JP2020530993A - キメラ抗原受容体または改変ｔｃｒを発現し、選択的に発現されるヌクレオチド配列を含む細胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞であって、ｉ）細胞の分化／消耗状態、またはｉｉ）細胞の微小環境における環境代謝物の存在に応じて細胞により選択的に発現される目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含む、細胞を提供する。一局面において、上記ＮＯＩが、ＣＤ４＋Ｔ細胞において選択的に発現される。別の局面において、上記ＮＯＩが、ＣＤ８＋Ｔ細胞において選択的に発現される。一局面において、上記ＮＯＩが、制御性Ｔ細胞において選択的に発現される。

Description

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞に関する。ＣＡＲまたはＴＣＲの発現および／または活性は、それが発現される細胞の分化および／もしくは消耗状態ならびに／または細胞の微小環境における１つまたは複数の環境代謝物の存在に関連し得る。

伝統的には、抗原特異的Ｔ細胞は、標的抗原に対して天然に特異的な末梢血Ｔ細胞の選択的増殖により生成されている。しかし、ほとんどのがん抗原に対して特異的な多数のＴ細胞を選択し増殖させることは、困難であり、不可能であることが非常に多い。末梢血Ｔ細胞のバルクの集団をｅｘ ｖｉｖｏでウイルスベクターにより形質導入することによって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現が生じると、任意の表面抗原に対して特異的な多数のＴ細胞の生成が可能となるため、ベクターの組込みによる遺伝子治療は、この課題への解決策をもたらすものとなる。

キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。この通常の形態は、Ｉ型膜貫通ドメインタンパク質の形態であり、抗原を認識するアミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインを有し、これらのすべてが化合物のエンドドメインに接続され、これにより、Ｔ細胞の生存および活性化シグナルを伝達する（図２Ａ参照）。

このような分子の最も一般的形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合物であり、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインと融合する。このような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化を生じる。Ｔ細胞が、このようなＣＡＲを発現すると、これらは、標的抗原を発現する標的細胞を認識して殺傷する。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、このようなＣＡＲを発現するＴ細胞を使用する養子移植アプローチは、現在、様々ながんの処置において臨床試験中である。

ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床研究では、ＣＡＲ Ｔ細胞生着、増殖および持続が、臨床活性、特には持続的応答のために必須であることが確立された。例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病のＣＤ１９ ＣＡＲ療法において、ＣＡＲ Ｔ細胞生着の失敗および結果としてのＢ細胞コンパートメントの復帰は、再発と関連している。いくつかの戦略により、ＣＡＲ Ｔ細胞が生着、増殖および持続する傾向を高めることができる。このような戦略は、ＣＡＲ Ｔ細胞のナイーブまたはセントラルメモリー表現型との比率を上昇させるＣＡＲ Ｔ細胞生成プロセスを使用する、調製的リンパ球枯渇化学療法の実施、および共刺激性シグナルを有するＣＡＲの使用を含む。このような戦略にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞は、生着できず、結果として無効な治療となることが多い。

最新のＣＡＲ Ｔ細胞療法は、現在、典型的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにナイーブ、幹細胞メモリー、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＴ細胞で構成されるＴ細胞の混合物からなる。

生理学的には、種々の状態のＴ細胞は、種々のシグナルに対して異なって応答する。しかし、最新のＣＡＲ療法では、ＣＡＲ型および発現は、発現されるＴ細胞の分化状態および消耗状態にかかわらず、一定のままである。したがって、Ｔ細胞が分化するにつれて、これらは、現在、最適以下のシグナルを受領していることとなる。

その表現型に応じてＴ細胞に最適なシグナルを送達する１つの方法は、生成の間にＴ細胞を選別し、種々のベクターにより形質導入することである。例えば、Ｔ細胞をＣＤ４およびＣＤ８集団に選別し、形質導入してＣＤ４またはＣＤ８細胞に最適化した種々の共刺激シグナルを有するＣＡＲを発現させることができる。このアプローチは、各生成物に必要とされる細胞およびベクターの生成プロセスが倍増するため、高価である。さらに、他のほとんどの適用については、例えば、分化／消耗状態、すなわち表現型は、高度に動的であり、例えば、生成において形質導入するセントラルメモリーＴ細胞は、このコンパートメントにとどまる場合もあれば、または時間をわたって分化する場合もある。

したがって、生着、増殖および持続を最適化した、ＣＡＲ発現細胞、および改変ＴＣＲを発現するＴ細胞の生成のための代替アプローチが必要とされている。

ＣＡＲ−Ｔ細胞、特に、固形がんの処置のためのＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの持続が不十分である別の理由は、細胞が、不適な腫瘍微小環境を克服するために苦闘することである。特には、ＣＡＲ Ｔ細胞は、固形がん腫瘍床において生着および増殖できないことがある。

この問題についての実験的証拠が存在し、例えば、ＰＳＣＡ ＣＡＲ改変Ｔ細胞で処置したマウスが、腫瘍増殖の遅延を示した（Ｈｉｌｌｅｒｄａｌ ｅｔ ａｌ （２０１４） ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １４：３０；およびＡｂａｔｅ−Ｄａｇａ ｅｔ ａｌ （２０１４） ２５：１００３−１０１２）。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは高い細胞傷害を示したが、ｉｎ ｖｉｖｏでは、腫瘍増殖は遅延したものの、腫瘍担持マウスは治癒しなかった。

ＣＡＲ Ｔ細胞の持続および活性は、サイトカインの投与により、またはＣＡＲ Ｔ細胞を改変してサイトカイン、毒素または他の因子を分泌または発現させることにより増強することができる。しかし、このようなアプローチには、制限が存在し、サイトカインの全身投与が毒性であることがあり、また、サイトカインが構成的に生成されると、増殖および形質転換が制御不能となることがある（Ｎａｇａｒｋａｔｔｉ ｅｔ ａｌ （１９９４） ＰＮＡＳ ９１：７６３８−７６４２；Ｈａｓｓｕｎｅｈ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：６１０−６２０）。他の因子、例えば、転写または生存因子の発現は、ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍内に存在する場合に発現されることが好ましい。
したがって、Ｔ細胞の生着および増殖を促進して、不適な腫瘍微小環境の作用に対抗する、代替ＣＡＲ Ｔ細胞アプローチが必要とされている。

Ｈｉｌｌｅｒｄａｌら、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ（２０１４）１４：３０ Ｎａｇａｒｋａｔｔｉら、ＰＮＡＳ（１９９４）９１：７６３８〜７６４２ Ｈａｓｓｕｎｅｈら、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）８９：６１０〜６２０

図１は、各細胞型と関連する発現マーカーを示すＴ細胞分化の線形モデルを説明する模式図である。ＡＰＣは抗原提示細胞、ＴＣＭはセントラルメモリーＴ細胞、ＴＥＦＦはエフェクターＴ細胞、ＴＥＭはエフェクターメモリーＴ細胞、ＴＮはナイーブＴ細胞、ＴＳＣＭはＴメモリー幹細胞である。 図２（ａ）は、古典的ＣＡＲを説明する模式図である。（ｂ）〜（ｄ）は、ＣＡＲエンドドメインの種々の世代および並び替えであり、（ｂ）初期のデザインは、ＩＴＡＭシグナル単独をＦｃεＲ１−γまたはＣＤ３ζエンドドメインを介して伝達し、一方で、後期のデザインは、追加の（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激性シグナルを同一の複合エンドドメインにおいて伝達した。 図３は、ＣＡＲまたはＣＡＲ成分を、ある特定の転写状態においてのみ発現されるカセットを説明する模式図である。ＡおよびＢは、導入遺伝子であり、Ｘは、導入遺伝子Ａの発現を制御する選択的に活性なプロモーター／エンハンサーであり、ＣＡは、導入遺伝子Ｂの発現を制御する構成的に活性なプロモーターであり、ｐＡは、ポリアデニル化配列である。Ｘは、例えば、Ｔ細胞の消耗に対して感受性である可能性があり、Ａは、カセットを含む細胞が消耗する場合にのみ発現されるが、Ｂは常に発現される。第１の特定の例は、Ｘが消耗を検出し、Ａが阻害性分子、例えば、切断型ＺＡＰ７０であり、ＢがＣＡＲである場合である。カセットがＴ細胞において発現されると、阻害性分子は、Ｔ細胞が消耗して、さらなる消耗を防ぎ、ＣＡＲ活性を減衰させる場合にのみ発現される。第２の特定の例は、Ｘがエフェクターメモリーへの分化を検出し、Ａが４１ＢＢ−Ｚエンドドメインを有するＣＡＲであり、ＢがＣＤ２８−Ｚエンドドメインを有するＣＡＲである場合である。カセットがＴ細胞において発現されると、ＣＤ２８−Ｚ ＣＡＲのみが発現し、一方で、細胞は、ナイーブ／セントラルメモリー状態にある。細胞がエフェクターメモリーに分化すると、４１ＢＢ−Ｚ ＣＡＲもまた発現して、急速な増殖を引き起こす。 図４は、単一の導入遺伝子が選択的に発現可能な種々の方法を説明する模式図である。（ａ）特定のＴ細胞状況においてのみ転写を駆動する内部プロモーター「Ｘ」を有する自己不活型レトロウイルスベクターを示す。この場合、ＣＡＲ−０１は、プロモーターＸが活性である場合にのみ発現される。レトロウイルスの末端反復配列Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を、パッケージングシグナルψおよびウッドチャックプロセシング前エレメントＷＰＲＥとともに示す。（ｂ）あるいは、遺伝子発現は、構成的に活性なプロモーター（ＣＡ）の制御下にあり得る。この場合、タンパク質発現の制御は、特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を転写物の５’非翻訳領域に組み込むことにより達成される。ｍｉＲＮＡが発現されるＴ細胞状況では、転写物は分解される。（ｃ）一部の適用では、両方の方法を適用する。 図５は、独立して発現される導入遺伝子を保有させるための戦略を説明する模式図である。（ａ）特異的プロモーター／ｍｉＲＮＡ標的配列のいずれかまたは両方により制御される２つの別々のカセットをＴ細胞に同時に導入する。（ｂ）発現カセットは、改変して分割転写系を組み込むことができる。１つの方法は、ベクターに２つの転写物を発現させることである。選択的に活性な５’のプロモーターが、長い転写物の転写を駆動すると、第１のオープンリーディングフレームは、選択的に発現すべき第１のタンパク質をコードする。これより下流では、第１のプロモーターと同一方向の第２の構成的に活性なプロモーターが、短い転写物の転写を駆動し、第２のオープンリーディングフレームは、構成的に発現すべき第２のタンパク質をコードする。両方の転写物は、同一のポリＡアデニル化シグナルを共有する。（ｃ）あるいは、２つの別々のプロモーターは、２つの独立した転写物の発現を駆動することができる。これは、センス鎖から読み取られる一方の転写物およびアンチセンス鎖から読み取られる他方の転写物とヘッドトゥーヘッドに転写物を方向付けることにより、最も好都合に達成される。（ｄ）さらなる代替として、構成的に活性な双方向性プロモーターにより、２つの転写物の逆方向での転写が生じる。各転写物は、別々のｍｉＲＮＡ標的配列により制御される。 図６は、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）経路を説明する模式図である。 図７は、キヌレニン経路を説明する模式図である。 図８は、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の構造を説明する模式図である。 図９は、Ａ）刺激なし、ならびにＢ）３μｇ／ｍＬのＰＨＡおよび５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で刺激して７２時間の、多種多様なプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現するＴ細胞のメモリー表現型である。 図１０は、Ａ）刺激なし、ならびにＢ）３μｇ／ｍＬのＰＨＡおよび５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で刺激して７２時間の、レポーター遺伝子が多種多様なプロモーターの制御下にある、形質導入したＴ細胞の種々のメモリーサブセットにおける、レポーター遺伝子ｅＧＦＰの示差的発現である。 図１１は、ＰＨＡによる刺激なしか刺激ありのいずれかで２４時間の、レポーター遺伝子がＣＲＥＢ応答性プロモーターの制御下にある、形質導入したＴ細胞の種々のメモリーサブセットにおける、ｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー解析である。 図１１は、ＰＨＡによる刺激なしか刺激ありのいずれかで２４時間の、レポーター遺伝子がＣＲＥＢ応答性プロモーターの制御下にある、形質導入したＴ細胞の種々のメモリーサブセットにおける、ｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー解析である。 図１２は、Ａ）ＰＨＡによる刺激なしか刺激ありのいずれかで２４時間の、ＣＲＥＢ応答性プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現するＴ細胞のメモリー表現型であり、Ｂ）ＰＨＡによる刺激なしか刺激ありのいずれかで２４時間の、レポーター遺伝子がＣＲＥＢ応答性プロモーターの制御下にある、形質導入したＴ細胞の種々のメモリーサブセットにおける、レポーター遺伝子ｅＧＦＰの示差的発現である。

