ES2729841T3 - Conjugados de partículas similares a virus para tratar tumores - Google Patents

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John T Schiller
Rhonda C Kines
John Macdougall
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Abstract

Una partícula similar a virus de direccionamiento a tumores que comprende de 50 a 1000 moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas de la cápside del virus del papiloma, en donde la citotoxicidad de las moléculas fotosensibles se activa por exposición a luz infrarroja, de infrarrojo cercano o ultravioleta.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de partículas similares a virus para tratar tumores
Campo de la invención
Esta descripción se refiere al campo del diagnóstico y terapéutica de tumores.
Antecedentes de la invención
Aunque se encuentran disponibles numerosos tratamientos para el cáncer, muchas formas de cáncer permanecen incurables, intratables o se han vuelto resistentes a las terapias estándar, y los tratamientos eficaces para muchos cánceres tienen efectos secundarios indeseables. Los cánceres oculares, como el melanoma ocular y el retinoblastoma, son particularmente difíciles de tratar. Un paciente al que se le haya diagnosticado melanoma ocular, dependiendo del tamaño del tumor, tiene pocas opciones de tratamiento, que incluyen lo siguiente: (1) procedimientos quirúrgicos como resección, enucleación o exenteración, todos los cuales son sumamente invasivos e implican principalmente la extirpación del ojo y de parte del nervio óptico (normalmente, después de la cirugía, el paciente es idóneo para la colocación de un ojo artificial); y (2) braquiterapia con placas, un tipo de radioterapia, en donde una fina pieza de metal (por ejemplo, oro) con semillas radioactivas que cubren un lado se cose en la pared exterior del ojo con las semillas dirigidas al tumor. La fina pieza de metal se retira al final del tratamiento, que dura normalmente varios días. Las complicaciones graves relacionadas con radiactividad incluyen: formación de cataratas, que es la más común, seguida por hemorragia vítrea. Otras complicaciones incluyen ojo seco, queratitis, neovascularización del iris inducida por radiación, glaucoma neovascular, retinopatía inducida por radiación, neuropatía óptica inducida por radiación, depósitos epiesclerales, necrosis escleral y/o alteraciones de los músculos extraoculares. Se ha documentado que la retinopatía por radiación ocurre en un 10-63% de pacientes tratados con braquiterapia con placas, y el tiempo medio desde el tratamiento al desarrollo de la maculopatía es de aproximadamente 25,6 meses.
La publicación internacional WO 2008/140961 A2 describe una partícula similar a virus (VLP) de direccionamiento a tumores, es decir, VPH-16RFP acoplado al colorante fluorescente Alexa Fluor cuyo uso se contempla en “methods of inhibiting the proliferation of cancer cells and/or killing cancer cells without inhibiting proliferation and/ or killing of normal cells comprising administering to said identified subject a composition that comprises a therapeutic agent formulated with the a papilloma pseudovirus or a papilloma VLP the therapeutic agent is chemically coupled to said pseudovirus or said VLP”.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona partículas similares a virus tal como se establece en las reivindicaciones que acompañan.
La presente descripción proporciona, al menos en parte, composiciones de partículas similares a virus para detectar y/o dirigirlas de manera selectiva a células tumorales, por ejemplo, para el diagnóstico y/o tratamiento de cáncer (por ejemplo, cáncer ocular). En algunos casos, las composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden utilizar para matar de manera selectiva células tumorales cancerosas sin dañar las células sanas. Por ejemplo, nanopartículas similares a virus que comprenden (por ejemplo, se conjugan con) moléculas fotosensibles se pueden entregar de manera selectiva a células tumorales y fotoactivarlas al exponerlas a la luz. Cuando se fotoactiva, una molécula fotosensible absorbe fotones, y esa energía absorbida produce cambios moleculares que provocan toxicidad (por ejemplo, toxicidad celular). Una "nanopartícula similar a virus fotosensible", (también denominada en la presente memoria como una "partícula similar a virus fotosensible") se refiere a una nanopartícula similar a virus conjugada con una molécula fotosensible. Sorprendentemente, la conjugación de moléculas fotosensibles a nanopartículas similares a virus no interfiere con el tropismo tejido/tumor de las nanopartículas (por ejemplo, la especificidad de las nanopartículas similares a virus para un tejido tumoral huésped o célula tumoral particulares). En términos generales, las nanopartículas similares a virus (también denominadas como partículas similares a virus (VLP)) de la presente descripción se ensamblan a partir de proteínas de la cápside LI, o una combinación de proteínas de la cápside L1 y L2, y las moléculas fotosensibles, en algunos aspectos, se conjugan con una proteína de la cápside que forma la nanopartícula similar a virus. Por consiguiente, varios aspectos de la descripción proporcionan nanopartículas similares a virus de direccionamiento a tumores que comprenden moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas de la cápside.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan también partículas similares a virus de direccionamiento a tumores que comprenden de aproximadamente a 50 a aproximadamente 500, de aproximadamente 50 a aproximadamente 600, de aproximadamente 50 a aproximadamente 700, de aproximadamente 50 a aproximadamente 800, de aproximadamente 50 a aproximadamente 900, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles por partícula. En algunos aspectos, las partículas similares a virus de direccionamiento a tumores comprenden aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900 o aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles por partícula. En algunos aspectos, las partículas similares a virus de direccionamiento a tumores comprenden 500 moléculas fotosensibles o 1000 moléculas fotosensibles por partícula.
En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside son proteínas de la cápside del virus del papiloma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las proteínas de la cápside del virus del papiloma son proteínas de la cápside del virus del papiloma no humano, como proteínas de la cápside del virus del papiloma bovino. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside el virus del papiloma humano y no reaccionan de manera cruzada con los virus del papiloma humano (VPH) 16, VPH18 o anticuerpos preexistentes específicos para el VPH.
En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas L1 o L1/L2 del papiloma (por ejemplo, humano, bovino, u otras especies). En algunas realizaciones, las VLP L1 o L1/L2 no reaccionan de manera cruzada con anticuerpos neutralizantes de los virus del papiloma humano (VPH) 16, VPH 18 o anticuerpos preexistentes específicos para otros VPH. Sin embargo, en algunos aspectos, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside del virus del papiloma humano de VPH16.
En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se conjugan con péptidos expuestos en la superficie de proteínas de la cápside.
En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside L1 o una combinación de proteínas de la cápside L1 y L2. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus consisten en proteínas de la cápside L1.
En algunos aspectos, una partícula similar a virus comprende proteína de la cápside L1 del VPB (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPB y L2 del VPB. En algunas realizaciones, una partícula similar a virus comprende proteínas de la cápside L1 del VPH o una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPH y L2 del VPH. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside L1 del VPH es una variante de la proteína L1 del VPH 16/31 que tiene inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Por consiguiente, en algunas realizaciones, una partícula similar a virus comprende o consiste en variantes de las proteínas de la cápside L1 del VPH16/31 o una combinación de variantes de las proteínas de la cápside L1 del VPH16/31 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) y proteínas de la cápside L2 del VPH.
En algunos aspectos, las proteínas de la cápside de una partícula similar a virus tienen inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas. Un ejemplo no limitativo de una proteína de la cápside de este tipo son proteínas de la cápside L1 del VPH16/31 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Las partículas similares a virus que contienen proteínas de la cápside modificadas se pueden denominar en la presente memoria como partículas similares a virus que contienen inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas en comparación con partículas similares a virus de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan covalentemente con proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan con un aminoácido de las proteínas de la cápside. En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se conjugan con un grupo amino (por ejemplo, amina alifática primaria) de un aminoácido de las proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan con grupos amino de residuos de lisina (por ejemplo, amina de cadena lateral de lisina) de las proteínas de la cápside. En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se conjugan con grupos amino de residuos de arginina y/o histidina de las proteínas de la cápside. La presente descripción proporciona métodos para conjugar moléculas fotosensibles con lisina y con otros aminoácidos que contienen grupos amino.
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles no comprometen (por ejemplo, evitan, interfieren o inhiben) la unión de la partícula similar a virus a la superficie de células tumorales. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles no comprometen (por ejemplo, evitan, interfieren o inhiben) la unión de la partícula similar a virus a proteoglicanos de heparán sulfato u otros polisacáridos en la superficie de células tumorales.
En algunos aspectos, las partículas similares a virus comprenden de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus como se definen en las reivindicaciones comprenden de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. En algunos aspectos, las partículas similares a virus comprenden de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. En algunos aspectos, las partículas similares a virus comprenden de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 moléculas fotosensibles. En algunos aspectos, las partículas similares a virus comprenden de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles o más.
En algunos aspectos, las partículas similares a virus comprenden de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles que se conjugan con residuos de lisina u otros residuos de aminoácidos de proteínas de la cápside L1, proteínas de la cápside L2, o una combinación de proteínas de la cápside L1 y proteínas de la cápside En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se activan por luz infrarroja, de infrarrojo cercano o ultravioleta. Una molécula fotosensible se considera como "activada" cuando la molécula absorbe protones, y esa energía absorbida produce cambios moleculares que provocan toxicidad, tal como se describe en otra parte de la presente memoria.
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles comprenden un colorante fluorescente, un colorante infrarrojo, un colorante de infrarrojo cercano, una molécula de porfirina, una molécula de clorofila, o una combinación de dos o más de cualquiera de los anteriores.
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles son moléculas de porfirina. Los ejemplos de moléculas de porfirina para su uso según la presente descripción incluyen, sin limitación, HpD (derivado de hematoporfirina), basado en HpD, BPD (derivado de benzoporfirina), ALA (ácido 5-aminolevulínico) y texafirinas. En algunas realizaciones, la molécula de porfirina es verteporfina (Visudyne®).
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles son moléculas de clorofila. Los ejemplos de moléculas de clorofila para su uso según la presente descripción incluyen, sin limitación, clorinas, purpurinas y bacterioclorinas. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles son colorantes. Los ejemplos de colorantes para su uso según la presente descripción incluyen, sin limitación, ftalocianina y naftalocianina.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es tanto una molécula fluorescente como una molécula de infrarrojo cercano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX, LI-COR®). Un colorante IR700 es un colorante fluorescente que tiene unas longitudes de onda de absorción y emisión en el espectro de infrarrojo cercano (IRC) típicamente entre 680 nm y 800 nm. Otros colorantes infrarrojos que tienen unas longitudes de onda de absorción y emisión en el espectro IRC se proporcionan en la presente memoria.
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se seleccionan de entre colorantes de ftalocianina (por ejemplo, colorante IR700 como IRDye® 700DX), moléculas de porfirina (por ejemplo, verteporfina como Visudyne®) y una combinación de colorantes de ftalocianina y de moléculas de porfirina.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan métodos que comprenden administrar, a dicho sujeto que tiene un tumor, cualquier partícula similar a virus, o partículas similares a virus fotosensibles, proporcionada en la presente memoria. En algunos aspectos, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles de una partícula similar a virus a una longitud de onda de luz que permite visualizar las moléculas sensibles a la luz. Por consiguiente, en algunos aspectos, las moléculas fotosensibles de la presente descripción se utilizan como agentes de diagnóstico por imágenes y/o agentes diagnósticos. En algunos aspectos, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles a una longitud de onda de luz que provoca que la molécula sea citotóxica. En algunos aspectos, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles a una longitud de onda de luz que genera una transferencia de energía en la célula tumoral que crea daño celular directo e irreversible que lleva a necrosis. Por consiguiente, en algunos aspectos, las moléculas fotosensibles de la presente descripción se utilizan como agentes terapéuticos y/o profilácticos.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan métodos que comprenden administrar, a un sujeto que tiene un tumor, una partícula similar a virus de direccionamiento a tumores que comprende moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas de la cápside. En algunos aspectos, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles de partículas similares a virus a una longitud de onda que hace que las moléculas se vuelvan visibles. Esto es, las moléculas fotosensibles vuelven a emitir luz tras excitación luminosa. En algunas realizaciones, los métodos comprenden activar moléculas fotosensibles a una longitud de onda que hace que las moléculas se vuelvan citotóxicas, matando así las células del tumor. Esto es, las moléculas fotosensibles experimentan un cambio molecular tras excitación luminosa que da lugar a que las moléculas fotosensibles se vuelvan tóxicas para las células.
Algunos aspectos proporcionan métodos que comprenden administrar, a un sujeto que tiene un tumor, una partícula similar a virus de direccionamiento a tumores que comprende de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar, a un sujeto que tiene un tumor, una partícula similar a virus de direccionamiento a tumores que comprende aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más moléculas fotosensibles. En algunos aspectos, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles a una longitud de onda que hace que las moléculas se vuelvan visibles. En algunos aspectos, los métodos comprenden activar moléculas fotosensibles a una longitud de onda que hace que las moléculas se vuelvan citotóxicas, matando así las células del tumor.
En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se activan por láser. En algunos aspectos, el láser es un láser infrarrojo, de infrarrojo cercano o ultravioleta. En algunos aspectos, el láser infrarrojo es de 5 julios (J) a 100 J (o J/cm2) (por ejemplo, 5 J, 6 J, 7 J, 8 J, 9 J, 10 J, 11 J, 12 J, 13 J, 14 J, 15 J, 16 J, 17 J, 18 J, 19 J, 20 J, 21 J, 22 J, 23 J, 24 J, 25 J, 26 J, 27 J, 28 J, 29 J, 30 J, 31 J, 32 J, 33 J, 34 J, 35 J, 36 J, 37 J, 38 J, 39 J, 40 J, 41 J, 42 J, 43 J, 44 J, 45 J, 46 J, 47 J, 48 J, 49 J, 50 J, 51 J, 52 J, 53 J, 54 J, 55 J, 56 J, 57 J, 58 J, 59 J, 60 J, 61 J, 62 J, 63 J, 64 J, 65 J, 66 J, 67 J, 68 J, 69 J, 70 J, 71 J, 72 J, 73 J, 74 J, 75 J, 76 J, 77 J, 78 J, 79 J, 80 J, 81 J, 82 J, 83 J, 84 J, 85 J, 86 J, 87 J, 88 J, 89 J, 90 J, 91 J, 92 J, 93 J, 94 J, 95 J, 96 J, 97 J, 98 J, 99 J o 100 J (o J/cm2)). En algunos aspectos, el láser se aplica durante entre aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos.
En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se activan de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas después de administrar las partículas similares a virus a un sujeto. Por ejemplo, las moléculas fotosensibles se pueden activar 30 minutos después de administrar las partículas similares a virus al sujeto. En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se activan 1 hora, 2 horas (h) 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 7 h, 8 h, 9 h, 10 h, 11 h, 12 h, 13 h, 14 h, 15 h, 16 h, 17 h, 18 h, 19 h, 20 h, 21 h, 22 h, 23 o 24 h después de administrar la partícula similar a virus al sujeto. En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se activan 1 día, 2 días o 3 días después de administrar la partícula similar a virus al sujeto.
