用於兩者。同樣，重組表現載體可經製造以用於持續性表現(constitutive expression)或誘導性表現(inducible expression)。
此外，重組表現載體可經製造以包括自殺基因。如本文中所使用，用語「自殺基因(suicide gene)」係指造成表現自殺基因之細胞死亡的基因。自殺基因可係賦予表現該基因之細胞對藥劑(例如藥物)之敏感性、且當該細胞與該藥劑接觸或暴露於該藥劑時造成該細胞死亡之基因。自殺基因在所屬技術領域係已知的，並包括例如單純疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶去胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶、及硝基還原酶。
包括在本發明之範疇中係偶聯物，例如生物偶聯物，其包含CAR、多肽、及蛋白質(包括其功能性部分或功能性變體)、宿主細胞、核酸、重組表現載體、宿主細胞群、或抗體或其抗原結合部分中任一者。偶聯物、以及一般合成偶聯物之方法在所屬技術領域中係已知的(參見例如Hudecz,F.,Methods Mol.Biol.298：209-223(2005)及Kirin et al.,Inorg Chem.44(15)：5405-5415(2005))。
本發明之一實施例進一步提供一種抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分與本發明之CAR的表位結合(例如特異性結合)。
抗體可係所屬技術領域中已知之任何類型的免疫球蛋白。免疫球蛋白可被分為五大類：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM。IgA及IgG被進一步分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。脊椎動物物種之抗體輕鏈可 被分為兩種類型(kappa(κ)及lambda(λ))中之一者，此係基於其恆定域之胺基酸序列。抗體可屬於任何類別或同型。
抗體包括免疫球蛋白分子，其包括單株抗體(包括鼠類、人類、人源化(humanized)、及嵌合單株抗體)、多株抗體、抗原結合片段、雙特異性或多特異性抗體、單聚體、二聚體、四聚體、或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體、及任何其他包含所需特異性之抗原結合部位的免疫球蛋白分子之修飾組態。抗體可係天然存在的抗體，例如自哺乳動物(例如鼠類、靈長類、小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人類等)單離及/或純化之抗體。替代地，抗體可係經工程改造(例如經基因工程改造)之抗體。
「人類抗體(human antibody)」係指經最佳化以在投予至人類對象時具有最小免疫反應之抗體。人類抗體之可變區係衍生自人類免疫球蛋白序列。若人類抗體含有恆定區或恆定區的一部分，則該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。如果該人類抗體的可變區係得自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重及輕鏈可變區。此等例示性系統係經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫(gene library)、及基因轉殖非人類動物(諸如帶有人類免疫球蛋白基因位點的小鼠或大鼠)。當相較於人類中表現之免疫球蛋白時，「人類抗體」一般含有胺基酸差異，這是由於用於獲得人類抗體及人類免疫球蛋白基因位點之系統之間的差異、引入體細胞突變或向架構或CDR或兩者中刻意引入取代。一般而言，「人類抗體」在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況下，「人類抗體(human antibody)」可含有衍生自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如在Knappik et al.,(2000)J Mol Biol 296：57-86中所述，或含有併入經展示在噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如在Shi et al.,(2010)J Mol Biol 397：385-96及國際專利公開號WO2009/085462中所述。至少一種CDR係衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。
「人源化抗體(humanized antibody)」係指至少一個CDR係衍生自非人類物種且至少一個架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可在架構中包括取代，所以該等架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或人類免疫球蛋白生殖系基因序列的確切複製物。
一般而言，人源化抗體具有衍生自非人類物種之抗原結合部位且可變區架構係衍生自人類免疫球蛋白序列。人類抗體具有重鏈及輕鏈可變區，其中架構及抗原結合部位兩者皆衍生自人源序列。
同樣，抗體可對CAR之功能性部分具有任何水平的親和力或親留力(avidity)。在一些實施例中，抗體可以一範圍之親和力(KD)結合GPRC5D抗原。在根據本發明之一個實施例中，及在下列每一個編號實施例之一些實施例中，抗體以高親和力與GPRC5D抗原結合，例如KD等於或小於約10-7M，諸如但不限於1至9.9(或其中任何範圍或值，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、或9)×10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M、或其中任何範圍或值，如藉由表面電漿共振或Kinexa方法判定，如所屬技術領域中具有通常知識者所實踐。一個例示親和力等於或小於1×10-8M。另一例示親和力等於或小於1×10-9M。
測試抗體之與CAR之任何功能性部分結合的能力之方法在所屬技術領域中係已知的，並包括任何抗體-抗原結合檢定，諸如例如放射免疫檢定(RIA)、西方墨點法、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、免疫沉澱法、及競爭性抑制檢定。
製造抗體之適合方法在所屬技術領域中係已知的。例如，標準融合瘤方法係描述於例如Köhler and Milstein,Eur.J.Immunol.,5,511-519(1976)、Harlow and Lane(eds.),Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press(1988)、及C.A.Janeway et al.(eds.),Immunobiology,5th Ed.,Garland Publishing,New York,N.Y.(2001))中。替代地，其他方法在所屬技術領域中係已知的，諸如EBV-融合瘤方法(Haskard and Archer,J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984)及Roder et al.,Methods Enzymol.,121,140-67(1986))、及噬菌體載體表現系統(參見例如Huse et al.,Science,246,1275-81(1989))。此外，在非人類動物中生產抗體之方法係描述於例如美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、及第5,714,352號、及美國專利申請公開案第2002/0197266 A1號中。
噬菌體展示亦可用於產生抗體。就此而言，可使用標準分子生物學及重組DNA技術來產生編碼抗體之抗原結合可變(V)域的噬菌體庫(參見例如上述Sambrook等人及上述Ausubel等人)。選擇編碼具有所欲特異性之可變區的噬菌體以與所欲抗原(即GPRC5D)特異性結合，並重構包含所選可變域之完整或部分抗體。將編碼經重構抗體之核酸序列引入適合細胞系(諸如用於融合瘤生產之骨髓瘤細胞)中，此得由細胞分泌具有單株抗體之特性的抗體(參見例如上述Janeway等人、上述Huse等人、及美國專利第6,265,150號)。
抗體可藉由經過特定重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因基因轉殖的基因轉殖小鼠生產。此類方法在所屬技術領域中係已知的並描述於例如美國專利第5,545,806號及第5,569,825號、及上述Janeway等人中。
用於產生人源化抗體之方法在所屬技術領域中係已知的並描述於例如上述Janeway等人、美國專利第5,225,539號、第5,585,089號、及第5,693,761號、歐洲專利第0239400 B1號、及英國專利第2188638號中。亦可使用描述於美國專利第5,639,641號及Pedersen et al.,J.Mol.Biol.,235,959-973(1994)中之抗體表面重塑技術(resurfacing technology)產生人源化抗體。
如本文中所使用，抗體可係多鏈或單鏈、或完整免疫球蛋白，並可衍生自天然來源或衍生自重組來源。抗體可係免疫球蛋白分子之四聚體。
在一些實施例中，抗體係雙特異性抗體。「雙特異性(bispecific)」係指特異性結合兩種不同抗原或在相同抗原內的兩個不同表位之分子(諸如抗體)。雙特異性分子可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物(homolog))具有交叉反應性，例如食蟹獼猴(Macaca cynomolgus,cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes)，或者可結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。現有抗體之VL及/或VH區或如本文中所述從頭鑑定之VL及VH區可經工程改造成雙特異性全長抗體。此類雙特異性抗體可藉由調節在抗體Fc中之CH3交互作用以形成雙特異性抗體來製造，該製造使用諸如在下列中所述之技術：美國專利第7,695,936號；國際專利公開號WO04/111233；美國專利公開號U52010/0015133；美國專利公開號US2007/0287170；國際專利公開號WO2008/119353；美國專利公開號US2009/0182127；美國專利公開號 US52010/0286374；美國專利公開號US2011/0123532；國際專利公開號WO2011/131746；國際專利公開號WO2011/143545；或美國專利公開號US2012/0149876。舉例而言，本發明之雙特異性抗體可在無細胞環境中體外產生，此係藉由在兩個單特異性同二聚體抗體(homodimeric antibody)之CH3區中引入非對稱突變，且在還原條件中(以讓雙硫鍵異構化)自兩個親本單特異性同二聚體抗體形成雙特異性異二聚體抗體，其係根據國際專利公開號WO2011/131746中所述之方法。在該等方法中，第一單特異性二價抗體及第二單特異性二價抗體經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代；該等抗體係在足以讓鉸鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復至非還原性(non-reducing)。可使用之例示還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol,DTE)、麩胱甘肽、參(2-接乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、及參(2-羧乙基)膦。舉例而言，可使用在至少20℃之溫度且至少25mM 2-MEA存在下或在至少0.5mM二硫蘇糖醇存在且5至8之pH下(例如在7.0之pH下或在7.4之pH下)至少90min的培養。
用語「抗體片段(antibody fragment)」係指完整抗體或其重組變體之至少一部分，該抗體片段保留親本全長抗體之抗原結合性質。舉例而言，其係指抗原結合域，例如完整抗體之抗原決定可變區，其係足以賦予抗體片段對目標(諸如抗原)之辨識及結合(例如特異性結合)。「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係指免疫球蛋白分子之一部分。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段、單鏈抗體(scFv)、線性抗體、單域 抗體(諸如sdAb(VL或VH))、駱駝VHH域、及由抗體片段形成之多特異性抗體。
用語「scFv」係指一種蛋白質，其包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段。在一些實施例中，輕鏈可變區及重鏈可變區經由短可撓性多肽連接子相鄰地連接，並能夠以單鏈多肽表現，且其中scFv保留完整抗體(衍生出該scFv)的特異性。除非有指明，否則如本文中所使用，scFv可具有呈任一順序之VL及VH可變區，例如就多肽之N端及C端而言，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
本發明之一實施例亦提供本文中所述之抗體之任一者的抗原結合部分。抗原結合部分可係具有至少一個抗原結合部位之任何部分，諸如Fab、F(ab')2、dsFv、sFv、雙鏈抗體(diabody)、及三鏈抗體(triabody)。
在一些實施例中，抗原結合片段係重鏈互補決定區(HCDR)1、2、及/或3、輕鏈互補決定區(LCDR)1、2、及/或3、重鏈可變區(VH)、或輕鏈可變區(VL)、Fab、F(ab')2、Fd、及Fv片段、及包含一個VH域或一個VL域(例如由其組成)的域抗體(dAb)。VH及VL域可經由連接子(例如合成連接子)連接在一起。
「互補決定區(complementarity determining region,CDR)」係抗體中的抗原結合部位。CDR可使用各種用語來定義：(i)互補決定區(CDR)，三個在VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且三個在VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其係基於序列變異性(Wu and Kabat,J Exp Med 132：211-50,1970；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)「高度變異區 (hypervariable region)」、「HVR」、或「HV」，三個在VH(H1、H2、H3)且三個在VL(L1、L2、L3)，其係指如Chothia及Lesk所定義般在結構上係高度變異之抗體可變域中的區域(Chothia and Lesk,Mol Biol 196：901-17,1987)。國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics,IMGT)資料庫(http：//www_imgt_org)提供了標準化編號及抗原結合部位的定義。CDR、HV及IMGT描繪之間的對應性係描述於Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27：55-77,2003。如本文中所使用，用語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」、及「LCDR3」包括由上述Kabat、Chothia、或IMGT中之任何方法定義的CDR，除非在說明書中另有明確說明。
同樣，抗體、或其抗原結合部分可經修飾以包含可偵測之標示，諸如例如放射性同位素、螢光團(例如螢光異硫氰酸鹽(FITC)、藻紅素(Pe))、酶(例如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶)、及元素粒子(例如金粒子)。
本揭露亦提供一種核酸，其包含編碼本文中所述之CAR、多肽、或蛋白質(包括其功能性部分及功能性變體)中之任一者的核苷酸序列。
CAR包含抗體或其抗體片段之部分可以各種形式存在，其中抗原結合域係以相鄰多肽鏈之部分表現，該部分包括例如單域抗體片段(sdAb)、scFv、及人類嵌合抗體或人源化抗體(Harlow et al.,1999,In：Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.；Harlow et al.,1989,In：Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242：423-426)。在一個態樣中，本發明之CAR組成物的抗原結合域包含抗體片段。在一個態樣中，CAR包含抗體片段，該抗體片段包含scFv。
用語「重組抗體(recombinant antibody)」係指使用重組DNA技術產生之抗體，諸如例如由噬菌體或酵母表現系統表現之抗體。該用語亦應解讀為意指已藉由合成編碼抗體之DNA分子或指定該抗體之胺基酸序列來產生的抗體，且該DNA分子表現抗體蛋白質，其中該DNA或胺基酸序列已使用所屬技術領域中可得且已知的重組DNA或胺基酸序列技術來獲得。
用語「抗原(antigen)」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體生產、或特定免疫機能健全細胞之活化、或兩者。所屬技術領域中具有通常知識者會理解任何巨分子(包括實際上所有蛋白質或肽)皆可作為抗原。此外，抗原可衍生自重組或基因組DNA。所屬技術領域中具有通常知識者會理解，包含編碼誘發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列之任何DNA因而編碼如本文中所使用之用語「抗原」。此外，所屬技術領域中具有通常知識者會理解，抗原不需僅由基因之全長核苷酸序列編碼。顯然，本揭露包括但不限於使用多於一個基因之部分核苷酸序列，且此等核苷酸序列係以各種組合排列以編碼誘發所欲免疫反應的多肽。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的重鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的重鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的重鏈CDR3；或
具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR3；
其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含
包含具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該胞外抗原結合域，且進一步包含具有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：71之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
包含具有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的該重鏈 CDR3之該胞外抗原結合域，且進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：49之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或
胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有選自由SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、及SEQ ID NO：45、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR1，其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有選自由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、及SEQ ID NO：46、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR2，其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有選自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、及SEQ ID NO：47、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR3，其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有選自由SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、及SEQ ID NO：45、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR1；
具有選自由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、及SEQ ID NO：46、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR2；及
具有選自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、及SEQ ID NO：47、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR3；
其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有選自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、及SEQ ID NO：54、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR1，其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有選自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、及SEQ ID NO：55、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR2，其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有選自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、及SEQ ID NO：56、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR3，其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有選自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、及SEQ ID NO：54、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR1；
具有選自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、及SEQ ID NO：55、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR2；及