本発明者らは、例えば、ＣＡＲ／ＴＣＲ、ＣＡＲ成分またはＣＡＲ／ＴＣＲ活性を調節する作用物質の発現を、細胞の転写状態に合わせて調整することにより、ＣＡＲ発現またはＴＣＲ発現細胞の機能を最適化することが可能であることを見出した。１つまたは複数の遺伝子の発現は、細胞の分化または消耗の状態と関連する可能性があり、このことは、ＣＡＲの構造またはＣＡＲの活性が、時間をわたって制御可能であることを意味する。

この技術は、様々に適用することができ、ＣＡＲ発現細胞をより「ナイーブ」な状態に偏向させて、それらの有効性および生存を患者において向上させることを含む。

例えば、ＣＡＲ／ＴＣＲ、ＣＡＲ成分またはＣＡＲ／ＴＣＲ活性を調節する作用物質の発現を、ＣＡＲ／ＴＣＲ発現細胞の微小環境における環境代謝物の存在に合わせて調整することにより、ＣＡＲ／ＴＣＲ発現および／またはＣＡＲ／ＴＣＲ細胞活性のタイミングおよび／または位置をｉｎ ｖｉｖｏで制御することも可能である。

したがって、第１の態様において、本発明では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞であって、
ｉ）細胞の分化／消耗状態、または
ｉｉ）細胞の微小環境における環境代謝物の存在
に応じて選択的に発現される目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含む、細胞を提供する。

本発明の第１の態様の第１の実施形態では、ＮＯＩは、細胞の分化および／または消耗状態に応じて選択的に発現される。

ＮＯＩは、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、または消耗したＴ細胞において選択的に発現され得る。

ＮＯＩの発現は、選択的に活性なプロモーターの制御下にあり得る。

細胞は、細胞におけるＮＯＩの発現がｍｉＲＮＡにより制御され得るように、ｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。

細胞におけるＮＯＩの発現は、選択的に活性なプロモーターおよびｍｉＲＮＡ標的配列の制御下にあり得る。

本発明の第１の態様の第２の実施形態では、ＮＯＩは、細胞の微小環境における環境代謝物の存在に応じて選択的に発現される。

環境代謝物は、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）を活性化し得る。

環境代謝物は、トリプトファン代謝物であり、例えば、キヌレニンである。

本発明の第１の態様の細胞の第１および第２の両方の実施形態では、ＮＯＩは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または改変Ｔ細胞受容体をコードし得る。

あるいは、ＮＯＩは、ＣＡＲ成分、例えば、受容体成分または細胞内シグナル伝達成分をコードし得る。

ＮＯＩは、ＣＡＲまたはＴＣＲの活性を調節する作用物質、例えば、シグナル伝達修飾タンパク質、減弱因子（ｄａｍｐｅｎｅｒ）；阻害性ＣＡＲ、サイトカインシグナル伝達ドメイン、接着分子または転写因子をコードし得る。

ＮＯＩは、細胞の活性を調節する作用物質、例えば、サイトカイン、接着分子または転写因子をコードし得る。

ＮＯＩは、標的細胞の活性を調節する作用物質をコードし得る。例えば、作用物質は、毒素を含み得る。

ＮＯＩは、標的細胞微小環境を調節する作用物質をコードし得る。例えば、作用物質は、ケモカインもしくはサイトカインであってもよいし、またはサイトカインもしくはケモカインにより媒介されるシグナル伝達に影響する作用物質、例えば、ドミナントネガティブケモカイン／サイトカインもしくはケモカイン／サイトカイン受容体、またはケモカイン／サイトカインにより媒介されるシグナル伝達を調節する結合作用物質、例えば、抗体もしくは抗体断片であってもよい。

第２の態様において、本発明では、核酸配列を提供する。

本発明の第２の態様の第１の実施形態では、それが発現される細胞の分化／消耗状態に応じて選択的に活性である目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含む核酸配列を提供する。

ＮＯＩは、それが発現される細胞の分化／消耗状態に応じて選択的に活性なプロモーターの制御下にあり得る。

あるいは、または加えて、ＮＯＩは、核酸配列が発現される細胞のある特定の分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。

本発明の第２の態様の第２の実施形態では、プロモーターの制御下にある、目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含む核酸配列であって、プロモーターは、それが発現される細胞の微小環境における環境代謝物の存在に応じて選択的に活性である、核酸配列を提供する。

本発明の第３の態様では、本発明の第２の態様による核酸配列を含む核酸配列のキットを提供する。
キットは、
（ｉ）構成的に活性なプロモーターの制御下にある第１の核酸配列、および
（ｉｉ）それが発現される細胞の分化／消耗状態、またはそれが発現される細胞の微小環境における環境代謝物の存在
のいずれかに応じて、選択的に活性なプロモーターの制御下にある第２の核酸配列
を含み得る。

キットは、第１の選択的に活性なプロモーターの制御下にある第１の核酸配列、および第２の選択的に活性なプロモーターの制御下にある第２の核酸配列を含み得、この第１および第２のプロモーターは、核酸配列のキットが発現される細胞の異なる分化／消耗状態において活性である。

キットは、
（ｉ）核酸配列が発現される細胞のある特定の分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす、特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含む第１の核酸配列、および
（ｉｉ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を欠く第２の核酸配列
を含み得る。

キットは、第１のｍｉＲＮＡ標的配列を有する第１の核酸配列、および第２のｍｉＲＮＡ標的配列を有する第２の核酸配列を含み得、この第１および第２のｍｉＲＮＡ標的配列は、核酸配列のキットが発現される細胞の異なる分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす。

第４の態様において、本発明では、本発明の第２の態様による核酸配列を含む、核酸構築物を提供する。

核酸構築物は、
（ｉ）構成的に活性なプロモーターの制御下にある第１の核酸配列、および
（ｉｉ）それが発現される細胞の分化／消耗状態、またはそれが発現される細胞の微小環境における環境代謝物の存在のいずれかに応じて、選択的に活性なプロモーターの制御下にある第２の核酸配列
を含み得る。

核酸構築物は、第１の選択的に活性なプロモーターの制御下にある第１の核酸配列、および第２の選択的に活性なプロモーターの制御下にある第２の核酸配列を含み得、この第１および第２のプロモーターは、核酸構築物が発現される細胞の異なる分化／消耗状態において活性である。

核酸構築物は、
（ｉ）核酸構築物が発現される細胞のある特定の分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含む第１の核酸配列、および
（ｉｉ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を欠く第２の核酸配列
を含み得る。

核酸構築物は、第１のｍｉＲＮＡ標的配列を有する第１の核酸配列、および第２のｍｉＲＮＡ標的配列を有する第２の核酸配列を含み得、この第１および第２のｍｉＲＮＡ標的配列は、核酸構築物が発現される細胞の異なる分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす。

第１および第２の核酸配列は、構成的に活性な双方向性プロモーターの制御下にあり得る。

核酸構築物がＴ細胞において発現されると、ＣＡＲまたはＣＡＲ成分またはＴＣＲが構成的に発現されるが、Ｔ細胞が消耗すると、阻害性分子が選択的に発現され、この阻害性分子が、ＣＡＲまたはＴＣＲの活性の低下を引き起こすように、第１の核酸配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲ成分または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし得、第２の核酸配列は、阻害性分子をコードし得る。

阻害性分子は、例えば、１つまたは複数のＩＴＡＭ結合ドメインを含むが、キナーゼドメインを欠く、切断型ＺＡＰ７０を含み得る。

核酸構築物がＴ細胞において発現されると、第１のＣＡＲまたはＣＡＲ成分が構成的に発現されるが、細胞がエフェクターメモリーまたはエフェクター状態にあると、第２のＣＡＲまたはＣＡＲ成分が選択的に発現されるように、第１の核酸配列は、ＣＤ２８共刺激性ドメインを含むＣＡＲまたはＣＡＲ成分をコードし得、第２の核酸配列は、ＯＸ４０または４１ＢＢ共刺激性ドメインを含むＣＡＲまたはＣＡＲ成分をコードし得る。

核酸構築物がＴ細胞において発現されると、ＣＡＲ、ＣＡＲ成分またはＴＣＲが構成的に発現されるが、Ｔ細胞の微小環境における環境代謝物の存在下でサイトカインが選択的に発現されるように、第１の核酸配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲ成分または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし得、第２の核酸配列は、サイトカインをコードし得る。

第５の態様において、本発明では、本発明の第２の態様による核酸配列、本発明の第３の態様による核酸配列のキット、または本発明の第４の態様による核酸構築物を含む、ベクターを提供する。

第６の態様において、本発明では、本発明の第２の態様による核酸配列、本発明の第３の態様による核酸配列のキット、もしくは本発明の第４の態様による核酸構築物、または本発明の第５の態様によるベクターを細胞に導入するステップを含む、本発明の第１の態様による細胞を生成するための方法を提供する。

細胞は、被験体から単離した試料に由来し得る。

第７の態様において、本発明では、本発明の第１の態様による複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。

第８の態様において、本発明では、疾患の処置および／または予防における使用のための、本発明の第７の態様による医薬組成物を提供する。

第９の態様において、本発明では、本発明の第７の態様による医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。

方法は、次のステップ：
（ｉ）細胞を含む試料の単離、
（ｉｉ）本発明の第２の態様による核酸配列、本発明の第３の態様による核酸配列のキット、もしくは本発明の第４の態様による核酸構築物、または本発明の第５の態様によるベクターの細胞への形質導入またはトランスフェクション、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞の被験体への投与
を含み得る。

第１０の態様において、本発明では、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第７の態様による医薬組成物の使用を提供する。

疾患は、がんであり得る。

本発明では、細胞の転写状態または細胞の微小環境における環境代謝物の存在に応じて選択的に発現される、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む細胞を提供する。

ＮＯＩは、例えば、細胞の、ある特定の分化または消耗状態において選択的に発現され得る。

細胞は、Ｔ細胞であり得る。

Ｔ細胞の分化
活性化後、Ｔ細胞は、図１に示すように、多種多様なＴ細胞亜型に分化する。

Ｔ細胞分化ならびにメモリーおよびエフェクターＴ細胞は、病原性因子に対する免疫において重要な役割を果たす。抗原提示細胞が病原性抗原をナイーブＴ細胞に提示すると、細胞は、活性化し、細胞数を増加させて、感染部位に遊走し病原体を除去するエフェクター細胞に分化する。エフェクター細胞は、短命な細胞であり、一方で、形成されるメモリー細胞のサブセットは、長期生存の可能性を有する。メモリー細胞は、二次リンパ器官（セントラルメモリー細胞、Ｔ ＣＭ）または直近に感染した組織（エフェクターメモリー細胞、Ｔ ＥＭ細胞）に位置し得る。二次免疫応答の間の抗原への再曝露において、メモリーＴ細胞は、急速な増殖を経て、一次免疫応答と比較して、感染の除去において、より有効かつ急速な免疫応答を引き起こす。メモリー細胞は、いくつかの特有の特徴：ｉ）以前の増殖および活性化の存在、（ｉｉ）抗原の非存在下での持続、およびｉｉｉ）抗原への再曝露時の活性の上昇を有する。

別個のＴ細胞サブセット、または別個のＴ細胞分化状態は、発現される細胞表面マーカーおよび／またはこれらが生成するエフェクター分子に基づいて同定することができる。以下の表では、それらの表面表現型、転写制御因子、エフェクター分子および免疫応答における機能に関して基づく種々のＴ細胞サブセットをまとめる。

トランスジェニック転写を特定のＴ細胞状態と関連付けるために、選択的表面マーカー由来のプロモーターを使用して、トランスジェニック転写を駆動させてもよい。あるいは、その状態に対して選択的な転写因子に応答性の転写エレメントを使用してもよい。
ナイーブＴ細胞
１．ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞

２．ＣＤ８＋ナイーブ細胞

セントラルメモリーＴ細胞

エフェクターメモリーＴ細胞

エフェクターＴ細胞
１．細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）

２．Ｔ_Ｈ１細胞

３．Ｔ_Ｈ２細胞

４．Ｔ_Ｈ９細胞

５．Ｔ_Ｈ１７細胞

６．Ｔ_Ｈ２２細胞

７．Ｔ_ＦＨ細胞

８．ナチュラルＴ_Ｒｅｇ細胞

９．誘導性Ｔ_Ｒｅｇ細胞

１０．Ｔ_Ｒ１細胞

本発明の文脈では、ＮＯＩは、
ａ）ナイーブＴ細胞、
ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、
ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、
ｄ）セントラルメモリーＴ細胞、
ｅ）エフェクターメモリーＴ細胞、
ｆ）制御性Ｔ細胞、または
ｇ）エフェクターＴ細胞
において選択的に発現され得る。

ＮＯＩは、特定のＴ細胞サブセットにおいて選択的発現を引き起こす、プロモーターの制御下にあり得る。例えば、ＮＯＩは、ＡＰ１、ＣＲＥＢ、ＳＲＥ、ＴＣＦ−ＬＥＦ、ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ５に応答性のプロモーターの制御下にあり得る。

このようなプロモーターの配列は、配列番号２７〜３２として以下に示す。

Ｔ細胞の消耗
Ｔ細胞の消耗は、Ｔ細胞機能障害の状態であり、多くの慢性感染およびがんにおいて生じる。これは、不十分なエフェクター機能、阻害性受容体の持続的発現、および機能性エフェクターまたはメモリーＴ細胞のそれと異なる転写状態により定義される。

外因性の負の制御経路（免疫制御性サイトカイン等）および細胞内因性の負の制御経路（ＰＤ−１等）はともに、消耗において鍵となる役割を有する。消耗したＴ細胞は、特徴的なＴ細胞分化状態を示す。

消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞は、慢性ウイルス感染において、サイトカインを生成しない、ウイルス特異的四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞として初めて同定された。消耗の間、階層的に機能の喪失が生じ、消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞は、一部の特性を失って、その後、他の特性を失う。典型的には、ＩＬ−２生成、高増殖能およびｅｘ ｖｉｖｏでの殺傷のような機能は、はじめに失われる。腫瘍壊死因子を生成する能力を含む他の特性は、機能障害の、より中間の段階で失われることが多い。重度の消耗は、大量のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）もしくはベータケモカインを生成、または脱顆粒する能力を部分的に、または一部の場合に、完全に欠く、ウイルス特異的細胞を最終的に生じる。消耗の最終段階は、ウイルス特異的Ｔ細胞の物理的除去である。ウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、慢性ウイルス感染においてエフェクター機能を失う。

免疫制御は、Ｔ細胞消耗に中心的に関与する。このような負の経路は、細胞表面阻害性受容体（ＰＤ−１等）、可溶性因子（ＩＬ−１０等）および免疫制御性細胞型（制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）および他の細胞等）の３つの主なカテゴリーに分類することができる。

いくつかの特定の転写経路は、Ｔ細胞消耗と関連付けられている。例えば、転写抑制因子Ｂｌｉｍｐ−１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の消耗に中心的に関与する。転写プロファイリングでは、消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞において、転写因子ＮＦＡＴｃ１（ＮＦＡＴ２）のより高い発現を示す。

組込みゲノム方法は、ＰＤ−１ライゲーションにより誘導され、マウスおよびヒトにおけるＴ細胞消耗にも関与する、遺伝子を定義するために使用されている。このような研究では、消耗したＴ細胞において、ＰＤ−１の下流にある一般的転写経路としてＢＡＴＦを同定した。ＢＡＴＦは、転写因子ｃ−Ｊｕｎとともに二量体を形成して転写因子ｃ−Ｆｏｓに取って代わり、正準のＡＰ−１媒介性転写を阻害することができる。

次の表では、それらの表面表現型、転写制御因子、エフェクター分子および免疫応答における機能に関して消耗したＴ細胞をまとめ、定義する。

本発明の文脈では、ＮＯＩは、消耗したＴ細胞において選択的に発現され得る。これを達成するために、ＰＤ１、ＴＩＭ３およびＬａｇ３のような消耗マーカーから入手したプロモーターによりトランスジェニック転写を駆動することができる。

選択的に活性なプロモーター
本明細書において使用する用語「プロモーター」は、プロモーターおよび／またはエンハンサーを意味する。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する、ＤＮＡの領域である。プロモーターは、そのＤＮＡの同一の鎖上で上流（センス鎖の５’領域方向）にある遺伝子の転写開始部位の近傍に配置する。プロモーターは、通常、約１００〜１０００塩基対の長さである。エンハンサーは、ＤＮＡの短い（５０〜１５００ｂｐ）領域であり、転写因子により結合して、特定の遺伝子の転写が発生する可能性を高めることができる。エンハンサーは、シス作用性であり、転写開始部位から上流または下流に配置することができる。

導入遺伝子の発現は、そのＴ細胞状態において導入遺伝子の発現を生理学的に方向付ける、特異的プロモーターによって、Ｔ細胞の特定の分化状態に制限することができる。例えば、ＣＤ４プロモーター由来のこの導入遺伝子の発現を駆動することにより、導入遺伝子の発現を、Ｔ細胞のＣＤ４＋細胞への分化に関連付けることができる。例えば、ＣＤ４４プロモーター由来の導入遺伝子の発現を駆動することにより、導入遺伝子の発現を、ナイーブＴ細胞状態に関連付けることができる。例えば、ＣＤ１２２プロモーター由来の導入遺伝子の発現を駆動することにより、導入遺伝子の発現を、メモリーＴ細胞状態に関連付けることができる。例えば、ＦＯＸＰ３プロモーター等に由来する導入遺伝子の発現を駆動することにより、導入遺伝子の発現を、制御性Ｔ細胞状態に関連付けることができる。

ＣＤ４＋Ｔ細胞に特異的な発現は、ＣＤ４遺伝子の（転写開始部位に対して）−１０７６〜＋２０をプロモーターとして使用することにより達成することができる。このプロモーターのＤＮＡ配列は、配列番号１として以下に示す。導入遺伝子オープンリーディングフレーム上流のＣＤ４遺伝子のこのセグメントをクローニングすると、ＣＤ４遺伝子がＴ細胞においてオンにされる場合はいつでも導入遺伝子の発現が生じる。ＣＤ８＋特異的発現は、配列番号２として以下に示す、ＣＤ８遺伝子の等価な部分を使用して達成することができる。

制御性Ｔ細胞に特異的な発現は、ＦＯＸＰ３特異的プロモーターを使用することにより達成することができる。ＦＯＸＰ３に特異的なプロモーターは、ＦＯＸＰ３遺伝子の（転写開始部位に対して）−５１１〜＋１７６塩基対の領域に位置する。このプロモーターのＤＮＡ配列は、配列番号３として以下に示す。

導入遺伝子の発現は、例えば、ＣＤ４４プロモーター由来の導入遺伝子の発現を駆動することにより、ナイーブＴ細胞状態に関連付けることができる。ＣＤ４４に特異的なプロモーターは、ＣＤ４４遺伝子の転写開始部位から−９０８〜−１１８のＣＤ４４に位置する。このプロモーターのＤＮＡ配列は、配列番号４として以下に示す。

ナイーブ／セントラルメモリー細胞の他のマーカーは、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７を含む。このような遺伝子由来のプロモーターを使用して、ナイーブ／セントラルメモリー特異的発現を生じさせ得る。ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＤ１２７のＤＮＡ配列は、配列番号５、６および７として以下にそれぞれ示す。

最終分化エフェクターＴ細胞の他のマーカーは、ＣＤ５７、ＫＬＲＧ１、ＣＤ１６１（ＫＬＲＢ１）、ＣＤ５８およびＣＤ１２２を含む。このような遺伝子由来のプロモーターを使用して、エフェクターＴ細胞特異的発現を生じさせ得る。ＣＤ１２２プロモーターのＤＮＡ配列は、配列番号８として以下に示す。

いくつかのデータベースは、プロモーター配列情報を含有する。例えば、ＥＰＤｎｅｗ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ）は、実験により検証された、ヒト（および他の）ゲノムのプロモーターの新たなコレクションである（参照：Ｄｒｅｏｓ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４３ （Ｄ１）：Ｄ９２−Ｄ９６）。

記載されていないプロモーターは、当業者により推定することができる。簡潔には、典型的に、問題の遺伝子の転写開始部位上流の、ゲノム配列の解析により推定することができる。公知のモチーフおよび他のプロモーターとの比較を行うことができる。いくつかの公開データベースおよびソフトウェアツールが利用可能であり、このような解析に役立つ。例えば：
− 古い情報であるが、Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）（参照：Ｍ．Ｇ． Ｒｅｅｓｅ ２００１． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． ２６： ５１−６）
− 脊椎動物Ｐｏｌ ＩＩプロモーターの転写開始部位をＤＮＡ配列において予測する、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ２．０ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｅｒ（Ｓ． Ｋｎｕｄｓｅｎ， Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ）
− プロモーター配列および転写開始部位を哺乳動物ゲノムにおいてマッピングする、ＰＲＯＭＯＳＥＲ−ヒト、マウスおよびラットプロモーター抽出サービス（Ｂｏｓｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）（参照：Ｓ． Ａｎａｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００３． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２００３ ３１： ３５５４−５９）。

ｍｉＲＮＡ標的ドメインを使用する制御
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、小型の非コードＲＮＡ分子（約２２ヌクレオチドを含む）であり、遺伝子発現のＲＮＡサイレンシングおよび転写後制御において機能する。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子における相補的配列による塩基対形成を介して機能する。結果として、このようなｍＲＮＡ分子は、次のプロセスのうちの１つまたは複数によりサイレンシングされる：（ｉ）ｍＲＮＡ鎖の２つの断片への切断、（ｉｉ）ポリ（Ａ）尾部の短縮によるｍＲＮＡの不安定化、およびリボソームによるｍＲＮＡのタンパク質へのより効率的ではない翻訳。

本発明の文脈における、発現を選択的に制御する代替方法は、特定のｍｉＲＮＡ標的配列を転写物の非翻訳領域へ導入することである。このようなｍｉＲＮＡ標的配列は、同族ｍｉＲＮＡによる転写物の破壊を方向付ける。ｍｉＲＮＡ標的配列は、これらの同族ｍｉＲＮＡが、導入遺伝子の発現が望ましくない場合に発現されるように選択される。

マイクロＲＮＡは、ほぼ間違いなく、Ｔ細胞生物学の最初期および最終段階におけるＴ細胞に最も重要である。初期胸腺分化の第１段階では、マイクロＲＮＡネットワークに決定的に依存し、一方で、後の段階および末梢性ホメオスタシスでは、完全ではないが、大部分がマイクロＲＮＡ非依存性である。Ｔ細胞に対する最も著明な作用は、従来型および制御性Ｔ細胞のエフェクターおよび制御性機能の活性化におけるものであり、この場合、マイクロＲＮＡが欠乏すると、ほぼ完全に機能が失われる。Ｔ細胞分化におけるｍｉＲＮＡの経時的活性は、Ｊｅｋｅｒ， ａｎｄ Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ （２０１３； Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ２５３， ６５−８１）；Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ （２０１３； Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ２５３， ５３−６４）およびＢａｕｍｊｏｈａｎｎ ａｎｄ Ａｎｓｅｌ （２０１３； Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３： ６６６−６７８）において総説が記載されている。

適切なｍｉＲＮＡ標的配列は、文献、データベースおよび予測ソフトウェアから当業者により選択することができる。

例えば、ｍｉＲＤＢ（Ｎａｔｈａｎ Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｘｉａｏｗｅｉ Ｗａｎｇ （２０１５） ｍｉＲＤＢ： ａｎ ｏｎｌｉｎｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ４３（Ｄ１）：Ｄ１４６−１５２）である。