En algunas realizaciones, el tumor es un tumor ocular o un tumor que se ha metastatizado al ojo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tumor ocular se localiza en el vítreo, espacio coroideo, iris, cuerpo ciliar, esclerótica, fóvea, retina, papila óptica o nervio óptico.
En algunas realizaciones, el tumor se localiza en un pulmón, pleura, hígado, páncreas, estómago, esófago, colon, pecho, ovario, próstata, cerebro, meninges, testículo, tracto gastrointestinal, riñones o vejiga.
En algunas realizaciones, el tumor es accesible sin intervención quirúrgica.
En algunas realizaciones, el tumor se localiza en la cabeza, cuello, cérvix, laringe o piel.
En algunas realizaciones, el tumor es una enfermedad huérfana o rara.
En algunas realizaciones, el tumor es canceroso. En algunas realizaciones, el tumor es metastásico. En algunas realizaciones, el tumor es precanceroso o displástico.
En algunas realizaciones, las partículas similares a virus se administran por inyección. Por ejemplo, las partículas similares a virus se pueden administrar por inyección por vía intraocular, en el vítreo, o por vía intravenosa. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus se administran con una aguja hueca o recubierta, miniaguja o microaguja. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus se administran por vía tópica. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus se administran por implantación.
En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside son proteínas de la cápside del virus del papiloma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las proteínas de la cápside del virus del papiloma son proteínas de la cápside del virus del papiloma no humano, como proteínas de la cápside del virus del papiloma bovino (VPB). En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside del virus del papiloma humano y no reaccionan de manera cruzada con los virus del papiloma humano (VPH) 16, VPH18 o anticuerpos preexistentes específicos para el VPH. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside del virus del papiloma humano de tipo 16. En algunas realizaciones, las VLP no se unen a anticuerpos específicos para VLP del virus del papiloma humano (VPH) 16, VPH 18 o a anticuerpos preexistentes inducidos específicamente por infección con VPH.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan métodos para detectar, en un sujeto, tumores (por ejemplo, tumores oculares y nevus malignos), los métodos comprenden administrar al sujeto (por ejemplo, al ojo del sujeto) cualquiera de las partículas similares a virus proporcionadas en la presente memoria, como una partícula similar a virus que comprende una molécula fotosensible (por ejemplo, colorante fluorescente o colorante infrarrojo), y detectar la ubicación del tumor. En algunos aspectos, los métodos comprenden detectar la ubicación del tumor al iluminar al sujeto (por ejemplo, el ojo del sujeto) con un láser (por ejemplo, láser ultravioleta o láser infrarrojo). En algunos aspectos, los métodos comprenden identificar al sujeto que se sospecha que tiene un tumor antes de administrar la partícula similar a virus. En algunos aspectos, los métodos comprenden diagnosticar y/o tratar el tumor administrando partículas similares a virus fotosensibles a un tumor del sujeto o a un sujeto que tiene un tumor o se sospecha que lo tiene
Otros aspectos de la descripción proporcionan métodos para inhibir de manera selectiva o matar las células cancerosas sin inhibir la proliferación o viabilidad de células no cancerosas (por ejemplo, normales, sanas), los métodos comprenden administrar a un tumor de un sujeto (por ejemplo, a un tumor ocular del sujeto) cualquiera de las partículas similares a virus de direccionamiento a tumores proporcionas en la presente memoria, como partículas similares a virus que comprenden moléculas fotosensibles (por ejemplo, colorante infrarrojo), e irradiar las células cancerosas del tumor sometiendo al tumor a un láser infrarrojo (por ejemplo, a una longitud de onda de aproximadamente 660 nm a aproximadamente 740 nm y a una dosis de al menos 8 julios), de manera eficaz.
En algunos aspectos, la presente descripción proporciona una nanopartícula similar a virus (también denominada como partícula similar a virus) que comprende moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas L1 del virus del papiloma (por ejemplo, proteínas L1 del virus del papiloma bovino). En algunos aspectos, las nanopartículas similares a virus tienen de 20 a 60 nanómetros (por ejemplo, 10, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 nanómetros) de diámetro. En algunos aspectos, una nanopartícula similar a virus contiene de 300 a 500 proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, L1 de VPB), por ejemplo, 360 proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, basado en simetría icosaédrica). Se debería apreciar que, en algunos aspectos, las nanopartículas similares a virus contienen cada una aproximadamente 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 o 500 proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, L1 del VPB). Sin embargo, en algunos aspectos, una nanopartícula similar a virus contiene menos de 300 proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, L1 del VPB).
En algunos aspectos, la presente descripción proporciona una nanopartícula similar a virus del virus del papiloma bovino conjugada covalentemente con de 100 a 1000 moléculas fotosensibles (por ejemplo, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 moléculas). En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside de la nanopartícula similar a virus del virus del papiloma bovino (VPB) comprenden o consisten en proteínas de la cápside L1 del VPB o una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPB y L2 del VPB. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan con nanopartículas similares a virus (o proteínas de la cápside de las nanopartículas similares a virus) a través de un enlace covalente formado al reaccionar un grupo éster en las moléculas fotosensibles con un grupo amino de las proteínas de la cápside, formando así un enlace amida. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las proteínas de la cápside de nanopartículas similares a virus de la presente descripción se conjugan con moléculas fotosensibles a través de enlaces amida.
En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona una nanopartícula similar a virus que comprende de 300 a 500 proteínas de la cápside L1 del bVp y/o un diámetro de 2060 nm, al menos algunas de las cuales (por ejemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%) se conjugan covalentemente (por ejemplo, a través de un enlace amida) con de 1 a 5 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5) moléculas fotosensibles (por ejemplo, colorante IR700 como IRDye® 700DX). La presente descripción proporciona también métodos para producir nanopartículas similares a virus. Las partículas descritas se pueden utilizar en métodos para administrar nanopartículas similares a virus a un sujeto como agente diagnóstico, terapéutico o profiláctico.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un mecanismo para inducir muerte celular utilizando una partícula similar a virus (VLP) conjugada con una molécula fotosensible.
La Figura 2 muestra una comparación de direccionamiento bivalente, por ejemplo, por un anticuerpo, y direccionamiento multivalente, por ejemplo, por una VLP.
La Figura 3 muestra un gráfico que demuestra que la especificidad de unión de VLP a células la media interacciones de proteoglicano de heparán sulfato (HSPG) y la inhibe la heparina. También muestra la muerte específica de células tumorales solo cuando las VLP fotosensibles se unen a la célula y las células se someten a irradiación infrarroja.
La Figura 4 muestra un gráfico que demuestra que la muerte celular depende de la dosis de radiación infrarroja y de la cantidad de VLP y moléculas fotosensibles (por ejemplo, colorante) entregada.
La Figura 5 muestra un gráfico que muestra la muerte in vitro de una célula de cáncer de ovario (SKOV-3) tras irradiación con VLP (designadas como PsV en la figura) conjugadas con IR700.
La Figura 6A muestra un análisis de tiempo de vuelo con ionización por electrospray (ESI-TOF) de VLP de control. La Figura 6B muestra un análisis ESI-TOF de VLP (designadas como PsV en la figura) conjugadas con 1000 moléculas de IR700.
Las Figuras 7A-7C muestran gráficos de muerte celular de una línea celular (92.1) de melanoma ocular del receptor 2 negativo (HER2) del factor de crecimiento epidérmico humano, comparando la efectividad de agentes bivalentes (por ejemplo, anticuerpos) y de agentes multivalentes (por ejemplo, VLP fotosensibles, también denominadas como conjugados de VLP, designados como PsV en la figura).
Las Figuras 8A-8C muestran gráficos de muerte celular de una línea celular de cáncer de ovario (SKOV-3) del receptor 2 positivo (HER2+) del factor de crecimiento epidérmico humano, comparando la efectividad de agentes bivalentes (por ejemplo, anticuerpos) y de agentes multivalentes (por ejemplo, VLP fotosensibles, también denominadas como conjugados de VLP, designados como PsV en la figura).
La Figura 9 muestra un gráfico que demuestra que los anticuerpos neutralizantes anti-VPH16 inducidos por vacunas no bloquean la unión de VLP VPB*IR700 a la línea celular de melanoma ocular, 92.1.
La Figura 10A muestra una estructura química de éster de NHS IRDye® 700DX. La Figura 10B muestra una estructura química de Visudyne® con un grupo carboxilo reactivo marcado con un círculo.
La Figura 11 muestra un esquema de reacción que implica hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y sulfo-N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) mediada por la unión de Visudyne® y VLP. En este esquema, @ representa Visudyne® y @ representa VLP. Téngase en cuenta que existen 2 rutas para el producto final deseado. La presencia de sulfo-NHS tiende a estabilizar la reacción y mejora la producción del producto deseado.
La Figura 12 muestra histogramas de muestras representativas de la unión dependiente de HSPG de nanopartículas similares a virus que contienen proteínas de la cápside del VPH16, la variante de las proteínas de la cápside del HPV16/31 y proteínas de la cápside del VPB1 (proteínas L1, o L1 y L2) que se unen a varios tipos de células cancerosas.
Las Figuras 13A y 13B muestran imágenes de tejido tumoral extirpado en fondo claro (Figura 13A) y fluorescencia (Figura 13B) de ratones de control negativos inyectados con PBS a las 12 horas, ratones inyectados con nanopartículas similares a virus fotosensibles a las 12 horas (#3 y #4) y ratones inyectados con nanopartículas similares a virus fotosensibles a las 24 horas (#1 y #2) después de inyección.
La Figura 14 muestra una representación cuantitativa del tumor total asociado a fluorescencia relacionada con nanopartículas similares a virus en muestras tumorales TC-1 ex vivo extirpadas 12 y 24 horas después de inyección intravenosa de las VLP (los mismos tumores de la Figura 13).
La Figura 15 muestra un esquema del diseño experimental para el Ejemplo 14.
Las Figuras 16A y 16B muestran gráficos del porcentaje de muerte celular después de administración in vivo de nanopartículas similares a virus fotosensibles (designadas como NP en la figura) y valoración lumínica en células de melanoma ocular (MO) 92.1 subcutáneo (viabilidad celular medida 24 horas después de tratamiento luminoso). Las Figuras 17A-17C muestran histogramas sin procesar para los datos presentados en las Figuras 16A y 16B. La Figura 18 (panel superior) muestra muestras de tejido obtenidas de animales inoculados por vía subcutánea con 2 x 105 células tumorales TC-1 en 100 |jl de PBS y administradas: (1) sin tratamiento, (2) 100 |jg de nanopartículas similares a virus (designadas como NP en la figura) ensambladas a partir de variantes de las proteínas L1 del VPH16/31 y de proteínas L2 del HPV, marcadas con IRDye® 700DX sin luz, (3) PBS con 50 J/cm2 de luz, (4) 200 jg de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz, (5) 100 jg de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2de luz y (6) 50 jg de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz. La Figura 18 (panel inferior) muestra el porcentaje de células muertas para cada una de las seis condiciones de prueba.
La Figura 19A muestra un esquema del experimento descrito en el Ejemplo 15. La Figura 19B muestra un gráfico del porcentaje de supervivencia en animales inyectados con nanopartículas similares a virus (designadas como nanopartículas en la figura) frente a control (con luz). La Figura 19C muestra el volumen del tumor (panel superior), "células T CD8+ tetrámetro E7+" y "células c D8+ que secretan INF-gamma" en ratones individuales.
La Figura 20 muestra un gráfico de los resultados de un ensayo de potencia, que compara los efectos de nanopartículas similares a virus del VPB fotosensibles y nanopartículas similares a virus del VPH fotosensibles sobre viabilidad celular.
La Figura 21 muestra un gráfico de los resultados de un ensayo de unión, que compara la unión de nanopartículas similares a virus del VPB fotosensibles y nanopartículas similares a virus del VPH fotosensibles a células.
La Figura 22 muestra un gráfico de la curva de crecimiento tumoral de células cancerosas de cabeza y cuello después de tratamiento con nanopartículas similares a virus fotosensibles (designadas como PsV en la figura). Las Figuras 23A y 23B representan ejemplos de un proceso de producción de nanopartículas similares a virus fotosensibles de la presente descripción (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 20).
Descripción detallada de la invención
La terapia fotodinámica (TFD) es una forma de fototerapia que utiliza moléculas fotosensibles no tóxicas que, cuando se exponen de manera selectiva a la luz, se vuelven tóxicas, y se dirigen a y/o matan células malignas y otras células enfermas. Un reto que plantea la TFD en el tratamiento del cáncer es la entrega de altas concentraciones de moléculas fotosensibles exclusivamente a células tumorales. Para conseguir una entrega dirigida, se pueden utilizar anticuerpos, aunque estos están limitados por su capacidad de entrega, que se encuentra en el intervalo de 2-8 moléculas fotosensibles por anticuerpo. Además, existen tumores importantes que carecen de una molécula receptora tumoral identificada y, por lo tanto, no pueden ser la diana de un anticuerpo. Como consecuencia, múltiples tumores permanecen intratables (por ejemplo, melanoma ocular). Además, muchas de las moléculas (por ejemplo, RFCE) que son la diana de conjugados de anticuerpo/colorante se encuentran también en la superficie de células no tumorales, lo que lleva a efectos de direccionamiento no deseados.
La presente descripción se basa, en parte, en el inesperado descubrimiento de que las partículas similares a virus (VLP) (por ejemplo, VLP del papiloma) (también denominadas en la presente memoria como nanopartículas similares a virus) se pueden modificar químicamente para transportar muchas moléculas fotosensibles (por ejemplo, IR700) sin perder su capacidad de direccionamiento a tumores o estabilidad estructural. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las VLP se pueden modificar químicamente para transportar más de 50 moléculas, más de 100 moléculas, o más de 1000 moléculas (o aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles). Las partículas similares a virus ensambladas a partir de proteínas de la cápside L1 o L1 y L2 se pueden unir de manera selectiva o infectar células cancerosas sin afectar a las células no cancerosas, minimizando así la citotoxicidad de los tratamientos (véase la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US20100135902A1). Además, en algunos casos, la entrega de grandes cantidades de moléculas fotosensibles por partícula permite la destrucción selectiva de células tumorales tras radiación luminosa con cantidades sumamente pequeñas de fármaco (por ejemplo, concentraciones picomolares).
