JP7054181B2 - キメラ抗原受容体 - Google Patents
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Description
(1)NKp44の免疫グロブリンドメインと、膜貫通ドメインと、活性化シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体。
(2)細胞外ヒンジドメインをさらに含む、(1)に記載のキメラ抗原受容体。
(3)共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、(1)又は(2)に記載のキメラ抗原受容体。
(4)前記活性化シグナル伝達ドメインがCD3ζの活性化シグナルドメインを含む、(1)~(3)のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(5)前記膜貫通ドメインが、NKp44、CD8α、及びCD28からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、(1)~(4)のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(6)前記細胞外ヒンジドメインが、NKp44、CD8α、及びCD28からなる群より選択されるタンパク質の細胞外ヒンジドメインを含む、(2)~(5)のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(7)前記共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BB及びCD28からなる群より選択されるタンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、(1)~(6)のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(8)配列番号30、32、34、36又は38に記載のアミノ酸配列のN末端から22番目以降C末端までのアミノ酸配列を含む、(1)に記載のキメラ抗原受容体。
(9)(1)~(8)のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
(10)(9)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(11)(1)~(8)のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
(12)T細胞又はナチュラルキラー細胞である、(11)に記載の細胞。
(13)(9)に記載のポリヌクレオチド又は(10)に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
(14)前記細胞がT細胞又はナチュラルキラー細胞である、(13)に記載の製造方法。
(15)(11)又は(12)に記載の細胞を含む、医薬組成物。
(16)(11)又は(12)に記載の細胞を含む、腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物。
1実施形態において、本発明は、NKp44の免疫グロブリンドメインと、膜貫通ドメインと、活性化シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体を提供する。
本実施形態のCARは、リガンド結合ドメインとして、NKp44の免疫グロブリンドメインを含む。
(i)配列番号4のN末端から22~130番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(ii)(i)のアミノ酸配列と比較して、1~30個、1~20個、1~10個、又は1~5個、又は1~3個程度の変異を有し、かつNKp44リガンドに対する結合能を有するポリペプチド(前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい);
(iii)(i)のアミノ酸配列と、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の配列同一性(相同性)を有するアミノ酸配列を含み、かつNKp44リガンドに対する結合能を有するポリペプチド;並びに
(iv)(i)のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつNKp44リガンドに対する結合能を有するポリペプチド(前記複数個とは、2~30個であり、好ましくは2~20個であり、より好ましくは2~10個であり、さらに好ましくは2~5個である)。
本実施形態のCARは、少なくとも1つの膜貫通ドメインを有する。本実施形態のCARに使用可能な膜貫通ドメインは、細胞膜を貫通する機能を有するポリペプチドであれば特に限定されない。膜貫通ドメインは、天然タンパク質に由来するものであってもよく、人為的に設計したものであってもよい。天然タンパク質に由来する膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質から取得することができる。本実施形態のCARにおいて、膜貫通ドメインは、NKp44免疫グロブリンドメインに対するリガンドの結合に対応して、活性化シグナル伝達ドメインに活性化シグナルを伝達し得る。
