BR112016005917B1 - Conjugados de partículas semelhantes a vírus, composição e seus usos - Google Patents

Abstract

CONJUGADOS DE PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS, COMPOSIÇÃO E SEUS USOS. A presente invenção refere-se a métodos e composições para o diagnóstico e/ou o tratamento de tumores, tais como tumores oculares, usando partículas semelhantes a vírus conjugadas a moléculas fotossensíveis.

Description

Pedido Relacionado

[001] Este pedido reivindica o benefício nos termos do 35 U.S.C. § 119(e) do pedido provisório US número 61/879,627, depositado em 18 de setembro de 2013, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência.

Campo da Invenção

[002] Esta invenção refere-se ao campo de diagnóstico e terapêutica de tumores.

Antecedentes da Invenção

[003] Embora se encontrem disponíveis numerosos tratamentos para câncer, muitas formas de câncer continuam incuráveis, intratáveis ou ficam resistentes a terapias tradicionais e tratamentos eficazes para muitos cânceres têm efeitos colaterais indesejáveis. Cânceres oculares, tais como melanoma ocular e retinoblastoma, são de tratamento particularmente desafiador. Um paciente diagnosticado com melanoma ocular, dependendo do tamanho do tumor, tem poucas opções de tratamento, incluindo: (1) procedimentos cirúrgicos tais como ressecção, enucleação ou exenteração, todos estes sendo altamente invasivos e envolvendo principalmente a remoção do olho e parte do nervo ótico (depois da cirurgia o paciente usualmente recebe um olho artificial); e (2) braquiterapia de placas, um tipo radioterapia, onde um pedaço fino de metal (por exemplo, ouro) com sementes radioativos cobrindo um lado é suturado na parede externa do olho com as sementes apontadas para tumor. O pedaço fino de metal é retirado no fim do tratamento, que normalmente leva vários dias. As diversas complicações relacionadas incluem: formação de catarata, que é a mais comum, seguida por hemorragia vítrea. Outras complicações incluem olho ressecado, ceratite, neovascularização da íris induzida pela radiação, glaucoma neovascular, retinopatia induzida pela radiação, neuropatia ótica induzida pela radiação, depósitos epiesclerótico, necrose esclerótica e/ou alterações do músculo extraocular. Já foi reportado que a retinopatia induzida pela radiação ocorre em 10-63% dos pacientes tratados com braquiterapia de placas, e o tempo médio desde o tratamento até o desenvolvimento de maculopatia é aproximadamente 25.6 meses.

Sumário da Invenção

[004] A presente invenção oferece, pelo menos em parte, métodos e composições para detectar e/ou atacar seletivamente células tumores, por exemplo, para o diagnóstico e/ou o tratamento de câncer (por exemplo, câncer ocular). Em alguns casos, os métodos e composições oferecidos nesta invenção podem ser usados para matar células tumorais cancerosas sem danificar as células saudáveis. Por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus que compreendem (por exemplo, são conjugadas a) moléculas fotossensíveis podem ser seletivamente distribuídas para células tumorais e fotoativadas por exposição à luz. Quando fotoativadas, uma molécula fotossensível absorve fótons, e aquela energia absorvida produz alterações moleculares que causam toxicidade (por exemplo, toxicidade celular). Uma "nanopartícula semelhante a vírus fotossensível", (também denominada neste relatório "partícula semelhante a vírus fotossensível") refere-se a uma nanopartícula semelhantes a vírus conjugada a uma molécula fotossensível. Surpreendentemente, a conjugação de moléculas fotossensíveis a nanopartículas semelhantes a vírus não interfere tecidual/tumoral das nanopartículas (por exemplo, a especificidade das nanopartículas semelhantes a vírus para um tecido tumoral ou célula tumoral hospedeira particular).

[005] As nanopartículas semelhantes a vírus (também denominadas partículas semelhantes a vírus (VLPs)) da presente invenção, geralmente, são montadas a partir de proteínas do capsídeo L1, ou uma combinação das proteínas do capsídeo L1 e L2, e as moléculas fotossensíveis, em algumas modalidades, são conjugadas a uma proteína do capsídeo que forma a nanopartícula semelhantes a vírus. Por conseguinte, vários aspectos da invenção oferecem nanopartículas semelhantes a vírus endereçadas a tumores que compreendem moléculas fotossensíveis conjugadas a proteínas de capsídeo.

[006] Alguns aspectos da invenção também oferecem partículas semelhantes a vírus endereçadas a tumores que compreendem cerca de 50 a cerca de 500, cerca de 50 a cerca de 600, cerca de 50 a cerca de 700, cerca de 50 a cerca de 800, cerca de 50 a cerca de 900, ou cerca de 50 a cerca de 1000 moléculas fotossensíveis por partícula. Em algumas modalidades, partículas semelhantes a vírus endereçadas a tumores compreendem cerca de 400, cerca de 500, cerca de 600, cerca de 700, cerca de 800, cerca de 900 ou cerca de 1000 moléculas fotossensíveis por partícula. Em algumas modalidades, partículas semelhantes a vírus endereçadas a tumores compreendem 500 moléculas fotossensíveis ou 1000 moléculas fotossensíveis por partícula.

[007] Em algumas modalidades, as proteínas de capsídeo são proteínas do capsídeo do vírus do papiloma. Por exemplo, em algumas modalidades, as proteínas do capsídeo do vírus do papiloma são proteínas do capsídeo do vírus do papiloma não humano, tais como proteínas do capsídeo do vírus do papiloma bovino. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem proteínas do capsídeo do vírus do papiloma humano e não reagem de forma cruzada com o vírus do papiloma humano (HPV) 16, HPV 18 ou com anticorpos preexistentes específicos para HPV.

[008] Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem as proteína L1 ou L1/L2 do papiloma (por exemplo, da espécie humana, bovina, ou de outras espécies). Em algumas modalidades, as VLPs L1 ou L1/L2 não reagem de forma cruzada com anticorpos neutralizadores para o vírus do papiloma humano (HPV) 16, HPV 18 ou com anticorpos preexistentes específicos para outros HPVs. No entanto, em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem proteínas do capsídeo do vírus do papiloma humano de HPV16.

[009] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são conjugadas a peptídeos expostos na superfície de proteínas de capsídeo.

[0010] Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem proteínas do capsídeo L1 ou uma combinação das proteínas do capsídeo L1 e L2. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus consistem em proteínas do capsídeo L1.

[0011] Em algumas modalidades, uma partícula semelhante a vírus compreende a proteína do capsídeo BPV L1 (por exemplo, SEQ ID N°: 2), uma combinação de proteínas do capsídeo BPV L1 e BPV L2. Em algumas modalidades, uma partícula semelhante a vírus compreende proteínas do capsídeo HPV L1, ou uma combinação de proteínas do capsídeo HPV L1 e HPV L2. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo HPV L1 é uma proteína variante HPV16/31 L1 tendo imunogenicidade e/ou antigenicidade modificadas (por exemplo, SEQ ID N°: 1). Assim sendo, em algumas modalidades, uma partícula semelhante a vírus compreende ou consiste em proteínas do capsídeo variantes HPV16/31 L1 ou uma combinação de proteínas do capsídeo variantes HPV16/31 L1 (por exemplo, SEQ ID N°: 1) e proteínas do capsídeo HPV L2.

[0012] Em algumas modalidades, as proteínas do capsídeo de uma partícula semelhante a vírus têm imunogenicidade e/ou antigenicidade modificadas. Um exemplo não limitativo de tal proteína do capsídeo é proteína do capsídeo HPV16/31 L1 (por exemplo, SEQ ID N°: 1). Partículas semelhantes a vírus que contê m proteínas de capsídeo modificadas podem ser chamadas neste relatório de partículas semelhantes a vírus que contêm imunogenicidade e/ou antigenicidade modificadas em comparação com partículas semelhantes a vírus do tipo selvagem.

[0013] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são covalentemente conjugadas a proteínas de capsídeo. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são conjugadas a um aminoácido das proteínas de capsídeo. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são conjugadas a um grupo amina (por exemplo, amina primária alifática) de um aminoácido das proteínas de capsídeo. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são conjugadas a grupos amina de resíduos de lisina (por exemplo, amina da cadeia lateral de lisina) das proteínas de capsídeo. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são conjugadas a grupos amina de resíduos de arginina (e/ou histidina) das proteínas de capsídeo. A presente invenção oferece métodos para conjugar moléculas fotossensíveis à lisina e a outros aminoácidos que contêm grupos amina.