さらなる例は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ． ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ： Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ ｒｅｓｏｕｒｃｅ： ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｂｅｔｅｌ Ｄ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｍ， Ｇａｂｏｗ Ａ， Ｍａｒｋｓ ＤＳ， Ｓａｎｄｅｒ Ｃ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００８ Ｊａｎ； ３６（Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ）： Ｄ１４９−５３である。

表１は、Ｔ細胞に重要なマイクロＲＮＡ配列の一部の例を示す。

環境代謝物
第２の実施形態では、本発明の第１の態様は、細胞の微小環境における環境代謝物の存在に応じて細胞により選択的に発現されるＮＯＩを含む細胞に関する。

環境代謝物は、腫瘍微小環境において見出される代謝物であり得る。代謝物は、腫瘍により直接的または間接的に生成され得る。

アリール炭化水素受容体
環境毒素に対する細胞応答は、大部分は、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の活性化により媒介される。ＡＨＲ活性化は、毒素がＰＡＳ（Ｐｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍ）ドメインに結合した後に発生する。これにより、構造変化が始まって細胞シャペロンの放出が生じ、これによりＡＲＮＴ転写因子との二量体形成が可能となる。生じるＡＨＲ／ＡＲＮＴヘテロ二量体が特異的ＤＮＡ配列（ＸＲＥ−生体異物認識エレメント）に結合すると、細胞傷害に対する応答に必要とされる遺伝子の上方制御が生じる（図６）。

本発明の文脈では、環境代謝物は、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）を活性化し得る。

目的のヌクレオチドの発現は、ＡＨＲ／ＡＲＮＴヘテロ二量体により上方制御され得る。

ＮＯＩを含む核酸配列はまた、１つまたは複数の生体異物認識エレメント（ＸＲＥ）を含み、これは、ＡＨＲ／ＡＲＮＴヘテロ二量体により特異的に認識され得る。

ＸＲＥコア配列は、以下に配列番号１２として示す。この配列は、配列番号１３として示すコンセンサス配列に含まれることが多い。
５’−ＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１２）
５’−Ｔ／ＧＮＧＣＧＴＧＡ／ＣＧ／ＣＡ−３’（配列番号１３）

本発明のヌクレオチド配列は、配列番号１２または１３を、ＮＯＩとともに含み得る。逆方向（すなわち、アンチセンス鎖）では、ＸＲＥコア配列は、配列ＣＡＣＧＣ（配列番号２４）を有する。

本発明のヌクレオチド配列は、配列番号２４を含み得る。例えば、ＸＲＥプロモーターは、次の配列のうちの１つを含み得る。
ＣＴＧＧＴＡＡＧＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＡ（配列番号２５）、または
ＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＣＴＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＣＴＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＣＴＡＧＣＡＧＡＴ（配列番号２６）

キヌレニン経路
腫瘍微小環境は、栄養素が不十分な状況であることに加えて、強力な免疫抑制活性をも持続し、これは、微小環境におけるアデノシンの生成およびトリプトファン代謝物の生成によりある程度維持される。免疫抑制性生成物を生成するトリプトファンの分解経路は、図７に示す。

このような代謝物のうちの１つであるキヌレニンは、図６に模式的に示すように、ＸＲＥ配列を介して、ＡＨＲに結合して転写を刺激することにより作用する。

本発明の文脈では、環境代謝物は、アデノシンまたはトリプトファン代謝物であり得る。環境代謝物は、例えば、キヌレニン、キヌレン酸、キナルジン酸、３−ＯＨ−キヌレニン（ｋｙｎｅｕｒｅｎｉｎｅ）、キサンツレン酸、３−ＯＨ−アントラニル酸、キノリン（ｑｕｉｎｏｌｉｃ）酸またはピコリン酸であり得る。特に、環境代謝物は、キヌレニンであり得る。

キメラ抗原受容体
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および選択的に発現されるＮＯＩを含む細胞を提供する。

図２に模式的に示す、古典的ＣＡＲは、キメラのＩ型膜貫通タンパク質であり、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続する。このバインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式または標的抗原のリガンドをベースとすることができる。スペーサードメインは、バインダーを膜から隔離するため、およびバインダーの適切な方向付けを可能とするために必要であり得る。一般的に使用されるスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原に応じた、ＣＤ８α由来のストークおよび単なるＩｇＧ１ヒンジのみでも十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜内にタンパク質を固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。

初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有した。結果的には、このような第１世代の受容体は、免疫シグナル１を伝達し、これは、Ｔ細胞による同族標的細胞の殺傷を引き起こすのに十分であったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存させることはできなかった。この制限を克服するために、複合エンドドメインが構築されており、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分が、ＣＤ３ζの細胞内部分と融合すると、第２世代受容体がもたらされ、これは、抗原認識後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達することができる。最も一般的に使用される共刺激性ドメインは、ＣＤ２８の共刺激性ドメインである。これは、最も強力な共刺激シグナル、すなわち、免疫シグナル２を供給し、これによりＴ細胞の増殖が引き起こされる。一部の受容体はまた、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン、例えば、密接に関わるＯＸ４０および４１ＢＢを含むと記載されており、これらは、生存シグナルを伝達する。さらにより強力な第３世代ＣＡＲは、活性化、増殖および生存シグナルを伝達可能なエンドドメインを有すると、ここで記載している。

ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に移入され得る。この方法では、多数の抗原特異的Ｔ細胞を生成して、養子細胞移植することができる。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、これにより、それが発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達が生じる。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害を、標的化抗原を発現する細胞に方向付ける。

抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識する、古典的ＣＡＲの部分である。

多数の抗原結合ドメインは、当技術分野において公知であり、抗体、抗体模倣体、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位をベースとするものを含む。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、標的抗原の天然リガンド、標的に対する十分な親和性を有するペプチド、単一ドメインバインダー、例えば、ラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）、人工バインダー、例えば、Ｄａｒｐｉｎ、またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。

様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、以下の表２に示すように、公知である。本発明において使用する抗原結合ドメインは、そこに示すように、ＴＡＡに結合可能なドメインであり得る。

抗原結合ドメインは、Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ）および膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）を含み得る。ＡＰＲＩＬをベースとする抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、国際公開第２０１５／０５２５３８号に記載されている。

膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜を横断する、古典的ＣＡＲの配列である。これは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来し、良好な受容体安定性をもたらし得る。

シグナルペプチド
ＣＡＲは、シグナルペプチドを含み得、これにより、それが細胞、例えば、Ｔ細胞において発現されると、新生タンパク質が、小胞体、およびその後に、これが発現される細胞表面に方向付けられる。

シグナルペプチドのコアは、長いひと続きの疎水性アミノ酸を含み得、これは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する。このシグナルペプチドは、短い正荷電のひと続きのアミノ酸から開始し得、トランスロケーションの間にポリペプチドの適切なトポロジーを強制させるのに役立ち得る。シグナルペプチドの末端には、典型的に、シグナルペプチダーゼにより認識および切断されるひと続きのアミノ酸が存在する。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーションの間または完了後のいずれかに切断して、遊離のシグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離のシグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。

スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続させる、スペーサー配列を含み得る。可撓性のスペーサーは、抗原結合ドメインを種々の方向に方向付けて、結合を促進することを可能とする。

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークもしくはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する、代替リンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更され得る。

細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。

最も一般的に使用されるシグナル伝達ドメイン成分は、ＣＤ３ゼータエンドドメインの成分であり、これは、３つのＩＴＡＭを含む。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３ゼータは、十分に適格な活性化シグナルをもたらさないことがあり、追加の共刺激シグナル伝達を必要とし得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３ゼータとともに使用して、増殖／生存シグナルを伝達することができるか、または３つすべてをともに使用することができる（図２Ｂに例示）。

ＣＡＲ成分
本発明の細胞では、ＮＯＩは、ＣＡＲ成分をコードし得る。

例えば、ＮＯＩは、ＣＡＲの部分、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインをコードし得る。

ＣＡＲシグナル伝達系は、２つの部分：抗原結合ドメイン、必要に応じたスペーサードメインおよび膜貫通ドメインを含む、受容体成分、ならびに細胞内シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達成分を含むと以前に記載されている。１つまたは複数の共刺激性ドメインは、受容体成分および／または細胞内シグナル伝達成分上に位置し得る。

受容体成分と細胞内シグナル伝達成分との間のヘテロ二量体形成により、機能性ＣＡＲを生成する。ヘテロ二量体形成は、国際公開第２０１６／１２４９３０号に記載のように、自然に発生し得るか、または国際公開第２０１５／１５０７７１号に記載のように、二量体形成の化学誘導因子（ＣＩＤ）の存在下でのみ発生し得る。第３の代替では、ヘテロ二量体形成を、特定の低分子のような作用物質の存在により妨害し、このため、ＣＡＲにより媒介されるシグナル伝達は、作用物質の非存在下でのみ発生する。このような系は、国際公開第２０１６／０３０６９１号に記載されている。

本発明の細胞では、このようなＣＡＲ系の受容体成分および／または細胞内シグナル伝達成分の発現は、細胞の分化／消耗状態、または細胞の微小環境における環境代謝物の存在に応じて選択的であり得る。言い換えれば、「ＣＡＲ成分」は、受容体成分または細胞内シグナル伝達成分であり得る。

特定の一実施形態では、細胞は、構成的に活性なプロモーターの制御下で受容体成分をコードするＮＯＩを含み得る。例えば、細胞は、種々の共刺激性ドメインまたは共刺激性ドメインの組合せを有する細胞内シグナル伝達成分を、異なる選択的プロモーター／ｍｉＲＮＡ標的の制御下でそれぞれコードする、２つまたはそれよりも多い核酸を含み得る。したがって、ＣＡＲ系における共刺激性ドメインまたは共刺激性ドメインの組合せは、細胞の分化または消耗の状態により変化する。

Ｔ細胞受容体
本発明ではまた、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および選択的に発現されるＮＯＩを含む、細胞を提供する。

ＴＣＲは、Ｔ細胞の表面上に発現される分子であり、抗原の断片を、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合するペプチドとして認識することを担う。

ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖で構成されるヘテロ二量体である。ヒトでは、Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（ＴＲＡおよびＴＲＢによりそれぞれコードされる）からなるが、Ｔ細胞の５％において、ＴＣＲは、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（ＴＲＧおよびＴＲＤによりそれぞれコードされる）からなる。

ＴＣＲが、抗原性ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と係合すると、Ｔリンパ球は、シグナル伝達により活性化される。

抗体により方向付けられる従来の標的抗原とは対照的に、ＴＣＲにより認識される抗原は、潜在的細胞内タンパク質のアレイ全体を含むことができ、これは、プロセシングされて細胞表面にペプチド／ＭＨＣ複合体として送達される。

細胞を改変して、ＴＲＡおよびＴＲＢ遺伝子、またはＴＲＧおよびＴＲＤ遺伝子を、ベクターを使用して細胞に人工的に導入することにより、異種（すなわち、非ネイティブ）ＴＣＲ分子を発現させることが可能である。例えば、改変ＴＣＲの遺伝子は、自家Ｔ細胞に再導入し、Ｔ細胞養子療法のために患者に移入し戻し得る。

目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）
本発明の細胞は、
ｉ）細胞の分化／消耗状態、または
ｉｉ）細胞の微小環境における環境代謝物の存在
に応じて選択的に発現される、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む。

ＮＯＩは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。

ＮＯＩは、上記のように、ＣＡＲ、ＣＡＲ成分またはＴＣＲをコードし得る。

ＮＯＩは、ＣＡＲまたはＴＣＲの活性を調節する作用物質をコードし得る。

ＮＯＩは、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞の活性を調節する作用物質をコードし得る。

ＮＯＩは、標的細胞の活性を調節する作用物質をコードし得る。

ＮＯＩは、標的細胞微小環境を調節する作用物質をコードし得る。

細胞は、
ｉ）細胞の分化／消耗状態、または
ｉｉ）細胞の微小環境における環境代謝物の存在
に応じて選択的に発現される、２つまたはそれよりも多いＮＯＩを含み得る。細胞は、例えば、ＣＡＲ／ＴＣＲ発現細胞、標的細胞、または標的細胞微小環境に影響する作用物質の組合せを生成し得る。細胞は、例えば、複数のサイトカインもしくは複数のケモカインまたは１つのサイトカインおよび１つのケモカインの組合せを生成し得る。