具有選自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、及SEQ ID NO：56、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR3；其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有選自由SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、及SEQ ID NO：45、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR1；
具有選自由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、及SEQ ID NO：46、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR2；及
具有選自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、及SEQ ID NO：47、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR3；及
具有選自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、及SEQ ID NO：54、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR1；
具有選自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、及SEQ ID NO：55、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR2；及
具有選自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、及SEQ ID NO：56、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR3；
其中該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(LCVR)，其包含選自由SEQ ID NO：73、65、1、3、及5所組成之群組的胺基酸序列；或重鏈可變區(HCVR)，其包含選自由SEQ ID NO：72、64、2、4、及6所組成之群組的胺基酸序列；或包含選自由SEQ ID NO：73、65、1、3、及5所組成之群組的 胺基酸序列之LCVR、與包含選自由SEQ ID NO：72、64、2、4、及6所組成之群組的胺基酸序列之HCVR的組合。
在一些實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(LCVR)，其包含與SEQ ID NO：73、65、1、3、或5中任一者具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(LCVR)，其包含與SEQ ID NO：73具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(LCVR)，其包含與SEQ ID NO：65具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(LCVR)，其包含與SEQ ID NO：1具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(LCVR)，其包含與SEQ ID NO：3具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(LCVR)，其包含與SEQ ID NO：5具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，胞外抗原結合域包含重鏈可變區(HCVR)，其包含與SEQ ID NO：72、64、2、4、或6中任一者具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含重鏈可變區(HCVR)，其包含與SEQ ID NO：72具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含重鏈可變區(HCVR)，其包含與SEQ ID NO：64具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含重鏈可變區(HCVR)，其包含與SEQ ID NO：2具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含重鏈可變區(HCVR)，其包含與SEQ ID NO：4具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含重鏈可變區(HCVR)，其包含與SEQ ID NO：6具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含：
包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈可變區；
包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈可變區；
包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區；
包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈可變區；或
包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含scFv。在一些實施例中，scFv包含在輕鏈可變區與重鏈可變區之間的連接子多肽。在某些實施例中，胞外抗原結合域係scFv，其包含選自由SEQ ID NO：78、77、75、76、8、9、10、24、25、及26所組成之群組的胺基酸序列，並與GPRC5D多肽(例如具有SEQ ID NO：57之胺基酸序列的人類GPRC5D多肽或其片段)特異性結合。
在一些實施例中，scFv自N至C端包含VH、連接子、及VL(VH-連接子-VL)。
在一些實施例中，scFv自N至C端包含VL、連接子、及VH(VL-連接子-VH)。
在重組表現系統中，連接子係肽連接子並可包括任何天然存在的胺基酸。可被包括至連接子中之例示性胺基酸係Gly、Ser、Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His、及The。連接子應具有足以連接VH及VL之長度，以 此方式使彼等相對於彼此形成正確的構形，使得彼等保留所欲活性，諸如與GPRC5D結合。
連接子可係約5至50個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至40個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約15至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係6個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係7個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係8個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係9個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係10個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係11個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係12個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係13個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係14個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係15個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係16個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係17個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係18個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係19個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係21個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係22個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係23個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係24個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係26個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係27個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係28個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係29個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係31個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係32個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係33個胺 基酸長。在一些實施例中，連接子係34個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係36個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係37個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係38個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係39個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係40個胺基酸長。可使用之例示性連接子係富含Gly之連接子、含Gly及Ser之連接子、含Gly及Ala之連接子、含Ala及Ser之連接子、及其他可撓性連接子。
在一個實施例中，連接子多肽包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
其他連接子序列可包括免疫球蛋白鉸鏈區域、衍生自任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈同型之CL或CH1之部分。可使用之例示性連接子係顯示於表1中。額外的連接子係描述於例如國際專利公開號WO2019/060695中，其全文以引用方式併入本文中。
在一個實施例中，連接子多肽包含SEQ ID NO：91至123中任一者之胺基酸序列。
Figure 109101459-A0202-12-0044-1
Figure 109101459-A0202-12-0045-2
在一個實施例中，scFv包含選自由SEQ ID NO：78、77、75、76、8、9、10、24、25、及26所組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：78、77、75、76、8、9、10、24、25、及26中任一者具 有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：78具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：77具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：75具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：76具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：8具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：9具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：10具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：24具有至少50%、至少 55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：25具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與SEQ ID NO：26具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含信號多肽。在一些實施例中，信號多肽包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：11具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO：82、81、80、79、17、18、19、20、21、及22所組成之群組的胺基酸序列、或與其具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之序列。具有包含選自由SEQ ID NO：82、81、80、79、17、18、19、20、21、及22所組成之群組的胺基酸序列之胞外抗原結合域的CAR之另一特徵係該胞外抗原結合域結合GPRC5D抗原。
在一個實施例中，胞內信號傳導域包含選自由下列所組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9(CD137)組分、T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分、分化簇(CD27)組分、分化簇超家族成員(諸如例如CD28或誘導性T細胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator,ICOS))組分、及其組合。
在一個實施例中，CD137組分包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。在一些實施例中，CD137組分包含與SEQ ID NO：12具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，CD3z組分包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3z組分包含與SEQ ID NO：13具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，胞內信號傳導域包含CD137組分及CD3z組分。
在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO：14具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
CAR之跨膜域可衍生自下列之跨膜域：CD8、T細胞受體之α、β、或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDI la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1 BB (CD137)、4-1 BBL、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFI)、CD160、CD1 9、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDI Id、ITGAE、CD103、ITGAL、CDI la、LFA-1、ITGAM、CDI lb、ITGAX、CDI lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD1 8、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、及/或NKG2C。
在一個實施例中，跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽。在一些實施例中，CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。在一些實施例中，CD8a-TM多肽包含與SEQ ID NO：15具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，跨膜域至少包含下列之(多個)跨膜區：T細胞受體之α、β、或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、或CD154。在另一實施例中，跨膜域至少包含下列之跨膜域：ζ、η、或FcεR1γ及-β、MB1(Igα.)、B29、或CD3-γ、ζ、或η。在另一實施例中，跨膜域係合成的，例如其主要包含疏水性殘基(諸如白胺酸及纈胺酸)、苯丙胺酸三聯體(triplet)、或色胺酸。
在一個實施例中，CAR進一步包含將跨膜域連接至胞外抗原結合域之鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區係CD8a鉸鏈區。在一些實施例中，CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些實施例中，CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO：16具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，鉸鏈區包含序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：124)，或包含與EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：124)具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，鉸鏈區包含序列ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：125)，或包含與ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：125)具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，鉸鏈區包含序列ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3 SEQ ID NO：126)，或包含與ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3 SEQ ID NO：126)具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，鉸鏈區包含序列ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：127)，或包含與ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：127)具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO：82、81、80、79、17、18、19、20、21、及22所組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：82、81、80、79、17、18、19、20、21、及22中任一者具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：82具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：81具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：80具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：79具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：17具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：18具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：19具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：20具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：21具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO：22具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，本揭露之CAR包含選自由SEQ ID NO：86、85、83、84、27、28、29、30、31、及32所組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：86、85、83、84、27、28、29、30、31、及32中任一者具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：86具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：85具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：83具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：84具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：27具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：28具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：29具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：30具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：31具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：32具有至少 50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