[0014] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis não comprometem (por exemplo, previnem, interferem ou inibem) a ligação da partícula semelhante a vírus à superfície de células tumorais. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis não comprometem (por exemplo, previnem, interferem ou inibem) a ligação da partícula semelhante a vírus a proteoglicanas de heparan sulfato ou outros polissacarídeos na superfície de células tumorais.

[0015] Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem cerca de 10 a cerca de 1000 moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem cerca de 50 a cerca de 1000 moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem cerca de 100 a cerca de 1000 moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem cerca de 100 a cerca de 500 moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem cerca de 500 a cerca de 1000 moléculas fotossensíveis, ou mais.

[0016] Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem cerca de 10 a cerca de 1000 moléculas fotossensíveis que são conjugadas a resíduos de lisina ou outros resíduos aminoácidos das proteínas do capsídeo L1, proteínas do capsídeo L2, ou uma combinação de proteínas do capsídeo L1 e proteínas do capsídeo L2.

[0017] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são ativadas por luz infravermelha, perto do infravermelho ou ultravioleta. Uma molécula fotossensível é considerada "ativada" quando a molécula absorve fótons, e aquela energia absorvida produz alterações moleculares que causam toxicidade, como descrito mais adiante neste relatório.

[0018] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis compreendem um corante fluorescente, um corante infravermelho, um corante perto do infravermelho, uma molécula de porfirina, uma molécula de clorofila, uma combinação de quaisquer dois ou mais destes.

[0019] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são moléculas de porfirina. Exemplos de moléculas de porfirina para uso de acordo com a presente invenção incluem, porém sem limitação, HpD (derivado de hematoporfirina), à base de HpD, BPD (derivado de benzoporfirina), ALA (ácido 5-aminolevulínico) e texafirinas. Em algumas modalidades, a molécula de porfirina é verteporfina (Visudyne®)

[0020] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são moléculas de clorofila. Exemplos de moléculas de clorofila para uso de acordo com a presente invenção incluem, porém sem limitação, clorinas, purpurinas e bacerioclorinas.

[0021] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são corantes. Exemplos de corantes para uso de acordo com a presente invenção incluem, porém sem limitação, ftalocianina e naftalocianina.

[0022] Em algumas modalidades, o corante do tipo ftalocianina é tanto uma molécula fluorescente quanto uma molécula perto do infravermelho. Por exemplo, em algumas modalidades, o corante do tipo ftalocianina é o corante IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX, LICOR®). Um corante IR700 é um corante fluorescente que tem comprimentos de onda de absorção e de emissão no espectro perto do infravermelho (NIR) tipicamente entre 680 nm e 800 nm. Outros corantes fluorescentes tendo comprimentos de onda de absorção e de emissão no espectro do NIR são oferecidos neste relatório.

[0023] Em algumas modalidades, moléculas fotossensíveis são selecionadas dentre corantes do tipo ftalocianina (por exemplo, corante IR700 tal como IRDye® 700DX), moléculas de porfirina (por exemplo, verteporfina tal como Visudyne®) e uma combinação de corantes do tipo ftalocianina e moléculas de porfirina.

[0024] Alguns aspectos da invenção oferecem métodos que compreendem administrar, a um indivíduo tendo um tumor, qualquer uma das partículas semelhantes a vírus, ou das partículas semelhantes a vírus fotossensíveis, oferecidas nesta invenção. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ativar as moléculas fotossensíveis de uma partícula semelhante a vírus a um comprimento de onda de luz que permite a visualização das moléculas sensíveis à luz. Assim sendo, em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis da presente invenção são usadas como agentes de imagem e/ou agentes de diagnóstico. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ativar as moléculas fotossensíveis a um comprimento de onda de luz que faz com que a molécula fique citotóxica. Em algumas modalidades os métodos compreendem ativar as moléculas fotossensíveis a um comprimento de onda de luz gerando uma transferência de energia para a célula tumoral que cria diretos e irreversíveis na célula levando à necrose. Assim sendo, em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis da presente invenção são usadas como agentes terapêuticos e/ou profiláticos.

[0025] Alguns aspectos da invenção oferecem métodos que compreendem administrar, a um indivíduo tendo um tumor, uma partícula semelhante a vírus endereçada a tumores compreendendo moléculas fotossensíveis conjugadas a proteínas de capsídeo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ativar moléculas fotossensíveis das partículas semelhantes a vírus a um comprimento de onda que deixa as moléculas visíveis. Isto é, as moléculas fotossensíveis reemitem luz mediante excitação da luz. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ativar moléculas fotossensíveis a um comprimento de onda que deixa as moléculas citotóxicas, dessa forma eliminando células do tumor. Isto é, as moléculas fotossensíveis sofrem uma alteração molecular mediante excitação da luz que resulta no fato de as moléculas fotossensíveis ficarem tóxicas para células.

[0026] Alguns aspectos da invenção oferecem métodos que compreendem administrar, a um indivíduo tendo um tumor, uma partícula semelhante a vírus endereçada a tumores compreendendo cerca de 50 a cerca de 1000, cerca de 50 a 500, ou cerca de 500 a 1000 moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar, a um indivíduo tendo um tumor, uma partícula semelhante a vírus endereçada a tumores compreendendo cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ou mais moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ativar moléculas fotossensíveis a um comprimento de onda que deixa as moléculas visíveis. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ativar moléculas fotossensíveis a um comprimento de onda que deixa as moléculas citotóxicas, dessa forma eliminando células do tumor.

[0027] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são ativadas por laser. Em algumas modalidades, o laser é um laser infravermelho, perto do infravermelho ou ultravioleta. Em algumas modalidades, o laser infravermelho é 5 Joules (J) a 100 J (ou J/cm2) (por exemplo, 5 J, 6 J, 7 J, 8 J, 9 J, 10 J, 11 J, 12 J, 13 J, 14 J, 15 J, 16 J, 17 J, 18 J, 19 J, 20 J, 21 J, 22 J, 23 J, 24 J, 25 J, 26 J, 27 J, 28 J, 29 J, 30 J, 31 J, 32 J, 33 J, 34 J, 35 J, 36 J, 37 J, 38 J, 39 J, 40 J, 41 J, 42 J, 43 J, 44 J, 45 J, 46 J, 47 J, 48 J, 49 J, 50 J, 51 J, 52 J, 53 J, 54 J, 55 J, 56 J, 57 J, 58 J, 59 J, 60 J, 61 J, 62 J, 63 J, 64 J, 65 J, 66 J, 67 J, 68 J, 69 J, 70 J, 71 J, 72 J, 73 J, 74 J, 75 J, 76 J, 77 J, 78 J, 79 J, 80 J, 81 J, 82 J, 83 J, 84 J, 85 J, 86 J, 87 J, 88 J, 89 J, 90 J, 91 J, 92 J, 93 J, 94 J, 95 J, 96 J, 97 J, 98 J, 99 J ou 100 J (ou J/cm2)). Em algumas modalidades, o laser é aplicado por cerca de 5 segundos a cerca de 5 minutos.

[0028] Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são ativadas cerca de 30 minutos a cerca de 48 horas depois da administração das partículas semelhantes a vírus a um indivíduo. Por exemplo, as moléculas fotossensíveis podem ser ativadas 30 minutos depois da administração das partículas semelhantes a vírus a um indivíduo. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são ativadas 1 hora, 2 horas (h), 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 7 h, 8 h, 9 h, 10 h, 11 h, 12 h, 13 h, 14 h, 15 h, 16 h, 17 h, 18 h, 19 h, 20 h, 21 h, 22 h, 23 ou 24 h depois da administração da partícula semelhante a vírus a um indivíduo. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são ativadas 1 dia, 2 dias ou 3 dias depois da administração da partícula semelhante a vírus a um indivíduo.

[0029] Em algumas modalidades, o tumor é um tumor ocular ou um tumor que fez metástase para o olho. Por exemplo, em algumas modalidades, o tumor ocular está localizado no vítreo, espaço coroidal, íris, corpo ciliar, esclerótica, fóvea, retina, disco ótico ou nervo ótico.

[0030] Em algumas modalidades, o tumor está localizado em um pulmão, na pleura, fígado, pâncreas, estômago, esôfago, cólon, mama, ovário, próstata, cérebro, meninges, testículo, trato gastrointestinal, rins ou bexiga.

[0031] Em algumas modalidades, o tumor é acessível sem intervenção cirúrgica.

[0032] Em algumas modalidades, o tumor está localizado na cabeça, pescoço, cérvice, laringe ou pele.

[0033] Em algumas modalidades, o tumor é uma doença órfã ou rara.

[0034] Em algumas modalidades, o tumor é canceroso. Em algumas modalidades, o tumor é metastático. Em algumas modalidades, o tumor é pré-canceroso ou displásico.

