ES2861501T3

ES2861501T3 - Célula

Info

Publication number: ES2861501T3
Application number: ES14806356T
Authority: ES
Inventors: Martin Pule; Khai Kong; Shaun Cordoba
Original assignee: Autolus Ltd
Current assignee: Autolus Ltd
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2021-10-06
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: EP3071222A1; PL3071222T3; HK1223553A1; US20240033292A1; IL245573B; AU2014351557A1; US10172886B2; AU2014351558B2; PL3071223T3; KR101991555B1; CN105848673A; ES2832586T3; IL245572B; WO2015075470A1; CN105848673B; JP2021045172A; CA2929984C; EP3071223A1; KR20160085347A; US20190038672A1

Abstract

Un linfocito T o linfocito citolítico natural (NK) que coexpresa un primer receptor de antígeno quimérico (CAR) y un segundo CAR en la superficie celular, comprendiendo cada CAR: (i) un dominio de unión a antígeno; (ii) un espaciador (iii) un dominio transmembrana; y (iv) un endodominio en el que los dominios de unión a antígeno del primer y segundo CAR se unen a diferentes antígenos, y en el que uno del primero o el segundo CAR es un CAR activador que comprende un endodominio activador y el otro CAR es un CAR inhibidor que comprende un endodominio inhibidor con ligadura que comprende todos de PTPN6 o una parte de los mismos que comprende el dominio tirosina fosfatasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Célula

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una célula que comprende más de un receptor de antígeno quimérico (CAR). La célula es capaz de reconocer específicamente una célula diana, debido a un patrón diferencial de expresión (o de no expresión) de dos o más antígenos por la célula diana.

Antecedentes de la invención

Se han descrito una serie de agentes inmunoterapéuticos para su uso en el tratamiento del cáncer, incluyendo los anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAb), mAb inmunoconjugados, mAb radioconjugados y moléculas de unión a linfocitos T biespecíficas.

Típicamente, estos agentes inmunoterapéuticos se dirigen a un único antígeno: por ejemplo, rituximab se dirige a cD20; Mylotarg se dirige a CD33; y alemtuzumab se dirige a CD52.

Sin embargo, es relativamente rara la presencia (o ausencia) de un único antígeno para describir eficazmente un cáncer, lo que puede conducir a una falta de especificidad. El direccionamiento de la expresión de antígeno en células normales lleva a una toxicidad específica-colateral del tumor.

La mayoría de los cánceres no se pueden diferenciar de los tejidos normales basándose en un solo antígeno. Por lo tanto, se produce una toxicidad "específica-colateral del tumor" considerable por la cual los tejidos normales son dañados por la terapia. Por ejemplo, cuando el tratamiento va dirigido a CD20 para tratar los linfomas de linfocitos B con rituximab, se agota todo el compartimento de linfocitos B normales, mientras que cuando va dirigido a CD52 para tratar la leucemia linfocítica crónica, se agota todo el compartimento linfoide, y cuando va dirigido a CD33 para tratar la leucemia mieloide aguda, se daña todo el compartimento mieloide, etc.

El problema predicho de la toxicidad "específica-colateral del tumor" ha sido confirmado por ensayos clínicos. Por ejemplo, un enfoque dirigido a ERBB2 causó la muerte a un paciente con cáncer de colon metastásico en los pulmones y el hígado. ERBB2 se sobreexpresa en el cáncer de colon en algunos pacientes, pero también se expresa en varios tejidos normales, incluidos el corazón y la vasculatura normal.

En algunos cánceres, un tumor se define mejor por la presencia de un antígeno (normalmente un antígeno específico de tejido) y la ausencia de otro antígeno que está presente en células normales. Por ejemplo, las células de leucemia mieloide aguda (AML) expresan CD33. Las células madre normales expresan CD33 pero también expresan CD34, mientras que las células de AML son normalmente CD34 negativas. El direccionamiento de CD33 solo para tratar la AML se asocia con una toxicidad significativa, ya que agota las células madre normales. Sin embargo, el direccionamiento de manera específica de células que son CD33 positivas pero no CD34 positivas evitaría esta toxicidad específica-colateral del tumor.

Por lo tanto, existe la necesidad de agentes inmunoterapéuticos que sean capaces de un mayor direccionamiento para reflejar el patrón complejo de expresión de marcador que está asociado con muchos tipos de cánceres.

Receptores de antígeno quiméricos (CAR)

Los receptores de antígeno quiméricos son proteínas que injertan la especificidad de un anticuerpo monoclonal (mAb) con la función efectora de un linfocito T. Su forma habitual es la de una proteína de dominio transmembrana de tipo I con un extremo amino terminal que reconoce el antígeno, un espaciador, un dominio transmembrana, todo ello conectado a un endodominio compuesto que transmite señales de supervivencia y activación de linfocitos T (véase la figura 1A).

La forma más habitual de estas moléculas son fusiones de fragmentos variables monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales que reconocen un antígeno diana, fusionados mediante un espaciador y un dominio transmembrana a un endodominio de señalización. Dichas moléculas dan como resultado la activación de los linfocitos T en respuesta al reconocimiento por el scFv de su diana. Cuando los linfocitos T expresan dicho CAR, reconocen y destruyen las células diana que expresan el antígeno diana. Se han desarrollado varios CAR contra antígenos asociados al tumor, y las estrategias de transferencia adoptiva usando dichos linfocitos T que expresan CAR están actualmente en ensayo clínico para el tratamiento de diversos cánceres.

Sin embargo, el uso de linfocitos T que expresan CAR también está asociado con la toxicidad específica-colateral del tumor. Por ejemplo, un enfoque basado en CAR dirigido a la carboxi anhidrasa IX (CAIX) para tratar el carcinoma de células renales dio como resultado una toxicidad hepática que se cree que es causada por el ataque específico a las células epiteliales de los conductos biliares (Lamers et al (2013) Mol. Ther. 21:904-912.

Por lo tanto, existe la necesidad de enfoques de linfocitos T basados en CAR con una mayor selectividad y toxicidad especifica-colateral del tumor reducida.

Descripción de las figuras

Figura 1: (a) Arquitectura generalizada de un CAR: Un dominio de unión reconoce el antígeno; el espaciador eleva el dominio de unión desde la superficie celular; el dominio transmembrana ancla la proteína a la membrana y el endodominio transmite señales. (b) a (d): Diferentes generaciones y permutaciones de endodominios de CAR: (b) los diseños iniciales transmitían señales ITAM en solitario a través del endodominio FcsRI -y o CD3Z, mientras que los diseños posteriores transmitían una (c) o dos (d) señales coestimuladoras adicionales en cis.

Figura 2: Diagrama esquemático que ilustra la invención

La invención se refiere al diseño de linfocitos T para responder a reglas lógicas de la expresión de antígenos de la célula diana. Esto se ilustra mejor con un diagrama de dispersión de FACS. Las poblaciones de células diana expresan ambos, uno o ninguno de los antígenos "A" y "B". Diferentes poblaciones diana (marcadas en rojo) son destruidas por los linfocitos T transducidos con un par de CAR conectados por diferentes puertas. Con los receptores con puerta O, se eliminarán tanto las células de positivo único como las doble positivo. Con los receptores con puerta Y, solo se destruyen las células diana de doble positivo. Con la puerta Y No, se conservan las dianas de doble positivo, mientras que las dianas positivo único

Figura 3: Creación de poblaciones de células diana

Se usaron células SupT1 como células diana. Estas células se transdujeron para expresar CD19, CD33 o tanto CD19 como CD33. Las células diana se tiñeron con anticuerpos apropiados y se analizaron por citometría de flujo.

Figura 4 (para referencia): Diseño de casete para una puerta O

Un solo marco de lectura abierto proporciona a ambos CAR una secuencia de FMD-2A en marco que da como resultado dos proteínas. Señal1 es un péptido señal derivado de IgG1 (pero puede ser cualquier péptido señal efectivo). scFv1 es el segmento variable monocatenario que reconoce cD19 (pero puede ser un scFv o un bucle peptídico o ligando o, de hecho, cualquier dominio que reconozca cualquier diana arbitraria deseada). STK es el pedúnculo de CD8 pero puede ser cualquier dominio extracelular adecuado. CD28tm es el dominio transmembrana de CD28 pero puede ser cualquier dominio transmembrana de proteína tipo I estable y CD3Z es el endodominio de CD3 Zeta pero puede ser cualquier endodominio que contenga ITAM. Señal2 es un péptido señal derivado de CD8 pero puede ser cualquier péptido señal efectivo que sea diferente en la secuencia de ADN de la señal1. scFv reconoce CD33 pero en cuanto a scFv1 es arbitrario. HC2CH3 es la bisagra-CH2-CH3 de la IgG1 humana pero puede ser cualquier dominio extracelular que no se empareje de forma cruzada con el espaciador utilizado en el primer CAR. CD28tm' y CD3Z' codifican la misma secuencia de proteínas que CD28tm y cD3Z, pero se tambalean por codones para evitar la recombinación homóloga.

Figura 5 (para referencia): Representación esquemática de los receptores de antígenos quiméricos (CAR) para una puerta O Se construyeron CAR estimuladores que consistían en un dominio scFv anti-CD19 N-terminal A) seguido de la región bisagra extracelular de CD8 humana o el dominio scFv anti-CD33 B) seguido de la región bisagra extracelular, CH2 y CH3 (que contenía una mutación pvaa a reducir la unión de FcR) de IgG1 humana. Ambos receptores contienen un dominio transmembrana de cD28 humana y un dominio intracelular de CD3 Zeta (CD247) humana. "S" representa la presencia de enlaces disulfuro.

Figura 6 (para referencia): Datos de expresión que muestran la coexpresión de ambos CAR en la superficie de un linfocito T.

Figura 7 (para referencia): Análisis funcional de la puerta O

Las células efectoras (5x10A4 células) que expresan la construcción de la puerta O se coincubaron con un número variable de células diana y se analizó la IL-2 después de 16 horas mediante ELISA. El gráfico muestra la secreción máxima promedio de IL-2 de una estimulación química (PMA y lonomicina) de las células efectoras en solitario, y la IL-2 de fondo de las células efectoras sin ningún estímulo de tres réplicas.

Figura 8 (para referencia): Representación que muestra ambas versiones del casete utilizado para expresar ambas puertas Y. Los CAR activadores e inhibidores se coexpresaron una vez más utilizando una secuencia FMD-2A. Señal1 es un péptido señal derivado de IgG1 (pero puede ser cualquier péptido señal efectivo). scFv1 es el segmento variable monocatenario que reconoce CD19 (pero puede ser un scFv o un bucle peptídico o ligando o, de hecho, cualquier dominio que reconozca cualquier diana arbitraria deseada). STK es el pedúnculo de CD8 pero puede ser cualquier dominio extracelular no voluminoso. CD28tm es el dominio transmembrana de CD28 pero puede ser cualquier dominio transmembrana de proteína tipo I estable y CD3Z es el endodominio de CD3 Zeta pero puede ser cualquier endodominio que contenga ITAM. Señal2 es un péptido señal derivado de CD8 pero puede ser cualquier péptido señal efectivo que sea diferente en la secuencia de ADN de la señal1. scFv reconoce CD33 pero en cuanto a scFv1 es arbitrario. HC2CH3 es la bisagra-CH2-CH3 de la IgG1 humana, pero puede ser cualquier dominio extracelular voluminoso. CD45 y CD148 son los dominios transmembrana y endodominio de CD45 y CD148 respectivamente, pero pueden derivarse de cualquiera de esta clase de proteínas.

Figura 9 (para referencia): Representación esquemática de la estructura proteica de los receptores de antígeno quiméricos (CAR) para las puertas Y. El CAR estimulador que consiste en un dominio scFv anti-CD19 N-terminal seguido por la región extracelular del pedúnculo de CD8 humana, dominio transmembrana de CD28 humana y dominio intracelular de CD3 Zeta humana (CD247). Se probaron dos CAR inhibidores. Estos consisten en un dominio scFv anti-CD33 N-terminal seguido de la región bisagra extracelular, CH2 y CH3 (que contienen una mutación pvaa para reducir la unión de FcR) de la IgG1 humana seguida del dominio transmembrana e intracelular de CD148 o c D45 humanas. "S" representa la presencia de enlaces disulfuro.

Figura 10 (para referencia): Coexpresión de la activación y CAR inhibidores

Se usaron células BW5147 como células efectoras y se transdujeron para expresar la activación de CAR anti-CD19 y uno de los CAR anti-CD33 inhibidores. Las células efectoras se tiñeron con CD19-Fc de ratón y CD33-Fc de conejo y con los anticuerpos secundarios apropiados y se analizaron por citometría de flujo.

Figura 11 (para referencia): Análisis funcional de las puertas Y

Células efectoras (5x10A4 células) que expresan c Ar anti-CD19 activador y el CAR anti-CD33 inhibidor con el dominio intracelular A) CD148 o B) CXD45 se incubaron conjuntamente con diversas células diana e IL-2 se analizó después de 16 horas por ELISA. El gráfico muestra la secreción máxima de IL-2 de una estimulación química (PMA y lonomicina) de las células efectoras en solitario, y la IL-2 de fondo de las células efectoras sin ningún estímulo de tres réplicas.

Figura 12: Representación que muestra tres versiones del casete utilizado para generar la puerta Y NO. Los CAR activadores e inhibidores se coexpresaron una vez más utilizando una secuencia FMD-2A. Señal1 es un péptido señal derivado de IgG1 (pero puede ser cualquier péptido señal efectivo). scFv1 es el segmento variable monocatenario que reconoce CD19 (pero puede ser un scFv o un bucle peptídico o ligando o, de hecho, cualquier dominio que reconozca cualquier diana arbitraria deseada). STK es el pedúnculo de CD8 humana pero puede ser cualquier dominio extracelular no voluminoso. CD28tm es el dominio transmembrana de CD28 pero puede ser cualquier dominio transmembrana de proteína tipo I estable y CD3Z es el endodominio de CD3 Zeta pero puede ser cualquier endodominio que contenga ITAM. Señal2 es un péptido señal derivado de CD8 pero puede ser cualquier péptido señal efectivo que sea diferente en la secuencia de ADN de la señal1. scFv reconoce CD33 pero en cuanto a scFv1 es arbitrario. muSTK es el pedúnculo de CD8 de ratón, pero puede ser cualquier espaciador que se colocalice pero no se empareje de forma cruzada con el del CAR activador. dPTPN6 es el dominio fosfatasa de PTPN6. LAIR1 es la región transmembrana y el endodominio de LAIR1. 2Aw es una versión tambaleante por codones de la secuencia FMD-2A. SH2-CD148 es el dominio SH2 de PTPN6 fusionado con el dominio fosfatasa de CD148.

Figura 13: Representación esquemática de los receptores de antígenos quiméricos (CAR) para las puertas NO Y A) Un CAR estimulador que consiste en un dominio scFv anti-CD19 N-terminal seguido de la región del pedúnculo de CD8 humana, dominio de CD28 humana y dominio intracelular de CD247 humana. B) Un CAR inhibidor que consiste en un dominio scFv anti-CD33 N-terminal seguido de la región del pedúnculo de CD8 de ratón, la región transmembrana de CD8 de ratón y el dominio de fosfatasa de PTPN6. C) Un CAR inhibidor que consiste en un dominio scFv anti-CD33 N-terminal seguido de la región del pedúnculo de CD8 de ratón y los segmentos transmembrana e intracelular de LAIR1. D) Un CAR inhibidor idéntico al CAR anterior, excepto que se coexpresa con una proteína de fusión del dominio SH2 de PTPN6 y el dominio fosfatasa de CD148.

Figura 14: Análisis funcional de la puerta NO Y

Las células efectoras (5x10A4 células) que expresan A) SHP-1 de longitud completa o B) la forma truncada de SHP-1 se coincubaron con un número variable de células diana, y la IL-2 se analizó después de 16 horas mediante ELISA. El gráfico muestra la secreción máxima promedio de IL-2 de una estimulación química (PMA y lonomicina) de las células efectoras en solitario, y la IL-2 de fondo de las células efectoras sin ningún estímulo de tres réplicas.

Figura 15 (para referencia): Secuencia de aminoácidos de una puerta O

Figura 16 (para referencia): Secuencia de aminoácidos de una puerta Y basada en CD148 y CD145

Figura 17: Secuencia de aminoácidos de dos puertas y NO

Figura 18 (para referencia): Análisis de la función de la puerta Y

A. El prototipo de la puerta Y se ilustra a la derecha y su función en respuesta a las dianas CD19, positivo único para CD33 y doble positivo para CD19, CD33 se muestra a la izquierda. B. Los scFv se intercambian de modo que el endodominio activador se activa por CD33 y el endodominio inhibidor se activa por CD19. Esta puerta Y sigue siendo funcional a pesar de este intercambio de scFv. C. El pedúnculo de CD8 de ratón reemplaza a Fc en el espaciador del CAR inhibidor. Con esta modificación, la puerta no responde a las dianas positivo único para CD19 ni a CD19, CD33 doble positivo.

Figura 19 (para referencia): Expresión de los antígenos diana en células diana artificiales

A. Muestra los diagramas de dispersión de citometría de flujo de CD19 frente a CD33 del conjunto original de células diana artificiales derivadas de células SupT1. De izquierda a derecha: células SupT 1 doble negativo, células SupT1 positivas para CD19, positivas para CD33 y positivas para CD19 y CD33. B. Muestra los diagramas de dispersión de citometría de flujo de CD19 frente a GD2 de las células diana artificiales generadas para ensayar la puerta CD19 Y GD2: De izquierda a derecha: células SupT 1 negativas, células SupT 1 que expresan CD19, células SupT1 transducidas con vectores GD2 y GM3sintasa que se convierten en células positivas para GD2 y SupT1 transducidas con CD19, así como GD2 y GM3 sintasa que son positivas tanto para GD2 como para CD19. C. Muestra los diagramas de dispersión de citometría de flujo de c D19 frente a e Gf Rv III de las dianas artificiales generadas para ensayar la puerta CD19 Y EGFRv III. De izquierda a derecha: células SupT1 negativas, células SupT1 que expresan CD19, células SupT1 transducidas con EGFRv III y células SupT1 transducidas tanto con CD19 como con EGFRv III. D. Muestra los diagramas de dispersión de citometría de flujo de CD19 frente a CD5 de las dianas artificiales generadas para ensayar la puerta CD19 Y CD5. De izquierda a derecha: células 293T negativas, células 293T transducidas con c D19, células 293T transducidas con CD5, células 293T transducidas con vectores CD5 y CD19.

Figura 20 (para referencia): Generalización de la puerta Y

A. Representación de la puerta Y modificada de modo que la segunda especificad de CAR está cambiada respecto a la especificidad original de CD33, para generar 3 nuevos CAR: CD19 Y GD2, CD19 Y EGFRvlll, CD19 Y CD5. B. Puerta Y de CD19 Y GD2: Izquierda: se muestra la expresión de la puerta Y, tinción de CD19-Fc recombinante (eje x) para el CAR de CD19, frente a la tinción de anti-Fc humano (eje Y) para el CAR de GD2. Derecha: función en respuesta a las dianas de positivo único y doble positivo. C. Puerta Y de CD19 Y EGFRv III: Izquierda: se muestra la expresión de la puerta Y, tinción de CD19-Fc recombinante (eje x) para el CAR de CD19, frente a la tinción de anti-Fc humano (eje Y) para el CAR de EGFRv III. Derecha: función en respuesta a las dianas de positivo único y doble positivo. D. Puerta Y de CD19 Y CD5: Izquierda: se muestra la expresión de la puerta Y, tinción de CD19-Fc recombinante (eje x) para el CAR de CD19, frente a la tinción de anti-Fc humano (eje Y) para el CAR de CD5. Derecha: función en respuesta a las dianas de positivo único y doble positivo.