ＣＡＲ／ＴＣＲ調節作用物質
本発明ではまた、ＣＡＲまたは改変ＴＣＲ、およびＣＡＲまたはＴＣＲの活性を調節する作用物質を含む細胞を提供する。作用物質は、細胞の転写状態に応じて選択的に発現され得る。

ＣＡＲ／ＴＣＲ活性を調節する作用物質は、例えば、シグナル伝達修飾タンパク質、「減弱因子」；阻害性ＣＡＲまたはサイトカインシグナル伝達ドメインであり得る。

シグナル伝達修飾タンパク質
国際公開第２０１６／１９３６９６号では、免疫細胞活性化後にシグナル伝達経路を調節する、様々な融合タンパク質および切断型タンパク質について記載している。

シグナル伝達修飾タンパク質は、例えば、次のうちの１つであり得る：
（ｉ）リン酸化免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含むが、キナーゼドメインを欠く、切断型タンパク質、
（ｉｉ）リン酸化免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含むが、ホスファターゼドメインを欠く、切断型タンパク質、
（ｉｉｉ）（ａ）リン酸化免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来、またはリン酸化免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン、および（ｉｉ）異種ドメインを含む、融合タンパク質。

シグナル伝達修飾タンパク質は、ＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメインを含むが、ＺＡＰ７０キナーゼドメインを欠く、切断型タンパク質であり得る。

シグナル伝達修飾タンパク質は、ＰＴＰＮ６ ＳＨ２を含むが、ＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインを欠く、切断型タンパク質であり得る。

シグナル伝達修飾タンパク質は、ＳＨＰ−２ ＳＨ２ドメインを含むが、ＳＨＰ−２ホスファターゼドメインを欠く、切断型タンパク質であり得る。

シグナル伝達修飾タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン、および（ｉｉ）ホスファターゼドメインを含む、融合タンパク質であり得る。

融合タンパク質は、例えば、ＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメイン、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２ホスファターゼドメインを含み得る。

シグナル伝達修飾タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン、および（ｉｉ）キナーゼドメインを含む、融合タンパク質であり得る。

融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含み得る。

融合タンパク質は、Ｚａｐ７０キナーゼドメインを含み得る。

融合タンパク質は、ＡＫＴまたはＪＡＫキナーゼドメインを含み得る。

シグナル伝達修飾タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来、またはリン酸化免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン、および（ｉｉ）異種シグナル伝達ドメインを含む、融合タンパク質であり得る。

融合タンパク質は、ＺＡＰ７０、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含み得る。

異種シグナル伝達ドメインは、通常は、ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭを含む受容体により活性化されない、シグナル伝達分子由来であり得る。

異種シグナル伝達ドメインは、共刺激性ドメインであり得る。この点に関して、融合タンパク質は、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４１ＢＢ共刺激性ドメインを含み得る。

異種シグナル伝達ドメインは、阻害性ドメインであり得る。この点に関して、阻害性ドメインは、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインであってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。あるいは、異種シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲまたはＨＶＥＭのエンドドメインであるか、またはこれを含む。

シグナル伝達修飾タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン、および（ｉｉ）ＩＴＡＭを含むドメインを含む、融合タンパク質であり得る。

融合タンパク質は、ＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメインを含み得る。

ＩＴＡＭを含むドメインは、ＣＤ３ゼータのエンドドメインであってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。

シグナル伝達修飾タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン、および（ｉｉ）ＩＴＩＭを含むドメインを含む、融合タンパク質であり得る。

融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含み得る。

ＩＴＩＭを含むドメインは、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３由来のエンドドメインであってもよいし、またはそれらを含んでいてもよい。

シグナル伝達修飾タンパク質が、ＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメインを含むがＺＡＰ７０キナーゼドメインを欠く切断型タンパク質を含む場合、切断型タンパク質は、配列番号９に示す配列を含んでいてもよいし、またはそれからなっていてもよい。

ＺＡＰ７０は、２つのＳＨ２ドメインを、配列のＮ末端の、配列の残基１０〜１０２および１６３〜２５４に有する。したがって、本発明の切断型タンパク質または融合タンパク質は、配列番号１０および１１に示す配列の一方または両方を含み得る。

融合タンパク質は、改変体配列が、必要とされる特性を有するＳＨ２ドメイン配列であるという条件で、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する、配列番号９、１０または１１の改変体を含み得る。言い換えれば、改変体配列は、ＺＡＰ７０の動員を可能とする、ＣＤ３ゼータの細胞質尾部のリン酸化チロシン残基に結合可能であるべきである。

減弱因子
代替の実施形態では、作用物質は、ホスファターゼ「減弱因子」であり、ＣＡＲまたはＴＣＲエンドドメインの脱リン酸化を引き起こし、ある特定の転写状態における活性化に対する閾値を上昇させ得る。

減弱因子は、シグナル減衰ドメイン（ＳＤＤ）を含む膜係留型シグナル減衰成分（ＳＤＣ）であり得る。

ＳＤＤは、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインを阻害することが可能であり得る。

ＳＤＤは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を脱リン酸化することが可能なホスファターゼドメイン、例えば、ＣＤ１４８もしくはＣＤ４５のエンドドメインまたはＳＨＰ−１もしくはＳＨＰ−２のホスファターゼドメインを含み得る。

ＳＤＤは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含むことがあり、例えば、ＳＤＤは、次の阻害性受容体：ＰＤ１、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＴＬＡ−４、ＧＰ４９Ｂ、Ｌａｉｒ−１、Ｐｉｒ−Ｂ、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ２２、Ｓｉｇｌｅｃ７、Ｓｉｇｌｅｃ９、ＫＬＲＧ１、ＩＬＴ２、ＣＤ９４−ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ５のうちの１つ由来のエンドドメインを含み得る。

ＳＤＤは、Ｓｒｃプロテインキナーゼ、例えば、Ｌｃｋを阻害し得る。ＳＤＤは、ＣＳＫのキナーゼドメインを含み得る。

膜係留型ＳＤＣは、例えば、膜貫通ドメインまたはミリストイル化配列を含み得る。

阻害性ＣＡＲ
作用物質は、阻害性ＣＡＲ、すなわち、阻害性エンドドメインを含むＣＡＲであり得る。阻害性エンドドメインは、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば、ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２由来のＰＴＰドメインを含み得る。

あるいは、阻害性エンドドメインは、ＣＤ２２、ＬＡＩＲ−１、キラー阻害性受容体ファミリー（ＫＩＲ）、ＬＩＬＲＢ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ等由来のもののようなエンドドメインを含むＩＴＩＭ（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ）を含み得る。リン酸化されると、ＩＴＩＭは、そのＳＨ２ドメインを介して内因性ＰＴＰＮ６を動員する。ＩＴＡＭを含むエンドドメインと共局在する場合、脱リン酸化が発生し、活性化しているＣＡＲが阻害される。

あるいは、阻害性ＣＡＲは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を脱リン酸化することが可能なホスファターゼドメイン、例えば、ＣＤ１４８もしくはＣＤ４５のエンドドメインまたはＳＨＰ−１もしくはＳＨＰ−２のホスファターゼドメインを含み得る。

サイトカインシグナル伝達ドメイン
多くの細胞機能は、サイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーにより制御される。このような受容体によるシグナル伝達は、それらのヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）との会合に依存し、このＪＡＫは、受容体複合体に対して動員されるシグナル伝達タンパク質のチロシンリン酸化にリガンド結合をカップリングさせる。これらの中でも、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）、サイトカイン応答の多様性に寄与する転写因子のファミリーがある。

サイトカイン受容体が、そのリガンドに結合する場合、次の細胞内シグナル伝達経路：
（ｉ）ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、
（ｉｉ）ＭＡＰキナーゼ経路、および
（ｉｉｉ）ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路
のうちの１つまたは複数を開始し得る。

サイトカイン受容体は、「サイトカイン型」細胞シグナル伝達を引き起こす、エンドドメインを含む。

本発明の作用物質は、サイトカイン受容体エンドドメインであってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。

エンドドメインは、Ｉ型サイトカイン受容体に由来し得る。Ｉ型サイトカイン受容体は、細胞膜に隣接する細胞外部分に共通のアミノ酸モチーフ（ＷＳＸＷＳ）を共有する。

エンドドメインは、ＩＩ型サイトカイン受容体に由来し得る。ＩＩ型サイトカイン受容体は、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンに結合するもの、およびインターロイキン１０ファミリーのメンバー（インターロイキン１０、インターロイキン２０およびインターロイキン２２）に結合するものを含む。

Ｉ型サイトカイン受容体は、
（ｉ）インターロイキン受容体、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３およびＩＬ−２７の受容体、
（ｉｉ）コロニー刺激因子受容体、例えば、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの受容体、ならびに
（ｉｉｉ）ホルモン受容体／神経ペプチド受容体、例えば、ホルモン受容体およびプロラクチン受容体
を含む。

Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、種々の鎖を含み、このうち、リガンド／サイトカイン相互作用に関与するものもあれば、シグナル伝達に関与するものもある。例えば、ＩＬ−２受容体は、α鎖、β鎖およびγ鎖を含む。

ＩＬ−２受容体共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２としても公知）は、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１３受容体およびＩＬ−１５受容体の間で共有される。

ＣＡＲ／ＴＣＲ発現細胞を調節する作用物質
ＮＯＩは、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞の活性を調節する作用物質をコードし得る。

例えば、作用物質は、サイトカインもしくはケモカイン、接着分子、または転写因子であり得る。

サイトカイン／ケモカイン
作用物質は、サイトカインまたはケモカインであり得る。例えば、ＩＬ１２、ｆｌｅｘｉＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ２およびＣＣＬ１９から選択される。特に、作用物質は、ＩＬ−１２であり得る。

インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、がんに対する免疫応答を再び方向付ける（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）腫瘍微小環境を調節する特定の目的のための、強力な免疫調節性サイトカインである。ＩＬ−１２は、全身毒性であり、このため、ＩＬ−１２を局所的に生成するための方法は、大変興味深い対象である。本発明の方法では、キヌレニンのような環境代謝物の存在下で免疫調節性サイトカインを生成し得る機構を提供する。キヌレニンのような代謝物の存在下でのＩＬ−１２の選択的生成は、腫瘍微小環境内にそれが存在する場合にのみ、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞によるＩＬ−１２の局所的生成を可能とする。

接着分子
細胞接着分子（ＣＡＭ）は、細胞接着において他の細胞または細胞外基質（ＥＣＭ）との結合に関与する細胞表面上に位置するタンパク質である。

このようなタンパク質は、典型的に膜貫通受容体であり、３つのドメイン：細胞骨格と相互作用する細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および同類の他のＣＡＭ（同種親和性結合）または他のＣＡＭもしくは細胞外基質（ヘテロ親和性結合）のいずれかと相互作用する細胞外ドメインで構成される。

ほとんどのＣＡＭは、４つのタンパク質ファミリー：Ｉｇ（免疫グロブリン）スーパーファミリー（ＩｇＳＦ ＣＡＭ）、インテグリン、カドヘリン、およびセレクチンに属する。

本発明の作用物質は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞の活性を調節する接着分子であってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。

転写因子
本発明の作用物質は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞の活性を調節する転写因子であってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。

転写因子は、特定のＤＮＡ配列に結合することにより、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写速度を制御し、この配列を含むか、または隣接する遺伝子の発現を調節するタンパク質である。

転写因子は、ＲＮＡポリメラーゼの動員を（活性化因子として）促進または（抑制因子として）遮断することにより作用する。

転写因子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含み、これは、ＤＮＡのエンハンサーまたはプロモーター領域のいずれかに結合する。転写因子に応じて、隣接する遺伝子の転写は、上方または下方制御される。転写因子はまた、トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、これは、他のタンパク質、例えば、転写共制御因子の結合部位を有する。

転写因子は、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡへの結合の安定化もしくは遮断、またはヒストンタンパク質のアセチル化もしくは脱アセチル化の触媒を含む遺伝子発現の制御のための様々な機構を使用する。転写因子は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を有し得、これは、ヒストンタンパク質をアセチル化して、ＤＮＡのヒストンとの会合を弱め、ＤＮＡを転写に到達し易くさせ、これにより、転写を上方制御する。あるいは、転写因子は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）活性を有し得、これは、ヒストンタンパク質を脱アセチル化して、ＤＮＡのヒストンとの会合を強化し、ＤＮＡを転写に到達し難くさせ、これにより、転写を下方制御する。それらが機能し得る別の機構は、共活性化因子または共抑制因子タンパク質を転写因子ＤＮＡ複合体に動員することによる。

