CN111164203A - 表达嵌合抗原受体或工程化tcr并包含选择性表达的核苷酸序列的细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)的细胞，该细胞包含感兴趣的核苷酸序列(NOI)，该感兴趣的核苷酸序列根据以下由该细胞选择性地表达：i)细胞的分化/耗竭状态；或ii)细胞的微环境中环境代谢物的存在。

Description

表达嵌合抗原受体或工程化TCR并包含选择性表达的核苷酸 序列的细胞
发明领域
本发明涉及表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞。CAR或TCR的表达和/或活性可以与表达它的细胞的分化和/或耗竭状态和/或细胞的微环境中一种或多种环境代谢物的存在有关。
发明背景
传统上，抗原特异性T细胞是通过天然对靶抗原具有特异性的外周血T细胞的选择性扩增而生成的。但是，选择和扩增对大多数癌症抗原具有特异性的大量T细胞是困难的，而且常常是不可能的。使用整合载体的基因疗法为该问题提供了解决方案，因为嵌合抗原受体(CAR)的转基因表达允许通过大量外周血T细胞群体的离体病毒载体转导生成大量针对任何表面抗原的T细胞。
嵌合抗原受体是将单克隆抗体(mAb)的特异性移植到T细胞的效应功能的蛋白质。它们通常的形式是I型跨膜结构域蛋白，其中抗原识别氨基末端、间隔区、跨膜结构域都与复合胞内域连接，该复合胞内域传输T细胞存活和活化信号(参见图2A)。
这些分子的最常见形式是衍生自识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)经由间隔区和跨膜结构域与信号传导胞内域融合的融合物。此类分子响应于scFv对其靶标的识别导致T细胞活化。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并将杀伤表达靶抗原的靶细胞。已经开发出几种针对肿瘤相关抗原的CAR，并且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前正处于用于治疗各种癌症的临床试验中。
CAR T细胞的临床研究已经确定，CAR T细胞植入、扩增和持久性是临床活性特别是持续反应的先决条件。例如，在B细胞急性淋巴母细胞性白血病的CD19 CAR疗法中，CAR T细胞植入失败和随后B细胞区室的恢复与复发相关。几种策略可以增加CAR T细胞植入、扩增和持久的倾向。这些包括使用施用制备性淋巴衰竭化疗，使用导致具有初始或中央记忆表型的CAR T细胞比例增加的CAR T细胞产生过程，以及CAR与共刺激信号的使用。尽管采取了这些策略，CAR T细胞通常仍无法植入，导致疗法无效。
当前的CAR T细胞疗法目前通常由T细胞的混合物组成，所述T细胞的混合物包含CD4+ T细胞、CD8+ T细胞以及初始、干细胞记忆、中央记忆和效应记忆的T细胞。
在生理上，处于不同状态的T细胞对不同信号的响应不同。然而，在当前的CAR疗法中，不论正在表达的T细胞的分化状态和耗竭状态，CAR类型和表达保持不变。因此，随着T细胞分化，它们目前正在接收次优信号。
根据其表型向T细胞递送最佳信号的一种方法是在产生期间对T细胞进行分类，并用不同的载体进行转导。例如，可以将T细胞分类为CD4和CD8群体，并对其进行转导以表达具有针对CD4或CD8细胞优化的不同共刺激信号的CAR。这种方法是昂贵的，因为它使每种产品所需的细胞和载体生产过程加倍。此外，对于大多数其他应用，例如分化/耗竭状态-表型是高度动态的-例如转化为生产的中央记忆T细胞可能保留在该区室中，或者可能随时间而分化。
因此，需要用于生成针对植入、扩增和持久性进行了优化的表达CAR的细胞和表达工程化TCR的T细胞的替代方法。
体内CAR-T细胞(尤其是用于治疗实体癌的CAR-T细胞)的持久性差的另一个原因是，细胞难以克服不利的肿瘤微环境。特别是，CAR T细胞可能无法在实体癌肿瘤床中植入并扩增。
存在针对此问题的实验证据，例如，用经PSCA CAR工程化改造的T细胞治疗的小鼠显示出肿瘤生长延迟(Hillerdal et al(2014)BMC Cancer 14:30；and Abate-Daga et al(2014)25:1003-1012)。尽管细胞显示出高的体外细胞毒性，但是在体内，肿瘤的生长得以延迟但荷瘤的小鼠却无法治愈。
通过施用细胞因子，或通过工程化改造CAR T细胞以分泌或表达细胞因子、毒素或其他因子，可以增强CAR T细胞的持久性和活性。然而，这些方法有局限性：细胞因子的系统性施用可能是有毒的；细胞因子的组成型产生可能导致不受控制的增殖和转化(Nagarkatti et al(1994)PNAS 91:7638-7642；Hassuneh et al(1997)Blood 89:610-620)。当CAR T细胞在肿瘤中时，优选表达其他因子如转录或存活因子的表达。
因此，需要有助于T细胞的植入和扩增以抵消不利的肿瘤微环境的影响的替代的CAR T细胞方法。
附图说明
图1–阐明T细胞分化线性模型的示意图，其显示与每种细胞类型相关的表达标志物。APC-抗原呈递细胞；TCM-中央记忆T细胞；TEFF-效应T细胞；TEM-效应记忆T细胞；TN-初始T细胞；TSCM-T记忆干细胞。
图2–a)阐明经典CAR的示意图。(b)至(d)：CAR胞内域的不同代和排列：(b)初始设计通过FcεR1-γ或CD3ζ胞内域传输单独的ITAM信号，而后来的设计则在同一个复合胞内域中传输另外(c)一个或(d)两个共刺激信号。
图3–阐明仅在某些转录状态下表达CAR或CAR组分的表达盒的示意图。
A和B是转基因；X是控制转基因A表达的选择性活性启动子/增强子；CA是控制转基因B表达的组成型活性启动子；pA是多腺苷酸化序列。X可以例如对T细胞耗竭敏感，在这种情况下，A仅在包含表达盒的细胞耗竭的情况下表达，而B一直表达。
第一个具体实例是X检测到耗竭的情况下；A是抑制性分子，如截短的ZAP70；而B是CAR。当表达盒在T细胞中表达时，抑制性分子仅在T细胞耗竭时表达，以防止进一步耗竭并抑制CAR活性。
第二个具体实例是X检测到分化为效应记忆的情况下；A是具有41BB-Z胞内域的CAR；而B是具有CD28-Z胞内域的CAR。当表达盒在T细胞中表达时，在细胞处于初始/中央记忆状态时仅CD28-Z CAR表达。当细胞分化为效应记忆时，41BB-Z CAR也表达，从而引起快速扩增。
图4–阐明可以选择性表达单个转基因的不同方式的示意图。
(a)显示了一种自灭活的逆转录病毒载体，其中内部启动子“X”仅在特定的T细胞背景中驱动转录。在这种情况下，仅当启动子X有活性时才表达CAR-01。显示了逆转录病毒长末端重复U3、R和U5区以及包装信号ψ和土拨鼠预处理元件WPRE。(b)或者，基因表达可以在组成型活性启动子(CA)的控制下。在这种情况下，可以通过在转录物的5’非翻译区掺入特异性miRNA靶序列来实现对蛋白质表达的控制。在表达miRNA的T细胞背景中，转录物将被降解。(c)在一些应用中，应用两种方法。
图5–阐明用于具有独立表达的转基因的策略的示意图
(a)将受特定启动子/miRNA靶序列之一或两者控制的两个分开的表达盒同时导入到T细胞中。(b)表达盒可以经工程改造以整合分裂转录系统。一种方法是使载体表达两个转录物。5’选择性活性启动子驱动长转录物的转录，其中第一开放阅读框编码应当选择性表达的第一蛋白质。在此下游，与第一开放阅读框方向相同的第二组成型活性启动子驱动较短的转录物的转录，其中第二开放阅读框编码应当组成型表达的第二蛋白质。两个转录物共享相同的polyA腺苷酸化信号。(c)或者，两个分开的启动子可以驱动两个独立的转录物的表达。这通过将转录物与从有义链读取的一个转录物和从反义链读取的另一个转录物头对头定向来最方便地实现。(d)作为进一步的替代，组成型活性双向启动子导致两个转录物沿相反方向转录。每个转录物均由单独的miRNA靶序列控制。
图6–阐明芳烃受体(AHR)途径的示意图。
图7–阐明犬尿氨酸途径的示意图。
图8–阐明芳烃受体(AHR)的结构的示意图。
图9–在A)无刺激，和B)用3μg/mL PHA和50IL-2U/mL刺激下于72小时T细胞的记忆表型在各种不同启动子的控制下表达报告物基因。
图10–在A)无刺激，和B)用3μg/mL PHA和50IL-2U/mL刺激下于72小时在经转导的T细胞的不同记忆亚群中报告物基因eGFP的差异表达，其中报告物基因在各种不同启动子的控制下。
图11–在有或没有PHA刺激的情况下于24小时在经转导的T细胞的不同记忆亚群中eGFP表达的流式细胞术分析，其中报告物基因在CREB应答性启动子的控制下。
图12–A)在有或没有PHA刺激的情况下于24小时T细胞的记忆表型在CREB应答性启动子的控制下表达报告物基因；
B)在有或没有PHA刺激的情况下于24小时报告物基因eGFP在经转导的T细胞的不同记忆亚群中的差异表达，其中报告物基因在CREB应答性启动子的控制下。
发明概述
本发明人已发现，可以通过根据细胞的转录状态调整例如CAR/TCR、CAR组分或调控CAR/TCR活性的试剂的表达来优化表达CAR或表达TCR的细胞的功能。一种或多种基因的表达可以与细胞的分化或耗竭状态联系起来，这意味着可以随时间控制CAR的结构或CAR活性。
这项技术具有许多应用，包括将表达CAR的细胞偏向更“初始”的状态，以改善其在患者中的功效和存活。
还可以通过根据表达CAR/TCR的细胞的微环境中环境代谢物的存在调整例如CAR/TCR、CAR组分或调控CAR/TCR活性的试剂的表达来控制CAR/TCR表达的时间和/或体内位置和/或CAR/TCR细胞活性。
因此，在第一方面，本发明提供了表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)的细胞，该细胞包含感兴趣的核苷酸序列(NOI)，所述感兴趣的核苷酸序列根据以下选择性地表达：
i)细胞的分化/耗竭状态；或
ii)细胞的微环境中环境代谢物的存在。
在本发明的第一方面的第一实施方案中，根据细胞的分化和/或耗竭状态选择性地表达NOI。
NOI可以在例如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞、初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞或耗竭的T细胞中选择性表达。
NOI的表达可以在选择性活性启动子的控制下。
细胞可以包含miRNA靶序列，使得细胞中NOI的表达由miRNA控制。
细胞中NOI的表达可以在选择性活性启动子和miRNA靶序列的控制下。
在本发明的第一方面的第二实施方案中，根据细胞的微环境中环境代谢物的存在选择性地表达NOI。
环境代谢物可以激活芳烃受体(AHR)。
环境代谢物是色氨酸代谢物，如犬尿氨酸。
对于本发明的第一方面的细胞的第一和第二实施方案两者，NOI可以编码嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体。
或者，NOI可以编码CAR组分，如受体组分或细胞内信号传导组分。
NOI可以编码调控CAR或TCR活性的试剂，如例如信号转导修饰蛋白、抑制剂(dampener)；抑制性CAR、细胞因子信号传导结构域、粘附分子或转录因子。
NOI可以编码调控细胞活性的试剂，例如细胞因子、粘附分子或转录因子。
NOI可以编码调控靶细胞活性的试剂。例如，试剂可以包含毒素。
NOI可以编码调控靶细胞微环境的试剂。例如，试剂可以是趋化因子或细胞因子，或影响细胞因子或趋化因子介导的信号传导的试剂，如显性阴性趋化因子/细胞因子或趋化因子/细胞因子受体或结合剂，如调控趋化因子/细胞因子介导的信号传导的抗体或抗体片段。
在第二方面，本发明提供了核酸序列。
在本发明的第二方面的第一实施方案中，提供了核酸序列，其包含感兴趣的核苷酸序列(NOI)，所述NOI根据表达它的细胞的分化/耗竭状态而选择性地具有活性。
NOI可以在启动子的控制下，所述启动子根据表达它的细胞的分化/耗竭状态而选择性地具有活性。
备选地或另外，NOI可以包含特异性miRNA靶序列，其在表达核酸序列的细胞的某些分化/耗竭状态下引起转录物降解。
在本发明的第二方面的第二实施方案中，提供了包含感兴趣的核苷酸序列(NOI)的核酸序列，所述NOI在启动子的控制下，所述启动子根据表达它的细胞的微环境中环境代谢物的存在而说选择性地具有活性。
在第三方面，本发明提供了核酸序列的试剂盒，其包含根据本发明的第二方面的核酸序列。
试剂盒可以包含：
(i)在组成型活性启动子的控制下的第一核酸序列；和
(ii)在启动子的控制下的第二核酸序列，所述启动子根据以下之一选择性地具有活性：
表达它的细胞的分化/耗竭状态，或表达它的细胞的微环境中环境代谢物的存在。
试剂盒可以包含在第一选择性活性启动子的控制下的第一核酸序列；和在第二选择性活性启动子的控制下的第二核酸序列，其中第一和第二启动子在表达核酸序列的试剂盒的细胞的不同分化/耗竭状态下具有活性。
试剂盒可以包含：
(i)第一核酸序列，其包含特异性miRNA靶序列，所述特异性miRNA靶序列在表达该核酸序列的细胞的某些分化/耗竭状态下引起转录物降解；和
(ii)第二核酸序列，其缺少特异性miRNA靶序列。
试剂盒可以包含具有第一miRNA靶序列的第一核酸序列；和具有第二miRNA靶序列的第二核酸序列，其中第一和第二miRNA靶序列在表达核酸序列的试剂盒的细胞的不同分化/耗竭状态下引起转录物降解。
在第四方面，本发明提供了核酸构建体，其包含根据本发明的第二方面的核酸序列。
核酸构建体可以包含：
(i)在组成型活性启动子的控制下的第一核酸序列；和
(ii)在启动子的控制下的第二核酸序列，所述启动子根据以下之一选择性地具有活性：表达它的细胞的分化/耗竭状态；或表达它的细胞的微环境中环境代谢物的存在。
核酸构建体可以包含在第一选择性活性启动子的控制下的第一核酸序列；和在第二选择性活性启动子的控制下的第二核酸序列，其中第一和第二启动子在表达核酸构建体的细胞的不同分化/耗竭状态下具有活性。
核酸构建体可以包含：
(i)第一核酸序列，其包含特异性miRNA靶序列，所述特异性miRNA靶序列在表达核酸构建体的细胞的某些分化/耗竭状态下引起转录物降解；和
(ii)第二核酸序列，其缺少特异性miRNA靶序列。