Una característica de unión clave de una VLP es la presencia de un gran número de sitios de unión a heparina en las proteínas de la cápside (por ejemplo, L1). La conjugación de moléculas fotosensibles con aminoácidos de superficie (por ejemplo, conjugación por medio de enlace amida con aminoácidos de superficie como residuos de lisina, residuos de arginina y residuos de histidina de superficie), sorprendentemente, no compromete la unión de la VLP a proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) en la superficie de células tumorales. Aunque la presente descripción describe la conjugación de moléculas fotosensibles con péptidos expuestos en la superficie de proteínas de la cápside, se debe entender que las moléculas fotosensibles se pueden conjugar con cualquier péptido de proteínas de la cápside. Esto es, las moléculas fotosensibles se pueden conjugar con proteínas L1 solas o con una combinación de proteínas L1 y L2. La proteína y el residuo de aminoácido con los que se conjuga una molécula fotosensible pueden depender de la composición de la partícula similar a virus.
Los descubrimientos anteriores tienen importantes implicaciones en el desarrollo de tratamientos de cáncer dirigidos innovadores. Por ejemplo, las VLP fotosensibles (también denominadas como conjugados de VLP) de la presente descripción proporcionan una ventaja en relación a otras moléculas de direccionamiento tales como anticuerpos, que tienen una capacidad de entrega muy limitada. Asimismo, las VLP fotosensibles de la presente descripción son útiles para dirigirse a una amplia gama de tumores a los que de otra manera no se podrían dirigir los anticuerpos u otras moléculas de direccionamiento (por ejemplo, tumores oculares) porque no se han identificado determinantes específicos adecuados de superficie tumoral. Además, las VLP fotosensibles son útiles para tratar metástasis a distancia. Asimismo, las VLP fotosensibles son útiles para diagnosticar y tratar lesiones malignas tempranas o precancerosas (por ejemplo, nevus ocular que se transforma, premaligno o maligno).
Una "partícula similar a virus" (VLP), tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una estructura similar a cápside organizada (por ejemplo, de forma casi esférica o cilíndrica) que comprende matrices ordenadas autoensamblantes de capsómeros L1 o L1 y L2 y que no incluye genoma vírico. Las partículas similares a virus son similares morfológica y antigénicamente a viriones auténticos, pero carecen de material genético vírico (por ejemplo, ácido nucleico vírico), haciendo que las partículas sean no infecciosas. Una VLP se puede utilizar para entregar un agente (por ejemplo, agente profiláctico, agente terapéutico o agente diagnóstico) a una célula receptora o una molécula de ADN o ARN circular cerrada o lineal. Se debe entender que las expresiones "partícula similar a virus" o "VLP" y "pseudovirus" o "PsV" se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente memoria y también se pueden utilizar de manera intercambiable con la expresión "nanopartícula similar a virus".
Una "partícula similar a virus de direccionamiento al tumor", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una VLP que se dirige a células tumorales (por ejemplo, cancerosas) sin dirigirse a células no tumorales (por ejemplo, no cancerosas, por lo contrario, normales y sanas) (por ejemplo, tejido intacto).
Las VLP según la presente descripción pueden tener una inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas con respecto a las VLP del papilomavirus de tipo salvaje. Las VLP pueden, por ejemplo, ensamblarse a partir de capsómeros que tienen una variante de proteína de la cápside con inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas. Una variante de proteína de la cápside con "inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas" es una que se ha modificado de manera natural o sintética (por ejemplo, mutado, sustituido, con deleciones, pegilada o insertada) en un aminoácido para reducir o evitar el reconocimiento de la proteína de la cápside por anticuerpos específicos de serotipo vírico (por ejemplo, endógenos) preexistentes. Una variante de proteína de la cápside puede ser una variante L1 del papilomavirus humano (VPH), una variante L1 del papilomavirus no humano, o una variante L1 del papilomavirus basada en una combinación de aminoácidos a partir de diferentes serotipos de VPH. Por ejemplo, una variante L1 con inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas puede ser una proteína recombinante basada en el serotipo 16 del VPH y el serotipo 31 del VPH (denominadas en la presente memoria como "variante de la proteína L1 del VPH16/31" - SEQ ID NO: 1), que se describe en la publicación internacional n.° WO/2010/120266.
En algunas realizaciones, una VLP es un virus del papiloma como se define en las reivindicaciones. La VLP puede ser una VLP del virus del papiloma humano (VPH) (por ejemplo, derivado de un virus que puede infectar a un ser humano), mientras que, en otros aspectos, la VLP es un VLP del virus del papiloma no humano. Los ejemplos de VLP no humanas incluyen aquellas que derivan de, sin limitación, partículas del virus del papiloma bovino, virus del papiloma murino, virus del papiloma del conejo cola de algodón y virus del papiloma de macaco o rhesus. En algunas realizaciones, las VLP son nanopartículas similares a virus del vi rus del papiloma bovino (por ejemplo, nanopartículas similares a virus del tipo 1) (por ejemplo, ensambladas a partir de proteínas de la cápside L1 del VPB o una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPB y L2 del VPB).
Una "proteína de la cápside", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un monómero de proteína, varios de los cuales forman un oligómero de capsómero. Un "capsómero", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una unidad estructural oligomérica básica de una cápside viral, que es un recubrimiento externo de proteína que protege el material genético de un virus como, por ejemplo, papilomavirus humano (VPH). Las proteínas de la cápside de la presente descripción incluyen proteínas mayores de la cápside L1 del papilomavirus y proteínas menores de la cápside L2 del papilomavirus. En algunos aspectos, las VLP de la presente descripción contienen solo proteínas de la cápside L1, mientras que, en otras realizaciones, las VLP contienen una mezcla (o combinación) de proteínas de la cápside L1 y L2.
En algunos aspectos, el porcentaje de proteínas de la cápside L1 en una partícula similar a virus es mayor que el porcentaje de proteínas de la cápside L2 en la partícula similar a virus. Por ejemplo, en algunos aspectos, el porcentaje de proteínas de la cápside L1 en una partícula similar a virus es de un 80% a un 100% (del número total de proteínas de la cápside en la partícula similar a virus). En algunos aspectos, el porcentaje de proteínas de la cápside L1 en una partícula similar a virus es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En algunos aspectos, el porcentaje de proteínas de la cápside L2 en una partícula similar a virus es de un 1% a un 25% (del número total de proteínas de la cápside en la partícula similar a virus). Por ejemplo, en algunos aspectos, el porcentaje de proteínas de la cápside L2 en una partícula similar a virus es 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%.
En algún aspecto, una partícula similar a virus contiene de 12 a 72 proteínas L2. En algún aspecto, una partícula similar a virus contiene 360 proteínas L1 y de 12 a 72 proteínas L2. En algunos aspectos, las proteínas de la cápside se ensamblan en nanopartículas similares a virus que tienen un diámetro de 20 a 60 nm. Por ejemplo, las proteínas de la cápside se pueden ensamblar en nanopartículas similares a virus que tienen un diámetro de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 nm.
Una "proteína de la cápside externa", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una proteína de la cápside que está expuesta en la superficie de una VLP. En algunos aspectos, proteínas de la cápside externas (por ejemplo, proteínas L1) se conjugan con una (por ejemplo, al menos una) molécula fotosensible.
Una "molécula fotosensible", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula no tóxica que, cuando se expone de manera selectiva a la luz, se convierte en "activada" (también denominada como "fotoactivada"). En algunos aspectos, una molécula fotosensible activada vuelve a emitir luz tras excitación luminosa (por ejemplo, un fluoróforo). En algunas realizaciones, una molécula fotosensible activada se puede volver tóxica, o puede producir moléculas tóxicas, tras excitación luminosa. Por ejemplo, una clase de moléculas fotosensibles, denominada como fotosensibilizadores, se pueden promover a un estado excitado tras absorción de luz y experimentar un cruce intersistema con oxígeno para producir oxígeno singlete. Este oxígeno singlete ataca rápidamente cualquier compuesto orgánico que encuentra, por lo que es altamente citotóxico.
Según varios aspectos de la presente descripción, las moléculas fotosensibles se pueden conjugar con proteínas de la cápside (por ejemplo, proteínas de la cápside L1 y/o L2) de las VLP. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan covalentemente con proteínas de la cápside de las VLP. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan covalentemente con residuos de lisina de proteínas de la cápside de las VLP. En la presente memoria, se puede denominar a las VLP que se conjugan con moléculas fotosensibles como "conjugados de VLP" o "VLP fotosensibles". En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles comprenden un grupo éster de NHS (N-hidroxisuccinimida) que reacciona con un grupo amino de la proteína de la cápside (por ejemplo, grupo amino de lisina o de otro aminoácido) para formar un enlace amida covalente.
La relación de molécula fotosensible (MF) a VLP puede variar. En algunos aspectos, la relación de VLP:FM es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1000, de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:500, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:500 o de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:1000. Esto es, en algunos aspectos, una VLP puede comprender de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. En algunas realizaciones, la relación de v Lp :FM es 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:50, 1:75, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800. 1:850, 1:900, 1:950 o 1:1000. En algunos aspectos, la VLP puede comprender 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 moléculas fotosensibles. En algunos aspectos, la VLP puede comprender más de 1000 moléculas fotosensibles o menos de 10 moléculas fotosensibles.
Más de una molécula fotosensible se puede conjugar con una única proteína de la cápside. Por ejemplo, una única proteína de la cápside (por ejemplo, proteína de la cápside L1 o L2) se puede conjugar con de 1 a 5 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5) moléculas fotosensibles. Por consiguiente, más de un aminoácido de una proteína de la cápside se puede conjugar con una molécula fotosensible. En algunos aspectos, una única proteína de la cápside se puede conjugar con de 1 a 2, de 1 a 3, o de 2 a 3 moléculas fotosensibles. Por consiguiente, una molécula fotosensible se puede conjugar con 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos diferentes (por ejemplo, lisina, arginina y/o histidina, u otro aminoácido) de una única proteína de la cápside.
Los ejemplos de moléculas fotosensibles para su uso según la presente descripción incluyen, sin limitación, colorantes fluorescentes, colorantes infrarrojos, colorantes de infrarrojo cercano, moléculas de porfirina y moléculas de clorofila.
Los ejemplos de colorantes fluorescentes para su uso según la presente descripción incluyen, sin limitación, naranja de acridina, amarillo de acridina, Alexa Fluor, 7-aminoactinomicina D, ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfónico, colorantes ATTO, tinción de auramina-rodamina, benzantrona, bimano, 9,10-bis(feniletinil)antraceno, 5,12-bis(feniletinil)naftaceno, bisbencimida, pintura de luz negra, calceína, carboxifluoresceína, succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína, succinimidil éster de carboxifluoresceína, 1-cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno, 2-cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno, 2-cloro-9,10-difenilantraceno, cumarina, DAPI, desactivador oscuro, DiOC6, DyLight Fluor, Fluo-3, Fluo-4, FluoProbes, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, cirugía guiada por fluorescencia, tinción de fluoro-jade, fura-2, fura-2-acetoximetil éster, Gelgreen, Gelred, proteína verde fluorescente, colorantes de heptametina, amarillo indio, indo-1, amarillo de Lucifer, luciferina, MCherry, merocianina, azul Nilo, rojo Nilo, blanqueante óptico, perileno, floxina, ficobilina, ficoeritrina, ficoeritrobilina, yoduro de propidio, piranina, rodamina, rodamina 123, rodamina 6G, RiboGreen, RoGFP, rubreno, (E)-estilbeno, (Z)-estilbeno, sulforhodamina 101, sulforhodamina B, SYBR Green I, synapto-pHluorin, tetrafenil butadieno, tetrasodio tris(batofenantrolina disulfonato) rutenio (II), rojo Texas, amarillo Titán, TSQ, umbeliferona, proteína amarilla fluorescente y YOYO-1. Los ejemplos de colorantes fotosensibilizadores para su uso según la presente descripción incluyen, sin limitación, HpD, porfímero sódico, (Photofrin®, Photogem®, Photosan Hemporfin®), m-THPC, temoporfina (Foscan®), verteporfina (Visudyne®), HPPH (Photochlor®), paladio bacteriofeofórbido (Tookad®), 5-ALA, ácido 5-aminolevulínico (Levulan®),metil éster de 5-ALA (Metvix®), bencil éster de 5-ALA(Benzvix®), hexil éster de 5-ALA (Hexvix®), texafirina de lutecio(NI) o lutecio motexafina (Lutex®, Lutrin®, Angrin®, Optrin®), SnET2, Tin (IV) etiopurpurina de etilo (Purlytin®, Photrex®), NPe6, mono-L-aspartil-clorina e6, talaporfina sódica, (Talporfin®, Laserphyrin®), BOPP, protoporfirina borada (BOPP®), ftalocianina de zinc (CGP55847®), ftalocianina de silicio (Pc4®), mezcla de derivados de ftalocianina de aluminio sulfonada (Photosens®), ATMPn, acetoxi-tetrakis (beta-metoxietil-)porficeno), TH9402 y metil éster de dibromorodamina.
Los ejemplos de colorantes fotosensibilizadores para su uso según la presente descripción incluyen aquellos que se pueden utilizar en diagnóstico por fluorescencia (por ejemplo, colorantes fluorescentes de infrarrojo cercano (IRC)) como La Jolla Blue® y IRDye® 700DX.
La presente descripción proporciona también métodos para administrar, a un sujeto que tiene un tumor, una partícula similar a virus de direccionamiento a tumores que comprende moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas de la cápside, o administrar, a un sujeto que tiene un tumor, una partícula similar a virus de direccionamiento a tumores que comprende aproximadamente de 50 a aproximadamente 1000 (por ejemplo, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000) moléculas fotosensibles.
En algunos aspectos, el sujeto es un mamífero, como un ser humano.
El modo de administración puede ser por inyección, infusión, implantación, administración por vía tópica, o por medio de cualquier medio utilizado típicamente para entregar partículas similares a virus. En algunas realizaciones, se utilizan agujas huecas, agujas recubiertas, miniagujas o microagujas, dependiendo del área de inyección. En algunas realizaciones, el modo de administración es por medio de inyección en el espacio intraocular o en el vítreo de un ojo (por ejemplo, para dirigirse a tumores oculares o tumores que se han metastatizado al ojo).
Los ejemplos de reactivos que se pueden utilizar para entregar partículas similares a virus de la presente descripción incluyen, sin limitación, solución salina, MgCl2, trehalosa, hialuronato de sodio, polisorbato 20, polisorbato 80 o cualquier combinación de dos o más de los reactivos anteriores.