Figura 21: Función de las puertas Y NO

Se muestra la función de las tres implementaciones de una puerta Y NO. A la derecha se muestra una representación de las puertas probadas, y a la izquierda se muestra la función en respuesta a dianas de positivo único y doble positivo. A. Puerta Y NO basada en PTPN6 en la que el primer CAR reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 humana y un endodominio activador que contiene ITAM; se coexpresa con u n segundo CAR que reconoce CD33, tiene un espaciador en el pedúnculo CD8 de ratón y tiene un endodominio que comprende un dominio fosfatasa de PTPN6. B. La puerta Y NO basada en ITIM es idéntica a la puerta de PTPN6, excepto que el endodominio se reemplaza por el endodominio de LAIR1. C. La puerta Y NO reforzada con CD148 es idéntica a la puerta basada en ITIM excepto que se expresa una fusión adicional entre SH2 de PTPN6 y el endodominio de CD148. Las tres puertas funcionan como se esperaba con la activación en respuesta a CD19 pero no en respuesta a CD19 y CD33 juntas.

Figura 22: Disección de la función de puerta Y NO basada en PTPN6

La puerta Y NO original basada en PTPN6 se compara con varios controles para demostrar el modelo. A la derecha se muestra una representación de las puertas probadas, y a la izquierda se muestra la función en respuesta a dianas de positivo único y doble positivo. A. Puerta Y NO original en la que el primer CAR reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 humana y un endodominio activador que contiene ITAM; se coexpresa con un segundo CAR que reconoce CD33, tiene un espaciador en el pedúnculo CD8 de ratón y tiene un endodominio que comprende un dominio fosfatasa de PTPN6. B. La puerta Y NO se modificó para que el espaciador en el pedúnculo de CD8 de ratón se reemplace por un espaciador Fc. C. La puerta Y NO se modificó para que el dominio fosfatasa de PTPN6 se reemplace por el endodominio de CD148. La puerta Y NO original (A.) funciona como se esperaba y se activa en respuesta a CD19, pero no en respuesta a CD19 ni a CD33. La puerta en B. se activa tanto en respuesta a CD19 en solitario o CD19 y CD33 juntas. La puerta en C. no se activa en respuesta a una o ambas dianas.

Figura 23 (para referencia): Disección de la puerta Y NO basada en LAIR1

Se muestra la actividad funcional contra dianas positivas para CD19, positivas para CD33 y CD19, CD33 doble positivas. A. Estructura y actividad de la puerta Y NO basada en ITIM original. Esta puerta está compuesta por dos CAR: el primero reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 humana y un endodominio que contiene ITAM; el segundo CAR reconoce CD33, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 de ratón y un endodominio que contiene ITIM. B Estructura y actividad de la puerta de control basada en ITIM donde el espaciador en el pedúnculo de CD8 de ratón se ha reemplazado por un dominio Fc. Esta puerta está compuesta por dos CAR: el primero reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 humana y un endodominio que contiene ITAM; el segundo CAR reconoce CD33, tiene un espaciador Fc y un endodominio que contiene ITIM. Ambas puertas responden a dianas de positivo único para CD19, mientras que solo la puerta original está inactiva en respuesta a dianas CD19 y CD33 positivo doble.

Figura 24: Modelo de segregación cinética de puertas lógicas de CAR

Modelo de segregación cinética y comportamiento de la puerta Y, puerta NO Y, y controles. Los CAR reconocen CD19 o CD33. La sinapsis inmunológica se puede imaginar entre la línea azul, que representa la membrana de la célula diana y la línea roja, que representa la membrana del linfocito T. "45" es la proteína CD45 nativa presente en los linfocitos T. "H8" es un ectodominio de CAR con el pedúnculo de CD8 humana como espaciador. "Fc" es un ectodominio de CAR con HCH2CH3 humana como espaciador. "M8" es un ectodominio de c A r con el pedúnculo de CD8 murina como espaciador. "19" representa CD19 en la superficie de la célula diana. "33" representa CD33 en la superficie de la célula diana. El símbolo "©" representa un endodominio activador que contiene ITAMS. El símbolo "0" representa una fosfatasa con cinética lenta - un endodominio en "presencia de ligadura" tal como uno que comprende el dominio catalítico de PTPN6 o un ITIM. El símbolo ^{" 0 "}representa una fosfatasa con cinética rápida - un endodominio en "ausencia de ligadura" tal como el endodominio de CD45 o CD148. Este símbolo está aumentado en la figura para resaltar su potente actividad.

(a) Muestra el comportamiento postulado de la puerta Y funcional que comprende un par de CAR donde el primer CAR reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio activador; y el segundo CAR reconoce CD33, tiene un espaciador Fc y un endodominio de CD148;

(b) Muestra el comportamiento postulado de la puerta Y de control. Aquí, el primer CAR reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio activador; y el segundo CAR reconoce CD33, pero tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio de CD148;

(c) Muestra el comportamiento postulado de una puerta Y NO funcional que comprende un par de CAR donde el primer CAR reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio activador; y el segundo CAR reconoce CD33, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 de ratón y un endodominio de PTPN6;

(d) Muestra el comportamiento postulado de la puerta Y NO de control que comprende un par de CAR donde el primer CAR reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio activador; y el segundo CAR reconoce CD33, pero tiene un espaciador Fc y un endodominio de PTPN6;

En la primera columna, las células diana son negativas para CD19 y CD33. En la segunda columna, las células diana son negativas para CD19 y positivas para CD33. En la tercera columna, las células diana son positivas para CD19 y negativas para CD33. En la cuarta columna, las células diana son positivas tanto para CD19 como para CD33.

Figura 25: Diseño de CAR basados en APRIL.

El diseño de CAR se modificó para que el scFv se reemplazara por una forma modificada de un ligando inductor de proliferación (APRIL), que interactúa con BCMA, TACI y proteoglicanos, para actuar como un dominio de unión a antígeno: APRIL se truncó de manera que el extremo amino de unión a proteoglicanos esté ausente. A continuación, se unió un péptido señal al extremo amino de APRIL truncado para dirigir la proteína a la superficie celular. Se generaron tres CAR con este dominio de unión basado en APRIL: A. En el primer CAR, se usó el dominio del pedúnculo de CD8 humana como dominio espaciador. B. En el segundo CAR, se usó la bisagra de IgG1 como dominio espaciador. C. En el tercer CAR, los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la IgG1 humana modificada con las mutaciones pva/a descritas por Hombach et al (2010 Gene Ther. 17: 1206-1213) para reducir la unión del receptor Fc se utilizó como espaciador (en lo sucesivo denominado Fc-pvaa). En todos los CAR, estos espaciadores estaban conectados al dominio transmembrana de CD28 y a continuación a un endodominio tripartito que contenía una fusión del endodominio de CD28, OX40 y CD3-Zeta (Pule et al, Molecular therapy, 2005: Volumen 12; Número 5; Páginas 933-41).

Figura 26: Secuencia de aminoácidos anotada de los tres CAR con APRIL anteriores

A: Muestra la secuencia de aminoácidos anotada del CAR con APRIL del pedúnculo de CD8; B: Muestra la secuencia de aminoácidos anotada del CAR basado en la bisagra de IgG1 con APRIL; C: Muestra la secuencia de aminoácidos anotada del CAR basado en Fc-pvaa con APRIL.

Figura 27: Expresión y unión a ligando de diferentes CAR basados en APRIL

A. Los receptores se coexpresaron con CD34 truncado con un gen marcador en un vector génico retroviral. La expresión del gen marcador en células transducidas permite la confirmación de la transducción. B. Se transdujeron linfocitos T con CAR basados en APRIL con el espaciador en el pedúnculo de CD8, la bisagra de IgG1 o el espaciador Fc. Para probar si estos receptores podían expresarse de forma estable en la superficie celular, los linfocitos T se tiñeron a continuación con biotina anti-APRIL/estreptavidina APC y anti-CD34. Se realizó un análisis de citometría de flujo. APRIL se detectó igualmente en la superficie celular en los tres CAR, lo que sugiere que se expresan de manera igualmente estable. C. A continuación, se determinó la capacidad de los c Ar para reconocer TACI y BCMA. Los linfocitos T transducidos se tiñeron con BCMA recombinante o TACI fusionado con la fusión Fc de IgG2a de ratón junto con un anti-ratón secundario y anti-CD34. Los tres formatos de receptor mostraron unión tanto a BCMA como a TACI. Un hallazgo sorprendente fue que la unión a BCMA parecía mayor que a TACI. Otro hallazgo sorprendente fue que aunque los tres CAR se expresaron por igual, los CAR del pedúnculo de CD8 y de la bisagra de IgG1 parecieron reconocer mejor BCMA y TACI que con el espaciador Fc.

Figura 28: Función de las diferentes construcciones de CAR.

Se realizaron ensayos funcionales con los tres CAR diferentes basados en APRIL. Linfocitos T de sangre periférica de donante normal no transducidas (NT) o transducidas para expresar los diferentes CAR. La transducción se realizó utilizando sobrenadante de igual título. A continuación, estos linfocitos T se agotaron en CD56 para eliminar la actividad NK no específica y se usaron como efectores. Se utilizaron como dianas células SupT 1 no transducidas (NT) o transducidas para expresar BCMA o TACI. Los datos mostrados son la media y la desviación estándar de 5 experimentos independientes. A. Se determinó la destrucción específica de linfocitos T que expresaban BCMA y TACI usando liberación de cromo. B. También se determinó la liberación de interferón-p. Las dianas y los efectores se cocultivaron en una relación de 1:1. Después de 24 horas, se ensayó mediante ELISA el interferón-p en el sobrenadante. C. También se determinó la proliferación/supervivencia de los linfocitos T con CAR contando el número de linfocitos T con CAR en el mismo cocultivo incubado durante 6 días más. Los 3 CAR responden directamente contra dianas que expresan BCMA y TACI. Las respuestas a BCMA fueron mayores que a TACI.

Figura 29 (para referencia): Funcionalidad de la puerta Y en células primarias

Se aislaron PBMC de la sangre y se estimularon usando PHA e IL-2. Dos días más tarde las células fueron transducidas en placas recubiertas con retronectina con retrovirus que contenían la construcción de la puerta Y CD19:CD33. El día 5, el nivel de expresión de los dos CAR traducidos por la construcción de la puerta Y se evaluó mediante citometría de flujo y se agotaron los linfocitos CD56+ de las células (predominantemente los linfocitos NK). El día 6, las PBMC se colocaron en un cocultivo con células diana en una relación efector:célula diana de 1:2. El día 8, el sobrenadante se recogió y se analizó mediante ELISA para determinar la secreción de IFN-gamma.

Figura 30: IgM e IgG en puerta Y NO

Para probar si la puerta Y NO podría funcionar en longitudes de espaciador extendidas, tanto los espaciadores CAR activadores (anti-CD19) como los CAR inhibidores (anti-CD33) fueron sustituidos por espaciadores más largos. Se usó la región Fc de IgM e IgG humanas para extender la longitud del espaciador. El Fc de IgM contiene un dominio de Ig adicional en comparación con IgG, por esta razón el espaciador de IgM se colocó en el CAR anti-CD19 que se sabe que tiene un epítopo de unión proximal a la membrana. Por el contrario, el epítopo de unión anti-CD33 está ubicado en un extremo distal de la molécula, por lo que se usó el espaciador de IgG relativamente más corto en este CAR. La construcción de puerta Y NO de espaciador extendido se transdujo en una línea de linfocitos T de ratón. Luego, se cocultivó un número fijo de linfocitos T transducidos con un número variable de células diana durante 16-24 horas, después de lo cual se analizó la cantidad de IL-2 secretada en el sobrenadante mediante ELISA.

Figura 31: puerta Y NO de anti-CD19/anti-GD2:

Para probar la robustez de la plataforma de la puerta Y NO, el dominio de unión del CAR inhibidor (anti-CD33) se sustituyó por otros dos aglutinantes no relacionados (anti-GD2 y anti-EGFRvlll). El fragmento scFv para anti-GD2 o anti-EGFRvIII se sustituyó por anti-CD33 en el CAR inhibidor en la plataforma de la puerta Y NO con un dominio citosólico SHP-1 o LAIR truncado. Estas construcciones se transdujeron en una línea de linfocitos T de ratón y se cultivaron conjuntamente un número fijo de linfocitos T con un número variable de células diana. Después de 16 24 horas de cocultivo, se analizó mediante ELISA la cantidad de IL-2 secretada en el sobrenadante. A) Puerta Y NO de anti-CD19/anti-GD2 B) Puerta Y NO de anti-CD19/anti-EGFRvIII.

Figura 32: Reglas de diseño para construir linfocitos T con CAR con puerta lógica.

Los CAR con puertas O, Y NO e Y se muestran en formato de representación con la celda diana en la parte superior, y el linfocito T en la parte inferior con la sinapsis en el medio. Las células diana expresan los antígenos diana arbitrarios A y B. Los linfocitos T expresan dos CAR que comprenden dominios de reconocimiento anti-A y anti-B, espaciadores y endodominios. Una puerta O requiere (1) espaciadores que simplemente permitan el reconocimiento de antígenos y la activación de CAR, y (2) que ambos CAR tengan endodominios activadores; Una puerta Y NO requiere (1) espaciadores que den como resultado la cosegregación de ambos CAR tras reconocer ambos antígenos y (2) un CAR con un endodominio activador, y el otro cuyo endodominio comprenda o reclute una fosfatasa débil; una puerta Y requiere (1) espaciadores que den como resultado la segregación de ambos CAR en diferentes partes de la sinapsis inmunológica tras el reconocimiento de ambos antígenos, y (2) un CAR con un endodominio activador, y el otro cuyo endodominio comprenda una potente fosfatasa.

Sumario de aspectos de la invención

Los presentes inventores han desarrollado un panel de pares de receptores de antígeno quimérico "de puertas lógicas" que, cuando se expresa en una célula, tal como un linfocito T, son capaces de detectar un patrón particular de expresión de al menos dos antígenos diana. Si los al menos dos antígenos diana se representan arbitrariamente como antígeno A y antígeno B, las tres posibles opciones son las siguientes:

"PUERTA O" - activa el linfocito T cuando el antígeno A o el antígeno B está presente en la célula diana "PUERTA Y" - activa el linfocito T solo cuando están presentes tanto el antígeno A como el antígeno B en la célula diana

"PUERTA Y NO" - activa el linfocito T si solo el antígeno A es el que está presente en la célula diana, pero no si están presentes ambos, antígeno A y B, en la célula diana

Los linfocitos T diseñados que expresan estas combinaciones de CAR pueden diseñarse para ser exquisitamente específicos de células cancerosas, basándose en su expresión particular (o falta de expresión) de dos o más marcadores.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un linfocito T o linfocito citolítico natural (NK) que coexpresa un primer receptor de antígeno quimérico (CAR) y un segundo CAR en la superficie celular, comprendiendo cada CAR:

(i) un dominio de unión a antígeno;

(ii) un espaciador

(iii) un dominio transmembrana; y

(iv) un endodominio

en el que los dominios de unión a antígeno del primer y segundo CAR se unen a diferentes antígenos, y en el que uno del primer o segundo CAR es un CAR activador que comprende un dominio intracelular de señalización de linfocitos T y el otro CAR es un CAR inhibidor que comprende una unión en el dominio inhibidor intracelular de señalización de linfocitos T que comprende todos de PTPN6 o parte de los mismos que comprende el dominio de tirosina fosfatasa.

El espaciador del primer CAR puede ser diferente al espaciador del segundo CAR.

Los espaciadores del primer y del segundo CAR pueden ser lo suficientemente diferentes como para evitar el emparejamiento cruzado, pero ser lo suficientemente similares como para provocar que los CAR se colocalicen en la membrana de los linfocitos T.

Los espaciadores del primer y del segundo CAR pueden ser ortólogos, tal como los pedúnculos de CD8 de ratón y de humano.

En la presente invención, que se refiere a la puerta "Y NO", uno del primer o segundo CAR es un CAR activador que comprende un endodominio activador, y el otro CAR es un CAR inhibidor que comprende un endodominio inhibidor “con ligadura” que comprende todas de PTPN6 o una parte de los mismos que comprende el dominio tirosina fosfatasa. El CAR inhibidor no inhibe significativamente la activación de linfocitos T por el c Ar en ausencia de ligadura de CAR inhibidor, pero inhibe la activación de linfocitos T por el CAR activador cuando el CAR inhibidor está ligado. En estas realizaciones, el primer y segundo espaciadores son lo suficientemente diferentes como para evitar el emparejamiento cruzado del primer y del segundo CAR, pero son lo suficientemente similares para dar como resultado la colocalización del primer y del segundo CAR tras la ligadura.

El endodominio inhibidor puede comprender un dominio ITIM.

Como se explicó en la introducción, las células de leucemia mieloide aguda (AML) expresan CD33. Las células madre normales expresan CD33 pero también expresan CD34, mientras que las células de AML son típicamente CD34 negativas. Dirigirse a CD33 solo para tratar la AML se asocia con una toxicidad significativa, ya que agota las células madre normales. Sin embargo, dirigirse específicamente a células que son positivas para CD33 pero no positivas para CD34 evita esta considerable toxicidad fuera de diana. Por tanto, en la presente invención, el CAR que comprende el endodominio de activación puede comprender un dominio de unión a antígeno que se une a CD33 y el CAR que comprende el endodominio inhibidor de ligación puede comprender un dominio de unión a antígeno que se une a CD34.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica tanto el primer como el segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) como se define en el primer aspecto de la invención.

La secuencia de ácido nucleico puede tener la siguiente estructura: AgB1-espaciador1-TM1-endo 1-coexpr-AgB2-espaciador2-TM2-endo2

en la que

AgB1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a antígeno del primer CAR; espaciador 1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el espaciador del primer CAR;

TM1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana del primer CAR;

endo 1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el endodominio del primer CAR;

coexpr es una secuencia de ácido nucleico que permite la coexpresión de dos CAR (por ejemplo, un sitio de escisión);

AgB2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a antígeno del segundo CAR; espaciador 2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el espaciador del segundo CAR;

t M2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana del segundo CAR;

endo 2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el endodominio del segundo CAR;

cuya secuencia de ácido nucleico, cuando se expresa en un linfocito T, codifica un polipéptido que se escinde en el sitio de escisión de manera que el primer y segundo CAR se coexpresan en la superficie del linfocito T.

La secuencia de ácido nucleico que permite la coexpresión de dos CAR puede codificar un péptido autoescindible o una secuencia que permite medios alternativos de coexpresión de dos CAR, tal como una secuencia de entrada interna al ribosoma o un 2° promotor u otros medios por los que un experto en la técnica puede expresar dos proteínas del mismo vector.

