CN110267973A - 表达嵌合抗原受体的t细胞 - Google Patents

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Abstract

本文中描述的是用于生成和利用包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的方法,该嵌合抗原受体(CAR)包含肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体,例如增殖诱导性配体(APRIL)的胞外域的一部分。本发明的CAR T细胞克服对抗BCMA靶向疗法的抗性且利用二聚化和三聚化跨膜域实现最佳的功能。进一步地,本发明涉及治疗癌症,浆细胞疾病或病症,或自身免疫性疾病或病症的方法。

Description

表达嵌合抗原受体的T细胞
对相关申请的交叉援引
本申请要求2017年1月10日提交的美国临时申请No.62/444,622,2017年6月7日提交的美国临时申请No.62/516,279,和2017年11月1日提交的美国临时申请No.62/580,258在35 U.S.C.§119(e)下的权益,通过援引将其内容完整收入本文。
技术领域
本文中描述的技术涉及免疫疗法。
发明背景
嵌合抗原受体(CAR)提供一种将细胞毒性T细胞应答导向表达选定靶抗原(最常见的是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原)的靶细胞的方式。CAR是T细胞受体的一种改编,其中用特异性结合衍生的靶抗原的抗体的抗原结合域替换抗原结合域。在T细胞(“CAR T细胞”)上表达的CAR对靶细胞的表面上的靶抗原的啮合促进对靶细胞的杀伤。
发明概述
CAR T细胞是一种前沿治疗剂,在治疗癌症中显示极大希望。该技术已经证明针对多种非实体癌症,例如白血病,淋巴瘤和骨髓瘤特别有效。为给定疾病或病症创建CAR T细胞的最大挑战之一是克服来自脱靶和全身效应的不良反应,诸如细胞因子释放综合征。虽然细胞因子释放综合征一般是可治疗的,但是担心这种并发症的治疗可能限制CAR T细胞治疗的功效和/或长期持续效果。
在CAR T治疗剂设计中遭遇的另一个问题是肿瘤经由丧失受到CAR识别的靶定抗原或肿瘤相关因子而逃脱。当肿瘤下调或以其它方式丧失靶定抗原或因子的细胞表面表达时,它不再会受到设计靶向该抗原或因子的CAR T细胞有效攻击。例如,已经在靶向例如在B细胞恶性,白血病,淋巴瘤和多发性骨髓瘤中表达的B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR T疗法中观察到这一点。
本文中描述的是CAR设计的改进,其避免脱靶效应和降低肿瘤逃脱的可能性(丧失靶抗原所致)。因而,本文中描述的发明的一个方面涉及一种嵌合抗原受体(CAR)多肽,其包含:一个或多个包含肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体的部分的胞外域；铰链和跨膜域；共刺激域；和胞内信号传导域。在一个实施方案中,本文中描述一种办法,使用BCMA相关蛋白作为例示肿瘤相关靶展现,使用结合两种不同肿瘤相关抗原或因子的单一配体。在一些实施方案中,单一配体与本领域知道对于CAR必需的跨膜和T细胞受体胞内效应域,任选与共刺激域融合。具有结合两种不同肿瘤相关抗原或因子的配体代替单一抗原意味着如果肿瘤的细胞下调抗原或因子之一或另一的话,CAR不会丧失有效性。这在本文中使用以高亲和力结合BCMA和TACI(另一种肿瘤相关抗原或因子)二者的APRIL(一种增殖诱导性配体)多肽的部分作为配体来例示。在本文中描述的任何方面的一些实施方案中,配体寡聚化(例如二聚化或三聚化),例如通过自我寡聚化。例如,在一些实施方案中,配体是TNF超家族受体配体的部分。在一些方面,CAR设计包括超过一个配体(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个配体)。
因而,本文中描述的发明的一个方面涉及一种CAR多肽,其包含包含TNF超家族受体配体的部分的胞外域(它在内源切割位点的N端),铰链和跨膜域,共刺激域,和胞内信号传导域。在一个实施方案中,TNF超家族受体配体是APRIL。在其它实施方案中,TNF超家族受体配体是TNF-α,淋巴毒素β,OX40L,CD154,FasL,LIGHT,TL1A,CD70,Siva,CD153,4-1BB配体,TRAIL,RANKL,TWEAK,BAFF,CAMLG,LIGHT,NGF,BDNF,NT-3,NT-4,GITR配体,TL1A,或EDA-A2。
因而,本文中描述的发明的一个方面涉及一种CAR多肽,其包含包含APRIL的部分的胞外域(它在内源切割位点的N端),铰链和跨膜域,共刺激域,和胞内信号传导域。
在任何方面的一个实施方案中,CAR多肽进一步包含CD8前导序列。在一个实施方案中,CD8前导序列包含选自SEQ ID NO:20,26,或32的序列,或由包含选自SEQ ID NO:2,9,或14的序列的核酸编码。
在一个实施方案中,APRIL的部分包含选自SEQ ID NO:21,27,或33的序列,或由包含选自SEQ ID NO:3,9,或15的序列的核酸编码。在任何方面的一个实施方案中,APRIL的部分不包含APRIL的富赖氨酸区。
在任何方面的一个实施方案中,铰链和跨膜域包含CD8或4-1BB的铰链和跨膜域。在一个实施方案中,CD8铰链和跨膜域序列包含SEQ ID NO:22的序列,或由包含SEQ ID NO:4的序列的核酸编码。在一个实施方案中,4-1BB铰链和跨膜域序列选自SEQ ID NO:28或34,或由包含SEQ ID NO:10或16的序列的核酸编码。
在任何方面的一个实施方案中,胞内信号传导域包含CD3泽塔,CD3伊塔,或CD3西塔的信号传导域。在一个实施方案中,CD3泽塔胞内信号传导域序列选自SEQ ID NO:24或30,或由包含SEQ ID NO:6或12的序列的核酸编码。在一个实施方案中,CD3西塔胞内信号传导域序列包含SEQ ID NO:36的序列,或由包含SEQ ID NO:18的序列的核酸编码。
在任何方面的一个实施方案中,共刺激域是4-1BB胞内域(ICD),CD28ICD,CD27ICD,ICOS ICD,或OX40ICD。在一个实施方案中,共刺激域是4-1BB ICD。在一个实施方案中,4-1BB ICD序列包含选自SEQ ID NO:23,29,或35的序列,或由包含SEQ ID NO:5,11,或17的序列的核酸编码。
在任何方面的一个实施方案中,CAR多肽包含两个或更多个(例如两个或更多个,三个或更多个,四个或更多个,五个或更多个,六个或更多个,七个或更多个,八个或更多个,九个或更多个,或十个或更多个)包含TNF超家族受体配体的部分的胞外域。在一个实施方案中,CAR多肽包含三个包含TNF超家族受体配体的部分的胞外域。
本文中描述的发明的另一个方面涉及一种CAR多肽,其与选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列包含至少95％同一性,或由与选自SEQ ID NO:1,7,或13的序列包含至少95％同一性的序列编码。
本文中描述的发明的另一个方面涉及一种CAR多肽,其包含选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列,或由选自SEQ ID NO:1,7,或13的序列编码。
本文中描述的发明的另一个方面涉及一种CAR多肽,其包含与选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列对应的序列,或由选自SEQ ID NO:1,7,或13的序列编码。
本文中描述的发明的另一个方面涉及一种多肽复合物,其包含两个或更多个(例如两个或更多个,三个或更多个,四个或更多个,五个或更多个,六个或更多个,七个或更多个,八个或更多个,九个或更多个,或十个或更多个)本文中描述的任何CAR多肽。在一个实施方案中,多肽复合物包含三个本文中描述的任何CAR多肽。
本文中描述的发明的另一个方面涉及一种哺乳动物细胞,其包含:本文中描述的任何CAR多肽；编码本文中描述的任何CAR多肽的核酸；或本文中描述的任何多肽复合物。
在任何方面的一个实施方案中,细胞是T细胞。在一个实施方案中,细胞是人细胞。在一个实施方案中,细胞是自具有或诊断为具有癌症,浆细胞病症,或自身免疫性疾病的个体获得的。
本文中描述的发明的另一个方面涉及一种治疗受试者中的癌症,浆细胞病症,淀粉样变,或自身免疫性疾病的方法,该方法包含:改造T细胞以包含在该T细胞表面上的本文中描述的任何CAR多肽；将经改造的T细胞施用于受试者。
本文中描述的发明的另一个方面涉及一种治疗受试者中的癌症,浆细胞病症,或自身免疫性疾病的方法,该方法包含施用包含本文中描述的任何CAR多肽或编码本文中描述的任何CAR多肽的核酸的细胞。
在任何方面的一个实施方案中,癌症是BAFF+,BCMA+和/或TACI+的。在一个实施方案中,癌症是多发性骨髓瘤或冒烟型骨髓瘤(smoldering myeloma)。
在任何方面的一个实施方案中,对受试者进一步施用抗BCMA疗法。在一个实施方案中,受试者对抗BCMA疗法有抗性。
在任何方面的一个实施方案中,自身免疫性疾病是选自由带有针对凝固因子的抗体的血友病,重症肌无力,多发性硬化,和慢性移植物抗宿主病组成的组。
本文中描述的技术的另一个方面涉及一种组合物,其包含如本文中描述的CAR多肽,为了治疗癌症而配制。在一个实施方案中,组合物进一步包含药学可接受载剂。
本文中描述的技术的另一个方面涉及一种组合物,其包含如本文中描述的蛋白质复合物,为了治疗癌症而配制。在一个实施方案中,组合物进一步包含药学可接受载剂。
本文中描述的技术的另一个方面涉及一种组合物,其包含如本文中描述的CAR T细胞,为了治疗癌症而配制。在一个实施方案中,组合物进一步包含药学可接受载剂。
定义
为了便利,下文提供说明书,实施例,和所附权利要求书中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明,或上下文暗示,下面的术语和短语包括下文提供的含义。提供定义来帮助描述特定实施方案,并非意图限制请求保护的技术,因为该技术的范围仅仅由权利要求限制。除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与此技术所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。如果术语在本领域中的用法和它在本文中提供的定义之间有明显差异的话,应当以说明书内提供的定义为准。
免疫学和分子生物学中的常用术语的定义可以见The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy,19th Edition,Merck Sharp&Dohme Corp.,2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular CellBiology and Molecular Medicine,Blackwell Science Ltd.,1999-2012(ISBN9783527600908)；Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann,Elsevier,2006；Janeway’s Immunobiology,KennethMurphy,Allan Mowat,Casey Weaver(eds.),Taylor&Francis Limited,2014(ISBN0815345305,9780815345305)；Lewin's Genes XI,Jones&Bartlett Publishers,2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis et al.,Basic Methods inMolecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(2012)(ISBN044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch(ed.)Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology(CPMB),FrederickM.Ausubel(ed.),John Wiley and Sons,2014(ISBN 047150338X,9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(ed.),John Wiley andSons,Inc.,2005；和Current Protocols in Immunology(CPI),John E.Coligan,ADA MKruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe(eds.),John Wileyand Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735,9780471142737),通过援引将其内容均完整收入本文。
术语“TNF超家族受体配体”指结合TNF超家族受体的配体。TNF超家族受体配体可以是作为非共价寡聚体(例如三聚体)有活性的。在一些实施方案中,TNF超家族受体配体是作为同寡聚体(例如同三聚体)有活性的。然而,一些TNF超家族受体配体可以是作为异寡聚体(例如异三聚体)有活性的,包括能与APRIL形成异寡聚体的BAFF。在一些实施方案中,TNF超家族受体配体是Aggarwal,Nat.Rev.Immunol.3:745-756,2003或Croft et al.,Nat.Rev.Immunol.9(4):271-285,2009中描述的。在一些实施方案中,TNF超家族受体配体是TNF-α,淋巴毒素β,OX40L,CD154,FasL,LIGHT,TL1A,CD70,Siva,CD153,4-1BB配体,TRAIL,RANKL,TWEAK,BAFF,CAMLG,LIGHT,NGF,BDNF,NT-3,NT-4,GITR配体,TL1A,或EDA-A2。在一些实施方案中,TNF超家族受体配体结合Aggarwal,见上文或Croft et al.,见上文中描述的TNF超家族受体,包括例如TNFR1,TNFR2,CD95,DCR3,DR3,DR4,DR5,DCR1,DCR2,DR6,EDAR,NGFR,OPG,RANK,LTβR,FN14,HVEM,CD27,CD30,CD40,4-1BB,OX40,GITR,BCMA,TACI,BAFFR,XEDAR,TROY,或RELT。
术语“部分”指多肽,例如TNF超家族受体配体(例如APRIL)的一部分。在一些实施方案中,TNF超家族受体配体的部分在内源切割位点的N端,且至少包含TNF样域。在一些实施方案中,TNF超家族受体配体的部分能够寡聚化(例如二聚化或三聚化)。寡聚化可以是同寡聚化或异寡聚化。
术语“降低”,“减少”,“减轻”,或“抑制”均在本文中用于表示降低统计学上显著的量。在一些实施方案中,“降低”,“减少”,“减轻”,或“抑制”典型地表示与参照水平(例如在给定治疗或药剂缺失下)相比降低至少10％且可以包括例如降低至少约10％,至少约20％,至少约25％,至少约30％,至少约35％,至少约40％,至少约45％,至少约50％,至少约55％,至少约60％,至少约65％,至少约70％,至少约75％,至少约80％,至少约85％,至少约90％,至少约95％,至少约98％,至少约99％,或更多。如本文中使用的,“降低”或“抑制”并不涵盖与参照水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参照水平相比的100％抑制。在适用时,降低可以是优选下降至对于没有给定病症的个体正常的范围内可接受的水平。
术语“提高”,“增加”,“增强”,或“活化”均在本文中用于表示提高统计学上显著的量。在一些实施方案中,术语“提高”,“增加”,“增强”,或“活化”可以表示与参照水平相比提高至少10％,例如与参照水平相比提高至少约20％,或至少约30％,或至少约40％,或至少约50％,或至少约60％,或至少约70％,或至少约80％,或至少约90％或高至且包括100％增量,或10-100％之间的任何增量,或与参照水平相比至少约2倍,或至少约3倍,或至少约4倍,或至少约5倍或至少约10倍增量,或2倍和10倍之间的任何增量或更大。在标志物或症状的背景中,“升高”是此类水平的统计学上显著的升高。
如本文中使用的,“受试者”表示人或动物。通常,动物是脊椎动物,诸如灵长动物,啮齿动物,驯养动物,或狩猎动物。灵长动物包括例如黑猩猩,食蟹猴,蜘蛛猴,和猕猴,例如恒河猴。啮齿动物包括例如小鼠,大鼠,土拨鼠,雪貂,家兔和仓鼠。驯养和狩猎动物包括例如牛,马,猪,鹿,野牛,水牛,猫科动物,例如驯养的猫,犬科动物,例如犬,狐狸,狼,鸟类物种,例如鸡,鸸鹋,鸵鸟,和鱼,例如鳟鱼,鲶鱼和鲑鱼。在一些实施方案中,受试者是哺乳动物,例如灵长动物,例如人。术语“个体”,“患者”,和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地,受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人,非人灵长动物,小鼠,大鼠,犬,猫,马,或牛,但是不限于这些例子。除了人以外的哺乳动物可以有利地用作受试者,代表疾病(例如癌症)的动物模型。受试者可以是雄性/男性或雌性/女性。
受试者可以是先前诊断有或鉴定为罹患或具有需要治疗的状况(例如白血病或另一种类型的癌症,等等)或一种或多种与此类状况有关的并发症的,和任选早就为了状况或一种或多种与状况有关的并发症而经历治疗的。或者,受试者还可以是先前没有诊断为具有此类状况或相关并发症的。例如,受试者可以是展现状况或一种或多种与状况有关的并发症的一种或多种风险因子的或不展现风险因子的受试者。
为了特定状况“需要治疗的受试者”可以是具有该状况,诊断为具有该状况,或有风险发生该状况的受试者。
“疾病”是如下的动物(例如人)的健康状态,其中动物不能维持体内稳态,且其中如果疾病没有减轻,那么动物的健康继续恶化。与之对比,动物中的“病症”是如下的健康状态,其中动物能够维持体内稳态,但其中动物的健康状态不如在病症缺失下有利。如果不治疗,病症并不必然引起动物的健康状态进一步降低。
如本文中使用的,术语“肿瘤抗原”和“癌抗原”可互换使用,指由癌细胞差异表达且由此可用于靶向癌细胞的抗原。癌抗原是能潜在刺激明显肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码,尽管并不必然表达。这些抗原可以表征为那些在正常细胞中在正常情况下沉默的(即不表达的),那些仅仅在分化的某些阶段表达的,和那些时间性表达的,诸如胚胎和胎儿抗原。其它癌抗原由突变细胞基因编码,诸如癌基因(例如活化的ras癌基因),抑制基因(例如突变体p53),和源自内部删除或染色体易位的融合蛋白。仍有其它癌症抗原可以由病毒基因编码,诸如那些在RNA和DNA肿瘤病毒上携带的。已经就多种实体瘤而言定义了许多肿瘤抗原:MAGE 1,2,和3,通过免疫性来定义；MART-1/Melan-A,gp100,癌胚抗原(CEA),HER2,粘蛋白(即MUC-1),前列腺特异性抗原(PSA),和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。另外,病毒蛋白,诸如由乙型肝炎病毒(HBV),埃巴二氏病毒(EBV),和人乳头瘤病毒(HPV)编码的一些,已经显示分别在肝细胞癌,淋巴瘤,和宫颈癌的发生中是重要的。
如本文中使用的,术语“嵌合”指至少两种或更多种不同多核苷酸分子的部分的融合产物。在一个实施方案中,术语“嵌合”指经由操作已知元件或其它多核苷酸分子而生成的基因表达元件。
在一些实施方案中,“活化”可以指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。在一些实施方案中,活化可以指诱导的细胞因子生成。在其它实施方案中,活化可以指可检测的效应器功能。最低限度,如本文中使用的,“活化的T细胞”是增殖性T细胞。
如本文中使用的,术语“特异性结合”指两个分子,化合物,细胞,和/或颗粒之间的物理相互作用,其中第一实体以比它结合第三非靶实体更大的特异性和亲和力结合第二靶实体。在一些实施方案中,特异性结合可以指在相同条件下第一实体对第二靶实体的亲和力比对第三非靶实体的亲和力大至少10倍,至少50倍,至少100倍,至少500倍,至少1000倍,或更多。对给定靶特异性的试剂是在所利用的测定法的条件下展现对该靶的特异性结合的试剂。一个非限制性例子包括识别并结合关联结合配偶(例如T细胞上存在的刺激性和/或共刺激性分子)蛋白的抗体或配体。
如本文中使用的,“刺激性配体”指当在抗原呈递细胞(APC,例如巨噬细胞,树突细胞,B细胞,人工APC,等等)上存在时能特异性结合T细胞上的关联结合配偶(在本文中称作“刺激性分子”或“共刺激性分子”),由此介导T细胞的初级应答,包括但不限于增殖,活化,启动免疫应答,等等的配体。刺激性配体是本领域公知的且格外涵盖加载有肽的MHC I类分子,抗CD3抗体,超激动性抗CD28抗体,和超激动性抗CD2抗体。
如该术语在本文中使用的,“刺激性分子”表示T细胞上特异性结合抗原呈递细胞上存在的关联刺激性配体的分子。