核酸构建体可以包含具有第一miRNA靶序列的第一核酸序列；和具有第二miRNA靶序列的第二核酸序列，其中第一和第二miRNA靶序列在表达核酸构建体的细胞的不同分化/耗竭状态下引起转录物降解。
第一和第二核酸序列可以在组成型活性双向启动子的控制下。
第一核酸序列可以编码嵌合抗原受体(CAR)、CAR组分或工程化T细胞受体(TCR)，并且第二核酸序列可以编码抑制性分子，使得当核酸构建体在T细胞中表达时，CAR、CAR组分或TCR组成性表达，而当T细胞耗竭时，抑制性分子选择性地表达，所述抑制性分子导致CAR或TCR活性降低。
抑制性分子可以例如包含截短的ZAP70，其包含一个或多个ITAM结合结构域但缺少激酶结构域。
第一核酸序列可以编码包含CD28共刺激结构域的CAR或CAR组分；并且第二核酸序列可以编码包含OX40或41BB共刺激结构域的CAR或CAR组分，使得当核酸构建体在T细胞中表达时，第一CAR或CAR组分组成性表达，而当细胞处于效应记忆或效应状态时，第二CAR或CAR组分选择性地表达。
第一核酸序列可以编码嵌合抗原受体(CAR)、CAR组分或工程化T细胞受体(TCR)，并且第二核酸序列可以编码细胞因子，使得当核酸构建体在T细胞中表达时，CAR、CAR组分或TCR组成性表达，而在T细胞的微环境中存在环境代谢物的情况下，细胞因子选择性地表达。
在第五方面，本发明提供了载体，其包含根据本发明的第二方面的核酸序列；根据本发明的第三方面的核酸序列的试剂盒；或根据本发明的第四方面的核酸构建体。
在第六方面，本发明提供了用于制备根据本发明的第一方面的细胞的方法，其包括将以下项引入到细胞中的步骤：根据本发明的第二方面的核酸序列；根据本发明的第三方面的核酸序列的试剂盒；根据本发明的第四方面的核酸构建体；或根据本发明的第五方面的载体。
细胞可以来自从受试者分离的样品。
在第七方面，本发明提供了药物组合物，其包含多个根据本发明的第一方面的细胞。
在第八方面，本发明提供了根据本发明的第七方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
在第九方面，本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据本发明的第七方面的药物组合物施用于受试者的步骤。
方法可以包括以下步骤：
(i)分离含有细胞的样品；
(ii)用以下项转导或转染细胞：根据本发明的第二方面的核酸序列；根据本发明的第三方面的核酸序列的试剂盒；根据本发明的第四方面的核酸构建体；或根据本发明的第五方面的载体；和
(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。
在第十方面，本发明提供了根据本发明的第七方面的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
疾病可以是癌症。
发明详述
本发明提供了细胞，其包含感兴趣的核苷酸(NOI)，所述NOI根据细胞的转录状态或在细胞的微环境中环境代谢物的存在而选择性地表达。
NOI可以例如在细胞的某些分化或耗竭状态下选择性地表达。
细胞可以是T细胞。
T细胞分化
活化后，T细胞分化为多种不同的T细胞亚型，如图1中所示。
T细胞分化以及记忆和效应T细胞在针对病原体的免疫中起重要作用。当抗原呈递细胞向初始T细胞呈递病原性抗原时，细胞被激活，细胞数量增加，并分化成效应细胞，所述效应细胞迁移到感染部位并消除病原体。效应细胞是短寿命的细胞，而形成的记忆细胞的亚群具有长期存活的潜力。记忆细胞可以位于次级淋巴器官(中央记忆细胞，T CM)或最近感染的组织(效应记忆细胞，T EM细胞)中。在再次免疫应答期间再次暴露于抗原的过程中，记忆T细胞在消除感染中经历快速扩增，并且与初次免疫应答相比引起更有效且更快的免疫应答。记忆细胞具有几个特性特征：i)先前存在扩增和活化；(ii)在不存在抗原的情况下持续存在；iii)再次暴露于抗原后活性增加。
可以基于表达的细胞表面标志物和/或它们产生的效应分子来鉴定不同的T细胞亚群或不同的T细胞分化状态。下表根据其表面表型、转录调节物、效应分子和免疫应答功能总结了各种T细胞亚群。
为了将转基因转录与特定的T细胞状态联系起来，可以使用来自选择性表面标志物的启动子来驱动转基因转录。或者，可以使用响应于对该状态具有选择性的转录因子的转录元件。
初始T细胞
1.CD4+初始T细胞
Figure BDA0002426672450000101
2.CD8+初始细胞
Figure BDA0002426672450000102
中央记忆T细胞
Figure BDA0002426672450000103
效应记忆T细胞
Figure BDA0002426672450000111
效应T细胞
1.细胞毒性T细胞(CTL)
Figure BDA0002426672450000112
2.TH1细胞
Figure BDA0002426672450000113
3.TH2细胞
Figure BDA0002426672450000121
4.TH9细胞
Figure BDA0002426672450000122
5.TH17细胞
Figure BDA0002426672450000123
6.TH22细胞
表面表型 TCR、CD3、CD4、CCR10
转录因子 AHR
分泌的效应分子 IL-22
功能 在炎性皮肤病中鉴定。
7.TFH cell
Figure BDA0002426672450000131
8.天然TReg细胞
Figure BDA0002426672450000132
9.诱导型TReg细胞
Figure BDA0002426672450000133
10.TR1细胞
Figure BDA0002426672450000141
在本发明的上下文中，NOI可以在以下项中选择性地表达：
a)初始T细胞；
b)CD4+ T细胞；
c)CD8+ T细胞；
d)中央记忆T细胞；
e)效应记忆T细胞；
f)调节性T细胞；或
g)效应T细胞。
NOI可以在启动子的控制下，所述启动子在特定的T细胞亚群中引起选择性表达。例如，NOI可以在AP1-、CREB-、SRE-、TCF-LEF-、STAT3-或STAT5-反应性启动子的控制下。
这些启动子的序列如以下SEQ ID No.27至32所示。
SEQ ID No.27(AP1-应答性启动子)
TGAGTCAGTGACTCAGTGAGTCAGTGACTCAGTGAGTCAGTGACTCAG
SEQ ID No.28(CREB-应答性启动子)
GCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAAC
SEQ ID No.29(SRE-应答性启动子)
AGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCT
SEQ ID No.30(TCF-LEF-应答性启动子)
AGATCAAAGGGTTTAAGATCAAAGGGCTTAAGATCAAAGGGTATAAGATCAAAGGGCCTAAGATCAAAGGGACTAAGATCAAAGGGTTTAAGATCAAAGGGCTTAAGATCAAAGGGCCTA
SEQ ID No.31(STAT3-应答性启动子)
AGCTTCATTTCCCGTAAATCGTCGAAGCTTCATTTCCCGTAAATCGTCGAAGCTTCATTTCCCGTAAATCGTCGAAGCTTCATTTCCCGTAAATCGTCGAAGCTTCATTTCCCGTAAATCGTCGA
SEQ ID No.32(STAT5-应答性启动子)
AGTTCTGAGAAAAGTAGTTCTGAGAAAAGTAGTTCTGAGAAAAGTAGTTCTGAGAAAAGTAGTTCTGAGAAAAGT
T细胞耗竭
T细胞耗竭是在许多慢性感染和癌症期间出现的T细胞功能障碍状态。它由不良的效应功能、抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应或记忆T细胞的转录状态定义。
外在负调节途径(如免疫调节性细胞因子)和细胞内在性负调节途径(如PD-1)两者均在耗竭中起关键作用。耗竭的T细胞代表T细胞分化的独特状态。
耗竭的CD8+ T细胞首先在慢性病毒感染期间鉴定为不产生细胞因子的病毒特异性四聚体阳性CD8+ T细胞。在耗竭期间，功能丧失以分级的方式发生，其中耗竭的CD8+ T细胞丧失一些特性，然后丧失其他特性。通常，首先丧失如IL-2产生、高增殖能力和离体杀伤等功能。其他特性，包括产生肿瘤坏死因子的能力，通常会在功能障碍的更中间阶段丧失。严重的耗竭最终导致病毒特异性细胞部分或在一些情况下完全缺乏产生大量干扰素-γ(IFN-γ)或β-趋化因子或脱颗粒的能力。耗竭的最后阶段是病毒特异性T细胞的物理缺失。在慢性病毒感染期间，病毒特异性CD4+ T细胞也丧失效应功能。
免疫调节中心地参与T细胞耗竭。这些负途径可以分为三种主要类别：细胞表面抑制性受体(如PD-1)、可溶性因子(如IL-10)和免疫调节性细胞类型(如调节性T细胞(Treg细胞)和其他细胞)。
几种特定的转录途径与T细胞耗竭有关。例如，转录阻遏物Blimp-1中心地参与CD8+ T细胞耗竭。转录谱分析表明，耗竭的CD8+ T细胞中转录因子NFATc1(NFAT2)的表达更高。
一种整合的基因组学方法已用于定义由PD-1连接诱导并且还参与小鼠和人类中T细胞耗竭的基因。此类研究已将BATF鉴定为耗竭的T细胞中PD-1下游的常见转录途径。取代转录因子c-Fos，BATF与转录因子c-Jun形成二聚体，并可以抑制经典的AP-1介导的转录。
下表关于表面表型、转录调节物、效应分子和免疫应答功能对耗竭的T细胞进行总结。
Figure BDA0002426672450000161
在本发明的上下文中，NOI可以在耗竭的T细胞中选择性地表达。为了实现这一点，可以由从耗竭的标志物如PD1、TIM3和Lag3获取的启动子驱动转基因转录。
选择性活性启动子
本文使用的术语“启动子”是指启动子和/或增强子。启动子是启动特定基因转录的DNA区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，在同一条链上，在DNA的上游(朝向有义链的5’区)。启动子通常约100-1000个碱基对长。增强子是短的DNA区域(50-1500bp)，其可以被转录因子结合以增加特定基因转录发生的可能性。增强子是顺式作用的，并且可以位于转录起始位点的上游或下游。
可以通过特定的启动子将转基因的表达限制在T细胞的特定分化状态，所述启动子在生理上指导转基因在所述T细胞状态下的表达。例如，通过从CD4启动子驱动所述转基因的表达，可以将转基因的表达与T细胞向CD4+细胞的分化相关联。通过例如从CD44启动子驱动转基因的表达，可以将转基因的表达与初始T细胞状态相关联。通过例如从CD122启动子驱动转基因的表达，可以将转基因的表达与记忆T细胞状态相关联。通过例如从FOXP3启动子等驱动转基因的表达，可以将转基因的表达与调节性T细胞状态相关联。
通过使用CD4基因的-1076至+20(相对于转录起始位点)作为启动子，可以实现CD4+ T细胞特异性表达。该启动子的DNA序列如以下SEQ ID No.1所示。在T细胞内打开CD4基因的任何时候，在转基因开放阅读框的上游克隆CD4基因的这个区段导致转基因的表达。使用CD8基因的等同部分(如以下SEQ ID No.2所示)可以实现CD8+特异性表达。
SEQ ID No.1(CD4启动子)
AAGACAGGTTCTCACTCTGTCACTCAGGCTAGAGTGCAGTGGTGCAATCACGGTTCACTGCAGCCTCAACTTCCTGGGCTCAAGCGATCCCCCCACCTCGGCCTCCTAAAATGCTGGGATTATAGGCATGAGCCACCACTCCCAGCCCCACTTTTTTCAGACTGGAAAACGCACACTCACATGTGCATCTTTAAATGATCACTTGGGCTGTGGTATGGAGAATGGCGACCAGTGAGGAGGCAGGAGCTGTTGTCCGAGCAAGGGATGATATTGGCATCTTGGATTGGCATGGTGGCAGTAGTGGTAGTGCAGAGTGACTTGGGTAGATTTTGGAGCCATTTAGAAGGTAACATCCACAGGAACTGGTAAATAAATACGTGGGAGAAGTTGGGTGAAGGGGGTGTCAAAGATTACACCCAATTTATTTTGCTTGGGCAAGTTGGTGGATGGTGAGCCCCTCACTGAGTGAGAAGCCTGGAGAAGCAGGTTTGGAGGGTGGTAGTATGCAGGTGGTATGCATAGTTGGGGATGTGTGTTGAGTTTGCTATGTCCGGTGAGCTTCCCAGTGGAGATGTCCAATGGGCAGACGGATACTCACATAGAGAGTTCATGGTAGATTCGGGCTAGAGGAAAGCACCTGAGGCCTGGCCAGAGACGCCTAGAGGAACAGAGCCTGGTTAACAGTCACTCCTGGTGTCTCAGATATTCTCTGCTCAGCCCACGCCCTCTCTTCCACACTGGGCCACCTATAAAGCCTCCACAGATACCCCTGGGGCACCCACTGGACACATGCCCTCAGGGCCCCAGAGCAAGGAGCTGTTTGTGGGCTTACCACTGCTGTTCCCATATGCCCCCAACTGCCTCCCACTTCTTTCCCCACAGCCTGGTCAGACATGGCGCTACCACTAATGGAATCTTTCTTGCCATCTTTTTCTTGCCGCTTAACAGTGGCAGTGACAGTTTGACTCCTGATTTAAGCCTGATTCTGCTTAACTTTTTCCCTTGACTTTGGCATTTTCACTTTGACATGTTCCCTGAGAGCCTGGGGGGTGGGGAACCCAGCTCCAGCTGGTGACGTTTGGGGCCGGCCCAGGCC
SEQ ID No.2(CD8启动子)