Se pueden usar codones alternativos en regiones de secuencia que codifican secuencias de aminoácidos iguales o similares, para evitar la recombinación homóloga.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende

(i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el primer receptor de antígeno quimérico (CAR) como se define en el primer aspecto de la invención, cuya secuencia de ácido nucleico tiene la siguiente estructura:

AgB1-espaciador1-TM1-endo1

en la que

endo 1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el endodominio del primer CAR; y

(ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica el segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) como se define en el primer aspecto de la invención, cuya secuencia de ácido nucleico tiene la siguiente estructura: AgB2-espaciador2-TM2-endo2

t M2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana del segundo CAR; endo 2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el endodominio del segundo CAR.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende: un primer vector que comprende la primera secuencia de ácido nucleico como se ha definido anteriormente; y un segundo vector que comprende la segunda secuencia de ácido nucleico como se ha definido anteriormente.

Los vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores retrovirales o vectores transposónicos. Los vectores pueden ser vectores lentivirales.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención. El vector puede ser un vector lentiviral.

El vector puede ser un vector plasmídico, un vector retroviral o un vector transposónico.

En un sexto aspecto, la presente invención implica la coexpresión de más de dos CAR de tal manera que se pueda reconocer un patrón complejo de más de dos antígenos en la célula diana.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para fabricar un linfocito T o NK de acuerdo con el primer aspecto de la invención, que comprende la etapa de introducir una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el primer y segundo CAR; o uno o más vectores como se ha definido anteriormente en un linfocito T.

El linfocito T puede ser de una muestra aislada de un paciente, un donante de trasplante hematopoyético emparentado o no emparentado, un donante completamente ajeno, de sangre del cordón umbilical, diferenciado de una línea de células madre embrionaria, diferenciado de una línea celular progenitora inducible, o derivado de una línea de linfocitos T transformada.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de linfocitos T o NK de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En el presente documento se describe un método para tratar y/o prevenir una enfermedad, que comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica de acuerdo con el octavo aspecto de la invención a un sujeto.

El método puede comprender las siguientes etapas:

(i) aislamiento de un linfocito T como se ha enumerado anteriormente.

(ii) transducción o transfección de los linfocitos T con una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el primer y segundo CAR o uno o más vectores que comprenden dicha secuencia o secuencias de ácidos nucleicos; y

(iii) administrar los linfocitos T de (ii) al sujeto.

La enfermedad puede ser un cáncer.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con el octavo aspecto de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

La enfermedad puede ser un cáncer.

Además, en el presente documento se describe el uso de un linfocito T de acuerdo con el primer aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

La enfermedad puede ser un cáncer.

También se describe en el presente documento una secuencia de ácido nucleico que comprende:

a) una primera secuencia de nucleótidos que codifica un primer receptor de antígeno quimérico (CAR);

b) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un segundo CAR;

c) una secuencia que codifica un péptido autoescindible posicionado entre la primera y segunda secuencias de nucleótidos, de manera que los dos CAR se expresan como entidades separadas.

Se pueden usar codones alternativos en una o más porciones de la primera y segunda secuencias de nucleótidos en regiones que codifican la misma secuencia o secuencias de aminoácidos, o similares.

La presente divulgación también proporciona un vector y una célula que comprenden tal secuencia de ácido nucleico.

La "puerta Y NO" de la presente invención ofrece una ventaja significativa sobre los enfoques con CAR descritos hasta la fecha que implican dirigirse a un único antígeno asociado a un tumor. Aquí, cuando una célula tumoral se caracteriza por la presencia de uno (o más) antígeno(s) y la ausencia de otro antígeno, esto puede ser dirigido específicamente usando el enfoque basado en CAR Y NO de la presente invención. Una célula normal, que expresó ambos antígenos, no será la diana, lo que conducirá a una mayor selectividad y reducirá la toxicidad del tumor, fuera de diana. Un enfoque CAR dirigido a un solo antígeno se enfocaría tanto en células tumorales como en células normales en esta situación.

Descripción detallada

RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICOS (CAR)

Los CAR, que se muestran esquemáticamente en la figura 1, son proteínas transmembrana quiméricas de tipo I que conectan un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular (ligante) con un dominio de señalización intracelular (endodominio). El ligante es típicamente un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb), pero puede basarse en otros formatos que comprenden un sitio de unión a antígeno de tipo anticuerpo. Normalmente, es necesario un dominio espaciador para aislar el ligante de la membrana y permitir una orientación adecuada. Un dominio espaciador común utilizado es el Fc de IgG1. Los espaciadores más compactos pueden ser suficientes, por ejemplo, el pedúnculo de CD8a e incluso solo la bisagra de IgG1 en solitario, dependiendo del antígeno. Un dominio transmembrana ancla la proteína en la membrana celular y conecta el espaciador al endodominio.

Los primeros diseños de CAR tenían endodominios derivados de las partes intracelulares de la cadena y de FcsRI o CD3Z. En consecuencia, estos receptores de primera generación transmitieron la señal inmunológica 1, que fue suficiente para desencadenar la destrucción de linfocitos T de las células diana relacionadas, pero no pudo activar completamente al linfocito T para proliferar y sobrevivir. Para superar esta limitación, se han construido endodominios compuestos: la fusión de la parte intracelular de una molécula coestimuladora de linfocitos T con la de CD3Z da como resultado receptores de segunda generación que pueden transmitir una señal activadora y coestimuladora simultáneamente después del reconocimiento de antígeno. El dominio coestimulador más utilizado es el de CD28. Este suministra la señal coestimuladora más potente, es decir, la señal inmunológica 2, que desencadena la proliferación de linfocitos T. También se han descrito algunos receptores que incluyen los endodominios de la familia de receptores de TNF, tales como OX40 y 41BB estrechamente relacionados que transmiten señales de supervivencia. Incluso se han descrito CAR más potentes de tercera generación que tienen endodominios capaces de transmitir señales de activación, proliferación y supervivencia.

Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden transferirse a linfocitos T usando, por ejemplo, vectores retrovirales. Se pueden emplear vectores lentivirales. De esta manera, puede generarse una gran cantidad de linfocitos T específicos del cáncer para transferencia celular adoptiva. Cuando el CAR se une al antígeno diana, esto da como resultado la transmisión de una señal de activación al linfocito T en el que se expresa. Por lo tanto, el CAR dirige la especificidad y la citotoxicidad del linfocito T hacia las células tumorales que expresan el antígeno diana.

La presente divulgación se refiere a un linfocito T que coexpresa un primer CAR y un segundo CAR de modo que un linfocito T puede reconocer un patrón de expresión deseado en las células diana como una puerta lógica como se detalla en las tablas de verdad: Tabla 1,2 y 3.

Tanto el primero como el segundo (y opcionalmente el posterior) CAR comprenden:

(i) un dominio de unión a antígeno;

(ii) un espaciador;

(iii) un dominio transmembrana; y

(iii) un dominio intracelular.

Tabla 1: T l v r r l P ERTA CAR

Tabl ^ CAR

T abl : T l v r r l P ERTA Y N ^ CAR

El primer y segundo CAR del linfocito T de la presente invención se pueden producir como un polipéptido que comprende ambos CAR, junto con un sitio de escisión.

Las SEQ ID No. 1 a 5 dan ejemplos de dichos polipéptidos, comprendiendo cada uno dos CAR. Por lo tanto, el CAR puede comprender una u otra parte de las siguientes secuencias de aminoácidos, que corresponde a un único CAR. La SEQ ID No 1 es una puerta O de CAR de referencia que reconoce CD19 O CD33

La SEQ ID No 2 es una puerta Y de CAR de referencia que reconoce CD19 Y CD33 usando una fosfatasa de CD148

La SEQ ID No 3 es una implementación alternativa de referencia de la PUERTA Y de CAR que reconoce CD19 Y CD33 que usa una fosfatasa de CD45

La SeQ ID No 4 es una PUERTA Y NO de CAR que reconoce CD19 Y NO CD33 basándose en una fosfatasa de PTPN6

La SEQ ID No 5 es una implementación alternativa de referencia de la puerta Y NO de CAR que reconoce CD19 Y NO CD33 y se basa en un endodominio que contiene ITIM de LAIR1

La SEQ ID No 6. es una implementación alternativa adicional de referencia de la puerta Y NO de CAR que reconoce CD19 Y NO CD33 y recluta una proteína de fusión PTPN6-CD148 en un endodominio que contiene ITIM.

SEQ ID No. 1 (solo para referencia)

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPD

GTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTK

LEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYG

VSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYC

AKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG

AVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQL

YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE

RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQ

VLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLI

YDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRS

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMH

WIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYC

AAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK

DTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNGVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPA

YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA

YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No. 2 (solo para referencia)

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPD

GTVKLUYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTK

LEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYG

VSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYC

AKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG

AVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQL

YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE

RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQ

VLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLI

YDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRS

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMH

WIRGAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYC

AAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK

DTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPK

KSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPY

DISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLT

KCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHF

TSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENEN

TVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAP

VTTFGKTNGYIA

SEQ ID No. 3 (solo para referencia)

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPD

GTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTK

LEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYG

VSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYC

AKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG

AVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQL

YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE

RRRGKGHDGLYGGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQ

VLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLI

YDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKR3

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMH

WIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYC

AAGDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK

DTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

HGDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKALIAFLAFLIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVER

DDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYV

DILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKAT

VIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINGHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKAT

GREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDA

MLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYL

HNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVPLKH

ELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFWQMI

FQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKR

KDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDG

SQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNG

QVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSV

NGPASPALNQGS

SEQ ID No. 4

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPD

GTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTK

LEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYG

VSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYC

AKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG

AVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQL

YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE

RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQ

VLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLI

YDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRS

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMH

WIRGAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYC

AAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPATTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRG

SVKGTGLDFACDIYWAPLAGICVALLLSLIITLICYHRSRKRVCKSGGGSFWEEFESLQKQEV

KNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENA

KTYIASQGCLEATVNDFWGMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPY

SVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVPSEPGGVLSFLDQINQ

RQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQMVRAQRSGMVQTE

AQYKFIYVAIAQFIETTKKKL

SEQ ID No. 5 (solo para referencia)

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPD

GTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTK

LEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYG

VSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYC

AKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG

AVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQL

YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE

RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQ

VLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLI

YDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRS

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMH

WIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYC

AAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPATTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRG

SVKGTGLDFACDILIGVSVVFLFCLLLLVLFCLHRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVD

VLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPM

AESITYAAVARH

SEQ ID No. 6 (solo para referencia)

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPD

GTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTK

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VLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLI

YDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRS

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMH

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SVKGTGLDFACDILIGVSVVFLFCLLLLVLFCLHRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVD

VLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPM

AESITYAAVARHRAEGRGSLLTCGDVEENPGPWYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVR

ESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKT

GIEEASGAFVYLRQPYSGGGGSFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAE

NRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWR

MVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNI

QTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGT

FIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIY

QNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIASGS

El CAR puede comprender una variante de la parte que codifica CAR de la secuencia mostrada como SEQ ID No. 2 o 3 que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 % de identidad de secuencia, siempre que la secuencia variante sea un CAR que tiene las propiedades requeridas.

Los métodos de alineación de secuencias son bien conocidos en la técnica y se logran utilizando programas de alineación adecuados. El % de identidad de secuencia se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos en las dos secuencias cuando están alineadas de manera óptima. La homología o identidad de secuencia de nucleótidos y proteínas puede determinarse utilizando algoritmos estándar tal como un programa BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología) usando parámetros predeterminados, que está públicamente disponible en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Otros algoritmos para determinar la identidad u homología de secuencia incluyen: LALIGN (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/ y http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/nucleotide.html), AMAS (Análisis de múltiples secuencias alineadas, en http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/Amas/amas.html), FASTA (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/), Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), SIM (http://web.expasv.org/sim/), y EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss needle/nucleotide.html).

PUERTA LÓGICA O DE CAR (solo para referencia)

Como se describe en el presente documento, los dominios de unión a antígeno del primer y segundo CAR se unen a diferentes antígenos y ambos CAR comprenden un endodominio activador. Ambos CAR tienen dominios espaciadores diferentes para evitar el emparejamiento cruzado de los dos receptores diferentes. Por lo tanto, un linfocito T puede diseñarse para activarse tras el reconocimiento de uno o ambos antígenos. Esto es útil en el campo de la oncología como lo indica la hipótesis de Goldie-Coldman: el direccionamiento único de un único antígeno puede dar como resultado el escape del tumor por modulación de dicho antígeno debido a la alta tasa de mutación inherente a la mayoría de los cánceres. Al dirigirse simultáneamente a dos antígenos, la probabilidad de dicho escape se reduce exponencialmente.

Se conocen diversos antígenos asociados a tumores como se muestra en la siguiente Tabla 4. Para una enfermedad dada, el primer CAR y el segundo CAR pueden unirse a dos TAA diferentes asociados con esa enfermedad. De esta manera, se evita el escape del tumor modulando un solo antígeno, ya que también se dirige un segundo antígeno. Por ejemplo, cuando se dirige a una neoplasia de linfocitos B, tanto CD19 como CD20 pueden dirigirse simultáneamente. En esta realización, es importante que los dos CAR no se heterodimericen.

TABLA 4

MODELO DE SEGREGACIÓN CINÉTICA

El emparejamiento posterior de CAR para generar la puerta Y y la puerta Y NO se basa en el modelo de segregación cinética (KS) de activación de linfocitos T. Este es un modelo funcional, respaldado por datos experimentales, que explica cómo el reconocimiento de antígeno por un receptor de linfocitos T se convierte en señales de activación cadena abajo. Brevemente: en el estado fundamental, los componentes de señalización en la membrana de los linfocitos T están en homeostasis dinámica, donde los ITAM desfosforilados se ven favorecidos sobre los ITAM fosforilados. Esto se debe a una mayor actividad de las fosfatasas transmembrana de CD45/CD148 respecto a las cinasas fijadas a la membrana, tal como Ick. Cuando un linfocito T se une a una célula diana a través del reconocimiento de un receptor de linfocitos T (o CAR) del antígeno afín, se forman estrechas sinapsis inmunológicas. Esta estrecha yuxtaposición de los linfocitos T y las membranas diana excluye CD45/CD148 debido a sus grandes ectodominios que no pueden caber en la sinapsis. La segregación de una alta concentración de ITAM y cinasas asociadas a receptores de linfocitos T en la sinapsis, en ausencia de fosfatasas, conduce a un estado en el que se favorecen los ITAM fosforilados. ZAP70 reconoce un umbral de ITAM fosforilados y propaga una señal de activación de linfocitos T. Este conocimiento avanzado de la activación de linfocitos T es aprovechado por la presente invención. En particular, la invención se basa en el conocimiento de cómo los ectodominios de diferente longitud y/o peso y/o carga y/o configuración y/o glucosilación dan como resultado una segregación diferencial tras la formación de sinapsis.

LA PUERTA Y LÓGICA DE CAR (solo para referencia)

Tal como se describe en el presente documento, un CAR comprende un endodominio activador y un CAR comprende un endodominio inhibidor donde el CAR inhibidor inhibe constitutivamente el primer CAR activador, pero al reconocer su antígeno afín libera su inhibición del CAR activador. De esta manera, un linfocito T puede diseñarse para activarse solo si una célula diana expresa ambos antígenos afines. Este comportamiento se logra mediante el CAR activador que comprende un endodominio activador que contiene dominios ITAm , por ejemplo, el endodominio de CD3 Zeta, y el CAR inhibidor que comprende el endodominio de una fosfatasa capaz de fosforilar un ITAM (por ejemplo, CD45 o CD148). Esencialmente, los dominios del espaciador de ambos CAR son de un tamaño y/o forma y/o carga significativamente diferente. Cuando solo está ligado el CAR activador, el CAR inhibidor está en solución en la superficie del linfocito T y puede difundirse en y fuera de la sinapsis inhibiendo el CAR activador. Cuando ambos CAR están ligados, debido a diferencias en las propiedades del espaciador, los CAR activadores e inhibidores están segregados de forma diferente, lo que permite que el CAR activador desencadene la activación de los linfocitos T sin ser obstaculizada por el CAR inhibidor.

Esto es de considerable utilidad en el campo de la terapia contra el cáncer. En la actualidad, las inmunoterapias se dirigen típicamente a un antígeno. La mayoría de los cánceres no se pueden diferenciar de los tejidos normales basándose en un solo antígeno. Por lo tanto, se produce una toxicidad "específica-colateral del tumor" considerable por la cual los tejidos normales son dañados por la terapia. Por ejemplo, cuando el tratamiento va dirigido a CD20 para tratar los linfomas de linfocitos B con rituximab, se agota todo el compartimento de linfocitos B normales. Por ejemplo, mientras que cuando va dirigido a CD52 para tratar la leucemia linfocítica crónica, se agota todo el compartimento linfoide. Por ejemplo, y cuando va dirigido a CD33 para tratar la leucemia mieloide aguda, se daña todo el compartimento mieloide, etc. Al restringir la actividad a un par de antígenos, se puede desarrollar un direccionamiento mucho más refinado y, por lo tanto, una terapia menos tóxica. Un ejemplo práctico es el direccionamiento a la CLL que expresa tanto CD5 como CD19. Solo una pequeña proporción de linfocitos B normales expresa ambos antígenos, por lo que la toxicidad colateral del direccionamiento a ambos antígenos con una puerta Y lógica es sustancialmente menor que el direccionamiento a cada antígeno individualmente.

El diseño de la presente invención es una mejora considerable con respecto a la implementación anterior como se describe por Wilkie et al. ((2012). J. Clin. Immunol. 32, 1059-1070) y posteriormente probado in vivo (Kloss et al (2013) Nat. Biotechnol. 31, 71-75). En esta implementación, el primer CAR comprende un endodominio activador, y el segundo un dominio coestimulador. De esta manera, un linfocito T solo recibe una señal activadora y coestimuladora cuando ambos antígenos están presentes. Sin embargo, el linfocito T se seguirá activando en la sola presencia del primer antígeno, dando como resultado una posible toxicidad colateral. Además, la implementación de la presente invención permite múltiples puertas unidas compuestas donde una célula puede interpretar un patrón complejo de antígenos.

TABLA 5

LA PUERTA LÓGICA Y NO DE CAR

En esta realización, un CAR comprende un endodominio activador y un CAR comprende un endodominio inhibidor que comprende todos de PTPN6 o una parte de los mismos que comprende el dominio tirosina fosfatasa, de manera que este CAR inhibidor solo está activo cuando reconoce su antígeno afín. Por lo tanto, un linfocito T diseñado de esta manera se activa en respuesta a la sola presencia del primer antígeno, pero no se activa cuando ambos antígenos están presentes. Esta invención se implementa mediante CAR inhibidores con un espaciador que se colocaliza con el primer CAR, pero la actividad fosfatasa del CAR inhibidor no debe ser tan potente como para inhibir en solución, o el endodominio inhibidor de hecho recluta una fosfatasa únicamente cuando el CAR inhibidor reconoce su diana afín. Dichos endodominios se denominan en el presente documento "en presencia de ligadura" o semi-inhibidores.

Fedorov et al. ((2012) Experimental Hematology 41) y Chicaybam et al. ((2010) Human Gene Therapy 21 y (2011) International Reviews of Immunology 30, 294-311) describen CAR inhibidores en presencia de ligadura que comprenden los dominios intracelulares de los receptores CTLA4, PD1, LAG3, 2B4 o BTLa .

Esta invención es útil para refinar el direccionamiento cuando un tumor se puede distinguir del tejido normal por la presencia de antígeno asociado al tumor y la pérdida de un antígeno expresado en tejido normal. La puerta Y No es de considerable utilidad en el campo de la oncología, ya que permite el direccionamiento de un antígeno que es expresado por una célula normal, célula normal que también expresa el antígeno reconocido por el CAR que comprende el endodominio activador. Un ejemplo de tal antígeno es el CD33 que se expresa en células madre normales y células de leucemia mieloide aguda (AML). CD34 se expresa en células madre pero no se expresa típicamente en células de AML. Un linfocito T que reconozca CD33 Y No CD34 daría como resultado la destrucción de las células leucémicas pero no afectaría a las células madre normales.