[0035] Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus são administradas por injeção. Por exemplo, as partículas semelhantes a vírus podem ser administradas por injeção intraocular, no vítreo, ou intravenosa. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus são administradas com uma agulha oca ou revestida, uma miniagulha ou uma microagulha. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus são administradas topicamente. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus são administradas por implantação.

[0036] Em algumas modalidades, as proteínas de capsídeo são proteínas do capsídeo do vírus do papiloma. Por exemplo, em algumas modalidades, as proteínas do capsídeo do vírus do papiloma são proteínas do capsídeo do vírus do papiloma não humano, tais como proteínas do capsídeo do vírus do papiloma bovino (BPV). Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem proteínas do capsídeo do vírus do papiloma humano e não reagem de forma cruzada com o vírus do papiloma humano (HPV) 16, HPV 18 ou com anticorpos preexistentes específicos para HPV. Em algumas modalidades, as partículas semelhantes a vírus compreendem proteínas do capsídeo do vírus do papiloma humano tipo 16. Em algumas modalidades as VLPs não se ligam a anticorpos específicos para o vírus do papiloma humano (HPV) 16, HPV 18 VLPs ou a anticorpos preexistentes induzidos especificamente por infecção por HPV.

[0037] Alguns aspectos da invenção oferecem métodos para detectar, em um indivíduo, tumores (por exemplo, tumores oculares e nevos malignos), os métodos compreendendo administrar ao indivíduo (por exemplo, ao olho do indivíduo) qualquer uma das partículas semelhantes a vírus oferecidas nesta invenção, tal como uma partícula semelhante a vírus compreendendo uma molécula fotossensível (por exemplo, corante fluorescente ou corante infravermelho), e detectar a localização do tumor. Em algumas modalidades, os métodos compreendem detectar a localização do tumor iluminando o indivíduo (por exemplo, o olho do indivíduo) com um laser (por exemplo, laser ultravioleta ou infravermelho). Em algumas modalidades, os métodos compreendem identificar o indivíduo com suspeita de ter um tumor antes de administrar a partícula semelhante a vírus. Em algumas modalidades, os métodos compreendem diagnosticar e/ou tratar o tumor administrando partículas semelhantes a vírus fotossensíveis a um tumor do indivíduo ou ao indivíduo tendo ou com suspeita de ter um tumor.

[0038] Outros aspectos da invenção oferecem métodos para inibir seletivamente a proliferação ou para eliminar células cancerosas sem inibir a proliferação ou a viabilidade de células não cancerosas (por exemplo, normais, saudáveis), os métodos compreendendo administrar a um tumor de um indivíduo (por exemplo, a um tumor ocular do indivíduo) qualquer uma das partículas semelhantes a vírus endereçadas a tumores oferecidas nesta invenção, tais como partículas semelhantes a vírus compreendendo moléculas fotossensíveis (por exemplo, corante infravermelho), e irradiar as células cancerosas do tumor submetendo o tumor a um laser infravermelho (por exemplo, a um comprimento de onda de cerca de 660 nm a 740 nm e a uma dose de pelo menos 8 Joules), efetivamente.

[0039] Em algumas modalidades, a presente invenção oferece uma nanopartícula semelhante a vírus (também denominada uma partícula semelhante a vírus) compreendendo moléculas fotossensíveis conjugadas a proteínas L1 do vírus do papiloma (por exemplo, proteínas L1 do vírus do papiloma bovino). Em algumas modalidades, as nanopartículas semelhantes a vírus têm 20 a 60 nanômetros (por exemplo, 10, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 nanômetros) de diâmetro. Em algumas modalidades, uma nanopartícula semelhante a vírus contém 300 a 500 proteínas do capsídeo L1 (por exemplo, BPV L1), por exemplo, 360 proteínas do capsídeo L1 (por exemplo, com base na simetria icosaédrica). Deve ser observado que em algumas modalidades, cada uma das nanopartículas semelhantes a vírus contém cerca de 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 ou 500 proteínas do capsídeo L1 (por exemplo, BPV L1). Entretanto, em algumas modalidades, uma nanopartícula semelhante a vírus contém menos de 300 proteínas do capsídeo L1 (por exemplo, BPV L1).

[0040] Em algumas modalidades, a presente invenção oferece uma nanopartícula semelhante a vírus do vírus do papiloma bovino covalentemente conjugada a 100 a 1000 moléculas fotossensíveis (por exemplo, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 moléculas). Em algumas modalidades, as proteínas do capsídeo da nanopartícula semelhante a vírus do vírus do papiloma bovino (BPV) compreendem ou consistem em proteínas do capsídeo BPV L1 ou uma combinação de proteínas do capsídeo BPV L1 e BPV L2. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são conjugadas às nanopartículas semelhantes a vírus (ou a proteínas de capsídeo das nanopartículas semelhantes a vírus) através de uma ligação covalente formada por reação de um grupo éster nas moléculas fotossensíveis com um grupo amina nas proteínas de capsídeo, formando assim uma ligação amida. Portanto, em algumas modalidades, as proteínas de capsídeo das nanopartículas semelhantes a vírus da presente invenção são conjugadas a moléculas fotossensíveis através de ligações amida.

[0041] Em algumas modalidades, a presente invenção oferece uma nanopartícula semelhante a vírus compreendendo 300 a 500 proteínas do capsídeo BPV L1 e/ou um diâmetro de 20 60 nm, pelo menos algumas delas (por exemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%) sendo covalentemente conjugadas (por exemplo, através de uma ligação amida) a 1 a 5 (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5) moléculas fotossensíveis (por exemplo, corante IR700 tal como IRDye® 700DX). A presente invenção também oferece métodos para produzir nanopartículas semelhantes a vírus e métodos para administrar nanopartículas semelhantes a vírus a um indivíduo como um agente de diagnóstico, terapêutico ou profilático.

Breve Descrição dos Desenhos

[0042] A figura 1 mostra um mecanismo para induzir morte celular usando uma partícula semelhante a vírus (VLP) conjugada a uma molécula fotossensível.

[0043] A figura 2 mostra uma comparação de vetorização bivalente, por exemplo, por um anticorpo, e vetorização multivalente, por exemplo, por uma VLP.

[0044] A figura 3 mostra um gráfico demonstrando que a especificidade de VLP ligando-se a células é mediada por interações da proteoglicana de heparan sulfato (HSPG) e é inibida pela heparina. Ela mostra ainda o extermínio específico de células tumorais somente quando as VLPs fotossensíveis são ligadas às células e as células submetidas à radiação infravermelha.

[0045] A figura 4 mostra um gráfico demonstrando que a morte celular depende da dose de radiação infravermelha e da quantidade de VLP e de molécula fotossensível (por exemplo, corante) distribuída.

[0046] A figura 5 mostra um gráfico demonstrando a morte de células de câncer de ovário (SKOV-3) in vitro mediante irradiação com VLPs (designadas PsV na figura) conjugadas ao IR700.

[0047] A figura 6A mostra uma análise por análise de ionização por "electrospray" por tempo de vôo (ESI-TOF) de VLPs de controle. Figura 6B mostra uma análise de ESI-TOF de VLPs (designadas PsV na figura) conjugadas a 1000 moléculas de IR700.

[0048] As figuras 7A-7C mostram gráficos de morte celular de uma linhagem celular de melanoma ocular humano negativo para o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico (HER2-) (92.1), comparando a eficácia de agentes bivalentes (por exemplo, anticorpos) e agentes multivalentes (por exemplo, VLPs fotossensíveis, também denominadas conjugados de VLP, designadas PsV na figura).

[0049] As figuras 8A-8C mostram gráficos de morte celular de uma linhagem celular de câncer de ovário humano positivo para o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico (HER2+) (SKOV-3), comparando a eficácia de agentes bivalentes (por exemplo, anticorpo) e agentes multivalentes (por exemplo, VLPs fotossensíveis, também denominadas conjugados de VLP, designadas PsV na figura).

[0050] A figura 9 mostra um gráfico demonstrando que anticorpos neutralizadores anti-HPV16 induzidos por vacina não bloqueiam a ligação de BPV*IR700 VLPs à linhagem celular de melanoma ocular, 92.1.

[0051] A figura 10A mostra uma estrutura química de IRDye® 700DX NHS éster. A figura 10B mostra uma estrutura química de Visudyne® com um grupo carboxila reativo envolvido por um círculo.