転写は、構成的に活性であってもよいし、または条件的に活性であってもよく、すなわち、活性化を必要としてもよい。

転写因子は、天然に存在するものでもよいし、または人工であってもよい。

転写因子は、ナイーブ、セントラルメモリーおよび／または幹細胞メモリーＴ細胞のＣＡＲ−Ｔ細胞組成物における比率を上昇させ得る。

転写因子は、例えば、セントラルメモリー抑制転写因子、例えば、ＢＣＬ６またはＢＡＣＨ２であり得る。セントラルメモリー抑制因子は、Ｔ細胞のエフェクターメモリー細胞への分化を阻害し、これにより、これらは低分化Ｔ細胞亜型、例えば、ナイーブおよび幹細胞メモリーＴ細胞のうちの１つにとどまる。

あるいは、この転写因子は、エフェクターメモリー抑制転写因子、例えば、ＢＬＩＭＰ−１であり得る。

標的細胞調節作用物質
ＮＯＩは、標的細胞、例えば、腫瘍細胞の活性を調節する作用物質をコードし得る。

例えば、作用物質は、毒素であり得る。作用物質は、腫瘍細胞に対して毒性である毒素であり得る。例えば、作用物質は、ジフテリア毒素、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ毒素またはｓｈｉｇｅｌｌａ毒素であり得る。

標的細胞微小環境調節作用物質
ＮＯＩは、標的細胞、例えば、腫瘍細胞の環境を調節する作用物質をコードし得る。

例えば、作用物質は、ＩＬ−７もしくはＩＬ−１２のようなサイトカインまたはＣＣＬ１９のようなケモカインであり得る。あるいは、作用物質は、サイトカインまたはケモカインの発現または活性に影響し得る。例えば、作用物質は、サイトカインまたはケモカインのドミナントネガティブバージョンであり得る。ドミナントネガティブバージョンは、例えば、サイトカイン／ケモカインの変異または切断バージョンであり得、これは、受容体に結合して野生型サイトカイン／ケモカインと競合するが、サイトカイン／ケモカインシグナル伝達を引き起こさない。

例えば、作用物質は、サイトカイン受容体またはケモカイン受容体のドミナントネガティブバージョンであり得る。ドミナントネガティブバージョンは、例えば、サイトカイン／ケモカイン受容体の変異または切断バージョンであり得、これは、サイトカインに結合して、野生型サイトカイン／ケモカイン受容体へのその結合を遮断する。

あるいは、作用物質は、サイトカインまたはケモカインのシグナル伝達経路を遮断するか、他の方法で調節する、抗体または抗体断片であり得る。

細胞機能を最適化するための選択的発現の使用
本発明の核酸配列または構築物は、例えば、ナイーブ／未分化状態に細胞を維持して、最終分化を低減させるか、または消耗を低減させることにより、細胞機能を最適化するようにデザインし得る。１つまたは複数の遺伝子の発現は、特定のＴ細胞型、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋または制御性Ｔ細胞に合わせて調整し得る。

例えば、細胞は、ＣＡＲまたはＣＡＲ成分を構成的に発現するが、阻害性分子、例えば、切断型ＺＡＰ７０、減弱因子または阻害性ＣＡＲを選択的に発現する、１つの核酸配列を含み得る。Ｔ細胞が消耗した場合にのみ阻害性分子が発現されると、これにより、Ｔ細胞活性が減衰し、さらなる消耗を防ぐ。

本発明を使用して、ＣＡＲの共刺激性ドメインを特定の分化状態に合わせて調整することもできる。例えば、ＣＤ２８共刺激性ドメインを含むＣＡＲまたはＣＡＲ成分は、構成的に発現し得るが、ＯＸ４０または４１ＢＢ共刺激性ドメインを含むＣＡＲまたはＣＡＲ成分は、細胞がエフェクターメモリーに分化する場合にのみ発現し得る。このように、集団動態は、都合の良いセントラルメモリー／ナイーブＴ細胞に偏向させるが、分化の際には、急速に増殖させることが好ましい。

核酸配列
本発明では、上記のＮＯＩを含む核酸配列を提供する。

ＮＯＩは、細胞の分化／消耗の状態に応じて選択的に活性なプロモーターの制御下にあり得る。

核酸は、細胞の、ある特定の分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす、特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は、例えば、５’非翻訳領域に存在し得る。

核酸配列は、上記のように、選択的に活性なプロモーターと１つまたは複数のｍｉＲＮＡ標的配列の両方を含み得る。

ＮＯＩは、それが発現される細胞の微小環境における環境代謝物の存在に応じて選択的に活性なプロモーターの制御下にあり得る。

本明細書において使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、相互に同義であることが意図される。

多種多様なポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝子コードの縮重の結果として同一のポリペプチドをコードすることが可能であることが当業者により理解される。加えて、当業者が、常用技術を使用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチドの置換を行って、ポリペプチドが発現すべき特定の任意の宿主生物のコドン使用を反映させ得ることが理解されるべきである。

本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。これらは、一本鎖または二本鎖であり得る。これらはまた、その中に合成または修飾ヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドへの多種多様な修飾は、当技術分野において公知である。このような修飾は、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加を含む。本明細書に記載する使用の目的のために、ポリヌクレオチドを、当技術分野において利用可能な任意の方法により修飾し得ることが理解されるべきである。このような修飾を行って、目的のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏでの活性または寿命を増強し得る。

ヌクレオチド配列に関する用語「改変体」、「相同体」または「誘導体」は、１つ（または複数）の核酸の、配列から、または配列への任意の置換、変異、修飾、交換、欠失または付加を含む。

核酸配列のキット
本発明ではまた、その少なくとも１つが上記のものである、２つまたはそれよりも多い核酸配列を含むキットを提供する。

キットは、構成的に活性なプロモーターの制御下にある１つの核酸配列、および選択的に活性なプロモーターの制御下にある１つの核酸配列を含み得る。

キットは、選択的に活性な異なるプロモーターの制御下にある２つの核酸配列を含み得る。

キットは、２つの核酸配列を含み得、その１つは特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含み、その１つは含まない。

キットは、異なるｍｉＲＮＡ標的配列を含む２つの核酸配列を含み得る。

一方または両方の核酸配列は、選択的に活性なプロモーターとｍｉＲＮＡ標的配列の組合せを含み得る。

核酸構築物
本発明ではまた、そのうちの少なくとも１つが上記のものである、２つまたはそれよりも多い核酸配列を含む、カセットまたは核酸構築物を提供する。

核酸構築物は、構成的に活性なプロモーターの制御下にある１つの核酸配列、および選択的に活性なプロモーターの制御下にある１つの核酸配列を含み得る。

核酸構築物は、選択的に活性な異なるプロモーターの制御下にある２つの核酸配列を含み得る。

核酸構築物は、２つの核酸配列を含み得、その１つは特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含み、その１つは含まない。

核酸構築物は、異なるｍｉＲＮＡ標的配列を含む２つの核酸配列を含み得る。

一方または両方の核酸配列は、選択的に活性なプロモーターとｍｉＲＮＡ標的配列の組合せを含み得る。

発現カセットは、分割転写系を組み込むように改変することができる。例えば、ベクターにより、２つの別々の転写物を発現させることができる。図５（ｂ）に示す配置では、５’の選択的に活性なプロモーターが、長い転写物の転写を駆動し、ここで第１のオープンリーディングフレームは、選択的に発現される第１のタンパク質をコードする。これより下流では、第１のプロモーターと同一方向の第２の構成的に活性なプロモーターが、より短い転写物の転写を駆動し、第２のオープンリーディングフレームは、構成的に発現される第２のタンパク質をコードする。両方の転写物は、同一のポリＡアデニル化シグナルを共有する。

あるいは、２つの別々のプロモーターは、２つの独立した転写物の発現を駆動することができる。転写物は、図５（ｃ）に示すように、ヘッドトゥーヘッドに方向付けられ得、一方の転写物はセンス鎖から読み取られ、他方の転写物はアンチセンス鎖から読み取られる。あるいは、図５（ｄ）に示すように、構成的に活性な双方向性プロモーターを使用し得、２つの転写物の転写を逆方向に生じる。各転写物は、別々のｍｉＲＮＡ標的配列により制御される。

Ｔ細胞は、プロモーターもしくはｍｉＲＮＡ標的配列、または両方によって制御される発現が独立したカセットと組み合わせて改変することができる。

より好都合には、Ｔ細胞は、種々の導入遺伝子の示差的発現を可能とする、単一のカセットを用いて改変することができる。例えば、レトロウイルスベクターカセットは、２つの転写物を転写することができ、その１つは構成的に発現し、その１つは条件的に発現される。

特異的プロモーターまたはｍｉＲＮＡ標的ドメインは、場合により、不十分な選択的発現を生じ得る。当業者は、発現カセットの複雑性を上昇させて、発現の選択性を高めることができる。例えば、特異的プロモーターおよび特異的ｍｉＲＮＡ標的化ドメインを組み合わせることができる。あるいは、種々の転写単位間のフィードフォワードおよびフィードバックループを利用して、発現の選択性を厳密にすることができる。

単純な転写スイッチは、良好な抑制または活性化をもたらす。しかし、これらは、目的の遺伝子を完全にオフまたはオンにすることを妨げる、漏出性を示すことが多い。一部の場合では、この漏出性は、必要とされるプロファイルに許容されるが、一部の適用では、より厳密なスイッチが必要とされる。転写スイッチは、誘導型発現（選択的プロモーター）をｓｈＲＮＡとカップリングさせ、これが、誘導性転写物に作用する構成的に活性な抑制因子に対抗して作用するように改変することができる。このような系は、誘導型発現が、完全にオフ／オンされるように改変することができ、正確な転写活性レベルで切り換えるように調整することができる（Ｄｅａｎｓ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｃｅｌｌ １３０：３６３−３７２）。

ベクター／ベクターのキット
本発明ではまた、本発明の１つまたは複数の核酸配列または核酸構築物を含む、ベクターまたはベクターのキットを提供する。このようなベクターを使用して核酸配列または構築物を宿主細胞に導入し得、これにより、この宿主細胞がＮＯＩを発現する。

ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンをベースとしたベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。

ベクターは、細胞にトランスフェクトまたは形質導入することが可能であり得る。

細胞
本発明の細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得る。

ＴまたはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血（第１者）、またはドナー末梢血由来の造血幹細胞移植片の設定において（第２者）、または無関係なドナー由来の末梢血（第３者）に由来し得る。ＴまたはＮＫ細胞は、活性化および／または増殖した後に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体による処置により、本発明の第１の態様によるＣＡＲ系を生じる分子をコードする核酸を形質導入し得る。

あるいは、ＴまたはＮＫ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのｅｘ ｖｉｖｏでの分化により誘導し得る。あるいは、その溶解性機能を維持する不死化Ｔ細胞株を使用し得る。

細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）であり得る。ＨＳＣは、薬理学的用量のサイトカイン、例えば、Ｇ−ＣＳＦ［末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）］の投与による動員後の末梢血の白血球フェレーシスにより、適切に適合するドナーの骨髄から、または出産後の胎盤から採取した臍帯血（ＵＣＢ）から、移植のために入手することができる。骨髄、ＰＢＳＣまたはＵＣＢは、処理せずに移植し得るか、またはＨＳＣは、モノクローナル抗体によるＣＤ３４表面抗原に対する免疫選択により濃縮され得る。

細胞を生成するための方法
ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多くの方法のうちの１つによって、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより、生成し得る。

本発明の細胞は、
（ｉ）被験体または上に列挙した他の供給源のうちの１つからの、細胞を含む試料の単離、および
（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの上に定義する１つまたは複数の核酸配列または核酸構築物の細胞への形質導入またはトランスフェクション
により生成し得る。

次いで、細胞は、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択されることにより精製され得る。

医薬組成物
本発明はまた、本発明の複数の細胞を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。このような製剤は、例えば、静脈内注入に適する形態であり得る。

処置の方法
本発明では、本発明の細胞を（例えば、上記の医薬組成物により）被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。

疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。この点に関して、細胞は、疾患または状態が存在している被験体に投与して、疾患と関連する少なくとも１つの症状を軽減、低減もしくは改善し、および／または疾患の進行を減速、低減もしくは遮断し得る。

疾患を予防するための方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。この点に関して、細胞は、疾患にまだ罹患していない、および／または疾患のいかなる症状も示していない被験体に投与して、疾患の原因を予防もしくは減損し、または疾患と関連する少なくとも１つの症状の発症を低減または予防し得る。被験体は、疾患の素因を有するか、または疾患の発症リスクがあると考えられ得る。

方法は、
（ｉ）細胞を含む試料の単離、
（ｉｉ）本発明により提供する核酸配列またはベクターの、このような細胞への形質導入またはトランスフェクション、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞の被験体への投与
のステップを含み得る。

本発明では、疾患の処置および／または予防における使用のための本発明の細胞を提供する。

本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の細胞の使用に関する。

本発明の方法により処置および／または予防すべき疾患は、感染、例えば、ウイルス感染であり得る。

本発明の方法はまた、例えば、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶における、病原性免疫応答の制御のためであり得る。

方法は、癌性疾患、例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎がん（腎細胞）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵がん、前立腺がん、および甲状腺がんの処置のためであり得る。

本発明のＣＡＲ細胞は、標的細胞、例えば、がん細胞を殺傷することが可能であり得る。標的細胞は、ＴＡＡの発現、例えば、上記の表１に提示するＴＡＡの発現により認識可能であり得る。

ここで本発明を実施例によりさらに説明するが、これは、本発明の実行において当業者の役に立つようになっているが、本発明の範囲を限定することは決して意図されない。

（実施例１ 種々のＴ細胞サブセットにおける様々なプロモーターの制御下でのレポーター遺伝子発現の調査）
ＡＰ１／ＳＲＥ／ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ５応答性プロモーターをレポーター遺伝子ｅＧＦＰのコード配列の上流にクローニングした、自己不活型レトロウイルスベクターを構築した。この第１のオープンリーディングフレームの後には、ＰＧＫプロモーターおよびＲＱＲ８細胞表面マーカーをコードする第２のコード配列を配置する。正常ドナー由来の初代ヒトＴ細胞に、レトロウイルスベクターを形質導入し、３μｇ／ｍＬのＰＨＡおよび５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で７２時間刺激するか、または刺激せずに放置した。細胞のメモリー表現型について、フローサイトメトリーにより解析した。結果を図９に示す。種々のメモリーコンパートメント（ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリーおよびエフェクター）は、ＰＨＡおよびＩＬ−２による刺激後に形質導入した種々のＴ細胞間で異ならない。

種々のメモリーサブセットのｅＧＦＰ発現レベルをまた解析した。結果を図１０に示す。種々の応答エレメントが、メモリーサブセットに応じて種々のパターンのｅＧＦＰの上方制御を誘導したことが見出され、ＡＰ１およびＳＴＡＴ３応答性プロモーターは、主に、エフェクターメモリーコンパートメントにおいてｅＧＦＰ発現を誘導したが、ＳＲＥおよびＳＴＡＴ５応答性プロモーターは、ナイーブおよびエフェクターメモリーサブセットの両方においてｅＧＦＰの上方制御を示した。

（実施例２ 種々のＴ細胞サブセットにおけるＣＲＥＢ応答性プロモーターの制御下でのレポーター遺伝子発現の調査）
ＣＲＥＢ応答性プロモーターをレポーター遺伝子ｅＧＦＰのコード配列の上流にクローニングした、自己不活型レトロウイルスベクターを構築した。この第１のオープンリーディングフレームの後には、ＰＧＫプロモーターおよびＲＱＲ８細胞表面マーカーをコードする第２のコード配列を配置する。正常ドナー由来の初代ヒトＴ細胞に、レトロウイルスベクターを形質導入し、ＰＨＡで２４時間刺激するか、または刺激せずに放置した。細胞のメモリー表現型およびｅＧＦＰ発現について、フローサイトメトリーにより解析した。結果を図１１および１２に示す。ＣＲＥＢ応答性プロモーターは、エフェクターメモリーおよびエフェクター細胞サブセットにおいてｅＧＦＰの上方制御を誘導した。

（実施例３ ＣＤ４＋Ｔ細胞において示差的に共刺激する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞のデザインおよび構築）
自己不活型レトロウイルスベクターを構築し、これにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞に特異的な初期プロモーターを第１のＣＡＲのコード配列の上流にクローニングする。この第１のＣＡＲは、ｆｍｃ６３由来の抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８スペーサーおよびＣＤ２８−ＣＤ３Ｚエンドドメインを使用して構築する。ＰＧＫプロモーターを、この第１のコード配列から下流にクローニングする。第２のＣＡＲをコードする第２のコード配列を、ＰＧＫプロモーターから下流にクローニングする。この第２のＣＡＲは、ｈｄ３７由来の抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８スペーサーおよび４１ＢＢ−ＣＤ３Ｚエンドドメインを使用して構築する。このレトロウイルスカセットにより、ｈｄ３７／４１ＢＢ−ＣＤ３Ｚ ＣＡＲの発現をすべての細胞において生じるはずであるが、加えて、ｆｍｃ６３／ＣＤ２８−ＣＤ３Ｚ ＣＡＲが、ＣＤ４＋Ｔ細胞において選択的に発現されるはずである。Ｔ細胞にレトロウイルスベクターを形質導入する。正常ドナー由来の初代ヒトＴ細胞に、このレトロウイルスベクターを形質導入する。２つのＣＡＲの示差的発現を、フローサイトメトリーにより決定する。ＣＤ１９に対する２つの異なるｓｃＦｖの使用によって、２つの異なる抗イディオタイプ抗体を使用したフローサイトメトリーによる、独立した発現の検証が可能となる。このようなＴ細胞の性能は、４１ＢＢ−ＣＤ３ＺまたはＣＤ２８−ＺのいずれかのＣＡＲを発現する単純なベクターを形質導入したＴ細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養において、およびＮＡＬＭ６のＮＳＧマウスへの異種移植モデルにおいても比較する。

（実施例４ ナイーブおよびセントラルメモリーＴ細胞において示差的に共刺激する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞のデザインおよび構築）
自己不活型レトロウイルスベクターを構築し、これにより、ＣＤ１２７特異的プロモーターを第１のＣＡＲのコード配列の上流にクローニングする。この第１のＣＡＲは、ｆｍｃ６３由来の抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８スペーサーおよびＣＤ２８−ＣＤ３Ｚエンドドメインを使用して構築する。ＰＧＫプロモーターを、この第１のコード配列から下流にクローニングする。第２のＣＡＲをコードする第２のコード配列を、ＰＧＫプロモーターから下流にクローニングする。この第２のＣＡＲは、ｈｄ３７由来の抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８スペーサーおよび４１ＢＢ−ＣＤ３Ｚエンドドメインを使用して構築する。このレトロウイルスカセットにより、ｈｄ３７／４１ＢＢ−ＣＤ３Ｚ ＣＡＲの発現をすべての細胞において生じるはずであるが、加えて、ｆｍｃ６３／ＣＤ２８−ＣＤ３Ｚ ＣＡＲが、ナイーブおよびセントラルメモリーＴ細胞において選択的に発現されるはずである。Ｔ細胞にレトロウイルスベクターを形質導入する。正常ドナー由来の初代ヒトＴ細胞に、このレトロウイルスベクターを形質導入する。２つのＣＡＲの示差的発現を、フローサイトメトリーにより決定する。ＣＤ１９に対する２つの異なるｓｃＦｖの使用によって、２つの異なる抗イディオタイプ抗体を使用したフローサイトメトリーによる、独立した発現の検証が可能となる。このようなＴ細胞の性能は、４１ＢＢ−ＣＤ３ＺまたはＣＤ２８−ＺのいずれかのＣＡＲを発現する単純なベクターを形質導入したＴ細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養において、およびＮＡＬＭ６のＮＳＧマウスへの異種移植モデルにおいても比較する。

（実施例５ Ｔ細胞分化状態に応じてＩＬ−２を示差的に発現する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞のデザインおよび構築）
自己不活型レトロウイルスベクターを構築し、これにより、ＥＯＭＥＳ応答性プロモーターを構成的に活性なＩＬ２構築物のコード配列の上流にクローニングする。この第１のオープンリーディングフレームの後には、ＰＧＫプロモーターを配置する。ＣＡＲをコードする第２のコード配列を、ＰＧＫプロモーターから下流にクローニングする。このＣＡＲは、ｈｄ３７由来の抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８スペーサーおよび４１ＢＢ−ＣＤ３Ｚエンドドメインを使用して構築する。このレトロウイルスカセットにより、ＩＬ２構築物の発現を分化Ｔ細胞において生じるが、ナイーブまたはセントラルメモリーＴ細胞においては生じないはずである。ＣＡＲは、すべてのＴ細胞において発現されるはずである。正常ドナー由来の初代ヒトＴ細胞に、このレトロウイルスベクターを形質導入する。２つの構築物の示差的発現を、フローサイトメトリーにより決定する。このようなＴ細胞の性能は、ＣＡＲ単独またはＩＬ２構築物の共発現を制御しないＣＡＲのいずれかを発現する単純なベクターを形質導入したＴ細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養において、およびＮＡＬＭ６のＮＳＧマウスへの異種移植モデルにおいても比較する。

（実施例６ キヌレニンの存在に対して感受性のＣＡＲ−Ｔ細胞のデザインおよび構築）
キヌレニンは、アミノ酸トリプトファンから酵素ＩＤＯの作用により合成される免疫抑制代謝物である。腫瘍細胞により発現されるＩＤＯは、固形腫瘍の微小環境において高レベルのキヌレニンをもたらすことが多く、次いで、このキヌレニンは、高度に免疫抑制性の環境を生成し、これにより、腫瘍反応性ＣＡＲ Ｔ細胞の機能が阻害されて腫瘍拒絶が妨げられる。ＣＡＲ Ｔ細胞がキヌレニンの存在に反応可能な機構を、望ましい導入遺伝子を発現させることによりデザインすると、このようなＴ細胞が、キヌレニンにより媒介される免疫抑制を克服することが可能となる。

形質導入マーカー、例えば、ＲＱＲ８に結合するキヌレニン応答性プロモーターの制御下、および構成的に活性なプロモーター、例えば、ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーターの制御下にある、所望の導入遺伝子からなるレトロウイルス構築物を生成する。３つのキヌレニン応答性導入遺伝子：蛍光マーカータンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；特定のリガンドに対するＣＡＲ、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ；およびキヌレニンがＣＡＲ Ｔ細胞機能を抑制することを防ぐ酵素、キヌレニナーゼについて調査する。

キヌレニン応答性プロモーター（配列番号１６）の制御下にあるＧＦＰの場合では、形質導入したＴ細胞は、０μＭ（キヌレニンなし）、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび５０μＭの濃度のキヌレニンにおいて、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間および２４時間を含む様々な時間培養する。キヌレニンにより誘導されるＧＦＰの発現は、このような細胞を各時点で形質導入マーカー（ＲＱＲ８）について共染色し、このマーカーとＧＦＰとの共発現を、キヌレニン処理細胞において、キヌレニンに曝露していない対照細胞と比較して評価することにより測定する。ＧＦＰ発現の強度は、誘導の強さを反映する。

キヌレニンにより誘導される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現の場合では、形質導入したＴ細胞は、０μＭ（キヌレニンなし）、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび５０μＭの濃度の増加量のキヌレニンの存在下で、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間および２４時間を含む様々な時間培養する。次いで、Ｔ細胞の表面上でキヌレニンにより誘導されるＣＡＲの発現は、機能アッセイにおいて、ＣＡＲ Ｔ細胞応答を評価することにより測定する。形質導入したＴ細胞は、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞（Ｂ細胞由来腫瘍株）と４：１、１：１および１：４のＴ細胞：標的比で、２４時間および７２時間共培養する。次いで、このような共培養物を、Ｔ細胞マーカーＣＤ３、形質導入マーカーＲＱＲ８、および生存色素、例えば、７−ＡＡＤによる細胞生存度について染色する。生標的細胞は、それらがＣＤ３およびＲＱＲ８を欠くこと、ならびにそれらが７−ＡＡＤを排除することにより同定する。生標的細胞は、各共培養条件について数え上げ、キヌレニンに曝露していないためＣＡＲにより媒介される殺傷が生じていないＴ細胞との共培養物と比較する。このような共培養物の上清はまた、Ｔ細胞サイトカインＩＦＮガンマおよびＩＬ２のレベルについて、特定のＥＬＩＳＡにより評価する。発現されるＣＡＲにより、ＣＤ１９を発現する標的に応答してＴ細胞の活性化が引き起こされるため、キヌレニンにより誘導されるＣＡＲ発現により、このようなサイトカインのレベルが共培養物上清において上昇すると予想される。