如该术语在本文中使用的,“共刺激性配体”包括APC上特异性结合T细胞上的关联共刺激性分子,由此提供在通过例如TCR/CD3复合物结合加载有肽的MHC分子提供的主要信号以外介导T细胞应答,包括但不限于增殖,活化,分化,等等的信号的分子。共刺激性配体可以包括但不限于4-1BBL,OX40L,CD7,B7-1(CD80),B7-2(CD86),PD-L1,PD-L2,诱导型共刺激性配体(ICOS-L),细胞间粘附分子(ICAM),CD30L,CD40,CD70,CD83,HLA-G,MICA,MICB,HVEM,淋巴毒素β受体,3/TR6,ILT3,ILT4,HVEM,结合Toll样受体的激动剂或抗体和特异性结合B7-H3的配体。共刺激性配体还可以包括但不限于特异性结合T细胞上存在的共刺激性分子,诸如但不限于CD27,CD28,4-1BB,OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3的抗体,和特异性结合CD83的配体。
“共刺激性分子”指T细胞上特异性结合共刺激性配体,由此介导T细胞的共刺激性应答,诸如但不限于增殖的关联结合配偶。共刺激性分子包括但不限于MHC I类分子,BTLA,Toll样受体,CD27,CD28,4-1BB,OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3,和CD83。
在一个实施方案中,如本文中使用的,术语“经改造的”和它的语法等同物可以指一处或多处人设计的对核酸,例如生物体的基因组内的核酸的改变。在另一个实施方案中,经改造的可以指基因的改变,添加,和/或删除。“经改造的细胞”可以指添加,删除和/或改变了基因的细胞。如本文中使用的,术语“细胞”或“经改造的细胞”和它们的语法等同物可以指人或非人动物起源的细胞。
如本文中使用的,术语“可操作连接”指第一多核苷酸分子,诸如启动子与第二可转录多核苷酸分子,诸如感兴趣基因连接,其中多核苷酸分子的排列使得第一多核苷酸分子影响第二多核苷酸分子的功能。两种多核苷酸分子可以是或不是单一连续多核苷酸分子的部分且可以是或不是相邻的。例如,如果在细胞中启动子调解或介导感兴趣基因的转录的话,启动子与感兴趣基因是可操作连接的。
在本文中描述的各种实施方案中,进一步涵盖的是涵盖所描述的任何特定多肽的变体(天然发生的或其它的),等位基因,同源物,保守修饰的变体,和/或保守替代变体。对于氨基酸序列,普通技术人员会认识到在改变导致氨基酸用化学上相似的氨基酸替代且保留多肽的期望活性的情况中,改变所编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸,肽,多肽,或蛋白质序列的个别替代,删除,或添加是“保守修饰变体”。此类保守修饰变体补充且不排除与本公开一致的多态性变体,物种间同源物,和等位基因。
给定氨基酸可以用具有相似的生理化学特征的残基替换,例如用一种脂肪族残基替代另一种(诸如Ile,Val,Leu,或Ala彼此替代),或一种极性残基替代另一种(诸如Lys和Arg；Glu和Asp；或Gln和Asn之间)。其它此类保守替代(例如具有相似疏水性特征的整个区域的替代)是公知的。可以在本文中描述的任一种测定法中测试包含保守氨基酸替代的多肽以确认天然或参照多肽的期望活性(例如配体介导的受体活性和特异性)得到保留。
氨基酸可以依照它们侧链特性的相似性来分组(A.L.Lehninger,inBiochemistry,second ed.,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975)):(1)非极性的:Ala(A),Val(V),Leu(L),Ile(I),Pro(P),Phe(F),Trp(W),Met(M)；(2)不带电荷的极性的:Gly(G),Ser(S),Thr(T),Cys(C),Tyr(Y),Asn(N),Gln(Q)；(3)酸性的:Asp(D),Glu(E)；(4)碱性的:Lys(K),Arg(R),His(H)。或者,天然发生残基可以基于共同的侧链特性来分成各组:(1)疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；(2)中性的亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；(3)酸性的:Asp,Glu；(4)碱性的:His,Lys,Arg；(5)影响链取向的残基:Gly,Pro；(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。非保守替代会需要用这些类别之一的成员交换另一个类别的。特定的保守替代包括例如Ala变成Gly或变成Ser；Arg变成Lys；Asn变成Gln或变成His；Asp变成Glu；Cys变成Ser；Gln变成Asn；Glu变成Asp；Gly变成Ala或变成Pro；His变成Asn或变成Gln；Ile变成Leu或变成Val；Leu变成Ile或变成Val；Lys变成Arg,变成Gln或变成Glu；Met变成Leu,变成Tyr或变成Ile；Phe变成Met,变成Leu或变成Tyr；Ser变成Thr；Thr变成Ser；Trp变成Tyr；Tyr变成Trp；和/或Phe变成Val,变成Ile或变成Leu。
在一些实施方案中,本文中描述的多肽(或编码此类多肽的核酸)可以是本文中描述的氨基酸序列之一的功能性片段。如本文中使用的,“功能性片段”是肽的依照本领域知道的或本文中下文描述的测定法保留野生型参照多肽的活性的至少50％的片段或区段。功能性片段可以包含本文中公开的序列的保守替代。
在一些实施方案中,本文中描述的多肽可以是如本文中描述的多肽或分子的变体。在一些实施方案中,变体是保守修饰的变体。可以通过例如突变天然核苷酸序列来获得保守替代变体。如本文中提到的,“变体”是与天然或参照多肽实质性同源的,但因一处或多处删除,插入或替代而具有与天然或参照多肽不同的氨基酸序列的多肽。编码变体多肽的DNA序列涵盖与天然或参照DNA序列相比包含一处或多处核苷酸添加,删除,或替代,但编码保留非变体多肽的活性的变体蛋白或其片段的序列。极其多种基于PCR的位点特异性诱变办法是本领域知道的且可以由普通技术人员应用。
变体氨基酸或DNA序列可以与天然或参照序列至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或更多同一。可以例如通过使用万维网上免费可得的普遍用于这种目的的计算机程序(例如BLASTp或BLASTn,以缺省设置)比较两种序列来确定天然和突变序列之间同源性的程度(百分比同一性)。
可以通过本领域技术人员知道的多种技术任一来实现对天然氨基酸序列的改变。可以如下例如在特定基因座处引入突变,即合成含有突变序列,侧翼为允许连接至天然序列的片段的限制性位点的寡核苷酸。连接后,所得重新构建的序列编码具有期望氨基酸插入,替代,或删除的类似物。或者,可以采用寡核苷酸指导的位点特异性诱变规程来提供改变的核苷酸序列,其中特定密码子依照所需要的替代,删除,或插入而改变。用于生成此类改变的技术已经完善确立且包括例如下述公开的那些:Walder et al.(Gene 42:133,1986)；Bauer et al.(Gene 37:73,1985)；Craik(BioTechniques,January 1985,12-19)；Smith et al.(Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981)；和美国专利No.4,518,584和4,737,462,通过援引将其完整收入本文。还可以替代不牵涉维持多肽的正确构象的任何半胱氨酸残基,一般用丝氨酸,以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反,可以将半胱氨酸键添加至多肽以改善它的稳定性或推动寡聚化。
如本文中使用的,术语“DNA”定义为脱氧核糖核酸。术语“多核苷酸”在本文中与“核酸”可互换使用,指示核苷的聚合物。典型地,多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的在DNA或RNA中天然找到的核苷(例如腺苷,胸苷,鸟苷,胞苷,尿苷,脱氧腺苷,脱氧胸苷,脱氧鸟苷,和脱氧胞苷)构成。然而,该术语涵盖包含核苷或含有经化学或生物学修饰的碱基,经修饰的主链,等的核苷类似物的分子,无论是否是在天然发生核酸中找到的,而且此类分子对于某些应用可能是优选的。在本申请提到多核苷酸的情况中,理解的是提供DNA,RNA二者,而且在每种情况中提供单和双链形式二者(和每种单链分子的互补位)。如本文中使用的,“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料自身和/或在生物化学上表征特定核酸的序列信息(即作为碱基的缩写使用的字母的序列)。本文中呈现的多核苷酸序列是以5'至3'方向呈现的,除非另外指明。
如本文中使用的,术语“多肽”指氨基酸的聚合物。术语“蛋白(质)”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对较短的多肽,典型地长度介于约2和60个氨基酸之间。在本文中使用的多肽典型地含有氨基酸,诸如最常见在蛋白质中找到的20种L-氨基酸。然而,可以使用本领域知道的其它氨基酸和/或氨基酸类似物。可以修饰多肽中的一个或多个氨基酸,例如通过添加化学实体,诸如用于连接,官能化,等的碳水化合物基团,磷酸基团,脂肪酸基团,接头。具有与之共价或非共价联合的非多肽模块的多肽仍然认为是“多肽”。例示性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以自天然来源纯化,使用重组DNA技术生成或经由化学手段(诸如常规固相肽合成)合成,等。如本文中使用的,术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指多肽材料自身和/或在生物化学上表征多肽的序列信息(即作为氨基酸名称的缩写使用的字母或三字母代码的序列)。本文中呈现的多肽序列是以N端至C端方向呈现的,除非另外指明。
在一些实施方案中,编码如本文中描述的多肽(例如CAR多肽)的核酸由载体所包含。在本文中描述的一些方面,编码如本文中描述的给定多肽,或其任何模块的核酸序列与载体可操作连接。如本文中使用的,术语“载体”指设计用于投递至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建物。如本文中使用的,载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”涵盖能够在与适当的控制元件联合时复制且能将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可以包括但不限于克隆载体,表达载体,质粒,噬菌体,转座子,粘粒,人工染色体,病毒,病毒体,等。
如本文中使用的,术语“表达载体”指自与载体上的转录调节序列连接的序列指导RNA或多肽表达的载体。所表达的序列常常会是但并非必然是对细胞异源的。表达载体可以包含另外的元件,例如,表达载体可以具有两个复制系统,如此容许它在两种生物体中维持,例如在人细胞中为了表达和在原核宿主中为了克隆和扩增。术语“表达”指在生成RNA和蛋白质和适当时分泌蛋白质中牵涉的细胞过程,在适用时包括但不限于例如转录,转录物加工,翻译和蛋白质折叠,修饰和加工。“表达产物”包括自基因转录的RNA,和通过翻译自基因转录的mRNA而获得的多肽。术语“基因”意味着当与适当的调节序列可操作连接时在体外或在体内(将DNA)转录成RNA的核酸序列。基因可以包括或不包括在编码区之前和之后的区域,例如5’非翻译(5’UTR)或“前导”序列和3’UTR或“尾部”序列,以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文中使用的,术语“病毒载体”指包括至少一种病毒起源的元件且有能力包装至病毒载体颗粒中的核酸载体构建物。病毒载体可以含有编码如本文中描述的多肽的核酸替换非必需的病毒基因。为了在体外或在体内将核酸转移至细胞中的目的可以利用载体和/或颗粒。本领域知道众多形式的病毒载体。
“重组载体”意味着包括异源核酸序列,或能够在体内表达的“转基因”的载体。应当理解的是,在一些实施方案中,本文中描述的载体可以与其它合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中,载体是附加体。合适的附加体载体的使用提供在高拷贝数染色体外DNA中在受试者中维持感兴趣核苷酸的手段,由此消除染色体整合的潜在影响。
如本文中使用的,术语“治疗”,“处理”,“改善”,或“缓解”指治疗性处理,其中目标是逆转,减轻,缓解,抑制,减缓,或停止与疾病或病症有关的状况的进展或严重程度,例如急性成淋巴细胞性白血病或其它癌症,疾病,或病症。术语“治疗”包括降低或减轻状况,疾病,或病症的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物降低的话,治疗一般是“有效的”。或者,如果疾病的进展降低或停止的话,治疗是“有效的”。也就是,“治疗”不仅包括与在治疗缺失下的预期相比改善症状或标志物,而且包括停止或至少减缓症状的进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状,减轻疾病的程度,稳定(即不恶化)疾病的状态,延迟或减缓疾病进展,缓解或缓和疾病状态,减退(无论部分或是全部),和/或降低死亡率,无论是可检测的或者是不可检测的。术语“治疗”疾病还包括提供缓解疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)。
如本文中使用的,术语“药学组合物”指活性剂与药学可接受载剂(例如制药工业中常用的载剂)组合。短语“药学可接受的”在本文中用于指在合理医学判断的范围内适合在与人和动物的组织接触中使用而没有过度的毒性,刺激,变应性反应,或其它问题或并发症,与合理的益处/风险比相称的那些化合物,材料,组合物,和/或剂量形式。在任何方面的一些实施方案中,药学可接受载剂可以是除了水以外的载剂。在任何方面的一些实施方案中,药学可接受载剂可以是乳膏,乳液,凝胶,脂质体,纳米颗粒,和/或软膏。在任何方面的一些实施方案中,药学可接受载剂可以是人造的或改造的载剂,例如在自然界中不会找到存在活性组分的载剂。
如本文中使用的,术语“施用”指通过导致在期望部位至少部分投递药剂的方法或路径将如本文中公开的治疗性或药学组合物放置至受试者中。可以通过在受试者中导致有效治疗的任何适宜的路径来施用包含如本文中公开的药剂的药学组合物。
术语“统计学上显著的”或“显著”指统计学显著性且一般意味着两个标准偏差(2SD)或更大差异。
除了在操作实施例中以外,或另外指明之处,本文中使用的表示组分或反应条件的数量的所有数值应当理解为在所有情况中通过术语“约”来修饰。术语“约”在联合百分比使用时可以意味着±1％。
如本文中使用的,术语“包含”意味着在所呈现的限定要件以外还可以存在其它要件。“包含”的使用表示包括而非限制。
术语“由……组成”指如本文中描述的组合物,方法,和其各自成分排除实施方案的该描述中没有提到的任何要件。
如本文中使用的,术语“本质上由……组成”指给定实施方案要求的那些要件。该术语允许存在对本技术的该实施方案的基本的和新颖的或功能性的特征没有实质性影响的另外的要件。
单数术语“一个/一种”和“该/所述”包括复数所指物,除非上下文另外清楚指明。类似地,词语“或”意图包括“和”,除非上下文另外清楚指明。虽然在此公开的实践或测试中可以使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料,但是下文描述了合适的方法和材料。“例如”在本文中用于表示非限制性例子。
在任何方面的一些实施方案中,本文中描述的公开不涉及用于克隆人的方法,用于修饰人的种系遗传同一性的方法,人胚胎用于工业或商业目的的用途或用于修饰动物的遗传同一性,很可能导致它们受苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的方法,还有此类方法产生的动物。
其它术语在下面的技术的各种方面和实施方案的描述内定义。
附图简述
图1描绘基于scFv的抗BCMA CAR与APRIL抗BCMA/TACI CAR的示意性比较。
图2描绘本文中描述的CAR的某些实施方案的示意图。预期使用4-1BB跨膜域更有可能促进三聚化。
图3描绘所示细胞类型中的靶表面表达。
图4描绘表达APRIL或BCMA CAR的细胞的生长曲线。
图5A描绘APRIL CAR的CAR-T细胞转导效率。图5B描绘BCMA CAR的CAR-T细胞转导效率。X轴是mCherry,y轴是侧散射。在活的CD3+ T细胞上对细胞设门。
图6描绘比较APRIL和BCMA CAR的杀伤测定法的结果。
图7描绘比较APRIL和BCMA CAR的活化测定法的结果。在NFAT启动子(JNL)后面表达萤光素酶的Jurkat细胞系中测试CAR-介导的T细胞活化。如所示地经由慢病毒用CAR转导JNL细胞并暴露于x轴上所示靶达数小时。测量光发射(相对光单位,y轴)。
图8描绘所示多发性骨髓瘤细胞系中BCMA和TACI的表达水平。
图9描绘经改造的细胞系中BCMA和TACI的表达。
图10描绘数种APRIL和BCMA CAR的示意图和它们的转导效率。
图11描绘展现BCMA和APRIL CAR在用RPMI8226BCMA重复刺激后扩充的图。
图12描绘BCMA和TACI表达性细胞系的APRIL-CAR杀伤的图。
图13描绘APRIL-CAR的特异性活化。
图14展现BCMA和APRIL CAR响应用RPMI8226亲本刺激而脱粒。
图15描绘APRIL-CART细胞的细胞因子概况。
图16描绘例示性TriPRIL构建物的示意图。
图17描绘TriPRIL CAR的CAR-T细胞转导效率。X轴显示mCherry信号传导,而y轴是侧散射。顶部小图显示对照未转导(UTD)细胞,而底部小图显示用TriPRIL CAR转导的细胞。
图18描绘使用TriPRIL CAR T细胞的细胞杀伤测定法的结果。
发明详述
本文中描述的是CAR设计的改进,其避免脱靶效应和降低肿瘤逃脱的可能性(丧失靶抗原所致)。在一个实施方案中,本文中描述使用结合两种不同肿瘤相关抗原或因子的单一配体的办法。单一配体与本领域知道对于CAR必需的跨膜和T细胞受体胞内效应器域,任选与共刺激域融合。如果靶定细胞下调抗原或因子之一或另一的话,带有结合两种不同肿瘤相关抗原或因子的配体的CAR不会丧失有效性。在一些实施方案中,CAR包括包括TNF超家族受体配体的部分的配体。这在本文中使用以高亲和力结合多发性骨髓瘤和白血病相关BCMA多肽和TACI(在多发性骨髓瘤上表达的另一种因子)二者的APRIL多肽的部分作为配体来例示。
本文中描述的技术的实施方案涉及包含包含TNF超家族受体配体(例如APRIL)的胞外部分的CAR多肽的T细胞是治疗癌症,浆细胞病症,或自身免疫性疾病的有效治疗剂,不引起脱靶效应或不良反应的发现。
因而,本文中描述的发明的一个方面涉及一种CAR多肽,其包含a)包含TNF超家族受体配体(例如APRIL)的部分(它在内源切割位点的N端)且至少包含TNF样域的胞外域,b)铰链和跨膜域,和c)胞内信号传导域。在一些实施方案中,TNF超家族受体配体是APRIL。在其它实施方案中,TNF超家族受体配体是TNF-α,淋巴毒素β,OX40L,CD154,FasL,LIGHT,TL1A,CD70,Siva,CD153,4-1BB配体,TRAIL,RANKL,TWEAK,BAFF,CAMLG,LIGHT,NGF,BDNF,NT-3,NT-4,GITR配体,TL1A,或EDA-A2。
下面描述生成和使用本技术的这些和其它方面所必需的考虑事项。
嵌合抗原受体(CAR)
本文中描述的技术提供供免疫疗法中使用的改进的CAR。下面讨论CAR和各种改进。
如本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指经改造的T细胞受体,其将配体或抗原特异性移植至T细胞(例如幼稚T细胞,中心记忆T细胞,效应记忆T细胞,或其组合)上。CAR还称作人工T细胞受体,嵌合T细胞受体,或嵌合免疫受体。
CAR将特异性结合在T细胞应答要靶向的细胞的表面上表达的靶(例如多肽)的嵌合胞外靶结合域放置至包括T细胞受体分子的跨膜域和胞内域(包括信号传导域)的构建物上。在一个实施方案中,嵌合胞外靶结合域包含特异性结合在T细胞应答要靶向的细胞上表达的抗原的抗体的抗原结合域。CAR的胞内信号传导域的特性可以变化,如本领域知道的和如本文中公开的,但是嵌合靶/抗原结合域在嵌合靶/抗原结合域结合靶定细胞的表面上靶/抗原时使得受体对信号传导活化敏感。
就胞内信号传导域而言,所谓的“第一代”CAR包括那些在抗原结合时仅仅提供CD3泽塔(CD3ζ)信号的。所谓的“第二代”CAR包括那些提供共刺激(例如CD28或CD137)和活化(CD3ζ)域二者的,而所谓的“第三代”CAR包括那些提供多种共刺激(例如CD28和CD137)域和活化域(例如CD3ζ)。在各种实施方案中,选择CAR以具有对靶/抗原的高亲和力或亲合力--例如,抗体衍生的靶或抗原结合域一般会具有比天然发生T细胞受体要高的对靶抗原的亲和力和/或亲合力。这种特性与能对抗体选择的高特异性组合提供CAR T细胞的高特异性T细胞靶向。
如本文中使用的,“CAR T细胞”或“CAR-T”指表达CAR的T细胞。当在T细胞中表达时,CAR具有利用单克隆抗体的抗原结合特性,以非MHC约束的方式将T细胞特异性和反应性重新引导朝向选定靶的能力。非MHC约束的抗原识别给予表达CAR的T细胞以不依赖于抗原加工而识别抗原的能力,如此绕开肿瘤逃脱的主要机制。
如本文中使用的,术语“胞外靶结合域”指在细胞的外部找到的足以推动结合靶的多肽。胞外靶结合域会特异性结合它的结合配偶。作为非限制性例子,胞外靶结合域可以包括抗体的抗原结合域,或识别和结合关联结合配偶蛋白的配体(例如APRIL)。在此语境中,配体是特异性结合蛋白和/或受体的一部分的分子。在本文中描述的方法和组合物中有用的配体的关联结合配偶一般可以在细胞的表面上找到。配体:关联配偶结合可导致携带配体的受体的改变,或生理应答的活化,例如信号传导途径或级联的活化。在一个实施方案中,配体对于基因组可以是非天然的。任选地,配体具有在至少两种物种中保守的功能。
抗体试剂
在各种实施方案中,本文中描述的CAR包含抗体试剂或其抗原结合域作为胞外靶结合域。