CACAGGAGGCTCAGCACTAATCGGTAGATACTGCGAGATGCTGGGAGGTTAAGGGGCCTACCCGCAATATCTCTGGCCAATGCCTTGGGCTAGAAATGCCATAATTAGCCGCTCTTTTGATCCCTTGCAAAATGCGAATCCCACCGCACCTCCACCCCACCCGAGTGGTAATCTCCTAGTGGTAATCTAAGTGAGCCTGTGATAAGATAAGTAGCTCCTGGTGGTGAGGGTGAGAAATTGGGGAGCTGGAGCCCCAGCCAGGGACGAGGCTGTAGGGGCTAGGGCGAAGATGGAGGCTGCTGGGCCCCCAGATGGAAGACGGTAACGTGCGCCCGCTTCGTTTTTGCTCGAGGTCAGTCAGGTGCAGACTGAATTCGAAGTCGCTCCCTCCTCCGCTCAACCCCGACCAGGCCAAAACTAAAGCAGCACCGCCCCCTGCTGGGCCGACAGGGCATCAGATTTTGCTGGACGCGGGTGACAGGCGAGATAGGGAGTGTCCCTGCTGCTAGTGCCCCTGCTGCTAGTGCCTAGTTACCTGCA
通过使用FOXP3特异性启动子，可以实现调节性T细胞特异性表达。对FOXP3具有特异性的启动子位于FOXP3基因的-511至+176个碱基对(相对于转录起始位点)的区域中。该启动子的DNA序列如以下SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.3(FOXP3启动子)
TCCCATCCACACATAGAGCTTCAGATTCTCTTTCTTTCCCCAGAGACCCTCAAATATCCTCTCACTCACAGAATGGTGTCTCTGCCTGCCTCGGGTTGGCCCTGTGATTTATTTTAGTTCTTTTCCCTTGTTTTTTTTTTTTCAAACTCTATACACTTTTGTTTTAAAAACTGTGGTTTCTCATGAGCCCTATTATCTCATTGATACCTCTCACCTCTGTGGTGAGGGGAAGAAATCATATTTTCAGATGACTCGTAAAGGGCAAAGAAAAAAACCCAAAATTTCAAAATTTCCGTTTAAGTCTCATAATCAAGAAAAGGAGAAACACAGAGAGAGAGAAAAAAAAAACTATGAGAACCCCCCCCCACCCCGTGATTATCAGCGCACACACTCATCGAAAAAAATTTGGATTATTAGAAGAGAGAGGTCTGCGGCTTCCACACCGTACAGCGTGGTTTTTCTTCTCGGTATAAAAGCAAAGTTGTTTTTGATACGTGACAGTTTCCCACAAGCCAGGCTGATCCTTTTCTGTCAGTCCACTTCACCAAGGTGAGTGTCCCTGCTCTCCCCTACCAGATGTGGGCCCCATTGGAGGAGATG
通过例如从CD44启动子驱动转基因的表达，可以将转基因的表达与初始T细胞状态相关联。对CD44具有特异性的启动子位于CD44，位于CD44基因的转录起始位点-908至-118。该启动子的DNA序列如以下SEQ ID No.4所示。
SEQ ID No.4(CD44启动子)
GAAGTTGTATGGGAAGATGAATAGAAGAATAGGTGGTTGAATAAATTAAAAGGTGTGTGGTTGGATGAATGAATGAGTGGGATGATAGATGGACCTAAGTGGTTAGTGGATGGACAGGAGGATGGATGGATGTGAGAGCCCCAGAAGGACATAAGGAAAGATGGGTGGATAGATGGATGGGCGGATGGAAGGATATTTAGGAGGATGAATGAGCATGTGTGTGGAGAGAGGTGCCCATTCACACTGGCTTGAACACATGGGTTAGCTGAGCCAAATGCCAGCCCTATGACAGGCCATCAGTAGCTTTCCCTGAGCTGTTCTGCCAAGAAGCTAAAATTCATTCAAGCCATGTGGACTTGTTATTGAGGGGAAAAAGAATGAGCTCTCCCTCTTTCCACTTGGAAGATTCACCAACTCCCCACCCCTCACTCCCCACTGTGGGCACGGAGGCACTGCGCCACCCAGGGCAAGACCTCGCCCTCTCTCCAGCTCCTCTCCCAGGATATCCAACATCCTGTGAAACCCAGAGATCTTGCTCCAGCCGGATTCAGAGAAATTTAGCGGGAAAGGAGAGGCCAAAGGCTGAACCCAATGGTGCAA
其他用于初始/中央记忆细胞的标志物包括：CCR7、CD62L、CD27、CD28、CD127。这些基因的启动子可以用于产生初始/中央记忆的特异性表达。CD27、CD28和CD127的DNA序列分别如以下SEQ ID No.5、6和7所示。
SEQ ID No.5(CD27启动子区域)
TTTTGTGGTGCTGGTTTCTGTATAAACCTGAAAAATTCTGAATTCCAAAACTTATCTGACCCCCAAAGTTTCAGATAAGAGCTTGTGGACCTGTGCTCAATTCTGGTTCTCCTTCCTTCTTTCAACTGTTGTCTGTGAAAGGAGGGATGCAGGTATGGGAGACAGGAGTCCTGCGAATTCGTCTGTAAACTGTGGACGGGGGGGTGGGTGGGGGGGGGTAACGTGGGCACCTTTGTGCACAAGTGCATGAATAGGAGGGGTGAGCAACTGTGTGTCCATCACCTTTTTGTCAAAGAAGCAGGAGTCAGTGGGCTACGTGCTTCATGAGCAGGAGAGGCGGAAACTAAGGAAGGCTCATGTGTTGGAGGAAGCATGTTTGAAGAGCAGCAGGTCTCACAGAGTTTGCTCTTTAATACTCTCCCCAGCACACGGAAGGGGAAGGGGGTGGAGGTTGCTGCTATGAGAGAGAAAAAAAAAACAGCCACAATAGAGATTCTGCCTTCAAAGGTTGGCTTGCCACCTGAAGCAGCCACTGCCCAGGGGGTGCAAAGAAGAGACAGCAGCGCCCAGCTTGGAGGTGCTAACTCCAGAGGCCAGCAT
SEQ ID No.6(CD28启动子区域)
CAGGTACCCACCATGATGCCTGGCTAATTTTTTGTATTTTCAATGGAGACGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTCGTCTTGACCTCCTGGCCTCAAATGATCCACCCACTTTGGCCTCCCAAATTGCTGGCATTACAGGCGTGAGCCACTGCACCCGGCCTGTTCCTTCTTAAGAACACTTTGTCTCCCCTTTAATCTCTGCTGGATTTCAAGCACCCCTTTTACACAACTCTTGATATCCATCAATAAAGAATAATTCCCATAAGCCCATCATGTAGTGACCGACTATTTTTCAGTGACAAAAAAAAAGTCTTTAAAAATAGAAGTAAAAGTCTAAAGTCATCAAAACAACGTTATATCCTGTGTGAAATGCTGCAGTCAGGATGCCTTGTGGTTTGAGTGCCTTGATCATGTGCCCTAAGGGGATGGTGGCGGTGGTGGTGGCCGTGGATGACGGAGACTCTCAGGCCTTGGCAGGTGCGTCTTTCAGTTCCCCTCACACTTCGGGTTCCTCGGGGAGGAGGGGCTGGAACCCTAGCCCATCGTCAGGACAAAGATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTC
SEQ ID No.7(CD127启动子区域)
CGAGACAAGCCTGGCCAACATGGCGAAACCCCGTCTCCACTGAAAACACAAAAATTAGGCTGGCATAGTGGCATTTGCCTGTAGTCCTAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCTGGGAGGTGGAAATTGCAGTGAGCCGAGATCATGCTATTGTACTCCAGCCTGGGCAACAAAGCAAGACTCTGTCTCAAAAAAATAAAAATTAAAAAAATAAAGTAGCCTCTAGCCTAAGATAGCTTGAGCCTAGGTGTGAATCTACTGCCTTACTCTGATGTAAGCACAGTAAGTGTGGGGGCTGCAGGGAATATCCAGGAGGAACAATAATTTCAGAGGCTCTGTCTCTTCATGTCCTTGACCTCTGCTTACAGCAGCAATACTTTTACTCAGACTTCCTGTTTCTGGAACTTGCCTTCTTTTTTGCTGTGTTTATACTTCCCTTGTCTGTGGTTAGATAAGTATAAAGCCCTAGATCTAAGCTTCTCTGTCTTCCTCCCTCCCTCCCTTCCTCTTACTCTCATTCATTTCATACACACTGGCTCACACATCTACTCTCTCTCTCTATCTCTCTCAGAATGACAATTCTAGG
其他用于终末分化的效应T细胞的标志物包括：CD57、KLRG1、CD161(KLRB1)、CD58和CD122。这些基因的启动子可以用于产生效应T细胞特异性表达。CD122的DNA序列如以下SEQ ID No.8所示。
SEQ ID No.8(CD122启动子)
TGCTAAACGGAGTAAGGGGCTTCCTGGAAGGCTGGGTGAAATGGGAGTCTCGGAAAGATGGTGTGTTGCAGGCTGGGAGGAGGGTGAGACGCTGGGGTCACCTAGAGGGACCTGCTTGTGTGAAGCCTACGTATTAGTGGGTATGTGTGTGACCGGATGGAGGCGTCAGAGGTGTTGGGTAGCCTGTGTGAGTTGGCGTGGGGGTGATGTAGGAGGGGAGAGAGGGAGGGCCTGCGTTCCCTTGGCTCCTGTGTGCAGCTAGGCCCCTATTTGACAATGTGTGTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCCGCCCCCAGCGTAGGAGGCAGATCTTTATCTGGCCCTGGGTGCTTGAGGAGTTTCAGGCTTTCTCATAAGCCTCGTCTCCCCGCCTCTCCACCCCAGGCCTTGCCCCTCTATCCTCTGCACAGGAAGTGGGCTGGCTCTGGGCTTTTAGTCTTTGCGGCCCCAGCAGCCAGAGCTCAGCAGGGCCCTGGAGAGATGGCCACGGTCCCAGCACCGGGGAGGACTGGAGAGCGCGCGCTGCCACCGCCCCATGTCTCAGCCAGGTGATGTCC
几个数据库包含启动子序列信息。例如，EPDnew(真核启动子数据库)是人(和其他)基因组中经过实验验证的启动子的新集合。(参考文献：Dreos,R.etal.2015.Nucl.Acids Res.43(D1):D92-D96)。
本领域技术人员推断未描述的启动子。简而言之，可以通过分析通常在所讨论的基因的转录起始位点上游的基因组序列来进行推断。可以与已知的基序和其他启动子进行比较。有几种公共数据库和软件工具可用于协助进行此类分析，例如：
·神经网络启动子预测(Berkeley Drosophila Genome Project,U.S.A.)-已过时(参考文献：M.G.Reese 2001.Comput.Chem.26:51-6)。
·启动子2.0预测服务器(S.Knudsen,Center for Biological SequenceAnalysis,Technical University of Denmark)-预测DNA序列中脊椎动物Pol II启动子的转录起始位点
·PROMOSER-人、小鼠和大鼠启动子提取服务(Boston University,U.S.A.)-绘制哺乳动物基因组中的启动子序列和转录起始位点。(参考文献：S.Anason etal.2003.Nucl.Acids.Res.200331:3554-59)。
使用miRNA靶结构域进行控制
microRNA(miRNA)是小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)，其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用。miRNA经由与mRNA分子内互补序列的碱基配对起作用。结果，这些mRNA分子通过以下一个或多个过程沉默：(i)将mRNA链切割成两部分；(ii)通过缩短其poly(A)尾巴使mRNA去稳定化；和核糖体将mRNA翻译为蛋白质的效率较低。
在本发明的上下文中，选择性地控制表达的替代方法是将特定的miRNA靶序列引入转录物的非翻译区。这些miRNA靶序列指导同源miRNA破坏转录物。选择miRNA靶序列，以便在不期望转基因的表达时表达其同源miRNA。
在T细胞生物学的最早和最后阶段期间，microRNA在T细胞中可能是最重要的。胸腺早期分化的最初阶段至关重要地依赖于microRNA网络，而后期和外周稳态则很大程度上(尽管不完全)独立于microRNA。对T细胞的最深远影响是常规和调节性T细胞的效应和调节功能的激活，其中microRNA缺乏导致功能几乎完全丧失。miRNA在T细胞分化中的时间活性由以下综述：Jeker和Bluestone(2013；Immunol.Rev.253,65–81)；Dooley等人(2013；Immunol.Rev.253,53-64)以及Baumjohann和Ansel(2013；Nat.Rev.Immunol.13:666-678)。
本领域技术人员可以从文献、数据库和预测软件中选择适当的miRNA靶序列。
例如miRDB(Nathan Wong and Xiaowei Wang(2015)miRDB:an online resourcefor microRNA target prediction and functional annotations.Nucleic AcidsResearch.43(D1):D146-152.)