(i)天然タンパク質由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列と比較して、1~30個、1~20個、1~10個、又は1~5個、又は1~3個程度の変異を有し、かつ膜貫通能を有するポリペプチド(前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい);
(ii)天然タンパク質由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列と、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の配列同一性(相同性)を有するアミノ酸配列を含み、かつ膜貫通能を有するポリペプチド;並びに
(iii)天然タンパク質由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通能を有するポリペプチド(前記複数個とは、2~30個であり、好ましくは2~20個であり、より好ましくは2~10個であり、さらに好ましくは2~5個である)。
本実施形態のCARは、少なくとも1つの活性化シグナル伝達ドメインを含む。T細胞は、TCRにMHC・ペプチド複合体が結合すると、TCR・CD3複合体を介して細胞内にシグナルが伝達され、様々なリン酸化シグナルが惹起される(一次シグナル伝達)。本明細書において、「活性化シグナル伝達ドメイン」とは、上記のようなTCRに対する抗原ペプチドの結合によって誘導される一次シグナル伝達に関与するタンパク質の、当該シグナル伝達に関与するドメインを意味する。
(i)天然タンパク質由来の活性化シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列と比較して、1~30個、1~20個、1~10個、又は1~5個、又は1~3個程度の変異を有し、かつ一次シグナル伝達能を有するポリペプチド(前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい);
(ii)天然タンパク質由来の活性化シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列と、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の配列同一性(相同性)を有するアミノ酸配列を含み、かつ一次シグナル伝達能を有するポリペプチド;並びに
(iii)天然タンパク質由来の活性化シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一次シグナル伝達能を有するポリペプチド(前記複数個とは、2~30個であり、好ましくは2~20個であり、より好ましくは2~10個であり、さらに好ましくは2~5個である)。
本実施形態のCARは、NKp44の免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び活性化シグナル伝達ドメインに加えて、他のドメインを含むこともできる。他のドメインの例としては、細胞外ヒンジドメイン、共刺激伝達ドメイン、シグナルペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
本実施形態のCARは、好ましい態様において、細胞外ヒンジドメインを含み得る。本明細書において、「細胞外ヒンジドメイン」とは、細胞外のリガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結するドメインを意味する。細胞外ヒンジドメインは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインを連結できるものであれば特に限定されない。天然タンパク質に由来するものであってもよく、人為的に設計されたものであってもよい。細胞外ヒンジドメインは、例えば、10~300個程度のアミノ酸、好ましくは20~100個程度のアミノ酸で構成することができる。細胞外ヒンジドメインは、NKp44の免疫グロブリンドメインのリガンド結合能を妨げず、かつ活性化シグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達を妨げないものであることが好ましい。
(i)天然タンパク質由来の細胞外ヒンジドメインのアミノ酸配列と比較して、1~20個、1~10個、又は1~5個、又は1~3個程度の変異を有し、かつNKp44免疫グロブリンドメインと膜貫通ドメインとを連結可能なポリペプチド(前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい);
(ii)天然タンパク質由来の細胞外ヒンジドメインのアミノ酸配列と、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の配列同一性(相同性)を有するアミノ酸配列を含み、かつNKp44免疫グロブリンドメインと膜貫通ドメインとを連結可能なポリペプチド;並びに