[0052] A figura 11 mostra um esquema reacional envolvendo a ligação de Visudyne® e VLP mediada por (cloridrato de 1-etil-3-(-3- dimetilaminopropil) carbodi-imida) (EDC) e sulfo-N-hidroxissuccinimida (sulfo-NHS). Neste esquema, Φ representa Visudyne® e Φ representa VLP. Observe que há 2 rotas levando ao produto final desejado. A presença de sulfo-NHS tende a estabilizar a reação e aumenta a produção do produto desejado.

[0053] A figura 12 mostra histogramas de amostras representativas da ligação HSPG-dependente de nanopartículas semelhantes a vírus contendo proteínas do capsídeo HPV16, proteínas do capsídeo variantes HPV16/31 e proteínas do capsídeo BPV1 (proteínas L1, ou L1 e L2) ligando-se a vários tipos de células cancerosas.

[0054] As figuras 13A e 13B mostram imagens de tecido excisado em campo brilhante (figura 13A) e fluorescência (figura 13B) de camundongos de controle negativos injetados com PBS 12 horas, camundongos injetados com nanopartícula semelhante a vírus fotossensível 12 horas (#3 e #4) e camundongos injetados com nanopartícula semelhante a vírus fotossensível 24 horas (#1 e #2) subsequente à injeção.

[0055] A figura 14 mostra uma representação quantitativa da fluorescência total relacionada com a nanopartícula semelhante a vírus associada ao tumor em amostra de tumor TC-1 ex vivo excisadas 12 e 24 horas depois de injeção intravenosa das VLPs (os mesmos tumores que aqueles da Fig 13).

[0056] A figura 15 mostra uma representação esquemática do desenho experimental para o exemplo 14.

[0057] As figuras 16A e 16B mostra gráficos da percentagem de morte celular depois da administração in vivo de nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis (designadas NPs na figura) e titulação da luz em células de melanoma ocular (OM) 92.1 subcutâneo (viabilidade celular medida 24 horas após tratamento com luz).

[0058] As figuras 17A-17C mostram histogramas brutos para os dados apresentados nas figuras 16A e 16B.

[0059] A figura 18 (painel superior) mostra amostras teciduais provenientes de animais inoculados por via subcutânea com 2 x 105 células tumorais TC-1 em 100 μl de PBS e que receberam: (1) nenhum tratamento, (2) 100 μg de nanopartículas semelhantes a vírus (designadas NPs na figura) montadas a partir de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2, marcadas com IRDye® 700DX [sem luz, (3) PBS com 50 J/cm2 de luz, (4) 200 μg de nanopartículas semelhantes a vírus com 50 J/cm2 de luz, (5) 100 μg de nanopartículas semelhantes a vírus com 50 J/cm2 de luz e (6) 50 μg de nanopartículas semelhantes a vírus com 50 J/cm2 de luz. A figura 18 (painel inferior mostra a percentagem de células mortas para cada uma das seis condições de teste.

[0060] A figura 19A mostra uma representação esquemática da experiência descrita no Exemplo 15. A figura 19B mostra um gráfico da percentagem de sobrevivência em animais injetados com nanopartículas semelhantes a vírus (designadas nanoparticles na figura) versus o controle (com luz). A figura 19C mostra o volume tumoral (painel superior), "células E7 tetrâmero+ CD8+" e "células CD8+ secretando INF-gama" em camundongos individuais.

[0061] A figura 20 mostra um gráfico dos resultados de um ensaio de potência, comparando os efeitos de nanopartículas semelhantes a vírus de BPV fotossensívies e de nanopartículas semelhantes a vírus de HPV fotossensívies sobre a viabilidade celular.

[0062] A figura 21 mostra um gráfico dos resultados de um ensaio de ligação, comparando a ligação de nanopartículas semelhantes a vírus de BPV fotossensívies e de nanopartículas semelhantes a vírus de HPV fotossensívies a células.

[0063] A figura 22 mostra um gráfico da curva de crescimento tumoral de células de câncer de cabeça e pescoço subsequente a tratamento com nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis (designadas PsV na figura).

[0064] As figuras 23A e 23B apresenta exemplos de um processo de produção de nanopartícula semelhante a vírus fotossensível da presente invenção (por exemplo, descrito no Exemplo 20).

Descrição Detalhada da Invenção

[0065] Terapia fotodinâmica (PDT) é uma forma de fototerapia usando moléculas fotossensíveis atóxicas que, quando expostas seletivamente à luz, ficam tóxicas, e atacam e/ou eliminam células malignas e outras células doentes. Um desafio proposto pela PDT no tratamento de câncer é a distribuição de altas concentrações de moléculas fotossensíveis exclusivamente para as células tumorais. Para conseguir uma distribuição vetorizada, é possível usar anticorpos, embora eles sejam limitados por sua capacidade de distribuição, que varia na faixa de 2-8 moléculas fotossensíveis por anticorpo. Além disso, existem tumores importantes aos quais falta uma molécula receptora de tumor identificada e, portanto, não podem ser atacados com um anticorpo. Como consequência, múltiplos tumores continuam intratáveis (por exemplo, melanoma ocular). Além disso, muitas das moléculas (por exemplo, EGFR) visadas por conjugados de anticorpo/corante também são encontradas na superfície de células não tumorais, o que leva a efeitos indesejados fora do alvo.

[0066] A presente invenção baseia-se, em parte, na inesperada descoberta de que partículas semelhantes a vírus (VLPs) (por exemplo, VLPs de papiloma) (também denominadas neste relatório nanopartículas semelhantes a vírus) podem ser modificadas quimicamente para carregar muitas moléculas fotossensíveis (por exemplo, IR700) sem perder sua capacidade de atacar o tumor ou sua estabilidade estrutural. Por exemplo, em algumas modalidades, VLPs podem ser modificadas quimicamente para carregar mais de 50 moléculas, mais de 100 moléculas, ou mais de 1000 moléculas (ou cerca de 1000 moléculas fotossensíveis). Partículas semelhantes a vírus montadas a partir de proteínas do capsídeo L1, ou a partir de proteínas do capsídeo L1 e L2, podem ligar-se seletivamente a células cancerosas e infectar as mesmas sem afetar células não cancerosas, dessa forma minimizando a citotoxicidade dos tratamentos (vide Publicação de Pedido de Patente US N° US20100135902A1, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência). Além disso, em outros casos, a distribuição de grandes quantidades de moléculas fotossensíveis por partícula permite o extermínio seletivo de células tumorais mediante radiação luminosa com quantidades extremamente pequenas de droga (por exemplo, concentrações picomolares).

[0067] Uma característica essencial da ligação celular de uma VLP é a presença de um grande número de sítios de ligação de heparina nas proteínas do capsídeo (por exemplo, L1). A conjugação de moléculas fotossensíveis a aminoácidos superficiais (por exemplo, conjugação via uma ligação amida a aminoácidos superficiais tais como resíduos de lisina, resíduos de arginina e resíduos de histidina superficiais), surpreendentemente, não compromete a ligação da VLP a proteoglicanas de heparan sulfato (HSPGs) na superfície de células tumorais. Apesar de a presente invenção descrever a conjugação de moléculas fotossensíveis a peptídeos expostos na superfície de proteínas de capsídeo, deve ficar entendido que moléculas fotossensíveis podem ser conjugadas a quaisquer peptídeos de proteínas de capsídeo. Isto é, moléculas fotossensíveis podem ser conjugadas a proteínas L1 apenas ou a uma combinação de proteínas L1 e L2. A proteína e o resíduo de aminoácido ao qual uma molécula fotossensível é conjugada pode depender da composição da partícula semelhante a vírus.

[0068] As descobertas acima têm implicações importantes para o desenvolvimento de novos tratamentos vetorizados para câncer. Por exemplo, as VLPs fotossensíveis (também denominadas conjugados de VLP) da presente invenção oferecem uma vantagem em relação a outras moléculas vetorizadas tais como anticorpos, que têm uma capacidade de distribuição muito limitada. Além disso, as VLPs fotossensíveis da presente invenção são úteis para atacar uma ampla gama de tumores que de outra forma não poderiam ser atacados por anticorpos ou outra moléculas vetorizadas (por exemplo, tumores oculares) porque determinantes específicos para superfície tumoral adequados ainda não foram identificados. Além disso, as VLPs fotossensíveis são úteis para tratar metástases distantes. Além disso, as VLPs fotossensíveis são úteis para o diagnóstico e o tratamento de lesões malignas ou pré-cancerosas iniciais (por exemplo, nevos oculares que são transformados, pré-malignos ou malignos).