Las moléculas fotosensibles de la descripción se pueden activar a una longitud de onda adecuada. En algunas realizaciones, la activación de las moléculas fotosensibles hace que se vuelvan citotóxicas o capaces de producir una molécula citotóxica. Las longitudes de onda adecuadas incluyen, sin limitación, longitudes de onda ultravioleta, longitudes de onda visible, longitudes de onda infrarroja y longitudes de onda de infrarrojo cercano. En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se activan y se vuelven citotóxicas a una longitud de onda de 600 nm a 800 nm, o de 660 nm a 740 nm. En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se activan y se vuelven citotóxicas a una longitud de onda de aproximadamente 600 nm, 610 nm, 620 nm, 630 nm, 640 nm, 650 nm, 660 nm, 670 nm, 680 nm, 690 nm, 700 nm, 710 nm, 720 nm, 730 nm, 740 nm, 750 nm, 760 nm, 770 nm, 780 nm, 790 nm o 800 nm. En algunos aspectos, las moléculas fotosensibles se activan a una longitud de onda inferior a 600 nm o superior a 800 nm. Las longitudes de onda adecuadas para activar moléculas fotosensibles dependerán de la molécula particular utilizada.
Las moléculas fotosensibles de la descripción, dependiendo del tipo de molécula, se pueden activar por medio de luz infrarroja, de infrarrojo cercano o ultravioleta. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede utilizar un láser infrarrojo, de infrarrojo cercano o ultravioleta para activar moléculas fotosensibles de conjugados de VLP. La energía entregada por el láser puede oscilar de aproximadamente 5 J a aproximadamente 100 J, de aproximadamente 5 julios (J) a aproximadamente 50 J, o de aproximadamente 8 J a aproximadamente 36 J. En algunas realizaciones, la energía entregada por el láser es 8 J, 9 J, 10 J, 11 J, 12 J, 13 J, 14 J, 15 J, 16J, 17 J, 18 J, 19 J, 20 J, 21 J, 22 J, 23 J, 24 J, 25 J, 26 J, 27 J, 28 J, 29 J, 30 J, 31 J, 32 J, 33 J, 34 J, 35 J, 36 J, 37 J, 38 J, 39 J, 40 J, 41 J, 42 J, 43 J, 44 J, 45 J, 46 J, 47 J, 48 J, 49 J, 50 J, 51 J, 52 J, 53 J, 54 J, 55 J, 56 J, 57 J, 58 J, 59 J, 60 J, 61 J, 62 J, 63 J, 64 J, 65 J, 66 J, 67 J, 68 J, 69 J, 70 J, 71 J, 72 J, 73 J, 74 J o 75 J. En algunas realizaciones, la energía entregada por el láser es 10 J, 20 J, 30 J, 40 J, 50 J, 60 J, 70 J, 80 J, 90 J o 100 J.
Se puede aplicar una luz o un láser a las moléculas fotosensibles (o VLP fotosensibles) de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la luz o el láser se aplica a las moléculas fotosensibles durante 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 55 segundos para activar las moléculas. En algunas realizaciones, el láser se aplica a las moléculas fotosensibles durante 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5 o 5 minutos, o más. Se entenderá que la longitud del tiempo durante el que se aplica una luz o un láser a una molécula fotosensible puede variar dependiendo, por ejemplo, de la energía (por ejemplo, vataje) de este último. Por ejemplo, los láseres con un vataje inferior se pueden aplicar a una molécula fotosensible durante un periodo de tiempo mayor para activar la molécula.
Se puede aplicar una luz o un láser a las moléculas fotosensibles (o conjugados de VLP) de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas después de administrar los conjugados de VLP. Por ejemplo, en algunos aspectos, la luz o el láser se aplica a las moléculas fotosensibles 30, 35, 40, 45, 50 o 55 minutos después de administrar los conjugados de v Lp . En algunos aspectos, la luz o el láser se aplica a las moléculas fotosensibles 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas después de administrar los conjugados de VLP. En algunas realizaciones, la luz o el láser se aplica a las moléculas fotosensibles 36 o 48 horas después de administrar los conjugados de VLP.
La luz o el láser se puede aplicar directamente en el lugar del tumor. Por ejemplo, los conjugados de VLP que se dirigen a tumores oculares se pueden activar iluminando el ojo.
Cualquier tipo de tumor puede ser la diana según la presente descripción. Los ejemplos de tumores incluyen, sin limitación, aquellos localizados en el ojo, pulmón, pleura, hígado, páncreas, estómago, esófago, colon, pecho, ovario, próstata, cerebro, meninges, testículos, riñones, vejiga, cabeza, cuello, cérvix, laringe y/o piel.
En algunas realizaciones, el tumor es un tumor ocular. El tumor ocular se puede localizar en el vítreo, espacio coroideo, iris, cuerpo ciliar, esclerótica, fóvea, retina, papila óptica o nervio óptico.
En algunas realizaciones, el tumor es canceroso o maligno. En algunas realizaciones, el tumor es metastásico. También otros tumores pueden ser la diana. Por ejemplo, la presente solicitud proporciona métodos y composiciones para dirigirse a células de cáncer cervical, células de cáncer de ovario, células de melanoma, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de cabeza y/o cuello, y células de cáncer de vejiga.
Composiciones
En algunos aspectos, las partículas similares a virus (nanopartículas similares a virus) de la presente descripción son nanopartículas similares a virus conjugadas con moléculas fotosensibles. Las nanopartículas similares a virus contienen uno o más tipos de proteínas de la cápside del virus del papiloma. En algunos aspectos, se modifican las proteínas de la cápside. Las proteínas de la cápside se autoensamblan típicamente en proto-cápsides "vacías" de aproximadamente 55 nm de diámetro (por ejemplo, partículas de tipo esférico que contienen un núcleo vacío). Después de maduración de las proto-cápsides para formar nanopartículas similares a virus (partículas similares a virus), las nanopartículas similares a virus se conjugan entonces químicamente con una molécula fotosensible (por ejemplo, un colorante IR700 como IRDye® 700DX, un colorante infrarrojo fabricado por LI-COR®).
En algunos aspectos, las nanopartículas similares a virus fotosensibles se proporcionan en una disolución estéril (por ejemplo, 1 o 2 ml) en viales de un único uso (por ejemplo, viales de vidrio de borosilicato). En algunos aspectos, las nanopartículas similares a virus fotosensibles se proporcionan en una disolución estéril de agua que incluye opcionalmente NaCl, KCl, Na2HPO4.2H2O, KH2PO4 o cualquier combinación de dos o más de lo anterior. En algunos aspectos, el NaCl puede estar presente en la disolución en una concentración de 400 a 600 mMol (por ejemplo, 500 mMol). En algunos aspectos, el KCl puede estar presente en la disolución en una concentración de 2 a 6 mMol (por ejemplo, 2,7 mMol). En algunos aspectos, el Na2HPO4.2H2O puede estar presente en la disolución en una concentración de 5 a 15 mMol (por ejemplo, 10 mMol). En algunos aspectos, el KH2PO4 puede estar presente en la disolución en una concentración de 1 a 3 mMol (por ejemplo, 2 mMol).
En algunos aspectos, las nanopartículas similares a virus fotosensibles se diluyen y administran por vía intraocular utilizando una jeringuilla y una aguja estériles utilizadas comúnmente en procedimientos oftalmológicos. La presente descripción proporciona también otras vías de administración y administración a otros tumores y/o metástasis, como se describe en otra parte de este documento.
En algunos aspectos, cada nanopartícula similar a virus comprende 12-72 capsómeros, cada capsómero contiene 5 moléculas de proteína de la cápside L1 (por ejemplo, 55-56 kD cada una) y 1 molécula de proteína de la cápside L2 (por ejemplo, 52 kD cada una). En algunos aspectos, cada nanopartícula similar a virus comprende 12-72 capsómeros, cada capsómero contiene solo proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, 5 moléculas de proteína L1 por capsómero).
En algunos aspectos, cada nanopartícula similar a virus se conjuga químicamente (por ejemplo, por medio de un enlace amida) con de 10 a 1000 moléculas (por ejemplo, 500 moléculas) de molécula fotosensible (un colorante IR700 como IRDye® 700DX) con al menos un aminoácido (por ejemplo, aminoácido lisina) de la proteína.
Métodos para producir partículas similares a virus
Para producir las nanopartículas similares a virus de la presente descripción, se pueden cultivar (por ejemplo, en un cultivo de suspensión) células de mamífero, tales como células 293T (por ejemplo, células HEK293F) y transfectarlas de manera transitoria con un ácido nucleico (por ejemplo, ADN plásmido bicistrónico) que codifica proteínas de la cápside L1 del VPB o del VPH (o L1 y L2). Esto induce la formación de proto-cápsides (por ejemplo, como se describe en Buck et. al. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, diciembre 2007. Después de la recuperación y disrupción de la masa celular, las proto-cápsides se pueden someter a aclaramiento del ADN huésped con tratamiento con benzonasa y un proceso de maduración in vitro subsecuente para formar nanopartículas similares a virus estables. Después de la purificación, las nanopartículas similares a virus se pueden conjugar químicamente con moléculas fotosensibles (por ejemplo, éster de NHS IR700) para producir las nanopartículas similares a virus fotosensibles). La Figura 23 muestra una representación esquemática de un ejemplo de un proceso de producción proporcionado en la presente memoria.
Por consiguiente, en algunos aspectos, se proporcionan en la presente memoria métodos para producir moléculas fotosensibles, que comprende (a) transfectar de manera transitoria células con un ácido nucleico que codifica una o más proteínas de la cápside, formando así proto-cápsides, (b) recolectar las proto-cápsides y someter las protocápsides a un proceso de maduración in vitro, formando así nanopartículas similares a virus estables, y (c) conjugar químicamente las nanopartículas similares a virus con de 50 a 1000 moléculas fotosensibles. En algunas realizaciones, las nanopartículas similares a virus se conjugan con 500 moléculas fotosensibles. En algunas realizaciones, las nanopartículas similares a virus se conjugan con moléculas fotosensibles a través de un enlace amida (por ejemplo, reaccionando un grupo éster de una molécula fotosensible con un grupo amino de un aminoácido de la proteína de la cápside de una nanopartícula similar a virus).
Ejemplos
Ejemplo 1 - Conjugación de IRDye® 700DX
El procedimiento de conjugación química de VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de variantes de las proteínas L1 del VPH 16/31 y proteínas L2 del VPH) con una molécula fotosensible (por ejemplo, IRDye® 700DX) es como sigue. Típicamente, las disoluciones de VLP se mantuvieron en una concentración de 1 mg/ml en PBS, pH=7,2 y de 0,3 a 0,5 M de NaCl. Las moléculas de IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX) fueron suministradas por el fabricante como ésteres de NHS (N-hidroxicurrinimida) secos (los ésteres de NHS reaccionan con los grupos amino en las proteínas para formar enlaces amida covalentes) (Figura 10A). Los grupos amino disponibles en las proteínas son el amino terminal de la proteína o el grupo £-amino en el aminoácido (por ejemplo, lisina). El éster de NSH-IR700 seco sólido se disolvió en DMSO en una concentración de 5 mg/ml y se almacenó congelado. Típicamente, las diferentes relaciones de VLP: colorante se alcanzaron al mezclar diferentes cantidades de NHS-IR700 con una cantidad fija de VLP, normalmente 1 ml de 1 mg/ml de disolución en PBS. Las relaciones y las cantidades típicas de NHS-IR700 se enumeran en la siguiente tabla:
Tabla 1
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Para hacer una relación de 200:1, 1 ml de VLP a 1 mg/ml en PBS se mezcló con 3,2 |jl de la disolución de éster de NHS-IR700. Estas reacciones se ejecutaron durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Después de completar la reacción, las VLP se purificaron por medio de cromatografía en columna de afinidad a heparina para separar el NHS-IR700 no unido del conjugado VLP-IR700 recién formado (también denominado como v Lp fotosensible).
Ejemplo 2 - Conjugación de Visudyne®
La conjugación de Visudyne® con las VLP seguida por un protocolo ligeramente diferente en relación con el de NHS-IR700. Las moléculas de Visudyne® requirieron funcionalización a NHS, antes de conjugación con VLP. Esta funcionalización se consiguió a través del uso de EDC (hidrocloruro de 1-etil-3-(-3-dimetilaminopropil)carbodiimida)). La EDC se utilizó para funcionalizar moléculas que tienen una molécula de ácido carboxílico libre, como Visudyne® (véase la Figura 10b , marcado con un círculo), y en presencia de sulfo-NHS transfiere eficazmente el resto de NHS a este agente. Este esquema de reacción se describe en la Figura 11. En síntesis, aproximadamente 2 mM de EDC y un exceso 2x molar de sulfo-NHS se reaccionó con cantidades variables de Visudyne®. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, las reacciones se pararon con la adición de 2-mercaptoetanol en una concentración final de 20 mM. Esta mezcla de reacción se añadió a 1 mg de VLP a una concentración de 1 mg/ml en PBS, pH=7,2 0,3­ 0,5 M de NaCl y se incubó durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Finalmente, los componentes no reactados se separaron de los conjugados de VLP por medio de cromatografía en columna de afinidad a heparina.
Ejemplo 3 - La especificidad de unión de VLP se media por medio de HSPG y se inhibe por heparina
Se trataron células SK-OV-3 en suspensión en las siguientes condiciones: sin VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de variantes de las proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH), VLP conjugada tanto con Alexa Fluor® 488 (Figura 3 "AF488*PsV") como IR700 (Figura 3, "IR700*PsV") como los mismos conjugados de VLP incubados en presencia de HSPG. Después de la incubación, estos cultivos se sometieron a 4 julios de luz de infrarrojo cercano de 690 mm. Un conjunto paralelo de células irradiadas sin luz actuó como control. Después de la irradiación, los cultivos se evaluaron para el alcance de la muerte celular. La Figura 3 muestra que la única condición en la que hubo una destrucción celular sustancial fue la exposición a IR700*PsV y a 4 julios de luz. No se observó muerte celular similar con exposición a AF488*PsV, lo que revela que la muerte celular es específica de los conjugados de colorante IR700. Además, la muerte celular se suprime casi por completo en presencia de HSPG, lo que revela que la unión de VLP a la célula es fundamental para la muerte celular mediada por IR700.