CAR建構體及表現CAR之免疫反應性細胞
在一個態樣中，本揭露提供編碼本文中所述之CAR的經單離核酸分子。在一些實施例中，核酸分子包含選自由SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、及38所組成之群組的核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、或38之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。
在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：90之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：90之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：89之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：89之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：87之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：87之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：88之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：88之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：33之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：33之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：34之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：34之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：35之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：35之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：36之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：36之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：37之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：37之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：90之核酸序列。在一些實施例中，經單離核酸分子包含與SEQ ID NO：38之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。
用語「編碼(encoding)」係指多核苷酸(諸如基因、cDNA、或mRNA)中核苷酸之特定序列在生物程序中作為合成其他聚合物及巨分子之模板的固有性質，該等聚合物及大分子具有所定義之核苷酸序列(例如rRNA、tRNA、及mRNA)或所定義之胺基酸序列、及自其得到之生物性質。因此，若對應於基因之mRNA的轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中生產蛋白質，則該基因、cDNA、或RNA編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列同一的編碼股及用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股兩者皆可稱為編碼蛋白質或該基因或cDNA之其他產物。
除非另有指明，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括係彼此之簡併型式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子，其達到使編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些型式中含有(多個)內含子之程度。
用語「經單離(isolated)」係指已自生產出該分子的系統(諸如重組細胞)的其他組分實質上分離及/或純化出之均質分子族群(諸如合成多核苷酸或多肽)、以及已經受至少一次純化或單離步驟的蛋白質。「經單離」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學物之分子，且涵蓋經單離成更高純度之分子，諸如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%純度。
在一些實施例中，本揭露提供一種表現載體，其包含所述之核酸分子(例如SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、或38)。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、或38之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。
在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：90之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：90之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：89之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：89之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：87之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：87之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：88之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：88之核苷酸序列至 少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：33之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：33之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：34之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：34之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：35之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：35之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：36之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：36之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：37之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：37之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序 列。在一些實施例中，表現載體包含SEQ ID NO：38之核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：38之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。
所述之核酸分子編碼具有選自由SEQ ID NO：86、85、83、84、27、28、29、30、31、及32所組成之群組的序列之胺基酸或其變體。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：86之胺基酸序列的核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：85之胺基酸序列的核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：83之胺基酸序列的核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：84之胺基酸序列的核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：27之胺基酸序列的核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：28之胺基酸序列的核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：29之胺基酸序列的核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：30之胺基酸序列的核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：31之胺基酸序列的核酸分子。在一些實施例中，表現載體包含編碼SEQ ID NO：32之胺基酸序列的核酸分子。
用語「表現載體(expression vector)」係指包含重組多核苷酸之載體，該重組多核苷酸包含與待表現之核苷酸序列可操作地連接之表現控制序列。表現載體包含足以供表現之順式作用元件(cis-acting element)；其他表現元件可由宿主細胞或在體外表現系統中供應。表現載體包括所屬技術領域中已知 之所有表現載體，包括併入重組多核苷酸之黏質體、質體(例如裸露或含於脂質體中)、及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、及腺相關病毒)。
在一個實施例中，本揭露提供一種表現本文中所述之核酸分子的細胞。在一個實施例中，本揭露之CAR包含選自由SEQ ID NO：86、85、83、84、27、28、29、30、31、及32所組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO：86、85、83、84、27、28、29、30、31、及32中任一者具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。
在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO：86具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO：85具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO：84具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO：27具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO：28具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO：29具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO：30具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO：31具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO：32具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個態樣中，本揭露提供包含本文中所述之CAR的經單離之免疫反應性細胞。在一些實施例中，將經單離之免疫反應性細胞用CAR轉導， 例如使CAR在免疫反應性細胞之表面上持續表現。在某些實施例中，將經單離之免疫反應性細胞進一步用至少一種共刺激配體轉導，使得該免疫反應性細胞表現該至少一種共刺激配體。在某些實施例中，至少一種共刺激配體係選自由下列所組成之群組：4-1BBL、CD48、CD70、CD80、CD86、OX40L、TNFRSF14、及其組合。在某些實施例中，將經單離之免疫反應性細胞進一步用至少一種細胞介素轉導，使得該免疫反應性細胞分泌該至少一種細胞介素。在某些實施例中，至少一種細胞介素係選自由下列所組成之群組：IL-2、IL-3，IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、及其組合。在一些實施例中，經單離之免疫反應性細胞係選自由下列所組成之群組：T淋巴球(T細胞)、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、人類胚胎幹細胞、淋巴樣前驅細胞(lymphoid progenitor cell)、T細胞前體細胞(T cell-precursor cell)、及多能性幹細胞(自其可分化出淋巴樣細胞)。
本發明編碼CAR之核酸序列可藉由「轉染(transfection)」、「轉形(transformation)」、或「轉導(transduction)」引入細胞中。如本文中所使用，「轉染」、「轉形」、或「轉導」係指藉由使用物理或化學方法將一或多種外源性多核苷酸引入宿主細胞中。許多轉染技術在所屬技術領域中係已知的，並包括例如磷酸鈣DNA共沉澱(參見例如Murray E.J.(ed.),Methods in Molecular Biology,Vol.7,Gene Transfer and Expression Protocols,Humana Press(1991))；DEAE-葡聚糖；電穿孔；陽離子脂質體介導之轉染；鎢粒子促進之微粒子轟擊(Johnston,Nature,346：776-777(1990))；及磷酸鍶DNA共沈澱(Brash et al.,Mol.Cell Biol.,7：2031-2034(1987))。在傳染性粒子在適合的包裝細胞(packaging cell)(其中許多為市售可得的)中生長之後，可將噬菌體或病毒載體引入宿主細胞中。
在一個實施例中，本揭露之CAR T細胞可藉由將包含所欲CAR(例如包含抗GPRC5D、CD8α鉸鏈及跨膜域、及人類4-1BB及CD3ζ信號傳導域之CAR)之慢病毒載體引入細胞中來產生。本發明之CAR T細胞能夠在體內複製導致長期持續存在，致使腫瘤控制得以持續。
本發明之實施例進一步提供宿主細胞，其包含本文中所述之重組表現載體中之任一者。如本文中所使用，用語「宿主細胞(host cell)」係指可含有重組表現載體之任何類型的細胞。宿主細胞可係真核細胞(例如植物、動物、或藻類、真菌)或可係原核細胞(例如細菌或原生動物)。宿主細胞可係經培養之細胞或初代細胞，即直接自生物(例如人類)單離。宿主細胞可係貼附性細胞或懸浮細胞(即在懸浮液中生長之細胞)。適合的宿主細胞在所屬技術領域中係已知的，並包括例如DH5α大腸桿菌細胞、中國倉鼠卵巢細胞、猴VERO細胞、COS細胞、HEK293細胞、及類似者。出於擴增或複製重組表現載體之目的，宿主細胞可係原核細胞，例如DH5α細胞。出於產生重組CAR、多肽、或蛋白質之目的，宿主細胞可係哺乳動物細胞。宿主細胞可係人類細胞。雖然宿主細胞可屬於任何細胞類型，可源自於任何類型的組織，且可處於任何發展階段，但宿主細胞可係周邊血液淋巴球(PBL)。宿主細胞可係T細胞。
出於本文中之目的，T細胞可係任何T細胞，諸如經培養之T細胞(例如初代T細胞)、或來自經培養之T細胞系(例如Jurkat、SupT1等)的T細胞、或獲自哺乳動物之T細胞。若獲自哺乳動物，則T細胞可獲自許多來源，包括但不限於骨髓、血液、淋巴結、胸腺、或其他組織或流體。T細胞亦可經 富集或純化。T細胞可係人類T細胞。T細胞可係單離自人類之T細胞。T細胞可係任何類型的T細胞且可處於任何發展階段，包括但不限於CD4+/CD8+雙陽性T細胞、CD8+ T細胞(例如細胞毒性T細胞)、CD4+輔助T細胞(例如Th1及Th2細胞)、周邊血液單核細胞(PBMC)、周邊血液白血球(PBL)、腫瘤浸潤細胞(tumor infiltrating cell)、記憶T細胞、初始T細胞、及類似者。T細胞可係CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。
T細胞亦可包括「NKT細胞」，其係指T細胞之特化族群，其表現半不變αβ T細胞受體(semi-invariant αβ T-cell receptor)，但亦表現一般與NK細胞相關聯之各種分子標記，諸如NK1.1。NKT細胞包括NK1.1+及NK1.1-、以及CD4+、CD4-、CD8+、及CD8-細胞。NKT細胞上之TCR係獨特的，在於其辨識由類MHC I分子CD Id所呈現之醣脂質(glycolipid)抗原。NKT細胞由於其產生促進發炎或免疫耐受性之細胞介素的能力以致可具有防護效應或有害效應。亦包括的是「γ-δ T細胞(gamma-delta T cell，γδ T細胞)」，其係指特化族群，即在表面上具有不同TCR之T細胞小亞群，且不像大多數T細胞(其中TCR係由兩條指定為α-TCR鏈及β-TCR鏈之醣蛋白鏈構成)，γδ T細胞中之TCR係由γ鏈及δ鏈組成。γδ T細胞可在免疫監視及免疫調控中發揮作用，且發現其係IL-17之重要來源並誘導穩健的CD8+細胞毒性T細胞反應。亦包括的是「調節性T細胞(regulatory T cell)」或「Treg」，其係指抑制異常或過度免疫反應且在免疫耐受性中發揮作用之T細胞。Treg細胞一般係轉錄因子Foxp3陽性CD4+T細胞，且亦可包括係生產IL-10之CD4+T細胞的轉錄因子Foxp3陰性調節性T細胞。
T細胞系可購自例如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC,Manassas,VA)及德國微生物及細胞培養物保藏中心 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,DSMZ)，且包括例如Jurkat細胞(ATCC TIB-152)、Sup-Tl細胞(ATCC CRL-1942)、RPMI 8402細胞(DSMZ ACC-290)、Karpas 45細胞(DSMZ ACC-545)、及其衍生物。
在另一實施例中，宿主細胞係自然殺手(NK)細胞。NK細胞係細胞毒性淋巴球類型，其在先天性免疫系統中發揮作用。NK細胞係定義為顆粒淋巴球，並構成分化自普通淋巴樣前驅細胞(其亦產生B淋巴球及T淋巴球)的第三種細胞(參見例如Immunobiology,5th ed.,Janeway et al.,eds.,Garland Publishing,New York,NY(2001))。NK細胞在骨髓、淋巴結、脾臟、扁桃腺、及胸腺中分化並成熟。在成熟之後，NK細胞以具有特殊細胞毒性顆粒之大淋巴球進入循環中。NK細胞能夠辨識並殺滅一些異常細胞，諸如例如一些腫瘤細胞及病毒感染之細胞，且被認為在對抗胞內病原體之先天性免疫防禦中係重要的。如上關於T細胞所述，NK細胞可係任何NK細胞，諸如經培養之NK細胞(例如初代NK細胞)、或來自經培養之NK細胞系的NK細胞、或獲自哺乳動物之NK細胞。若獲自哺乳動物，則NK細胞可獲自許多來源，包括但不限於血液、骨髓、淋巴結、胸腺、或其他組織或流體。NK細胞亦可經富集或純化。NK細胞較佳地係人類NK細胞(例如自人類單離出)。NK細胞系可購自例如美國典型培養物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)，且包括例如NK-92細胞(ATCC CRL-2407)、NK92MI細胞(ATCC CRL-2408)、及其衍生物。
亦提供一種細胞群，其包含至少一種本文所述之宿主細胞。細胞群可係非均質族群，其除了至少一種其他細胞以外包含含有所述重組表現載體中之任一者的宿主細胞，其他細胞例如不包含該等重組表現載體中之任一者的宿主細胞(例如T細胞)或T細胞以外之細胞(例如B細胞、巨噬細胞、紅血 球、嗜中性球、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞、腦細胞等)。替代地，細胞群可係實質上均質族群，其中族群主要包含宿主細胞(例如基本上由其所組成)，該等宿主細胞包含該重組表現載體。族群亦可係細胞之殖株族群，在其中該族群之所有細胞係單一宿主細胞之殖株，該宿主細胞包含重組表現載體，使得該族群之所有細胞包含該重組表現載體。在一個實施例中，細胞群係包含宿主細胞之殖株族群，該等宿主細胞包含如本文中所述之重組表現載體。
醫藥組成物/投予
在本揭露之實施例中，表現CAR之細胞可以組成物形式提供，例如適合的(多種)醫藥組成物，其包含表現CAR之細胞及醫藥上可接受之載劑。在一個態樣中，本揭露提供醫藥組成物，其包含有效量的表現一或多種所述CAR的淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。本揭露之醫藥組成物可包含表現CAR之細胞(例如複數個表現CAR之細胞，如本文中所述)與一或多種醫藥上或生理上可接受之載劑、賦形劑、或稀釋劑的組合。醫藥上可接受之載劑可係活性成分以外之醫藥組成物中的成分，其對對象係無毒的。
醫藥上可接受之載劑可包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。醫藥上可接受之載劑的實例係生理上相容的溶劑、分散介質、覆膜(coating)、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、及類似者，諸如鹽、緩衝劑、抗氧化劑、醣、水性或非水性載劑、防腐劑、潤濕劑、界面活性劑、或乳化劑、或其組合。醫藥組成物中(多種)醫藥上可接受之載劑的量可 基於(多種)載劑之活性及配方之所欲特性(諸如穩定性及/或最小氧化)來實驗判定
此類組成物可包含緩衝劑，諸如乙酸、檸檬酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、碳酸、蘋果酸、天冬胺酸、組胺酸、硼酸、Tris緩衝劑、HEPPSO、HEPES、中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、及類似者；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(如氫氧化鋁)；抗細菌劑及抗真菌劑；及防腐劑。
本揭露之組成物可經配製以用於經腸或非腸外投予之各種手段。在一個實施例中，組成物可經配製以用於輸注或靜脈內投予。本文中所揭示之組成物可例如以無菌液體製劑提供，例如等滲水溶液、乳化液、懸浮液、分散夜、黏性組成物，其可經緩衝至所欲的pH。適合用於口服投予之配方可包括液體溶液、膠囊、囊劑(sachet)、錠劑、口含錠(lozenge)、及口含錠(troche)、於適當液體中之粉末液體懸浮液、及乳化液。
如本文中關於醫藥組成物所使用，用語「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」意指經美國聯邦或州政府的管理機構批准，或列在美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他公認的藥典中以用於動物及/或人類。