如本文中使用的,术语“抗体试剂”指包括至少一种免疫球蛋白可变域或免疫球蛋白可变域序列且特异性结合给定抗原的多肽。抗体试剂可以包含抗体或包含抗体的抗原结合域的多肽。在任何方面的一些实施方案中,抗体试剂可以包含单克隆抗体或包含单克隆抗体的抗原结合域的多肽。例如,抗体可以包括一个重(H)链可变区(在本文中缩写为VH),和一个轻(L)链可变区(在本文中缩写为VL)。在另一个例子中,抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段(例如单链抗体,Fab和sFab片段,F(ab')2,Fd片段,Fv片段,scFv,CDR,和域抗体(dAb)片段(参见例如de Wildt etal.,Eur J.Immunol.1996；26(3):629-39；通过援引将其完整收入本文))以及完整抗体。抗体可以具有IgA,IgG,IgE,IgD,或IgM(以及亚类和其组合)的结构特征。抗体可以来自任何来源,包括小鼠,家兔,猪,大鼠,和灵长动物(人和非人灵长动物)和灵长化抗体。抗体还包括微抗体(midibodies),人化抗体,嵌合抗体,等等。例如,可以使用本领域普通技术人员知道的方法自噬菌体展示文库选择完全人抗体结合域。
VH和VL区可以进一步细分成称作“互补决定区”(“CDR”)的具有高变性的区域,间隔称作“框架区”(“FR”)的更加保守的区域。已经精确定义了FR和CDR的范围(参见Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；通过援引将其完整收入本文)。每个VH和VL典型地由三个CDR和四个FR构成,自氨基端至羧基端以下面的次序排列:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。
在一个实施方案中,抗体或抗体试剂不是人抗体或抗体试剂(即,抗体或抗体试剂是小鼠的),但是已经人化。“人化抗体或抗体试剂”指已经在蛋白质序列水平经过修饰以提高它与在人中天然生成的抗体或抗体试剂变体的相似性的非人抗体或抗体试剂。一种人化抗体的办法采用将鼠或其它非人CDR移植至人抗体框架上。
在一个实施方案中,CAR的胞外靶结合域包含通过经由柔性接头肽融合抗体(一般是单克隆抗体)的VH和VL域产生的单链Fv(scFv)片段或本质上由其组成。在各种实施方案中,scFv是与跨膜域和与T细胞受体胞内信号传导域(例如如本文中描述的改造的胞内信号传导域)融合的。
抗体结合域和选择和克隆它们的方式是本领域普通技术人员公知的。
在一个实施方案中,CAR多肽的胞外域包含TNF超家族受体配体的部分,其中TNF超家族受体配体的部分在内源切割位点N端,且至少包含TNF样域。
例如,在一个实施方案中,CAR多肽的胞外域包含APRIL的部分,其中APRIL的部分在内源切割位点的N端,且至少包含TNF样域(SEQ ID NO:37)。
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFV(SEQ ID NO:37)
APRIL是肿瘤坏死因子配体(TNF)家族的一个成员,且作为BCMA的配体发挥功能。知道多种物种的APRIL序列,例如人APRIL,也称作TNFSF13(NCBI基因ID:8741)多肽(例如NCBI Ref Seq NP_001185551.1)和mRNA(例如NCBI Ref Seq NM_001198622.1)。APRIL可以指人APRIL,包括其天然发生变体,分子,和等位基因。在任何方面的一些实施方案中,例如在兽医应用中,APRIL可以指例如犬,猫,牛,马,猪,等等的APRIL。本领域技术人员容易为此类物种鉴定人APRIL的同源物和/或直向同源物,例如为给定物种为与参照APRIL序列相似的序列使用NCBI直向同源物搜索功能或搜索可得序列数据。
在一个实施方案中,APRIL的部分具有与选自SEQ ID NO:3,8,15,21,27,或33序列对应的序列；或包含选自SEQ ID NO:3,8,15,21,27,或33的序列；或包含与选自SEQ ID NO3,8,15,21,27,或33的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中,APRIL的部分本质上由选自SEQ ID NO:3,8,15,21,27,或33的序列组成；或本质上由与选自SEQ ID NO 3,8,15,21,27,或33的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或至少100％序列同一性的序列组成。在一个实施方案中,APRIL的部分不包含自APRIL的部分衍生,在内源切割位点C端的序列。
在一个实施方案中,CAR多肽包含在它的编码区内包含一处或多处突变的TNF超家族受体配体的部分。例如,在一个实施方案中,CAR多肽包含在它的编码区内包含一处或多处突变的APRIL的部分。例示性氨基酸突变包括对SEQ ID NO:21的氨基酸18,61,91,92,和117；SEQ ID NO:27的氨基酸18,63,91,92,117；和SEQ ID NO:33的氨基酸18,63,91,92,117做出的点突变。本领域技术人员会能够使用标准技术将突变引入至基因或基因产物的核酸序列中。例如,可以经由定点诱变,PCR技术引入点突变。定点诱变试剂盒是商购可得的,例如经由New England Biolabs；Ipswich,MA。将点突变引入至基因或基因产物的核酸序列的备选方法的非限制性例子包括盒式诱变或全质粒诱变。
任选地,TNF超家族受体配体(例如APRIL)的部分不包含富赖氨酸区。在一个实施方案中,“富赖氨酸区”指氨基酸序列中包含至少30％,至少35％,至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,或至少100％赖氨酸氨基酸的区域。如本文中使用的,“区/区域”指至少4或更多个连续氨基酸。在一个实施方案中,富赖氨酸序列包含序列KQKKQH(SEQ ID NO:38)。
在一个实施方案中,在本文中描述的技术中有用的CAR包含胞外域中的至少两个抗原特异性靶向区,跨膜域,和胞内信号传导域。在此类实施方案中,两个或更多个抗原特异性靶向区靶向至少两种不同抗原且可以串联排列并通过接头序列分开。在另一个实施方案中,CAR是双特异性CAR。双特异性CAR是对两种不同抗原特异性的。
在任何方面的一个实施方案中,CAR多肽包含两个或更多个(例如两个或更多个,三个或更多个,四个或更多个,五个或更多个,六个或更多个,七个或更多个,八个或更多个,九个或更多个,或十个或更多个)包含TNF超家族受体配体(例如APRIL)的部分的胞外域。在一个实施方案中,CAR多肽包含三个包含TNF超家族受体配体(例如APRIL)的部分的胞外域。例如,在一些实施方案中,CAR多肽可以包括两个或更多个(例如两个或更多个,三个或更多个,四个或更多个,五个或更多个,六个或更多个,七个或更多个,八个或更多个,九个或更多个,或十个或更多个)TNF超家族受体配体(例如APRIL,如图16中显示的,其中作为三重重复提供APRIL)的重复。在一些实施方案中,TNF超家族受体配体是相同的。在其它实施方案中,TNF超家族受体配体可以是不同的(例如,CAR可以包括一个或多个APRIL的部分和一个或多个第二TNF超家族受体配体(例如BAFF)的部分。
在任何方面的一个实施方案中,TNF超家族受体配体(例如APRIL)与另一个TNF超家族受体配体(例如APRIL)寡聚化(例如二聚化或三聚化)。寡聚化可以是分子内的或分子间的。寡聚体可以是同寡聚体或异寡聚体。
靶/抗原
可以通过CAR靶向任何细胞表面模块。最常见的是,靶会是在希望将T细胞应答靶向的细胞上差异或优先表达的细胞表面多肽。在这点上,肿瘤抗原或肿瘤相关抗原提供有吸引力的靶,提供靶向肿瘤细胞,同时避免或至少限制对非肿瘤细胞或组织的附带损伤的手段。肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的非限制性例子包括CEA,未成熟层粘连蛋白受体,TAG-72,HPV E6和E7,BING-4,钙活化氯化物通道2,细胞周期蛋白B1,9D7,Ep-CAM,EphA3,Her2/neu,端粒酶,间皮素,SAP-1,存活素,BAGE家族,CAGE家族,GAGE家族,MAGE家族,SAGE家族,XAGE家族,NY-ESO-1/LAGE-1,PRAME,SSX-2,Melan-A/MART-1,Gp100/pmel17,酪氨酸酶,TRP-1/-2,MC1R,BRCA1/2,CDK4,MART-2,p53,Ras,MUC1,和TGF-βRII。
在一个方面,细胞表面模块可以是TNF超家族受体,例如TNFR1,TNFR2,CD95,DCR3,DR3,DR4,DR5,DCR1,DCR2,DR6,EDAR,NGFR,OPG,RANK,LTβR,FN14,HVEM,CD27,CD30,CD40,4-1BB,OX40,GITR,BCMA,TACI,BAFFR,XEDAR,TROY,或RELT。在一些实施方案中,TNF超家族受体是BCMA或TACI。
铰链和TM域
如本文中描述的每一种CAR必然包括将胞外靶结合域连接至胞内信号传导域的跨膜域。
如本文中使用的,“铰链域”指容许结合模块和T细胞膜的分开和柔性的氨基酸区域。柔性铰链的长度还容许更好地结合相对不可及的表位,例如较长的铰链区容许最佳的结合。本领域技术人员会能够确定对于给定CAR靶适宜的铰链。在一个实施方案中,本文中描述的任何CAR多肽的跨膜域或其片段包含CD8或4-1BB铰链域。
如本文中描述的每一种CAR必然包括将胞外靶结合域连接至胞内信号传导域的跨膜域。
如本文中使用的,“跨膜域”(TM域)指CAR中穿越细胞的质膜的一般疏水性的区域。TM域可以是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白或其它跨膜蛋白)的跨膜区或其片段,人工疏水性序列,或其组合。虽然本文中提供了且实施例中使用了具体例子,但是其它跨膜域会是本领域技术人员显而易见的且可以与该技术的备选实施方案联合使用。选定的跨膜区或其片段会优选不干扰CAR的预定功能。如关于蛋白或多肽的跨膜域使用,“其片段”指跨膜域中足以将蛋白锚定或附着至细胞表面的部分。
在一个实施方案中,本文中描述的任何CAR多肽的跨膜域或其片段包含选自CD8或4-1BB的跨膜域的跨膜域。在任何方面的一个备选实施方案中,本文中描述的CAR的跨膜域或其片段包含选自T细胞受体α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137,CD154,KIRDS2,OX40,CD2,CD27,LFA-1(CD11a,CD18),ICOS(CD278),4-1BB(CD137),GITR,CD40,BAFFR,HVEM(LIGHTR),SLAMF7,NKp80(KLRF1),CD160,CD19,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Ra,ITGA1,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRT AM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,PAG/Cbp,NKp44,NKp30,NKp46,NKG2D,和/或NKG2C的跨膜域的跨膜域。
4-1BBL是一种属于TNFR/TNF配体超家族的2型跨膜糖蛋白。4-1BBL是结合在T细胞上表达的受体4-1BB(CD137)的共刺激性配体。4-1BBL在专职APC,包括树突细胞,巨噬细胞,和活化的B细胞上表达。知道多种物种的4-1BBL序列,例如人4-1BBL,也称作TNFSF9(NCBI基因ID:8744)多肽(例如NCBI Ref Seq NP_003802.1)和mRNA(例如NCBI Ref Seq NM_003811.3)。4-1BBL可以指人4-1BBL,包括其天然发生变体,分子,和等位基因。在任何方面的一些实施方案中,例如在兽医应用中,4-1BBL可以指例如犬,猫,牛,马,猪,等等的4-1BBL。本领域技术人员容易为此类物种鉴定人4-1BBL的同源物和/或直向同源物,例如为给定物种为与参照4-1BBL序列相似的序列使用NCBI直向同源物搜索功能或搜索可得序列数据。
在一个实施方案中,4-1BBL铰链和跨膜序列对应于选自SEQ ID NO:10或16的核苷酸序列；或包含选自SEQ ID NO:10或16的序列；或包含与选自SEQ ID NO:10或16的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中,4-1BBL铰链和跨膜序列对应于选自SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列；或包含选自SEQID NO:28或34的序列；或包含与选自SEQ ID NO:28或34的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。
CD8是一种优先在细胞毒性T淋巴细胞的细胞表面上找到的抗原。CD8介导免疫系统内的细胞-细胞相互作用,且作为T细胞共受体起作用。CD8由α(CD8α)和β(CD8β)链组成。知道多种物种的CD8α序列,例如人CD8α(NCBI基因ID:925)多肽(NCBI Ref Seq NP_001139345.1)和mRNA(例如NCBI Ref Seq NM_000002.12)。CD8可以指人CD8,包括其天然发生变体,分子,和等位基因。在任何方面的一些实施方案中,例如在兽医应用中,CD8可以指例如犬,猫,牛,马,猪,等等的CD8。本领域技术人员容易为此类物种鉴定人CD8的同源物和/或直向同源物,例如为给定物种为与参照CD8序列相似的序列使用该NCBI直向同源物搜索功能或搜索可得序列数据。
在一个实施方案中,CD8铰链和跨膜序列对应于SEQ ID NO:4的核苷酸序列；或包含SEQ ID NO:4的序列；或包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中,CD8铰链和跨膜序列对应于SEQID NO:22的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:22的序列；或包含与SEQ ID NO:22的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。
共刺激域
本文中描述的每种CAR包含共刺激分子的胞内域,或共刺激域。如本文中使用的,术语“共刺激域”指共刺激分子的胞内信号传导域。共刺激分子是在结合抗原后提供T淋巴细胞的有效活化和功能需要的第二信号的除了抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子。此类共刺激分子的例示性例子包括CARD11,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CD54(ICAM),CD83,CD134(OX40),CD137(4-1BB),CD150(SLAMF1),CD152(CTLA4),CD223(LAG3),CD270(HVEM),CD273(PD-L2),CD274(PD-L1),CD278(ICOS),DAP10,LAT,NKD2C SLP76,TRIM,和ZAP70。在一个实施方案中,胞内域是4-1BB的胞内域。
在一个实施方案中,CAR多肽进一步包含胞内域。如本文中使用的,“胞内域”指完全包含在细胞内的核酸。在一个实施方案中,胞内域指受体的胞内域。胞内域能与细胞的内部相互作用。就受体的胞内域而言,胞内域能发挥转播所转导的信号的功能。受体的胞内域可以包含酶活性。
在一个实施方案中,胞内域是4-1BB的胞内域。在一个实施方案中,4-1BB胞内域序列对应于选自SEQ ID NO:5,11或17的核苷酸序列；或包含选自SEQ ID NO:5,11或17的序列；或包含与选自SEQ ID NO:5,11或17的序列的至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性。在一个实施方案中,4-1BB胞内域氨基酸序列对应于选自SEQ ID NO:23,29或35的氨基酸序列；或包含选自SEQ IDNO:23,29或35的序列；或包含与选自SEQ ID NO:23,29或35的序列的至少80％,至少85％,至少90％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性。
胞内信号传导域
如本文中描述的CAR包含胞内信号传导域。“胞内信号传导域”指CAR多肽中参与将有效CAR结合靶抗原的信息转导至免疫效应细胞的内部中以引发效应器细胞功能(例如活化,细胞因子生成,增殖,和细胞毒性活性,包括将细胞毒性因子释放至CAR结合的靶细胞,或在抗原结合胞外CAR域后引发的其它细胞应答)的部分。
CD3是一种在与适宜的共刺激(例如共刺激分子的结合)同时啮合时推动T淋巴细胞活化的T细胞共受体。CD3复合物由4条不同链组成；哺乳动物CD3由一条CD3γ链,一条CD3δ链,和两条CD3ε链组成。这些链与称作T细胞受体(TCR)和CD3ζ的分子联合以生成T淋巴细胞中的活化信号。完整的TCR复合物包含TCR,CD3ζ,和完整的CD3复合物。
在任何方面的一些实施方案中,本文中描述的CAR多肽包含包含来自CD3泽塔(CD3ζ)的免疫受体基于酪氨酸的活化基序或ITAM的胞内信号传导域。在任何方面的一些实施方案中,ITAM包含三个CD3ζ的ITAM的基序(ITAM3)。在任何方面的一些实施方案中,三个CD3ζ的ITAM的基序是突变的。
知道ITAM是主要信号传导域,其或是以刺激性方式或是以抑制性方式调节TCR复合物的主要活化。以刺激性方式起作用的主要信号传导域可以含有称作免疫受体基于酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在该技术中特别有用的含有ITAM的胞内信号传导域的非限制性例子包括那些自TCRζ,FcRγ,FcRβ,CD3γ,CD3θ,CD3δ,CD3ε,CD3ζ,CD22,CD79a,CD79b,和CD66d衍生的。
本领域技术人员会能够使用标准技术将突变引入至基因或基因产物的核酸序列中,例如ITAM。例如,可以经由定点诱变,PCR技术引入点突变。定点诱变试剂盒是商购可得的,例如经由New England Biolabs；Ipswich,MA。将点突变引入至基因或基因产物的核酸序列的备选方法的非限制性例子包括盒式诱变或全质粒诱变。
在一个实施方案中,CAR中利用的ITAM基于CD3ζ的备选,包括突变的来自CD3ζ的ITAM(其含有3个ITAM基序),CD3ζ的截短,和称作CD3ε,CD3θ的可变剪接变体,和改造成表达CD3ε或CD3θ和CD3ζ之间的融合物的人工构建物。
在一个实施方案中,CD3ζ胞内信号传导序列对应于选自SEQ ID NO:6或12的核苷酸序列；或包含选自SEQ ID NO:6或12的序列；或包含与选自SEQ ID NO:6或12的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中,CD3ζ胞内信号传导序列对应于选自SEQ ID NO:24或30的氨基酸序列；或包含选自SEQ IDNO:24或30的序列；或包含与选自SEQ ID NO:24或30的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。
在一个实施方案中,CD3θ胞内信号传导序列对应于SEQ ID NO:18的核苷酸序列；或包含SEQ ID NO:18的序列；或包含与SEQ ID NO:18的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中,CD3θ胞内信号传导序列对应于SEQ ID NO:36的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:36的序列；或包含与SEQ ID NO:36的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。
关于CAR和CAR T细胞的更加详细的描述可见于Maus et al.,Blood 2014,123:2624-35；Reardon et al.,Neuro-Oncology 2014,16:1441-1458；Hoyos et al.,Haematologica 2012,97:1622；Byrd et al.,J Clin Oncol 2014,32:3039-47；Maher etal.,Cancer Res 2009,69:4559-4562；和Tamada et al.,Clin Cancer Res2012,18:6436-6445；通过援引将其每一篇完整收入本文。
在一个实施方案中,CAR多肽进一步包含CD8前导序列。如本文中使用的,“前导序列”,也称作前导RNA,指mRNA中直接在起始密码子上游的区域。前导序列对于调节转录物的翻译可能是重要的。
在一个实施方案中,CD8前导序列对应于选自SEQ ID NO:2,8或14的核苷酸序列；或包含选自SEQ ID NO:2,8或14的序列；或包含与选自SEQ ID NO:2,8或14的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中,CD8前导序列对应于选自SEQ ID NO:20,26或32的氨基酸序列；或包含选自SEQ ID NO:20,26或32的序列；或包含与选自SEQ ID NO:20,26或32的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或至少100％序列同一性的序列。