Ejemplo 4 - La muerte celular depende de la radiación infrarroja y de la cantidad de VLP e IR700
Se trataron células SK-OV-3 en suspensión con concentraciones diferentes de VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de variantes de las proteínas L1 del VPH16/31 y de proteínas L2 del VPH) se habían conjugado con cantidades diferentes de colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX). Se utilizó VLP sin conjugar con colorante IR700 como control. Después de la incubación, estos cultivos se sometieron de 0 a 16 julios de luz de infrarrojo cercano de 690 mm. Después del tratamiento luminoso, se evaluó el alcance de la muerte celular. La Figura 4 muestra que la muerte celular es dependiente tanto de la presencia del colorante IR700 como del tratamiento luminoso. Esto se sustenta en la observación de que la muerte celular depende tanto de la concentración de VLP como de la relación de conjugación del colorante IR700.
Ejemplo 5 - Muerte celular in vitro de células SKOV-3 tras irradiación después de tratamiento de VLP conjugadas con IR700
Las células de cáncer de ovario SKOV-3 se colocaron en placas en una placa de 24 pocillos y se trataron con dos concentraciones diferentes de partículas VLP fotosensibles (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de variantes de las proteínas L1 del VPH16/31 y de proteínas L2 del VPH conjugadas con colorante IR700), 2,5 jg (rojo) y 0,25 jg (azul), durante 1 hora a 37 °C. Tras unión, las células se lavaron, seguido de tratamiento con 4 J de luz. Se determinó la muerte celular tras estimación enzimática de liberación de LDH (determinada por medio de medición de la absorbancia a 490 nm). Tres relaciones molares diferentes de conjugación de VLP:IR700 se sometieron a prueba: 1:500, 1:1000 y 1:2000, respectivamente. La Figura 5 muestra que la eficacia máxima de la muerte celular se observó a una relación 1:1000 de VLP:IR700 ("PsV:IR700") para ambas concentraciones sometidas a prueba. Se utilizó lisis celular mediada por detergente como control positivo.
Ejemplo 6 - Evaluación estructural de complejos IR700-PsV
La Figura 6 muestra un análisis ESI-TOF de VLP de control (PsV) (A) y VLP conjugadas con IR700 (PsV) (B). En la Figura 6B, la reacción se configuró para alcanzar conjugación de cada molécula de VLP (PsV) con 1000 moléculas de IR700. La señal alcanza un pico en los escáneres ESI-TOF que se corresponde con la VLP de la proteína L1. Un cambio de 5517 uma se observó en muestras conjugadas en relación a muestras de control, dichas muestras conjugadas se corresponden con un promedio de 3 moléculas de IR700 conjugadas (1840 uma) por proteína L1 o aproximadamente 1000 moléculas de IR700 por VLP (típicamente, hay 360 L1 por VLP).
Ejemplo 7 - La unión de agente determina el alcance de la muerte celular en una línea celular de melanoma ocular
Se expuso la línea celular de melanoma ocular (92.1; HER2-) en suspensión a diluciones variables tanto de anticuerpo Herceptin® conjugado con colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX) como de VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de variantes de las proteínas L1 del VPH16/31 y de las proteínas L2 del VPH) conjugada con colorante IR700. Se evaluaron entonces cultivos paralelos para unión de agente (Figura 7C) o muerte celular en ausencia (Figura 7B) o presencia (Figura 7A) de 16 julios de luz de infrarrojo cercano de 690 nm. La Figura 7C muestra la unión de VLP dependiente de concentración a las células de melanoma ocular 92.1, mientras la unión del anticuerpo Herceptin® está ausente esencialmente. La Figura 7B muestra que, en ausencia de luz, no hay muerte celular. La Figura 7A muestra muerte celular dependiente de concentración solo en células tratadas con VLP fotosensible.
Ejemplo 8 - La unión de agente determina el alcance de la muerte celular en una línea celular de cáncer de ovario
Se expusieron células SK-OV-3 (HER2-) es suspensión a diluciones variables tanto de anticuerpos Herceptin® como de partículas VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de variantes de las L1 del VPH16/31 y de las proteínas L2 del VPH) conjugada con colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX). Se evaluaron entonces cultivos paralelos para unión de Herceptin® o VLP (Figura 8C) o muerte celular en ausencia (Figura 8B) o presencia (Figura 8A) de 16 julios de luz de infrarrojo cercano de 690 nm. La Figura 8C muestra que la unión de VLP se satura en células SK-OV-3. La unión de Herceptin® también es dependiente de concentración, pero en un grado menor en relación a las VLP. La Figura 8B muestra que, en ausencia de luz, no hay muerte celular. La Figura 8A muestra la muerte celular dependiente de concentración en ambas condiciones, pero, de manera similar a la unión, la respuesta se satura con VLP mientras parece haber un aumento dependiente de concentración en muerte celular con Herceptin®. Estos datos implican que las VLP conjugadas con IR700 (PsV-IR700) son más potentes que Herceptin® conjugado con IR700 (Herceptin-IR700).
Ejemplo 9 - Los anticuerpos neutralizantes anti-VPH16 inducidos por vacunas no bloquean la unión de VPB*IR700 VLP a la línea celular de melanoma ocular, 92.1
Las muestras de suero que contienen anticuerpos diferentes se sometieron a prueba para la capacidad de inhibir partículas VLP fotosensibles (por ejemplo, VLP del VPH 16 o VLP del VPB) que se unen a la línea celular del melanoma ocular 92.1. La Figura 9 muestra que condiciones "sin suero" o "sin tratar con suero" no contienen actividad que neutralice la unión de VLP. Además, la actividad bloqueante que se ha observado fue específica para serotipo de virus. Esto es, solo partículas similares a virus del papiloma humano conjugadas con colorante IR700 (VPH16-IR700) se neutralizaron con suero que contiene anticuerpos de VPH16. Las partículas similares a virus del papiloma bovino conjugadas con IR700 (VPB-IR700) no se neutralizaron por medio de suero que contiene anticuerpos específicos para VPH16.
Ejemplo 10 - Evaluación de la inmunogenicidad
En un estudio similar al descrito en el Ejemplo 9, se determinaron títulos neutralizantes por medio de dilución en serie de sueros que contienen anticuerpos tanto contra VPH16 como VPB. Los resultados descritos en la Tabla 2 muestran que los anticuerpos contra VPH16 neutralizan solo VPH16. Además, los anticuerpos contra VPB neutralizan solo VPB. Por consiguiente, no hay ni reactividad cruzada de anticuerpos de VPH16 contra VPB ni de anticuerpos BVP contra VPH16.
Tabla 2
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Ejemplo 11 - Estudio de unión
El objetivo de este Ejemplo es evaluar la unión de nanopartículas similares a virus que contienen proteínas de la cápside del virus del papiloma humano 16 (VPH16), variantes de las proteínas de la cápside L1 del VPH16/31 y proteínas de la cápside del virus del papiloma bovino (VPB) a varios tipos de células cancerosas. Además, las nanopartículas similares a virus que contienen proteínas de la cápside L1 y L2, o solo proteínas de la cápside L1, se sometieron a prueba para determinar si había una dependencia de L2 para nanopartículas similares a virus que se unen a células cancerosas. Los resultados de este estudio muestran que la unión de nanopartículas similares a virus del VPB y de nanopartículas similares a virus del VPH era comparable.
Se cribó un gran panel de líneas celulares, que incluyó: líneas celulares diversas (por ejemplo, 293TT, HaCaT, PAM-212 y TC-1), líneas celulares cervicales (por ejemplo, HeLa, SiHa, CaSki y C-33A), líneas celulares de ovario (por ejemplo, MOSEC, SHIN-3, SK-OV-3, WF-3, ES-2, A2780, OVCAR-3 y OVCAR-4), líneas celulares de melanoma (por ejemplo, B16F10, SKMEL-2, SKMEL-5, SKMEL-28 y UACC), líneas celulares de melanoma ocular (por ejemplo, 92.1, MKT-BR, OCM-1 y UW-1), líneas celulares de pulmón (por ejemplo, NCI-H23, NCI-H322M, NCI-H460 y NCI-H522), líneas celulares de cabeza y cuello (por ejemplo, CAL-33 (HPV-), FaDu (HPV-), HSC-3 (HPV-), SNU-1076 (HPV-), UM-SCC-47 (HPV+), UPCI-SSC-90 (HPV+) y UPCI-SCC-154 (HPV+), y líneas celulares de vejiga (por ejemplo, 5637, J82, RT112, SCaBER, SVHUC, T24, UMUC-3, UMUC-5).
Antes del experimento, se conjugaron nanopartículas similares a virus con AlexaFluor488 para permitir un análisis fácil y directo de nanopartículas similares a virus que se unen a la superficie celular. Se fijó AlexaFluor488 a la nanopartícula similar a virus utilizando la química del éster de N-hidroxicurrinimida (NHS), que no interfiere con la unión. Se sometió a prueba cada nanopartícula similar a virus en una concentración de 10 pg/ml, 1 pg/ml y 0,1 pg/ml.
Se tripsinizaron células para retirarlas de la superficie plástica de placas de cultivo tisular, se lavaron y se les dejó recuperarse durante 4 horas a 37 °C en medio de crecimiento en una plataforma basculante. Las células se lavaron entonces, se contaron y se colocaron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a 1 x 105 células/pocillo en solución salina tamponada con fosfato (PBS)/suero bovino al 2% (FBS). Se añadieron las nanopartículas similares a virus a las células en un volumen final de 100 pl de PBS/FBS al 2%. Se añadieron también nanopartículas similares a virus incubadas previamente con heparina (1 mg/ml, 1 hora, 4 °C) a los pocillos como controles. Las células y las nanopartículas similares a virus se incubaron entonces durante 1 hora a 4 °C (en la oscuridad), se lavaron dos veces con PBS/ FBS al 2% y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las células se lavaron de nuevo y se volvieron a suspender en 200 pl de PBS/FBS al 2% y se analizaron en un BD FACS CANTO™ II (BD Biosciences, San Jose, California, EE. UU.) utilizando BD FACSDIVA™ (BD Biosciences, San Jose, California, EE. UU.) y software FlowJo.
Los resultados utilizando las líneas celulares TC-1, HeLa, SK-OV-3, SKMEL-28, 92.1, NCI-H322M, HSC-3, UPCI-SCC-154 y T24 se representan como histogramas en la Figura 12. Como evidencia la Figura 12, todas las nanopartículas similares a virus, sin importar su serotipo o composición (L1 frente a L1/L2) se unen a células cancerosas en el ensayo de unión. Además, la heparina compite por la unión, lo que demuestra que la unión de la nanopartícula similar a virus es específica y dependiente de HSPG.
Ejemplo 12 - Curso del tiempo de la biodistribución
El objetivo de este Ejemplo es evaluar la ubicación tumoral y el curso del tiempo del aclaramiento de nanopartículas similares a virus después de inyección intravenosa en animales con tumor.
Se prepararon nanopartículas similares a virus purificadas marcando nanopartículas similares a virus (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de variantes de las proteínas L1 del VPH16/31 y de L2 del VPH) con colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX) en una relación de nanopartícula similar a virus:colorante de 1:500. Las nanopartículas similares a virus fotosensibles se purificaron por medio de ultracentrifugación en gradiente de densidad utilizando medio de gradiente de densidad OPTIPREP™.
Los tumores se generaron en ratones C57Bl/6 albinos por medio de inyección subcutánea de 2 x 105 células cancerosas TC-1 en 100 pl de PBS. Después de aproximadamente dos semanas, los animales se aleatorizaron en grupos de tratamiento. Los animales con tumor recibieron por inyección intravenosa tanto PBS como 200 pg de nanopartículas similares a virus fotosensibles en un volumen de 100 pl. Doce o veinticuatro horas después de la inyección, se practicó la eutanasia a los animales. Después de la eutanasia, el tejido tumoral se recolectó y diagnosticó por imágenes para fluorescencia del colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX), que indica la presencia de nanopartículas similares a virus fotosensibles.
La Figura 13B muestra la florescencia del colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX) detectable en el tejido tumoral obtenido a partir de puntos temporales tanto de 12 como de 24 horas, mientras no se detectó fluorescencia en el control de PBS (punto temporal de 12 horas). La fluorescencia total cuantitativa en el tejido tumoral se representa gráficamente en el gráfico representado en la Figura 14.
Ejemplo 13 - Curso del tiempo de la biodistribución
El objetivo de este Ejemplo es evaluar la ubicación tumoral y el curso del tiempo del aclaramiento de nanopartículas similares a virus después de inyección intravenosa en animales con tumor.
Las nanopartículas similares a virus purificadas se marcaron con AlexaFluor488 y se purificaron por medio de ultracentrifugación en gradiente de densidad utilizando medio de gradiente de densidad OPTIPREP™.
Los tumores se generaron en ratones C57Bl/6 albinos por medio de inyección subcutánea de 2 x 105 células cancerosas TC-1 en 100 pl de PBS. Después de aproximadamente 2 semanas, se entregaron 200 pg de las nanopartículas similares a virus fotosensibles por medio de inyección intravenosa en un volumen de 100 pl. Los tumores se recolectaron en los siguientes puntos temporales después de inyección con nanopartículas similares a virus: T=1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 y 72 horas. Tras la recolección, los fragmentos de tumores se congelaron para evaluación microscópica. Para esta evaluación microscópica, las secciones de tejido se tiñeron adicionalmente. Se utilizó suero policlonal de conejo contra VPH16 en conjunción con anticuerpos secundarios de AlexaFluor-488. Los vasos sanguíneos se tiñeron conjuntamente con un anticuerpo anti-CD31 de rata y un anticuerpo secundario de AlexaFluor-594 anti rata. Los núcleos se resaltaron con DAPI.
Los datos (imágenes in situ no mostradas) demostraron la presencia de las nanopartículas similares a virus en el punto temporal de 1 hora. La localización de la señal pareció estar asociada en los vasos sanguíneos. El nivel máximo de tinción pareció ocurrir en el punto temporal de 8 horas y, en el punto temporal de 8 horas, las nanopartículas similares a virus fotosensibles parecieron estar difundiendo desde los vasos sanguíneos a las células tumorales. Finalmente, en los puntos temporales de 24 horas y 48 horas, pareció existir una pequeña señal de nanopartículas similares a virus en el tumor.
Ejemplo 14- Eficacia in vivo después de administración sistémica
El estudio presentado en este Ejemplo se diseñó para medir viabilidad tumoral 24 horas después de un único tratamiento. El estudio establece directrices para estudios in vivo de larga duración.