在一個態樣中，本揭露係關於使用淋巴球輸注投予表現CAR之經基因修飾之T細胞，以用於治療患有癌症或有患癌症之風險的患者。在至少一個實施例中，在治療中使用自體淋巴球輸注。自有需要治療之對象收集自體PBMC，並將T細胞使用本文中所述及所屬技術領域中已知之方法活化並擴增，然後將其輸注回至該對象中。
在一個態樣中，本揭露大致上係關於治療有發展癌症之風險的對象。本發明亦包括治療對象之化學療法及/或免疫療法導致顯著免疫抑制從而增加對象發展癌症之風險的惡性疾病或自體免疫疾病。在一個態樣中，本揭露提供預防癌症之方法，該等方法包含向有需要之對象投予一定量的表現一或多種所述CAR之淋巴球。
在一個態樣中，本揭露提供治療患有癌症之對象的方法，該等方法包含向有需要之對象投予治療有效量的表現一或多種所述CAR之淋巴球，藉此該淋巴球誘導或調節該對象中癌細胞之殺滅。
在另一態樣中，本揭露提供減少患有癌症之對象的腫瘤負荷之方法，該等方法包含向有需要之對象投予治療有效量的表現一或多種本文中所述之CAR的淋巴球，藉此該淋巴球誘導殺滅該對象之癌細胞。在另一態樣中，本揭露提供增加患有癌症之對象的存活之方法，該等方法包含向有需要之對象投予治療有效量的表現一或多種所述CAR之淋巴球，藉此延長該對象之存活。通常而言，表現(多種)CAR之淋巴球誘導對象中癌細胞之殺滅，並導致對象中腫瘤/癌細胞之減少或根除。可靶向的癌症(包括轉移性病灶)之非限制性清單包括：肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌、轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)、多發性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、及其組合。在一個實施例中，對象正接受治療的癌症係多發性骨髓瘤。
在一個態樣中，本文中所述之方法適用於治療有發展成癌性病況之風險的非癌性病況，諸如例如有發展成血癌(諸如MM或淋巴瘤)之風險的意義未明的單株球蛋白症(monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS)、及有發展成血癌(諸如白血病)之風險的骨髓發育不良症候群。
在一個態樣中，提供治療患有癌症之對象的方法，該等方法包含向有需要之對象投予治療有效量的表現CAR之淋巴球，該CAR具有結合GPRC5D抗原之胞外抗原結合域，藉此該淋巴球誘導殺滅該對象之癌細胞。在一些實施例中，CAR中之至少一者包含選自由SEQ ID NO：86、85、83、84、27、28、29、30、31、及32所組成之群組的胺基酸序列。
在一個態樣中，揭示一種靶向殺滅癌細胞之方法，該方法包含使該癌細胞與表現一或多種所述CAR的淋巴球接觸，藉此該淋巴球誘導殺滅該癌細胞。可靶向的癌細胞(包括轉移性癌細胞)之非限制性清單包括：肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、肝細胞癌細胞、腎細胞癌細胞、膀胱泌尿上皮癌細胞、轉移性黑色素瘤細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞、子宮頸癌細胞、頭頸癌細胞、胰腺癌細胞、神經膠質瘤細胞、神經膠質母細胞瘤細胞、及非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)細胞、急性淋巴球性白血病(ALL)細胞、慢性淋巴球性白血病(CLL)細胞、慢性骨髓性白血病(CML)細胞、燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)細胞、多發性骨髓瘤(MM)細胞、急性骨髓性白血病(AML)細胞、及其組合。在一個實施例中，癌細胞係多發性骨髓瘤細胞。
本揭露之醫藥組成物可以適於待治療(或預防)疾病之方式投予。儘管適當劑量可藉由臨床試驗判定，但投予的數量及頻率將由諸如下列之因子判定：對象的病況、及對象的疾病之類型及嚴重性。
用語「治療(treat或treatment)」係指治療性處理，其中目的係在於減緩(減輕)非所欲之生理變化或疾病，或在治療期間提供有益或所欲之臨床結果。有益或所欲之臨床結果包括症狀的減輕、疾病程度的減小、疾病狀態的穩定化(即不惡化)、疾病進程的延緩或減緩、疾病狀態的改善或緩和、及/或緩解(無論部分或完全)，無論是可偵測或不可偵測的。「治療」亦可意指相較於未接受治療之對象之預期存活而延長存活。那些需要治療的對象包括那些已經患有不想要的生理變化或疾病的對象，以及那些易患有該生理變化或疾病的對象。
「治療有效量(therapeutically effective amount)」或「有效量(effective amount)」在本文中可互換使用，且係指有效達到所欲治療結果所需之劑量及時間段的量。治療有效量可依不同因素而異，諸如對象之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在對象中引發所欲反應的能力。有效治療劑或治療劑組合之例示指標包括例如病患幸福感的提高、腫瘤負荷的減少、腫瘤生長的停止或減緩、及/或癌細胞沒有轉移至身體的其他位置。
如本文中所使用，用語「對象(subject)」係指動物。用語「對象(subject)」及「患者(patient)」在本文中提及對象時可互換使用。因此，「對象(subject)」包括作為患者正接受疾病治療或疾病預防之人類。
本文中所述之方法可用來治療屬於任何分類之動物對象。此類動物之實例包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於嚙齒目之哺乳動物(諸如小 鼠及倉鼠)及兔形目(諸如兔)之哺乳動物。哺乳動物可係來自食肉目，其包括貓科動物(貓)及犬科動物(狗)。哺乳動物可係來自偶蹄目，其包括牛科動物(牛)及豬科動物(豬)，或屬於奇蹄目，其包括馬科動物(馬)。哺乳動物可屬於靈長目、新世界猴類(Ceboid)、或猴類(Simoid)(猴)或屬於類人猿亞目(人類及猿)。在一個實施例中，哺乳動物係人類。
當指示治療有效量時，所投予之本揭露之組成物的準確量可由醫師考慮個體在年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度、及對象病況之差異來判定。通常可陳述為，包含本文中所述之T細胞的醫藥組成物可以約104至約1010個細胞/kg體重之劑量、在一些情況下約105至約106個細胞/kg體重之劑量(包括在該等範圍內之全部整數值)投予。在一些實施例中，包含本文中所述之T細胞的醫藥組成物可以約106個細胞/kg體重之劑量投予。T細胞組成物亦可以此等劑量投予多次。可藉由使用免疫療法中一般已知的輸注技術投予細胞(參見例如Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。
可用於本發明之實施例的背景中的遞送系統可包括延時釋放(time-released)、延緩釋放(delayed release)、及持續釋放(sustained release)遞送系統，使得T細胞組成物之遞送在待治療部位之敏化前發生，且有足夠的時間以引起待治療部位之敏化。組成物可與其他治療劑或療法結合使用。此類系統可避免組成物之重複投予，從而增加對對象及醫師的便利性，且可特別適用於本發明之某些組成物實施例。
許多類型的釋放遞送系統為所屬技術領域中具有通常知識者可得且已知的。彼等包括聚合物基底系統(polymer base system)，諸如聚(乳酸交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚酯醯胺、聚原酸酯、聚己內酯、聚羥基丁酸、及聚 酐。前述含有藥物之聚合物的微膠囊係描述於例如美國專利第5,075,109號中。遞送系統亦包括非聚合物系統，其係脂質，包括固醇(諸如膽固醇、膽固醇酯)、及脂肪酸或中性脂肪(諸如單酸、二酸、及三酸甘油酯)；矽橡膠系統；基於肽之系統；水凝膠釋放系統；蠟覆膜；使用習知黏合劑及賦形劑之壓製錠；部分融合型植入物；及類似者。具體實例包括但不限於：(a)侵蝕系統(erosional system)，其中活性組成物係以一形式含在基質內，諸如在美國專利第4,452,775號；第4,667,014號；第4,748,034號；及第5,239,660號中所述者及(b)擴散系統，其中活性組分以受控速率自聚合物滲出，諸如在美國專利第3,854,480號及第3,832,253號中所述。此外，可使用基於泵之硬體遞送系統，其中一些經調適以用於植入。
在某些態樣中，可能所欲的是將經活化之T細胞投予至對象，隨後再抽血(或執行血球分離術)，根據本揭露活化T細胞，並將這些經活化並擴增之T細胞再輸注至對象。此程序可每幾週執行多次。在某些態樣中，T細胞可由抽取10cc至400cc的血液來活化。在某些態樣中，T細胞係由抽取20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc的血液來活化。
CAR-T細胞及組成物之投予可以任何方式進行，例如藉由腸胃外或非腸胃外投予，包括藉由氣霧劑吸入、注射、輸注、攝食、輸血、植入、或移植。舉例而言，本文中所述之CAR-T細胞及組成物可經動脈、皮內、皮下、腫瘤內、髓內、結內(intranodally)、肌內、藉由靜脈(i.v.)注射、或腹膜內投予至患者。在一個態樣中，本揭露之組成物係藉由i.v.注射投予。在一個態樣 中，本揭露之組成物係藉由皮內或皮下注射投予至對象。T細胞之組成物可例如直接注射至腫瘤、淋巴結、組織、器官、或感染部位中。
投予可係自體的或非自體的。舉例而言，表現G蛋白偶聯受體(例如GPRC5D)特異性CAR之免疫反應性細胞可獲自一個對象，並將其投予至相同對象或不同、相容的對象。本揭露之周邊血液衍生之T細胞、或經擴增之T細胞(例如體內、離體、或體外衍生)可經由例如靜脈內注射、局部注射、全身性注射、導管投予、或腸胃外投予來投予。
在具體實施例中，對象可經歷白血球分離術(leukapheresis)，其中白血球經離體收集、富集、或去除，以選擇及/或單離感興趣之細胞(例如T細胞)。可將此等T細胞單離物藉由所屬技術領域中已知的方法擴增並處理，使得可引入本揭露之一或多種CAR建構體，從而產生CAR-T細胞。有需要之對象隨後可經歷高劑量化學療法的標準治療，接著經歷周邊血液幹細胞移植。在某些態樣中，在移植之後或與移植同時，對象接受經擴增之CAR-T細胞輸注。在一個態樣中，經擴增之細胞係在手術之前或之後投予。
投予至患有惡性疾病之患者的劑量係足以減輕或至少部分地停止所治療之疾病(「治療有效量」)。投予至患者之以上治療之劑量將隨所治療病況之準確性質及治療之接受者而變化。用於人類投予之劑量可根據所屬技術領域中一般接受之實務進行調整。
本發明之CART T細胞可經歷體內T細胞擴增並可建立GPRC5D特異性記憶細胞，該等記憶細胞在血液及骨髓中保持在高水平達很長的時間量。在一些情況下，將本發明之CAR T細胞輸注至對象中可在體內消除患有晚期化學療法抗藥性癌症之對象的癌細胞，例如白血病細胞。
在一個實施例中，將本揭露之CAR引入T細胞中(例如使用體外轉錄)，且對象(例如人類)接收本揭露之CAR-T細胞的初次投予、及CAR-T細胞之一或多次後續投予，其中一或多次後續投予係在前次投予之後少於15天投予，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2天。在一個實施例中，每週向對象(例如人類)投予一次以上的CAR-T細胞投予，例如每週投予2、3、或4次的CAR-T細胞投予。在一個實施例中，對象每週接受一次以上的CAR-T細胞投予(例如每週2、3、或4次投予)(本文中亦稱為週期)，之後一週沒有CAR-T細胞投予，然後向對象投予一或多次額外的CAR-T細胞投予(例如每週一次以上的CAR-T細胞投予)。在另一實施例中，對象接受一個週期以上的CAR-T細胞，且各週期之間的時間少於10、9、8、7、6、5、4、或3天。在一個實施例中，CAR-T細胞係每隔一天投予，每週3次投予。在一個實施例中，投予CAR-T細胞至少二、三、四、五、六、七、八、或更多週。
在一個實施例中，投予可在一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、兩週、三週、一個月、五週、六週、七週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、或更久之後重覆進行。重覆治療過程亦為可能者，如為慢性投予。重覆投予可在相同劑量或在不同劑量下。
CAR-T細胞可在本發明之方法中藉由維持療法來投予，諸如例如一週一次持續6個月或更久的期間。
在一個實施例中，CAR-T細胞係使用慢病毒病毒載體(諸如慢病毒)產生。用此類病毒載體產生的CAR-T細胞通常將具有穩定的CAR表現。
在一個實施例中，CAR-T細胞在轉導之後暫時表現CAR載體達4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。CAR之暫時表現可受RNA CAR載體遞送影響。在一個實施例中，CAR RNA係藉由電穿孔轉導至T細胞中。
若患者在暫時CAR療法療程期間有產生抗CAR抗體反應之高風險(諸如因RNA轉導而產生者)，則CAR-T輸注間歇期不應持續多於十至十四天。
本文中所述之表現CAR之細胞可與其他已知的藥劑及療法組合使用。如本文中所使用，「組合(in combination)」投予意指在對象的治療療程期間將二(或更多)種不同的療法遞送至對象，例如在對象已經診斷有癌症之後及在癌症已經治癒或消除或治療已因其他原因中止之前遞送二(或更多)種療法。在一些實施例中，一種療法之遞送在第二療法之遞送開始時仍存在，使得就投予而言存在重疊。在本文中此有時被稱為「同時(simultaneous)」或「並行遞送(concurrent delivery)」。在其他實施例中，一種療法之遞送在另一種療法之遞送開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，療法因組合投予而更有效。舉例而言，第二療法更有效，例如用較少的第二療法見到等效效應，或第二療法減少症狀的程度大於若在不存在第一療法下投予第二療法所見到的程度，或用第一療法見到類似情況。在一些實施例中，遞送使得症狀或與病症相關之其他參數的減少大於在不存在另一療法下用一種療法遞送時所觀測到的減少。兩種療法之效應可係部分相加的、完全相加、的或大於相加的。遞送可使得當遞送第二療法時，仍可偵測到所遞送之第一療法之效應。
在一個實施例中，其他治療劑(諸如因子)可在投予CAR-T細胞之前、之後投予、或與CAR-T細胞在相同時間(同時)投予，包括但不限於：介白素，例如IL-2、IL-3、IL 6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21、以及 其他介白素；群落刺激因子，諸如G-CSF、M-CSF、及GM-CSF；及干擾素，例如γ-干擾素。
本文中所述之表現CAR之細胞及至少一種額外治療劑可以同一個組成物或以分開的組成物同時投予、或依序投予。針對依序投予，可先投予本文中所述之表現CAR之細胞，其次可投予另一種藥劑，或投予順序可顛倒。
在進一步實施例中，本文中所述之表現CAR之細胞在治療方案中可與下列組合使用：手術、輻射、化學療法、免疫抑制劑(諸如胺甲喋呤(methotrexate)、環孢素、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸酯(mycophenolate)、及FK506)、抗體或其他免疫消融劑(immunoablative agent)(諸如抗CD3抗體或其他抗體療法)、細胞毒素、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素(rapamycin)、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞介素、及幅照。
在一個實施例中，本文中所述之表現CAR之細胞可與化學治療劑組合使用。例示化學治療劑包括但不限於蒽環類藥物(anthracycline)(例如阿黴素(doxorubicin)(例如脂質體阿黴素)、長春花生物鹼類(vinca alkaloid)(例如長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine))、烷化劑(例如環磷醯胺、達卡巴仁(decarbazine)、美法侖(melphalan)、異環磷醯胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide))、免疫細胞抗體(例如阿來組單抗(alemtuzamab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托西莫單抗(tositumomab))、抗代謝藥(包括例如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、及腺苷去胺酶抑制劑(例如氟達拉濱(fludarabine)))、mTOR抑制劑、TNFR糖皮質素誘導性TNFR相關蛋白(GITR)促效劑、蛋白酶體抑制劑(例如阿克拉黴素A(aclacinomycin A)、黴膠毒素 (gliotoxin)、或硼替佐米(bortezomib))、免疫調節劑(諸如沙利度胺(thalidomide)或沙利度胺衍生物(例如來那度胺(lenalidomide))。
考慮在組合療法中使用之化學治療劑的非窮舉清單包括：安美達錠(anastrozole)(Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide)(Casodex®)、博來黴素硫酸鹽(bleomycin sulfate)(Blenoxane®)、白消安(busulfan)(Myleran®)、亞葉酸鈣(leucovorin calcium)、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、胺甲喋呤(Folex®)、米托蒽醌(mitoxantrone)(Novantrone®)、Mylotarg、紫杉醇(paclitaxel)(Taxol®)、菲尼克斯(phoenix)(釔90/MX-DTPA)、噴司他丁(pentostatin)、聚苯丙生(polifeprosan)20與卡莫司汀植入物(Gliadel®)、放線菌素(dactinomycin)(放線菌素D(actinomycin D)、Cosmegan)、道諾黴素鹽酸鹽(daunorubicin hydrochloride)(Cerubidine®)、道諾黴素檸檬酸鹽脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松(dexamethasone)、歐洲紫杉醇(docetaxel)(Taxotere®)、阿黴素鹽酸鹽((Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(etoposide)(Vepesid®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine)(Xeloda®)、N4-戊氧羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(carboplatin)(Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine)(BiCNU®)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)(Leukeran®)、順鉑(cisplatin)(Platinol®)、克拉屈濱(cladribine)(Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯醣(cytosine arabinoside)(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴仁(DTIC-Dome®)、氟達拉濱磷酸鹽(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(flutamide)(Eulexin®)、替扎他濱(tezacitibine)、吉西他濱(gemcitabine)(二氟去氧胞苷)、羥基脲(Hydrea®)、艾達黴素(idarubicin)(Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、愛萊諾迪肯(irinotecan) (Camptosar®)、L-天冬醯胺酸酶(ELSPAR®)、他莫昔芬檸檬酸鹽(tamoxifen citrate)(Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide)(Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、噻替哌(thiotepa)、替拉札明(tirapazamine)(Tirazone®)、用於注射之拓撲替康鹽酸鹽(topotecan hydrochloride)(Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)、及長春瑞濱(vinorelbine)(Navelbine®)。
例示烷化劑包括但不限於氮芥子氣、伸乙亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲(nitrosourea)、及三氮烯：尿嘧啶氮芥(uracil mustard)(Aminouracil Mustard®、Chlorethaminacil®、Haemanthamine®、Nordopan®、Uracil Nitrogen Mustard®、Uracillost®、Uracilmostaza®、Uramustin®、Uramustine®)、氮芥(chlormethine)(Mustargen®)、環磷醯胺(Cytoxan®、Neosar®、Clafen®、Endoxan®、Procytox®、RevimmuneTM)、異環磷醯胺(Mitoxana®)、美法侖(Alkeran®)、苯丁酸氮芥(Leukeran®)、哌泊溴烷(pipobroman)(Amedel®、Vercyte®)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)(Hemel®、Hexylen®、Hexastat®)、Demethyldopan®、Desmethyldopan®、三乙烯硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺(temozolomide)(Temodar®)、噻替哌(Thioplex®)、白消安(Busilvex®、Myleran®)、卡莫司汀(BiCNU®)、洛莫司汀(lomustine)(CeeNU®)、鏈脲佐菌素(streptozocin)(Zanosar®)、及達卡巴仁(DTIC-Dome®)。額外例示烷化劑包括但不限於：奧沙利鉑(oxaliplatin)(Eloxatin®)；美法侖(亦稱為L-PAM、L-溶肉瘤素、及苯丙胺酸氮芥、Alkeran®)；六甲蜜胺(altretamine)(亦稱為六甲基三聚氰胺(HMM)、Hexylen®)；卡莫司汀(BiCNU®)；苯達莫司汀(bendamustine)(Treanda®)；白消安(Busulfex®及Myleran®)；卡鉑(Paraplatin®)；替莫唑胺(Temodar®及 Temodal®)；放線菌素(亦稱為放線菌素D、Cosmegan®)；洛莫司汀(亦稱為CCNU、CeeNU®)；順鉑(亦稱為CDDP、Platinol®、及Platinol®-AQ)；苯丁酸氮芥(Leukeran®)；環磷醯胺(Cytoxan®及Neosar®)；達卡巴仁(亦稱為DTIC、DIC、及咪唑甲醯胺、DTIC-Dome®)；六甲蜜胺(altretamine)(亦稱為六甲基三聚氰胺(HMM)、Hexylen®)；異環磷醯胺(Ifex®)；潑尼莫司汀(prednumustine)；丙卡巴肼(procarbazine)(Matulane®)；甲基二(氯乙基)胺(Mechlorethamine)(亦稱為氮芥子氣、氮芥(mustine)、及甲基二(氯乙基)胺鹽酸鹽(mechloroethamine hydrochloride)、Mustargen®)；鏈脲佐菌素(Zanosar®)；噻替哌(亦稱為硫代磷醯胺(thiophosphoamide)、TESPA、及TSPA、Thioplex®)；環磷醯胺(Endoxan®,Cytoxan®,Neosar®,Procytox®,Revimmune®)；及苯達莫司汀HCl(Treanda®)。