Los pares de antígenos potenciales para su uso con puertas Y NO se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

PUERTAS COMPUESTAS

El modelo de segregación cinética con los componentes anteriores permite construir puertas compuestas, por ejemplo, un linfocito T que se activa en respuesta a patrones de más de dos antígenos diana. Por ejemplo, es posible fabricar un linfocito T que solo se active cuando estén presentes tres antígenos (A Y B Y C). Aquí, una célula expresa tres CAR, reconociendo cada una los antígenos A, B y C. Un CAR es excitador y dos son inhibidores, teniendo cada CAR dominios de espaciador que dan como resultado la segregación diferencial. Solo cuando los tres están ligados, se activará el linfocito T. Un ejemplo adicional: (A O B) Y C: en este caso, los CAR que reconocen los antígenos A y B se activan y tienen espaciadores que están colocalizados, mientras que el CAR que reconoce el antígeno C es inhibidor y tiene un espaciador que da lugar a una cosegregación diferente. Un ejemplo adicional (A Y NO B) Y C: Aquí CAR contra el antígeno A tiene un endodominio activador y se colocaliza con CAR contra el antígeno B, que tiene un endodominio inhibidor condicional. CAR contra el antígeno C tiene un espaciador que se segrega de manera diferente de A o B y es inhibidor. De hecho, se puede programar una lógica booleana cada vez más compleja con estos componentes sencillos de la invención con cualquier número de CAR y espaciadores.

PÉPTIDO SEÑAL

Los CAR del linfocito T de la presente invención pueden comprender un péptido señal de modo que, cuando el CAR se exprese dentro de una célula, tal como un linfocito T, la proteína naciente se dirija al retículo endoplásmico y posteriormente a la superficie celular, donde se expresa.

El núcleo del péptido señal puede contener un largo tramo de aminoácidos hidrófobos que tiene tendencia a formar una única hélice alfa. El péptido señal puede empezar con un tramo corto de aminoácidos cargados positivamente, que ayuda a reforzar la topología adecuada del polipéptido durante la translocación. Al final del péptido señal típicamente hay un tramo de aminoácidos que reconoce y escinde la peptidasa señal. La peptidasa señal puede escindir durante o después de completarse la translocación, para generar un péptido señal libre y una proteína madura. A continuación, los péptidos señal libres se digieren por proteasas específicas.

El péptido señal puede estar en el extremo amino de la molécula.

El péptido señal puede comprender la SEQ ID No. 7, 8 o 9 o una variante de la misma que tiene 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones de aminoácido (inserciones, sustituciones o adiciones) con la condición de que el péptido señal aún funcione causando la expresión del CAR en la superficie celular.

SEQ ID No. 7: MGTSLLCWMALCLLGADHADG

El péptido señal de la SEQ ID No. 7 es compacto y altamente eficaz. Se predice que proporcione aproximadamente un 95 % de escisión después de la glicina terminal, dando una eliminación eficaz por la peptidasa señal.

SEQ ID No. 8: MSLPVTALLLPLALLLHAARP

El péptido señal de la SEQ ID No. 8 procede de la IgG1.

SEQ ID No. 9: MAVPTQVLGLLLLWLTDARC

El péptido señal de la SEQ ID No. 9 procede de la CD8.

El péptido señal para el primer CAR puede tener una secuencia diferente del péptido señal del segundo CAR (y del 3er CAR y 4° CAR, etc.).

DOMINIO DE UNIÓN A ANTÍGENO

El dominio de unión a antígeno es la porción del CAR que reconoce el antígeno. Se conocen numerosos dominios de unión a antígeno en la técnica, incluidos los basados en el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, miméticos de anticuerpos, y receptores de linfocitos T. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede comprender: un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal; un ligando natural del antígeno diana; un péptido con suficiente afinidad por la diana; un anticuerpo de dominio único; un ligante artificial único tal como Darpin (proteína repetida de anquirina diseñada); o una cadena sencilla derivada de un receptor de linfocitos T.

El dominio de unión a antígeno puede comprender un dominio que no está basado en el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede comprender un dominio basado en una proteína/péptido que es un ligando soluble para un receptor de la superficie celular (por ejemplo, un péptido soluble, tal como una citocina o una quimiocina); o un dominio extracelular de un ligando anclado a la membrana o un receptor para el que el par de unión se expresa en la célula tumoral.

Los ejemplos 11 a 13 se refieren a un CAR que se une a BCMA, en el que el dominio de unión a antígeno comprende APRIL, un ligando para BCMA.

El dominio de unión a antígeno puede basarse en un ligando natural del antígeno.

El dominio de unión a antígeno puede comprender un péptido de afinidad de una biblioteca combinatoria o una proteína/péptido de afinidad diseñada de novo.

DOMINIO ESPACIADOR

Los CAR comprenden una secuencia espaciadora para conectar el dominio de unión al antígeno con el dominio transmembrana y separar espacialmente el dominio de unión a antígeno del endodominio. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para posibilitar la unión.

En el linfocito T de la presente invención, el primer y segundo CAR pueden comprender diferentes moléculas espaciadoras. Por ejemplo, la secuencia espaciadora puede comprender, por ejemplo, una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un pedúnculo de CD8 humana o el pedúnculo de CD8 de ratón. El espaciador puede comprender, como alternativa, una secuencia enlazadora alternativa que tiene una longitud y/o propiedades espaciadoras de dominio similares como una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un pedúnculo de CD8. Un espaciador de IgG1 humana puede alterarse para eliminar los motivos de unión a Fc.

Los ejemplos de secuencias de aminoácidos para estos espaciadores se dan a continuación:

SEQ ID No. 10 (bisagra-CH2CH3 de lgG1 humana)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD

SEQ ID No. 11 (pedúnculo de CD8 humana):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

SEQ ID No. 12 (bisagra de lgG1 humana):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK

SEQ ID No. 13 (ectodominio de CD2)

KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLF

KNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNG

TDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCP EKGLD

SEQ ID no. 14 (ectodominio de CD34)

SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKF

TSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATS

PTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQ

ADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVA

SHQSYSQKT

Dado que los CAR son típicamente homodímeros (véase la figura 1a), el emparejamiento cruzado puede dar como resultado un receptor de antígeno quimérico heterodimérico. Esto no es deseable por varias razones, por ejemplo: (1) el epítopo puede no estar al mismo "nivel" en la célula diana, de modo que un c Ar emparejado cruzado solo puede unirse a un antígeno; (2) el VH y el VL de los dos scFv diferentes podrían intercambiarse y no reconocer la diana o peor aún reconocer un antígeno inesperado e impredecible. Para la puerta "O" y la puerta "Y NO", el espaciador del primer CAR es suficientemente diferente del espaciador del segundo CAR para evitar el emparejamiento cruzado. La secuencia de aminoácidos del primer espaciador puede compartir menos del 50 %, 40 %, 30 % o 20 % de identidad a nivel de aminoácidos con el segundo espaciador.

En otros aspectos descritos en el presente documento (por ejemplo, la puerta Y) es importante que el espaciador del primer CAR tiene una longitud y/o carga, y/o forma, y/o configuración, y/o glucosilación diferente de modo que cuando tanto el primer como el segundo CAR se unen a su antígeno diana, la diferencia en la carga o dimensiones del espaciador de como resultado la separación espacial de los dos tipos de CAR en diferentes partes de la membrana para que se produzca la activación según lo predicho por el modelo de separación cinética. En estos aspectos, la diferente longitud, forma y/o configuración de los espaciadores se elige cuidadosamente teniendo en cuenta el tamaño y el epítopo de unión en el antígeno diana para permitir la segregación diferencial en el reconocimiento de dianas afines. Por ejemplo, se espera que la bisagra de IgG1, el pedúnculo de CD8, Fc de IgG1, el ectodominio de CD34, y el ectodominio de CD45 se segreguen diferencialmente.

En la siguiente tabla se muestran ejemplos de pares de espaciadores que se segregan diferencialmente y, por lo tanto, son adecuados para su uso con la puerta Y:

Espaciador de CAR estimulador Espaciador de CAR inhibidor

CD8STK humana Bisagra-CH2CH3 de IgG humana

Ectodominio de CD3z humana Bisagra-CH2CH3 de IgG humana

Bisagra de IgG humana Bisagra-CH2CH3 de IgG humana

CD28STK humana Bisagra-CH2CH3 de IgG humana

CD8STK humana Bisagra-CH2CH3CD4 de IgG humana

Ectodominio de CD3z humana Bisagra-CH2CH3CD4 de IgG humana

Bisagra de IgG humana Bisagra-CH2CH3CD4 de IgG humana

CD28STK humana Bisagra-CH2CH3CD4 de IgG humana

En aspectos de la invención, es importante que el espaciador sea lo suficientemente diferente como para evitar el emparejamiento cruzado, pero lo suficientemente similar para colocalizarse. Pueden emplearse pares de secuencias espaciadoras ortólogas. Son ejemplos los pedúnculos de CD8 murina y humana o, como alternativa, dominios espaciadores que son monoméricos, por ejemplo, el ectodominio de CD2.

En la siguiente tabla se muestran ejemplos de pares de espaciadores que se colocalizan y, por lo tanto, son adecuados para su uso con la puerta Y NO:

Espaciador de CAR estimulador Espaciador de CAR inhibidor

CD28STK humana CD28STK de ratón

Bisagra de IgG humana Ectodominio de CD3z humana

CD28STK humana CD28STK de ratón

| CD28STK humana

CD28STK de ratón

Bisagra-CH2CH3 de IgG humana Bisagra-CH2CH3CD4 de lgM humana

Todos los dominios espaciadores mencionados anteriormente forman homodímeros. Sin embargo, el mecanismo no se limita al uso de receptores homodiméricos y debería funcionar con receptores monoméricos siempre que el espaciador sea suficientemente rígido. Un ejemplo de dicho espaciador es CD2 o CD22 truncado.

DOMINIO TRANSMEMBRANA

El dominio transmembrana es la secuencia del CAR que se extiende por la membrana.

Un dominio transmembrana puede ser cualquier estructura de proteína que sea termodinámicamente estable en una membrana. Esto es típicamente una hélice alfa que comprende varios residuos hidrófobos. El dominio transmembrana de cualquier proteína transmembrana se puede usar para suministrar la porción transmembrana de la invención. Los expertos en la técnica pueden determinar la presencia y la extensión de un dominio transmembrana de una proteína utilizando el algoritmo TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Además, dado que el dominio transmembrana de una proteína es una estructura relativamente sencilla, es decir, una secuencia de polipéptidos prevista para formar una hélice alfa hidrófoba de longitud suficiente para abarcar la membrana, también se puede usar un dominio TM diseñado artificialmente (el documento US 7052906 B1 describe componentes transmembrana sintéticos).

El dominio transmembrana puede obtenerse de CD28, que da una buena estabilidad de receptor.

ENDODOMINIO DE ACTIVACIÓN

El endodominio es la parte de transmisión de señales del CAR. Después del reconocimiento del antígeno, el grupo de receptores, CD45 y CD148 nativos se excluyen de la sinapsis y se transmite una señal a la célula. El componente de endodominio más habitualmente usado es el de CD3-zeta que contiene 3 ITAM. Este transmite una señal de activación al linfocito T después de que se una al antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación completamente competente y puede necesitarse una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, pueden usarse CD28 y OX40 quiméricos con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa/de supervivencia, o pueden usarse los tres conjuntamente.

Cuando el linfocito T de la presente invención comprende un CAR con un endodominio activador, puede comprender el endodominio de CD3-Zeta en solitario, el endodominio de CD3-Zeta con el de CD28 u OX40 o el endodominio de CD28 y el endodominio de OX40 y de CD3-Zeta.

Cualquier endodominio que contenga un motivo ITAM puede actuar como un endodominio activador en la presente invención. Se sabe que varias proteínas contienen endodominios con uno o más motivos ITAM. Ejemplos de dichas proteínas incluyen la cadena épsilon de CD3, la cadena gamma de CD3 y la cadena delta de CD3, por nombrar algunas. El motivo ITAM puede reconocerse fácilmente como una tirosina separada de una leucina o isoleucina por otros dos aminoácidos, dando la firma YxxL/l. Típicamente, pero no siempre, dos de estos motivos están separados por entre 6 y 8 aminoácidos en la cola de la molécula (YxxL/lx(6-8)YxxL/l). Por lo tanto, un experto en la técnica puede encontrar fácilmente proteínas existentes que contienen uno o más ITAM para transmitir una señal de activación. Además, dado que el motivo es sencillo y no se requiere una estructura secundaria compleja, los expertos en la técnica pueden diseñar polipéptidos que contengan ITAM artificiales para transmitir la señal de activación (véase el documento WO 2000063372, que se refiere a moléculas de señalización sintéticas).

El dominio de señalización de linfocitos T transmembrana e intracelular (endodominio) de un CAR con un endodominio activador puede comprender la secuencia mostrada como SEQ ID No. 15, 16 o 17 o una variante de la misma, que tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia.

SEQ ID No. 15 que comprende el dominio transmembrana de CD28 y el endodominio de CD3 Z

FW V LV VVG G VLA C Y S LLV TV A FIIFW V R R V K FS R S A D A P A Y Q Q G Q N Q LY N E LN LG R R E E Y

D VLD K R R G R D P E M G G K P R R K N P Q E G LY N E LQ K D K M A E A Y S E IG M K G E R R R G K G H D G LY

Q G LSTA TK D TY D ALH M Q A LPP R

SEQ ID No. 16 que comprende el dominio transmembrana de CD28 y los endodominios de CD28 y CD3 Zeta

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPP

RDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR

KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP

PR

SEQ ID No. 17 que comprende el dominio transmembrana de CD28 y los endodominios de CD28, OX40 y CD3 Zeta.

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPP

RDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQG

QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIG

MKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Una secuencia variante puede tener al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID No. 15, 16 o 17, con la condición de que la secuencia proporcione un dominio transmembrana eficaz y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T eficaz.

ENDODOMINIO INHIBIDOR EN "AUSENCIA DE LIGADURA" (solo para referencia)

En la puerta Y descrita en el presente documento, uno de los CAR comprende un endodominio inhibidor, de tal modo que el CAR inhibidor inhibe la activación de linfocitos T por el CAR activador en ausencia de ligadura del CAR inhibidor, pero no inhibe significativamente la activación de linfocitos T por el CAR activador cuando el CAR inhibidor está ligado. Este se denomina un endodominio inhibidor en "ausencia de ligadura".

En este caso, el espaciador del CAR inhibidor tiene una longitud, carga, forma y/o configuración y/o glucosilación diferente del espaciador del CAR activador, de modo que cuando ambos receptores están ligados, la diferencia en las dimensiones del espaciador da como resultado el aislamiento de los CAR activadores y los CAR inhibidores en diferentes compartimentos de membrana de la sinapsis inmunológica, de modo que el endodominio activador se libera de la inhibición por el endodominio inhibidor.

Por lo tanto, los endodominios inhibidores para su uso en un CAR inhibidor de la ligadura pueden comprender cualquier secuencia que inhiba la señalización de linfocitos T por el CAR activador cuando está en el mismo compartimento de membrana (es decir, en ausencia del antígeno para el CAR inhibidor) pero que no inhibe significativamente la señalización de los linfocitos T cuando se aísla en una parte separada de la membrana del CAR inhibidor.

El endodominio inhibidor en ausencia de la ligadura puede ser o comprender una tirosina fosfatasa, tal como una tirosina fosfatasa de tipo receptor. Un endodominio inhibidor puede ser o comprender cualquier tirosina fosfatasa que sea capaz de inhibir la señalización de TCR cuando solo se liga el receptor estimulante. Un endodominio inhibidor puede ser o comprender cualquier tirosina fosfatasa con una velocidad catalítica suficientemente rápida para ITAM fosforilados que sea capaz de inhibir la señalización de TCR cuando solo se liga el receptor estimulante.

Por ejemplo, el endodominio inhibidor de una puerta Y de la invención comprende el endodominio de CD148 o CD45. Se ha mostrado que CD148 y CD45 actúan de forma natural en las tirosinas fosforiladas cadena arriba de la señalización de TCR.

CD148 es una proteína tirosina fosfatasa de tipo receptor que regula negativamente la señalización de TCR interfiriendo con la fosforilación y la función de PLCy I y LAT.

CD45 presente en todas las células hematopoyéticas, es una proteína tirosina fosfatasa que es capaz de regular la transducción de señales y las respuestas funcionales, de nuevo mediante la fosforilación de PLC y1.

Un endodominio inhibidor puede comprender toda una parte de una tirosina fosfatasa similar a un receptor. La fospatasa puede interferir con la fosforilación y/o función de elementos involucrados en la señalización de células T, como PLCy1 y / o LAT.

El segmento transmembrana y el endodominio de CD45 y CD148 se muestran como la SEQ ID No. 18 y No. 19, respectivamente.

SEQ ID 18 - secuencia transmembrana y del endodominio de CD45

ALIAFLAFLIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYK

RKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSN

YINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWP

SMEEGTRAFGDWVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPH

LLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQ

RCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLP

SYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVPLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSE

EPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQ

YWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEP

KELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDI

FQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQ

DANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS

SEQ ID 19 - secuencia transmembrana y del endodominio de CD148

AVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSN

CGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYM

PGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQD

YGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVR

DYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTED

QYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

Un CAR inhibidor puede comprender toda o parte de la SEQ ID No 18 o 19 (por ejemplo, puede comprender la función fosfatasa del endodominio). Puede comprender una variante de la secuencia o parte de la misma que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia, siempre que la variante conserve la capacidad de inhibir basalmente la señalización de linfocitos T por el CAR activador.

Se pueden probar otros espaciadores y endodominios, por ejemplo, usando el sistema modelo ilustrado en el presente documento. Las poblaciones de células diana se pueden crear transduciendo una línea celular adecuada, tal como una línea celular SupT1, ya sea de forma individual o doble para establecer células negativas para ambos antígenos (el tipo silvestre), positivas para uno de ellos y positivas para ambos (por ejemplo, CD19-CD33-, CD19+CD33-, CD19-CD33+ y CD19+CD33+). Los linfocitos T, tal como la línea de linfocitos T de ratón BW5147 que libera IL-2 tras la activación, pueden transducirse con pares de CAR y su capacidad para funcionar en una puerta lógica se mide mediante la medición de la liberación de IL-2 (por ejemplo, mediante ELISA). Por ejemplo, se muestra en el Ejemplo 4 que los endodominios de CD148 y CD45 pueden funcionar como CAR inhibidores en combinación con un c Ar activador que contiene un endodominio de CD3 Zeta. Estos CAR se basan en un espaciador de pedúnculo de CD8 corto/no voluminoso en un CAR y un espaciador Fc voluminoso en el otro CAR para lograr la actividad de puerta Y. Cuando ambos receptores están ligados, la diferencia en las dimensiones del espaciador da como resultado el aislamiento de los diferentes receptores en diferentes compartimientos de membrana, liberando al receptor CD3 Zeta de la inhibición por los endodominios de CD148 o CD45. De esta manera, la activación solo se produce una vez que ambos receptores se han activado. Realmente se puede ver que este sistema modular puede usarse para analizar pares de espaciadores alternativos y endodominios inhibidores. Si los espaciadores no consiguen el aislamiento después de la ligadura de ambos receptores, la inhibición no se liberaría y, por lo tanto, no se produciría ninguna activación. Si el endodominio inhibidor a prueba es ineficaz, se esperaría la activación en presencia de ligadura del CAR activador, independientemente del estado de ligadura del CAR inhibidor.