在一个实施方案中,CAR进一步包含接头域。如本文中使用的,“接头域”指长度为自约2至100个氨基酸,将如本文中描述的CAR的任何域/区连接到一起的寡或多肽区域。在一些实施方案中,接头可以包括或构成为柔性残基,诸如甘氨酸和丝氨酸,使得邻近的蛋白域相对于彼此自由移动。当期望确保两个邻近域在空间上并不彼此干扰时,可以使用更长的接头。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割接头的例子包括2A接头(例如T2A),2A样接头或其功能等同物和其组合。在一个实施方案中,接头区是自Thosea asigna病毒衍生的T2A。接头的非限制性例子包括自Thosea asigna病毒衍生的接头,和自内部核糖体进入位点(IRES)序列衍生的接头。
在一个实施方案中,如本文中描述的CAR进一步包含报告分子,例如以允许非侵入性成像(例如正电子发射断层照相术PET扫描)。在包括报告分子的双特异性CAR中,第一胞外结合域和第二胞外结合域可以包括不同或相同的报告分子。在双特异性CAR T细胞中,第一CAR和第二CAR可以表达不同或相同的报告分子。在另一个实施方案中,如本文中描述的CAR进一步包含能单独或与底物或化学药品(例如9-[4-[18F]氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤([18F]FHBG))组合成像的报告分子(例如潮霉素磷酸转移酶(hph))。在另一个实施方案中,如本文中描述的CAR进一步包含能使用非侵入性技术容易地成像的纳米颗粒(例如用64Cu2+功能化的金纳米颗粒(GNP))。为了非侵入性成像标记CAR T细胞的综述见例如BhatnagarP,et al.,Integr.Biol.(Camb).2013Jan；5(1):231-238,和Keu KV,et al.,Sci TranslMed.2017Jan 18；9(373),通过援引将其完整收入本文。
GFP和mCherry在本文中证明是对于T细胞(例如CAR T细胞)上表达的CAR成像有用的荧光标签。预期本领域知道的本质上任何荧光蛋白可以作为用于这个目的的荧光标签使用。对于临床应用,CAR不需要包括荧光标签或荧光蛋白。
本发明的另一个方面涉及一种CAR多肽,其包含与选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或至少100％序列同一性的序列,或由包含与SEQ ID NO:1,7,或13的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或至少100％序列同一性的核苷酸序列的核酸编码。
本发明的另一个方面涉及一种CAR多肽,其包含选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列,或由包含选自SEQ ID NO:1,7,或13的核苷酸序列的核酸编码。
本发明的另一个方面涉及一种CAR多肽,其包含与选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列对应的序列,或由包含选自SEQ ID NO:1,7,或13的核苷酸序列的核酸编码。
本文中描述的发明的另一个方面涉及一种多肽复合物,其包含两个或更多个(例如两个或更多个,三个或更多个,四个或更多个,五个或更多个,六个或更多个,七个或更多个,八个或更多个,九个或更多个,或十个或更多个)本文中描述的任何CAR多肽。在一个实施方案中,多肽复合物包含三个本文中描述的任何CAR多肽。
本发明的另一个方面涉及一种哺乳动物细胞,其包含本文中描述的任何CAR多肽；或编码本文中描述的任何CAR多肽的核酸。在一个实施方案中,哺乳动物细胞包含抗体,抗体试剂,其抗原结合部分,或本文中描述的任何CAR多肽,或编码此类抗体,抗体试剂,其抗原结合部分,或本文中描述的任何CAR多肽的核酸。哺乳动物细胞或组织可以是人,灵长动物,仓鼠,家兔,啮齿动物,牛,猪,绵羊,马,山羊,犬或猫起源的,但是可以使用任何其它哺乳动物细胞。在任何方面的一个优选实施方案中,哺乳动物细胞是人。
在一个实施方案中,细胞是T细胞。在任何方面的备选实施方案中,细胞是免疫细胞。如本文中使用的,“免疫细胞”指在免疫应答中发挥作用的细胞。免疫细胞是造血起源的,而且包括淋巴细胞,诸如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞,诸如单核细胞,巨噬细胞,嗜曙红细胞,肥大细胞,嗜碱性细胞,和粒细胞。在一些实施方案中,细胞是T细胞；NK细胞；NKT细胞；淋巴细胞,诸如B细胞和T细胞；和髓样细胞,诸如单核细胞,巨噬细胞,嗜曙红细胞,肥大细胞,嗜碱性细胞,和粒细胞。
在一个实施方案中,细胞是自具有或诊断为具有癌症,浆细胞病症,或自身免疫性疾病的个体获得的。
如本文中使用的,“癌症”可以指其独特性状—丧失正常细胞控制—导致生长失调,缺乏分化,局部组织侵入,和转移的细胞的高度增殖,而且可以是白血病,淋巴瘤,多发性骨髓瘤,或实体瘤。白血病的非限制性例子包括急性髓样白血病(AML),慢性髓样白血病(CML),急性淋巴细胞性白血病(ALL),和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一个实施方案中,癌症是ALL或CLL。淋巴瘤的非限制性例子包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤,慢性淋巴细胞性白血病(CLL),小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤,伯基特淋巴瘤,毛细胞白血病(HCL)。在一个实施方案中,癌症是DLBCL或滤泡性淋巴瘤。实体瘤的非限制性例子包括肾上腺皮质肿瘤,泡状软组织肉瘤,癌瘤,软骨肉瘤,结肠直肠癌,硬纤维瘤,结缔组织增生性小圆细胞肿瘤,内分泌肿瘤,内胚层窦瘤,上皮样血管内皮瘤,尤因肉瘤,生殖细胞瘤(实体瘤),骨和软组织的巨细胞瘤,肝母细胞瘤,肝细胞癌,黑素瘤,肾瘤,神经母细胞瘤,非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTS),骨肉瘤,脊柱旁肉瘤,肾细胞癌,视网膜母细胞瘤,横纹肌肉瘤,滑膜肉瘤,和威尔姆斯瘤。实体瘤可以是在骨,肌肉,或器官中找到的,而且可以是肉瘤或癌瘤。涵盖的是可以使用本文中描述的发明的任何方面来治疗所有类型的癌症,包括本申请中没有列出的癌症。如本文中使用的,术语“肿瘤”指细胞或组织的异常生长,例如恶性类型或良性类型的。
如本文中使用的,“自身免疫性疾病或病症”特征在于一个人的免疫系统没有能力区分外来细胞和健康细胞。这导致一个人的免疫系统靶向一个人的健康细胞进行编程性细胞死亡。自身免疫性疾病或病症的非限制性例子包括炎性关节炎,1型糖尿病,多发性硬化,银屑病,炎性肠病,SLE,和血管炎,变应性炎症,诸如变应性哮喘,特应性皮炎,和接触过敏,类风湿性关节炎,多发性硬化(MS),系统性红斑狼疮(SLE),格雷夫斯氏病(甲状腺活动过度),桥本氏甲状腺炎(甲状腺活动不足),慢性移植物抗宿主病,带有针对凝固因子的抗体的血友病,乳糜泻,克罗恩氏病和溃疡性结肠炎,格巴二氏综合征,原发性胆汁性硬化/硬化症,硬化性胆管炎,自身免疫性肝炎,雷诺氏现象,硬皮病,斯耶格伦氏综合征,古德帕斯丘氏综合征,韦格纳氏肉芽肿病,风湿性多肌痛,颞动脉炎/巨细胞动脉炎,慢性疲劳综合征(CFS),银屑病,自身免疫性阿狄森氏病,强直性脊柱炎,急性散性脑脊髓炎,抗磷脂抗体综合征,再生障碍性贫血,特发性血小板减少性紫癜,重症肌无力,视性眼阵挛肌阵挛综合征,视神经炎,Ord氏甲状腺炎,天疱疮,恶性贫血,犬中的多关节炎,莱特尔氏综合征,高安氏动脉炎,温性自身免疫性溶血性贫血,韦格纳氏肉芽肿病,和纤维肌痛(FM)。
在一个实施方案中,为具有导致免疫系统活性异常低的免疫系统病症或阻碍一个人抗击外来细胞(即病毒或细菌细胞)的能力的免疫缺陷病症的患者获得哺乳动物细胞。
浆细胞是自发挥生成和释放抗击感染需要的抗体的功能的B淋巴细胞生成的白血细胞。如本文中使用的,“浆细胞病症或疾病”特征在于浆细胞增殖异常。异常浆细胞能够“挤出”健康浆细胞,这导致抗击外来物体(诸如病毒或细菌细胞)的能力降低。浆细胞病症的非限制性例子包括淀粉样变,瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症,骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征),意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS),和浆细胞骨髓瘤。
可以使用本领域知道的标准技术自受试者获得T细胞,例如,自抽取自患者的外周血分离T细胞。
可以改造细胞(例如T细胞)以包含本文中描述的任何CAR多肽；或编码本文中描述的任何CAR多肽的核酸。在一个实施方案中,本文中描述的CAR多肽包含在慢病毒载体中。使用感染标准技术使用慢病毒载体在细胞中表达CAR多肽。
逆转录病毒(诸如慢病毒)为投递编码基因或感兴趣嵌合基因的核酸序列提供方便的平台。可以使用本领域知道的技术将选定的核酸序列插入至载体中并在逆转录病毒颗粒中包装。然后可以分离重组病毒并投递至细胞,例如在体外或离体。逆转录病毒系统是本领域公知的且描述于例如美国专利No.5,219,740；Kurth and Bannert(2010)“Retroviruses:Molecular Biology,Genomics and Pathogenesis”Calster AcademicPress(ISBN:978-1-90455-55-4)；和Hu and Pathak,Pharmacological Reviews,2000,52:493-512；通过援引将其完整收入本文。用于有效DNA投递的慢病毒系统可以购自OriGene；Rockville,MD。在备选实施方案中,经由包含编码CAR的核酸的表达载体的转染或电穿孔在哺乳动物细胞中表达本文中描述的任何CAR的CAR多肽。本领域知道转染或电穿孔方法。
可以使用检测编码CAR的核酸的mRNA,DNA,或基因产物的标准测定法来评估本文中描述的任何CAR多肽的CAR多肽的有效表达。例如,RT-PCR,FACS,Northern印迹,Western印迹,ELISA,或免疫组织化学。
在一个实施方案中,组成性表达本文中描述的任何CAR多肽的CAR多肽。在一个实施方案中,由重组核酸序列编码本文中描述的任何CAR多肽的CAR多肽。
本文中描述的发明的一个方面涉及一种治疗受试者中的癌症,浆细胞病症,淀粉样变,或自身免疫性疾病的方法,该方法包含:改造T细胞以在该T细胞表面上包含本文中描述的任何CAR多肽；将经改造的T细胞施用于受试者。
本文中描述的发明的另一个方面涉及一种治疗受试者中的癌症,浆细胞病症,或自身免疫性疾病的方法,该方法包含施用包含本文中描述的任何CAR多肽或编码本文中描述的任何CAR多肽的核酸的细胞。
在一个实施方案中,该方法进一步包含在将细胞施用于受试者之前活化或刺激CAR-T,例如依照本文中别处描述的方法。
在一个实施方案中,癌细胞构成肿瘤抗原BAFF+,BCMA+,和/或TACI+癌症。在一个实施方案中,癌症是多发性骨髓瘤或冒烟型骨髓瘤。
施用
在一些实施方案中,本文中描述的方法涉及用包含本文中描述的任何CAR多肽或编码本文中描述的任何CAR多肽的核酸的哺乳动物细胞治疗具有或诊断为具有癌症,浆细胞疾病或病症,或自身免疫性疾病或病症的受试者。如本文中使用的,“如本文中描述的CART细胞”指包含本文中描述的任何CAR多肽或编码本文中描述的任何CAR多肽的核酸的哺乳动物细胞。如本文中使用的,“状况”指癌症,浆细胞疾病或病症,或自身免疫性疾病或病症。可以由内科医师使用当前诊断状况的方法来鉴定具有状况的受试者。表征这些状况且有助于诊断的状况的症状和/或并发症是本领域公知的且包括但不限于疲劳,持续感染,和持续出血。可能有助于诊断例如状况的测试包括但不限于血液筛选和骨髓测试,而且是本领域关于给定状况知道的。关于状况的家族史,或暴露于状况的风险因子也可能有助于确定受试者是否很可能具有状况或做出状况的诊断。
可以将本文中描述的组合物施用于具有或诊断为具有状况的受试者。在一些实施方案中,本文中描述的方法包含将有效量的本文中描述的活化的CAR T细胞施用于受试者以减轻状况的症状。如本文中使用的,“减轻状况的症状”是缓解任何状况或与状况有关的症状。与等同的未治疗的对照相比,此类降低是至少5％,10％,20％,40％,50％,60％,80％,90％,95％,99％或更多,如通过任何标准技术测量的。本领域技术人员知道用于将本文中描述的组合物施用于受试者的多种手段。在一个实施方案中,全身或局部施用本文中描述的组合物。在一个优选实施方案中,静脉内施用本文中描述的组合物。在另一个实施方案中,在肿瘤部位处施用本文中描述的组合物。
如本文中使用的,术语“有效量”指减轻疾病或病症的至少一种或多种症状需要的活化的CAR T细胞的量,而且涉及足够量的细胞制备物或组合物以提供期望的效果。因此,术语“治疗有效量”指在施用于典型的受试者时足以提供特定抗状况效果的活化的CAR T细胞的量。如本文中使用的,有效量在各种语境中还会包括足以延迟疾病的症状的发生,改变症状疾病的过程(例如但不限于减缓状况的进展),或逆转状况的症状的量。如此,规定确切的“有效量”一般是不切实际的。然而,对于任何给定情况,可以由本领域普通技术人员仅仅使用例行实验确定适宜的“有效量”。
可以通过标准药学规程在细胞培养物或实验动物中评估有效量,毒性,和治疗功效。剂量可以随采用的剂量形式和利用的施用路径而变化。毒性和治疗性效果之间的剂量比是治疗指数且可以表述为LD50/ED50比。展现较大治疗指数的组合物和方法是优选的。首先可以自细胞培养物测定法估算治疗有效剂量。还有,可以在动物模型中制定实现包括如在细胞培养物或适宜的动物模型中测定的IC50(即实现对症状的半最大抑制的活化的CART细胞的浓度)的循环血浆浓度范围的剂量。例如,可以通过高效液相层析术来测量血浆中的水平。可以通过合适的生物测定法来监测任何特定剂量的效果,例如用于骨髓测试的测定法,等等。可以由内科医师确定剂量并在必要时调整以适应观察到的治疗效果。
在本发明的一个方面,本文中描述的技术涉及药学组合物,其包含如本文中描述的活化的CAR T细胞,和任选地药学可接受载剂。药学组合物的活性组分最少包含如本文中描述的活化的CAR T细胞。在一些实施方案中,药学组合物的活性组分本质上由如本文中描述的活化的CAR T细胞组成。在一些实施方案中,药学组合物的活性组分由如本文中描述的活化的CAR T细胞组成。用于基于细胞的治疗性配制剂的药学可接受载剂包括盐水和水性缓冲溶液,林格氏溶液,和血清成分,诸如血清清蛋白,HDL,和LDL。诸如“赋形剂”,“载剂”,“药学可接受载剂”,等等术语在本文中可互换使用。
在一些实施方案中,包含如本文中描述的活化的CAR T细胞的药学组合物可以是胃肠外剂量形式。由于胃肠外剂量形式的施用典型地绕过患者针对污染物的天然防御,所以除了CAR T细胞自身以外的成分优选是无菌的或能够在施用于患者前灭菌。胃肠外剂量形式的例子包括但不限于准备好注射的溶液,准备好在用于注射的药学可接受媒介中溶解或悬浮的干燥产品,准备好注射的悬浮液,和乳状液。可以在施用前将任何这些添加至活化的CAR T细胞制备物。
可用于提供如本文中公开的活化的CAR T细胞的胃肠外剂量形式的合适媒介是本领域技术人员公知的。例子包括但不限于:盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介,包括但不限于氯化钠注射液,林格氏注射液,右旋糖注射液,右旋糖和氯化钠注射液,和乳酸化林格氏注射液；水混溶性媒介,诸如但不限于乙醇,聚乙二醇,和丙二醇；和非水性媒介,诸如但不限于玉米油,棉籽油,花生油,芝麻油,油酸乙酯,肉豆蔻酸异丙酯,和苯甲酸苯甲酯。
剂量
当该术语在本文中使用时,“单位剂量形式”指适合于一次施用的剂量。举例而言,单位剂量形式可以是配置在投递装置(例如注射器或静脉内滴注袋)中的治疗剂的量。在一个实施方案中,在单次施用中施用一个单位剂量形式。在另一个实施方案中,可以同时施用超过一个单位剂量形式。
在一些实施方案中,作为单一疗法施用本文中描述的活化的CAR T细胞,即没有对受试者并行施用针对状况的另一种治疗。
一般可以以104至109个细胞/kg体重,在一些情况中105至106个细胞/kg体重的剂量施用包含本文中描述的T细胞的药学组合物,包括那些范围内的所有整数值。如果有必要,还可以以这些剂量多次施用T细胞组合物。可以通过使用免疫疗法中普遍知道的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在某些方面,可能想要将活化的CAR T细胞施用于受试者,然后随后重新取出血液(或实施血液成分分离术),如本文中所述活化来自其中的T细胞,并对患者重新输注这些活化和扩充的T细胞。可以每几周进行这个过程多次。在某些方面,可以活化来自10cc至400cc的抽血的T细胞。在某些方面,活化来自20cc,30cc,40cc,50cc,60cc,70cc,80cc,90cc,或100cc的抽血的T细胞。
施用的模式可以包括例如静脉内(i.v.)注射或输注。可以将本文中描述的组合物经动脉,肿瘤内,结内,或髓内施用于患者。在一些实施方案中,可以将T细胞的组合物直接注射至肿瘤,淋巴结,或感染部位中。在一个实施方案中,将本文中描述的组合物施用至体腔或体液(例如腹水,胸膜液,腹膜液,或脑脊液)中。
在一个特定例示性方面,受试者可以经历白细胞分离术,其中收集白细胞,富集,或离体消减以选择和/或分离感兴趣细胞,例如T细胞。可以通过与如本文中描述的aAPC(例如表达如本文中描述的抗CD28和抗CD3CDR的aAPC)接触来扩充这些分离的T细胞并处理,使得可以引入本发明的一种或多种CAR构建物,由此产生CAR T细胞。有需要的受试者随后可以经历高剂量化疗的标准治疗,继以外周血干细胞移植。在移植后或与移植并行,受试者可以接受扩充的CAR T细胞的输注。在一个实施方案中,在手术之前或之后施用扩充的细胞。
在一些实施方案中,在施用如本文中描述的一种或多种CAR T细胞前对受试者实施淋巴消减。在此类实施方案中,淋巴消减可以包含施用美法仑,Cytoxan,环磷酰胺,和氟达拉滨中的一种或多种。
要施用于患者的上述治疗的剂量会随所治疗的状况的精确性质和治疗的接受者而变化。可以依照本领域公认的实践来实施用于人施用的剂量的缩放。
在一些实施方案中,需要单次治疗方案。在其它实施方案中,可以实施一个或多个后续剂量或治疗方案的施用。例如,在每两周治疗达三个月之后,可以每个月重复治疗一次,持续六个月或一年或更久。在一些实施方案中,在初始治疗后不施用另外的治疗。
可以由内科医师确定如本文中描述的组合物的剂量并在必要时调整以适应观察到的治疗效果。就治疗的持续时间和频率而言,典型地是熟练临床医生监测受试者以确定治疗何时提供治疗益处,及确定是否施用别的细胞,中止治疗,恢复治疗,或做出治疗方案的其它改变。剂量不应大到引起不良副作用,诸如细胞因子释放综合征。一般地,剂量会随患者的年龄,状况,和性别而变化且可以由本领域技术人员确定。还可以由内科医师个体在任何并发症的情况下调整剂量。
组合疗法
可以与其它已知的药剂和疗法组合使用本文中描述的活化的CAR T细胞。在一个实施方案中,对受试者进一步施用抗BCMA疗法。在一个实施方案中,受试者对抗BCMA疗法有抗性。如本文中使用的,“组合”施用意味着在受试者罹患病症的过程期间将两种(或更多种)不同治疗投递至受试者,例如在受试者已经诊断有病症之后和在病症已经治愈或消除或治疗已经出于其它原因而停止之前投递两种或更多种治疗。在一些实施方案中,一种治疗的投递在第二种治疗的投递开始时仍然正在发生,使得就施用而言有交叠。这在本文中有时称作“同时”或“并行投递”。在其它实施方案中,一种治疗的投递在其它治疗的投递开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中,治疗由于组合施用而更加有效。例如,第二种治疗更加有效,例如,对更少的第二种治疗看到等同的效果,或第二种治疗比在第一种治疗缺失下施用第二种治疗会看到的更大程度地减轻症状,或对第一种治疗看到类似的情况。在一些实施方案中,投递使得症状减轻,或其它与病症有关的参数大于对在其它治疗缺失下投递一种治疗会观察到的。两种治疗的效果可以是部分叠加,完全叠加,或大于叠加。投递可以使得所投递的第一种治疗的效果在投递第二种治疗时仍然可检测到。可以同时(在同一组合物中或在分开的组合物中)或顺序施用本文中描述的活化的CAR T细胞和至少一种另外的治疗剂。对于顺序施用,可以第一个施用本文中描述的CAR表达性细胞,而且可以第二个施用另外的药剂,或者可以颠倒施用的次序。可以在活动性病症时段期间,或在减退或活动性较低疾病时段期间施用CAR T疗法和/或其它治疗剂,规程,或模态。可以在另一种治疗之前,与治疗并行,治疗后,或在病症减退期间施用CAR T疗法。
在组合施用时,可以以比个别使用(例如作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高,更低,或相同的量或剂量施用活化的CAR T细胞和另外的药剂(例如第二种或第三种药剂),或所有。在某些实施方案中,施用的活化的CART细胞,另外的药剂(例如第二种或第三种药剂),或所有的量或剂量比个别使用的每种药剂的量或剂量更低(例如至少20％,至少30％,至少40％,或至少50％)。在其它实施方案中,导致期望效果(例如治疗癌症)的活化的CAR T细胞,另外的药剂(例如第二种或第三种药剂),或所有的量或剂量比实现相同治疗效果个别需要的每种药剂的量或剂量更低(例如低至少20％,至少30％,至少40％,或至少50％)。在别的实施方案中,可以在治疗方案中与手术,化疗,放射,mTOR途径抑制剂,免疫遏制剂,诸如环孢菌素,硫唑嘌呤,甲氨蝶呤,霉酚酸酯,和FK506,抗体,或其它免疫消融剂,诸如CAMPATH,抗CD3抗体或其它抗体疗法,cytoxin,氟达拉滨,雷帕霉素,霉酚酸,类固醇,FR901228,细胞因子,或肽疫苗(诸如Izumoto et al.,2008,J.Neurosurg.108:963-971中描述的)组合使用本文中描述的活化的CAR T细胞。