另一个实例：microRNA.org。microRNA靶标预测：microRNA.org资源：靶标和表达。Betel D,Wilson M,Gabow A,Marks DS,Sander C.,Nucleic Acids Res.2008Jan；36(Database Issue):D149-53.
表1给出了一些在T细胞中重要的microRNA序列的实例。
表1
Figure BDA0002426672450000231
环境代谢物
在第二实施方案中，本发明的第一方面涉及包含NOI的细胞，该NOI根据细胞的微环境中环境代谢物的存在而由该细胞选择性地表达。
环境代谢物可以是在肿瘤微环境中发现的代谢物。代谢物可以由肿瘤直接或间接产生。
芳烃受体
针对环境毒素的细胞反应主要是通过芳烃受体(AHR)的激活介导。毒素与PAS(Per-Arnt-Sim)结构域结合后发生AHR激活。这引发结构改变，导致释放细胞伴侣蛋白，从而允许与ARNT转录因子二聚化。所得的AHR/ARNT异二聚体与特定DNA序列(XRE–外源性物质识别元件(xenobiotic recognition element))的结合导致对细胞损伤作出反应所需的基因上调(图6)。
在本发明的上下文中，环境代谢物可以激活芳烃受体(AHR)。
感兴趣的核苷酸的表达可以通过AHR/ARNT异二聚体上调。
包含NOI的核酸序列还可以包含一种或多种由AHR/ARNT异二聚体特异性识别的外源性物质识别元件(XRE)。
XRE核心序列如以下SEQ ID No.12所示。此序列通常包含在如SEQ ID No.13所示的共有序列中。
5’–GCGTG–3’(SEQ ID No.12)
5’–T/GNGCGTGA/CG/CA–3’(SEQ ID No.13)
本发明的核苷酸序列可以包含SEQ ID No.12或13以及NOI。在相反方向(即反义链)，XRE核心序列具有序列CACGC(SEQ ID No.24)。
本发明的核苷酸序列可以包含SEQ ID No.24。例如，XRE启动子可以包含以下序列之一：
CTGGTAAGCACGCCAATGAA(SEQ ID NO.25)，或
TGAGTTCTCACGCTAGCAGATTGAGTTCTCACGCTAGCAGATTGAGTTCTCACGCTAGCAGAT(SEQID NO.26)。
犬尿氨酸途径
肿瘤微环境除了营养不良外，还保持有很强的免疫抑制活性，其部分通过微环境中腺苷和色氨酸代谢物的产生所维持。色氨酸降解以产生免疫抑制产物的途径如图7中所示。
这些代谢物之一，犬尿氨酸通过与AHR结合并经由XRE序列刺激转录而起作用，如图6中示意性所示。
在本发明的上下文中，环境代谢物可以是腺苷或色氨酸代谢物。环境代谢物可以是例如犬尿氨酸、犬尿酸、喹哪啶酸、3-OH-犬尿氨酸、黄尿酸、3-OH-邻氨基苯甲酸、喹啉酸或吡啶甲酸。具体而言，环境代谢物可以是犬尿氨酸。
嵌合抗原受体
本发明提供了包含嵌合抗原受体(CAR)并选择性表达NOI的细胞。
图2中示意性显示的CAR是嵌合I型跨膜蛋白质，其将细胞外抗原识别结构域(结合子)连接至细胞内信号传导结构域(胞内域)。结合子通常是衍生自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式或靶抗原的配体。间隔区结构域可以是必要的以将结合子与膜分离并允许其呈合适的定向。使用的常见间隔区结构域是IgG1的Fc。取决于抗原，更紧凑的间隔区可以满足，例如来自CD8α的茎部，以及甚至仅仅是IgG1铰链。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中并将间隔区连接至胞内域。
早期的CAR设计具有衍生自FcεR1或CD3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传输免疫信号1，其足够触发T细胞对关联靶细胞的杀伤，但不能完全活化T细胞以增殖或存活。为了克服这一限制，构建了复合胞内域：将T细胞共刺激分子的细胞内部分融合至CD3ζ的细胞内部分，产生了第二代受体，其能够在抗原识别后同时传输活化和共刺激信号。最通常使用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最强力的共刺激信号-即免疫信号2，其触发T细胞增殖。已经描述了一些受体，其包括TNF受体家族胞内域，例如紧密相关的OX40和41BB，其传输存活信号。现在已经描述甚至更强力的第三代CAR，其具有能够传输活化、增殖和存活信号的胞内域。
可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸转移至T细胞。以这种方式，可以生成大量癌症特异性T细胞用于过继细胞转移。当CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输至上面有其表达的T细胞。因此CAR将T细胞的特异性和细胞毒性引向表达靶向抗原的肿瘤细胞。
抗原结合结构域
抗原结合结构域是经典CAR的识别抗原的部分。
本领域已知许多抗原结合结构域，包括基于抗体，抗体模拟物和T细胞受体的抗原结合位点的那些。例如，抗原结合结构域可以包含：衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)；靶抗原的天然配体；对靶标具有足够亲和力的肽；单结构域结合子例如骆驼科动物的；人工结合子例如Darpin；或衍生自T细胞受体的单链。
各种肿瘤相关抗原(TAA)是已知的，如下表2所示。用于本发明的抗原结合结构域可以是能够结合其中所示的TAA的结构域。
表2
癌症类型 TAA
弥漫性大B细胞淋巴瘤 CD19、CD20
乳腺癌 ErbB2、MUC1
AML CD13、CD33
神经母细胞瘤 GD2、NCAM、ALK、GD2
B-CLL CD19、CD52、CD160
结直肠癌 叶酸结合蛋白、CA-125
慢性淋巴细胞性白血病 CD5、CD19
胶质瘤 EGFR、波形蛋白
多发性骨髓瘤 BCMA、CD138
肾细胞癌 碳酸酐酶IX、G250
前列腺癌 PSMA
肠癌 A33
抗原结合结构域可以包含结合B细胞膜抗原(BCMA)以及跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(transmembrane activator and calcium modulator andcyclophilin ligand interactor,TACI)的增殖诱导配体(APRIL)。在WO2015/052538中描述了包含基于APRIL的抗原结合结构域的CAR。
跨膜结构域
跨膜结构域是经典CAR的跨越膜的序列。其可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜结构域可以衍生自CD28，其提供良好的受体稳定性。
信号肽
CAR可以包含信号肽，使得当CAR在细胞例如T细胞内表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后被引导至其得以表达的细胞表面。
信号肽的核心可以含有长段的疏水性氨基酸，其倾向于形成单个alpha螺旋。信号肽可以以短的带正电荷的氨基酸段开始，该氨基酸段有助于在移位期间实施多肽的正确拓扑。在信号肽的末端处，典型地存在一段由信号肽酶识别并切割的氨基酸。信号肽酶可以在移位期间或移位完成后切割以产生游离信号肽和成熟蛋白质。然后通过特异性蛋白酶消化游离信号肽。
间隔区结构域
CAR可以包含间隔区序列以连接抗原结合结构域和跨膜结构域。柔性间隔区允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进抗原结合。
间隔区序列可以例如包含IgG1 Fc区、IgG1铰链或人CD8茎部或小鼠CD8茎部。或者，间隔区可以包含备选接头序列，其具有与IgG1 Fc区、IgG1铰链或CD8茎部相似的长度和/或结构域间隔特性。可以改变人IgG1间隔区以去除Fc结合基序。
细胞内信号传导结构域
细胞内信号传导结构域是经典CAR的信号传输部分。
最常用的信号传导结构域组分是CD3-zeta胞内域的，其含有3个ITAM。这在抗原结合后向T细胞传输活化信号。CD3-zeta可以不提供完全有能力的活化信号并因此可以需要其他共刺激信号。例如，嵌合的CD28和OX40可以与CD3-Zeta一起使用，以传递增殖/存活信号，或者可以将所有三种一起使用(如图2B中所示)。
CAR组分
在本发明的细胞中，NOI可以编码CAR组分。
例如，NOI可以编码CAR的一部分，如细胞内信号传导结构域。
先前已经描述了CAR信号传导系统，其包含两个部分：受体组分，其包含抗原结合结构域，任选的间隔区结构域和跨膜结构域；以及细胞内信号传导组分，其包含细胞内信号传导结构域。一个或多个共刺激结构域可以位于受体组分和/或细胞内信号传导组分上。
受体组分和细胞内信号传导组分之间的异二聚化产生功能性CAR。异二聚化可以自发发生，如WO2016/124930中所述；或者它可以仅在存在二聚化的化学诱导物(CID)的情况下发生，如WO2015/150771中所述。在第三种替代中，异二聚化被试剂如特定的小分子的存在破坏，因此CAR介导的信号传导仅在不存在试剂的情况下发生。此类系统描述于WO2016/030691中。
在本发明的细胞中，根据细胞的分化/耗竭状态或在细胞的微环境中环境代谢物的存在，此类CAR系统的受体组分和/或细胞内信号传导组分的表达可以是选择性的。换句话说，“CAR组分”可以是受体组分或细胞内信号传导组分。
在一个特定的实施方案中，细胞可以包含在组成型活性启动子的控制下的编码受体组分的NOI。例如，细胞可以包含两种或更多种编码具有不同共刺激结构域或共刺激结构域组合的细胞内信号传导组分的核酸，每种都在不同的选择性启动子/miRNA靶标的控制下。因此，CAR系统中的共刺激结构域或共刺激结构域组合将随着细胞的分化或耗竭状态而改变。
T细胞受体
本发明还提供了包含工程化T细胞受体(TCR)和选择性表达的NOI的细胞。
TCR是在T细胞的表面上表达的分子，其负责识别作为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽的抗原。
TCR是由两个不同的蛋白质链组成的异二聚体。在人类中，95％的T细胞中，TCR由alpha(α)链和beta(β)链组成(分别由TRA和TRB编码)，而在5％的T细胞中，TCR由gamma和delta(γ/δ)链组成(分别由TRG和TRD编码)。
当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC)接合时，T淋巴细胞通过信号转导活化。
与常规的抗体针对的靶抗原相比，TCR识别的抗原可以包括潜在的细胞内蛋白质的整个阵列，所述蛋白质作为肽/MHC复合物得以加工并递送到细胞表面。
通过使用载体人工将TRA和TRB基因；或TRG和TRD基因引入到细胞中，可以工程化改造细胞以表达异源(即非天然)TCR分子。例如，可以将经工程化改造的TCR的基因重新引入到自体T细胞中，并转移回患者中进行T细胞过继疗法。
感兴趣的核苷酸(NOI)
本发明的细胞包含感兴趣的核苷酸(NOI)，所述感兴趣的核苷酸(NOI)根据以下项选择性地表达：
i)细胞的分化/耗竭状态；或
ii)细胞的微环境中环境代谢物的存在。
NOI可以是RNA或DNA。
NOI可以编码如上所述的CAR、CAR组分或TCR。
NOI可以编码调控CAR或TCR活性的试剂。
NOI可以编码调控表达CAR或TCR的细胞的活性的试剂。
NOI可以编码调控靶细胞活性的试剂。
NOI可以编码调控靶细胞微环境的试剂。
细胞可以包含两种或更多种NOI，所述NOI根据以下项选择性地表达：
i)细胞的分化/耗竭状态；或
ii)细胞的微环境中环境代谢物的存在。细胞可以例如产生影响表达CAR/TCR的细胞、靶细胞或靶细胞微环境的试剂的组合。细胞可以例如产生细胞因子或趋化因子或细胞因子和趋化因子的组合。
CAR/TCR调控试剂
本发明还提供了包含CAR或工程化TCR以及调控CAR或TCR活性的试剂的细胞。试剂可以根据细胞的转录状态选择性地表达。
调控CAR/TCR活性的试剂可以例如是信号转导修饰蛋白；或“抑制剂”；抑制性CAR或细胞因子信号传导结构域。
信号转导修饰蛋白
WO2016/193696描述了多种融合蛋白和截短的蛋白质，其在免疫细胞活化后调控信号传导途径。
信号转导修饰蛋白可以是例如以下之一：
(i)截短的蛋白质，其包含来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的蛋白质的SH2结构域，但缺少激酶结构域；
(ii)截短的蛋白质，其包含来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的蛋白质的SH2结构域，但缺少磷酸酶结构域；
(iii)融合蛋白，其包含(a)来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的蛋白质或来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的蛋白质的SH2结构域；和(ii)异源结构域。
信号转导修饰蛋白可以是包含ZAP70 SH2结构域但缺少ZAP70激酶结构域的截短的蛋白质。
信号转导修饰蛋白可以是包含PTPN6 SH2但缺少PTPN6磷酸酶结构域的截短的蛋白质。
信号转导修饰蛋白可以是包含SHP-2SH2结构域但缺少SHP-2磷酸酶结构域的截短的蛋白质。
信号转导修饰蛋白可以是融合蛋白，其包含(i)来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的蛋白质的SH2结构域；和(ii)磷酸酶结构域。
融合蛋白可以例如包含ZAP70 SH2结构域、PTPN6或SHP-2磷酸酶结构域。
信号转导修饰蛋白可以是融合蛋白，其包含(i)来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的蛋白质的SH2结构域；和(ii)磷酸酶结构域。
融合蛋白可以包含来自PTPN6或SHP-2的SH2结构域。
融合蛋白可以包含Zap70激酶结构域。
融合蛋白可以包含AKT或JAK激酶结构域。
信号转导修饰蛋白可以是融合蛋白，其包含(i)来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的蛋白质或来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的蛋白质的SH2结构域；和(ii)异源信号传导结构域。
融合蛋白可以包含来自ZAP70、PTPN6或SHP-2的SH2结构域。
异源信号传导结构域可以来自通常不由含有ITAM或ITIM的受体激活的信号传导分子。