可用於本文中之免疫調節劑的實例包括但不限於例如：阿夫妥珠單抗(afutuzumab)(可購自Roche®)；培非格司亭(pegfilgrastim)(Neulasta®)；來那度胺(CC-5013,Revlimid®)；沙利度胺(Thalomid®)、艾科替米(actimid)(CC4047)；及IRX-2(人類細胞介素之混合物，包括介白素1、介白素2、及干擾素γ，CAS 951209-71-5，可購自IRX Therapeutics)。
在一個實施例中，可向對象投予使表現CAR之細胞之活性增強的藥劑。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可係抑制抑制性分子之藥劑。在一些實施例中，抑制性分子(例如程式性死亡1(PD1))可降低表現CAR之細胞建立免疫效應反應的能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及TGFRβ。
例示實施例說明如下。
實施例1.一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的重鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的重鏈CDR3；
具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的重鏈CDR3；或
具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR3；
其中該胞外抗原結合域結合抗G蛋白受體C家族5組成員D(GPRC5D)抗原。
實施例2.如實施例1之CAR，其中
該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈 CDR1、具有SEQ ID NO：70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：71之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：49之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或
該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
實施例3.如實施例1或2之CAR，其中該胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(LCVR)，其包含選自由SEQ ID NO：73、65、1、3、及5所組成之群組的胺基酸序列；或重鏈可變區(HCVR)，其包含選自由SEQ ID NO：72、64、2、4、及6所組成之群組的胺基酸序列；或包含選自由SEQ ID NO：73、65、1、3、及5所組成之群組的胺基酸序列之LCVR、與包含選自由SEQ ID NO：72、64、2、4、及6所組成之群組的胺基酸序列之HCVR的組合。
實施例4.如實施例1至3之CAR，其中該胞外抗原結合域包含：
包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈可變區；
包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈可變區；
包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區；
包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈可變區；或
包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的重鏈可變區。
實施例5.如實施例1至4中任一者之CAR，其中該胞外抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。
實施例6.如實施例5之CAR，其中該scFv包含在該輕鏈可變區與該重鏈可變區之間的連接子多肽。
實施例7.如實施例6之CAR，其中該連接子多肽包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
實施例8.如實施例5至7中任一者之CAR，其中該scFv包含選自由SEQ ID NO：78、77、75、76、8、9、10、24、25、及26所組成之群組的胺基酸序列。
實施例9.如實施例1至8中任一者之CAR，其中該胞外抗原結合域包含信號多肽。
實施例10.如實施例9之CAR，其中該信號多肽包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
實施例11.如實施例1至10中任一者之CAR，其中該胞內信號傳導域包含選自由下列所組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9(CD137)組分、T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分、分化簇(CD27)組分、分化簇超家族成員組分、及其組合。
實施例12.如實施例11之CAR，其中該CD137組分包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
實施例13.如實施例11之CAR，其中該CD3z組分包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
實施例14.如實施例11之CAR，其中該胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。
實施例15.如實施例1至14中任一者之CAR，其中該跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽。
實施例16.如實施例15之CAR，其中該CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
實施例17.如實施例1至16中任一者之CAR，其進一步包含將該跨膜域連接至該胞外抗原結合域之鉸鏈區。
實施例18.如實施例17之CAR，其中該鉸鏈區係CD8a鉸鏈區。
實施例19.如實施例18之CAR，其中該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。
實施例20.如實施例1至19中任一者之CAR，其中該胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO：82、81、80、79、17、18、19、20、21、及22所組成之群組的胺基酸序列。
實施例21.如實施例1至20中任一者之CAR，其中該CAR包含選自由SEQ ID NO：86、85、83、84、27、28、29、30、31、及32所組成之群組的胺基酸序列。
實施例22.一種經單離淋巴球，其表現如實施例1至21中任一者之CAR。
實施例23.如實施例22之經單離淋巴球，其中該淋巴球係T淋巴球。
實施例24.一種經單離核酸分子，其編碼如實施例1至21中任一者之CAR。
實施例25.如實施例24之經單離核酸分子，其中該核酸分子包含選自由SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、及38所組成之群組的核酸序列。
實施例26.如實施例24之經單離核酸分子，其中該核酸分子包含與SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、及38之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。
實施例27.一種載體，其包含如實施例24至26中任一者之核酸分子。
實施例28.一種細胞，其表現如實施例24至26中任一者之核酸分子。
實施例29.一種醫藥組成物，其包含有效量的如實施例22至23中任一者之淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。
實施例30.一種治療患有癌症之對象之方法，該方法包含：
向有需要之對象投予治療有效量的如實施例22至23中任一者之淋巴球，藉此該淋巴球誘導殺滅該對象之癌細胞。
實施例31.如實施例30之方法，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌、轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、及其他實體腫瘤、及非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)、多發性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、及其他液體腫瘤、及其組合。
實施例32.如實施例30之方法，其中該癌症係多發性骨髓瘤。
實施例33.一種靶向殺滅癌細胞之方法，該方法包含：
使該癌細胞與如實施例22至23中任一者之淋巴球接觸，藉此該淋巴球誘導殺滅該癌細胞。
實施例34.如實施例33之方法，其中該癌細胞係選自由下列所組成之群組：肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌、轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、及其他實體腫瘤、及非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)、多發性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、及其他液體腫瘤、及其組合
實施例35.如實施例33之方法，其中該癌細胞係多發性骨髓瘤細胞。
實例
下列實例係經提供以進一步描述本文中所揭露之一些實施例。該等實例意欲說明而非限制所揭露之實施例。
實例1-a-GPRC5D scFv CAR之表現
將初代人類泛T細胞在沒有mRNA情況下電穿孔(模擬物)或電穿孔導入10μg的表現α-GPRC5D scFv CAR或同型對照CAR之mRNA。電穿孔後24小時，在用生物素化L-蛋白及經鏈黴親和素接合之PE染色之後，藉由流式細胞術測量CAR表面表現。(圖1)。CAR表現百分比係藉由用L蛋白染色來判 定。針對CAR A、CAR B、CAR C、及同型CAR，分別將表現判定為95、88、70、及67%陽性。對模擬T細胞僅進行電穿孔，但並未將mRNA添加至細胞中。模擬T細胞如預期並未表現任何CAR結構。這些數據指示T細胞高度表現CAR結構。空心直方圖係模擬物，實心灰色直方圖係CAR-T族群。
靶向GPRC5D之CAR建構體之組分的胺基酸序列係顯示於表2。
Figure 109101459-A0202-12-0087-3
Figure 109101459-A0202-12-0088-4
實例2-經抗原刺激之CAR-T細胞中的活化標記之誘導
在暫時轉染之後二十四小時，將初代泛T細胞用Cell Trace Violet(CTV)螢光增生染料標示，然後與多發性骨髓瘤細胞系H929共培養。共培養後四天，預先圈選在CD8+CD4-族群上之細胞，並將CAR-T上的活化標記CD25及CD71之表面表現與單獨培養之T細胞或在α-CD3/CD28珠粒存在下培養 之T細胞進行比較。(圖2)。分析來自圖1之相同CAR T細胞對表現GPRC5D抗原之H929細胞的T細胞活化反應。在電穿孔之後四天，CAR A及CAR B顯示T細胞活化反應增加，此係藉由CD25及CD71表現回應於與H929細胞培養而增加所示。相較之下，模擬物及表現CAR C之細胞展現出T細胞活化回應於H929細胞而減低。作為陰性對照，將相同細胞在不存在任何GPRC5D或T細胞抗原下生長，且顯示出CD25或CD71的最小增加。作為陽性對照，將模擬物、CAR A、CAR B、及CAR C細胞與CD3/CD28珠粒共培養。四個細胞群之各者顯示CD25及CD71表現均類似的增加。總體來說，這些數據顯示CAR A及CAR B細胞展現出對表現GPRC5D之H929細胞最大的T細胞活化反應。
實例3-經抗原刺激之CAR-T細胞的細胞介素剖析
將先用表現CAR之mRNA暫時轉染24小時之初代泛T細胞以1：1比率與各種骨髓瘤細胞系共培養，該等骨髓瘤細胞系以高(+++)、中(++)、低(+)、或陰性(-)水平表現目標抗原GPRC5D。共培養後十六小時，收集上清液，並藉由Meso Scale Discovery(MSD)執行來自共培養物之上清液的細胞介素概況分析。(圖3)。來自GPRC5D CAR-T細胞之上清液顯示促發炎細胞介素INF-γ、TNF-α、或IL-2增加。各個促發炎細胞介素的增加跟與GPRC5D CAR-T細胞共培養之GPRC5D表現細胞系有關。與MM.1S共培養導致最高的INF-γ及TNF-α表現，而與KMS11細胞共培養導致最高的IL-2水平。K562細胞系係用作陰性對照，展示出非表現GPRC5D之細胞系的基礎背景細胞介素水平。
在用表現CAR之mRNA暫時轉染之後二十四小時，將初代泛T細胞與自體周邊血液單核細胞(PBMC)及多發性骨髓瘤細胞系H929共培養(以 1：1：1比率)。共培養後十六小時，收集上清液。將藉由MSD之來自含有所有三個族群(CAR-T、H929、自體PBMC)之共培養物之上清液的細胞介素概況分析與缺少CAR-T細胞、PBMC、或H929之對照共培養物、與單獨培養的各細胞群進行比較。(圖4)。類似於圖3，將模擬物、CAR-T A、CAR-T B、CAR-T C、或同型CAR-T細胞與H929及/或自體PBMC共培養。當將H929細胞與PBMC共培養時，觀察到用CAR-T A及CAR-T B細胞之TNF-α及IL-2增加。當將CAR-T C細胞與H929及PBMC共培養時，觀察到有限至無可偵測水平的INF-γ釋放。整體而言，CAR-T C細胞展現出減低之細胞介素釋放，與圖2中減少之T細胞活化標記一致。將CAR-T、H929、及PBMC細胞單獨培養作為陰性對照，並顯示出背景細胞介素水平。
實例4-表現GPRC5D之腫瘤細胞系之靶向細胞毒性：高表現/低表現/不表現GPRC5D之目標細胞系
藉由流式細胞術評估CAR-T細胞對表現GPRC5D之骨髓瘤細胞的細胞毒性潛力。將初代泛T細胞(如前述暫時表現三種CAR中之一者)以所指示之效應：目標(E：T)比與經螢光標示之骨髓瘤細胞系(MM1R、H929、及K562)共培養八小時，於此時將共培養物用活力染料染色。殺滅百分比係共培養物中剩餘之活(活力染料呈陰性)目標(CTV呈陽性)細胞的絕對數目相對於沒有與CAR-T細胞培養之活目標細胞的數目之比率。(圖5)。將CAR A、CAR B、CAR C、同型CAR、及模擬T細胞與GPRC5D+細胞系MM1R及H929或GPRC5D-K562細胞共培養八小時。分析各種不同的效應對目標比，顯示CAR A、CAR B、及CAR C細胞能夠誘導MM1R細胞之細胞毒性。細胞毒性的增加 與較高的效應對目標比相關。包括同型及模擬物對照作為對照組，且顯示大約20至30%細胞毒性。類似地，CAR A及CAR B細胞誘導H929細胞之細胞毒性。CAR A及CAR B細胞對同型及模擬細胞展現出類似的細胞毒性活性。這些數據證明CAR A及CAR B細胞對MM1R及H929細胞之特異性，但對K562細胞(GPRC5D)不具特異性。
實例5-表現GPRCSD之腫瘤細胞系之靶向細胞毒性：多發性骨髓瘤患者衍生之T細胞
藉由流式細胞術評估CAR-T細胞對表現GPRC5D之骨髓瘤細胞的細胞毒性潛力。將初代多發性骨髓瘤患者T細胞(如前述暫時表現兩種CAR中之一者)以所指示之效應：目標(E：T)比與經螢光標示之骨髓瘤細胞系MM.1S或對照GPRC5D陰性細胞系KG-1共培養48小時，於此時將共培養物用活力染料染色。細胞毒性百分比係判定為對活力染料染色呈陽性(指示細胞死亡)的經螢光標示之細胞的百分比。(圖6)。用GC5B81_LH或GC5B483_LH轉導之初代多發性骨髓瘤患者T細胞皆誘導GPRC5D+MM.1S細胞之細胞毒性，且相較於模擬T細胞具有增量的效應細胞。當與GPRC5D-KG-1細胞系共培養時，用GC5B81_LH或GC5B483_LH GPRC5D CAR-T細胞沒有可觀察到的細胞毒性。這些數據顯示用GPRC5D CAR轉導之多發性骨髓瘤T細胞可誘發殺滅GPRC5D+細胞，但GPRC5D細胞則不會。
實例6-α-GPRC5D CAR-T細胞之經抗原刺激之增生反應
α-GPRC5D CAR-T細胞之增生能力係藉由流式細胞術評估。將經螢光標示之泛T細胞(暫時表現α-GPRC5D CAR或同型CAR對照)以1效應：1目標比與H929共培養四天。增生係測量為具有經稀釋之螢光標示(CTV)之活(活力染料呈陰性)CAR-T細胞的絕對數目。在四天的α-CD3/CD28珠粒刺激及CAR-T單獨培養(無刺激對照)之後，將回應於H929之增生與CAR-T增生進行比較。(圖7)。將模擬物、同型CAR、CAR-T A、CAR-T B、及CAR-T C細胞與GPRC5D+ H929細胞、CD3/CD28珠粒共培養或在沒有刺激下共培養。在四天之後，分析CD4及CD8族群之總活計數，反映細胞回應於GPRC5D抗原之增生能力。在CD4族群中，CD3/CD28珠粒係用作陽性對照，且所有細胞群相較於無刺激者均展現出CD4事件增加。相較於同型及模擬物，僅CAR-T A及CAR-T B細胞顯示出回應於H929細胞之計數穩健增加。CD8族群觀察到類似的結果；然而，CAR-T C並未顯示回應於H929細胞之增生回應。綜合所述，這些數據顯示CAR-T A及CAR-T B細胞回應於GPRC5D+H929細胞而增生。
實例7-GPRC5D-CAR在健康捐贈者T細胞上之表現
將六種初代人類泛T細胞活化並使用Miltenyi Biotec T細胞TRANSACT系統擴增。在活化後24小時，將T細胞用包含編碼GPRC5D GC5B680-N68S-LH CAR之核苷酸序列(SEQ ID NO：90)的慢病毒轉導。使細胞擴增12天，其中在第6天及第10天使用市售可得之兔抗人類H+L偵測抗體藉由流式細胞測量術測量表面CAR表現。結果顯示於圖8中，其中數據表示來自6位健康捐贈者的平均值±SD。緊接在黑色長條(GCB6800-N68S-LH)左側之灰色陰影 長條(模擬物)表示在未經轉導(模擬物)之細胞中使用市售抗體之背景CAR偵測。黑色長條表示經轉導之CAR-T細胞中的GPRC5D GC5B680-N68S-LH。
實例8-在GPRC5D CAR-T細胞上CD4、CD8、及記憶標記之表現。
將來自六位健康捐贈者之泛T細胞用包含編碼GPRC5D GC5B680-N68S-LH CAR(GPRC5D CAR；SEQ ID NO：90)之核苷酸序列的慢病毒轉導。評估模擬物(未經轉導)細胞及經轉導之細胞(「T細胞池」，包括具有表面CAR(表現CAR或CAR+)之細胞及沒有表面CAR(不表現CAR或CAR-)之細胞)的具有表面CD4(CD4+)細胞之比例及具有表面CD8(CD8+)細胞之比例。數據係顯示於圖9A至9C中。圖9C中之數據顯示在CD4+及CD8+T細胞兩者中如預期皆偵測到GPRC5D CAR。圖9A至圖9C亦顯示CD4：CD8比在經評估之所有細胞群(包括CAR+細胞、CAR-細胞、及模擬細胞)之中係類似的。
CAR-T族群中的T細胞亞型係使用兩個表面標記CD45RA及CD62L判定以區分四種記憶細胞群：效應記憶RA+ T細胞(TEM RA+)、效應記憶細胞TEM、初始T細胞及幹細胞樣記憶細胞TN/SCM、及中央記憶T細胞(TCM)。數據係顯示於圖9D至圖9F中。圖9D係代表一個捐贈者樣本之流式細胞圖，其強調使用兩個表面標記區分四種不同記憶族群之圈選策略。圖9E及圖9F顯示GPRC5D GC5B680-N68S-LH大多在已知具有高增生能力、存活率、及治療療效之TN/SCM及TCM細胞上表現。
實例9-GPRC5D CAR-T細胞毒性檢定(在6小時及24小時)
以各種E：T比將來自六位健康捐贈者中之一位的經GPRC5D GC5B680-N68S-LH轉導之T細胞、或未經轉導(模擬物)之T細胞添加至(i)包含螢光素酶轉殖基因之GPRC5D+ MM.1S腫瘤細胞的培養物中，或添加至(ii)包含螢光素酶轉殖基因之GPRC5D- K562腫瘤細胞的培養物中。在6小時或24小時的培養之後，在每個E：T比下評估細胞毒性。6小時時間點的數據係顯示於圖10A中，且24小時時間點的數據係顯示於圖10B中。特異性裂解百分比係(i)藉由將在CAR-T存在下培養在6或24小時在腫瘤細胞中測得之螢光素酶信號除以在相同時間點在單獨培養之腫瘤細胞中之螢光素酶信號，並將其乘以100，然後(ii)用100減去該數字來計算。方程式係：100-[(CAR-T+腫瘤發光/平均單獨腫瘤發光)]×100。虛線強調零裂解。負的裂解指示細胞生長。
實例10-GPRC5D CAR-T細胞毒性檢定(在48小時)
自健康捐贈者製備經GPRC5D GC5B680-N68S-LH轉導及未經轉導(模擬物)之T細胞。以各種E：T比將(i)經GPRC5D GC5B680-N68S-LH轉導之T細胞或(ii)未經轉導(模擬物)之T細胞添加至經羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)標示之GPRC5D+ H929、GPRC5D+ MM.1S、GPRC5D+ MM.1R、GPRC5D+ MOLP-2、GPRC5D+ EJM、及GPRC5D- K562細胞中。在48小時的培養之後，將細胞用活/死染料(live/dead-dye)染色並評估死亡細胞及CFSE+細胞之百分比(細胞毒性%)。將細胞毒性百分比對於對數轉換x軸(E：T比)作圖且用4參數非線性迴歸曲線擬合，其中數據係以平均值±SD顯示於圖11A至圖11F中。模擬物陰性對照T細胞在除EJM以外之所有GPRC5D+細胞系中誘導一些程度的細胞毒性，但程度比GPRC5D GC5B680-N68S-LH細胞低，特別是在較高 E：T比下。不希望受理論束縛，減少的細胞毒性可能由同種異體反應引起。此外，GPRC5D CAR細胞之細胞毒性取決於細胞系而變化。
實例11-GPRC5D CAR-T活化檢定(在48小時)
自健康捐贈者製備經GPRC5D GC5B680-N68S-LH轉導及未經轉導(模擬物)之T細胞。以3：1之E：T比將經GPRC5D GC5B680-N68S-LH轉導或未經轉導(模擬物)之T細胞添加至經羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)標示之GPRC5D+ H929、GPRC5D+ MM.1S、GPRC5D+ MOLP-2、GPRC5D+ EJM、及GRRC5D- K562細胞中。在48小時的培養之後，將細胞用活/死染料、抗CD25、抗CD3、及抗CAR可視標記(visual marker)染色。接著評估細胞的表面CD25表現。數據係以平均值±SD表現於圖12中。如圖12中所示，在模擬細胞(即無活化)中觀察到小於13%的背景表面CD25表現。相比之下，將GC5B680-N68S-LH CAR-T細胞在GPRC5D+細胞系存在下活化，如藉由升高之CD25表現水平所示。在(i)模擬物及(ii)GC5B680-N68S-LH CAR-T細胞兩者中，在與K562細胞培養後或在單獨培養後觀察到低水平的表面CD25表現。