在一个实施方案中,可以与检查点抑制剂组合使用本文中描述的活化的CAR T细胞。例示性检查点抑制剂包括抗PD-1抑制剂(纳武单抗,MK-3475,派姆单抗,匹迪单抗,AMP-224,AMP-514),抗CTLA4抑制剂(伊匹单抗和曲美木单抗),抗PDL1抑制剂(阿特珠单抗,阿维单抗,MSB0010718C,MEDI4736,和MPDL3280A),和抗TIM3抑制剂。
在一个实施方案中,可以与化疗剂组合使用本文中描述的活化的CAR T细胞。例示性化疗剂包括蒽环类抗生素(例如多柔比星(例如脂质体多柔比星)),长春花生物碱(例如长春碱,长春新碱,长春地辛,长春瑞滨),烷化剂(例如环磷酰胺,达卡巴嗪,美法仑,异环磷酰胺,替莫唑胺),免疫细胞抗体(例如阿仑单抗,吉姆单抗,利妥昔单抗,托西莫单抗),抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂,嘧啶类似物,嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨)),mTOR抑制剂,TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂,蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A,胶霉毒素或硼替佐米),免疫调控剂诸如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺)。考虑供组合疗法中使用的一般化疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷,卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或),阿糖胞苷,胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(放线菌素D,Cosmegan),盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松,多西他赛盐酸多柔比星依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨,吉西他滨(二氟脱氧胞苷),羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶亚叶酸钙,美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌Mylotarg,帕利他赛Phoenix(钇90/MX-DTPA),喷司他丁,带有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤,塞替派,替拉扎明注射用盐酸托泊替康长春碱长春新碱和长春瑞滨例示性烷化剂包括但不限于氮芥,乙撑亚胺衍生物,烷基磺酸盐,亚硝基脲,和三氮烯):尿嘧啶芥(Aminouracil Uracil nitrogen ),氯甲川(chlormethine)环磷酰胺(RevimmuneTM),异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷(三乙撑蜜胺 三乙撑硫代磷酰胺,替莫唑胺塞替派白消安卡莫司汀洛莫司汀链佐星和达卡巴嗪另外的例示性烷化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称作放线菌素-D,)；美法仑(也称作L-PAM,L-溶肉瘤素,和苯丙氨酸芥,)；六甲蜜胺(也称作六甲基密胺(HMM),)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也称作CCNU,)；顺铂(也称作CDDP,和-AQ)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称作DTIC,DIC和咪唑羧酰胺,)；六甲蜜胺(也称作六甲基密胺(HMM),)；异环磷酰胺泼尼莫司汀；丙卡巴肼双氯乙基甲胺(也称作氮芥,莫司汀和盐酸双氯乙基甲胺,)；链佐星塞替派(也称作硫代磷酰胺,TESPA和TSPA,)；环磷酰胺 和盐酸苯达莫司汀例示性mTOR抑制剂包括例如替西罗莫司；ridaforolimus(正式称作地膦莫司,(1R,2R,45)-4-[(2R)-2[(1R,95,125,15R,16E,18R,19R,21R,235,24E,26E,28Z,305,325,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04'9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基膦酸酯,也称作AP23573和MK8669,且描述于PCT公开文本No.WO03/064383)；依维莫司(或RADOOI)；雷帕霉素(AY22989,)；塞马莫德(CAS 164301-51-3)；emsirolimus,(5-{2,4-双[(35,)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-(i]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[iraw5,-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-JJ嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-a-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ IDNO:84),内盐(SF1126,CAS 936487-67-1),和XL765。例示性免疫调控剂包括例如阿夫土珠单抗(可得自)；PEG非格司亭来那度胺(CC-5013,)；沙利度胺actimid(CC4047)；和IRX-2(人细胞因子的混合物,包括白介素1,白介素2,和干扰素γ,CAS951209-71-5,可得自IRX Therapeutics)。例示性蒽环类抗生素包括例如多柔比星(和)；博来霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素,道诺霉素,和盐酸红比霉素,)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体,)；米托蒽醌(DHAD,)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(Idamycin)；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；灰暗霉素；和脱乙酰基灰暗霉素。例示性长春花生物碱包括例如酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛长春碱(也称作硫酸长春碱,长春花碱和VLB,和)；和长春瑞滨例示性蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米卡菲佐米非(PX-171-007,(5)-4-甲基-N-((5)-1-(((5)-4-甲基-1-((R)-2-甲基氧杂环丙-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-2-((5,)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPT0052)；柠檬酸伊沙佐米(MLN-9708)；德兰佐米(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(11S')-2-[(2R)-2-甲基-2-氧杂环丙基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
本领域技术人员能容易地鉴定使用的化疗剂(例如参见Physicians'CancerChemotherapy Drug Manual 2014,Edward Chu,Vincent T.DeVita Jr.,Jones&BartlettLearning；Principles of Cancer Therapy,Chapter 85in Harrison’s Principles ofInternal Medicine,18th edition；Therapeutic Targeting of Cancer Cells:Era ofMolecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology,Chs.28-29in Abeloff’sClinical Oncology,2013Elsevier；和Fischer D S(ed):TheCancer ChemotherapyHandbook,4th ed.St.Louis,Mosby-Year Book,2003)。
在一个实施方案中,将本文中描述的活化的CAR T细胞与降低靶向GITR和/或调控GITR功能的分子的活性和/或水平的分子,减少Treg细胞群体的分子,mTOR抑制剂,GITR激动剂,激酶抑制剂,非受体酪氨酸激酶抑制剂,CDK4抑制剂,和/或BTK抑制剂组合施用于受试者。
功效
可以由熟练临床医生测定活化的CAR T细胞在例如治疗本文中描述的状况,或诱导如本文中描述的应答(例如癌细胞的减少)中的功效。然而,在该术语在本文中使用时,如果在依照本文中描述的方法的治疗后,本文中描述的状况的一种或多种体征或症状以有益方式改变,其它临床公认的症状改善,或甚至缓解,或诱导期望的应答,例如至少10％的话,认为治疗是“有效的治疗”。可以例如通过测量依照本文中描述的方法治疗的状况的标志物,指标,症状,和/或发生率或任何其它适宜的可测量参数来评估功效。依照本文中描述的方法的治疗能降低状况的标志物或症状的水平,例如至少10％,至少15％,至少20％,至少25％,至少30％,至少40％,至少50％,至少60％,至少70％,至少80％或至少90％或更多。
还可以通过个体没有如通过住院或需要医学干预评估的恶化(即疾病的进展停止)来测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员知道的和/或本文中描述的。
治疗包括个体或动物(一些非限制性例子包括人或动物)中的疾病的任何治疗且包括:(1)抑制疾病,例如预防症状(例如疼痛或炎症)恶化；或(2)减轻疾病的严重程度,例如引起症状消退。治疗疾病的有效量意味着该量在施用于有需要的受试者时足以对该疾病导致有效的治疗(如该术语在本文中定义的)。可以通过评估状况或期望应答的物理(physical)指标来测定药剂的功效。通过测量此类参数中的任一个,或参数的任何组合来监测施用和/或治疗的功效完全在本领域技术人员的能力内。可以在本文中描述的状况的动物模型中评估给定办法的功效,例如ALL的治疗。在使用实验性动物模型时,当观察到标志物的统计学显著变化时证明治疗的功效。
通过援引明确将贯穿本申请引用的所有专利和其它出版物(包括参考文献,已公告的专利,已公布的专利申请,和共同悬而未决的专利申请)收入本文,用于描述和公开例如此类出版物中描述的可能与本文中描述的技术联合使用方法学的目的。提供这些出版物仅仅因为它们在本申请的提交日前公开。在这点上任何内容不应解读为承认发明人没有资格凭借发明在先或出于任何其它原因而先于此类公开。所有关于这些文件的日期的声明或关于内容的陈述基于申请人可得的信息且不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
本公开的实施方案的描述并非意图是穷尽的或将本公开限制于所公开的精确形式。虽然本文中为了说明目的描述了本公开的具体实施方案和实施例,但是正如相关领域的技术人员会认识到的,在本公开的范围内各种等同修改是可能的。例如,虽然以给定次序呈现各方法步骤或功能,但是备选实施方案可以以不同次序实施各功能,或者可以实质性并行实施各功能。可以适当地将本文中提供的公开的教导应用于其它规程或方法。可以组合本文中描述的各种实施方案以提供别的实施方案。在必要时可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请中的组合物,功能和概念来提供本公开的还有别的实施方案。此外,由于生物学功能性等同性考虑,可以在蛋白质结构中做出一些变化而不在种类或量上影响生物学或化学作用。可以根据详述对本公开做出这些和其它变化。所有此类修改意图包括在所附权利要求的范围内。
可以组合任何前述实施方案的具体要件或替代其它实施方案中的要件。而且,虽然已经在这些实施方案的背景中描述了与本公开的某些实施方案有关的优点,但是其它实施方案也可能展现此类优点,而且并非所有实施方案必须展现此类优点才落在本公开的范围内。
通过下面的实施例进一步例示本文中描述的技术,它们绝不应当解读为进一步限制。
本文中描述的技术的一些实施方案可以依照任何下面编号的段落来限定:
1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽,其包含:
a)一个或多个包含肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体的部分的胞外域；
b)铰链和跨膜域；
c)共刺激域；和
d)胞内信号传导域。
2.段落1的CAR多肽,其中该TNF超家族受体配体是增殖诱导性配体(APRIL)。
3.段落1的CAR多肽,其中该TNF超家族受体配体是TNF-α,淋巴毒素β,OX40L,CD154,FasL,LIGHT,TL1A,CD70,Siva,CD153,4-1BB配体,TRAIL,RANKL,TWEAK,BAFF,CAMLG,LIGHT,NGF,BDNF,NT-3,NT-4,GITR配体,TL1A,或EDA-A2。
4.段落1-3任一项的CAR多肽,其进一步包含CD8前导序列。
5.段落4的CAR多肽,其中该CD8前导序列包含选自SEQ ID NO:20,26,或32的序列。
6.段落2,4,或5任一项的CAR多肽,其中该APRIL的部分不包含APRIL的富赖氨酸区。
7.段落2或4-6任一项的CAR多肽,其中该APRIL的部分包含选自SEQ ID NO:21,27,或33的序列。
8.段落1-7任一项的CAR多肽,其中该铰链和跨膜域包含CD8或4-1BB的铰链和跨膜域。
9.段落1-8任一项的CAR多肽,其中该CD8铰链和跨膜域序列包含SEQ ID NO:22的序列。
10.段落1-9任一项的CAR多肽,其中该4-1BB铰链和跨膜域序列包含选自SEQ IDNO:28或34的序列。
11.段落1-10任一项的CAR多肽,其中该胞内信号传导域包含CD3ξ,CD3ε,或CD3θ的信号传导域。
12.段落1-11任一项的CAR多肽,其中该CD3ξ胞内信号传导域序列包含选自SEQ IDNO:24或30的序列。
13.段落1-12任一项的CAR多肽,其中该CD3θ胞内信号传导域序列包含SEQ ID NO:36的序列。
14.段落1-13任一项的CAR多肽,其中该共刺激域是选自由4-1BB ICD,CD28ICD,CD27ICD,ICOS ICD,和OX40ICD组成的组的胞内域。
15.段落1-14任一项的CAR多肽,其中该共刺激域是4-1BB的胞内域。
16.段落15的CAR多肽,其中该4-1BB序列的胞内域包含选自SEQ ID NO:23,29,或35的序列。
17.段落1-16任一项的CAR多肽,其中该CAR多肽包含两个或更多个包含TNF超家族受体配体的部分的胞外域。
18.段落17的CAR多肽,其中该CAR多肽包含三个包含TNF超家族受体配体的部分的胞外域。
19.一种CAR多肽,其与选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列包含至少95％同一性,或由与选自SEQ ID NO:1,7,或13的序列包含至少95％同一性的序列编码。
20.一种CAR多肽,其包含选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列,或由选自SEQ IDNO:1,7,或13的序列编码。
21.一种CAR多肽,其包含与选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列对应的序列,或由选自SEQ ID NO:1,7,或13的序列编码。
22.一种多肽复合物,其包含两个或更多个段落1-21任一项的CAR多肽。
23.段落22的多肽复合物,其中该多肽复合物包含三个段落1-21任一项的CAR多肽。
24.一种哺乳动物细胞,其包含:
a)段落1-21任一项的CAR多肽；
b)编码段落1-21任一项的CAR多肽的核酸；或
c)段落22或23的多肽复合物。
25.段落24的细胞,其中该细胞是T细胞。
26.段落24或25的细胞,其中该细胞是人细胞。
27.段落24-26任一项的细胞,其中该细胞是自具有或诊断为具有癌症,浆细胞病症,或自身免疫性疾病的个体获得的。
28.一种治疗受试者中的癌症,浆细胞病症,淀粉样变,或自身免疫性疾病的方法,该方法包含:
a)改造T细胞以在该T细胞表面上包含段落1-21任一项的CAR；
b)将经改造的T细胞施用于受试者。
29.一种治疗受试者中的癌症,浆细胞病症,或自身免疫性疾病的方法,该方法包含将段落24-27任一项的细胞施用于受试者。
30.段落28或29的方法,其中该癌症是BAFF+,BCMA+和/或TACI+的。
31.段落28-30任一项的方法,其中对该受试者进一步施用抗BCMA疗法。
32.段落28-31任一项的方法,其中该受试者是对抗BCMA疗法有抗性的。
33.段落28-32任一项的方法,其中该癌症是多发性骨髓瘤或冒烟型骨髓瘤。
34.段落28-32任一项的方法,其中该自身免疫性疾病选自由带有针对凝固因子的抗体的血友病,重症肌无力,多发性硬化,和慢性移植物抗宿主病组成的组。
35.一种组合物,其包含段落1-2任一项的CAR多肽,段落22或23的多肽复合物,或段落24-27任一项的细胞,为了治疗癌症而配制。
36.段落35的组合物,其进一步包含药学可接受载剂。
实施例
实施例1
本文中描述基于与CD8或4-1BB的跨膜域和T细胞活化受体CD3泽塔,CD3伊塔,或CD3西塔的信号传导域融合的APRIL(一种增殖诱导性配体)的胞外域的嵌合抗原受体。这些CAR能克服对抗BCMA靶向疗法的抗性且利用二聚化和三聚化跨膜域实现最佳功能。这些CAR涵盖用于治疗癌症,例如多发性骨髓瘤,浆细胞病症,和/或重度自身免疫性疾病。
发明人考虑到可以使用BCMA的天然配体来改造抗原结合模块以生成抗骨髓瘤CART细胞。在表达BCMA,TACI,和/或BAFF受体的骨髓瘤细胞系中对基于scFv和天然配体(APRIL)的CAR T细胞比较细胞毒性活性,抗原特异性增殖,和细胞因子生成。
BCMA是一种小型III型跨膜蛋白,以低亲和力结合BAFF且以高亲和力结合APRIL48；BCMA信号传导保护骨髓瘤细胞免于凋亡49。BCMA具有两个亲密的家族成员:TACI和BAFF受体。TACI以相似水平且在B细胞发育的相似阶段表达,而与APRIL相比BAFF受体在B细胞发育的更早阶段表达且具有更高的对于结合BAFF的亲和力3。BCMA和TACI的胞内域均与TRAF相互作用,而且很可能在促进浆细胞存活中具有冗余的功能50。鉴于BCMA的表位结合区比反之小,特异性针对BCMA生成的抗体和scFv不太可能与TACI交叉反应。事实上,文献指示临床设置中的抗BCMA产品(抗体,scFv,或双特异性T细胞啮合剂)无一与BAFF受体或TACI交叉反应51。
设计具有新颖特异性的CAR T细胞的最大挑战之一是确定靶的肿瘤外表达。令人欣慰的是,已经认为抗BCMA产品在多种临床设置中是安全的,没有肿瘤外反应性的证据51。已经将针对BCMA的CAR T细胞产品与细胞因子释放综合征关联。然而,公众可得的来自TCGA,ENCODE,BLUEPRINT,和GTEX的数据指示BCMA和TACI的表达概况看来对于经由CAR T细胞的靶向是安全的(数据未显示)；两种分子无一由除了浆细胞和B细胞以外的健康成体组织表达,而且均在多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞性白血病中以高水平表达。而且,鉴于正在出现的关于接受抗CD19定向CAR T细胞的具有急性成淋巴细胞性白血病的患者中的抗原逃脱变体的数据33,52,53,开发结合具有相似表达概况和信号传导冗余的两种抗原的重新定向T细胞能提供一种避免逃脱变体的机制。
有三种推定方式来生成一种设计成与两种抗原反应的CAR。(1)生成与两种靶交叉反应的scFv。这种策略的危险在于杂乱的scFv可能还具有可能在临床前设置中难以预测的肿瘤外反应性。(2)生成由具有两种不同特异性的scFv串联构成的CAR。例如,针对CD19和CD2254和针对CD19和CD2055正在寻求这种策略。然而,必须凭经验确定两个scFv之间的最佳间距,而且交叉反应性双抗体-scFv的形成还可能导致脱靶结合。这种方法是可行的但具有挑战性且是昂贵的,尤其是因为必须独立生成并测试scFv,然后组成56。(3)开发结合两种受体的高亲和力配体并将它与嵌合抗原受体的剩余构件(跨膜和信号传导域)融合。在这种情况中,发明人意识到利用用APRIL的第三种办法的独特机会(图1)。