异源信号传导结构域可以是共刺激结构域。在这方面，融合蛋白可以包含CD28、OX40或41BB共刺激结构域。
异源信号传导结构域可以是抑制性结构域。在这方面，抑制性结构域可以是或包含CD148或CD45的胞内域。或者，异源信号传导结构域是或包含ICOS、CD27、BTLA、CD30、GITR或HVEM的胞内域。
信号转导修饰蛋白可以是融合蛋白，其包含(i)来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的蛋白质的SH2结构域；和(ii)含有ITAM的结构域。
融合蛋白可以包含ZAP70 SH2结构域。
含有ITAM的结构域可以是或包含CD3-Zeta的胞内域。
信号转导修饰蛋白可以是融合蛋白，其包含(i)来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的蛋白质的SH2结构域；和(ii)含有ITIM的结构域。
融合蛋白可以包含来自PTPN6或SHP-2的SH2结构域。
含有ITIM的结构域可以是或包含来自PD1、PDCD1、BTLA4、LILRB1、LAIR1、CTLA4、KIR2DL1、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR3DL1或KIR3DL3的胞内域。
当信号转导修饰蛋白包含包括ZAP70 SH2结构域但缺少ZAP70激酶结构域的截短的蛋白质时，该截短的蛋白质可以包含如SEQ ID NO:9所示的序列或由其组成。
ZAP70完整的SH2结构域(SEQ ID NO:9)
MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHP
ZAP70在序列的N末端具有两个SH2结构域，在序列的残基10-102和163-254处。因此，本发明的截短的蛋白质或融合蛋白可以包含如SEQ ID No.10和11所示的序列的一个或两个。
ZAP70 SH2 1(SEQ ID NO:10)
FFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPC
ZAP70 SH2 2(SEQ ID NO:11)
WYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEAC
融合蛋白可以包含具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性的SEQ ID NO:9、10或11的变体，条件是变体序列是具有所需特性的SH2结构域序列。换句话说，变体序列应当能够结合CD3-zeta的细胞质尾中的磷酸化酪氨酸残基，其允许募集ZAP70。
抑制剂
在另一个实施方案中，试剂可以是磷酸酶“抑制剂”，其引起CAR或TCR胞内域的去磷酸化，从而提高了在某些转录状态下活化的阈值。
抑制剂可以是包含信号抑制结构域(SDD)的膜拴系的信号抑制组分(SDC)。
SDD可以能够抑制CAR的细胞内信号传导结构域。
SDD可以包含能够使基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)去磷酸化的磷酸酶结构域，例如CD148或CD45的胞内域或SHP-1或SHP-2的磷酸酶结构域。
SDD可以包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，例如，SDD可以包含来自以下抑制性受体之一的胞内域：PD1、BTLA、2B4、CTLA-4、GP49B、Lair-1、Pir-B、PECAM-1、CD22、Siglec 7、Siglec 9、KLRG1、ILT2、CD94-NKG2A和CD5。
SDD可以抑制Src蛋白激酶，如Lck。SDD可以包含CSK的激酶结构域。
膜拴系的SDC可以例如包含跨膜结构域或豆蔻酰化序列。
抑制性CAR
试剂可以是抑制性CAR，即包含抑制性胞内域的CAR。抑制性胞内域可以包含蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)，如来自SHP-1或SHP-2的PTP结构域。
或者，抑制性胞内域可以包含ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)，其含有胞内域如来自CD22、LAIR-1、杀手抑制性受体家族(KIR)、LILRB1、CTLA4、PD-1、BTLA等的胞内域。当磷酸化时，ITIM通过其SH2结构域募集内源性PTPN6。如果与含有胞内域的ITAM共定位，则发生去磷酸化并抑制激活的CAR。
或者，抑制性CAR可以包含能够使基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)去磷酸化的磷酸酶结构域，例如CD148或CD45的胞内域或SHP-1或SHP-2的磷酸酶结构域。
细胞因子信号传导结构域
许多细胞功能受细胞因子受体超家族成员的调节。通过这些受体的信号传导取决于它们与Janus激酶(JAK)的关联，其将配体结合与募集到受体复合物的信号传导蛋白的酪氨酸磷酸化连接。其中有信号转导物和转录激活物(STAT)，即有助于细胞因子反应的多样性的转录因子的家族，。
当细胞因子受体结合其配体时，可以启动一种或多种以下细胞内信号传导途径：
(i)JAK-STAT途径；
(ii)MAP激酶途径；和
(iii)磷酸肌醇3激酶(PI3K)途径。
细胞因子受体包含引起“细胞因子型”细胞信号传导的胞内域。
本发明的试剂可以是或包含细胞因子受体胞内域。
胞内域可以衍生自I型细胞因子受体。I型细胞因子受体在与细胞膜相邻的细胞外部分共享共同的氨基酸基序(WSXWS)。
胞内域可以衍生自II型细胞因子受体。II型细胞因子受体包括结合I型和II型干扰素的那些，以及结合白细胞介素10家族成员(白细胞介素10、白细胞介素20和白细胞介素22)的那些。
I型细胞因子受体包括：
(i)白介素受体，如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL13、IL-15、IL-21、IL-23和IL-27的受体；
(ii)集落刺激因子受体，如促红细胞生成素、GM-CSF和G-CSF的受体；和
(iii)激素受体/神经肽受体，如激素受体和催乳素受体。
I型细胞因子受体家族的成员包含不同的链，其中一些参与配体/细胞因子相互作用，而其他参与信号转导。例如，IL-2受体包含α链、β链和γ链。
IL-2受体共同gamma链(也称为CD132)在IL-2受体、IL-4受体、IL-7受体、IL-9受体、IL-13受体和IL-15受体之间共享。
CAR/TCR表达细胞调控剂
NOI可以编码调控表达CAR或TCR的细胞的活性的试剂。
例如，试剂可以是细胞因子或趋化因子，粘附分子或转录因子。
细胞因子/趋化因子
试剂可以是细胞因子或趋化因子。例如选自：IL12、flexiIL12、GM-CSF、IL7、IL15、IL21、IL2和CCL19。特别地，试剂可以是IL-12。
白介素12(IL-12)是特别感兴趣的有效力的免疫调控细胞因子，用于调控肿瘤微环境，从而重定向针对癌症的免疫应答。IL-12具有系统性毒性，因此用于局部产生IL-12的方法引起了极大的兴趣。本发明的方法提供了一种机制，通过该机制可以在存在环境代谢产物如犬尿氨酸的情况下产生免疫调控细胞因子。在存在代谢物(如犬尿氨酸)的情况下选择性产生IL-12使得能够仅在肿瘤微环境中存在时，由表达CAR或TCR的细胞局部产生IL-12。
粘附分子
细胞粘附分子(CAM)是位于细胞表面上的蛋白质，其参与细胞粘附中与其他细胞或细胞外基质(ECM)结合。
这些蛋白质通常是跨膜受体，并且由三个结构域组成：与细胞骨架相互作用的细胞内结构域、跨膜结构域和与相同类型的其他CAM(同嗜性(homophilic)结合)或与细胞外基质的其他CAM(异嗜性(heterophilic)结合)相互作用的细胞外结构域。
大多数CAM属于四个蛋白质家族：Ig(免疫球蛋白)超家族(IgSF CAM)、整联蛋白、钙黏着蛋白和选择素。
本发明的试剂可以是或包含调控表达CAR或TCR的细胞活性的粘附分子。
转录因子
本发明的试剂可以是或包含调控表达CAR或TCR的细胞的活性的转录因子。
转录因子是蛋白质，其通过与特定的DNA序列结合并调节包含该序列或与该序列相邻的基因的表达来控制从DNA到信使RNA的遗传信息的转录速率。
转录因子通过促进(作为激活物)或阻断(作为阻遏物)RNA聚合酶的募集而发挥作用。
转录因子含有至少一个DNA结合结构域(DBD)，其附着于DNA的增强子或启动子区域。取决于转录因子，相邻基因的转录得以上调或下调。转录因子还含有转录激活结构域(TAD)，其具有其他蛋白质(如转录共调节物)的结合位点。
转录因子使用多种机制调节基因表达，包括稳定或阻断RNA聚合酶与DNA的结合，或催化组蛋白的乙酰化或去乙酰化。转录因子可以具有组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性，其乙酰化组蛋白，从而减弱DNA与组蛋白的缔合并使DNA更易于转录，从而上调转录。或者，转录因子可以具有组蛋白去乙酰酶(HDAC)活性，其使组蛋白去乙酰化，从而加强DNA与组蛋白的缔合，并使DNA难以转录，从而下调转录。它们可以起作用的另一种机制是通过将共激活物或共阻遏物募集到转录因子DNA复合物。
转录可以是组成性活性或条件性活性，即需要激活。
转录因子可以是天然存在的或人工的。
转录因子可以增加初始、中央记忆和/或干细胞记忆T细胞在CAR-T细胞组合中的比例。
转录因子可以例如是中央记忆阻遏转录因子(如BCL6或BACH2)。中央记忆阻遏物抑制T细胞向效应记忆细胞的分化，使得它们保持为分化程度较低的T细胞亚型之一，如初始和干细胞记忆T细胞。
或者，该转录因子可以是效应记忆阻遏转录因子(如BLIMP-1)。
靶细胞调控剂
NOI可以编码调控靶细胞，例如肿瘤细胞的活性的试剂。
例如，试剂可以是毒素。
试剂可以是对肿瘤细胞有毒的毒素。例如，试剂可以是白喉毒素、假单胞菌毒素或志贺氏菌毒素。
靶细胞微环境调控剂
NOI可以编码调控靶细胞例如肿瘤细胞的环境的试剂。
例如，试剂可以是细胞因子如IL-7或IL-12或趋化因子如CCL19。或者，试剂可以影响细胞因子或趋化因子的表达或活性。例如，试剂可以是细胞因子或趋化因子的显性阴性形式。显性阴性形式可以例如是细胞因子/趋化因子的突变或截短形式，其与受体结合并与野生型细胞因子/趋化因子竞争但不触发细胞因子/趋化因子信号传导。
例如，试剂可以是细胞因子受体或趋化因子受体的显性阴性形式。显性阴性形式可以例如是细胞因子/趋化因子受体的突变或截短形式，其与细胞因子结合，阻断其与野生型细胞因子/趋化因子受体的结合。
或者，试剂可以是阻断或以其他方式调控细胞因子或趋化因子信号传导途径的抗体或抗体片段。
使用选择性表达以优化细胞功能
可以设计本发明的核酸序列或构建体以优化细胞功能，例如通过将细胞保持在初始/未分化状态，减少终末分化或减少耗竭。可以经调整一种或多种基因的表达以适于特定的T细胞类型，如CD4+、CD8+或调节性T细胞。
例如，细胞可以包含组成性表达CAR或CAR组分，但选择性表达抑制性分子，如截短的ZAP70、抑制剂或抑制性CAR的一种核酸序列。如果仅在T细胞耗竭时才表达抑制性分子，这将抑制T细胞活性并阻止进一步的耗竭。
本发明还可以用于调整CAR的共刺激结构域以适于特定的分化状态。例如，包含CD28共刺激结构域的CAR或CAR组分可以组成性表达，而包含OX40或41BB共刺激结构域的CAR或CAR组分仅在细胞分化为效应记忆时表达。这样，群体动态偏向于倾向中央记忆/初始T细胞，但在分化时倾向于快速扩增。
核酸序列
本发明提供了包含如上所述的NOI的核酸序列。
NOI可以在启动子的控制下，所述启动子根据细胞的分化/耗竭状态选择性活化。
核酸可以包含特异性miRNA靶序列，其在细胞的某些分化/耗竭状态下引起转录物降解。miRNA靶序列可以例如在5’非翻译区中bw。
核酸序列可以包含如上定义的选择性活性启动子和一种或多种miRNA靶序列两者。
NOI可以在启动子的控制下，所述启动子根据表达它的细胞的微环境中环境代谢物的存在选择性活化。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响本文所述多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用。
根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3’和/或5’末端处添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本文所述用途的目的，应理解，可以通过本领域可用的任何方法修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
关于核苷酸序列的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括从该序列或向该序列的一个(或多个)核酸的任何取代、变化、修饰、替换、缺失或添加。
核酸序列的试剂盒
本发明还提供了试剂盒，其包含两种或更多种核酸序列，其中至少一种如上所定义。
试剂盒可以包含在组成型活性启动子控制下的一种核酸序列和在选择性活性启动子控制下的一种核酸序列。
试剂盒可以包含在不同的选择性活性启动子的控制下的两种核酸序列。
试剂盒可以包含两种核酸序列，一种包含特异性miRNA靶序列，而一种不包含。
试剂盒可以包含两种核酸序列，其包含不同的miRNA靶序列。
一种或两种核酸序列可以包含选择性活性启动子和miRNA靶序列的组合。
核酸构建体
本发明还提供了表达盒或核酸构建体，其包含两种或更多种核酸序列，其中至少一种如上所定义。
核酸构建体可以包含在组成型活性启动子控制下的一种核酸序列和在选择性活性启动子控制下的一种核酸序列。
核酸构建体可以包含在不同的选择性活性启动子的控制下的两种核酸序列。
核酸构建体可以包含两种核酸序列，一种包含特异性miRNA靶序列，而一种不包含。
核酸构建体可以包含两种核酸序列，其包含不同的miRNA靶序列。
一种或两种核酸序列可以包含选择性活性启动子和miRNA靶序列的组合。
表达盒可以经工程化改造以整合分裂转录系统。例如，载体可以表达两个分开的转录物。在图5(b)所示的排列中，5’选择性活性启动子驱动长转录物的转录，其中第一开放阅读框编码选择性表达的第一蛋白质。在此下游，与第一开放阅读框相同方向的第二组成型活性启动子驱动较短的转录物的转录，其中第二开放阅读框编码组成性表达的第二蛋白质。两个转录物共享相同的polyA腺苷酸化信号。
或者，两个分开的启动子可以驱动两个独立转录物的表达。转录物可以如图5(c)中所示头对头定向，其中一个转录物从有义链中读取，而另一个转录物从反义链中读取。或者，可以使用组成型活性双向启动子，如图5(d)中所示，其导致两个转录物沿相反方向转录。每个转录物均由单独的miRNA靶序列控制。