ENDODOMINIO "EN PRESENCIA DE LIGADURA"

En la puerta Y NO de la invención, uno de los CAR comprende un endodominio inhibidor "en presencia de ligadura", que comprende todos de PTPN6 o una parte de los mismos que comprende el dominio tirosina fosfatasa, de tal modo que el CAR inhibidor no inhibe significativamente la activación de linfocitos T por el CAR activador en ausencia de ligadura del CAR inhibidor, pero inhibe la activación de linfocitos T por el CAR activador cuando el CAR inhibidor está ligado.

Un endodominio inhibidor "en presencia de ligadura" comprende una tirosina fosfatasa que no sea capaz de inhibir la señalización de TCR cuando solo se liga el receptor estimulador.

El endodominio inhibidor "en presencia de ligadura" comprende una tirosina fosfatasa con una velocidad catalítica suficientemente lenta para los ITAM fosforilados que es incapaz de inhibir la señalización de TCR cuando solo el receptor estimulante está ligado, pero es capaz de inhibir la respuesta de señalización de TCR cuando se concentra en la sinapsis. La concentración en la sinapsis se logra mediante la ligadura del receptor inhibidor.

Si una tirosina fosfatasa tiene una velocidad catalítica que es demasiado rápida para un endodominio inhibidor "en presencia de ligadura", entonces es posible ajustar las velocidades catalíticas de la fosfatasa a través de modificaciones tales como mutaciones puntuales y enlazadores cortos (que causan impedimento estérico) para que sea adecuado para un endodominio inhibidor "en presencia de ligadura".

El endodominio comprende una fosfatasa que sea considerablemente menos activa que CD45 o CD148, de modo que la desfosforilación significativa de ITAMS solo se produzca cuando los endodominios activadores e inhibidores están colocalizados.

Las proteínas tirosina fosfatasas (PTP) son moléculas de señalización que regulan una diversidad de procesos celulares incluyendo el crecimiento celular, la diferenciación, el ciclo mitótico y la transformación oncogénica. La parte N-terminal de esta PTP contiene dos dominios homólogos de Src (SH2) en tándem, que actúan como dominios de unión a la proteína fosfotirosina y median la interacción de esta PTP con sus sustratos. Esta PTP se expresa principalmente en células hematopoyéticas y funciona como un importante regulador de múltiples vías de señalización en células hematopoyéticas.

El dominio inhibidor puede comprender la totalidad de PTPN6 (SEQ ID No. 20) o solo el dominio fosfatasa (SEQ ID No. 21).

SEQ ID 20 - Secuencia de PTPN6

MVRWFHRDLSGLDAETLLKGRGVHGSFLARPSRKNQGDFSLSVRVGDQVTHIRIQNSGDF

YDLYGGEKFATLTELVEYYTQQQGVLQDRDGTIIHLKYPLNCSDPTSERWYHGHMSGGQA

ETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGG

LETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYYATRVNAADIENRVLELNKKQESEDTAKA

GFWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYIN

ANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVP

YWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGV

PSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKT

IQMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQFIETTKKKLEVLQSQKGQESEYGNITYPPAMKNAH

AKASRTSSKHKEDVYENLHTKNKREEKVKKQRSADKEKSKGSLKRK

SEQ ID 21 - Secuencia del dominio fosfatasa de PTPN6

FWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINA

NYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPY

WPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVP

SEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTI

QMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQF

Un segundo endodominio inhibidor en presencia de ligadura es un ITIM (motivo de inhibición de inmunorreceptor basado en tirosina) que contiene un endodominio tal como el de CD22, LAIR-1, la familia de receptores inhibidores de linfocitos NK (KIR), LILRB1, CTLA4, PD-1, BTLA, etc. Cuando se fosforilan, los ITIM reclutan PTPN6 endógeno a través de su dominio SH2. Si se colocalizan con un endodominio que contiene ITAM, se produce la desfosforilación y se inhibe el CAR activador.

Un ITIM es una secuencia conservada de aminoácidos (S/l/V/LxYxxl/V/L) que se encuentra en las colas citoplásmicas de muchos receptores inhibidores del sistema inmunitario. Un experto en la técnica puede encontrar fácilmente dominios de proteínas que contengan un ITIM. Se ha generado una lista de proteínas que contienen ITIM candidatos humanos mediante exploraciones de todo el proteoma (Staub, et al (2004) Cell. Signal. 16, 435-456). Además, dado que la secuencia consenso es bien conocida y parece que se requiere poca estructura secundaria, un experto en la técnica podría generar un ITIM artificial.

Los endodominios ITIM de PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 y KIR3DL3 se muestran en la SEQ ID 22 a 31, respectivamente

SEQ ID 22 Endodominio de PDCD1

CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATI

VFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL

SEQ ID 23 BTLA4 KLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTL RFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELI QFGVGERPQAQENVDYVILKH

SEQ ID 24 LILRB1 LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQ PEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQM DTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH

SEQ ID 25 LAIR1 HRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSS QEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARH

SEQ ID 26 CTLA4 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN

SEQ ID 27 KIR2DL1

GNSRHLHVLIGTSVVIIPFAILLFFLLHRWCANKKNAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQDP

QEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP

SEQ ID 28 KIR2DL4

GIARHLHAVIRYSVAIILFTILPFFLLHRWCSKKKENAAVMNQEPAGHRTVNREDSDEQDPQ

EVTYAQLDHCIFTQRKITGPSQRSKRPSTDTSVCIELPNAEPRALSPAHEHHSQALMGSSRE

TTALSQTQLASSNVPAAGI

SEQ ID 29 KIR2DL5

TGIRRHLHILIGTSVAIILFIILFFFLLHCCCSNKKNAAVMDQEPAGDRTVNREDSDDQDPQEV

TYAQLDHCVFTQTKITSPSQRPKTPPTDTTMYMELPNAKPRSLSPAHKHHSQALRGSSRET

TALSQNRVASSHVPAAGI

SEQ ID 30 KIR3DL1

KDPRHLHILIGTSVVIILFILLLFFLLHLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEV

TYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP

SEQ ID 31 KIR3DL3

KDPGNSRHLHVLIGTSVVIIPFAILLFFLLHRWCANKKNAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQD

PQEVTYAQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTSV

Otro endodominio inhibidor en presencia de ligadura descrito en el presente documento es un endodominio que contiene ITIM coexpresado con una proteína de fusión. La proteína de fusión puede comprender al menos parte de una proteína tirosina fosfatasa y al menos parte de una tirosina fosfatasa de tipo receptor. La fusión puede comprender uno o más dominios SH2 de la proteína tirosina fosfatasa. Por ejemplo, la fusión puede ser entre un dominio SH2 de PTPN6 y un endodominio de CD45 o entre un dominio SH2 de PTPN6 y un endodominio de CD148. Cuando se fosforilan, los dominios ITIM reclutan la proteína de fusión, lo que lleva a la fosfatasa CD45 o CD148 altamente potente a la proximidad del endodominio activador que bloquea la activación.

Las SECUENCIAS de proteínas de fusión se enumeran 32 y 33

SEQ ID 32 Proteína de fusión PTPN6-CD45

WYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKV

MCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYKIYDLHKKRSCNLDEQQ

ELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQN

KNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIW

EQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNK

KEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTY

IGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSEL

HPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRV

LKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFMI

QRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRK

DSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGS

QQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQ

VKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVN

GPASPALNQGS

SEQ ID 33 fusión PTPN6-CD148

ETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGG

LETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENF

EAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQ

THSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTK

CEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVP

DTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYD

LRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGY

IA

Un CAR inhibidor en presencia de ligadura puede comprender la totalidad o parte de la SEQ ID No 20 o 21.

Como anteriormente, Se pueden probar espaciadores y endodominios alternativos, por ejemplo, usando el sistema modelo ilustrado en el presente documento. En el Ejemplo 5 se muestra que el endodominio de PTPN6 puede funcionar como un CAR semi-inhibidor en combinación con un CAR activador que contiene un endodominio de CD3 Zeta. Estos CAR se basan en un espaciador en el pedúnculo de CD8 humana en un CAR y un espaciador en el pedúnculo de CD8 de ratón en el otro CAR. Las secuencias ortólogas evitan el emparejamiento cruzado. Sin embargo, cuando ambos receptores están ligados, la similitud entre los espaciadores da como resultado la cosegregación de los diferentes receptores en los mismos compartimentos de la membrana. Esto da como resultado la inhibición del receptor CD3 Zeta por el endodominio de PTPN6. Si solo está ligado el CAR activador, el endodominio de PTPN6 no es suficientemente activo para prevenir la activación de los linfocitos T. De esta manera, la activación solo se produce si el CAR activador está ligado y el CAR inhibidor no está ligado (puerta Y NO). Realmente se puede ver que este sistema modular puede usarse para analizar pares de espaciadores alternativos y dominios inhibidores. Si los espaciadores no consiguen la cosegregación después de la ligadura de ambos receptores, la inhibición no sería eficaz y, por lo tanto, se produciría la activación. Si el endodominio semi-inhibidor a prueba es ineficaz, se esperaría la activación en presencia de ligadura del CAR activador, independientemente del estado de ligadura del CAR semiinhibidor.

SITIO DE COEXPRESIÓN

El segundo aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el primer y segundo CAR.

El ácido nucleico puede producir un polipéptido que comprende las dos moléculas CAR unidas por un sitio de escisión. El sitio de escisión puede ser autoescindible, de modo que cuando se produce el polipéptido, se escinde inmediatamente en el primer y segundo CAR sin necesidad de ninguna actividad de escisión externa.

Se conocen diversos sitios de autoescisión, incluido el péptido de autoescisión del virus de la fiebre aftosa (FMDV) 2a, que tiene la secuencia mostrada como SEQ ID No. 34:

SEQ ID No. 34

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP.

La secuencia de coexpresión puede ser una secuencia de entrada interna al ribosoma (IRES). La secuencia de coexpresión puede ser un promotor interno.

CÉLULA

El primer aspecto de la invención se refiere a un linfocito T o linfocito NK que coexpresa un primer CAR y un segundo CAR en la superficie celular.

Los linfocitos T son un tipo de linfocitos que desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como los linfocitos B y los linfocitos citolíticos naturales (linfocitos NK), por la presencia de un receptor de linfocitos T (TCR) en la superficie celular. Hay diversos tipos de linfocitos T, tal como se resume a continuación.

Los linfocitos T auxiliares (linfocitos TH) ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluyendo la maduración de linfocitos B en células plasmáticas y linfocitos B de memoria, y la activación de linfocitos T citotóxicos y macrófagos. Los linfocitos TH expresan CD4 en su superficie. Los linfocitos TH se activan cuando las moléculas MHC de clase II les presentan antígenos peptídicos en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Estas células pueden diferenciarse en uno de varios subtipos, incluyendo TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 o TFH, que secretan diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respuestas inmunitarias.

Los linfocitos T citotóxicos (linfocitos TC o CTL) destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Los CTL expresan el CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con MHC clase I, que está presente en la superficie de todas las células nucleadas. A través de la IL-10, la adenosina y otras moléculas secretadas por los linfocitos T reguladores, las células CD8+ pueden inactivarse a un estado anérgico, que previene enfermedades autoinmunitarias tales como la encefalomielitis autoinmunitaria experimental.

Los linfocitos T de memoria son un subconjunto de linfocitos T específicos de antígeno que persisten a largo plazo después de que se resuelve una infección. Se expanden rápidamente a un gran número de linfocitos T efectores tras la reexposición a su antígeno relacionado, proporcionando así al sistema inmune "memoria" contra infecciones pasadas. Los linfocitos T de memoria comprenden tres subtipos: linfocitos T de memoria central (linfocitos TCM) y dos tipos de linfocitos T efectores de memoria (linfocitos TEM y linfocitos TEMRA). Los linfocitos de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Los linfocitos T de memoria típicamente expresan la proteína de la superficie celular CD45RO.

Los linfocitos T reguladores (linfocitos Treg), anteriormente conocido como linfocitos T supresores, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. Su función principal es detener la inmunidad mediada por linfocitos T hacia el final de una reacción inmunitaria y suprimir linfocitos T autorreactivos que escaparon al proceso de selección negativa en el timo.

Se han descrito dos clases principales de linfocitos Treg CD4+: los linfocitos Treg naturales y los linfocitos Treg adaptativos.

Los linfocitos Treg de origen natural (también conocidos como linfocitos Treg CD4+CD25+FoxP3+) surgen en el timo y se han relacionado con interacciones entre los linfocitos T en desarrollo con células dendríticas mieloides (CD11c+) y plasmacitoides (CD123+) que se han activado con TSLP. Los linfocitos Treg de origen natural se pueden distinguir de otros linfocitos T por la presencia de una molécula intracelular llamada FoxP3. Las mutaciones del gen FOXP3 pueden prevenir el desarrollo de linfocitos T reguladores, causando la enfermedad autoinmunitaria letal IPEX.

Los linfocitos Treg adaptativos (también conocidos como linfocitos Tr1 o linfocitos Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal.

El linfocito T de la invención puede ser cualquiera de los tipos de linfocitos T mencionados anteriormente, en particular un CTL.

Los linfocitos citolíticos naturales (NK) son un tipo de célula citolítica que forma parte del sistema inmunitario innato. Los linfocitos NK proporcionan respuestas rápidas a las señales innatas de las células infectadas por virus de manera independiente del m Hc

Los linfocitos NK (que pertenecen al grupo de las células linfoides innatas) se definen como linfocitos granulares grandes (LGL) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas del progenitor linfoide común que genera linfocitos B y T. Se sabe que los linfocitos NK se diferencian y maduran en la médula ósea, ganglio linfático, bazo, las amígdalas y el timo, donde luego entran en la circulación.

Las células con CAR de la invención pueden ser cualquiera de los tipos de células mencionados anteriormente. Las células que expresan CAR, tales como linfocitos T o NK que expresan CAR, pueden ser creadas ex vivo ya sea de la propia sangre periférica del paciente (1a parte), o en el contexto de un trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre periférica del donante (2a parte), o de sangre periférica de un donante no relacionado (3a parte).

La presente invención también proporciona una composición celular que comprende linfocitos T que expresan CAR y/o linfocitos NK que expresan CAR de acuerdo con la presente invención. La composición celular puede hacerse transduciendo o transfectando una muestra de sangre ex vivo con un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

Como alternativa, las células que expresan CAR pueden derivarse de la diferenciación ex vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias al tipo de célula relevante, tales como linfocitos T. Como alternativa, se puede usar una línea celular inmortalizada tal como una línea de linfocitos T que conserva su función lítica y podría actuar como un agente terapéutico.

En todas estas realizaciones, las células con CAR se generan mediante la introducción de ADN o ARN que codifica los CAR por uno de los muchos medios, incluida la transducción con un vector viral, la transfección con a Dn o ARN. Un linfocito T con CAR de la invención puede ser un linfocito T ex vivo de un sujeto. El linfocito T puede ser de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Los linfocitos T pueden activarse y/o expandirse antes de ser transducidos con ácido nucleico que codifica CAR, por ejemplo, mediante tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.

Un linfocito T con CAR de la invención puede hacerse mediante:

(i) aislamiento de una muestra que contiene linfocitos T de un sujeto u otras fuentes enumeradas anteriormente; y (ii) transducción o transfección de los linfocitos T con una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el primer y el segundo CAR.

Después, los linfocitos T pueden purificarse, por ejemplo, seleccionarse en base de la coexpresión del primer y segundo CAR.

SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO

El segundo aspecto de la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica tanto un primer CAR como un segundo CAR tal como se define en el primer aspecto de la invención.

La secuencia de ácido nucleico puede comprender una de las siguientes secuencias, o una variante de las mismas SEQ ID 38 puerta Y NO usando PTPN6 como endodominio

SEQ ID No. 35: (solo para referencia)

>MP13974.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3pvaa-CD28tmZw ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCC AGACCAGACAT CCAGAT GACCCAGACCACC AGCAGCCT GAGCGCCAGCCT GGGCGAC CGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACC AGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACA GCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACC ATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCC TGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAG GCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGT GAAGCTGGAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGAC CTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCC CCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTA CAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGT GTTCCT GAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCAT CT ACTACT GCGCCAAG CACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTG ACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCC ACCAT CGCGTCGCAGCCCCTGT CCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGG GGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGT GGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTT TCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGG GCCAGAACCAGCT CT AT AACGAGCT CAAT CTAGGACGAAGAGAGGAGT ACG AT GTTTT GGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACC CTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGA G ATT GGGAT GAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACG AT GGCCTTT ACCAGG GTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCC TCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCC CGGGCCCATGGCCGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGTTGCTACTGTGGCTTACAGAT G CCAGAT GT GAC ATCC AGATG ACACAGT CTCC AT CTT CCCTGTCTGCATCTGT CGG AG A TCG CGTC ACCATC ACCTGTCG AGCAAGTGAG G AC ATTTATTTT AATTT AGTGTGGTATC A GCAGAAACCAGGAAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATACAAATCGCTTGGCAGAT GGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCTCTGGATCTGGCACACAGTATACTCTAACCATAA GT AGCCTGCAACCCGAAGATTT CGCAACCT ATT ATT GTC A AC ACT AT AAG AATT AT CCG C TCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAAGATCTGGTGGCGGAGGGTCAG GAGGCGGAGGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGAGGCGGAGGCTCGAGATCTGAGGTG CAGTTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCC TGTG C AG CCT C AGG ATT CACT CT CAGT AATT ATGG C ATG C ACT GG AT CAGGC AG GCT C CAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCGTCTATTAGTCTTAATGGTGGTAGCACTTACTAT CGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGGGACAATGCAAAAAGCACCCTCT ACCTT CA AAT G AAT AGT CT G AGGGCCG AGGACACGGCCGT CT ATT ACTGT GCAGC ACA G G ACGCTT AT ACGGG AG GTT ACTTT G ATT ACT GG GGCCA AGG AACGCT GGT CAC AGT C T CGT CT ATGG AT CCCGCCG AGCCCAA AT CT CCTG ACAAAACT C AC AC AT GCCCACCGT GCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA CG A AG ACCCT GAGGT C AAGTT C AACT GGT ACGT GG ACGGCGT GG AG GTGC AT AAT G CC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAG CCT GACCTGCCTGGT CAAAGGCTTCT ATCCGAGCGACAT CGCCGT GGAGTGGGAGAG CAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGG CTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCT CAT GCTCCGT G AT GCAT G AGGCCCTGC ACA ATC ACT ATACCCAG AA ATCTCT GAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGTTCTGGGTCCTGGTGGTGGTGGGAGG CGT GCTGG CCT GTT ACTCTCTCCTGGTG ACCGT GGCCTT CAT CAT CTTTTGGGT GCG CT

CCCGGGTGAAGTTTTCTCGCTCTGCCGATGCCCCAGCCTATCAGCAGGGCCAGAATCA

GCTGTACAATGAACTGAACCTGGGCAGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGCG

G AGAGGCAG AGACCCCGAG AT GGGCGGCAAACCACGGCGCAAAAAT CCCC AGG AGG

GACTCTATAACGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAGGCCTATTCCGAGATCGGCAT

GAAGGGAGAGAGAAGACGCGGAAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGATTGTCCAC

CGCTACAAAAGATACATATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCACCCAGATGA

SEQ ID No. 36 (solo para referencia)

>MP14802.SFG.aCD19fmc63_clean-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3pvaa-dCD45

ATGAGCCT GCCCGT GACCGCCCT GCTGCT GCCCCT GGCCCT GCTGCT GCACGCCGCC

AG ACCAGACAT CCAGAT GACCCAG ACCACCAGCAGCCT GAGCGCCAGCCT GGGCG AC

CGGGT G ACC AT CAGCT GC AG AGCC AGCCAGG ACAT CAGCAAGT ACCT G AACTGGT ACC

AGCAG AAGCCCGACGGCACCGT G AAGCTGCTGAT CT ACCACACCAGCCGGCT GCACA

GCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACC

AT CAGCAACCT GGAGCAGG AGGACATCGCCACCT ACTT CT GCCAGCAGGGCAACACCC

T GCCCT AC ACCTT CGG AGGCGGC ACCAAGCTGG AG AT C ACC AAGGCCGG AGGCGG AG

GCT CT GGCGG AGGCGGCT CTGGCGG AGGCGGCT CTGGCGG AGGCGGCAGCGAGGT

GAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGAC

CT GCACCGT GAGCGGCGT G AGCCTGCCCGACT ACGGCGT GAGCT GG AT CAGGCAGCC

CCCACGG A AGGGCCT GG AGTGGCTGGGCGT G AT CT GGGGCAGCGAG ACC ACCT ACT A

CAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGT

GTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAG

CACTACTACT AT GGCGGCAGCTACGCT AT GGACT ACT GGGGCCAGGGCACCAGCGT G

ACCGT GAGCT C AG AT CCC ACC ACG ACGCC AGCGCCGCG ACCACC AACACCGGCGCCC

ACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGG

GGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGT

GGT GGTT GGTGGAGT CCT GGCTTGCT AT AGCTTGCT AGT AACAGTGGCCTTT ATT ATTT

T CT GGGTG AGG AG AGTGAAGTTCAGCAGG AGCGCAG ACGCCCCCGCGTACCAGCAGG

GCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTT

GGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACC

CT CAGG AAGGCCT GT AC AATG AACT GCAG AAAG AT AAG AT GGCGG AGGCCT ACAGT G A

G ATT GGG AT G A AAGGCG AGCGCCGG AGGGGCAAGGGGCACG AT GGCCTTT ACCAGG

GT CT CAGT ACAGCCACCAAGG ACACCT ACGACGCCCTT CACATGCAGGCCCT GCCT CC

T CGC AG AGCCG AGGGC AGGGG A AGT CTT CT AACAT GCGGGG ACGT GG AGG AAAATCC

CGGGCCCAT GGCCGT GCCCACT CAGGT CCT GGGGTT GTT GCT ACTGT GGCTT ACAGAT

GCCAGAT GT GACAT CCAGAT GACAC AGT CT CCAT CTT CCCTGT CTGCATCT GT CGGAGA T CG CGTCACCATCACCT GT CG AGC AAGT G AG G AC ATTT ATTTT AATTT AGTGTGGTATC A GCAGAAACCAGGAAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATACAAATCGCTTGGCAGAT GGGGTCCC AT CACGGTT C AGT GGCT CTGG ATCTGGC ACAC AGT AT ACT CT AACC AT A A G T AGCCT G C A ACCCG AAG ATTT CGC AACCT ATTATTGTCAACACTAT AAG AATT ATCCG C TCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAAGATCTGGTGGCGGAGGGTCAG GAGGCGGAGGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGAGGCGGAGGCTCGAGATCTGAGGTG CAGTTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCC TGTGCAGCCT C AGG ATT CACT CT CAGT AATT ATGG C AT G C ACT GG AT CAGGC AG G CTC C AG GG A AGGGTCTGG AGTG GGT CT CGT CT ATT AGT CTTAATGGTGGT AGCACTT ACT AT CGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGGGACAATGCAAAAAGCACCCTCT ACCTT CA AAT G AAT AGT CT G AGGGCCG AGGACACGGCCGT CTATTACTGT GCAGC AC A G G ACGCTT AT ACGGG AG GTT ACTTT G ATT ACT GG GGCCA AG G AACGCT GGT CAC AGT C T CGT CT ATGG AT CCCGCCG AGCCCAA AT CT CCTG ACAAAACT C ACACAT GCCCACCGT GCCCAGCACCT CCCGT GGCCGGCCCGT CAGT CTT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCT CAT GATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGT GGTGGTGG ACGT GAGCCA CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCT CCCAGCCCCCAT CGAG A AA ACCAT CT CCAAAGCCA AAGGGC AGCCCCG AG A ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAG CCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAAT GGGCAACCGG AGAACAACT ACAAGACCACGCCT CCCGTGCT GGACT CCGACGG CTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCT CAT GCT CCGT G AT GCAT G AGGCCCT GC ACAAT CACT AT ACCCAG AA AT CT CT GAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCACTGATAGCATTTCTGGCATTTCTG ATT ATT GTG ACAT C AATAG CCCT GCTTGTTGTT CTCT ACA AA AT CT ATG ATCT AC AT AAG A AAAGATCCTGCAATTTAGATGAACAGCAGGAGCTTGTTGAAAGGGATGATGAAAAACAA CT G AT GAAT GT GG AGCCAAT CCAT GCAG AT ATTTT GTT GG A AACTT AT A AG AG G AAG AT TGCTGATGAAGGAAGACTTTTTCTGGCTGAATTTCAGAGCATCCCGCGGGTGTTCAGCA AGTTT CCTAT A AAGG AAGCT CG AA AGCCCTTT A ACCAG AAT A AA A ACCGTT ATGTT G ACA TTCTTCCTTATGATTATAACCGTGTTGAACTCTCTGAGATAAACGGAGATGCAGGGTCAA ACT ACAT AAAT GCC AGCT AT ATT G ATG GTTT CAAAG AACCCAGG AAAT AC ATTGCTGCAC AAGGTCCCAGGG ATG AAACT GTT G AT G ATTT CT GG AG GAT G ATTT GGG AAC AG AAAGC CACAGTTATTGTCATGGTCACTCGATGTGAAGAAGGAAACAGGAACAAGTGTGCAGAAT ACT G G CCGTC AAT GGAAG AGGGCACT CGGGCTTTT GG AG AT GTT GTT GT AAAG AT CAA CCAGCACAAAAG AT GT CC AG ATT ACAT CATT CAG AA ATT G AAC ATTGT AAAT AAAA AAG A AAAAGCAACTGGAAGAGAGGTGACTCACATTCAGTTCACCAGCTGGCCAGACCACGGG

GTGCCTGAGGATCCTCACTTGCTCCTCAAACTGAGAAGGAGAGTGAATGCCTTCAGCA

ATTTCTTCAGTGGTCCCATTGTGGTGCACTGCAGTGCTGGTGTTGGGCGCACAGGAAC

CTATATCGGAATTGATGCCATGCTAGAAGGCCTGGAAGCCGAGAACAAAGTGGATGTTT

ATGGTT AT GTT GTCA AGCT A AGGCG ACAG AG AT GCCTG AT GGTT C AAGT AG AGGCCC A

GT ACAT CTT G AT CCAT CAGGCTTTGGT GG AAT AC AAT CAGTTT GG AGA AACAG AAGT G A

ATTTGT CT G AATT AC AT CCAT ATCT AC AT AACAT G AAG AAAAGGG AT CC ACCCAGT G AGC

CGT CT CCACT AG AGGCTG A ATTCCAG AG ACTT CCTTC AT AT AGGAGCTGGAGG ACACA

GCACATTGGAAATCAAGAAGAAAAT AAAAGTAAAAACAGGAATT CT AAT GT CAT CCCAT A

TGACTATAACAGAGTGCCACTTAAACATGAGCTGGAAATGAGTAAAGAGAGTGAGCATG

ATT CAGAT GA AT CCT CT G ATG AT G ACAGT G ATT C AG AGG AACC AAG C AAAT ACAT C AAT

GCATCTTTT AT AAT G AGCT ACT GG A AACCTG AAGT G ATG ATTGCTGCTC AGGG ACC ACT

G AAGG AG ACCATTGGT G ACTTTTG G CAGAT G AT CTT CCAAAG AAAAGT CAAAGTT ATT G

TTATGCTGACAGAACTGAAACATGGAGACCAGGAAATCTGTGCTCAGTACTGGGGAGA

AGGAAAGCAAACAT ATGGAGAT ATTGAAGTT GACCTGAAAGACACAGACAAAT CTTCAA

CTT AT ACCCTT CGTGTCTTT G AACTG AG AC ATT CC A AG AG G A AAG ACT CT CG A ACTGTG

TACC AGT ACCAAT AT ACAA ACT GG AGTGT GG AG C AG CTT CCT GCAGAACCC AAG G AATT

AAT CT CT ATG ATT CAGGTCGT C AAACAA AAACTT CCCC AG AAG A ATT CCTCTG A AGGG A

AC AAGCAT C AC AAG AGT AC ACCT CTACT C ATT C ACT GC AGGG AT GG AT CT CAG C AAACG

GG AAT ATTTT GT GCTTT GTT AAAT CTCTT AGAAAGTGCGGAA ACAG AAG AGGT AGT GG A

T ATTTTT CAAGT GGT AAAAGCT CT ACG C AAAGCT AGG CC AGGCAT GGTTT CCAC ATT CG

AGCAATATCAATTCCTATATGACGTCATTGCCAGCACCTACCCTGCTCAGAATGGACAA

GT AAAG AA AAAC AACC AT C AAG AAG AT AAAATT G AATTT G AT AAT G AAGT GG AC AAAGT A

AAGCAGGAT GCT AATTGT GTT AATCCACTTGGTGCCCCAG AAAAGCT CCCT GAAGCAAA

GGAACAGGCTGAAGGTTCTGAACCCACGAGTGGCACTGAGGGGCCAGAACATTCTGTC

AAT GGTCCT GCAAGT CC AG CTTT AAAT C AAGGTT C AT AG

SEQ ID No. 37: (solo para referencia)

>MP14801 .SFG.aCDI 9fmc63_clean-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3pvaa- dCD148

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCC

AGACCAGACAT CCAGAT GACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCT GGGCGAC

CGGGTGACCAT CAGCT GC AGAGCCAGCCAGGACAT C AGCAAGT ACCT G AACT GGT ACC

AGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACA

GCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACC

ATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCC

TGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAG

GCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGT GAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGAC CTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCC CCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTA CAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGT GTT CCT GAAGAT GAACAGCCT GCAGACCGACGACACCGCCAT CT ACTACTGCGCCAAG CACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTG ACCGT GAGCT CAGAT CCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCC ACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGG GGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGT GGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTT T CT GGGT G AGG AG AGTG A AGTT CAGCAGG AGCGCAG ACGCCCCCGCGT ACC AGCAGG GCC AG A ACCAG CTCTAT AACG AGCT C AAT CT AGG ACG AAG AG AGG AGT ACG AT GTTTT GGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACC CTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGA GATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGG GTCT C AGT ACAGCC ACC AAGG AC ACCT ACG ACGCCCTT C AC AT G C AGGCCCT GCCTCC TCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCC CG G GCCC ATGGCCGTG CCCACTCAGGTCCTGGG GTTGTTG CTACTGTG GCTT AC AG AT GCC AG ATGT GACAT CCAG AT G AC AC AGT CTCC ATCTTCCCTGTCT GCAT CTGT CGG AG A T CGCGT C ACC ATC ACCT GT CGAGCA AGTG AGG ACATTT ATTTT A ATTTAGTGT GGT ATC A GCAG AA ACCAGG AAAGGCCCCT AAGCTCCTG AT CT ATG AT ACAAAT CGCTTG GCAG AT GGGGT CCCAT CACGGTT CAGT GGCTCTGG ATCTG G CAC ACAGTAT ACTCT AACC AT AA GTAG CCTGCAACCCG AAG ATTTCGC A ACCT ATT ATTGTCAAC ACTATAAG AATTATCCG C TCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAAGATCTGGTGGCGGAGGGTCAG GAGGCGGAGGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGAGGCGGAGGCTCGAGATCTGAGGTG CAGTTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCC TGTGC AGCCT CAGG ATT C ACT CT CAGT AATT AT G GCAT GCACT GG AT CAGGCAGGCTC C AGGG AAGGGT CTGG AGT GGGT CTCGTCT ATT AGT CTTAAT GGTGGT AGC ACTT ACT AT CGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGGGACAATGCAAAAAGCACCCTCT ACCTTC AA ATGAAT AGTCTG AGG G CCG AG G AC ACGGCCGTCTATTACTGTGC AG C AC A GGACGCTT AT ACGGG AGGTT ACTTTG ATT ACT GGGGCCAAGGA ACGCT GGTC AC AGT C TCGTCT ATGG AT CCCGCCG AGCCC AAAT CT CCTG AC AAAACT CAC AC AT GCCC ACCGT GCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA CG AAG ACCCT G AGGT C AAGTT C A ACT G GT ACGT GG ACGG CGT GG AGGT GCAT AAT GCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA

AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA

ACCACAGGT GT AC ACCCT GCCCCC ATCCCGGG ATGAGCTGACC AAGAACC AGGT C AG

CGTGACGTGCGTGGTCAAAGGCTTCTATCCGAGCGACATCGGCGTGGAGTGGGAGAG

C AAT GGGCAACCGG AG AAC AACT ACA AG ACCACGCCT CCCGTGCT GG ACT CCG ACGG

CT CCTTCTT CCT CT AC AGC AAGCT C ACCGT GG AC AAG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AAC

GTCTT CT CAT GCT CCGTG ATGCATGAGGCCCTGC AC AAT CACT AT ACCC AG AAAT CT CT

GAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCC

CT GGTT ATTGT GACTGT GGGAGGCTT CATCTTCT GG AGAAAGAAG AGGAAAG ATGCA AA

G A AT AATG AAGT GT CCTTTT CT CAA ATT AAACCT A AAAA AT CT AAGTT AAT C AG AGT GGA

G AATTTTG AGGCCT ACTTC AAG AAGC AGCAAGCT G ACT CCAACTGT GGGTT CGCAG AG

G A AT ACG AAGAT CTG AAGCTTGTTGG AATT AGT C AACCT AAAT AT GC AGC AG AACTGGC

TG AG AAT AG AGGAAAG AATCGCT AT AAT AATGTT CT GCCCT ATG ATATTT CCCGTGT CAA

ACTTTCGGTCC AG ACCC ATTCAACGGATG ACTACATCAATGCC AACTACATGCCTGGCT

ACC ACT CC AAG A AAG ATTTT ATT GCC ACACAAGG ACCTTT ACCG AACACTTT G AAAG ATT

TTT GGCGT AT GGTTTGGG AGA AAAAT GT AT AT GCC AT C ATT AT GTT G ACT AAAT GT GTT G

A ACAGGG AAG AACCAA AT GT G AGG AGT ATT GGCCCT CCAAGC AGGCT CAGG ACT ATGG

AG AC AT AACT GT GGC AAT G AC AT C AG AAATT GTT CTT CCGG A AT GG ACC AT C AG AG ATT

T CACAGT G A AAAAT ATCCAG AC AAGT G AG AGT CACCCT CT G AG ACAGTT CC ATTT CACC

TCCT GGCC AG ACC ACGGTGTT CCCG AC ACC ACT G ACCT GCTC AT C AACTT CCGGT ACC

T CGTT CGT GACT AC AT G AAGCAG AGT CCT CCCG A AT CGCCG ATT CT GGT GC ATT GCAGT

GCT GGGGT CGGA AGG ACGGGC ACTTT C ATT GCC ATT GAT CGT CTC ATCT ACC AG ATAG

AG AAT GAG AAC ACCGT GG AT GT GT AT GGG ATT GTGT ATG ACCTT CG AAT GCAT AGGCCT

TT AAT GGT GC AG AC AG AGG ACC AGT AT GTTTT CCT C AAT C AGT GT GTTTT GG AT ATTGT C

AG AT CCCAG AAAG ACT C AAAAGT AG AT CTT AT CT ACC AG A ACACAACT GCA AT G AC AAT

CTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATGGTTACATCGCCTAA

SEQ ID No. 38

>16076.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-muCD8STK-tm-dPTPN6

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCC

AGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGAC

CGGGTG ACCAT C AGCT GC AG AG CCAG CCAGG AC AT C AG C AAGT ACCT G AACT GGT ACC

AGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACA

GCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACT ACAGCCTG ACC

ATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCC

TGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAG

GCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGT

GAAGCT GCAGGAGT CTGGCCCAGGCCT GGT GGCCCCAAGCCAGAGCCT GAGCGT GAC CTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCC CCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTA CAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGT GTT CCT G A AGATG AACAGCCTGC AG ACCGACG AC ACCGCC AT CT ACT ACTGCGCC AAG CACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTG ACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCC ACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGG GGGCGC AGT GCACACG AGGGGGCT GG ACTTCGCCT GT G AT AT CTTTT GGGTGCT GGT G GTGGTTG GT GG AGT CCT GGCTT GCT AT AGCTT G CT AGT A AC AGT GGCCTTT ATT ATTT TCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGG GCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTT GGACAAGAGACGT GGCCGGG ACCCTG AGAT GGGGGGAAAGCCG AGAAGGAAGAACC CTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGA GATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGG GTCT C AGT AC AG CC ACCAAGG ACACCT ACGACGCCCTT CACAT GC AGGCCCT GCCT CC TCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCC CGGGCCCATGGCCGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGTTGCTACTGTGGCTTACAGAT G CCAGAT GTG AC ATCC AG AT G ACACAGT CTCC AT CTT CCCTGTCTGCATCTGTCGG AG A TCG CGTCACCATC ACCTGTCG AGC AAGTG AG G AC ATTTATTTT AATTT AGTGTGGTATC A GCAGAAACCAGGAAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATACAAATCGCTTGGCAGAT GGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCTCTGGATCTGGCACACAGTATACTCTAACCATAA GTAGCCTGCAACCCGAAGATTTCGCAACCTATTATTGTCAACACTATAAGAATTATCCGC T CACGTT CGGTC AGGGG ACCA AGCTGG AAAT CAAAAG AT CT GGT GGCG G AGGGT C AG GAGGCGGAGGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGAGGCGGAGGCTCGAGATCTGAGGTG CAGTT GGT GGAGTCT GGGGGCGGCTT GGTGCAGCCT GGAGGGT CCCT GAGGCTCTCC TGTG C AG CCTC AGG ATTCACTCTCAGT AATT ATGGC ATGC ACTGG ATCAGGC AG G CTC C AG GG AAGGGTCT GG AGTG GGTCT CGTCTATT AGT CTTA ATGGTGGTAGCACTT ACT AT CG AG ACT CCGT GAAGGGCCG ATT CACT AT CTCCAGGG AC AAT GCAAA AAGC ACCCTCT ACCTT CAAAT GAAT AGT CT GAGGGCCG AGGACACGGCCGT CT ATT ACTGT GCAGC ACA GGACGCTTATACGGGAGGTTACTTTGATTACTGGGGCCAAGGAACGCTGGTCACAGTC T CGT CT AT GG AT CCCGCC ACCACAACCAAGCCCGT GCT GCGG ACCCCAAGCCCT GTG C ACCCTACCGGCACCAGCCAGCCTCAGAGACCCGAGGACTGCCGGCCTCGGGGCAGC GTGAAGGGCACCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACTGGGCACCTCTGGCCGGA ATATGCGTGGCACTGCTGCTGAGCCTCATCATCACCCTGATCTGTTATCACCGAAGCCG CAAGCGGGT GT GT AAAAGT GGAGGCGGAAGCTT CT GGG AGGAGTTT GAGAGTTT GCA GAAGCAGGAGGTGAAGAACTTGCACCAGCGTCTGGAAGGGCAGCGGCCAGAGAACAA GGGCAAGAACCGCTACAAGAACATTCTCCCCTTTGACCACAGCCGAGTGATCCTGCAG