就使用APRIL作为用于CAR T细胞的胞外结合域而言,有四个潜在问题:(1)APRIL天然形成同三聚体,而认为基于scFv的CAR同二聚化43,57,58。不清楚APRIL同二聚体是否结合BCMA/TACI,或者CAR在它们形成三聚体的情况中是否能信号传导。值得注意的是,4-1BB也天然形成三聚体,但是包括4-1BB共刺激域的CAR构建物是高度有活性的,指示同二聚化和同三聚化TNF相关蛋白之间的功能灵活性。具有合适的对BCMA/TACI的结合的活性CAR的形成容易在体外经由用可溶性BCMA和TACI的流式细胞术,以及经由针对表达BCMA和TACI的靶细胞的细胞毒性测定法测试。(2)APRIL还结合与粘结蛋白聚糖(syndecan)家族的蛋白聚糖(包括CD138,粘结蛋白聚糖-1)(它们可能具有比TACI和BCMA更加散布的表达)有关的硫酸乙酰肝素链；如此,肿瘤外活性的可能性升高。具体而言,APRIL对硫酸乙酰肝素链的结合经由它N端中的富赖氨酸区发生,而TNF样区与BCMA和TACI受体相互作用59。在骨髓瘤细胞中,对CD138的结合能作为结合TACI的APRIL的共受体起作用60。由于APRIL CAR的推定结合和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖分子之间的距离,预期这种相互作用不会导致细胞毒性54,但是可以在表达CD138而无TACI或BCMA的细胞系中系统性检验这种预测。另外,能生成APRIL缺乏N端富赖氨酸区以避免结合硫酸乙酰肝素链的形式。(3)APRIL有推定的受体,尚未确认但假设它在上皮组织上表达61；这种相互作用会需要测试和模拟针对上皮细胞的APRIL-CAR定向活性。(4)天然APRIL序列自它的内源跨膜域切割,而且能促进骨髓瘤细胞中的存活信号传导；因此建议仅仅将APRIL的N端域(远离切割位点)锚定至CAR的跨膜和胞内域,从而避免自CART细胞脱落APRIL。
实验设计
本文中描述的是在我们的CAR骨架的背景中测试一小组对BCMA特异性的scFv序列,它们基于公开的鼠和噬菌体展示衍生的抗BCMA构建物的序列。另外,表征仅仅利用APRIL域结合BCMA和TACI的大部分胞外部分的基于APRIL的CAR。还描述的是N端截短型式的APRIL以消除结合硫酸乙酰肝素链的富赖氨酸区。接下来,在用生物素化可溶性BCMA-Ig和TACI-Ig(商购可得的)染色后经由流式细胞术使用两个基于scFv的和两个基于APRIL的CAR的慢病毒载体对原代T细胞测试CAR的表达。最后,通过自T细胞培养物收集上清液并经由ELISA测量可溶性APRIL,验证基于APRIL的CAR并不作为可溶性蛋白质分泌或切割APRIL。
经由慢病毒转导改造基于K562细胞的靶细胞系以单一和组合表达BAFF受体,BCMA,和TACI。改造表达CD138(粘结蛋白聚糖-1)的K562细胞以测试基于APRIL的CAR对这种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。这些系提供靶和抗原呈递细胞在其中对抗BCMA scFv-CAR和APRIL-CAR测试它们裂解BCMA和TACI表达性靶,和经历抗原特异性增殖的能力。对携带CD138的靶测试对APRIL-CAR介导的结合的敏感性和在肝素(其消除APRIL和硫酸乙酰肝素之间的结合60)存在和缺失下的毒性。通过以各种(E:T)比的共培养效应细胞与靶细胞来测量比裂解；还遗传修饰靶细胞以表达萤光素酶,使得能通过测量光发射来量化可存活靶细胞。
还通过使用可溶性BCMA和可溶性TACI作为要通过流式细胞术评估的CAR T细胞的染色试剂来测量结合CAR的交叉反应性。对抗BCMAscFv-CAR T细胞和APRIL-CAR T细胞测试它们响应呈递BCMA,TACI,或二者的靶而以抗原特异性方式增殖的能力。通过荧光染料CFSE的稀释,和通过在抗原刺激后1-2周过程里对T细胞计数来测量增殖。
最后,通过标准流式细胞术对来自具有多发性骨髓瘤的患者的原代人浆细胞检查它们的BCMA,TACI,和BAFF受体表达。MGH骨髓瘤小组具有来自具有多发性骨髓瘤的患者的骨髓标本的生物库,自其可以检查去鉴定样品。可以量化来自30名具有可测量的浆细胞负荷的患者的浆细胞中的BCMA,TACI,和BAFF-R水平。在可行时,共培养基于抗BCMA和APRIL的CAR T细胞与可存活原代骨髓瘤浆细胞；对共培养物评估骨髓瘤细胞的存活力和CAR T细胞的增殖。另外,可以检查已经接受基于抗BCMA scFv的CAR T细胞的患者的骨髓浆细胞中的BCMA和TACI表达水平。在这种情况中,在我们的地点治疗的患者中,可以在基线骨髓样品中和在治疗后1-3个月时或在复发时收集的骨髓样品中量化BCMA和TACI表达。
预期基于scFv的和基于APRIL的CAR转导的原代T细胞响应BCMA表达性靶细胞而发挥细胞毒性活性且增殖,它们是K562转导的细胞系,骨髓瘤细胞系,诸如U266和RPMI-8226,或原代患者骨髓瘤细胞。与之对比,只有基于APRIL的CAR针对仅仅表达TACI的细胞系发挥细胞毒性效应。基于APRIL的CAR结合可溶性型式的TACI和BCMA二者,而基于scFv的抗BCMACAR仅仅结合可溶性BCMA。
未转导的T细胞和CD19-CAR转导的T细胞预期并不响应BCMA表达性靶细胞或多发性骨髓瘤细胞系而展示细胞毒性活性；这些细胞充当阴性对照。基于APRIL的CAR预期并不分泌可溶性APRIL至培养液中；如果发生可检测的分泌的话,如通过上清液的ELISA或Luminex分析测量的,可以将CAR重新设计成备选型式(基于在TACI和BCMA之间交叉反应性的scFv),或包括APRIL的胞外远端(C端)部分的更少氨基酸域以进一步消除可能的切割位点。基于APRIL的和基于scFv的抗BCMA CAR预期响应BCMA表达性靶而产生相似水平的细胞因子生成,而且相似增殖,但是只有基于APRIL的CAR预期响应TACI表达性靶而生成IFNγ和IL-2。
由于结合位点之间的距离,基于APRIL的CAR预期并不在TACI或BCMA缺失下介导CD138表达靶的溶胞；会与基于抗CD138-scFv的CAR进行比较,其已经显示在体外和在体内消除骨髓瘤细胞系。然而,如果对基于APRIL的CAR没有观察到CD138定向细胞毒性的话,可以通过添加肝素以消除这种相互作用来验证硫酸乙酰肝素机制。本文中还描述N端截短型式的APRIL,从而消除富赖氨酸区但仅仅维持TNF样区作为CAR的胞外结合域。如果关于基于APRIL的CAR针对硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或上皮组织的潜在毒性有任何剩余问题的话,可以针对原代培养的角质形成细胞和在我们的皮肤移植物体内模型中测试细胞毒性。在这种模型中,给免疫缺陷小鼠移植人皮肤(来自整形外科或包皮环切的丢弃组织)并容许愈合。通过活检或移植物切除在组织病理学上监测CAR T细胞的皮肤毒性；皮肤毒性表现为淋巴细胞性浸润伴有破坏表皮/真皮连接和角质形成细胞凋亡,这是移植物抗宿主病的病征性体征。如果仍然担心基于APRIL的CAR T细胞的可能上皮毒性的话,可以在这种模型中评估基于APRIL的CAR的安全性。
在自具有多发性骨髓瘤的患者获得的骨髓样品中,预期确认浆细胞中高水平的TACI和BCMA表达,及较低水平的BAFF受体,如通过流式细胞术和适宜对照(荧光减去一)测定的。
实施例2:通过双重抗原靶向在多发性骨髓瘤中限制抗原逃脱
尽管最近治疗有进展,多发性骨髓瘤仍然是一种无法治愈的疾病。针对B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR T细胞的数项最新临床试验已经在具有多发性骨髓瘤的患者中导致临床应答,包括完全减退。然而,早已在一些患者中描述BCMA的抗原丧失所致的治疗失败。认为跨膜活化物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)在维持浆细胞存活中具有与BCMA冗余的作用,而且还在多发性骨髓瘤细胞上高度表达。在本文中描述的工作中,利用BCMA和TACI的天然配体APRIL作为CAR结合模块。该办法在多发性骨髓瘤中通过多种表面抗原的双重靶向预防抗原逃脱所致疾病复发(图3)。
材料和方法
用基于scFv的抗BCMA和携带不同铰链和跨膜域(CD8或4-1BB)的基于APRIL的CAR生成CAR构建物,均与4-1BB和CD3泽塔融合(图2)。经由慢病毒用抗BCMA-CAR或基于APRIL的CAR任一转导人原代T细胞。在体外针对具有不同BCMA和TACI表达水平的一组细胞系和在体内在多发性骨髓瘤的异种移植物模型中评估细胞毒性,增殖和细胞因子生成。
结果
对基于APRIL的CAR看到升高的响应BCMA+或TACI+靶细胞的活化。抗BCMA-CAR仅仅响应BCMA+靶细胞而活化。BCMA和APRIL-CD8铰链/跨膜CAR均展示抗原特异性细胞毒性。有趣的是,与抗BCMA-CAR相比对APRIL-CD8铰链/跨膜CAR发现更低水平的细胞因子生成。这项观察结果很可能反映使用APRIL或scFv作为CAR结合模块之间结合亲和力的差异。在APRIL-CAR中将铰链/跨膜域改变成4-1BB导致细胞毒性的降低和有限的细胞因子生成。使用异种移植物模型的正在进行的研究已经在用抗BCMA-CAR或APRIL-CD8铰链/跨膜CAR治疗的一些小鼠中显示完全肿瘤减退。
讨论
本文中描述的是CAR的设计,其基于天然配体APRIL,能够识别BCMA和TACI二者,从而限制多发性骨髓瘤中的潜在抗原逃脱。包括CD8铰链和跨膜区对于APRIL CAR功能是最佳的。尽管APRIL CAR有针对肿瘤细胞的细胞毒性功效,看到更低水平的效应器细胞因子生成。这是一项重要发现,因为CAR T细胞疗法能导致细胞因子释放综合征。
实施例3
在第0天用CD3/28珠刺激人T细胞并用编码APRIL-CD8TM-4-1BBzCAR的慢病毒载体转导,表达APRIL-CD8TM-4-1BBζCAR或BCMA-CD8TM-4-1BBζCAR。在第0天开始对细胞计数并将它们的生长作为群体倍增绘图(图4)。通过mCherry(报告物)阳性来测量转导效率(图5A-5B)。
将CAR转导的T细胞与经转导而表达萤光素酶的靶BCMA+ TACI+多细胞(RMPI-8226)一起温育18小时。以所示效应:靶比计算靶细胞的比裂解(图6)。
在NFAT启动子后面表达萤光素酶的Jurkat细胞系中测试CAR介导的T细胞活化(图7)。
实施例4
在多发性骨髓瘤细胞系中测量BCMA和TACI的表面表达(图8),并改造RPMI8226以表达各种水平的BCMA(图9)。将TACI转导至RPMI-BCMA KO中。
设计多种APRIL和BCMA CAR构建物并展现有效转导T细胞(图10)。表达CAR的T细胞在用BCMA表达性细胞刺激后扩充(图11)。APRIL-CAR表达性T细胞展现对表达BCMA和TACI的细胞的特异性杀伤(图12)且活化是类似特异性的(图13)。
BCMA和APRIL CAR响应用RPMI8226亲本刺激而脱粒(图14)。APRILCAR的细胞因子概况在图15中描绘。
实施例5–构建物序列
pMGH71–APRIL/CD8TM/4-1BB/CD3ζ(SEQ ID NO:1)包含:CD8前导(核苷酸1-63(SEQID NO:2))；APRIL序列(核苷酸64-471(SEQ ID NO:3))；CD8铰链和TM序列(核苷酸472-678(SEQ ID NO:4))；4-1BB ICD序列(核苷酸679-804(SEQ ID NO:5))；和CD3泽塔序列(核苷酸805-1140(SEQ ID NO:6))。ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(SEQ ID NO:1)
CD8前导(SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:1的核苷酸1-63)
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC(SEQID NO:2)
APRIL序列SEQ ID NO:3(SEQ ID NO:1的核苷酸64-471)
CACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTG(SEQ ID NO:3)
CD8铰链和TM序列(SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:1的核苷酸472-678))
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT(SEQ ID NO:4)
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AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG(SEQ ID NO:5)
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pMGH76–APRIL/4-1BBTM/4-1BB/CD3ζ(SEQ ID NO:7)包含CD8前导(核苷酸1-63(SEQ ID NO:8))；APRIL序列(核苷酸64-471(SEQ ID NO:9))；4-1BB铰链和TM序列(核苷酸472-633(SEQ ID NO:10))；4-1BB ICD序列(核苷酸634-759(SEQ ID NO:11))；CD3泽塔序列(核苷酸760-1095(SEQ ID NO:12))。
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTGCCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(SEQ ID NO:7)
CD8前导序列(SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:7的核苷酸1-63))
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC(SEQID NO:8)
APRIL序列(SEQ ID NO:9(SEQ ID NO:7的核苷酸64-471))
CACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTG(SEQ ID NO:9)
4-1BB铰链和TM序列(SEQ ID NO:10(SEQ ID NO:7的核苷酸472-633))CCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTT(SEQ ID NO:10)
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AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG(SEQ ID NO:11)
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CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(SEQ ID NO:12)
pMGH77–APRIL/4-1BBTM/4-1BB/CD3θ(SEQ ID NO:13)包含CD8前导(核苷酸1-63(SEQ ID NO:14))；APRIL序列(核苷酸64-471(SEQ ID NO:15))；4-1BB铰链和TM序列(核苷酸472-633(SEQ ID NO:16))；4-1BB ICD序列(核苷酸634-759(SEQ ID NO:17))；CD3西塔序列(核苷酸760-1200)(SEQ ID NO:18))。
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTGCCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGACAGCCACTTCCAAGCAGTTCCAGTACAGGAAAAGAAAAAAAGGCTCAGAAGGGCACCGTGGCGTGCATTCGCCCAGCCCCAGAGGTTAAAGCACCGAAACAATGAACTACCTGACTCCCTAGAGCCCATATATAAAAACATTTGGAACAAAACATTTATAGGAGAG(SEQ IDNO:13)
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ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC(SEQID NO:14)
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4-1BB铰链和TM序列(SEQ ID NO:16(SEQ ID NO:13的核苷酸472-633))
CCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTT(SEQ ID NO:16)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:17(SEQ ID NO:13的核苷酸634-759))
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG(SEQ ID NO:17)
CD3西塔序列(SEQ ID NO:18(SEQ ID NO:13的核苷酸760-1200))
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGACAGCCACTTCCAAGCAGTTCCAGTACAGGAAAAGAAAAAAAGGCTCAGAAGGGCACCGTGGCGTGCATTCGCCCAGCCCCAGAGGTTAAAGCACCGAAACAATGAACTACCTGACTCCCTAGAGCCCATATATAAAAACATTTGGAACAAAACATTTATAGGAGAG(SEQ IDNO:18)
实施例6
如本文中别处描述的,特定残基牵涉对BCMA/TACI的结合,即:APRIL的D132,T175,D205,R206,R231。那些残基的定位在下文以粗体描绘。
pMGH71-CD8前导/APRIL/CD8铰链+TM/4-1BB/CD3z(SEQ ID NO:19)包含CD8前导(氨基酸1-21(SEQ ID NO:20))；APRIL序列(氨基酸22-157(SEQ ID NO:21))；CD8铰链和TM序列(氨基酸158-226(SEQ ID NO:22))；4-1BBICD序列(氨基酸227-268(SEQ ID NO:23))；CD3泽塔序列(氨基酸269-380)(SEQ ID NO:24))。
MALPVTALLLPLALLLHAARPHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:19)
CD8前导序列(SEQ ID NO:20(SEQ ID NO:19的氨基酸1-21))
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:20)
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HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ IDNO:21)
CD8铰链和TM序列(SEQ ID NO:22(SEQ ID NO:19的氨基酸158-226))TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:22)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:23(SEQ ID NO:19的氨基酸227-268))
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:23)
CD3泽塔序列(SEQ ID NO:24(SEQ ID NO:19的氨基酸269-380))
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pMGH76-CD8前导/APRIL/4-1BB铰链+TM/4-1BB/CD3z(SEQ ID NO:25)包含CD8前导(氨基酸1-21(SEQ ID NO:26))；APRIL序列(氨基酸22-157(SEQ ID NO:27))；4-1BB铰链和TM序列(氨基酸158-211(SEQ ID NO:28))；4-1BB ICD序列(氨基酸212-253(SEQ ID NO:29))；CD3泽塔序列(氨基酸254-365(SEQ ID NO:30))。
MALPVTALLLPLALLLHAARPHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:25)
CD8前导序列(SEQ ID NO:26(SEQ ID NO:25的氨基酸1-21))
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:26)
APRIL序列(SEQ ID NO:27(SEQ ID NO:25的氨基酸22-157))
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ IDNO:27)
4-1BB铰链和TM序列(SEQ ID NO:28(SEQ ID NO:25的氨基酸158-211))
PSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV(SEQ ID NO:28)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:29(SEQ ID NO:25的氨基酸212-253))
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:29)
CD3泽塔序列(SEQ ID NO:30(SEQ ID NO:25的氨基酸254-365)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:30)