キヌレニナーゼの場合では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲに結合するキヌレニン応答性プロモーター（配列番号１６）の制御下、および構成的に活性なプロモーター、例えば、ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーターの制御下にある、キヌレニナーゼからなるレトロウイルス構築物を生成する。キヌレニンにより誘導されるキヌレニナーゼとＣＡＲとを共発現する形質導入したＴ細胞は、０μＭ（キヌレニンなし）、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび５０μＭの濃度のキヌレニンの存在下で、ＣＤ１９発現Ｒａｊｉ細胞と４：１、１：１および１：４のＴ細胞：標的比で、２４時間または７２時間共培養する。ＣＡＲにより媒介されるＲａｊｉ細胞の殺傷は、上記のような時点で、ＩＦＮガンマおよびＩＬ２の分泌とともに評価する。キヌレニンは、ＣＡＲ機能を阻害し、この阻害は、キヌレニナーゼの誘導および発現の際に防止され得ると予想される。

上記の明細書で言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。記載される本発明の方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と関連して説明したが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、本発明を実行するための記載の方法の様々な修飾は、分子生物学または関連する分野の当業者に明白であり、これらは、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (55)

1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞であって、
   ｉ）前記細胞の分化／消耗状態、または
   ｉｉ）前記細胞の微小環境における環境代謝物の存在
   に応じて前記細胞により選択的に発現される目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含む、細胞。
2. 前記ＮＯＩが、ＣＤ４＋Ｔ細胞において選択的に発現される、請求項１に記載の細胞。
3. 前記ＮＯＩが、ＣＤ８＋Ｔ細胞において選択的に発現される、請求項１に記載の細胞。
4. 前記ＮＯＩが、制御性Ｔ細胞において選択的に発現される、請求項１に記載の細胞。
5. ＮＯＩが、ナイーブＴ細胞において選択的に発現される、請求項１に記載の細胞。
6. ＮＯＩが、セントラルメモリーＴ細胞において選択的に発現される、請求項１に記載の細胞。
7. ＮＯＩが、エフェクターメモリーＴ細胞において選択的に発現される、請求項１に記載の細胞。
8. 前記ＮＯＩが、エフェクターＴ細胞において選択的に発現される、請求項１に記載の細胞。
9. 前記ＮＯＩが、消耗したＴ細胞において選択的に発現される、請求項１に記載の細胞。
10. ＮＯＩが、選択的に活性なプロモーターの制御下にある、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
11. 前記細胞におけるＮＯＩの発現がｍｉＲＮＡにより制御されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１から９のいずれかに記載の細胞。
12. 前記ＮＯＩの発現が、選択的に活性なプロモーターおよびｍｉＲＮＡ標的配列の制御下にある、請求項１０または１１に記載の細胞。
13. 前記ＮＯＩが、前記細胞の微小環境における環境代謝物の存在に応じて選択的に発現され、前記環境代謝物が、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）を活性化する、請求項１０に記載の細胞。
14. 前記環境代謝物が、トリプトファン代謝物である、請求項１３に記載の細胞。
15. 前記環境代謝物が、キヌレニンである、請求項１４に記載の細胞。
16. 前記ＮＯＩが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
17. 前記ＮＯＩが、ＣＡＲ成分をコードする、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞。
18. 前記ＣＡＲ成分が、受容体成分および細胞内シグナル伝達成分から選択される、請求項１７に記載の細胞。
19. 前記ＮＯＩが、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞。
20. 前記ＮＯＩが、ＣＡＲまたはＴＣＲの活性を調節する作用物質をコードする、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞。
21. 前記ＣＡＲまたはＴＣＲの活性を調節する作用物質が、シグナル伝達修飾タンパク質、減弱因子；阻害性ＣＡＲ、およびサイトカインシグナル伝達ドメインから選択される、請求項２０に記載の細胞。
22. 前記ＮＯＩが、前記細胞の活性を調節する作用物質をコードする、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞。
23. 前記細胞の活性を調節する作用物質が、サイトカイン、接着分子および転写因子から選択される、請求項２２に記載の細胞。
24. 標的細胞上の標的抗原を結合するＣＡＲまたはＴＣＲを発現し、前記ＮＯＩが、前記標的細胞の活性を調節する作用物質をコードする、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞。
25. 前記作用物質が、毒素を含む、請求項２４に記載の細胞。
26. 標的細胞上の標的抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲを発現し、前記ＮＯＩが、前記標的細胞の微小環境を調節する作用物質をコードする、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞。
27. 前記作用物質が、ケモカインもしくはサイトカインであるか、またはサイトカインもしくはケモカインにより媒介されるシグナル伝達に影響する作用物質である、請求項２６に記載の細胞。
28. プロモーターの制御下にある目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含む核酸配列であって、前記プロモーターは、前記ＮＯＩが発現される細胞の分化／消耗状態に応じて選択的に活性である、核酸配列。
29. プロモーターの制御下にある目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含む核酸配列であって、前記プロモーターは、前記ＮＯＩが発現される細胞の微小環境における環境代謝物の存在に応じて選択的に活性である、核酸配列。
30. 目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）、および特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含む核酸配列であって、前記特異的ｍｉＲＮＡ標的配列は、前記核酸配列が発現される細胞のある特定の分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす、核酸配列。
31. 前記ＮＯＩの発現が、前記ＮＯＩが発現される細胞の分化／消耗状態に応じて選択的に活性なプロモーターの制御下にあり、前記核酸配列が、前記核酸配列が発現される細胞のある特定の分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項３０に記載の核酸配列。
32. 請求項２８から３１のいずれかに記載の核酸配列を含む核酸配列のキット。
33. （ｉ）構成的に活性なプロモーターの制御下にある第１の核酸配列、および
    （ｉｉ）第２の核酸配列であって、前記第２の核酸配列が発現される細胞の分化／消耗状態、または前記第２の核酸配列が発現される細胞の微小環境における環境代謝物の存在のいずれかに応じて、選択的に活性なプロモーターの制御下にある第２の核酸配列
    を含む、請求項３２に記載の核酸配列のキット。
34. 第１の選択的に活性なプロモーターの制御下にある第１の核酸配列、および第２の選択的に活性なプロモーターの制御下にある第２の核酸配列を含み、前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、前記核酸配列のキットが発現される細胞の異なる分化／消耗状態において活性である、請求項３２に記載の核酸配列のキット。
35. （ｉ）第１の核酸配列であって、前記核酸配列が発現される細胞のある特定の分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含む第１の核酸配列、および
    （ｉｉ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を欠く第２の核酸配列
    を含む、請求項３２に記載の核酸配列のキット。
36. 第１のｍｉＲＮＡ標的配列を有する第１の核酸配列、および第２のｍｉＲＮＡ標的配列を有する第２の核酸配列を含み、前記第１のｍｉＲＮＡ標的配列および前記第２のｍｉＲＮＡ標的配列が、前記核酸配列のキットが発現される細胞の異なる分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす、請求項３２に記載の核酸配列のキット。
37. 請求項２８から３１のいずれかに記載の核酸配列を含む、核酸構築物。
38. （ｉ）構成的に活性なプロモーターの制御下にある第１の核酸配列、および
    （ｉｉ）第２の核酸配列であって、前記第２の核酸配列が発現される細胞の分化／消耗状態、または前記第２の核酸配列が発現される細胞の微小環境における環境代謝物の存在のいずれかに応じて、選択的に活性なプロモーターの制御下にある第２の核酸配列
    を含む、請求項３７に記載の核酸構築物。
39. 第１の選択的に活性なプロモーターの制御下にある第１の核酸配列、および第２の選択的に活性なプロモーターの制御下にある第２の核酸配列を含み、前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、前記核酸構築物が発現される細胞の異なる分化／消耗状態において活性である、請求項３７に記載の核酸構築物。
40. （ｉ）前記核酸構築物が発現される細胞のある特定の分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を含む第１の核酸配列、および
    （ｉｉ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列を欠く第２の核酸配列
    を含む、請求項３７に記載の核酸構築物。
41. 第１のｍｉＲＮＡ標的配列を有する第１の核酸配列、および第２のｍｉＲＮＡ標的配列を有する第２の核酸配列を含み、前記第１のｍｉＲＮＡ標的配列および前記第２のｍｉＲＮＡ標的配列が、前記核酸構築物が発現される細胞の異なる分化／消耗状態において転写物分解を引き起こす、請求項３７に記載の核酸構築物。
42. 前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が、構成的に活性な双方向性プロモーターの制御下にある、請求項４１に記載の核酸構築物。
43. 前記第１の核酸配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲ成分または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、前記第２の核酸配列が、阻害性分子をコードし、ここで前記核酸構築物がＴ細胞において発現されると、前記ＣＡＲ、ＣＡＲ成分またはＴＣＲが構成的に発現されるが、前記Ｔ細胞が消耗すると、前記阻害性分子が選択的に発現され、前記阻害性分子が、ＣＡＲまたはＴＣＲの活性の低下を引き起こす、請求項３８に記載の核酸構築物。
44. 前記阻害性分子が、１つまたは複数のＩＴＡＭ結合ドメインを含むが、キナーゼドメインを欠く、切断型ＺＡＰ７０を含む、請求項４３に記載の核酸構築物。
45. 前記第１の核酸配列が、ＣＤ２８共刺激性ドメインを含むＣＡＲまたはＣＡＲ成分をコードし、前記第２の核酸配列が、ＯＸ４０または４１ＢＢ共刺激性ドメインを含むＣＡＲまたはＣＡＲ成分をコードし、ここで前記核酸構築物がＴ細胞において発現されると、第１のＣＡＲまたはＣＡＲ成分が構成的に発現されるが、前記細胞がエフェクターメモリーまたはエフェクター状態にあると、第２のＣＡＲまたはＣＡＲ成分が選択的に発現される、請求項３８に記載の核酸構築物。
46. 前記第１の核酸配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲ成分または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、前記第２の核酸配列が、サイトカインをコードし、ここで前記核酸構築物がＴ細胞において発現されると、前記ＣＡＲ、ＣＡＲ成分またはＴＣＲが構成的に発現されるが、前記Ｔ細胞の微小環境における環境代謝物の存在下で前記サイトカインが選択的に発現される、請求項３８に記載の核酸構築物。
47. 請求項２８から３１のいずれかに記載の核酸配列、請求項３２から３６のいずれかに記載の核酸配列のキット、または請求項３７から４６のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
48. 請求項１から２５のいずれかに記載の細胞を生成するための方法であって、請求項２８から３１のいずれかに記載の核酸配列、請求項３２から３６のいずれかに記載の核酸配列のキット、請求項３７から４６のいずれかに記載の核酸構築物、または請求項４７に記載のベクターを細胞に導入するステップを含む、方法。
49. 前記細胞が、被験体から単離した試料に由来する、請求項４８に記載の方法。
50. 請求項１から２５のいずれかに記載の複数の細胞を含む医薬組成物。
51. 疾患の処置および／または予防における使用のための、請求項５０に記載の医薬組成物。
52. 請求項５０に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
53. 次のステップ：
    （ｉ）細胞を含む試料の単離、
    （ｉｉ）請求項２８から３１のいずれかに記載の核酸配列、請求項３２から３６のいずれかに記載の核酸配列のキット、請求項３７から４６のいずれかに記載の核酸構築物、または請求項４７に記載のベクターの前記細胞への形質導入またはトランスフェクション、および
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞の被験体への投与
    を含む、請求項５２に記載の方法。
54. 疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、請求項５０に記載の医薬組成物の使用。
55. 前記疾患が、がんである、請求項５１に記載の使用のための医薬組成物、請求項５２もしくは５３に記載の方法、または請求項５４に記載の使用。
    
    

Images