El diseño del estudio completo se ilustra en la Figura 15. Debido al intervalo en los tamaños de los tumores, los animales se aleatorizaron de tal manera que hubiera una distribución uniforme de tumores grandes y pequeños en cada grupo de n=3 en los grupos tratados con solución salina y de n=5 en los grupos tratados con nanopartículas similares a virus fotosensibles de IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX). Las nanopartículas similares a virus se administraron por vía intravenosa 12 horas antes del tratamiento luminoso. Se sometieron a prueba dosis de cien microgramos (100 pg) y de 200 pg. El tratamiento luminoso incluyó 25 J (62,3 s a 400 mW) o 50 J (125 s a 400 mW). Después de 24 horas, los tumores se recolectaron y procesaron utilizando colagenasa y Dnasa para generar una única suspensión de células. Se aplicó entonces tinción amarilla de BD LIVE/DEAD®, y las células se coloraron por todo un FACS CANTO™ II. Los datos se registraron como porcentaje de células muertas como indicó un cambio en la fluorescencia en el canal naranja pacífico (Figura 16A).
Una dosis única de 200 pg de nanopartículas (NP) similares a virus fotosensibles de IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX) fueron capaces de matar la mayoría de las células tumorales después de tratamiento con 50 J de luz (Figura 16B y Figura 17C). El nivel de destrucción con 200 pg de NP se redujo casi la mitad cuando los tumores se trataron con 25 J de luz (Figura 16B y Figura 17B). 100 pg de NP no fue suficiente para inducir la destrucción con 25 J de luz (Figura 16B y Figura 17B); sin embargo, alguna muerte tumoral se observó a una dosis de 50 J (Figura 16B y Figura 17C). Este estudio proporcionó las nanopartículas similares a virus fotosensibles de IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX) y la información sobre dosificación de luz necesarias para estudios in vivo.
Ejemplo 15 - Estudio de activación del sistema inmune
El modelo tumoral TC-1 ofrece la capacidad de examinar la inducción inmune antitumoral tras tratamiento con nanopartículas similares a virus en animales competentes inmunes. La línea tumoral TC-1 se desarrolló a partir de células epiteliales pulmonares C57Bl/6 inmortalizadas con oncogenes E6 y E7 del VPH16 al igual que un gen mutado que expresa c-Ha-Ras (Lin KY, et al., Cancer Research. 56(1):21-6, 1996). Estas células se pueden implantar por vía subcutánea o, para estudiar modelos metastásicos, se pueden inyectar por vía intravenosa para plantar células en los pulmones. Durante casi veinte años, estas células se han utilizado para someter a prueba la eficacia terapéutica de las vacunas contra E6 y E7. El E7 tiene un epítope MHC de clase I distintivo en el fondo C57Bl/6 que ha mostrado ser protector si se puede provocar una respuesta de una célula T CD8 contra él (H-2Db, aa 49-57 RAHYNIVTF) (Feltkamp MC, et al. European Journal of Immunology. 23(9):2242-9, 1993). Estas respuestas se detectan tanto por medio de tinción con tetrámetros como por reestimulación de las células con el péptido seguido por tinción de citosina intracelular.
Estudio de respuesta a la dosis: Los animales se inocularon por vía subcutánea con 2 x 105 células TC-1 en 100 pl de PBS. Aproximadamente dos semanas después de la inoculación, los animales se aleatorizaron en seis grupos: (1) controles sin tratamiento, (2) 100 pg de nanopartículas similares a virus (que contienen una combinación de variantes de las proteínas L1 del VPH16/31 y de proteínas L2 del VPH, marcadas con IRDye® 700DX) sin controles de luz, (3) PBS con 50 J/cm2 de controles de luz, (4) 200 pg de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz, (5) 100 pg de nanopartículas similares a virus 50 J/cm2 de luz y (6) 50 pg de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz. Los ratones recibieron PBS o nanopartículas similares a virus por inyección intravenosa de 100 pl de volumen, y se aplicó luz al tumor 12 horas después utilizando un láser a 690 nm. Los tumores se recolectaron 24 horas después, se digirieron para generar una única suspensión de células, y se tiñeron con una tinción de viabilidad para medir el porcentaje de células muertas (Figura 18, parte superior).
Varios animales en el grupo de dosis alta experimentaron síntomas relacionados con el síndrome de lisis tumoral, probablemente debido a la necrosis tumoral rápida y masiva y a la liberación de componentes intracelulares en el sistema de los animales. Mientras que no murió ninguno del grupo de "100 pg de nanopartículas con 50 J/cm2 de luz", los ratones en el grupo mostraron algunos signos de enfermedad (Figura 18, parte superior). Los grupos de "100 pg de nanopartículas sin luz" y de "PBS con 50 J/cm2 de luz" no mostraron signos de enfermedad, lo que indica que la respuesta observada se debió a la combinación de las nanopartículas similares a virus y luz. En general, la necrosis fue aparente en todos los grupos que recibieron las nanopartículas similares a virus y luz. La destrucción máxima ocurrió en todos los grupos, y no se observó una respuesta a la dosis (Figura 18, parte inferior).
Estudio de supervivencia: Los animales se inocularon por vía subcutánea con 2 x 105 células TC-1 en 100 pl de PBS. Aproximadamente de dos a tres semanas después de la inoculación, los animales se aleatorizaron en el grupo de tratamiento (25 pg de nanopartículas similares a virus) y en el grupo con placebo (solo PBS). Los animales recibieron dos rondas de tratamiento, con tres días de diferencia. Se consideró un tratamiento a una inyección intravenosa única de 100 pl de tanto 25 pg de nanopartículas similares a virus como de PBS estéril, seguido 12 horas después por tratamiento luminoso a 50 J/cm2 utilizando un láser de 690 nm. Se midieron los volúmenes tumorales cada 3-4 días, y se practicó la eutanasia a los animales cuando sus tumores alcanzaron un tamaño de >1500 mm3 (Figura 19A).
El tratamiento con nanopartículas similares a virus fue capaz de retrasar el crecimiento o de destruir los tumores en animales con tumores de menos de 500 mm3(Figuras 19B y 19C). No hubo efecto en la cinética del crecimiento tumoral en el grupo con placebo. Los dos animales que empezaron con los tumores más pequeños no mostraron evidencia de tumores dentro de 7 días del primer tratamiento, y tres de los animales mostraron signos de reducción tumoral (Figura 19C).
Estudio de inmunología: Para la lectura inmunológica, se recogió sangre en el día 0 (antes del primer tratamiento), día 10 y día 17. Los glóbulos rojos se lisaron y las células remanentes se dividieron en dos, una mitad se tiñó para marcadores de superficie celular (CD62L, CD127, CD103, CD69, CD4, CD8, CD3, tetrámetro H2-DbE7(49-57)). La otra mitad se reestimuló durante 4,5 horas con el péptido 49-57 E7 del VPH16 seguido de tinción con anticuerpos contra CD4, CD8 e IFN-gamma al igual que un colorante de viabilidad para discriminar células vivas.
En la sangre de los dos animales con crecimiento tumoral controlado, se podrán detectar tanto "células T CD8+tetrámetro E7+" y "células CD8+ que secretan INF-gamma" (después de reestimulación con péptido E7), lo que indica que se ha provocado una respuesta antitumoral potencial (Figura 19C).
Ejemplo 16 - Análisis histológico
Los efectos de nanopartículas similares a virus fotosensibles (por ejemplo, nanopartículas que contienen una combinación de variantes de las proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH conjugadas con colorante IR700) a nivel histológico se evaluaron utilizando un modelo murino de injerto heterólogo. En síntesis, 1,5 x 106 células de melanoma uveal 92.1 se implantaron en el espacio subcutáneo del flanco trasero de ratones desnudos. Se dejó a los tumores alcanzar aproximadamente 200 mm3, en dicho momento los animales se trataron con una inyección intravenosa de 200 |jg de nanopartículas similares a virus. Doce horas después de la inyección de nanopartículas similares a virus fotosensibles, el lugar el tumor se irradió con 50 J/cm2 de luz de infrarrojo cercano de 690 nm. Después de 24 horas adicionales, se practicó la eutanasia a los animales, el tejido tumoral se extirpó, se fijó en formalina, se impregnó con parafina y se procesó para examen histológico estándar.
Las imágenes de hematoxilina y eosina (H&E) relevaron un gran grado de necrosis, cuando se comparó con controles no tratados (imágenes no mostradas). El tumor tratado con nanopartículas similares a virus fotosensibles y láser tuvo una apariencia blanquecina cuando se comparó con el tumor de control. Tras examen con un aumento mayor, las células de los tumores tratados con nanopartículas similares a virus fotosensibles mostraron una pérdida drástica de citoplasma en comparación con el tumor tratado con control. Además, el alcance de la necrosis cubrió el tumor por completo lo que llevó a la conclusión de que la luz IRC penetra a través de la profundidad completa del tejido tumoral.
Ejemplo17 - Actividad de nanopartícula similar a virus en un modelo de injerto heterólogo ortotópico de melanoma uveal
La malignidad primaria más común del ojo es el melanoma uveal (MU). Aproximadamente 2000 pacientes lo presentan anualmente en los EE. UU., con más frecuencia en Europa. Aunque existen varias opciones de tratamiento para el MU, ningún tratamiento controla de manera fiable el crecimiento tumoral, conserva la visión ni minimiza la frecuencia de efectos secundarios relacionados con la radiación.
La fototerapia (FT) con nanopartículas similares a virus es una terapia molecular dirigida contra el cáncer innovadora que implica un proceso de dos etapas que requiere administración tanto de fármaco como activación de luz. La porción de fármaco de la FT con una nanopartículas similares a virus es una nanopartícula (NP) similar a virus fotosensible conjugada con IRDye®700 DX, un colorante de ftalocianina de infrarrojo cercano (IRC) que actúa como sensibilizador luminoso, seguido por la aplicación de luz IRC no térmica diseñada para tratar a adultos con melanoma uveal primario.
En el estudio actual, la actividad anticancerosa de la nanopartícula similar a virus fotosensible se evaluó en un modelo de injerto heterólogo ortotópico de melanoma uveal. En este modelo, las células de melanoma uveal humano se implantaron en el espacio coroideo de ratones inmunosuprimidos y se les dejó crecer. Cuando los tumores eran observables por medio de fundoscopia, los animales se asignaron a grupos de tratamiento o de control. En ambos casos, los animales se siguieron por medio de fundoscopia y ultrasonido para crecimiento tumoral progresivo o respuesta al tratamiento. Después de la terminación del estudio, los ojos con tumor se examinaron también por medio macroscopía e histopatología.
El estudio se llevó a cabo utilizando un total de 20 conejos implantados con la línea celular de melanoma uveal 92.1. En total, 11 de veinte animales desarrollaron tumores. Dos animales murieron inesperadamente durante el periodo de seguimiento antes del tratamiento, estos animales se utilizaron como controles no tratados. Varios animales tuvieron tumores extraoculares que no se sometieron a láser, estos se utilizaron como controles internos. Los animales con tumores en la cámara anterior se excluyeron del estudio.
Todos los tumores tratados mostraron una respuesta tumoral mayor en comparación con los animales de control, demostrado por medio de fundoscopia, patología macroscópica y evaluación histopatológica. Los tejidos retinianos adyacentes a los tumores no se vieron afectados por el tratamiento.
En conclusión, con base en el alcance de la respuesta tumoral y la necrosis vistos después de la administración de nanopartículas similares a virus fotosensibles y administración de láser, la metodología del tratamiento proporcionada en la presente memoria se puede utilizar para tratar tumores de melanoma uveal.
Programa del estudio: Dos grupos de tratamiento: 1) tratamiento de tumores completo; 2) sin tratamiento.
Tabla 3
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Métodos y diseño experimental:
Sistema de prueba
Tabla 4
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Modelo
Cultivo celular
Línea celular de melanoma uveal humano 92.1 (cortesía del Dr. Jerry Y. Niederkorn, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, Texas, EE. UU.) se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5% en medio de cultivo completo (RPMI-1640 con suero bovino fetal al 10%, 100 U/ml de penicilina G, 250 ng/ml de anfotericina B y 100 |jg/ml de disolución de estreptomicina).
Animales e inducción de la inmunosupresión
Se utilizaron conejos de Nueva Zelanda albinos con un peso inicial medio de aproximadamente 3 kg para este estudio. Los conejos se inmunosuprimieron con inyecciones subcutáneas diarias de ciclosporina A (CsA; Sandimmune 50 mg/ml; Novartis Pharmaceuticals, Cambridge, Massachusetts, EE. UU.). La administración de CsA se mantuvo a lo largo de todo el experimento para evitar regresión tumoral espontánea. El programa de dosificación fue 15 mg/kg por día durante 3 días antes de inoculación celular y durante 4 semanas después de esta, seguido por 10 mg/kg por día hasta el final del experimento. La dosificación se atenuó posteriormente a discreción del veterinario. Las dosis de CsA se ajustaron diariamente según el peso corporal de cada animal. El peso corporal se midió diariamente, y se colocó en la habitación en la que estaban alojados los conejos.
Durante el seguimiento, los animales se monitorizaron diariamente para signos de toxicidad de CsA, como hipertrofia gingival, sialorrea, diarrea y pérdida de peso. Si los animales mostraban signos de toxicidad de CsA (por ejemplo, pérdida de apetito), se consultaba de inmediato al personal veterinario para gestión de apoyo, como estimulantes del apetito y potenciador de la motilidad del GI.
También se consideró el ajuste de la dosis de inyección según la recomendación del veterinario.
Implantación celular
En el día 3 después de tratamiento con CsA, se anestesió a los animales con una inyección intramuscular de ketamina (40 mg/kg) y xilacina (6 mg/kg). Después de la anestesia, se aplicaron 1-3 gotas de hidrocloruro de proparacaína al 0,5% en los ojos derechos y 1,0 x 106 células de melanoma uveal humano 92.1 en un volumen de 100 j l de suspensión se inyectaron en el espacio supracoroideo del ojo derecho de los conejos utilizando una cánula doblada. En síntesis, una gasa estéril se colocó sobre el ojo para evitar cualquier contaminación con pelos o pestañas, y la conjuntiva se limpió con disolución de betadine al 10%. Después, el ojo se rotó hacia adelante utilizando suturas por debajo de los músculos oculares, y se diseccionó después la conjuntiva, se realizó una esclerotomía aproximadamente a 10 mm del limbus. La cánula se insertó luego en la esclerotomía (1/3-1/2 de su longitud) y las células (100 jL que contiene 1,0 x 106 células) se inyectaron en el espacio supracoroideo. La aguja se retrajo lentamente, y las suturas que cerraban la esclerotomía se apretaron para asegurar reflujo mínimo en el lugar de la inyección. Una gota de solución oftálmica antibiótica (pomada de eritromicina) se aplicó sobre la herida quirúrgica para evitar infección.