(iii)天然タンパク質由来の細胞外ヒンジドメインのアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつNKp44免疫グロブリンドメインと膜貫通ドメインとを連結可能なポリペプチド(前記複数個とは、2~30個であり、好ましくは2~20個であり、より好ましくは2~10個であり、さらに好ましくは2~5個である)。
本実施形態のCARは、一態様において、共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。T細胞上に発現する共刺激分子は、抗原提示細胞上に発現する各共刺激分子に特異的なリガンドとの結合により、細胞内に共刺激シグナルを伝達し、T細胞の活性化を補助することが知られている(二次シグナル伝達)。本明細書において、「共刺激シグナル伝達ドメイン」とは、上記のような共刺激分子の共刺激シグナル伝達に関与する細胞内ドメインを意味する。
(i)天然タンパク質由来の共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列と比較して、1~30個、1~20個、1~10個、又は1~5個、又は1~3個程度の変異を有し、かつ共刺激シグナル伝達能を有するポリペプチド(前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい);
(ii)天然タンパク質由来の共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列と、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の配列同一性(相同性)を有するアミノ酸配列を含み、かつ共刺激シグナル伝達能を有するポリペプチド;並びに
(iii)天然タンパク質由来の共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ共刺激シグナル伝達能を有するポリペプチド(前記複数個とは、2~30個であり、好ましくは2~20個であり、より好ましくは2~10個であり、さらに好ましくは2~5個である)。
本実施形態のCARは、一態様において、シグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、膜タンパク質や分泌タンパク質の局在化を指示するペプチドである。シグナルペプチドは、一般的に、膜タンパク質のN末端に存在する5~60個程度のアミノ酸からなるペプチドであり、局在化の完了した成熟タンパク質では除去されている。
本実施形態のCARにおいて、NKp44免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び活性化シグナル伝達ドメインは、前記の順番でN末端側から配置される。これらの各ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、他のドメインやスペーサー配列等を介して連結されていてもよい。
(b)NKp44の免疫グロブリンドメインと、NKp44の細胞外ヒンジドメインと、NKp44の膜貫通ドメインと、NKp44の活性化シグナル伝達ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(c)NKp44の免疫グロブリンドメインと、NKp44の細胞外ヒンジドメインと、NKp44の膜貫通ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(d)NKp44の免疫グロブリンドメインと、NKp44の細胞外ヒンジドメインと、CD8αの膜貫通ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(e)NKp44の免疫グロブリンドメインと、CD8αの細胞外ヒンジドメインと、CD8αの膜貫通ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(f)NKp44の免疫グロブリンドメインと、NKp44の細胞外ヒンジドメインと、CD28の膜貫通ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(g)NKp44の免疫グロブリンドメインと、CD28の細胞外ヒンジドメインと、CD28の膜貫通ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(h)NKp44の免疫グロブリンドメインと、NKp44の細胞外ヒンジドメインと、CD8αの膜貫通ドメインと、4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(i)NKp44の免疫グロブリンドメインと、CD8αの細胞外ヒンジドメインと、CD8αの膜貫通ドメインと、4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(j)NKp44の免疫グロブリンドメインと、NKp44の細胞外ヒンジドメインと、CD28の膜貫通ドメインと、4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(k)NKp44の免疫グロブリンドメインと、CD28の細胞外ヒンジドメインと、CD28の膜貫通ドメインと、4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