GGACGGGACAGT A ACAT CCCGGGGT CCG ACT AC AT C AAT GCC AACT AC AT C AAG AACC

AGCTGCT AGGCCCTGAT GAGAACGCT AAGACCT ACAT CGCCAGCCAGGGCT GT CT GGA

GGCCACGGTCAATGACTTCTGGCAGATGGCGTGGCAGGAGAACAGCCGTGTCATCGT

CAT G ACC ACCCGAG AGGT GGAGAAAGGCCGG AACAAAT GCGT CCCAT ACT GGCCCG A

GGTGGGCAT GCAGCGT GCTT ATGGGCCCTACT CTGTG ACCAACT GCGGGG AGCATG A

CACAACCG AAT ACAAACT CCGT ACCTT AC AGGT CT CCCCGCT GG ACAATGGAG ACCT G

ATTCGGGAGATCTGGCATTACCAGTACCTGAGCTGGCCCGACCACGGGGTCCCCAGT

GAGCCTGGGGGTGTCCTCAGCTTCCTGGACCAGATCAACCAGCGGCAGGAAAGTCTG

CCTCACGCAGGGCCCATCATCGTGCACTGCAGCGCCGGCATCGGCCGCACAGGCACC

ATCATTGTCAT CG ACATGCT CAT GG AG AAC AT CT CCACCAAGGGCCT GGACT GT G AC AT

TGACAT CCAGAAGACCATCCAGAT GGTGCGGGCGCAGCGCT CGGGCAT GGT GCAG AC

GG AGGCGCAGT AC AAGTT CAT CT ACGTGGCCAT CGCCCAGTT CATTG AAACCACT AAG

AAGAAGCTGTGA

SEQ ID No. 39 (solo para referencia)

>MP16091.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-muCD8STK-LAIR1tm-endo

ATG AGCCT GCCCGT GACCGCCCT GCT GCT GCCCCT GGCCCT GCTGCT GCACGGCGCC

AG ACC AG ACAT CC AG AT G ACCC AG ACC ACC AGC AGCCT G AGCGCC AGCCT GGGCG AC

CGGGTG ACC AT CAGCT GC AG AGCC AGCC AGG ACAT CAGCAAGT ACCT G AACTGGT ACC

AGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACA

GCGGCGT GCCCAGCCGGTT CAGCGGCAGCGGC AGCGGCACCGACT ACAGCCT G ACC

ATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCC

T GCCCT AC ACCTT CGG AGGCGGC ACCAAGCTGG AG AT C ACC AAGGCCGG AGGCGG AG

GCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGT

GAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGAC

CT GC ACCGT GAGCGGCGTG AGCCTGCCCGACT ACGGCGTG AGCT GG AT CAGGCAGCC

CCC ACGG A AGGGCCT GG AGTGGCT GGGCGTG ATCT GGGGCAGCGAG ACC ACCT ACT A

CA AC AGCGCCCT G AAG AGCCGGCT G ACC AT CAT CAAGG AC AAC AGCAAG AGCCAGGT

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ACAGT CCACAAAGCCCAT GGCCGAGT CCAT CACGTATGCAGCCGTTGCCAG ACACT G A

SEQ ID no. 40 (solo para referencia)

>MP16092.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-muCD8STK-LAIR1tm-endo-2A-PTPN6_SH2-dCD148

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La secuencia de ácido nucleico puede codificar la misma secuencia de aminoácidos que la codificada por la SEQ ID No. 38 pero puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente, debido a la degeneración del código genético. La secuencia de ácido nucleico puede tener al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 % de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID No 38, siempre que codifique un primer CAR y un segundo CAR como se define en el primer aspecto de la invención.

VECTOR

La presente invención también proporciona un vector que comprende ácido nucleico que codifica tanto el primer como el segundo CAR, o kit de vectores, que comprende un primer vector que comprende la primera secuencia de ácido nucleico y un segundo vector que comprende la segunda secuencia de ácido nucleico. Tal vector se puede usar para introducir la secuencia o secuencias de ácido nucleico en una célula hospedadora para que exprese el primer y el segundo CAR.

El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral, o un vector basado en transposón o ARNm sintético.

El vector puede tener la capacidad de transfectar o transducir un linfocito T.

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene una pluralidad de células que expresan CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Dicha formulación puede estar, por ejemplo, en una forma adecuada para infusión intravenosa.

MÉTODO DE TRATAMIENTO

Los linfocitos T de la presente invención pueden ser capaces de destruir células diana, tales como células cancerosas. La célula diana es reconocible por un patrón definido de expresión de antígeno del antígeno A Y NO antígeno B o iteraciones complejas de esta puerta.

Los linfocitos T de la presente invención pueden usarse para el tratamiento de una infección, tal como una infección viral.

Los linfocitos T de la invención también pueden usarse para el control de respuestas inmunitarias patógenas, por ejemplo, en enfermedades autoinmunitarias, alergias y rechazo de injerto contra huésped.

Los linfocitos T de la invención se pueden usar para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, tal como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (células renales), leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de tiroides.

Es particularmente adecuado para el tratamiento de tumores sólidos donde la disponibilidad de buenas dianas individuales selectivas es limitada.

Los linfocitos T de la invención pueden usarse para tratar: cánceres de la cavidad oral y la faringe, que incluyen cáncer de lengua, boca y faringe; cánceres del sistema digestivo que incluye cánceres esofágicos, gástricos y colorrectales; cánceres del hígado y del árbol biliar que incluye carcinomas hepatocelulares y colangiocarcinomas; cánceres del sistema respiratorio que incluye cánceres broncogénicos y cánceres de laringe; cánceres de huesos y articulaciones que incluyen osteosarcoma; cánceres de piel que incluyen melanoma; cáncer de mama; cánceres del tracto genital que incluyen cáncer de útero, ovario y cuello del útero en mujeres, cáncer de próstata y testículos en hombres; cánceres del tracto renal que incluyen carcinoma de células renales y carcinomas de células de transición de uréter o vejiga; cánceres cerebrales que incluyen gliomas, glioblastoma multiforme y medulobastomas; cánceres del sistema endocrino que incluyen cáncer de tiroides, carcinoma suprarrenal y cánceres asociados con síndromes de neoplasias endocrinas múltiples; linfomas que incluyen linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin; mieloma múltiple y plasmacitomas; leucemias agudas y crónicas, mieloides o linfoides; y cánceres de otros sitios no especificados, incluido el neuroblastoma.

El tratamiento con los linfocitos T de la invención puede ayudar a prevenir el escape o la liberación de células tumorales que a menudo ocurre con estrategias convencionales.

La invención se describirá adicionalmente a continuación por medio de los Ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la materia a poner en práctica la invención y que de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Creación de poblaciones de células diana

Con el fin de probar el principio de la invención, se eligieron arbitrariamente receptores basados en anti-CD19 y anti-CD33. Usando vectores retrovirales, se clonaron CD19 y CD33. Estas proteínas se truncaron para que no emitan señales y puedan expresarse de manera estable durante periodos prolongados. A continuación, estos vectores se usaron para transducir la línea celular SupT 1 de forma individual o doble para establecer células negativas para ambos antígenos (el tipo silvestre), positivas para uno y positivas para ambos. Los datos de expresión se muestran en la figura 3.

Ejemplo 2 - Diseño y función de la puerta O (para referencia)

Para construir la puerta O, se coexpresaron un par de receptores que reconocen CD19 y CD33. Se utilizaron diferentes espaciadores para evitar el emparejamiento cruzado. Ambos receptores tenían un dominio transmembrana derivado de CD28 para mejorar la estabilidad de la superficie y un endodominio derivado del de CD3 Zeta para proporcionar una señal de activación sencilla. De esta manera, se coexpresaron un par de CAR independientes de 1a generación. El casete de vector retroviral utilizado para coexpresar las secuencias utiliza un péptido autoescindible de la fiebre aftosa 2A para permitir la coexpresión 1:1 de ambos receptores. El diseño del casete se muestra en la figura 4, y las estructuras proteicas en la figura 5. La secuencia de nucleótidos de las regiones homólogas se tambaleó por codones para evitar la recombinación durante la transcripción inversa del vector retroviral.

Ejemplo 3 - Prueba de la puerta O (para referencia)

Se ensayó la expresión de ambos CAR en la superficie de linfocitos T mediante tinción con antígeno afín fusionado a Fc. Utilizando diferentes especies de dominios Fc (ratón para CD19 y conejo para CD33), se determinó la coexpresión de ambos CAR en la superficie celular mediante tinción con diferentes anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluoróforos. Esto se muestra en la figura 6.

A continuación, se realizó una prueba funcional utilizando la línea de linfocitos T de ratón BW5147. Esta línea celular libera IL2 tras la activación, lo que permite una lectura cuantitativa sencilla. Estos linfocitos T se cocultivaron con cantidades crecientes de las células diana artificiales descritas anteriormente. Los linfocitos T respondieron a las células diana que expresaban cualquiera de los antígenos, como se muestra por la liberación de IL2 medida por ELISA. Se demostró que ambos CAR se expresan en las superficies celulares y se demostró que los linfocitos T responden a uno o ambos antígenos. Estos datos se muestran en la figura 7.

Ejemplo 4 - Diseño y función de la puerta Y (para referencia)

La puerta Y combina un receptor activador sencillo con un receptor que inhibe básicamente la actividad, pero cuya inhibición se desactiva una vez que se liga el receptor. Esto se logró combinando un CAR de 1a generación convencional con un espaciador de pedúnculo de CD8 corto/no voluminoso y un endodominio de CD3 Zeta con un segundo receptor con un espaciador Fc voluminoso cuyo endodominio contenía endodominios de CD148 o CD45. Cuando ambos receptores están ligados, la diferencia en las dimensiones del espaciador da como resultado el aislamiento de los diferentes receptores en diferentes compartimientos de membrana, liberando al receptor CD3 Zeta de la inhibición por los endodominios de CD148 o CD45. De esta manera, la activación solo se produce una vez que ambos receptores se han activado. Se eligieron para esto CD148 y CD45, ya que funcionan de esta forma en estado natural: por ejemplo, el ectodominio de CD45 muy voluminoso excluye a todo el receptor de la sinapsis inmunológica. El casete de expresión se representa en la figura 8 y las posteriores proteínas en la figura 9.

La tinción de la superficie para la diferente especificidad mostró que ambos pares de receptores podrían expresarse efectivamente en la superficie celular que se muestra en la figura 10. La función en BW5147 muestra que el linfocito T solo se activa en presencia de ambos antígenos (figura 11).

Ejemplo 5: Demostración de la generalización de la puerta Y (para referencia)

Para asegurarse de que las observaciones no fueran una manifestación de alguna característica específica de CD19/CD33 y los ligantes que se habían utilizado, se intercambiaron los dos scFv de direccionamiento de tal manera que ahora, la señal de activación (ITAM) se transmitía al reconocer CD33, en lugar de CD19; y la señal inhibidora (CD148) se transmitía al reconocer CD19, en lugar de CD33. Dado que los endodominios de CD45 y CD148 se consideran funcionalmente similares, la experimentación se restringió a las puertas Y con el endodominio de CD148. Esto debería dar como resultado todavía una puerta Y funcional. Los linfocitos T que expresan la nueva puerta lógica fueron estimulados con dianas que portaban solo CD19 o CD33, o ambos. Los linfocitos T respondieron a dianas que expresaban tanto CD19 como CD33, pero no a dianas que expresaban solo uno o ninguno de estos antígenos. Esto muestra que la puerta Y todavía funciona en este formato (figura 18B).

En las mismas líneas, se buscó establecer en qué medida era generalizable nuestra puerta Y: la puerta Y debería ser generalizable con diferentes dianas. Si bien puede haber una fidelidad menor o mayor de la puerta dada la densidad relativa de antígeno, la cinética de unión de scFv afín y la distancia precisa del epítopo de unión de scFv, cabría esperar ver algunas manifestaciones de puerta Y con un amplio conjunto de dianas y ligantes. Para probar esto, se generaron tres puertas Y adicionales. Una vez más, la experimentación se restringió a la versión CD148 de la puerta Y. El segundo scFv de la puerta Y de CD148 original se reemplazó por el scFv anti-GD2 huK666 (SEQ ID 41 y SEQ ID 42), o por el scFv anti-CD5 (SEQ ID 43 y SEQ ID 44), o el scFv anti-EGFRvlll MR1.1 (SEQ ID 45 Y SEQ ID 46) para generar las siguientes puertas Y de CAR: CD19 Y GD2; CD19 Y CD5; CD19 Y EGFRvIII. También se generaron las siguientes líneas celulares que expresaban antígeno artificial: transduciendo SupT1, y nuestro SupT1.CD19 con las GM3 y GD2 sintasas, se generaron SupT1.GD2 y SupT1.CD19.GD2. Transduciendo SupT1 y SupT1.CD19 con un vector retroviral que codificaba EGFRvIII, se generaron SupT1.EGFRvIII y SupT1.CD19.EGFRvIII. Dado que CD5 se expresa en las células SupT1, se utilizó una línea celular diferente para generar las células diana: se generaron células 293T que expresan CD19 en solitario, CD5 en solitario y CD5 y CD19 juntos. La expresión se confirmó por citometría de flujo (figura 19). Los linfocitos T que expresan las tres nuevas puertas CAR Y se estimularon con SupT1.CD19 y las respectivas células diana doble positivo y positivo único afines. Las tres puertas Y demostraron una activación reducida por las líneas celulares doble positivo en comparación con las dianas de positivo único (figura 20). Esto demuestra la generalización del diseño de la puerta Y a dianas arbitrarias y ligantes afines.

Ejemplo 6: Prueba experimental del modelo de segregación cinética de la puerta Y de CAR (para referencia)

El objetivo era demostrar que el modelo de segregación diferencial causada por diferentes espaciadores es el mecanismo central que se esconde detrás de la capacidad de generar estas puertas lógicas de CAR. El modelo es que si solo el CAR activador está ligado, el potente CAR inhibidor en "ausencia de ligadura" está en solución en la membrana y puede inhibir el CAR activador. Una vez que ambos CAR están ligados, si ambos espaciadores CAR son lo suficientemente diferentes, se segregarán dentro de la sinapsis y no se ubicarán conjuntamente. Por lo tanto, un requisito clave es que los espaciadores sean lo suficientemente diferentes. Si el modelo es correcto, si ambos espaciadores son suficientemente similares para que se colocalicen cuando ambos receptores están ligados, la puerta no funcionará. Para probar esto, el espaciador Fc "voluminoso" en el CAR original se reemplazó con un espaciador CD8 murino. Se predijo que este tiene la longitud, el volumen y la carga similares a la CD8 humana, pero no debería emparejarse de forma cruzada con ella. Por lo tanto, la nueva puerta tenía un primer CAR que reconoce CD19, un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio activador; mientras que el segundo CAR reconoce CD33, tiene un espaciador de pedúnculo de CD8 de ratón y un endodominio de CD148 (figura 18C). Los linfocitos T se transdujeron para expresar esta nueva puerta de CAR. A continuación, estos linfocitos T se estimularon con células SupT1 que expresaban CD19 en solitario, CD33 en solitario o CD19 y CD33 juntas. Los linfocitos T no respondieron a las células SupT1 que expresaban cualquiera de los antígenos solos según la puerta Y original. Sin embargo, los linfocitos T con CAR no respondieron a las células SupT1 que expresaban ambos antígenos, confirmando así el modelo (figura 18C). Una puerta Y funcional requiere que ambos CAR tengan espaciadores suficientemente diferentes para que no se colocalicen dentro de una sinapsis inmunológica (figura 23A y B).

Ejemplo 7 - Diseño y función de una puerta Y NO

Las fosfatasas tales como CD45 y CD148 son tan potentes que incluso una pequeña cantidad que entra en una sinapsis inmunológica puede inhibir la activación de iTa M. Esta es la base de la inhibición de la puerta lógica Y. Otras clases de fosfatasas no son tan potentes, por ejemplo, PTPN6 y fosfatasas relacionadas. Se predijo que una pequeña cantidad de PTPN6 que entrara en una sinapsis por difusión no inhibiría la activación. Además, se predijo que si un CAR inhibidor tenía un espaciador suficientemente similar a un CAR activador, podría colocalizarse dentro de una sinapsis si ambos CAR estuvieran ligados. En este caso, grandes cantidades del endodominio inhibidor serían suficientes para detener la activación de ITAMS cuando ambos antígenos estuvieran presentes. De esta manera, se podría crear una puerta Y NO.

Para la puerta NO Y, la segunda señal debe "vetar" la activación. Esto se hace trayendo una señal inhibidora a la sinapsis inmunológica, por ejemplo, trayendo la fosfatasa de una enzima tal como PTPN6. Por lo tanto, se genera una puerta Y NO inicial de la siguiente manera: dos CAR coexpresados, por lo que el primero reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio activador; coexpresado con un CAR anti-CD33 con un espaciador en el pedúnculo de CD8 de ratón y un endodominio que comprende el dominio catalítico de PTPN6 (SEQ ID 38, figura 13 A con B). Un casete adecuado se muestra en la figura 12, y los datos funcionales preliminares se muestran en la figura 14.

Además, se desarrolló una estrategia alternativa para generar una puerta Y NO. Los motivos inhibidores inmunitarios de tirosinasa (ITIM) se activan de manera similar a los ITAMS, en el sentido de que son fosforilados por Ick tras agruparse y excluirse las fosfatasas. En lugar de desencadenar la activación mediante la unión de ZAP70, los ITIM fosforilados reclutan fosfatasas como PTPN6 a través de sus dominios SH2 afines. Un ITIM puede funcionar como un endodominio inhibidor, siempre que los espaciadores de los CAR activadores e inhibidores puedan colocalizarse. Para generar esta construcción, se generó una puerta Y NO de la siguiente manera: dos CAR coexpresados: el primero reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio activador; coexpresado con un CAR anti-CD33 con un espaciador en el pedúnculo de CD8 de ratón, y un endodominio que contiene ITIM derivado del de LAIR1 (SEQ ID 39, figura 13 A con C).

También se desarrolló una puerta Y NO adicional, más compleja, mediante la cual un ITIM se potencia por la presencia de una proteína quimérica adicional: una fusión intracelular del dominio SH2 de PTPN6 y el endodominio de CD148. En este diseño se expresan tres proteínas: la primera reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio activador; coexpresado con un CAR anti-CD33 con un espaciador en el pedúnculo de CD8 de ratón, y un endodominio que contiene ITIM derivado del de LAIR1. Un péptido 2A adicional permite la coexpresión de la fusión PTPN6-CD148 (SEQ ID 40, figura 13 A y D). Se predijo que estas puertas Y NO tendrían un rango de inhibición diferente: PTPN6-CD148 > PTPN6 >> ITIM.