可以用具有由启动子或miRNA靶序列或两者控制的独立表达的表达盒的组合工程化改造T细胞。
更方便的是，可以用单个表达盒改造T细胞，其允许不同转基因的差异表达。例如，逆转录病毒载体表达盒可以转录两个转录物，一个转录物组成性表达而一个转录物条件性表达。
特定的启动子或miRNA靶标结构域有时可能无法提供足够干净的选择性表达。本领域技术人员可以增加表达盒的复杂性以增加表达的选择性。例如，可以将特定的启动子和特定的miRNA靶标结构域组合。或者，可以采用不同转录单位之间的前馈和反馈回路来加强表达的选择性。
简单的转录开关提供良好的阻遏或激活。然而，它们经常表现出渗漏，从而阻止了感兴趣的基因得以完全关闭或打开。在一些情况下，此渗漏对于所需的概况是可接受的，但是对于某些应用，需要更紧密的开关。可以对转录开关进行工程化改造以将诱导的表达(选择性启动子)与shRNA偶联，所述shRNA针对作用于可诱导转录物的组成型活性阻遏物发挥作用。可以对此类系统进行工程化改造，使得诱导的表达清晰地打开/关闭，并且可以被调节以在精确水平的转录活性上转换(Deans et al(2007)Cell 130:363-372)。
载体/载体的试剂盒
本发明还提供了包含本发明的一个或多个核酸序列或核酸构建体的载体或载体的试剂盒。此类载体可以用于将核酸序列或构建体引入到宿主细胞中，使得它表达NOI。
载体可以例如是质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mRNA。
载体可以能够转染或转导细胞。
细胞
本发明的细胞可以是免疫效应细胞，如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
T或NK细胞可以衍生自患者自己的外周血(第一方)，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的环境中，或来自不相关供体的外周血(第三方)。根据本发明的第一方面，在用编码提供CAR系统的分子的核酸转导之前，T或NK细胞可以活化和/或扩增，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理。
或者，T或NK细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞向T细胞的离体分化。或者，可以使用保留其裂解功能的永生化T细胞系。
细胞可以是造血干细胞(HSC)。可以在通过施用药理剂量的细胞因子如G-CSF进行活动化(mobilization)后通过外周血的白细胞单采术(leukopheresis)从合适匹配的供体的骨髓中[外周血干细胞(PBSC)]，或者从分娩后从胎盘收集的脐带血(UCB)获得用于移植的HSC。骨髓、PBSC或UCB可以不经处理而移植，或者可以通过用针对CD34表面抗原的单克隆抗体进行免疫选择来富集HSC。
用于制备细胞的方法
可以通过许多方式之一引入编码CAR或TCR的DNA或RNA生成表达CAR或TCR的细胞，所述方式包括用病毒载体转导，用DNA或RNA转染。
本发明的细胞可以通过以下制备：
(i)从受试者或以上列出的其他来源之一中分离含有细胞的样品；和
(ii)在体外或离体用一种或多种如上定义的核酸序列或核酸构建体转导或转染细胞。
然后可以纯化细胞，例如基于抗原结合多肽的抗原结合结构域的表达来选择。
药物组合物
本发明还涉及含有多个本发明的细胞的药物组合物。药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类剂型可以是例如适合用于静脉内输注的形式。
治疗方法
本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括将本发明的细胞(例如在上文所述的药物组合物中)施用于受试者的步骤。
治疗疾病的方法涉及本发明细胞的治疗性用途。在这方面，可以对患有现有疾病或病况的受试者施用细胞以减轻、降低或改善至少一种与疾病相关的症状和/或减缓、降低或阻断疾病的进展。
预防疾病的方法涉及本发明的细胞的预防性用途。在这方面，可以对尚未感染疾病和/或未显示任何疾病症状的受试者施用此类细胞，以预防或削弱疾病的起因，或减少或预防至少一种与此类病有关的症状的形成。受试者可以具有疾病的素因，或认为有形成疾病的风险。
方法可以包括以下步骤：
(i)分离含有细胞的样品；
(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染此类细胞；
(iii)对受试者施用来自(ii)的细胞。
本发明提供了本发明的细胞，其用于治疗和/或预防疾病。
本发明还涉及本发明的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是感染，如病毒感染。
本发明的方法还可以用于控制致病性免疫应答，例如在自身免疫性疾病，过敏和移植物抗宿主排斥中。
方法可以用于治疗癌性疾病，如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。
本发明的CAR细胞可以能够杀伤靶细胞，如癌细胞。靶细胞可以通过TAA的表达来识别，例如以上表1中提供的TAA的表达。
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-研究不同T细胞亚群中各种启动子的控制下的报告物基因表达
构建自灭活的逆转录病毒载体，其中将AP1/SRE/STAT3/STAT5应答性启动子克隆到报告物基因eGFP的编码序列的上游。该第一开放阅读框之后是PGK启动子和编码RQR8细胞表面标志物的第二编码序列。用逆转录病毒载体转导来自正常供体的原代人T细胞，并用3ug/mL PHA和50IL-2U/mL刺激72小时或不进行刺激。通过流式细胞术分析了细胞的记忆表型，并且结果如图9中所示。在PHA和IL-2刺激后，不同转导的T细胞之间不同的记忆区室(初始、中央记忆、效应记忆和效应)没有差异。
还分析了不同记忆亚群的eGFP表达水平，并且结果如图10中所示。发现不同的应答元件根据记忆亚群诱导不同的eGFP上调模式：AP1和STAT3应答性启动子主要诱导效应记忆区室中的eGFP表达，而SRE和STAT5应答性启动子在初始和效应记忆亚群两者中均显示eGFP上调。
实施例2-研究不同T细胞亚群中CREB应答性启动子的控制下的报告物基因表达
构建自灭活的逆转录病毒载体，其中将CREB应答性启动子克隆到报告物基因eGFP的编码序列的上游。该第一开放阅读框之后是PGK启动子和编码RQR8细胞表面标志物的第二编码序列。用逆转录病毒载体转导来自正常供体的原代人T细胞，并用PHA刺激24小时或不进行刺激。通过流式细胞术分析了细胞的记忆表型和eGFP表达，并且结果如图11和12中所示。CREB应答性启动子诱导效应记忆和效应细胞亚群中的eGFP上调。
实施例3-在CD4+ T细胞中具有差异共刺激的抗CD19 CAR-T细胞的设计和构建
构建自灭活的逆转录病毒载体，由此将对CD4+ T细胞具有特异性的初始启动子克隆到第一CAR的编码序列的上游。使用来自fmc63的抗CD19 scFv、CD8间隔区和CD28-CD3Z胞内域构建了该第一CAR。将PGK启动子克隆到该第一编码序列的下游。将编码第二CAR的第二编码序列克隆到PGK启动子的下游。使用来自hd37的抗CD19 scFv、CD8间隔区和41BB-CD3Z胞内域构建该第二CAR。该逆转录病毒表达盒应当导致hd37/41BB-CD3Z CAR在所有细胞中表达，但此外，fmc63/CD28-CD3Z CAR应当在CD4+ T细胞中选择性表达。用逆转录病毒载体转导T细胞。用该逆转录病毒载体转导来自正常供体的原代人T细胞。通过流式细胞术确定两种CAR的差异表达。使用两种不同的针对CD19的scFv允许通过流式细胞术使用两种不同的抗独特型抗体验证独立表达。在体外共培养物中以及在NALM6异种移植到NSG小鼠中的模型中对这些T细胞的表现与用表达41BB-CD3Z或CD28-Z CAR的简单载体转导的T细胞进行了比较。
实施例4-在初始和中央记忆T细胞中具有差异共刺激的抗CD19 CAR-T细胞的设计 和构建
构建自灭活的逆转录病毒载体，由此将CD127特异性启动子克隆到第一CAR的编码序列的上游。使用来自fmc63的抗CD19 scFv、CD8间隔区和CD28-CD3Z胞内域构建了该第一CAR。将PGK启动子克隆到该第一编码序列的下游。将编码第二CAR的第二编码序列克隆到PGK启动子的下游。使用来自hd37的抗CD19 scFv、CD8间隔区和41BB-CD3Z胞内域构建该第二CAR。该逆转录病毒表达盒应当导致hd37/41BB-CD3Z CAR在所有细胞中表达，但此外，fmc63/CD28-CD3Z CAR应当在初始和中央记忆T细胞中选择性表达。用逆转录病毒载体转导T细胞。用该逆转录病毒载体转导来自正常供体的原代人T细胞。通过流式细胞术确定两种CAR的差异表达。使用两种不同的针对CD19的scFv允许通过流式细胞术使用两种不同的抗独特型抗体验证独立表达。在体外共培养物中以及在NALM6异种移植到NSG小鼠中的模型中对这些T细胞的表现与用表达41BB-CD3Z或CD28-Z CAR的简单载体转导的T细胞进行了比较。
实施例5-根据T细胞分化状态具有IL-2差异表达的抗CD19 CAR-T细胞的设计和构 建
构建自灭活的逆转录病毒载体，由此将EOMES应答性启动子克隆到组成型活性IL2构建体的编码序列的上游。该第一开放阅读框之后是PGK启动子。将编码CAR的第二编码序列克隆到PGK启动子的下游。使用来自hd37的抗CD19 scFv、CD8间隔区和41BB-CD3Z胞内域构建该CAR。该逆转录病毒盒应当导致IL2构建体在分化的T细胞中表达，但不在初始或中央记忆T细胞中。CAR应当在所述T细胞中表达。用该逆转录病毒载体转导来自正常供体的原代人T细胞。通过流式细胞术确定两种构建体的差异表达。在体外共培养物中以及在NALM6异种移植到NSG小鼠中的模型中对这些T细胞的表现与用表达单独的CAR或与不受控的IL2构建体共表达的CAR的简单载体转导的T细胞进行了比较。
实施例6-对犬尿氨酸的存在敏感的CAR-T细胞的设计和构建
犬尿氨酸是通过IDO酶的作用从氨基酸色氨酸合成的免疫抑制代谢物。在实体瘤的微环境中肿瘤细胞表达的IDO通常导致高水平的犬尿氨酸，其进而生成高度免疫抑制的环境，这可以抑制肿瘤反应性CAR T细胞的功能并防止肿瘤排斥。设计了以下机制，通过该机制CAR T细胞可以通过表达所期望的转基因来响应犬尿氨酸的存在，从而允许这些T细胞克服犬尿氨酸介导的免疫抑制。
生成逆转录病毒构建体，其由在犬尿氨酸应答性启动子的控制下的所需的转基因组成，该转基因与在组成型活性启动子(例如PGK或EF1a启动子)的控制下的转导标志物如RQR8连接。研究了三种犬尿氨酸应答性转基因：荧光标志物蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)；针对特定配体的CAR，抗CD19 CAR；以及酶，犬尿氨酸酶，其防止犬尿氨酸抑制CAR T细胞功能。
在犬尿氨酸应答性启动子(SEQ ID No.16)的控制下的GFP的情况下，在0uM(无犬尿氨酸)、0.5uM、1um、2uM、5uM、10uM、20uM和50uM的浓度的犬尿氨酸中培养经转导的T细胞不同的时间，包括0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时和24小时。通过在每个时间点对这些细胞进行转导标志物(RQR8)共染色，并相比于未暴露于犬尿氨酸的对照细胞评价经犬尿氨酸处理的细胞中该标志物和GFP的共表达来测量犬尿氨酸诱导的GFP表达。GFP表达的强度反映了诱导的强度。
在犬尿氨酸诱导的抗CD19 CAR表达的情况下，在存在增加量的0uM(无犬尿氨酸)、0.5uM、1um、2uM、5uM、10uM、20uM和50uM的浓度的犬尿氨酸的情况下培养经转导的T细胞不同的时间，包括0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时和24小时。然后在功能测定法中通过评价CAR T细胞应答来测量犬尿氨酸诱导的T细胞表面上CAR的表达。将经转导的T细胞与CD19+Raji细胞(B细胞来源的肿瘤细胞系)以4:1、1:1和1:4的T细胞:靶标比例共培养24小时和72小时。然后将这些共培养物用T细胞标志物CD3，转导标志物RQR8以及对细胞活力用活力染料(如7-AAD)进行染色。通过缺少CD3和RQR8以及排除7-AAD来鉴定活靶细胞。列举每种共培养条件下的活靶细胞，并将其与具有未暴露于犬尿氨酸的T细胞且因此未发生CAR介导的杀伤共培养物进行比较。来自这些共培养物的上清液的还通过特异性ELISA来评价T细胞细胞因子IFN-gamma和IL2的水平。预期犬尿氨酸诱导的CAR表达增加共培养上清液中这些细胞因子的水平，因为表达的CAR将响应于表达CD19的靶标引起T细胞的活化。
在犬尿氨酸酶的情况下，生成逆转录病毒构建体，其由在犬尿氨酸应答性启动子(SEQ ID No.16)的控制下的犬尿氨酸酶组成，该犬尿氨酸酶与在组成型活性启动子(例如PGK或EF1a启动子)的控制下的抗CD19 CAR连接。将共表达犬尿氨酸诱导的犬尿氨酸酶和CAR的经转导的T细胞与表达CD19的Raji细胞在存在0uM(无犬尿氨酸)、0.5uM、1um、2uM、5uM、10uM、20uM和50uM的浓度的犬尿氨酸的情况下以4:1、1:1和1:4的T细胞:靶标比例共培养24小时和72小时。如上所述，在这些时间点评价CAR介导的Raji细胞杀伤，以及IFN-gamma和IL2的分泌。预期犬尿氨酸抑制CAR功能，并且在诱导和表达犬尿氨酸酶后可以防止该抑制。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体的优选实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的是，所描述的用于实施本发明的方式的各种修改都在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 奥托路斯有限公司
<120> 表达嵌合抗原受体或工程化TCR并包含选择性表达的核苷酸序列的细胞
<130> P112493PCT
<150> GB 1712407.4
<151> 2017-08-02
<150> GB 1806372.7
<151> 2018-04-19
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1096
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD4启动子