[0069] Uma "partícula semelhante a vírus" (VLP), conforme usado neste relatório, refere-se a uma estrutura organizada semelhante a capsídeo (por exemplo, de formato aproximadamente esférico ou cilíndrico) que compreende arranjos ordenados automontados de capsômeros L1 ou L1 e L2 e não inclui um genoma viral. Partículas semelhantes a vírus são morfologicamente e antigenicamente similares a vírions autênticos, mais falta-lhes material genético viral (por exemplo, ácido nucleico viral), o que deixa as partículas não infecciosas. Uma VLP pode ser usada para distribuir para uma um agente (por exemplo, um agente profilático, um agente terapêutico ou um agente diagnóstico) ou uma molécula de DNA ou RNA circular ou linear embutida. Deve ficar entendido que os termos "partícula semelhante a vírus", "VLP" e "pseudovírus," ou "PsV" podem ser usados intercambiavelmente neste relatório e também podem ser usados intercambiavelmente com o termo "nanopartícula semelhante a vírus".

[0070] Uma "partícula semelhante a vírus endereçada a tumores", conforme usado neste relatório, refere-se a uma VLP que ataca células tumorais (por exemplo, cancerosas) sem atacar células não tumorais (por exemplo, não cancerosas, ou seja, normais, saudáveis) (por exemplo, em tecido intacto).

[0071] As VLPs de acordo com a presente invenção podem ter imunogenicidade e/ou antigenicidade modificadas em relação às VLPs de vírus do papiloma do tipo selvagem. As VLPs podem, por exemplo, ser montadas a partir de capsômeros tendo uma proteína de capsídeo variante com imunogenicidade e/ou antigenicidade modificadas. Uma proteína de capsídeo variante com "imunogenicidade e/ou antigenicidade modificadas" é aquela que é modificada naturalmente ou sinteticamente (por exemplo, mutada, substituída, deletada, peguliada ou inserida) em um aminoácido para reduzir ou prevenir o reconhecimento da proteína de capsídeo por anticorpos sorotipo- específicos virais preexistentes (por exemplo, endógeno). Uma proteína do capsídeo variante pode uma variante de L1 do vírus do papiloma humano (HPV), uma variante de L1 do vírus do papiloma não humano, ou uma variante de L1 do vírus do papiloma à base de uma combinação de aminoácidos de diferentes sorotipos do HPV. Por exemplo, uma variante de L1 com imunogenicidade e/ou antigenicidade modificadas pode ser uma proteína recombinante à base de HPV sorotipo 16 e HPV sorotipo 31 (doravante denominada neste relatório "proteína variante HPV16/31 L1" - SEQ ID N° 1), que está descrita na Publicação Internacional N° WO/2010/120266, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência.

[0072] Em algumas modalidades, uma VLP é uma VLP do vírus do papiloma. A VLP pode ser uma VLP do vírus do papiloma humano VLP (por exemplo, derivada de um vírus que pode infectar o homem), enquanto que em outras modalidades, a VLP é uma VLP do vírus do papiloma não humano. Exemplos de VLPs não humanas incluem aquelas derivadas de, porém sem limitação, vírus do papiloma bovino, vírus do papiloma murino, vírus do papiloma do coelho ("cotton-rabbit") e partículas do vírus do papiloma de Macaca ou rhesus. Em algumas modalidades, as VLPs são nanopartículas semelhantes a vírus do vírus do papiloma bovino (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus tipo 1) (por exemplo, montadas a partir de proteínas do capsídeo BPV L1 ou uma combinação de proteínas capsídicas BPV L1 e BPV L2).

[0073] Uma "proteína de capsídeo", conforme usado neste relatório, refere-se a um monômero de proteína, vários deles formando um oligômero de capsômero. Um "capsômero", conforme usado neste relatório, refere-se à unidade estrutural oligomérica básica de um capsídeo viral, que é uma cobertura externa de proteína que protege contra o material genético de um vírus tal como, por exemplo, vírus do papiloma humano (HPV). As proteínas de capsídeo da presente invenção incluem proteínas do capsídeo L1 maiores do vírus do papiloma e proteínas do capsídeo L2 menores do vírus do papiloma. Em algumas modalidades, as VLPs da presente invenção contêm apenas proteínas do capsídeo L1, enquanto que em outras modalidades, as VLPs contêm uma mistura (ou combinação) de proteínas do capsídeo L1 e L2.

[0074] Em algumas modalidades, a percentagem de proteínas do capsídeo L1 em uma partícula semelhante a vírus é maior que a percentagem de proteínas do capsídeo L2 na partícula semelhante a vírus. Por exemplo, em algumas modalidades, a percentagem de proteínas do capsídeo L1 em uma partícula semelhante a vírus varia de 80% a 100% (do número total de proteínas do capsídeo na partícula semelhante a vírus). Em algumas modalidades, a percentagem de proteínas do capsídeo L1 em uma partícula semelhante a vírus é 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a percentagem de proteínas do capsídeo L2 em uma partícula semelhante a vírus varia de 1% a 25% (do número total de proteínas do capsídeo na partícula semelhante a vírus). Por exemplo, em algumas modalidades, a percentagem de proteínas do capsídeo L2 em uma partícula semelhante a vírus é 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20%.

[0075] Em algumas modalidades, uma partícula semelhante a vírus contém 12 a 72 proteínas L2. Em algumas modalidades, uma partícula semelhante a vírus contém 360 proteínas L1 e 12 a 72 proteínas L2. Em algumas modalidades, as proteínas de capsídeo agrupam-se em nanopartículas semelhantes a vírus tendo um diâmetro de 20 a 60 nm. Por exemplo, as proteínas de capsídeo agrupam-se em nanopartículas semelhantes a vírus tendo um diâmetro de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 nm.

[0076] Uma "proteína de capsídeo externa", conforme usado neste relatório, refere-se a uma proteína de capsídeo que fica exposta na superfície de uma VLP. Em algumas modalidades, proteínas de capsídeo externas (por exemplo, proteínas L1) são conjugadas a uma (por exemplo, pelo menos uma) molécula fotossensível.

[0077] Uma "molécula fotossensível", conforme usado neste relatório, refere-se a uma molécula atóxica que, quando exposta seletivamente à luz, fica "ativada" (também denominada "fotoativada"). Em algumas modalidades, uma molécula fotossensível ativada reemite luz mediante excitação (por exemplo, um fluoróforo). Em algumas modalidades, uma molécula fotossensível ativada pode tornar-se tóxica, ou pode produzir moléculas tóxicas, mediante excitação com luz. Por exemplo, uma classe de moléculas fotossensíveis, denominadas fotossensibilizadores, pode ser promovida a um estado excitado mediante absorção de luz e sofrer cruzamento intersistemas com oxigênio para produzir oxigênio singleto. Este oxigênio singleto ataca rapidamente todos os compostos orgânicos que ele encontra, e é portanto altamente tóxico.

[0078] De acordo com vários aspectos da presente invenção, moléculas fotossensíveis podem ser conjugadas a proteínas do capsídeo (por exemplo, proteínas do capsídeo L1 e/ou L2) das VLPs. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são covalentemente conjugadas a proteínas de capsídeo das VLPs. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são covalentemente conjugadas a resíduos lisina de proteínas de capsídeo das VLPs. As VLPs que são conjugadas a moléculas fotossensíveis podem ser aqui denominadas "conjugados de VLP" ou "VLPs fotossensíveis." Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis compreendem um grupo NHS (N-hidroxissuccinimida) éster que reage com um grupo amina da proteína do capsídeo (por exemplo, um grupo amina de lisina ou outro aminoácido) para formar uma ligação amida covalente.

[0079] A proporção de molécula fotossensível (PM) para VLP pode variar.

[0080] Em algumas modalidades a proporção de VLP:PM varia de cerca de 1:10 a cerca de 1:1000, cerca de 1:10 a cerca de 1:500, cerca de 1:50 a cerca de 1:500, ou cerca de 1:50 a cerca de 1:1000. Isto é, em algumas modalidades, uma VLP pode compreender cerca de 10 a cerca de 1000 moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, a proporção de VLP:PM é 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:50, 1:75, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800. 1:850, 1:900, 1:950 ou 1:1000. Em algumas modalidades, a VLP pode compreender 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, a VLP pode compreender mais de 1000 moléculas fotossensíveis ou menos de 10 moléculas fotossensíveis.

[0081] Mais de uma molécula fotossensível pode ser conjugada a uma única proteína do capsídeo. Por exemplo, uma única proteína do capsídeo (por exemplo, proteína do capsídeo L1 ou L2) pode ser conjugada a 1 a 5 (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5) moléculas fotossensíveis. Portanto, mais de um aminoácido de uma proteína do capsídeo podem ser conjugados a uma molécula fotossensível. Em algumas modalidades, uma única proteína do capsídeo pode ser conjugada a 1 a 2, 1 a 3, ou 2 a 3 moléculas fotossensíveis. Assim sendo, uma molécula fotossensível pode ser conjugada a 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos diferentes (por exemplo, lisina, arginina e/ou histidina, ou outro aminoácido) de uma única proteína do capsídeo.