Alojamiento, comida, agua y condiciones del entorno, aclimatación
Los animales se alojaron en alojamientos grupales en grupos de 6 y se alimentaron con comida fresca, sabrosa y adecuada nutricionalmente a voluntad. El agua que era limpia, potable y sin contaminar se proporcionó a voluntad. Los controles del entorno se configuraron para mantener temperaturas 22 ± 4 °C (68 ± 5 °F) con una humedad relativa del 50% ± 20%. Se mantuvo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante al menos 5 días después de la llegada a las instalaciones antes de evaluación inicial. Los animales se asignaron a grupos de prueba después de evaluaciones fundoscópicas iniciales.
Artículos de prueba y de control
Tabla 5: Vehículo de artículo de prueba
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Tabla 6: Artículo de prueba
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Tabla 7: Láser
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Preparación de las formulaciones de dosis
El artículo de prueba se diluyó 1:1 en agua estéril para inyección.
Administración de artículos de prueba y de control
Dosificación: Se administró nanopartícula similar a virus fotosensible o solución salina por medio de inyección intraocular en el vítreo.
Administración del láser: El tratamiento con láser se aplicó utilizando un sistema de lámpara de hendidura con un láser Coherent Opal Photoactivator® que entrega luz de 690 nm a una potencia de 600 mW con una duración de 83 segundos para una fluencia total de 50 J/cm2. El tamaño del sitio del láser se ajustó a un diámetro de 5 mm y, como tal, los tumores que eran superiores a este tamaño se sometieron a láser con sitios de solapamiento. En los casos en los que una clara distinción del límite del tumor no se podía delinear debido a complicaciones oculares (por ejemplo, vitritis, desprendimiento de retina), las áreas sospechosas se sometieron por completo a láser.
Comprobaciones de mortalidad/morbilidad: Todos los animales permanecieron con buena salud a lo largo del estudio, aparte de dos animales que murieron debido a complicaciones de CsA (véase más adelante).
Observaciones clínicas: Todos los animales se observaron diariamente por personal de las instalaciones, las observaciones se registraron. La mayoría de los animales experimentó algún grado de pérdida de peso y de pérdida de apetito, que se atribuyó a CsA.
Oftalmología
Frecuencia: Se realizó examen oftalmológico por medio de fundoscopía y ultrasonido semanalmente.
Procedimiento: Se sedó al animal y se le dilató el ojo derecho utilizando gotas oculares de hidrocloruro de fenilefrina y de tropicamida. Después, se realizó un examen fundoscópico del ojo utilizando un oftalmoscopio binocular indirecto. El oftalmólogo registró cualquier complicación ocular. Cuando se identificó un tumor, el tamaño se estimó comparándolo con la papila óptica (diámetro de la papila [DD]; 1 DD = aproximadamente 1,75 mm). Para las lecturas de ultrasonido, inmediatamente después de examen del fondo del ojo, una sonda ultrasónica se aplicó en el ojo para visualizar la ubicación del tumor como se determinó por el examen del fondo del ojo. Las mediciones de ultrasonido probaron ser técnicamente difíciles, fundamentalmente porque algunos de los tumores se localizaban de manera muy periférica para ser visualizados apropiadamente. Como resultado, no siempre era posible medir la medición tumoral mayor y, en la mayoría de los casos, solo la altura fue cuantificable.
Procedimientos terminales y patología anatómica
Muertes no programadas: De los 20 animales utilizados en este estudio, a uno se le practicó la eutanasia debido a pérdida de peso (>20% de peso tras la llegada), como establecen las directrices del protocolo. Un animal murió inesperadamente debido a estasis gastrointestinal causada por toxicidad de CsA.
Eutanasia programada: Tras la terminación del estudio, se practicó la eutanasia a los animales según las directrices de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA). Los animales se sangraron con anestesia utilizando una combinación de ketamina-xilacina-acepromazina (0,75 mg/kg, 5mg/kg, y 20-35 mg/kg, respectivamente) y buprenorfina (0,2 mg/kg).
Resultados
En general, 11 animales desarrollaron tumores evidentes histopatológicamente. Como se mencionó previamente, dos animales murieron inesperadamente y se utilizaron como el control no tratado. 9 animales con diferentes tamaños de tumor recibieron tratamiento con nanopartículas similares a virus fotosensibles. Un animal no se incluyó en la evaluación debido al alcance del tumor en el segmento anterior del ecuador que no se podía someter a láser. Para los animales que tenían tumores en la parte posterior del ojo y recibieron el tratamiento completo (nanoparticula similar a virus fotosensible láser), se observó un tumor perceptible, que se caracterizó por tres elementos: 1) inducción de necrosis tumoral extensa; 2) cambio en el patrón de crecimiento, de uno difuso a un "patrón tipo manga"; y 3) conservación de la retina adyacente.
Tabla 8
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Controles no tratados
Se le practicó la eutanasia al conejo n.° 14 en la semana 4 debido a una pérdida de peso inaceptable (>20% del peso corporal inicial). El examen del fondo del ojo para la presencia de tumor fue no concluyente debido a hemorragia masiva y a desprendimiento de retina. Este animal no recibió tratamiento.
Utrasonido: Este conejo no experimentó examen de ultrasonido debido al momento de la muerte.
Macroscopía/histopatología: En patología macroscópica, un tumor intraocular que mide 3 mm de altura (A) x 8 mm en la dimensión mayor del tumor (LTD), y en histología se observó un tumor intraocular que mide 2,2 mm de A y 9,5 en la dimensión mayor del tumor. En patología macroscópica, se observó un tumor extraocular que mide 1,4 mm de altura y 9,4 mm en la dimensión mayor del tumor. Aproximadamente un 10% de los tumores tanto intra como extraoculares eran necróticos. No se detectó patrón tipo manga.
Tratamiento completo
Conejo 9
El conejo n.° 9 tuvo un tumor detectable clínicamente en el fondo del ojo de aproximadamente 1 DD de tamaño en la semana 4, que se trató inmediatamente. La siguiente semana, se estimó que el tumor era de 0,5 DD. En la semana 6, el tumor se estimó en <0,5 DD y en la semana final no se detectó.
Utrasonido: El ultrasonido no percibió ningún tumor en la semana 3, pero se identificó el peso 4 una masa que medía 1,04 mm de altura. En las semanas siguientes, las mediciones con ultrasonido retrocedieron hasta que ya no fue visible en la semana 6 y después de esta.
Macroscopía/histopatología: La histopatología no reveló tumores ni células. Sin embargo, están pendientes secciones en serie de un ojo entero y resultados inmunohistoquímicos para confirmar posteriormente este resultado.
Conejo 6
Hubo una sospecha clínica de un tumor en la semana 4 (masa elevada debajo de la retina), pero la hemorragia subretiniana, los fluidos y el desprendimiento de retina impidieron una estimación clínica del tamaño durante la duración del tratamiento.
Ultrasonido: Por medio de ultrasonido, en la semana 3, se detectó una masa grande de 4,88 mm, que creció hasta 5,29 mm en la semana 4, en dicho punto empezó el tratamiento. En la semana 5, el tumor medía 4,88 mm, mientras que en las semanas 6 y 7, el tumor medía 4,02 y 4,98 mm, respectivamente.
Macroscopía/histopatología: En patología mascrocópica, se identificaron dos tumores distintos: un tumor intraocular y un tumor de la conjuntiva, se sospecha que el último era el resultado de reflujo durante la implantación celular. Debido a la ubicación del tumor de la conjuntiva, este no se trató, y se considera así como un control interno. El tumor intraocular se desagregó y midió 7 mm de A x 11 mm de LTD. Una extensión extraocular que medía 6 mm de A x 9 mm de LTD se identificó también, que tenía una textura característica. En histopatología, el tumor intraocular midió 4,9 mm de A x 8,3 mm de LTD y fue >70% necrótico, con la mayoría de las células viables remanentes formando el patrón tipo manga mencionado anteriormente. El tumor de la conjuntiva no tratado exhibió bastante menos necrosis (~15%) y el patrón tipo manga no era similar.
El objetivo de este estudio era explorar la actividad de nanopartículas similares a virus fotosensibles luz IRC en un modelo de injerto heterólogo ortotópico de melanoma uveal en el ojo del conejo. Todos los tumores que recibieron tratamiento de nanopartículas similares a virus fotosensibles láser respondieron favorablemente al tratamiento. Esto es particularmente evidente para tumores de pequeños a medianos que tuvieron encogimiento del tumor evidente como respuesta al tratamiento y respuestas histopatológicas completas. En el conejo 9, por ejemplo, que presentaba un pequeño tumor en la semana 4, el tumor se erradicó por completo por medio de las dos primeras dosis del tratamiento y ya no era detectable ni clínica ni histopatológicamente dos semanas después del segundo tratamiento. En tumores más grandes, por ejemplo, el conejo 4, la mayor parte del tumor era necrónica, esto contrasta claramente con el control no tratado (conejo 14), que solo exhibió necrosis en aproximadamente un 10% del volumen del tumor, una clara indicación de la eficacia del tratamiento. Además, varios animales que tenían tumores intraoculares que recibieron el tratamiento completo tuvieron extensiones extraoculares que no se sometieron a láser; estas fracciones mostraron sustancialmente menos necrosis que las fracciones de tumor tratadas, que es una evidencia adicional que sustenta la eficacia de las nanopartículas similares a virus fotosensibles activadas por láser para el tratamiento de melanoma uveal. Las áreas retinianas adyacentes a los tumores no se vieron afectadas por el tratamiento.
Con base en la respuesta tumoral intraocular después del tratamiento, especialmente en comparación con los controles (fracciones extraoculares no tratadas), los datos proporcionados en la presente memoria sustentan una actividad anticancerosa selectiva y potente para nanopartículas similares a virus fotosensibles, en presencia de un tumor, para el tratamiento de melanoma ocular.
Ejemplo 18 - Ensayo de potencia in vitro que compara L1 del VPH frente a L1 del VPB
La potencia de nanopartículas similares a virus fotosensibles (por ejemplo, nanopartículas que contienen una combinación de variantes de las proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH conjugadas con colorante IR700) se sometió a ensayo por medio de un ensayo de destrucción de células in vitro. Se recolectaron células de melanoma uveal (por ejemplo, línea celular OCM-1 o 92.1) por medio de métodos habituales utilizando una disolución de EDTA y tripsina. Una vez que se retiró del plástico del cultivo tisular, las células se suspendieron en medio de crecimiento completo y se les dejó recuperarse durante aproximadamente 30 minutos a 37 °C. Durante este periodo de tiempo, se hicieron diluciones en serie de las nanopartículas similares a virus fotosensibles en aproximadamente incrementos A log (2000 pM, 600 pM, 200 pM, 60 pM, 20 pM, 6 pM, 2 pM y 0,6 pM) en PBS suero bovino al 2%. Después del periodo de recuperación, las células se contaron, centrifugaron y suspendieron en PBS FBS al 2% a una densidad celular de 3x106/ml. Un volumen igual de suspensión celular se añadió a las diluciones de nanopartículas similares a virus para producir 1,5x106 células por ml en la concentración adecuada (1000 pM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 10 pM, 3 pM, 1 pM y 0,3 pM) de nanopartículas similares a virus. Estas condiciones (por ejemplo, 360 pl) se incubaron en hielo durante aproximadamente de 1,5 a 2 horas.
Después de la incubación, los tubos se centrifugaron entonces para recolectar las células y, subsecuentemente, las células se lavaron dos veces con PBS FBS al 2%, sin las nanopartículas similares a virus fotosensibles. Después de la centrifugación final, las células se suspendieron en 200 pl de PBS FBS al 2%. 100 pl de cada muestra se retiraron y se transfirieron al pocillo de una placa de A área de 96 pocillos. Cada muestra se irradió entonces con 25 J/cm2 (600 mW, 43 segundos) de luz de infrarrojo cercano (689 nm) utilizando un láser oftálmico Coherent Opal Photoactivator. Después de la irradiación, la muestra de células se transfirió entonces a un nuevo tubo. Tanto la muestra irradiada con luz como la no irradiada se colocaron a 37 °C durante de 1 a 2 horas adicionales.
Después de la incubación, una muestra final de 20 pl de células se mezcló 1:1 con tinción AOPI (naranja de acridina y yoduro de propidio) y la viabilidad de las células se evaluó utilizando un Nexcelom Cellometer Auto 2000. La Figura 20 muestra efectos comparables de L1 del VPB y L1 del VPH en viabilidad celular a la mitad de la concentración eficaz máxima (EC50) (L1 del VPB = 88 pm; L1 del VPH = 60,5 pm), lo que indica que las potencias de las moléculas fotosensibles son comparables entre sí.
La Figura 21 muestra una muestra de células de un ensayo de destrucción descrito en la Figura 20 analizada para la unión de nanopartículas similares a virus fotosensibles. Las células del ensayo de destrucción se escanearon en un escáner de geles/placas Odyssey Clx. El Odyssey Clx está diseñado específicamente para detectar y cuantificar una serie de colorantes infrarrojos, que incluye, colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX). Por consiguiente, en este ensayo, las células que se trataron con diferentes concentraciones de nanopartículas similares a virus fotosensibles mostraron una cantidad dependiente de concentración de fluorescencia asociada con las células, lo que indica que las células se unieron tanto a VPB-L1-IR700 como a VPH-L1-IR700.
Ejemplo 19 - Actividad de nanopartículas similares a virus fotosensibles en un modelo de injerto heterólogo de cáncer de cabeza y cuello
Se implantaron células de cáncer de cabeza y cuello en el flanco lateral dorsal de ratones desnudos. Se dejaron crecer los tumores durante dos semanas. Una vez que el tumor alcanzó un tamaño medio de 150 mm3, los animales se aleatorizaron en 6 grupos de estudio (7 animales por grupo), como sigue: Solución salina; nanopartículas similares a virus fotosensibles (L1/L2 del VPH16/31; dosis de 200 pg); solución salina luz IRN (50 J/cm2); nanopartículas similares a virus fotosensibles (dosis de 200 pg) luz IRN (50 J/cm2); nanopartículas similares a virus fotosensibles (dosis de 100 pg) luz IRN (50 J/cm2); y nanopartículas similares a virus fotosensibles (dosis de 50 pg) luz IRN (50 J/cm2). La dosificación y tratamiento luminoso IRC se realizó cada tres días. Las mediciones tumorales se registraron cada 3-5 días.