<400> 1
aagacaggtt ctcactctgt cactcaggct agagtgcagt ggtgcaatca cggttcactg 60
cagcctcaac ttcctgggct caagcgatcc ccccacctcg gcctcctaaa atgctgggat 120
tataggcatg agccaccact cccagcccca cttttttcag actggaaaac gcacactcac 180
atgtgcatct ttaaatgatc acttgggctg tggtatggag aatggcgacc agtgaggagg 240
caggagctgt tgtccgagca agggatgata ttggcatctt ggattggcat ggtggcagta 300
gtggtagtgc agagtgactt gggtagattt tggagccatt tagaaggtaa catccacagg 360
aactggtaaa taaatacgtg ggagaagttg ggtgaagggg gtgtcaaaga ttacacccaa 420
tttattttgc ttgggcaagt tggtggatgg tgagcccctc actgagtgag aagcctggag 480
aagcaggttt ggagggtggt agtatgcagg tggtatgcat agttggggat gtgtgttgag 540
tttgctatgt ccggtgagct tcccagtgga gatgtccaat gggcagacgg atactcacat 600
agagagttca tggtagattc gggctagagg aaagcacctg aggcctggcc agagacgcct 660
agaggaacag agcctggtta acagtcactc ctggtgtctc agatattctc tgctcagccc 720
acgccctctc ttccacactg ggccacctat aaagcctcca cagatacccc tggggcaccc 780
actggacaca tgccctcagg gccccagagc aaggagctgt ttgtgggctt accactgctg 840
ttcccatatg cccccaactg cctcccactt ctttccccac agcctggtca gacatggcgc 900
taccactaat ggaatctttc ttgccatctt tttcttgccg cttaacagtg gcagtgacag 960
tttgactcct gatttaagcc tgattctgct taactttttc ccttgacttt ggcattttca 1020
ctttgacatg ttccctgaga gcctgggggg tggggaaccc agctccagct ggtgacgttt 1080
ggggccggcc caggcc 1096
<210> 2
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8启动子
<400> 2
cacaggaggc tcagcactaa tcggtagata ctgcgagatg ctgggaggtt aaggggccta 60
cccgcaatat ctctggccaa tgccttgggc tagaaatgcc ataattagcc gctcttttga 120
tcccttgcaa aatgcgaatc ccaccgcacc tccaccccac ccgagtggta atctcctagt 180
ggtaatctaa gtgagcctgt gataagataa gtagctcctg gtggtgaggg tgagaaattg 240
gggagctgga gccccagcca gggacgaggc tgtaggggct agggcgaaga tggaggctgc 300
tgggccccca gatggaagac ggtaacgtgc gcccgcttcg tttttgctcg aggtcagtca 360
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ggcgagatag ggagtgtccc tgctgctagt gcccctgctg ctagtgccta gttacctgca 540
<210> 3
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3启动子
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tcccatccac acatagagct tcagattctc tttctttccc cagagaccct caaatatcct 60
ctcactcaca gaatggtgtc tctgcctgcc tcgggttggc cctgtgattt attttagttc 120
ttttcccttg tttttttttt ttcaaactct atacactttt gttttaaaaa ctgtggtttc 180
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gtctcataat caagaaaagg agaaacacag agagagagaa aaaaaaaact atgagaaccc 360
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<210> 4
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD44启动子
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gaagttgtat gggaagatga atagaagaat aggtggttga ataaattaaa aggtgtgtgg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> CD27启动子区
<400> 5
ttttgtggtg ctggtttctg tataaacctg aaaaattctg aattccaaaa cttatctgac 60
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gtctgtaaac tgtggacggg ggggtgggtg ggggggggta acgtgggcac ctttgtgcac 240
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28启动子区
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caaattgctg gcattacagg cgtgagccac tgcacccggc ctgttccttc ttaagaacac 180
tttgtctccc ctttaatctc tgctggattt caagcacccc ttttacacaa ctcttgatat 240
ccatcaataa agaataattc ccataagccc atcatgtagt gaccgactat ttttcagtga 300
caaaaaaaaa gtctttaaaa atagaagtaa aagtctaaag tcatcaaaac aacgttatat 360
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD127启动子区
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gcaacaaagc aagactctgt ctcaaaaaaa taaaaattaa aaaaataaag tagcctctag 240
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tgtccttgac ctctgcttac agcagcaata cttttactca gacttcctgt ttctggaact 420
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<210> 8
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD122启动子
<400> 8
tgctaaacgg agtaaggggc ttcctggaag gctgggtgaa atgggagtct cggaaagatg 60
gtgtgttgca ggctgggagg agggtgagac gctggggtca cctagaggga cctgcttgtg 120
tgaagcctac gtattagtgg gtatgtgtgt gaccggatgg aggcgtcaga ggtgttgggt 180
agcctgtgtg agttggcgtg ggggtgatgt aggaggggag agagggaggg cctgcgttcc 240
cttggctcct gtgtgcagct aggcccctat ttgacaatgt gtgtctgtgt gtgtgtgtgt 300
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc cgcccccagc gtaggaggca gatctttatc 360
tggccctggg tgcttgagga gtttcaggct ttctcataag cctcgtctcc ccgcctctcc 420
accccaggcc ttgcccctct atcctctgca caggaagtgg gctggctctg ggcttttagt 480
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<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZAP70完整SH2结构域
<400> 9
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1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
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Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
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Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro
275 280
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZAP70 SH2 1
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Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg
20 25 30
Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His
35 40 45
His Phe Pro Ile Glu Arg Gln Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly
50 55 60
Gly Lys Ala His Cys Gly Pro Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg
65 70 75 80
Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys Asn Leu Arg Lys Pro Cys
85 90
<210> 11
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZAP70 SH2 2
<400> 11
Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys Leu Tyr
1 5 10 15
Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg Lys Glu
20 25 30
Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val Tyr His
35 40 45
Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro Glu Gly
50 55 60
Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys Leu Lys
65 70 75 80
Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys
85 90
<210> 12
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外源性物质识别元件(XRE)核心序列
<400> 12
gcgtg 5
<210> 13
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XRE共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
kngcgtgmsa 10
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-17
<400> 14
cctattccag cactttcaag tagctgtgat 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-146
<400> 15
agttcaacaa aagttctcac atggagtccc 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-214
<400> 16
aacttaccaa ggacaggcag gaccccgtcc 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-21
<400> 17