(l)NKp44の免疫グロブリンドメインと、NKp44の細胞外ヒンジドメインと、CD28の膜貫通ドメインと、CD28の共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むCAR。
1実施形態において、本発明は、上記実施形態のCARをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また、膜貫通ドメインとして、NKp44、CD8α、及びCD28のいずれかの膜貫通ドメインを用いる場合、これらのドメインをコードする塩基配列としては、それぞれ、配列番号4に記載のアミノ酸配列のN末端から191~213番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号6に記載のアミノ酸配列のN末端から181~206番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び配列番号8に記載のアミノ酸配列のN末端から153~179番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
また、活性化シグナル伝達ドメインとしてCD3ζの活性化シグナル伝達ドメインを用いる場合、当該ドメインをコードする塩基配列としては、配列番号12に記載のアミノ酸配列のN末端から52~163番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
また、本実施形態のポリヌクレオチドが、共刺激シグナル伝達ドメインを含み、当該ドメインに4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインを用いる場合、当該ドメインをコードする塩基配列としては、配列番号10に記載のアミノ酸配列のN末端から214~255番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
また、本実施形態のポリヌクレオチドが、シグナルペプチドを含み、当該シグナルペプチドにNKp44のシグナルペプチドを用いる場合、当該シグナルペプチドをコードする塩基配列としては、配列番号4に記載のアミノ酸配列のN末端から1~21番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
1実施形態において、本発明は、上記実施形態のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
1実施形態において、本発明は、上記実施形態のCARを発現する細胞を提供する。
1実施形態において、本発明は、上記実施形態の細胞を含む、医薬組成物を提供する。
また、他の態様において、本発明は、上記実施形態の細胞を対象に投与することを含む、腫瘍を治療又は予防する方法を提供する。
また、他の態様において、本発明は、腫瘍を治療又は予防するための上記実施形態の細胞を提供する。
(NKp44遺伝子のクローニング)
実施例で作成した全てのCARにおいて、抗原認識部位には、NKp44のリガンド結合部位である免疫グロブリンドメインを使用した。なお、以下では、抗原認識部位にNKp44のリガンド結合部位を用いたCARを、「NKp44-based CAR」という。NKp44の免疫グロブリンドメインのクローニングは以下の手順で行った。
健常ドナーから同意のもとで末梢血を10mL採取し、Ficoll密度勾配遠心法にて単核球を分離した。分離した単核球をフィーダー細胞(K562-mb15-41BBL)と1週間共培養し、ナチュラルキラー(natural killer:NK)細胞を増幅した。増幅したNK細胞からNucleoSpinTM RNA(TaKaRa)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAから、SuperScript(登録商標) III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)を用いて、逆転写反応により相補的DNA(cDNA)を合成した。このcDNAをテンプレートとして用いて、PrimeSTAR(登録商標) HS DNA Polymerase(TaKaRa)を酵素に用いたポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction:PCR)法にて、野生型NKp44遺伝子アイソフォーム1(NCBI Reference Sequence:タンパク質:NP_004819.2(配列番号4),mRNA:NM_004828.3(配列番号3))をクローニングした。なお、NKp44には、3種のアイソフォームが知られているが、他のアイソフォームのIDは以下の通りである;アイソフォーム2:NP_001186438.1,NM_001199509.1;アイソフォーム3:NP_001186439.1,NM_001199510.1。