實例12-GPRC5D CAR-T多功能性檢定
將經GC5B680-N68S-LH轉導之(CAR-T)細胞與PMA/離子黴素(ionomycin)(作為陽性對照)、GPRC5D+細胞系H929(H929)、GPRC5D- K562(K562)細胞(經CFSE標示)中任一者培養、或單獨培養18小時。當在H929或K562細胞存在下培養時，將細胞以1：2之E：T比培養。然後將細胞先用活/死染料、抗CD3、及抗獨特型表面染色，接著固定、透化(permeabilization)、並用抗 IFN-γ、抗IL-2、及抗TNF-α胞內染色。然後將經染色之細胞藉由流式細胞術分析。在分析流式細胞圖之後，使用布林(Boolean)(階層式)圈選來計算個別細胞介素水平之百分比係來計算，其中百分比係表示於下表3至表6中。同樣在表3至表6中，各組之多功能細胞介素釋放水平係以灰色突出顯示，並表示平均值之總和。
Figure 109101459-A0202-12-0096-5
Figure 109101459-A0202-12-0096-6
Figure 109101459-A0202-12-0097-7
Figure 109101459-A0202-12-0097-8
Figure 109101459-A0202-12-0098-9
Figure 109101459-A0202-12-0098-10
實例13-GPRC5D CAR-T增生檢定
使用來自一位捐贈者之細胞製備GC5B680-N68S-LH細胞。將(i)經GC5B680-N68S-LH轉導之細胞及(ii)模擬細胞在GPRC5D+細胞(MM.1S及 H929)存在或不存在下培養。模擬(未經轉導)細胞係用作陰性對照。細胞增生程度係在6天培養之後，藉由檢定細胞中CELLTRACE Violet(CTV)染料濃度之稀釋程度來測量，其中數量係由圖13之圖的X軸表示。將CAR+細胞用抗獨特型抗體染色，其中染色程度係由圖13之圖的Y軸表示。
如在圖13中所示，模擬物及經CTV標示之CAR T細胞，在單獨或在GPRC5D- K562細胞存在下，如自CTV染料之低稀釋至零稀釋所見展現少許至無細胞增生。促效劑CD3/CD28珠粒(其作為陽性對照)如預期導致所評估之所有T細胞群之增生。當CAR-T細胞係與GPRC5D+目標細胞(H929或MM.1S)培養時，增生主要富集在細胞表面上表現GC5B680-N68S-LH(CAR+)之經轉導細胞中(如在圖13之圖中的上部象限中所示)。此結果暗示的是，在GPRC5D+目標細胞存在下GC5B680-N68S-LH細胞增生增強。圖13中所示之數據表示使用自其他捐贈者所製備之細胞得到的類似觀察。
實例14-GPRC5D CAR-T增生檢定
將GC5B680-N68S-LH(CAR-T)細胞與陽性對照星形孢菌素、GPRC5D+ H929細胞、GPRC5D- K562細胞中任一者培養、或單獨培養24小時。使用1：2之E：T比進行GC5B680-N68S-LH(CAR-T)細胞與H929或K562細胞之培養。然後將細胞用活/死染料、抗CD3、抗獨特型、及抗裂解凋亡蛋白酶3/7染料染色。藉由流式細胞術分析經染色之細胞。數據係表現於圖14之圖中。如圖14中所示，星形孢菌素在CAR+及CAR- T細胞群兩者中均誘導裂解凋亡蛋白酶3/7染色。同樣，自24小時之時間點之後的4小時開始有50至65%的陽性細胞。 CAR+及CSR- T細胞群在陰性對照培養(K562及單獨CART)與在H929存在下培養之間均未展現凋亡蛋白酶3/7水平之明顯差異。
實例15-GC5B680-N68S-LH、GC5B680-N68S-HL、GP5B83_N24T_N31S-LH、及GP5B83_N24T_N31S-HL對NSG-B2M小鼠中所建立之MM.1S人類MM異種移植物之功效檢定
經GC5B680-N68S-LH(SEQ ID NO：86)、GC5B680-N68S-HL(SEQ ID NO：85)、GP5B83_N24T_N31S-LH(SEQ ID NO：84)、及GP5B83_N24T_N31S-HL(SEQ ID NO：83)轉導之T細胞(CAR-T細胞)之抗腫瘤功效係在雌性NSG B2m(替代地稱為NOD-scid Il2rgnull B2mnull、或稱為NOD-scid γ B2m)中所建立之皮下(sc)MM.1S人類多發性骨髓瘤(MM)異種移值物模型中評估。在第13天將(i)GC5B680-N68S-LH CAR-T細胞、(ii)GC5B680-N68S-HL CAR-T細胞、(iii)GP5B83_N24T_N31S-LH CAR-T細胞、或(iv)GP5B83_N24T_N31S-HL CAR-T細胞以1x106個CAR+細胞或5x106個CAR+細胞之劑量靜脈內(iv)投予，總共一劑。評估下列三組帶有MM.1S異種移植物之小鼠：(i)用PBS處理之小鼠、(ii)經歷模擬物轉導之小鼠、及(iii)用GPRC5D轉導之小鼠。在腫瘤植入後26天，計算三組帶有SC(皮下)MM.1S異種移植物之小鼠的△腫瘤生長抑制百分比(%△TGI)，其使用公式：([(TVc-TVc0)-(TVt-TVt0)]/(TVc-TVc0))×100，其中「TVc」係給定對照組之平均腫瘤負荷，「TVc0」係給定對照組之平均初始腫瘤負荷，「TVt」係治療組之平均腫瘤負荷，且「TVt0」係治療組之平均初始腫瘤負荷。
使用R中線性混合效應分析(linear mixed-effects analysis in R)計算統計顯著性，其中治療及時間為固定效應而動物為隨機效應。若個別軸向回應軌跡係非線性，則進行對數轉換(底數10)。將自此統計模型衍生之資訊用於與PBS對照或經模擬物傳導組進行成對治療比較，其中p值當<0.05時被認為具有統計顯著性。
與PBS及模擬物CAR-T對照相比，所有四種GPRC5D定向CAR-T建構體在1 x 106個及5 x 106個CAR+ T細胞劑量水平下均誘發統計上顯著的%△TGI，如在表7及圖15中所彙總。在腫瘤植入後第47天進行完全反應(完全腫瘤緩解，沒有可觸知(palpable)的腫瘤)評估。
Figure 109101459-A0202-12-0101-11
實例16 GC5B680-N68S-LH、GC5B680-N68S-HL、GP5B83_N24T_N31S-LH、及GP5B83_N24T_N31S-HL在NSG小鼠中對散播性H929 IV人類MM異種移植物之功效
在雌性NSGTM(替代地稱為NOD scidγ、或稱為NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/SzJ)小鼠中在散播性(iv)H929人類MM模型上評估經GC5B680-N68S-LH(SEQ ID NO：86；由SEQ ID NO：90之核苷酸編碼)、GC5B680-N68S-HL(SEQ ID NO：85；由SEQ ID NO：89之核苷酸編碼)、GP5B83_N24T_N31S-LH(SEQ ID NO：84；由SEQ ID NO：88之核苷酸編碼)、及GP5B83_N24T_N31S-HL(SEQ ID NO：83；由SEQ ID NO：87之核苷酸編碼)轉導之T細胞之功效。在此實例中，在腫瘤植入後第9天將表現GC5B680-N68S-LH、GC5B680-N68S-HL、GP5B83_N24T_N31S-LH、或GP5B83_N24T_N31S-HL之(CAR+)T細胞以單次1×106個CAR+細胞或5×106個CAR+細胞之iv劑量投予。
執行存活率評估，其中將不同研究日之存活百分比對研究日作圖。將後肢麻痹或其他過度散播之腫瘤負荷的臨床徵象用作死亡之替代終點。使用Kaplan-Meier存活分析來判定中位數存活率。ILS百分比(%ILS)係定義為治療組對對照組之中位數存活率之間的差異，且係計算為ILS=([MSt-MSc]/MSc)×100，其中「MSc」係給定對照組之中位數存活率，且「MSt」係特定治療組之中位數存活率。對由於不良臨床徵象(諸如潰瘍性腫瘤、體重減輕等)或與治療無關的死亡以致未能達到替代終點之動物予以審查以進行存活率評估。存活率係使用Kaplan-Meier曲線以圖形表示，並藉由對數等級(Mantel-Cox)檢定使用GraphPad Prism軟體(7.0版)來評估。
經PBS處理之對照小鼠在腫瘤植入後第52天(在CAR+注射後第43天)達到中位數50%存活率。經模擬物CAR-T細胞治療之小鼠在腫瘤植入後第44天(在CAR-T注射後第35天)達到中位數50%存活率。用GC5B680-N68S-LH CAR+細胞以1×106之劑量投予治療之小鼠在第111天(在CAR-T注射後第102天)之後達到中位數50%存活率。分別用GC5B680-N68S-HL CAR+細胞以1×106個細胞之劑量投予治療之小鼠在第63.5天(在CAR-T注射後第54.5天)達到中位數50%存活率。用GP5B83_N24T_N31S-LH CAR+細胞以1×106個細胞之劑量投予治療之小鼠在第93.5天(在CAR-T注射後第84.5天)達到中位數50%存活率。用GP5B83_N24T_N31S-HL CAR+細胞以1x106個細胞之劑量投予治療之小鼠在第111天(在CAR-T注射後第102天)之後達到中位數50%存活率。壽命增加(ILS)百分比係經由Kaplan-Meier曲線評估，並藉由對數等級Mantel-Cox檢定評估。
與PBS及模擬物CAR-T對照相比，所有四種GPRC5D定向CAR-T建構體在1×106劑量水平下誘發統計上顯著的%ILS，如以下所討論及在表8及圖16中所彙總。在第111天存活的動物被認為是CR。
Figure 109101459-A0202-12-0103-12
Figure 109101459-A0202-12-0104-13
在經PBS處理之對照組中，在腫瘤植入後第52天開始觀察到與進行性腫瘤疾病負荷相關聯之不良臨床徵象，然而在經模擬物轉導或GPRC5D CAR-T治療組中，在腫瘤植入後第48天開始發展出移植物抗宿主疾病之臨床徵象。
出於所有目的，本文中所引用之所有專利、公開申請案、及參考文獻之教示全文以引用方式併入本文中。
儘管已具體顯示並描述例示實施例，但所屬技術領域中具有通常知識者將理解可於其中進行形式及細節之各種改變而不脫離由隨附申請專利範圍所涵蓋的本實施例範疇。
序列表
輕鏈序列1(GC5B483)(SEQ ID NO：1)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVEIK
重鏈序列1(GC5B483)(SEQ ID NO：2)
Figure 109101459-A0202-12-0105-14
輕鏈序列2(GC5B81)(SEQ ID NO：3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK
重鏈序列2(GC5B81)(SEQ ID NO：4)
Figure 109101459-A0202-12-0105-15
輕鏈序列3(GC5B596)(SEQ ID NO：5)
Figure 109101459-A0202-12-0105-16
重鏈序列3(GC5B596)(SEQ ID NO：6)
Figure 109101459-A0202-12-0105-17
連接子多肽序列(SEQ ID NO：7)
GTEGKSSGSGSESKST
scFv序列1(GC5B483)(SEQ ID NO：8)
Figure 109101459-A0202-12-0106-18
scFv序列2(GC5B81)(SEQ ID NO：9)
Figure 109101459-A0202-12-0106-19
scFv序列3(GC5B596)(SEQ ID NO：10)
Figure 109101459-A0202-12-0106-20
信號序列(SEQ ID NO：11)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQA
CD137序列(SEQ ID NO：12)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3z序列(SEQ ID NO：13)
Figure 109101459-A0202-12-0107-21
胞內信號傳導域(SEQ ID NO：14)
Figure 109101459-A0202-12-0107-22
CD8a-TM序列(SEQ ID NO：15)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
CD8a鉸鏈序列(SEQ ID NO：16)
TSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
胞外結合域(GC5B483)(SEQ ID NO：17)
Figure 109101459-A0202-12-0108-23
胞外結合域(GC5B81)(SEQ ID NO：18)
Figure 109101459-A0202-12-0108-24
胞外結合域(GC5B596)(SEQ ID NO：19)
Figure 109101459-A0202-12-0108-25
Figure 109101459-A0202-12-0109-26
胞外結合域(GC5B483)(SEQ ID NO：20)
Figure 109101459-A0202-12-0109-27
胞外結合域(GC5B81)(SEQ ID NO：21)
Figure 109101459-A0202-12-0109-28
胞外結合域(GC5B596)(SEQ ID NO：22)
Figure 109101459-A0202-12-0109-29
Figure 109101459-A0202-12-0110-30
scFv序列4(GC5B483)(SEQ ID NO：24)
Figure 109101459-A0202-12-0110-31
scFv序列5(GC5B81)(SEQ ID NO：25)
Figure 109101459-A0202-12-0110-32
scFv序列6(GC5B596)(SEQ ID NO：26)
Figure 109101459-A0202-12-0110-33
Figure 109101459-A0202-12-0111-34
pDR000074490 GC5B483-LH-CAR序列(SEQ ID NO：27)
Figure 109101459-A0202-12-0111-35
pDR000074489 GC5B81-LH-CAR序列(SEQ ID NO：28)
Figure 109101459-A0202-12-0111-36
Figure 109101459-A0202-12-0112-37
pDR000074488 GC5B596-LH-CAR序列(SEQ ID NO：29)
Figure 109101459-A0202-12-0112-38
pDR000074483 GC5B483-HL-CAR序列(SEQ ID NO：30)
Figure 109101459-A0202-12-0112-39
Figure 109101459-A0202-12-0113-40
pDR000074482 GC5B81-HL-CAR序列(SEQ ID NO：31)
Figure 109101459-A0202-12-0113-41
pDR000074481 GC5B596-HL-CAR序列(SEQ ID NO：32)
Figure 109101459-A0202-12-0113-42
Figure 109101459-A0202-12-0114-43
pDR000074490 GC5B483-LH-CDS的DNA序列(SEQ ID NO：33)
Figure 109101459-A0202-12-0114-44
Figure 109101459-A0202-12-0115-45
pDR000074489 GC5B81-LH-CDS的DNA序列(SEQ ID NO：34)
Figure 109101459-A0202-12-0115-46
Figure 109101459-A0202-12-0116-301
pDR000074488 GC5B596-LH-CDS的DNA序列(SEQ ID NO：35)
Figure 109101459-A0202-12-0117-302
Figure 109101459-A0202-12-0118-303
pDR000074483 GC5B483-HL-CDS的DNA序列(SEQ ID NO：36)
Figure 109101459-A0202-12-0118-304
Figure 109101459-A0202-12-0119-305
pDR000074482 GC5B81-HL-CDS的DNA序列(SEQ ID NO：37)
Figure 109101459-A0202-12-0119-306
Figure 109101459-A0202-12-0120-307
pDR000074481 GC5B596-HL-CDS的DNA序列(SEQ ID NO：38)
Figure 109101459-A0202-12-0121-308
Figure 109101459-A0202-12-0122-309
HCDR1(GC5B81)(SEQ ID NO：39)
GGTFSSY
HCDR2(GC5B81)(SEQ ID NO：40)
ESRWRGYKLDY
HCDR3(GC5B81)(SEQ ID NO：41)
IPIFGT
HCDR1(GC5B483)(SEQ ID NO：42)
GYSFTSY
HCDR2(GC5B483)(SEQ ID NO：43)
YPGKSD
HCDR3(GC5B483)(SEQ ID NO：44)
VYSFGGRHKALFDY
HCDR1(GC5B596)(SEQ ID NO：45)
GYSFTGY
HCDR2(GC5B596)(SEQ ID NO：46)
NPYNSD
HCDR3(GC5B596)(SEQ ID NO：47)
VALRVALDY
LCDR1(GC5B81)(SEQ ID NO：48)
RASQSISSYLN
LCDR2(GC5B81)(SEQ ID NO：49)
AASSLQS
LCDR3(GC5B81)(SEQ ID NO：50)
QQSYSTPLT
LCDR1(GC5B483)(SEQ ID NO：51)
RASQSVSSYLA
LCDR2(GC5B483)(SEQ ID NO：52)
DASNRAT
LCDR3(GC5B483)(SEQ ID NO：53)
QQRSNWPLT
LCDR1(GC5B596)(SEQ ID NO：54)
KASQNVATHVG
LCDR2(GC5B596)(SEQ ID NO：55)
SASYRYS
LCDR3(GC5B596)(SEQ ID NO：56)
QQYNRYPYT
人類GPRC5D多肽(SEQ ID NO：57)
Figure 109101459-A0202-12-0124-310
HCDR1(GP5B83)(SEQ ID NO：58)
GGSLSSSSY
HCDR2(GP5B83)(SEQ ID NO：59)
YYSGN
HCDR3(GP5B83)(SEQ ID NO：60)
HVGYSYGRRFWYFDL
LCDR1(GP5B83)(SEQ ID NO：61)
RASQSVSSYLA
LCDR2(GP5B83)(SEQ ID NO：62)
DASNRAT
LCDR3(GP5B83)(SEQ ID NO：63)
QQRSNWPPT
重鏈序列(GP5B83)(SEQ ID NO：64)
Figure 109101459-A0202-12-0125-311
輕鏈序列(GP5B83)(SEQ ID NO：65)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
HCDR1(GC5B680)(SEQ ID NO：66)
GFSLTNIRM
HCDR2(GC5B680)(SEQ ID NO：67)
FSNDE
HCDR3(GC5B680)(SEQ ID NO：68)
MRLPYGMDV
LCDR1(GC5B680)(SEQ ID NO：69)
RSSQSLVHSDGNTYLS
LCDR2(GC5B680)(SEQ ID NO：70)
KISNRFF
LCDR3(GC5B680)(SEQ ID NO：71)
MQATQFPHT
重鏈序列(GC5B680)(SEQ ID NO：72)
Figure 109101459-A0202-12-0127-312
輕鏈序列(GC5B680)(SEQ ID NO：73)
Figure 109101459-A0202-12-0127-313
連接子多肽序列(SEQ ID NO：74)
GGSEGKSSGSGSESKSTGGS
scFv序列(GP5B83-HL)(SEQ ID NO：75)
Figure 109101459-A0202-12-0127-314
scFv序列(GP5B83-LH)(SEQ ID NO：76)
Figure 109101459-A0202-12-0127-315
Figure 109101459-A0202-12-0128-316
scFv序列(GC5B680-HL)(SEQ ID NO：77)
Figure 109101459-A0202-12-0128-317
scFv序列(GC5B680-LH)(SEQ ID NO：78)
Figure 109101459-A0202-12-0128-318
胞外結合域(GP5B83-HL)(SEQ ID NO：79)
Figure 109101459-A0202-12-0128-319
Figure 109101459-A0202-12-0129-320
胞外結合域(GP5B83-LH)(SEQ ID NO：80)
Figure 109101459-A0202-12-0129-321
胞外結合域(GC5B680-HL)(SEQ ID NO：81)
Figure 109101459-A0202-12-0129-322
胞外結合域(GC5B680-LH)(SEQ ID NO：82)
Figure 109101459-A0202-12-0129-323
Figure 109101459-A0202-12-0130-324
GP5B83-HL-CAR序列(SEQ ID NO：83)
Figure 109101459-A0202-12-0130-325
GP5B83-LH-CAR序列(SEQ ID NO：84)
Figure 109101459-A0202-12-0130-326
Figure 109101459-A0202-12-0131-327
GC5B680-HL-CAR序列(SEQ ID NO：85)
Figure 109101459-A0202-12-0131-328
GC5B680-LH-CAR序列(SEQ ID NO：86)
Figure 109101459-A0202-12-0131-329
Figure 109101459-A0202-12-0132-330
pDR000084454 GP5B83-HL序列的DNA序列(SEQ ID NO：87)
Figure 109101459-A0202-12-0132-331
Figure 109101459-A0202-12-0133-332
GP5B83-LH序列的DNA系列(SEQ ID NO：88)
Figure 109101459-A0202-12-0133-333
Figure 109101459-A0202-12-0134-334
GC5B680-HL序列的DNA序列(SEQ ID NO：89)
Figure 109101459-A0202-12-0135-335
Figure 109101459-A0202-12-0136-336
GC5B680-LH序列的DNA序列(SEQ ID NO：90)
Figure 109101459-A0202-12-0136-337
Figure 109101459-A0202-12-0137-338
連接子序列(SEQ ID NO：91)
GGSEGKSSGSGSESKSTGGS
連接子序列(SEQ ID NO：92)
GGGSGGGS
連接子序列(SEQ ID NO：93)
GGGSGGGSGGGS