Se transdujeron linfocitos T con estas puertas y se expusieron a dianas que expresaban CD19 o CD33 en solitario, o tanto CD19 como CD33 juntas. Las tres puertas respondieron a las dianas que expresaban solo CD19, pero no a las dianas que expresaban tanto CD19 como CD33 juntas (figura 21), lo que confirma que las tres puertas Y NO eran funcionales.

Ejemplo 8: Prueba experimental del modelo de segregación cinética de la puerta Y NO basada en PTPN6.

El modelo de la puerta Y NO se centra en el hecho de que la naturaleza de los espaciadores utilizados en ambos CAR es fundamental para el funcionamiento correcto de la puerta. En la puerta Y NO funcional con PTPN6, ambos espaciadores CAR son lo suficientemente similares como para que cuando ambos CAR estén ligados, ambos se colocalicen dentro de la sinapsis, por lo que la alta concentración, incluso PTPN6 débil, es suficiente para inhibir la activación. Si los espaciadores fueran diferentes, la segregación en la sinapsis aislará el PTPN6 del ITAM permitiendo la activación la interrupción de la puerta Y NO. Para probar esto, se generó un control reemplazando el espaciador en el pedúnculo CD8 murina por el de Fc. En este caso, la puerta de prueba consistía en dos CAR, el primero reconoce c D19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 humana y un endodominio con ITAM; mientras que el segundo CAR reconoce CD33, tiene un espaciador Fc y un endodominio que comprende la fosfatasa de PTPN6. Esta puerta se activa en respuesta a CD19, pero también se activa en respuesta a CD19 y CD33 juntas (figura 22B, donde la función de esta puerta se compara con la de la Y NO original, y la variante de la puerta Y de control descrita en el Ejemplo 6). Estos datos experimentales demuestran el modelo de que para una puerta Y NO funcional con PTPN6, se necesitan espaciadores de colocalización.

Ejemplo 9: Prueba experimental del modelo de segregación cinética de la puerta Y NO basada en ITIM. (para referencia)

De manera similar a la puerta Y NO basada en PTPN6, la puerta basada en ITIM también requiere la colocalización en una sinapsis inmunológica para funcionar como una puerta Y NO. Para probar esta hipótesis, se generó una puerta basada en ITIM de control de la siguiente manera: dos CAR coexpresados: el primero reconoce CD19, tiene un espaciador en el pedúnculo de CD8 y un endodominio activador; coexpresado con un CAR anti-CD33 con un espaciador Fc y un endodominio que contiene ITIM derivado del de LAIR1. La actividad de esta puerta se comparó con la de la puerta Y NO basada en ITIM original. En este caso, la puerta modificada se activó en respuesta a dianas que expresan CD19, pero también se activó en respuesta a células que expresaban tanto CD19 como CD33. Estos datos indican que las puertas Y NO basadas en ITIM siguen el modelo basado en segregación cinética y se debe seleccionar un espaciador correcto para crear una puerta funcional (figura 23B).

Ejemplo 10: Resumen del modelo de puertas lógicas de CAR generadas por segregación cinética

Basándose en el entendimiento actual del modelo de segregación cinética y los datos experimentales descritos en el presente documento, en la figura 24 se presenta un resumen del modelo para una puerta de dos CAR. La figura muestra una célula que expresa dos CAR, reconociendo cada uno un antígeno diferente. Cuando uno o ambos CAR reconocen un antígeno diana en una célula, se forma una sinapsis y CD45 y CD148 nativos se excluyen de la sinapsis debido al volumen de su ectodominio. Esto establece el escenario para la activación de linfocitos T. En el caso de que la célula diana lleve solo un antígeno afín, el CAR afín se liga, y el CAR afín se segrega en la sinapsis. El CAR no ligado permanece en solución en la membrana de linfocitos T y puede difundirse dentro y fuera de la sinapsis de modo que se forme un área de alta concentración local de CAR ligado con baja concentración de CAR no ligado. En este caso, si el CAR ligado tiene un ITAM y el CAR no ligado tiene un endodominio inhibidor de tipo "en ausencia de ligadura" tal como el de CD148, la cantidad de CAR no ligado es suficiente para inhibir la activación y la puerta está desactivada. Por el contrario, en este caso, si el CAR ligado tiene un ITAM y el CAR no ligado tiene un endodominio inhibidor de tipo "en presencia de ligadura" tal como PTPN6, la cantidad de CAR no ligado es insuficiente para la inhibición y la puerta está activada. Cuando se exponen a una célula diana que lleva ambos antígenos afines, ambos CAR afines se ligan y forman parte de una sinapsis inmunológica. De forma importante, si los espaciadores de CAR son lo suficientemente similares, los CAR se colocalizan en la sinapsis, pero si los espaciadores CAR son suficientemente diferentes, los CAR se segregan dentro de la sinapsis. En este último caso, están presentes áreas de forma de membrana en las que hay altas concentraciones de un CAR pero el otro CAR está ausente. En este caso, dado que la segregación es completa, incluso si el endodominio inhibidor es del tipo "en ausencia de ligadura", la puerta está activada. En el primer caso, las áreas de forma de membrana con altas concentraciones de ambos CAR se mezclan entre sí. En este caso, dado que ambos endodominios están concentrados, incluso si el endodominio inhibidor es del tipo "en presencia de ligadura", la puerta está desactivada. Al seleccionar la combinación correcta de espaciador y endodominio, la lógica se puede programar en un linfocito T con CAR.

Basándose en el trabajo anterior, se ha establecido una serie de reglas de diseño para permitir la generación de CAR con puerta lógica (ilustrados en la figura 32). Para generar un linfocito T con CAR con puerta "antígeno A O antígeno B", se deben generar CAR anti-A y anti-B de manera que (1) cada CAR tenga un espaciador que simplemente permita el acceso del antígeno y la formación de sinapsis de manera que el CAR funcione, y (2) cada CAR tenga un endodominio activador; Para generar un linfocito T con CAR con puerta "antígeno A Y NO B", se deben generar CAR anti-A y anti-B de manera que (1) ambos CAR tengan espaciadores que no se emparejen de forma cruzada, pero que permitan que los CAR se cosegreguen tras el reconocimiento de ambos antígenos afines en la célula diana, (2) y un CAR tenga un endodominio activador, mientras que el otro CAR tenga un endodominio que comprenda o reclute una fosfatasa débil (por ejemplo, PTPN6); (3) Para generar un linfocito T con CAR con puerta "antígeno A Y antígeno B", se deben generar CAR anti-A y anti-B de manera que (1) un CAR tenga un espaciador suficientemente diferente del otro CAR de modo que ambos CAR no se cosegreguen al reconocer ambos antígenos afines en la célula diana, (2) un CAR tenga un endodominio activador, mientras que el otro CAR tenga un endodominio que comprenda una fosfatasa potente (por ejemplo, la de CD45 o CD148). Los espaciadores correctos para lograr el efecto deseado se pueden seleccionar de un conjunto de espaciadores con tamaño/forma conocidos, etc., así como también teniendo en cuenta el tamaño/forma, etc., del antígeno diana y la ubicación del epítopo afín en el antígeno diana.

SEQ ID No 41 : SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aGD2-HCH2CH3pvaa-dCD148

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLL

IYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSG

GGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGS

ETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDP

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IIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL

QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENP

GPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQESGPGLVKPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLE

WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNQVFLKMSSLTAADTAVYYCAKRSDDYSWFAYWGQGTLV

TVSSGGGGSGGGGSGGGGSENQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGKAPKVWI

YSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGYPITFGQGTKVEIKRSDPAEPKS

PDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK

TKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD

ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPK

KSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKL

SVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEY

WPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRY

LVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQY

VFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

SEQ ID NO. 42: SFG.aCDl9-CD8STK-CD28tmZ-2A-aGD2-HCH2CH3pvaa-dCDl48

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACAT

CCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAG

CCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTG

ATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGA

CTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACA

CCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGC

GGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCC

AGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACT

ACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGC

GAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCA

GGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACT

ACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCC

ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCG

CCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATA

TCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTT

ATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCA

GAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTG GCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTG CAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGG GCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGG CCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCC GGGCCCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCCA GGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCCAGCCAGACCCTGAGCATCACCTGCACCG TGAGCGGCTTCAGCCTGGCCAGCTACAACATCCACTGGGTGCGGCAGCCCCCAGGCAAGGGCCTGGAG TGGCTGGGCGTGATCTGGGCTGGCGGCAGCACCAACTACAACAGCGCCCTGATGAGCCGGCTGACCAT CAGCAAGGACAACAGCAAGAACCAGGTGTTCCTGAAGATGAGCAGCCTGACAGCCGCCGACACCGCCG TGTACTACTGCGCCAAGCGGAGCGACGACTACAGCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTG ACCGTGAGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGAACCAGAT GACCCAGAGCCCCAGCAGCTTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGGGTGACCATGACCTGCAGAGCCAGCA GCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCAAGGCCCCAAAGGTGTGGATC TACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTA CACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCGGCT ACCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCT CCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAA GAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCTTCA TCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCTAAA AAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTG TGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAAC TGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTT TCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAA AGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGA AAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTAT TGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCC GGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGT GAGAGTCAC CCTCTGAGACAGT TCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTAC CTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGT CGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGG ATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTAT GTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTA CCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATG GTTACATCGCCTAA

SEQ ID NO. 43: SFG.aCD19-CD8STK-CD2 8tmZ-2A-aCD5-HCH2CH3pvaa-dCD14 8 MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLL IYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGS ETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDP TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVWGGVLACYSLLVTVAF IIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENP GPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKG LEWLAHIWWDDDVYYNPSLKNQLTISKDASRDQVFLKITNLDTADTATYYCVRRRATGTGFDYWGQGT TLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSNIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIACKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLL IYWTSTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCHQYNSYNTFGSGTRLELKRSDPAEPKS PDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPK KSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKL SVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEY WPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRY LVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQY VFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

SEQ ID NO. 44: SFG.aCDl9-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD5-HCH2CH3pvaa-dCDl48 ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACAT CCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAG CCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTG ATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGA CTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACA CCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGC GGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCC AGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACT ACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGC GAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCA GGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACT ACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCC ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCG CCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATA TCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTT ATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCA GAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTG GCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTG CAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGG GCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGG CCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCC GGGCCCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGCCA GGTGACCCTGAAGGAGAGCGGTCCCGGCATCCTGAAGCCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCAGCT TCAGCGGCTTCAGCCTGAGCACCAGCGGCATGGGCGTGGGCTGGATTCGGCAGCCCAGCGGCAAGGGC CTGGAGTGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACGTGTACTACAACCCCAGCCTGAAGAACCAGCT GACCATCAGCAAGGACGCCAGCCGGGACCAGGTGTTCCTGAAGATCACCAACCTGGACACCGCCGACA CCGCCACCTACTACTGCGTGCGGCGCCGGGCCACCGGCACCGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACC ACCCTGACCGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGTGGCAGCAACAT CGTGATGACCCAGAGCCACAAGTTCATGAGCACCAGCGTGGGCGACCGGGTGAGCATCGCCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGGGCACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTG ATCTACTGGACCAGCACCCGGCACACCGGCGTGCCCGACCGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGA CTTCACCCTGACCATCACCAACGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGCCACCAGTACAACA GCTACAACACCTTCGGCAGCGGCACCCGGCTGGAGCTGAAGCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCT CCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAA GAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCTTCA TCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCTAAA AAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTG TGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAAC TGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTT TCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAA AGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGA AAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTAT TGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCC GGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGT GAGAGT CACCC TCTGAGACAGT TCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTAC CTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGT CGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGG ATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTAT GTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTA CCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATG GTTACATCGCCTAA

SEQ ID No. 45: SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aEGFRvIII-HCH2CH3pvaadCD14 8

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLL IYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGS ETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDP TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVWGGVLACYSLLVTVAF IIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENP GPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGQVKLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLE WVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSST SYAMDYWGQGT TVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFL ISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEIKRSDPAEPK SPDKTHTCPPCPAPPVAGP SVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR

DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKP KKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVK LSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEE YWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFR YLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQ YVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

SEQ ID No. 46: SFG.aCDl9-CD8STK-CD2 8tmZ-2A-aEGFRvIII-HCH2CH3pvaadCD14 8

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACAT CCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAG CCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTG ATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGA CTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACA CCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGC GGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCC AGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACT ACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGC GAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCA GGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACT ACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCC ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCG CCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATA TCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTT ATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCA GAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTG GCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTG CAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGG GCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGG CCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCC GGGCCCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGCCA GGTGAAGCTGCAGCAGAGCGGCGGAGGCCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCCTGAAGCTGAGCTGCGTGA CCAGCGGCTTCACCTTCCGGAAGTTCGGCATGAGCTGGGTGCGGCAGACCAGCGACAAGCGGCTGGAG TGGGTGGCCAGCATCAGCACCGGCGGCTACAACACCTACTACAGCGACAACGTGAAGGGCCGGTTCAC CATCAGCCGGGAGAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAAGAGCGAGGACACCG CCCTGTACTACTGCACCCGGGGCTACAGCAGCACCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACC ACCGTGACAGTGAGCAGCGGCGGAGGAGGCAGTGGTGGGGGTGGATCTGGCGGAGGTGGCAGCGACAT CGAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGAGCGTGGCCACCGGCGAGAAGGTGACCATCCGGTGCATGA CCAGCACCGACATCGACGACGACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCGAGCCCCCAAAGTTCCTG ATCAGCGAGGGCAACACCCTGCGGCCCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCAGCAGCGGCACCGGCACCGA CTTCGTGTTCACCATCGAGAACACCCTGAGCGAGGACGTGGGCGACTACTACTGCCTGCAGAGCTTCA ACGTGCCCCTGACCTTCGGCGACGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAA TCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCT CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCG

AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG

GATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCG

ACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC

TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGG

CAAGAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCT

TCATCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCT

AAAAAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAA

CTGTGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAG

AACTGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAA

CTTTCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAA

GAAAGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGG

AGAAAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAG

TATTGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCT

TCCGGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGTGAGAGTCACCCTCTGAGAC

AGTTCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGG

TACCTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGG

GGTCGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCG

TGGATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAG

TATGTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTAT

CTACCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCA

ATGGTTACATCGCCTAA

Ejemplo 11: Diseño y construcción de CAR basados en APRIL.

APRIL en su forma natural es una proteína de tipo II secretada. El uso de APRIL como dominio de unión a BCMA para un CAR requiere la conversión de esta proteína secretada de tipo II en una proteína unida a membrana de tipo I y para que esta proteína sea estable y conserve la unión a BCMA en esta forma. Para generar moléculas candidatas, se eliminó el extremo amino terminal de APRIL para eliminar la unión a proteoglicanos. A continuación, se añadió un péptido señal para dirigir la proteína naciente al retículo endoplásmico y, por lo tanto, a la superficie celular. Además, debido a que la naturaleza del espaciador utilizado puede alterar la función de un CAR, se probaron tres dominios espaciadores diferentes: se generó un CAR basado en APRIL que comprendía (i) un espaciador de IgG1 humana alterado para eliminar los motivos de unión a Fc; (ii) un pedúnculo de CD8; y (iii) la bisagra de IgG1 en solitario (representación en la figura 25 y secuencias de aminoácidos en la figura 26). Estos CAR se expresaron en un vector retroviral bicistrónico (figura 27A) de modo que una CD34 truncada con proteína de marcador podría coexpresarse como un gen marcador conveniente.

Ejemplo 12: Expresión y función de los CAR basados en APRIL.

El objetivo de este estudio fue probar si los CAR basados en APRIL que se habían construido se expresaban en la superficie celular y si APRIL se había plegado para formar la proteína nativa. Los linfocitos T se transdujeron con estas diferentes construcciones de CAR y se tiñeron usando un mAb anti-APRIL disponible comercialmente, junto con la tinción para el gen marcador y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 27B, en la que la unión de APRIL se representa frente a la fluorescencia del gen marcador. Estos datos muestran que en este formato, los CAR basados en APRIL se expresan en la superficie celular y APRIL se pliega lo suficiente como para ser reconocido por un mAb anti-APRIL.

A continuación, se determinó si APRIL en este formato podría reconocer BCMA y TACI. Se generaron BCMA y TACI recombinantes como fusiones con Fc de IgG2a de ratón. Estas proteínas recombinantes se incubaron con los linfocitos T transducidos. Después de esto, las células se lavaron y se tiñeron con un anticuerpo conjugado con fluoróforo anti ratón y un anticuerpo para detectar el gen marcador conjugado con un fluoróforo diferente. Las células se analizaron mediante citometría de flujo y los resultados se presentan en la figura 27C. Los diferentes CAR pudieron unirse a BCMA y TACI. Sorprendentemente, los CAR fueron más capaces de unirse a BCMA que TACI. Además, sorprendentemente, los CAR con un espaciador en el pedúnculo de CD8 o de bisagra de IgG1 fueron más capaces de unirse a BCMA y TACI que los CAR con un espaciador Fc.

Ejemplo 13: Los receptores de antígenos quiméricos basados en APRIL son activos contra las células que expresan BCMA

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un linfocito T o linfocito citolítico natural (NK) que coexpresa un primer receptor de antígeno quimérico (CAR) y un segundo CAR en la superficie celular, comprendiendo cada CAR:

(i) un dominio de unión a antígeno;

(ii) un espaciador

(iii) un dominio transmembrana; y

(iv) un endodominio

en el que los dominios de unión a antígeno del primer y segundo CAR se unen a diferentes antígenos, y en el que uno del primero o el segundo CAR es un CAR activador que comprende un endodominio activador y el otro CAR es un CAR inhibidor que comprende un endodominio inhibidor con ligadura que comprende todos de PTPN6 o una parte de los mismos que comprende el dominio tirosina fosfatasa.

2. Una secuencia de ácido nucleico que codifica tanto el primer como el segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) como se define en la reivindicación 1.

3. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene la siguiente estructura:

AgB1-espaciador1-TM 1-endo1-coexpr-AgB2-espaciador2-TM2-endo2

en la que

coexpr es una secuencia de ácido nucleico que permite la coexpresión de ambos CAR

4. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en la que coexpr codifica una secuencia que comprende un péptido autoescindible.

5. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en la que se utilizan codones alternativos en regiones de secuencia que codifican secuencias de aminoácidos iguales o similares, para evitar la recombinación homóloga.

6. Un kit que comprende

(i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el primer receptor de antígeno quimérico (CAR) como se define en la reivindicación 1, cuya secuencia de ácido nucleico tiene la siguiente estructura:

AgB1-espaciador1-TM1-endo1

en la que

(ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica el segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) como se define en la reivindicación 1, cuya secuencia de ácido nucleico tiene la siguiente estructura:

AgB2-espaciador2-TM2-endo2

7. Un kit que comprende: un primer vector que comprende la primera secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 6; y un segundo vector que comprende la segunda

secuencia de ácido nucleico como

se define en la reivindicación 6.

8. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

9. Un método para fabricar un linfocito T o NK de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la etapa de introducir: una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5; una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 6; y/o un primer vector y un segundo vector como se define en la reivindicación 7, o un vector de acuerdo con la reivindicación 8, en un linfocito T o NK ex vivo.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el linfocito T o NK es de una muestra aislada de un sujeto.

11. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de linfocitos T o NK de acuerdo con la reivindicación 1.

12. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

13. Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la enfermedad es cáncer.