CARを構成する要素には、抗原認識ドメインの他に、細胞外ヒンジドメイン(EH)、膜貫通ドメイン(TM)、共刺激シグナル伝達ドメイン(CS)、及び活性化シグナル伝達ドメイン(AS)がある。細胞外ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインには、CD8α及びCD28由来の要素を使用し、共刺激シグナル伝達ドメインには4-1BB由来の要素を使用した。活性化シグナル伝達ドメインにはCD3ζ由来の要素を使用した。これらの配列のクローニングは以下の手順で行った。
フィトヘムアグルチニンで刺激したヒト末梢血T細胞からRNAを抽出し、逆転写反応によりcDNAを得た。得られたcDNAをテンプレートとして、CD8α(NP_001759.3:配列番号6,NM_001768.6:配列番号5)の細胞外ヒンジドメインの配列及び膜貫通ドメインの配列をPCR法でクローニングした。同様に、4-1BB(NP_001552.2:配列番号10,NM_001561.5:配列番号9)、及びCD3ζ(NP_000725.1:配列番号12,NM_000734.3:配列番号11)の共刺激シグナル伝達ドメイン又は活性化シグナル伝達ドメインの配列をクローニングした。CD28(NP_006130.1:配列番号8,NM_006139.3:配列番号9)の細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインの配列は、T細胞性白血病細胞株JurkatからRNAを抽出し、逆転写反応により得たcDNAをテンプレートとして、PCR法でクローニングした。なお、RNAの抽出、逆転写反応、及びPCR法は、上記「(NKp44遺伝子のクローニング)」で記載した方法と同様の方法で行った。
各要素のクローニングに使用したプライマーの配列を表1に示す。また、クローニングした各要素の全長アミノ酸配列における位置を、表2に示す。
Splicing by Overlap Extension-PCR法を用いて、CARの各要素間に余分なヌクレオチドを挟むことなく、繋ぎ合わせることにより、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、及び活性化シグナル伝達ドメインの組合せの異なる複数種類のNKp44-based CAR遺伝子を作成した。各要素の配列は、配列間に余分なヌクレオチドを挟んでいないため、作成されたCAR遺伝子から合成されるCARは、各要素間に余分なアミノ酸は含まない。
作成したNKp44-based CARのDNAは全て、5’側に制限酵素EcoRIの認識部位を、3’側にXhoIの認識部位を有している。EcoRI及びXhoIでNKp44-based CARのDNAを切断した後、Murine stem cell virus(MSCV)レトロウイルスベクターとライゲーションを行った。ライゲーション産物を用いて、コンピテントセルを形質転換した。LB培地上に形成された大腸菌コロニーを採取し、シークエンス解析により配列を確認した上で、採取した大腸菌を大容量のLB液体培地で培養し、高濃度のNKp44-based CARプラスミドを得た。得られたCARプラスミド、ウイルス構造蛋白プラスミド(pEQ-PAM3-E)、及びエンベローププラスミド(RDF)をリポフェクション法により293T細胞に一過性に感染させた(3プラスミドシステム)。2~4日後に上清を採取し、NKp44-based CARのレトロウイルス液を作成した。レトロウイルス液の力価は、ポリブレンの存在下でHela細胞への感染効率を測定することで決定した。
(ヒトT細胞へのCAR遺伝子の導入)
健常ドナーの末梢血からFicoll密度勾配遠心法にて単核球を分離した。分離した単核球から、RosetteSepTM human T Cell (STEMCELL technology)を用いてCD3陽性細胞を単離した。T細胞活性化・増殖刺激用ビーズ(Dynabeads(登録商標) Human T-Activator CD3/CD28, gibco)及びrIL-2を用いて、T細胞を48~72時間刺激した。一方、レトロネクチン(登録商標)(TaKaRa)を吸着させた15mLラウンドボトムチューブに、力価を測定したNKp44-based CARレトロウイルス液を加え、32℃、1200~1300gで120分間遠心し、レトロウイルスをコニカルチューブに吸着させた(RetroNectin-bound virus感染法)。このようにして作成したレトロネクチンコートチューブに、0.5~2x105個のT細胞、及び10%の最終濃度でウシ血清(FBS)を加えた培地(RPMI1640, SigmaAldrich)を2~3mL加え、37℃、5% CO2の条件でインキュベーター内にて培養することで、T細胞へのNKp44-based CAR遺伝子の導入を行った。CAR遺伝子導入後、2~3日毎に200U/mLのrIL-2を添加した。
健常ドナーの末梢血から分離した単核球を、rIL-2投与下でフィーダー細胞 K562-mb15-41BBL)と共培養し、NK細胞を増幅した。1週後、EasySep(登録商標) CD3 positive selection cocktail (STEMCELL technology)を用いてT細胞を除去した後に、RetroNectin-bound virus感染法により、NK細胞へCAR遺伝子の導入を行った。遺伝子導入を行ったNK細胞は、10%の最終濃度でFBSを加えたRPMI1640培地で培養し、2~3日毎に100U/mLのrIL-2を添加した。