連接子序列(SEQ ID NO：94)
GGGSGGGSGGGSGGGS
連接子序列(SEQ ID NO：95)
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS
連接子序列(SEQ ID NO：96)
GGGGSGGGGSGGGGS
連接子序列(SEQ ID NO：97)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
連接子序列(SEQ ID NO：98)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
連接子序列(SEQ ID NO：99)
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
連接子序列(SEQ ID NO：100)
IRPRAIGGSKPRVA
連接子序列(SEQ ID NO：101)
GKGGSGKGGSGKGGS
連接子序列(SEQ ID NO：102)
GGKGSGGKGSGGKGS
連接子序列(SEQ ID NO：103)
GGGKSGGGKSGGGKS
連接子序列(SEQ ID NO：104)
GKGKSGKGKSGKGKS
連接子序列(SEQ ID NO：105)
GGGKSGGKGSGKGGS
連接子序列(SEQ ID NO：106)
GKPGSGKPGSGKPGS
連接子序列(SEQ ID NO：107)
GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS
連接子序列(SEQ ID NO：108)
GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS
連接子序列(SEQ ID NO：109)
STAGDTHLGGEDFD
連接子序列(SEQ ID NO：110)
GEGGSGEGGSGEGGS
連接子序列(SEQ ID NO：111)
GGEGSGGEGSGGEGS
連接子序列(SEQ ID NO：112)
GEGESGEGESGEGES
連接子序列(SEQ ID NO：113)
GGGESGGEGSGEGGS
連接子序列(SEQ ID NO：114)
GEGESGEGESGEGESGEGES
連接子序列(SEQ ID NO：115)
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
連接子序列(SEQ ID NO：116)
PRGASKSGSASQTGSAPGS
連接子序列(SEQ ID NO：117)
GTAAAGAGAAGGAAAGAAG
連接子序列(SEQ ID NO：118)
GTSGSSGSGSGGSGSGGGG
連接子序列(SEQ ID NO：119)
GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS
連接子序列(SEQ ID NO：120)
GSGS
連接子序列(SEQ ID NO：121)
APAPAPAPAP
連接子序列(SEQ ID NO：122)
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
連接子序列(SEQ ID NO：123)
AEAAAKEAAAKEAAAAKEAAAAKEAAAAKAAA
鉸鏈序列(SEQ ID NO：124)
EPKSCDKTHTCPPCP
鉸鏈序列(SEQ ID NO：125)
ERKCCVECPPCP
鉸鏈序列(SEQ ID NO：126)
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP
鉸鏈序列(SEQ ID NO：127)
ESKYGPPCPSCP
<110> 楊森生技公司(JANSSEN BIOTECH,INC.) 阿塔爾，里卡多(ATTAR,RICARDO) 甘尼桑，拉庫瑪(GANESAN,RAJKUMAR) 格德，弗朗索瓦(GAUDET,FRANCOIS) 海德里希，布拉德利(HEIDRICH,BRADLEY) 瓊斯，卡門(JONES,CARMEN) 李，約翰(LEE,JOHN) 李，英哲(LI,YINGZHE)
<120> GPRC5D嵌合抗原受體及表現其之細胞
<130> JBI6043WOPCT1
<140>
<141>
<150> 62/793,973
<151> 2019-01-18
<160> 127
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 1
Figure 109101459-A0202-12-0143-339
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 2
Figure 109101459-A0202-12-0144-340
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 3
Figure 109101459-A0202-12-0144-341
Figure 109101459-A0202-12-0145-342
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 4
Figure 109101459-A0202-12-0145-343
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 5
Figure 109101459-A0202-12-0146-344
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 6
Figure 109101459-A0202-12-0146-345
Figure 109101459-A0202-12-0147-346
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 7
Figure 109101459-A0202-12-0147-347
<210> 8
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 8
Figure 109101459-A0202-12-0147-348
Figure 109101459-A0202-12-0148-349
<210> 9
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 9
Figure 109101459-A0202-12-0148-350
Figure 109101459-A0202-12-0149-351
<210> 10
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 10
Figure 109101459-A0202-12-0150-352
Figure 109101459-A0202-12-0151-353
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 11
Figure 109101459-A0202-12-0151-354
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 12
Figure 109101459-A0202-12-0151-355
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 13
Figure 109101459-A0202-12-0151-356
Figure 109101459-A0202-12-0152-357
<210> 14
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 14
Figure 109101459-A0202-12-0152-358
Figure 109101459-A0202-12-0153-359
<210> 15
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 15
Figure 109101459-A0202-12-0153-360
<210> 16
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 16
Figure 109101459-A0202-12-0153-361
<210> 17
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 17
Figure 109101459-A0202-12-0153-362
Figure 109101459-A0202-12-0154-363
Figure 109101459-A0202-12-0155-364
<210> 18
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 18
Figure 109101459-A0202-12-0155-365
Figure 109101459-A0202-12-0156-366
<210> 19
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 19
Figure 109101459-A0202-12-0156-367
Figure 109101459-A0202-12-0157-368
<210> 20
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 20
Figure 109101459-A0202-12-0157-369
Figure 109101459-A0202-12-0158-370
<210> 21
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 21
Figure 109101459-A0202-12-0158-371
Figure 109101459-A0202-12-0159-372
Figure 109101459-A0202-12-0160-373
<210> 22
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 22
Figure 109101459-A0202-12-0160-374
Figure 109101459-A0202-12-0161-375
<210> 23
<400> 23
000
<210> 24
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 24
Figure 109101459-A0202-12-0161-376
Figure 109101459-A0202-12-0162-377
<210> 25
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 25
Figure 109101459-A0202-12-0162-378
Figure 109101459-A0202-12-0163-379
<210> 26
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 26
Figure 109101459-A0202-12-0163-380
Figure 109101459-A0202-12-0164-381
<210> 27
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 27
Figure 109101459-A0202-12-0165-382
Figure 109101459-A0202-12-0166-383
Figure 109101459-A0202-12-0167-384
<210> 28
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 28
Figure 109101459-A0202-12-0167-385
Figure 109101459-A0202-12-0168-386
Figure 109101459-A0202-12-0169-387
<210> 29
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 29
Figure 109101459-A0202-12-0169-388
Figure 109101459-A0202-12-0170-389
Figure 109101459-A0202-12-0171-390
<210> 30
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 30
Figure 109101459-A0202-12-0171-391
Figure 109101459-A0202-12-0172-392
Figure 109101459-A0202-12-0173-393
<210> 31
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 31
Figure 109101459-A0202-12-0173-394
Figure 109101459-A0202-12-0174-395
Figure 109101459-A0202-12-0175-396
<210> 32
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 32
Figure 109101459-A0202-12-0175-397
Figure 109101459-A0202-12-0176-398
Figure 109101459-A0202-12-0177-399
<210> 33
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 33
Figure 109101459-A0202-12-0178-400
<210> 34
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 34
Figure 109101459-A0202-12-0179-401
<210> 35
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 35
Figure 109101459-A0202-12-0180-402
<210> 36
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 36
Figure 109101459-A0202-12-0181-403
<210> 37
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 37
Figure 109101459-A0202-12-0181-404
Figure 109101459-A0202-12-0182-405
<210> 38
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 38
Figure 109101459-A0202-12-0182-406
Figure 109101459-A0202-12-0183-407
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 39
Figure 109101459-A0202-12-0183-408
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 40
Figure 109101459-A0202-12-0184-409
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 41
Figure 109101459-A0202-12-0184-410
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 42
Figure 109101459-A0202-12-0184-411
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 43
Figure 109101459-A0202-12-0184-412
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 44
Figure 109101459-A0202-12-0184-413
Figure 109101459-A0202-12-0185-414
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 45
Figure 109101459-A0202-12-0185-415
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 46
Figure 109101459-A0202-12-0185-416
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 47
Figure 109101459-A0202-12-0185-417
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 48
Figure 109101459-A0202-12-0185-418
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 49
Figure 109101459-A0202-12-0186-419
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 50
Figure 109101459-A0202-12-0186-420
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 51
Figure 109101459-A0202-12-0186-421
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 52
Figure 109101459-A0202-12-0186-422
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 53
Figure 109101459-A0202-12-0187-423
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 54
Figure 109101459-A0202-12-0187-424
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 55
Figure 109101459-A0202-12-0187-425
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 56
Figure 109101459-A0202-12-0187-426
<210> 57
<211> 345
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Figure 109101459-A0202-12-0187-427
Figure 109101459-A0202-12-0188-428
Figure 109101459-A0202-12-0189-429
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 58
Figure 109101459-A0202-12-0189-430
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 59
Figure 109101459-A0202-12-0189-431
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 60
Figure 109101459-A0202-12-0189-432
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 61
Figure 109101459-A0202-12-0190-433
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 62
Figure 109101459-A0202-12-0190-434
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 63
Figure 109101459-A0202-12-0190-435
<210> 64
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽w
<400> 64
Figure 109101459-A0202-12-0190-436
Figure 109101459-A0202-12-0191-437
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 65
Figure 109101459-A0202-12-0191-438
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 66
Figure 109101459-A0202-12-0192-439
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 67
Figure 109101459-A0202-12-0192-440
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 68
Figure 109101459-A0202-12-0192-441
<210> 69
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 69
Figure 109101459-A0202-12-0192-442
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 70
Figure 109101459-A0202-12-0192-443
Figure 109101459-A0202-12-0193-444
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 71
Figure 109101459-A0202-12-0193-445
<210> 72
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 72
Figure 109101459-A0202-12-0193-446
<210> 73
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 73
Figure 109101459-A0202-12-0194-447
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 74
Figure 109101459-A0202-12-0194-448
<210> 75
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 75
Figure 109101459-A0202-12-0195-449
Figure 109101459-A0202-12-0196-450
<210> 76
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 76