tttattactt tattggtgtt aaggataaca 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-181
<400> 18
tgctatgtag atttctgaat gtgttgtatt 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-9
<400> 19
ccctaccccc caacccctag cccaaccaat 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-29
<400> 20
cctttcacat tggtgctttt ccatttatgc 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-126
<400> 21
aaagaggttt ttaataatga ggtccttctg 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-326
<400> 22
gtctgctatt cccagagagg tctcagaggg 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> microRNA靶序列, miR-155
<400> 23
ctgcacttat tgtaggaaat tttaatatat 30
<210> 24
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XRE核心序列
<400> 24
cacgc 5
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XRE启动子
<400> 25
ctggtaagca cgccaatgaa 20
<210> 26
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XRE启动子
<400> 26
tgagttctca cgctagcaga ttgagttctc acgctagcag attgagttct cacgctagca 60
gat 63
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AP-1应答性启动子
<400> 27
tgagtcagtg actcagtgag tcagtgactc agtgagtcag tgactcag 48
<210> 28
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CREB应答性启动子
<400> 28
gcaccagaca gtgacgtcag ctgccagatc ccatggccgt catactgtga cgtctttcag 60
acaccccatt gacgtcaatg ggagaac 87
<210> 29
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SRE应答性启动子
<400> 29
aggatgtcca tattaggaca tctaggatgt ccatattagg acatctagga tgtccatatt 60
aggacatcta ggatgtccat attaggacat ctaggatgtc catattagga catct 115
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCF-LEF应答性启动子
<400> 30
agatcaaagg gtttaagatc aaagggctta agatcaaagg gtataagatc aaagggccta 60
agatcaaagg gactaagatc aaagggttta agatcaaagg gcttaagatc aaagggccta 120
<210> 31
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAT3应答性启动子
<400> 31
agcttcattt cccgtaaatc gtcgaagctt catttcccgt aaatcgtcga agcttcattt 60
cccgtaaatc gtcgaagctt catttcccgt aaatcgtcga agcttcattt cccgtaaatc 120
gtcga 125
<210> 32
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAT5应答性启动子
<400> 32
agttctgaga aaagtagttc tgagaaaagt agttctgaga aaagtagttc tgagaaaagt 60
agttctgaga aaagt 75

Claims (55)

1.表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)的细胞，所述细胞包含感兴趣的核苷酸序列(NOI)，所述感兴趣的核苷酸序列根据以下由所述细胞选择性地表达：
i)所述细胞的分化/耗竭状态；或
ii)所述细胞的微环境中环境代谢物的存在。
2.根据权利要求1的细胞，其中所述NOI在CD4+T细胞中选择性表达。
3.根据权利要求1的细胞，其中所述NOI在CD8+T细胞中选择性表达。
4.根据权利要求1的细胞，其中所述NOI在调节性T细胞中选择性表达。
5.根据权利要求1的细胞，其中所述NOI在初始T细胞中选择性表达。
6.根据权利要求1的细胞，其中所述NOI在中央记忆T细胞中选择性表达。
7.根据权利要求1的细胞，其中所述NOI在效应记忆T细胞中选择性表达。
8.根据权利要求1的细胞，其中所述NOI在效应T细胞中选择性表达。
9.根据权利要求1的细胞，其中所述NOI在耗竭的T细胞中选择性表达。
10.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中所述NOI在选择性活性启动子的控制下。
11.根据权利要求1至9中任一项的细胞，其包含miRNA靶序列，使得所述细胞中NOI的表达由miRNA控制。
12.根据权利要求10或11的细胞，其中所述NOI的表达在选择性活性启动子和miRNA靶序列的控制下。
13.根据权利要求10的细胞，其中根据所述细胞的微环境中环境代谢物的存在选择性地表达所述NOI，其中所述环境代谢物激活芳烃受体(AHR)。
14.根据权利要求13的细胞，其中所述环境代谢物是色氨酸代谢物。
15.根据权利要求14的细胞，其中所述环境代谢物是犬尿氨酸。
16.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中所述NOI编码嵌合抗原受体(CAR)。
17.根据权利要求1至15中任一项的细胞，其中所述NOI编码CAR组分。
18.根据权利要求17的细胞，其中所述CAR组分选自：受体组分；和细胞内信号传导组分。
19.根据权利要求1至15中任一项的细胞，其中所述NOI编码工程化T细胞受体(TCR)。
20.根据权利要求1至15中任一项的细胞，其中所述NOI编码调控CAR或TCR活性的试剂。
21.根据权利要求20的细胞，其中所述调控CAR或TCR活性的试剂选自：信号转导修饰蛋白，抑制剂(dampener)；抑制性CAR和细胞因子信号传导结构域。
22.根据权利要求1至15中任一项的细胞，其中所述NOI编码调控所述细胞活性的试剂。
23.根据权利要求22的细胞，其中所述调控所述细胞活性的试剂选自：细胞因子，粘附分子和转录因子。
24.根据权利要求1至15中任一项的细胞，其表达与靶细胞上的靶抗原结合的CAR或TCR，其中所述NOI编码调控所述靶细胞活性的试剂。
25.根据权利要求24的细胞，其中所述试剂包含毒素。
26.根据权利要求1至15中任一项的细胞，其表达与靶细胞上的靶抗原结合的CAR或TCR，其中所述NOI编码调控所述靶细胞微环境的试剂。
27.根据权利要求26的细胞，其中所述试剂是趋化因子或细胞因子，或影响细胞因子或趋化因子介导的信号传导的试剂。
28.核酸序列，其包含在启动子的控制下的感兴趣的核苷酸序列(NOI)，所述启动子根据表达它的细胞的分化/耗竭状态而选择性地具有活性。
29.核酸序列，其包含在启动子的控制下的感兴趣的核苷酸序列(NOI)，所述启动子根据表达它的细胞的微环境中环境代谢物的存在而选择性地具有活性。
30.核酸序列，其包含感兴趣的核苷酸序列(NOI)和特异性miRNA靶序列，所述特异性miRNA靶序列在表达所述核酸序列的细胞的某个分化/耗竭状态下引起转录物降解。
31.根据权利要求30的核酸序列，其中所述NOI的表达在启动子的控制下，所述启动子根据表达它的细胞的分化/耗竭状态而选择性地具有活性，并且所述核酸序列包含特异性miRNA靶序列，所述特异性miRNA靶序列在表达所述核酸序列的细胞的某个分化/耗竭状态下引起转录物降解。
32.核酸序列的试剂盒，其包含根据权利要求28至31中任一项的核酸序列。
33.根据权利要求32的核酸序列的试剂盒，其包含：
(i)在组成型活性启动子的控制下的第一核酸序列；和
(ii)在启动子的控制下的第二核酸序列，所述启动子根据以下之一选择性地具有活性：表达它的细胞的分化/耗竭状态；或表达它的细胞的微环境中环境代谢物的存在。
34.根据权利要求32的核酸序列的试剂盒，其包含在第一选择性活性启动子的控制下的第一核酸序列；和在第二选择性活性启动子的控制下的第二核酸序列，其中所述第一和第二启动子在表达所述核酸序列的试剂盒的细胞的不同分化/耗竭状态下具有活性。
35.根据权利要求32的核酸序列的试剂盒，其包含：
(i)第一核酸序列，其包含特异性miRNA靶序列，所述特异性miRNA靶序列在表达所述核酸序列的细胞的某个分化/耗竭状态下引起转录物降解；和
(ii)第二核酸序列，其缺少特异性miRNA靶序列。
36.根据权利要求32的核酸序列的试剂盒，其包含具有第一miRNA靶序列的第一核酸序列；和具有第二miRNA靶序列的第二核酸序列，其中所述第一和第二miRNA靶序列在表达所述核酸序列的试剂盒的细胞的不同分化/耗竭状态下引起转录物降解。
37.核酸构建体，其包含根据权利要求28至31中任一项的核酸序列。
38.根据权利要求37的核酸构建体，其包含：
(i)在组成型活性启动子的控制下的第一核酸序列；和
(ii)在启动子的控制下的第二核酸序列，所述启动子根据以下之一选择性地具有活性：表达它的细胞的分化/耗竭状态；或表达它的细胞的微环境中环境代谢物的存在。
39.根据权利要求37的核酸构建体，其包含在第一选择性活性启动子的控制下的第一核酸序列；和在第二选择性活性启动子的控制下的第二核酸序列，其中所述第一和第二启动子在表达所述核酸构建体的细胞的不同分化/耗竭状态下具有活性。
40.根据权利要求37的核酸构建体，其包含：
(i)第一核酸序列，其包含特异性miRNA靶序列，所述特异性miRNA靶序列在表达所述核酸构建体的细胞的某个分化/耗竭状态下引起转录物降解；和
(ii)第二核酸序列，其缺少特异性miRNA靶序列。
41.根据权利要求37的核酸构建体，其包含具有第一miRNA靶序列的第一核酸序列；和具有第二miRNA靶序列的第二核酸序列，其中所述第一和第二miRNA靶序列在表达所述核酸构建体的细胞的不同分化/耗竭状态下引起转录物降解。
42.根据权利要求41的核酸构建体，其中所述第一和第二核酸序列在组成型活性双向启动子的控制下。
43.根据权利要求38的核酸构建体，其中所述第一核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)、CAR组分或工程化T细胞受体(TCR)，并且所述第二核酸序列编码抑制性分子，使得当所述核酸构建体在T细胞中表达时，所述CAR、CAR组分或TCR组成性表达，而当所述T细胞耗竭时，所述抑制性分子选择性地表达，所述抑制性分子导致CAR或TCR活性降低。
44.根据权利要求43的核酸构建体，其中所述抑制性分子包含截短的ZAP70，其包含一个或多个ITAM结合结构域但缺少激酶结构域。
45.根据权利要求38的核酸构建体，其中所述第一核酸序列编码包含CD28共刺激结构域的CAR或CAR组分；并且所述第二核酸序列编码包含OX40或41BB共刺激结构域的CAR或CAR组分，使得当所述核酸构建体在T细胞中表达时，所述第一CAR或CAR组分组成性表达，而当所述细胞处于效应记忆或效应状态时，所述第二CAR或CAR组分选择性地表达。
46.根据权利要求38的核酸构建体，其中所述第一核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)、CAR组分或工程化T细胞受体(TCR)，并且所述第二核酸序列编码细胞因子，使得当所述核酸构建体在T细胞中表达时，所述CAR、CAR组分或TCR组成性表达，而在所述T细胞的微环境中存在环境代谢物的情况下，所述细胞因子选择性地表达。
47.载体，其包含根据权利要求28至31中任一项的核酸序列；根据权利要求32至36中任一项的核酸序列的试剂盒；或根据权利要求37至46中任一项的核酸构建体。
48.用于制备根据权利要求1至25中任一项的细胞的方法，其包括将以下项引入到细胞中的步骤：根据权利要求28至31中任一项的核酸序列；根据权利要求32至36中任一项的核酸序列的试剂盒；根据权利要求37至46中任一项的核酸构建体；或根据权利要求47的载体。
49.根据权利要求48的方法，其中所述细胞来自从受试者分离的样品。
50.药物组合物，其包含多个根据权利要求1至25中任一项的细胞。
51.根据权利要求50的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
52.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据权利要求50的药物组合物施用于受试者的步骤。
53.根据权利要求52的方法，其包括以下步骤：
(i)分离含有细胞的样品；
(ii)用以下项转导或转染所述细胞：根据权利要求28至31中任一项的核酸序列；根据权利要求32至36中任一项的核酸序列的试剂盒；根据权利要求37至46中任一项的核酸构建体；或根据权利要求47的载体；和
(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。
54.根据权利要求50的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
55.根据权利要求51使用的药物组合物，根据权利要求52或53的方法，根据权利要求54的用途，其中所述疾病是癌症。
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