pMGH77-CD8前导/APRIL/4-1BB铰链+TM/4-1BB/CD3θ(SEQ ID NO:31)包含CD8前导(氨基酸1-21(SEQ ID NO:32))；APRIL序列(氨基酸22-157(SEQ ID NO:33))；4-1BB铰链和TM序列(氨基酸158-211(SEQ ID NO:34))；4-1BB ICD序列(氨基酸212-253(SEQ ID NO:35))；CD3西塔序列(氨基酸254-400)(SEQ ID NO:36))。
MALPVTALLLPLALLLHAARPHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQDSHFQAVPVQEKKKRLRRAPWRAFAQPQRLKHRNNELPDSLEPIYKNIWNKTFIGE(SEQ ID NO:31)
CD8前导序列(SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:31的氨基酸1-21))
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:32)
APRIL序列(SEQ ID NO:33(SEQ ID NO:31的氨基酸22-157))
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ IDNO:33)
4-1BB铰链和TM序列(SEQ ID NO:34(SEQ ID NO:31的氨基酸158-211))
PSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV(SEQ ID NO:34)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:35(SEQ ID NO:31的氨基酸212-253))
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:35)
CD3西塔序列(SEQ ID NO:36(SEQ ID NO:31的氨基酸254-400))
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQDSHFQAVPVQEKKKRLRRAPWRAFAQPQRLKHRNNELPDSLEPIYKNIWNKTFIGE(SEQ ID NO:36)
实施例7
增强靶向多聚体抗原的CAR的配体寡聚化
在这项研究中描述的工作中,使用天然寡聚化(例如同三聚化)来开发基于配体的CAR,其具有升高的针对表达它们的关联受体的细胞的活性。知道细胞表面受体的某些配体(包括TNF超家族的配体)寡聚化(例如三聚化)以结合它们的关联受体。例如,如上文描述的,知道人骨髓瘤表达两种可以为了有效抗肿瘤抗原而靶向的表面抗原:BCMA和TACI。BCMI和TACI分享共同的配体,APRIL,其是一种紧密的自我形成的三聚体,以纳摩尔亲和力结合TACI和BCMA。
设计并构建同三聚体APRIL CAR构建物(图16)。这种构建物在本文中称作“TriPRIL CAR”且包括经由接头连接的三个串联APRIL多肽,CD8铰链/跨膜域(CD8TM),4-1BB胞内域(4-1BB),和CD3ζ胞内域(CD3ζ)。这种构建物与启动子(例如EF1α启动子)可操作连接。
评估TriPRIL CAR构建物转导至原代人T细胞中的效率(图17)。与未转导对照的大约0.46％相比,大约22.6％的细胞是mCherry阳性的。因此,可以将TriPRIL CAR构建物转导至原代人T细胞中。
TriPRIL CAR表达性T细胞展现对表达BCMA和TACI细胞的特异性杀伤(图18)。因此,TriPRIL CAR对于治疗表达BCMA,TACI,和/或BAFF受体的肿瘤,例如骨髓瘤是有用的治疗剂。
可以使用使用其它自我寡聚化配体(例如TNF超家族配体(例如TNF-α,淋巴毒素β,OX40L,CD154,FasL,LIGHT,TL1A,CD70,Siva,CD153,4-1BB配体,TRAIL,RANKL,TWEAK,BAFF,CAMLG,LIGHT,NGF,BDNF,NT-3,NT-4,GITR配体,TL1A,或EDA-A2))的类似CAR构建物靶向对不想要的表达关联受体的细胞,例如肿瘤细胞的杀伤。
序列表
<110> 综合医院公司（THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION）
<120> 表达嵌合抗原受体的T细胞
<130> 51295-008WO4
<150> US 62/580,258
<151> 2017-11-01
<150> US 62/516,279
<151> 2017-06-07
<150> US 62/444,622
<151> 2017-01-10
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 1
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccccactctg tcctgcacct ggttcccatt aacgccacct ccaaggatga ctccgatgtg 120
acagaggtga tgtggcaacc agctcttagg cgtgggagag gcctacaggc ccaaggatat 180
ggtgtccgaa tccaggatgc tggagtttat ctgctgtata gccaggtcct gtttcaagac 240
gtgactttca ccatgggtca ggtggtgtct cgagaaggcc aaggaaggca ggagactcta 300
ttccgatgta taagaagtat gccctcccac ccggaccggg cctacaacag ctgctatagc 360
gcaggtgtct tccatttaca ccaaggggat attctgagtg tcataattcc ccgggcaagg 420
gcgaaactta acctctctcc acatggaacc ttcctggggt ttgtgaaact gaccactacc 480
ccagcaccga ggccacccac cccggctcct accatcgcct cccagcctct gtccctgcgt 540
ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg gccgtgcata cccggggtct tgacttcgcc 600
tgcgatatct acatttgggc ccctctggct ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc 660
gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc 720
ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag gaggacggct gttcatgccg gttcccagag 780
gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc 840
taccaacagg ggcagaacca gctctacaac gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac 900
gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag 960
aatccccaag agggcctgta caacgagctc caaaaggata agatggcaga agcctatagc 1020
gagattggta tgaaagggga acgcagaaga ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga 1080
ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg 1140
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 2
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 3
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 3
cactctgtcc tgcacctggt tcccattaac gccacctcca aggatgactc cgatgtgaca 60
gaggtgatgt ggcaaccagc tcttaggcgt gggagaggcc tacaggccca aggatatggt 120
gtccgaatcc aggatgctgg agtttatctg ctgtatagcc aggtcctgtt tcaagacgtg 180
actttcacca tgggtcaggt ggtgtctcga gaaggccaag gaaggcagga gactctattc 240
cgatgtataa gaagtatgcc ctcccacccg gaccgggcct acaacagctg ctatagcgca 300
ggtgtcttcc atttacacca aggggatatt ctgagtgtca taattccccg ggcaagggcg 360
aaacttaacc tctctccaca tggaaccttc ctggggtttg tgaaactg 408
<210> 4
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 4
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 180
ctttcactcg tgatcactct ttactgt 207
<210> 5
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 5
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 6
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 6
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc aacaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 7
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 7
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccccactctg tcctgcacct ggttcccatt aacgccacct ccaaggatga ctccgatgtg 120
acagaggtga tgtggcaacc agctcttagg cgtgggagag gcctacaggc ccaaggatat 180
ggtgtccgaa tccaggatgc tggagtttat ctgctgtata gccaggtcct gtttcaagac 240
gtgactttca ccatgggtca ggtggtgtct cgagaaggcc aaggaaggca ggagactcta 300
ttccgatgta taagaagtat gccctcccac ccggaccggg cctacaacag ctgctatagc 360
gcaggtgtct tccatttaca ccaaggggat attctgagtg tcataattcc ccgggcaagg 420
gcgaaactta acctctctcc acatggaacc ttcctggggt ttgtgaaact gccatctcca 480
gccgacctct ctccgggagc atcctctgtg accccgcctg cccctgcgag agagccagga 540
cactctccgc agatcatctc cttctttctt gcgctgacgt cgactgcgtt gctcttcctg 600
ctgttcttcc tcacgctccg tttctctgtt gttaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 660
atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 720
tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc 780
gcagatgctc cagcctacca acaggggcag aaccagctct acaacgaact caatcttggt 840
cggagagagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggac gggacccaga aatgggcggg 900
aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg 960
gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac 1020
ggactgtacc agggactcag caccgccacc aaggacacct atgacgctct tcacatgcag 1080
gccctgccgc ctcgg 1095
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 8
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 9
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 9
cactctgtcc tgcacctggt tcccattaac gccacctcca aggatgactc cgatgtgaca 60
gaggtgatgt ggcaaccagc tcttaggcgt gggagaggcc tacaggccca aggatatggt 120
gtccgaatcc aggatgctgg agtttatctg ctgtatagcc aggtcctgtt tcaagacgtg 180
actttcacca tgggtcaggt ggtgtctcga gaaggccaag gaaggcagga gactctattc 240
cgatgtataa gaagtatgcc ctcccacccg gaccgggcct acaacagctg ctatagcgca 300
ggtgtcttcc atttacacca aggggatatt ctgagtgtca taattccccg ggcaagggcg 360
aaacttaacc tctctccaca tggaaccttc ctggggtttg tgaaactg 408
<210> 10
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 10
ccatctccag ccgacctctc tccgggagca tcctctgtga ccccgcctgc ccctgcgaga 60
gagccaggac actctccgca gatcatctcc ttctttcttg cgctgacgtc gactgcgttg 120
ctcttcctgc tgttcttcct cacgctccgt ttctctgttg tt 162
<210> 11
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 11
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 12
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 12
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc aacaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 13
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 13
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccccactctg tcctgcacct ggttcccatt aacgccacct ccaaggatga ctccgatgtg 120
acagaggtga tgtggcaacc agctcttagg cgtgggagag gcctacaggc ccaaggatat 180
ggtgtccgaa tccaggatgc tggagtttat ctgctgtata gccaggtcct gtttcaagac 240
gtgactttca ccatgggtca ggtggtgtct cgagaaggcc aaggaaggca ggagactcta 300
ttccgatgta taagaagtat gccctcccac ccggaccggg cctacaacag ctgctatagc 360
gcaggtgtct tccatttaca ccaaggggat attctgagtg tcataattcc ccgggcaagg 420
gcgaaactta acctctctcc acatggaacc ttcctggggt ttgtgaaact gccatctcca 480
gccgacctct ctccgggagc atcctctgtg accccgcctg cccctgcgag agagccagga 540
cactctccgc agatcatctc cttctttctt gcgctgacgt cgactgcgtt gctcttcctg 600
ctgttcttcc tcacgctccg tttctctgtt gttaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 660
atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 720
tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc 780
gcagatgctc cagcctacca acaggggcag aaccagctct acaacgaact caatcttggt 840
cggagagagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggac gggacccaga aatgggcggg 900
aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg 960
gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac 1020
ggactgtacc aggacagcca cttccaagca gttccagtac aggaaaagaa aaaaaggctc 1080
agaagggcac cgtggcgtgc attcgcccag ccccagaggt taaagcaccg aaacaatgaa 1140
ctacctgact ccctagagcc catatataaa aacatttgga acaaaacatt tataggagag 1200
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 14
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 15
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 15
cactctgtcc tgcacctggt tcccattaac gccacctcca aggatgactc cgatgtgaca 60
gaggtgatgt ggcaaccagc tcttaggcgt gggagaggcc tacaggccca aggatatggt 120
gtccgaatcc aggatgctgg agtttatctg ctgtatagcc aggtcctgtt tcaagacgtg 180
actttcacca tgggtcaggt ggtgtctcga gaaggccaag gaaggcagga gactctattc 240
cgatgtataa gaagtatgcc ctcccacccg gaccgggcct acaacagctg ctatagcgca 300
ggtgtcttcc atttacacca aggggatatt ctgagtgtca taattccccg ggcaagggcg 360
aaacttaacc tctctccaca tggaaccttc ctggggtttg tgaaactg 408
<210> 16
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 16
ccatctccag ccgacctctc tccgggagca tcctctgtga ccccgcctgc ccctgcgaga 60
gagccaggac actctccgca gatcatctcc ttctttcttg cgctgacgtc gactgcgttg 120
ctcttcctgc tgttcttcct cacgctccgt ttctctgttg tt 162
<210> 17