[0082] Exemplos de moléculas fotossensíveis para uso de acordo com a presente invenção incluem, porém sem limitação, corantes fluorescentes, corantes infravermelhos, corantes perto do infravermelhos, moléculas de porfirina e moléculas de clorofila.

[0083] Exemplos de corantes fluorescentes para uso de acordo com a presente invenção incluem, porém sem limitação, laranja de acridina, amarelo de acridina, Alexa Fluor, 7-aminoactinomicina D, ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfônico, corantes do tipo ATTO, corante auramina-rodamina, benzantrona, bimane, 9,10- bis(feniletinil)antraceno, 5,12-Bis(feniletinil)naftaceno, bisbenzimida, tinta de luz negra, calceína, carboxifluoresceína, carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster, carboxifluoresceína succinimidil éster, 1- cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno, 2-cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno, 2-cloro-9,10-difenilantraceno, coumarina, DAPI, extintor escuro ("dark quencher"), DiOC6, DyLight Fluor, Fluo-3, Fluo-4, FluoProbes, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, cirurgia guiada por imagem por fluorescência, corante fluoro-jade, fura-2, fura- 2-acetoximetil éster, GelGreen, GelRed, proteína fluorescente verde, corantes do tipo heptametina, amarelo indiano, Indo-1, amarelo Lucifer, luciferina, MCherry, Merocyanine, azul do Nilo, vermelho do Nilo, abrilhantador ótico, perilene, floxina, ficobilina, ficoeritrina, ficoeritrobilina, iodeto de propídio, piranina, rodamina, rodamina 123, Rodamina 6G, RiboGreen, RoGFP, rubreno, (E)-estilbeno, (Z)-estilbeno, sulforrodamina 101, sulforrodamina B, SYBR Green I, synapto-pHluorin, tetrafenil butadieno, tris(batofenantrolina dissulfonato)rutênio (II) tetrassódico, vermelho do Texas, amarelo Titan, TSQ, umbeliferona, proteína fluorescente amarela e YOYO-1.

[0084] Exemplos de corantes fotossensibilizadores para uso de acordo com a presente invenção incluem, porém sem limitação, HpD, porfímero sódico (Photofrin®, Photogem®, Photosan Hemporfin®), m- THPC, Temoporfina (Foscan®), Verteporfina (Visudyne®), HPPH (Photochlor®), bacteriofeoforbida de paládio (Tookad®,) 5-ALA, ácido 5 aminolevulínico (Levulan®), 5-ALA metil éster (Metvix®), 5-ALA benzil éster (Benzvix®), 5-ALA hexil éster ( Hexvix®), lutécio (III)- texafirina ou Motexafina-lutécio ( Lutex®, Lutrin®, Angrin®, Optrin®), SnET2, estanho (IV) etil etiopurpurina (Purlytin®, Photrex®), NPe6, mono-L-aspartil clorina e6, talaporfina sódica (Talporfin®, Laserphyrin®), BOPP, protoporfirina boronada (BOPP®), ftalocianina de zinco (CGP55847®), ftalocianina de silício (Pc4®), mistura de derivados de ftalocianina de alumínio sulfonada (Photosens®), ATMPn, acetoxi-tetrakis (beta-metoxietil-)porficeno), TH9402 e dibromorodamina metil éster.

[0085] Exemplos de corantes fotossensibilizadores para uso de acordo com a presente invenção incluem aqueles que podem ser usados em imagem por fluorescência (por exemplo, corantes fluorescentes perto do infravermelho (NIR)) tais como La Jolla Blue® e IRDye® 700DX.

[0086] A presente invenção também oferece métodos para administrar, a um indivíduo tendo um tumor, uma partícula semelhante a vírus endereçada a tumores compreendendo moléculas fotossensíveis conjugadas a proteínas do capsídeo, ou para administrar, a um indivíduo tendo um tumor, uma partícula semelhante a vírus endereçada a tumores compreendendo cerca de 50 a cerca de 1000 (por exemplo, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 1000) moléculas fotossensíveis.

[0087] Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero, tal como um ser humano.

[0088] O modo de administração pode ser por injeção, infusão, implantação, administração tópica, ou por qualquer outro meio tipicamente usado para distribuir partículas semelhantes a vírus. Em algumas modalidades, agulhas ocas, agulhas revestidas, miniagulhas ou microagulhas são usadas, dependendo da área de injeção. Em algumas modalidades, o modo de administração é por injeção no espaço intraocular ou no vítreo de um olho (por exemplo, para atacar tumores oculares ou tumores que fizeram metástase para o olho).

[0089] Exemplos de reagentes que podem ser usados para distribuir partículas semelhantes a vírus da presente invenção incluem, porém sem limitação, solução salina, MgCl2, trealose, hialuronato de sódio, polissorbato 20, polissorbato 80 ou qualquer combinação de dois ou mais dos reagentes precedentes.

[0090] As moléculas fotossensíveis da invenção podem ser ativadas a um comprimento de onda adequado. Em algumas modalidades, a ativação das moléculas fotossensíveis deixa as mesmas citotóxicas ou capazes de produzir uma molécula citotóxica. Comprimentos de onda adequados incluem, porém sem limitação, comprimentos de onda na faixa do ultravioleta, comprimentos de onda do espectro visível, comprimentos de onda na faixa do infravermelho e comprimentos de onda perto do infravermelho. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são ativadas e ficam citotóxicas a um comprimento de onda de 600 nm a 800 nm, ou 660 nm a 740 nm. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são ativadas e ficam citotóxicas a um comprimento de onda de cerca de 600 nm, 610 nm, 620 nm, 630 nm, 640 nm, 650 nm, 660 nm, 670 nm, 680 nm, 690 nm, 700 nm, 710 nm, 720 nm, 730 nm, 740 nm, 750 nm, 760 nm, 770 nm, 780 nm, 790 nm ou 800 nm. Em algumas modalidades, as moléculas fotossensíveis são ativadas e ficam citotóxicas a um comprimento de onda menor que 600 nm ou maior que 800 nm. Os comprimentos de onda adequados para ativação de moléculas fotossensíveis vão depender da molécula particular usada.

[0091] As moléculas fotossensíveis da invenção, dependendo do tipo de molécula, podem ser ativadas por luz infravermelha, perto do infravermelho ou ultravioleta. Por exemplo, um laser infravermelho, perto do infravermelho ou ultravioleta pode ser usado, em algumas modalidades, para ativar as moléculas fotossensíveis de conjugados de VLP. A energia liberada pelo laser pode variar de cerca de 5 J a cerca de 100 J, cerca de 5 Joules (J) a cerca de 50 J, ou cerca de 8 J a cerca de 36 J. Em algumas modalidades, a energia liberada pelo laser é 8 J, 9 J, 10 J, 11 J, 12 J, 13 J, 14 J, 15 J, 16J, 17 J, 18 J, 19 J, 20 J, 21 J, 22 J, 23 J, 24 J, 25 J, 26 J, 27 J, 28 J, 29 J, 30 J, 31 J, 32 J, 33 J, 34 J, 35 J, 36 J, 37 J, 38 J, 39 J, 40 J, 41 J, 42 J, 43 J, 44 J, 45 J, 46 J, 47 J, 48 J, 49 J, 50 J, 51 J, 52 J, 53 J, 54 J, 55 J, 56 J, 57 J, 58 J, 59 J, 60 J, 61 J, 62 J, 63 J, 64 J, 65 J, 66 J, 67 J, 68 J, 69 J, 70 J, 71 J, 72 J, 73 J, 74 J ou 75 J. Em algumas modalidades, a energia liberada pelo laser é 10 J, 20 J, 30 J, 40 J, 50 J, 60 J, 70 J, 80 J, 90 J ou 100 J.

[0092] Uma luz ou laser pode ser aplicado às moléculas fotossensíveis (ou VLPs fotossensíveis) por cerca de 5 segundos a cerca de 5 minutos. Por exemplo, em algumas modalidades, a luz ou laser é aplicado às moléculas fotossensíveis por 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 50 ou 55 segundos para ativar as moléculas. Em algumas modalidades, o laser é aplicado às moléculas fotossensíveis por 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 ou 5 minutos, ou mais. Deve ficar entendido que o período de tempo que uma luz ou laser é aplicado a uma molécula fotossensível pode variar dependendo, por exemplo, da energia (por exemplo, potência em watts) deste último. Por exemplo, lasers com uma potência em watts mais baixa podem ser aplicados a uma molécula fotossensível por um período de tempo mais longo mais ativar a molécula.