本試験で使用したMSCVレトロウイルスベクターには、内部リボソーム侵入部位(IRES)配列の下流に緑色蛍光タンパク質(GFP)の遺伝子が組み込まれている。T細胞へのCAR遺伝子導入の効率は、フローサイトメトリーを用い、GFPの蛍光波長の検出域であるFL1のシグナル強度の測定により決定した(BD FACSCaliburTM, BD sciences)。
CAR遺伝子導入1週後に、T細胞又はNK細胞の細胞表面に存在するNKp44をモノクローナル抗体(NKp44-PE, BECKMAN COULTER)で染色し、フローサイトメトリーで測定することにより、NKp44-based CARの発現量を比較した。フローサイトメトリーでの解析結果を図2A及び図Bに示す。図2AはヒトT細胞に導入したときの結果であり、図2BはヒトNK細胞に導入したときの結果である。
ヒトT細胞においては、GFP発現を元に算出された遺伝子導入効率は93.5%(n=17、62.4~97.1%)であった。ヒトNK細胞における遺伝子導入効率は42.3%(n=8、24.0~49.2%)であった。NKp44-based CARの発現は、GFP発現量を基準として評価した。T細胞及びNK細胞のいずれにおいても、最も良好な細胞表面のNKp44-based CARの発現を認めた遺伝子コンストラクトは、細胞外ヒンジドメイン(EH)にNKp44、膜貫通ドメイン(TM)にCD28、活性化シグナル伝達ドメイン(AS)にCD3ζを用いたコンストラクトである、[EH(p44)-TM(CD28)-AS(CD3ζ):(F)]だった。また、[EH(CD8α)-TM(CD8α)-CS(4-1BB)-AS(CD3ζ):(I)]、[EH(CD28)-TM(CD28)-CS(CD28)-AS(CD3ζ):(L)]も、良好な細胞表面のNKp44-based CARの発現が認められた。そのため、後述する細胞傷害性評価試験では、これらのコンストラクトを導入したヒトT細胞を使用した。なお、[EH(p44)-TM(CD28)-AS(CD3ζ):(F)]の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号1及び配列番号2に示す。また、第2世代CARのコンストラクトの配列番号は、表3に示すとおりである。
細胞傷害性評価試験では、NKp44リガンドの表面発現が確認されているT細胞性白血病細胞株(MOLT4,Jurkat)、骨髄性白血病細胞株(K562,THP-1)、B細胞性白血病細胞株(OP-1)を標的細胞として用いた。これらの標的細胞に対し、第1世代CAR[EH(p44)-TM(CD28)-AS(CD3ζ):(F)]遺伝子を導入したT細胞(NKp44(F)-CART)の細胞傷害性の評価を、遺伝子導入後1週以降に行った。標的細胞を、CellTraceTM Calcein Red-Orange, AM(thermofisher)を用いて染色した後に、NKp44-CARTと標的細胞とを様々なeffector target ratio(E:T比)で、37℃、5% CO2の条件下でインキュベーター内にて、96ウェルU底プレートを用いて6時間共培養した。標的細胞のみを含むウェルを所定時間培養し、コントロールとした。比較対象として、空ベクター(mock)を遺伝子導入したT細胞(mock-T)を用いた。また、自己および他者の正常細胞ヘの攻撃の可能性を確認するため、rIL-2投与下で培養し刺激・増殖させた自己の活性化T細胞(Auto-T cell)を細胞傷害性試験の対象細胞に用いた。同様に、T細胞の提供者とは別の健常ドナーの末梢T細胞を分離し対象細胞として用いた(Allo-T cell)。
細胞傷害性評価試験の結果を図3に示す。NKp44(F)-CARTは、mock-Tと比べ、K562、THP-1、OP-1、MOLT4及びJurkatの各細胞株に対する細胞傷害性の著しい増強が認められた。一方で、NKp44-CARTは、mock-Tと同様に、Auto-T細胞及びAllo-T細胞に対する細胞傷害性は全く認められなかった。
標的細胞(K562)とNKp44(F)-CARTとを、37℃、5%CO2の条件下で、インキュベーター内にて96ウェル丸底プレートを用いて共培養した。共培養に用いたNKp44(F)-CARTの細胞数は1x105個とし、E:T比は1:1とした。200U/mLのrIL-2を添加し、10%の最終濃度のFBSを加えた200μLのRPMI1640を培養培地として用いた。共培養開始24時間後に上清を採取し、上清中のインターフェロンγをEIA法により測定した。陰性コントロールとして、1x105個のmock-Tを同条件でK562と24時間共培養した。
インターフェロンγアッセイの結果を図4に示す。NKp44(F)-CARTでは、mock-Tと比較して、インターフェロンγ産生量が顕著に増加した。