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 17
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 18
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 18
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc aacaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac caggacagcc acttccaagc agttccagta 300
caggaaaaga aaaaaaggct cagaagggca ccgtggcgtg cattcgccca gccccagagg 360
ttaaagcacc gaaacaatga actacctgac tccctagagc ccatatataa aaacatttgg 420
aacaaaacat ttataggaga g 441
<210> 19
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 19
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala
20 25 30
Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala
35 40 45
Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp
65 70 75 80
Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg
85 90 95
Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp
100 105 110
Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln
115 120 125
Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn
130 135 140
Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Thr Thr Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
165 170 175
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
180 185 190
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
195 200 205
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
210 215 220
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
225 230 235 240
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
245 250 255
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
260 265 270
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
275 280 285
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
290 295 300
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
305 310 315 320
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
325 330 335
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
340 345 350
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
355 360 365
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 20
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 21
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 21
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
130 135
<210> 22
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 22
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 23
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 23
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 24
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 25
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 25
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala
20 25 30
Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala
35 40 45
Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp
65 70 75 80
Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg
85 90 95
Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp
100 105 110
Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln
115 120 125
Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn
130 135 140
Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Pro Ser Pro
145 150 155 160
Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala
165 170 175
Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu
180 185 190
Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe
195 200 205
Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
245 250 255
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
275 280 285
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
290 295 300
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
305 310 315 320
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
325 330 335
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
340 345 350
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 27
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 27
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
130 135
<210> 28
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 28
Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe
20 25 30
Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr
35 40 45
Leu Arg Phe Ser Val Val
50
<210> 29
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 29
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 30
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 31
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 31
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala
20 25 30
Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala
35 40 45
Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp
65 70 75 80
Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg
85 90 95
Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp
100 105 110
Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln
115 120 125
Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn
130 135 140
Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Pro Ser Pro
145 150 155 160
Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala
165 170 175
Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu
180 185 190
Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe
195 200 205
Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
245 250 255
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
275 280 285
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
290 295 300
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
305 310 315 320
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
325 330 335
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Asp Ser His Phe Gln Ala Val Pro
340 345 350
Val Gln Glu Lys Lys Lys Arg Leu Arg Arg Ala Pro Trp Arg Ala Phe
355 360 365
Ala Gln Pro Gln Arg Leu Lys His Arg Asn Asn Glu Leu Pro Asp Ser
370 375 380
Leu Glu Pro Ile Tyr Lys Asn Ile Trp Asn Lys Thr Phe Ile Gly Glu
385 390 395 400
<210> 32
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 32
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 33
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 33
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
130 135
<210> 34
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 34
Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe
20 25 30
Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr
35 40 45
Leu Arg Phe Ser Val Val
50
<210> 35
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 35
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 36
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 36
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Asp Ser His Phe Gln
85 90 95
Ala Val Pro Val Gln Glu Lys Lys Lys Arg Leu Arg Arg Ala Pro Trp
100 105 110
Arg Ala Phe Ala Gln Pro Gln Arg Leu Lys His Arg Asn Asn Glu Leu
115 120 125
Pro Asp Ser Leu Glu Pro Ile Tyr Lys Asn Ile Trp Asn Lys Thr Phe
130 135 140
Ile Gly Glu
145
<210> 37
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 37
Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp
1 5 10 15
Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu
20 25 30
Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu
35 40 45
Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln
50 55 60
Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys
65 70 75 80
Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr
85 90 95
Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile
100 105 110
Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe
115 120 125
Leu Gly Phe Val
130

Claims (36)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽,其包含:
a)一个或多个包含肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体的部分的胞外域；
b)铰链和跨膜域；
c)共刺激域；和
d)胞内信号传导域。
2.权利要求1的CAR多肽,其中该TNF超家族受体配体是增殖诱导性配体(APRIL)。
3.权利要求1的CAR多肽,其中该TNF超家族受体配体是TNF-α,淋巴毒素β,OX40L,CD154,FasL,LIGHT,TL1A,CD70,Siva,CD153,4-1BB配体,TRAIL,RANKL,TWEAK,BAFF,CAMLG,LIGHT,NGF,BDNF,NT-3,NT-4,GITR配体,TL1A,或EDA-A2。
4.权利要求1的CAR多肽,其进一步包含CD8前导序列。
5.权利要求4的CAR多肽,其中该CD8前导序列包含选自SEQ ID NO:20,26,或32的序列。
6.权利要求2的CAR多肽,其中该APRIL的部分不包含APRIL的富赖氨酸区。
7.权利要求2的CAR多肽,其中该APRIL的部分包含选自SEQ ID NO:21,27,或33的序列。
8.权利要求1的CAR多肽,其中该铰链和跨膜域包含CD8或4-1BB的铰链和跨膜域。
9.权利要求1的CAR多肽,其中该CD8铰链和跨膜域序列包含SEQ ID NO:22的序列。
10.权利要求1的CAR多肽,其中该4-1BB铰链和跨膜域序列包含选自SEQ ID NO:28或34的序列。
11.权利要求1的CAR多肽,其中该胞内信号传导域包含CD3ξ,CD3ε,或CD3θ的信号传导域。
12.权利要求1的CAR多肽,其中该CD3ξ胞内信号传导域序列包含选自SEQ ID NO:24或30的序列。
13.权利要求1的CAR多肽,其中该CD3θ胞内信号传导域序列包含SEQ ID NO:36的序列。
14.权利要求1的CAR多肽,其中该共刺激域是选自由4-1BB ICD,CD28 ICD,CD27 ICD,ICOS ICD,和OX40 ICD组成的组的胞内域。
15.权利要求1的CAR多肽,其中该共刺激域是4-1BB的胞内域。
16.权利要求15的CAR多肽,其中该4-1BB序列的胞内域包含选自SEQ ID NO:23,29,或35的序列。
17.权利要求1的CAR多肽,其中该CAR多肽包含两个或更多个包含TNF超家族受体配体的部分的胞外域。
18.权利要求17的CAR多肽,其中该CAR多肽包含三个包含TNF超家族受体配体的部分的胞外域。
19.一种CAR多肽,其与选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列包含至少95％同一性,或由与选自SEQ ID NO:1,7,或13的序列包含至少95％同一性的序列编码。
20.一种CAR多肽,其包含选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列,或由选自SEQ ID NO:1,7,或13的序列编码。
21.一种CAR多肽,其包含与选自SEQ ID NO:19,25,或31的序列对应的序列,或由选自SEQ ID NO:1,7,或13的序列编码。
22.一种多肽复合物,其包含两个或更多个权利要求1的CAR多肽。
23.权利要求22的多肽复合物,其中该多肽复合物包含三个权利要求1-21任一项的CAR多肽。
24.一种哺乳动物细胞,其包含:
a)权利要求1的CAR多肽；
b)编码权利要求1的CAR多肽的核酸；或
c)包含两个或更多个权利要求1的CAR多肽的多肽复合物。
25.权利要求24的细胞,其中该细胞是T细胞。
26.权利要求24的细胞,其中该细胞是人细胞。
27.权利要求24的细胞,其中该细胞是自具有或诊断为具有癌症,浆细胞病症,或自身免疫性疾病的个体获得的。
28.一种治疗受试者中的癌症,浆细胞病症,淀粉样变,或自身免疫性疾病的方法,该方法包含:
a)改造T细胞以在该T细胞表面上包含权利要求1的CAR；
b)将经改造的T细胞施用于受试者。
29.一种治疗受试者中的癌症,浆细胞病症,或自身免疫性疾病的方法,该方法包含将权利要求24的细胞施用于受试者。
30.权利要求29的方法,其中该癌症是BAFF+,BCMA+和/或TACI+的。
31.权利要求29的方法,其中对该受试者进一步施用抗BCMA疗法。
32.权利要求29的方法,其中该受试者是对抗BCMA疗法有抗性的。
33.权利要求29的方法,其中该癌症是多发性骨髓瘤或冒烟型骨髓瘤(smolderingmyeloma)。
34.权利要求29的方法,其中该自身免疫性疾病选自由带有针对凝固因子的抗体的血友病,重症肌无力,多发性硬化,和慢性移植物抗宿主病组成的组。
35.一种组合物,其包含权利要求1的CAR多肽,为了治疗癌症而配制。
36.权利要求35的组合物,其进一步包含药学可接受载剂。
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