[0093] Uma luz ou laser pode ser aplicado às moléculas fotossensíveis (ou conjugados de VLP) cerca de 30 minutos a cerca de 48 horas depois da administração dos conjugados de VLP. Por exemplo, em algumas modalidades, a luz ou laser é aplicado às moléculas fotossensíveis 30, 35, 40, 45, 50 ou 55 minutos depois da administração dos conjugados de VLP. Em algumas modalidades, a luz ou laser é aplicado às moléculas fotossensíveis 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas depois da administração dos conjugados de VLP. Em algumas modalidades, a luz ou laser é aplicado às moléculas fotossensíveis 36 ou 48 horas depois da administração dos conjugados de VLP.

[0094] A luz ou laser pode ser aplicado diretamente ao sítio do tumor. Por exemplo, conjugados de VLP vetorizados para tumores oculares por ativados com a iluminação do olho.

[0095] Qualquer tipo de tumor pode ser atacado de acordo com a presente invenção. Exemplos de tumores incluem, porém sem limitação, aqueles localizados no olho, pulmão, pleura, fígado, pâncreas, estômago, esôfago, cólon, mama, ovário, próstata, cérebro, meninges, testículo, rins, bexiga, cabeça, pescoço, cérvice, laringe e/ou pele.

[0096] Em algumas modalidades, o tumor é um tumor ocular. O tumor ocular pode estar localizado no vítreo, espaço coroidal, íris, corpo ciliar, esclerótica, fóvea, retina, disco ótico ou nervo ótico.

[0097] O tumor, em algumas modalidades, é canceroso ou maligno. Em algumas modalidades, o tumor é metastático. Outros tumores também podem ser atacados. Por exemplo, a presente invenção oferece métodos e composições para atacar células de câncer cervical, células de câncer de ovário, células de câncer do tipo melanoma, células de câncer do pulmão, células de câncer da cabeça e/ou pescoço, e células de câncer de bexiga.

Composições

[0098] As partículas semelhantes a vírus (nanopartículas semelhantes a vírus) da presente invenção são, em algumas modalidades, nanopartículas semelhantes a vírus conjugadas a moléculas fotossensíveis. As nanopartículas semelhantes a vírus contêm um ou dois tipos de proteínas do capsídeo do vírus do papiloma. Em algumas modalidades, as proteínas do capsídeo são modificadas. As proteínas do capsídeo são tipicamente automontadoas em protocapsídeos "vazios" de aproximadamente 55 nm de diâmetro (por exemplo, partículas esféricas contendo um núcleo oco). Depois da maturação dos protocapsídeos para formar nanopartículas semelhantes a vírus (partículas semelhantes a vírus), as nanopartículas semelhantes a vírus são então quimicamente conjugadas com uma molécula fotossensível (por exemplo, corante IR700 tal como IRDye® 700DX, um corante infravermelho produzido pela LI-COR®).

[0099] Em algumas modalidades, as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis são apresentadas em uma solução estéril (por exemplo, 1 ou 2 ml) em frascos descartáveis (por exemplo, frascos de vidro de borossilicato). Em algumas modalidades, as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis são apresentadas em uma solução estéril de água que opcionalmente inclui NaCl, KCl, Na2HPO4.2H2O, KH2PO4, ou qualquer combinação de dois ou mais destes. Em algumas modalidades, NaCl pode estar presente na solução a uma concentração de 400 a 600 mMol (por exemplo, 500 mMol). Em algumas modalidades, KCl pode estar presente na solução a uma concentração de 2 a 6 mMol (por exemplo, 2.7 mMol). Em algumas modalidades, Na2HPO4.2H2O pode estar presente na solução a uma concentração de 5 a 15 mMol (por exemplo, 10 mMol). Em algumas modalidades, KH2PO4 pode estar presente na solução a uma concentração de 1 a 3 mMol (por exemplo, 2 mMol).

[00100] Em algumas modalidades, as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis são diluídas e administradas intraocularmente usando-se uma seringa e uma agulha estéreis comumente usadas em procedimentos oftalmológicos. A presente invenção também oferece outras vias de administração e administração a outros tumores e/ou metástases, como descrito neste relatório.

[00101] Em algumas modalidades, cada nanopartícula semelhante a vírus compreende 12-72 capsômeros com cada capsômero contendo 5 moléculas de proteína do capsídeo L1 (por exemplo, 55-56 kD cada) e 1 molécula de proteína do capsídeo L2 (por exemplo, 52 kD cada). Em algumas modalidades, cada nanopartícula semelhante a vírus compreende 12-72 capsômeros com cada capsômero contendo apenas proteínas do capsídeo L1 (por exemplo, 5 moléculas de proteína L1 por capsômero).

[00102] Em algumas modalidades, cada nanopartícula semelhante a vírus é quimicamente conjugada (por exemplo, via uma ligação amida) com 10 a 1000 moléculas (por exemplo, 500 moléculas) de molécula fotossensível (corante IR700 tal como IRDye® 700DX) a pelo menos um aminoácido (por exemplo, aminoácido lisina) da proteína.

Métodos para produzir partículas semelhantes a vírus

[00103] Para produzir as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis da presente invenção, células mamíferas, tais como células 293T (por exemplo, células HEK293F) podem ser cultivadas (por exemplo, em cultura em suspensão) e transitoriamente transfectadas com um ácido nucleico (por exemplo, DNA plasmídico bicistrônico) codificando proteínas do capsídeo BPV ou HPV L1 (ou L1 e L2). Isto induz a formação de protocapsídeos (por exemplo, como descrito por Buck et. al. Current Protocols in Cell Biology 26.1.126.1.19, Dezembro 2007). Subsequente à recuperação e rompimento da massa celular, os protocapsídeos podem ser submetidos à depuração do DNA hospedeiro com tratamento com benzonase e um subsequente processo de maturação in vitro para formar nanopartículas semelhantes a vírus estáveis. Subsequente à purificação, as nanopartículas semelhantes a vírus podem ser quimicamente conjugadas com moléculas fotossensíveis (por exemplo, IR700 NHS éster) para produzir as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis. A figura 23 mostra uma representação esquemática de um exemplo de um processo de produção oferecido nesta invenção.

[00104] Portanto, em alguns aspectos, são oferecidos nesta invenção métodos para produzir moléculas fotossensíveis, compreendendo (a) transfectar transitoriamente células com um ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas do capsídeo, formando assim protocapsídeos, (b) coletar os protocapsídeos e submeter os protocapsídeos a um processo de maturação in vitro, formando assim nanopartículas semelhantes a vírus estáveis, e (c) conjugar quimicamente as nanopartículas semelhantes a vírus a 50 a 1000 moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, as nanopartículas semelhantes a vírus são conjugadas a 500 moléculas fotossensíveis. Em algumas modalidades, as nanopartículas semelhantes a vírus são conjugadas a moléculas fotossensíveis através de uma ligação amida (por exemplo, por reação de um grupo éster de uma molécula fotossensível com um grupo amina de um aminoácido da proteína do capsídeo de uma nanopartícula semelhante a vírus).

EXEMPLOS Exemplo 1 - Conjugação de IRDye® 700DX

[00105] O procedimento de conjugação química de VLPs (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2) a uma molécula fotossensível (por exemplo, IRDye® 700DX) é o seguinte. Tipicamente, soluções de VLPs foram mantidas a uma concentração de 1 mg/ml em PBS, pH=7.2 e 0.3 a 0.5 M de NaCl. As moléculas de IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX) foram fornecidas pelo fabricante como NHS (N-hidroxissuccinimida) ésteres secos (NHS ésteres reagem com grupos amina nas proteínas para formar ligações amida covalentes) (figura 10A). Grupos amina disponíveis nas proteínas são o terminal amino da proteína o grupo ε-amino no aminoácido (por exemplo, lisina). O (por exemplo, lisina). O IR700- NHS éster sólido seco foi dissolvido em DMSO a uma concentração de 5 mg/ml e armazenado congelado. Tipicamente, diferentes proporções de VLP:corante foram obtidas misturando-se diferentes quantidades de IR700-NHS com uma quantidade fixa de VLP, usualmente 1 ml de solução 1 mg/ml em PBS. As proporções típicas e as quantidades de IR700-NHS estão listadas na tabela que se segue:Tabela 1

[00106] Para fazer uma proporção de 200:1, 1 ml de VLP a 1 mg/ml em PBS foi misturado com 3.2 μl da solução de IR700-NHS éster. Estas reações ocorreram por 2-4 horas à temperatura ambiente. Subsequente ao término da reação, as VLPs foram purificadas por cromatografia de coluna de afinidade à heparina para separar o IR700- NHS não ligado do recém-formado conjugado de VLP-IR700 conjugate (também denominado VLP fotossensível).