Figure 109101459-A0202-12-0196-451
Figure 109101459-A0202-12-0197-452
<210> 77
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 77
Figure 109101459-A0202-12-0197-453
Figure 109101459-A0202-12-0198-454
<210> 78
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 78
Figure 109101459-A0202-12-0198-455
Figure 109101459-A0202-12-0199-456
<210> 79
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 79
Figure 109101459-A0202-12-0199-457
Figure 109101459-A0202-12-0200-458
<210> 80
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 80
Figure 109101459-A0202-12-0201-459
Figure 109101459-A0202-12-0202-460
<210> 81
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 81
Figure 109101459-A0202-12-0202-461
Figure 109101459-A0202-12-0203-462
<210> 82
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 82
Figure 109101459-A0202-12-0203-463
Figure 109101459-A0202-12-0204-464
<210> 83
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 83
Figure 109101459-A0202-12-0204-465
Figure 109101459-A0202-12-0205-466
Figure 109101459-A0202-12-0206-467
<210> 84
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 84
Figure 109101459-A0202-12-0206-468
Figure 109101459-A0202-12-0207-469
Figure 109101459-A0202-12-0208-470
<210> 85
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 85
Figure 109101459-A0202-12-0209-471
Figure 109101459-A0202-12-0210-472
<210> 86
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 86
Figure 109101459-A0202-12-0211-473
Figure 109101459-A0202-12-0212-474
Figure 109101459-A0202-12-0213-475
<210> 87
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 87
Figure 109101459-A0202-12-0213-476
<210> 88
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 88
Figure 109101459-A0202-12-0214-477
<210> 89
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 89
Figure 109101459-A0202-12-0215-478
<210> 90
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多核苷酸」
<400> 90
Figure 109101459-A0202-12-0216-479
<210> 91
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 91
Figure 109101459-A0202-12-0217-480
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 92
Figure 109101459-A0202-12-0217-481
<210> 93
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 93
Figure 109101459-A0202-12-0217-482
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 94
Figure 109101459-A0202-12-0217-483
<210> 95
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 95
Figure 109101459-A0202-12-0218-484
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 96
Figure 109101459-A0202-12-0218-485
<210> 97
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 97
Figure 109101459-A0202-12-0218-486
<210> 98
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 98
Figure 109101459-A0202-12-0218-487
Figure 109101459-A0202-12-0219-488
<210> 99
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 99
Figure 109101459-A0202-12-0219-489
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 100
Figure 109101459-A0202-12-0219-490
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 101
Figure 109101459-A0202-12-0219-491
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 102
Figure 109101459-A0202-12-0219-492
<210> 103
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 103
Figure 109101459-A0202-12-0220-493
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 104
Figure 109101459-A0202-12-0220-494
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 105
Figure 109101459-A0202-12-0220-495
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 106
Figure 109101459-A0202-12-0220-496
<210> 107
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 107
Figure 109101459-A0202-12-0221-497
<210> 108
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 108
Figure 109101459-A0202-12-0221-498
<210> 109
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 109
Figure 109101459-A0202-12-0221-499
<210> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 110
Figure 109101459-A0202-12-0221-500
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 111
Figure 109101459-A0202-12-0222-501
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 112
Figure 109101459-A0202-12-0222-502
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 113
Figure 109101459-A0202-12-0222-503
<210> 114
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 114
Figure 109101459-A0202-12-0222-504
<210> 115
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 115
Figure 109101459-A0202-12-0223-505
<210> 116
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 116
Figure 109101459-A0202-12-0223-506
<210> 117
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 117
Figure 109101459-A0202-12-0223-507
<210> 118
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 118
Figure 109101459-A0202-12-0223-508
Figure 109101459-A0202-12-0224-509
<210> 119
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 119
Figure 109101459-A0202-12-0224-510
<210> 120
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 120
Figure 109101459-A0202-12-0224-511
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 121
Figure 109101459-A0202-12-0224-512
<210> 122
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 122
Figure 109101459-A0202-12-0224-513
Figure 109101459-A0202-12-0225-514
<210> 123
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 123
Figure 109101459-A0202-12-0225-515
<210> 124
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 124
Figure 109101459-A0202-12-0225-516
<210> 125
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 125
Figure 109101459-A0202-12-0225-517
<210> 126
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成多肽」
<400> 126
Figure 109101459-A0202-12-0226-518
<210> 127
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成肽」
<400> 127
Figure 109101459-A0202-12-0226-519

Claims (42)

  1. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含：
    具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR3；
    具有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的重鏈CDR3；
    具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的重鏈CDR3；
    具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的重鏈CDR3；或
    具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR3；
    其中該胞外抗原結合域結合抗G蛋白受體C家族5組成員D(GPRC5D)抗原。
  2. 如請求項1所述之CAR，其中
    該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈 CDR1、具有SEQ ID NO：70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：71之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
    該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
    該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：49之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR3；
    該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或
    該胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的該重鏈CDR3，且進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
  3. 如請求項1或2所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含輕鏈可變區(LCVR)，其包含選自由SEQ ID NO：73、65、1、3、及5所組成之群組的胺基酸序列；或重鏈可變區(HCVR)，其包含選自由SEQ ID NO：72、64、2、4、及6所組成之群組的胺基酸序列；或包含選自由SEQ ID NO：73、65、1、3、及5所組成之群組的胺基酸序列之LCVR、與包含選自由SEQ ID NO：72、64、2、4、及6所組成之群組的胺基酸序列之HCVR的組合。
  4. 如請求項1或2所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含：
    包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈可變區；
    包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈可變區；
    包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區；
    包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈可變區；或
    包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的重鏈可變區。
  5. 如請求項1或2所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。
  6. 如請求項5所述之CAR，其中該scFv包含在該輕鏈可變區與該重鏈可變區之間的連接子多肽。
  7. 如請求項6所述之CAR，其中該連接子多肽包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
  8. 如請求項5所述之CAR，其中該scFv包含選自由SEQ ID NO：78、77、75、76、8、9、10、24、25、及26所組成之群組的胺基酸序列。
  9. 如請求項1或2所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含信號多肽。
  10. 如請求項9所述之CAR，其中該信號多肽包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
  11. 如請求項1或2所述之CAR，其中該胞內信號傳導域包含選自由下列所組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9(CD137)組分、T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分、分化簇(CD27)組分、分化簇超家族成員組分、及其組合。
  12. 如請求項11所述之CAR，其中該CD137組分包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
  13. 如請求項11所述之CAR，其中該CD3z組分包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
  14. 如請求項11所述之CAR，其中該胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。
  15. 如請求項1或2所述之CAR，其中該跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽。
  16. 如請求項15所述之CAR，其中該CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
  17. 如請求項1或2所述之CAR，其進一步包含將該跨膜域連接至該胞外抗原結合域之鉸鏈區。
  18. 如請求項17所述之CAR，其中該鉸鏈區係CD8a鉸鏈區。
  19. 如請求項18所述之CAR，其中該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。
  20. 如請求項1或2所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO：82、81、80、79、17、18、19、20、21、及22所組成之群組的胺基酸序列。
  21. 如請求項1或2所述之CAR，其中該CAR包含選自由SEQ ID NO：86、85、83、84、27、28、29、30、31、及32所組成之群組的胺基酸序列。
  22. 一種經單離淋巴球，其表現如請求項1至21中任一項所述之CAR。
  23. 如請求項22所述之經單離淋巴球，其中該淋巴球係T淋巴球。
  24. 如請求項23所述之經單離淋巴球，其中該T淋巴球係初始T細胞(naïve T cell)。
  25. 如請求項23所述之經單離淋巴球，其中該T淋巴球係幹細胞樣記憶T細胞(memory stem T cell)。
  26. 如請求項23所述所述之經單離淋巴球，其中該T淋巴球係中央記憶T細胞(central memory T cell)。
  27. 如請求項23至26中任一項所述之經單離淋巴球，其中該T淋巴球係CD4+。
  28. 如請求項23至26中任一項所述之經單離淋巴球，其中該T淋巴球係CD8+。
  29. 如請求項23至26中任一項所述之經單離淋巴球，其中該T淋巴球係CD4+及CD8+。
  30. 一種經單離核酸分子，其編碼如請求項1至29中任一項所述之CAR。
  31. 如請求項30所述之經單離核酸分子，其中該核酸分子包含選自由SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、及38所組成之群組的核酸序列。
  32. 如請求項30所述之經單離核酸分子，其中該核酸分子包含與SEQ ID NO：90、89、87、88、33、34、35、36、37、及38之核苷酸序列至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的核苷酸序列。
  33. 一種載體，其包含如請求項30至32中任一項所述之核酸分子。
  34. 一種細胞，其表現如請求項30至32中任一項所述之核酸分子。
  35. 一種醫藥組成物，其包含
    有效量的如請求項22至29中任一項所述之淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。
  36. 一種治療有效量的如請求項22至29中任一項所述之淋巴球用於製備治療患有癌症之對象之藥物的用途。
  37. 如請求項36所述之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌(bladder urothelial carcinoma)、轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)、多發性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、及其組合。
  38. 如請求項36所述之用途，其中該癌症係多發性骨髓瘤。
  39. 一種如請求項22至29中任一項所述之淋巴球用於製備靶向殺滅癌細胞之藥物的用途。
  40. 如請求項39所述之用途，其中該癌細胞係選自由下列所組成之群組：肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌、轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、及非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)、多發性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、及其組合。
  41. 如請求項39所述之用途，其中該癌細胞係多發性骨髓瘤細胞。
  42. 一種偵測對象中癌症之存在的方法，其包含：
    (a)使獲自該對象之細胞樣本與如請求項1所述之CAR接觸，從而形成CAR-細胞複合物；及
    (b)偵測該複合物，其中該複合物之偵測指示該對象中存在癌症。
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