NKp44(F)-CARTについて、固形細胞腫瘍株(骨肉腫:NOS10,SaOS2,U2OS;神経芽細胞腫:IMR32,SK-N-SH;横紋筋肉腫:RMS-YM)に対する細胞傷害性を調べた。陰性対照として、細胞外部位は同一構造だが活性化シグナル伝達ドメインを欠損している受容体[truncated CAR:(M)EH(p44)-TM(p44)]を導入したヒトT細胞を用いた。96ウェル平底プレートのウェルに、一定数の固形腫瘍細胞株を準備した(骨肉腫:2x103個,神経芽細胞腫・横紋筋肉腫:1x104個)。この固形腫瘍細胞株に対し、effector-target ratio(E:T比)を4:1となるように、NKp44(F)-CART及び陰性対照T細胞(truncated CAR-T(M))をそれぞれに加えた。10%のウシ血清を含むRPMI1640培地に、リコンビナントヒトIL-2を添加(最終濃度10U/ml)した培地を用いて、各ウェルの溶液量を200μLとした。また、前記培地200μLのみを加えたウェルをブランクの吸光度測定用として準備した。また、CAR-Tを加えず、固形腫瘍細胞株のみを加えたウェルを細胞傷害性試験のコントロールとして準備した。いずれの条件もTriplicateで試験した。7日間の共培養後に、Cell Counting Kit-8(同仁化学研究所)を各ウェルに20μLずつ添加し、CO2インキュベーター内で反応させた。添加後60~120分後に、マイクロプレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定した。対照波長として650nmの吸光度を測定し、450nmの吸光度との差を算出することで目的とする吸光度を算出した。各ウェルについて、下記式(1)により細胞生存率を算出し、3つのウェルの平均値を求めた。7日間の共培養後には、CAR-Tの残存をほぼ認めないことを、フローサイトメトリーを用いた測定により確認した。
第1世代CAR[EH(p44)-TM(CD28)-AS(CD3ζ):(F)]、CD28ベースの第2世代CAR[EH(p44)-TM(CD28)-CS(CD28)-AS(CD3ζ):(L)]、4-1BBベースの第2世代CAR[EH(CD8α)-TM(CD8α)-CS(4-1BB)-AS(CD3ζ):(I)]、及びtruncated CAR(M)を導入したT細胞(CAR-T)について、単回のCAR刺激後から5日後の増幅率を調べた。96ウェル平底プレートに1x105個/ウェルでそれぞれのCAR-Tを播種した。それぞれのウェルに、50Gyの放射線照射を行った白血病細胞株THP-1を、2.5x104個ずつ加えた。10%のウシ血清を含むRPMI1640培地に低濃度のリコンビナントヒトIL-2を添加(最終濃度10U/ml)したものを培地に用い、各ウェルの最終の溶液量を200μLとした。5日後に各ウェルの細胞数を計測して細胞増幅率を算出した。
第1世代CAR[EH(p44)-TM(CD28)-AS(CD3ζ):(F)]、CD28ベースの第2世代キメラ抗原受容体[EH(p44)-TM(CD28)-CS(CD28)-AS(CD3ζ):(L)]、4-1BBベースの第2世代CAR[EH(CD8α)-TM(CD8α)-CS(4-1BB)-AS(CD3ζ):(I)]、及び陰性対照としてtruncated CAR(M)を導入したT細胞(CAR-T)について、骨肉腫細胞株(NOS10,SaOS2)に対する細胞傷害活性を調べた。96ウェル丸底プレートに2x103個/ウェルで骨肉腫細胞株を播種した。effector-target ratio 4:1(E/T=4:1)又はE/T=1:1で、上記のCAR-Tのいずれかを加えて共培養した。試験は全てTriplicateで行った。7日間の共培養後に、Cell Counting Kit-8 (同仁化学研究所)で生存細胞数を定量測定した。
Claims (10)
- NKp44の免疫グロブリンドメインと、CD8αの細胞外ヒンジドメインと、CD8αの膜貫通ドメインと、4-1BBの共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζの活性化シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体。
- 配列番号30、32、34、36又は38に記載のアミノ酸配列のN末端から22番目以降C末端までのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
- 請求項1又は2に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項1又は2に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
- T細胞又はナチュラルキラー細胞である、請求項5に記載の細胞。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチド又は請求項4に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
- 前記細胞がT細胞又はナチュラルキラー細胞である、請求項7に記載の製造方法。
- 請求項5又は6に記載の細胞を含む、医薬組成物。
- 請求項5又は6に記載の細胞を含む、腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物。
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