Mientras que todos los controles no mostraron un efecto sustancial a su respectivo tratamiento, hubo una inhibición del crecimiento tumoral significativo observado en todos los grupos de dosis (Figura 22). La inhibición del crecimiento tumoral observada fue dependiente de la dosis. Hubo una respuesta de los tumores en el grupo de dosis alta. Dos animales murieron en el grupo de tratamiento de 200 pg asociado con muerte celular masiva y potencialmente toxicidades relacionadas con el síndrome de lisis tumoral.
Ejemplo 20 - Producción de nanopartículas similares a virus fotosensibles
Para producir las nanopartículas similares a virus fotosensibles de la presente descripción, se cultivaron HEK293F en suspensión y se transfectaron de manera transitoria con plásmido de ADN bicistrónico que codifica proteínas de la cápside L1 (o L1 y L2). Esto induce la formación de proto-cápsides (como se describe en Buck et. al. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, diciembre 2007). Después de la recuperación y disrupción de la masa celular, las proto-cápsides pasaron por un tratamiento de benzonasa para eliminar el ADN huésped y por un proceso de maduración in vitro subsecuente para formar nanopartículas similares a virus estables para conjugación. Después de la purificación, las nanopartículas similares a virus se conjugaron químicamente con éster de NHS IR700 para producir las nanopartículas similares a virus. La Figura 23 muestra una representación esquemática de un proceso de producción.
Las nanopartículas similares a virus fotosensibles producidas en el proceso descrito en este Ejemplo se han caracterizado utilizando SDS-PAGE, SE-HPLC y DLS y muestran purezas de un 90-95%. Las histonas de las células HEK293 están presentes como parte de la composición de nanopartículas similares a virus y comprenden un 10-15% de la proteína total de la nanopartícula similar a virus.
Secuencias
Variante de la secuencia de nucleótidos de la proteína L1 del VPH16/31(SEQ ID NO:1)
ATGAGCCTGTGGCTGCCCAGCGAGGCCACCGTGTACCTCfCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGT GGTGAGCACCGACGAGTACGTGGCCAGGAC'CAAOATCTACTACCACGCCGGCACCAGCAGGC TGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTTCCCCATCAAGAAGCCCAACAACAACAAGATCCTGGTG CCCAAGG’lGAGCGGCClGCAGTACAGGGTG’lTCAGGATCCACr'rGCCCGACCCCAACAAG’lT CGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGG GCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAAC AAGCTÜGACGACACCGAGAACGCCAGCGCCTACGCCGCCAACGCCGGCGTCiGACAACAÜGÜ AG TGCATrAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTOTGrCTGAI'CGGCrGrAAGCCCTTCATC ÜÜCÜAGCACTGGÜGCAAGGÜCAGCCCCTGCACCAACGTGGCCGTÜAACCCCGGCÜACTÜCCC CCCCCTGGAGCTGATCAACACCGTGATCCAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCG CCATGGACTTCACCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGAÜGTÜCCCCTGGACATCTÜCACCAGC ATCTGCAAGT ACCCCGACT ACATCAAGAT GGTGAGCGAGCCCT ACGGCGACAGCCTGTTCTTC TACCTGAGGAGGGAGCAGATGTI'CGTGAGGCACCTGTI'CAACAGGGCCGGCGCCGTGGGCGA GAACGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGCiGCAGCGGCAGCACCGC’CACCCTGGCCAACAGCA ACTACTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATGGTCiACCAGCGACGCCCAGATCTTCAACAAGCCC t a c t ü g c t g c a g a ü g g c c c a g g ü c c a c a a c a a c g g c a t c t g c t g g g g c a a c c a g c t g t t c g t GACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGAGCCTGTGCGCCGCCATCAGCACCAGCG AGACCACCTACAAGAACACCAACTTCAAGGAGTACCTGAGGCACGGCGAGGAGTACGACCT GC-AG l 'I CATC 1TCCAGC I’G I GCAAGA I’CACCC I GACC’GCC’GACG TGATGACC l’AC’A l’CCAC’AG CATGAACAGCACCATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCCTGCAGCCCCCCCCCGGCGGCACCC TGGAGGACACCl’ACAGG n C G I G ACCAGCCAGGCCAICGCCIGCCAGAAGC AC ACCCCCCCC GCCCCCAAGGAGGACCCCCTGAAGAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTT CAGCGCC’GACC IGOACC AG rrCCCCC’TGGGC AGGAAGTTCC1GCTGC AOGCCOGCCIG AAGG CCAAGCCCAAGTTCACCCTGGGCAAGAGGAAGGCCACCCCCACCACCAGCAGCACCAGCACC ACCGCCAAGAGGAAGAAGAGGAAGCTGTGA
Secuencia de nucleótidos de la proteína L1 del VPB1 (SEQ ID NO:2)
ATGGCCCTCTGGCAGCAGGGGCAGAAACTCTACCTGCCACCCACACCCGTGTCAAAAGTCCT GTG rTCCGAGACA'lACGTCCAGCGGAAG'l'CAA'l'C riCTA CC ACGCCGAG ACCGAAAGGCl CC TCACCATCGGCCACCCCTACTACCCCGTCAGCATTGGCGCTAAGACCGTGCCCAAAGTCTCCG CCAAC’CAATACCGCGTGTTCAACiATCCAGCTGCCCGACCCAAACCAGTTCGCCCTGCCCGATC GCACCGTGCA1AACCCCJ CCAAGGAAAGAC rCG'i'CrGGGCCGrGArCGGCGrCCAAG rCI'CA CÜGGÜCCAACCCCTGGÜCGGCACCÜTGACCGGCCATCCAACCTTCAACÜCCCTCCTGGACÜC CGAGAACGTCAACCGGAAAGTCACAACACAAACCACCGACGATCGCAAGCAGACCGGGCTG GACGCCAAACAGCAGCAAATCCTCCTCCTGGGGTGCACACCCGCTGAGGGCGAGTAC'TGGAC CACCGCTCGGCCCTGCGTGACCGACAGGCTGGAGAACGGGGCTTGTCCC’CCCCTGGAGCTGA AGAAl’AAGCA'rA rCGAGGACGGCGACAl'GAl'GGAGA rC G G C nC G G eG C C G e lAACTlCAAG GAGATrAACGCC rCCAA GA GCG ArCTG CCrCTGG ATA irC AGAACGAAAl'Tl G i r i CTA TCrC GATTATCTGAAGATGGCCGAAGATGCCGCCGGCAACTCAATGTTTTTCTTCGCCCGCAAGGAG CAAGTCTACGTGCGGCATATTTGGACACGGGGCGGGAGCGAAAAGGAGGCTCCCACAACCG
AeTTeTAeeTGAAAAAeAAeAAGGGeGACGCTAeAeTGAAGATeeeATCeGTeCAeTTeGGe TCCCCATCCGGGAGCCTCGTCAGCACCGACAACCAGATCTTCAACAGACCATATTGGCTGTTT
a g g g c t c a a g g g a t g a a t a a c g g c a t c g c t rG GA ACA Ace t g c t c t t c g t g a c c g t c g c t Cg a T A A C A e C A G G G G C A e C A A ee T G A C A A T C T e eG T G G C T A G C G A C G G e A C A ee ee T G A eC G A A T ACCiACTCAAGCAAGTTTAACGTGTATCACCGGCACATGCiAGGAGTACAAACTCiGCTTTCATC eTGGAAeTGTGTAGCGTeGAGATTACCGCCCAGACCGTCAGCCACeTCCAGGGCCTGATGCC AAGCGTCCTGCjAGAACTGGGAGATCGGCCjTCCAACCACCAACAAGCAGCATCCTGGAAGATA CATACAÜATACATCÜAAAGCCCCGCCACCAAGTGCÜCCTCAAACGTGATCCCCGCCAAGGAG GATCCCTACGCCGGCTTCAAATTCTGGAATATCGACCTGAAGGAGAAACTGAGCCTCGATCT G G A eeA G r r e c e A ereG G eeG G C G G n eci'G G ec:eA A eA G G G c:G ci'G G e i GCAGe A e r o r e e GGAAGAGGCGGATCTCACAAAAGACCAGTTCCAAACCCGCCAAGAAGAAGAAÜAAGTAG

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Una partícula similar a virus de direccionamiento a tumores que comprende de 50 a 1000 moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas de la cápside del virus del papiloma, en donde la citotoxicidad de las moléculas fotosensibles se activa por exposición a luz infrarroja, de infrarrojo cercano o ultravioleta.
2. La partícula similar a virus de la reivindicación 1, en donde las proteínas de la cápside del virus del papiloma son proteínas de la cápside del virus del papiloma no humano, por ejemplo, proteínas de la cápside del virus del papiloma bovino, o comprende proteínas de la cápside del virus del papiloma humano.
3. La partícula similar a virus según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde las proteínas de la cápside comprenden o consisten en proteínas de la cápside L1, o comprenden una combinación de proteínas de la cápside L1 y L2.
4. La partícula similar a virus según la reivindicación 3, en donde las proteínas de la cápside L1 se codifican por medio de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.: 1.
5. La partícula similar a virus de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las moléculas fotosensibles se conjugan covalentemente con las proteínas de la cápside, por ejemplo, se conjugan con residuos de lisina de las proteínas de la cápside, por ejemplo, se conjugan a través de enlaces amida covalentes.
6. La partícula similar a virus de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde las moléculas fotosensibles no comprometen la unión de la partícula similar a virus a la superficie de las células tumorales, por ejemplo, proteoglicanos de heparán sulfato en la superficie de las células tumorales.
7. La partícula similar a virus de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde las moléculas fotosensibles comprenden un colorante fluorescente, un colorante infrarrojo, un colorante de infrarrojo cercano, una molécula de porfirina, una molécula de clorofila, o una combinación de dos o más de cualquiera de los anteriores; y/o se seleccionan de entre un colorante de ftalocianina, una molécula de verteporfina y una combinación de un colorante de ftalocianina y una molécula de verteporfina.
8. La partícula similar a virus de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un método para tratar un tumor en un sujeto que comprende administrar la partícula similar a virus a dicho sujeto, opcionalmente comprende además activar las moléculas fotosensibles, por ejemplo, a una longitud de onda de luz que permita un cruce intersistema con oxígeno, produciendo así moléculas citotóxicas o transferencia de energía directa para dañar la membrana celular.
9. Una partícula similar a virus de direccionamiento a tumores para su uso en un método para tratar un tumor en un sujeto que comprende administrar la partícula similar a virus a dicho sujeto en donde la partícula similar a virus comprende de 50 a 1000 moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas de la cápside del virus del papiloma, en donde la citotoxicidad de las moléculas fotosensibles se activa por exposición a luz infrarroja, de infrarrojo cercano o ultravioleta.
10. La partícula similar a virus para su uso según la reivindicación 9, en donde el método comprende además activar las moléculas fotosensibles a una longitud de onda que hace que las moléculas se vuelvan citotóxicas, matando así las células del tumor, opcionalmente en donde las moléculas fotosensibles se activan por láser, por ejemplo, utilizando un láser infrarrojo, de infrarrojo cercano o ultravioleta, por ejemplo, un láser infrarrojo que entrega de 5 J a 100 J, o 50 J de energía, opcionalmente en donde el láser se aplica durante de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos, y opcionalmente en donde las moléculas fotosensibles se activan aproximadamente de 30 minutos a aproximadamente 48 horas después de administrar las partículas similares a virus.
11. La partícula similar a virus para su uso según la reivindicación 9 o 10, en donde el tumor es un tumor ocular, por ejemplo, localizado en el vítreo, espacio coroideo, iris, cuerpo ciliar, esclerótica, fóvea, retina, papila óptica o nervio óptico; y/o en donde el tumor se localiza en el pulmón, pleura, hígado, páncreas, estómago, esófago, colon, pecho, ovario, próstata, cerebro, meninges, testículos, riñones o vejiga; y/o en donde el tumor se localiza en la cabeza, cuello, cérvix, laringe o piel; opcionalmente en donde el tumor es accesible sin intervención quirúrgica.
12. La partícula similar a virus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el tumor es un tumor huérfano, un tumor de enfermedad rara, o un tumor canceroso o maligno, por ejemplo, un tumor que es metastásico, precanceroso, displástico o que tiene un crecimiento de células sospechoso indicativo de transformación maligna.
13. La partícula similar a virus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde la partícula similar a virus se administra por vía tópica, intraocular, intravítrea, supracoroidea, o por implantación, o por inyección, por ejemplo, utilizando una aguja hueca o recubierta, miniaguja o microaguja.
14. La partícula similar a virus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en donde las proteínas de la cápside del virus del papiloma comprenden proteínas de la cápside del virus del papiloma no humano, por ejemplo, proteínas de la cápside del virus del papiloma bovino, y/o en donde las proteínas de la cápside comprenden o consisten en proteínas de la cápside L1, o comprenden una combinación de proteínas de la cápside L1 y L2.
15. La partícula similar a virus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en donde la partícula similar a virus comprende proteínas de la cápside del virus del papiloma humano que no reaccionan de manera cruzada con anticuerpos inducidos por el papilomavirus humano (VPH) 16, VLP del VPH 18, o anticuerpos preexistentes inducidos por infección del VPH, y opcionalmente tienen inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas.
16. La partícula similar a virus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9-15, en donde las moléculas fotosensibles se conjugan, por ejemplo, se conjugan covalentemente, por ejemplo, a través de enlaces amida covalentes, con proteínas de la cápside de la partícula similar a virus, por ejemplo, se conjugan con residuos de lisina de las proteínas de la cápside, y opcionalmente en donde las moléculas fotosensibles no comprometen la unión de la partícula similar a virus a la superficies de las células tumorales, por ejemplo, a proteoglicanos de heparán sulfato en la superficie de las células tumorales.
17. La partícula similar a virus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9-16, en donde la partícula similar a virus comprende de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles, en donde las moléculas fotosensibles comprenden un colorante fluorescente, un colorante infrarrojo, un colorante de infrarrojo cercano, una molécula de porfirina, una molécula de clorofila, o una combinación de dos o más de cualquiera de los anteriores, opcionalmente en donde las moléculas fotosensibles se seleccionan de entre un colorante de ftalocianina, una molécula de verteporfina y una combinación de un colorante de ftalocianina y una molécula de verteporfina.
18. La partícula similar a virus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9-17, en donde las moléculas fotosensibles comprenden un colorante fluorescente, un colorante infrarrojo, un colorante de infrarrojo cercano, una molécula de porfirina, una molécula de clorofila, o una combinación de dos o más de cualquiera de los anteriores, en donde opcionalmente las moléculas fotosensibles se seleccionan de entre un colorante de ftalocianina, una molécula de verteporfina y una combinación de un colorante de ftalocianina y una molécula de verteporfina.
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