Exemplo 2 - Conjugação de Visudyne®

[00107] A conjugação de Visudyne® às VLPs seguiu um protocolo ligeiramente diferente em relação ao IR700-NHS. As moléculas de Visudyne® exigiram funcionalização para o NHS, antes de serem conjugadas a VLPs. Esta funcionalização foi obtida através do uso de EDC (cloridrato de 1-etil-3-(-3-dimetilaminopropil) carbodi-imida). EDC foi usado funcionalizar moléculas que possuem uma molécula de ácido carboxílico livre, tal como Visudyne® (vide figura 10B; envolvida por um círculo), e na presença de sulfo-NHS transferem efetivamente a porção NHS para este agente. Este esquema reacional está mostrado na figura 11. Em suma, aproximadamente 2 mM de EDC e um excesso molar de 2x de sulfo-NHS foram reagidos com quantidades variáveis de Visudyne®. Depois de 15 minutos à temperatura ambiente, as reações foram interrompidas com a adição de 2-mercaptoetanol até uma concentração final de 20 mM. Esta mistura reacional foi adicionada a 1 mg de VLPs a uma concentração de 1 mg/ml em PBS, pH=7.2 + 0.3-0.5 M de NaCl e incubada por 2-4 horas à temperatura ambiente. Finalmente, os componentes não reagidos foram separados dos conjugados de VLP por cromatografia de coluna de afinidade à heparina.

Exemplo 3 - A especificidade da ligação de VLP é mediada por HSPG e inibida por heparina.

[00108] Células SK-OV-3 em suspensão foram tratadas nas seguintes condições: sem VLP (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2), VLP conjugada a Alexa Fluor® 488 (figura 3, "AF488*PsV") ou a IR700 (figura 3, "IR700*PsV"), ou os mesmos conjugados de VLP incubados na presente de HSPG. Subsequente à incubação, estas culturas foram submetidas a 4 joules de luz perto do infravermelho a 690 mm. Um conjunto paralelo de células não irradiadas com luz funcionou como controle. Subsequente à radiação, as culturas foram avaliadas quanto à extensão de morte celular. A figura 3 mostra que a única condição na qual houve substancial extermínio celular foi a exposição das células a IR700*PsV e 4 joules de luz. Morte celular similar não foi observada com exposição a AF488*PsV, revelando que a morte celular é específica para os conjugados do corante IR700. Além disso, a morte celular é completamente anulada na presença de HSPG, revelando que a ligação de VLP à célula é crítica para a morte celular mediada por IR700.

Exemplo 4 - A morte celular depende da radiação infravermelha e da quantidade de VLP e IR700.

[00109] Células SK-OV-3 em suspensão que foram tratadas com diferentes concentrações de VLP (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2) foram conjugadas com diferentes quantidades do corante IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX). VLP sem conjugação ao corante IR700 foi usada como controle. Subsequente à incubação, estas culturas foram submetidas a 0 ou 16 joules de luz perto do infravermelho de 690 nm. Subsequente ao tratamento com luz, a extensão da morte celular foi avaliada. A figura 4 mostra que a morte celular é dependente tanto da presença do corante IR700 quanto do tratamento com luz. Isto é suportado pela observação de que a morte celular depende tanto da concentração de VLP quanto da proporção de conjugação do corante IR700.

Exemplo 5 - Morte celular in vitro de células SKOV-3 mediante radiação subsequente a tratamento com VLPs conjugadas a IR700.

[00110] Células de câncer de ovário SKOV-3 foram plaqueadas em uma placa de 24 poços e tratadas com duas concentrações diferentes de partículas VLP fotossensíveis (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2 conjugadas ao corante IR700), 2.5 μg (vermelho) e 0.25 μg (azul), por 1 hora a 37 °C. Depois de ligadas, as células foram lavadas, seguidas por tratamento com 4J de luz. A morte celular foi determinada por estimativa enzimática da liberação de LDH (determinada medindo-se a absorvência a 490 nm). Três proporções molares diferentes da conjugação VLP:IR700 foram testadas: 1:500, 1:1000 e 1:2000, respectivamente. A figura 5 mostra que a eficácia máxima de morte celular foi observada a uma proporção de 1:1000 de VLP:IR700 ("PsV:IR700") para ambas as concentrações testadas. Lise celular mediada por detergente foi usada como um controle positivo.

Exemplo 6 - Avaliação estrutural de complexos IR700-PsV

[00111] A figura 6 mostra uma análise por ESI-TOF de VLPs de controle (PsV) (A) e VLPs conjugadas a IR700 (PsVs) (B). Na figura 6B, a reação foi configurada para obter conjugação de cada molécula de VLP (PsV) com 1000 moléculas de IR700. Os picos de sinal nas varreduras de ESI-TOF correspondem à proteína VLP L1. Um desvio de 5517 amu foi observado nas amostras conjugadas em relação às amostras de controle, estas amostras conjugadas correspondendo a uma média de 3 moléculas de IR700 conjugadas (1840 amu) por proteína L1 ou cerca de 1000 moléculas de IR700 por VLP (tipicamente, há 360 L1 por VLP).

Exemplo 7 - A ligação do agente determina a extensão da morte celular em uma linhagem celular de melanoma ocular.

[00112] Linhagens celulares de melanoma ocular (92.1; HER2-) em suspensão foram expostas a diluições variáveis seja do anticorpo Herceptin® conjugado ao corante IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX) ou de VLPs (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2) conjugadas ao corante IR700. Culturas paralelas foram então avaliadas quanto à ligação do agente (figura 7C) ou quanto à morte celular na ausência (figura 7B) ou presença (figura 7A) de 16 joules de luz perto do infravermelho de 690 nm. A figura 7C mostra a ligação de VLP concentração-dependente às células 92.1 de melanoma ocular, ao passo que ligação do anticorpo Herceptin® está essencialmente ausente. A figura 7 B mostra que, na ausência de luz, não ocorre morte celular. A figura 7A mostra morte celular concentração-dependente somente nas células tratadas com VLPs fotossensíveis.

Exemplo 8 - A ligação do agente determina a extensão da morte celular em uma linhagem celular de câncer de ovário.

[00113] Células SK-OV-3 (HER2-) em suspensão foram expostas a diluições variáveis seja de anticorpos Herceptin® ou de partículas VLPs (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2) conjugadas ao corante IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX). Culturas paralelas foram então avaliadas quanto à ligação de Herceptin® ou de VLP (figura 8C) ou quanto à morte celular na ausência (figura 8B) ou presença (figura 8A) de 16 joules de luz perto do infravermelho de 690 nm. A figura 8C mostra que a ligação de VLP é saturada em células SK-OV-3. A ligação de Herceptin® também é concentração- dependente, mas em grau menor em relação às VLPs. A figura 8B mostra que, na ausência de luz, não ocorre morte celular. A figura 8A mostra a morte celular concentração-dependente em ambas as condições, mas semelhante à ligação, a resposta é saturada com VLPs embora pareça haver um aumento concentração-dependente na morte celular com Herceptin®. Estes dados sugerem que as VLPs conjugadas a IR700 (PsV-IR700) são mais potentes que a Herceptin® conjugada a IR700 (Herceptin-IR700).

Exemplo 9 - Anticorpos neutralizadores anti-HPV16 induzidos por vacina não bloqueiam a ligação de BPV*IR700 VLPs à linhagem celular de melanoma ocular, 92.1.

[00114] Amostras de soro contendo diferentes anticorpos foram testadas quanto à capacidade de inibir a ligação de partículas de VLP fotossensíveis (por exemplo, HPV16 VLPs ou BPV VLPs) à linhagem celular de melanoma ocular 92.1. A figura 9 mostra que as condições "sem soro" ou "soro naive" não contêm qualquer atividade que neutralize a ligação de VLPs. Além disso, a atividade de bloqueio que foi observada foi específica para o sorotipo do vírus. Isto é, apena as partículas semelhantes a vírus do vírus do papiloma humano conjugadas ao corante IR700 (HPV16-IR700) foram neutralizadas com soro contendo anticorpo HPV16. As partículas semelhantes a vírus do vírus do papiloma bovino conjugadas a IR700 (BPV-IR700) não foram neutralizados por soro contendo anticorpos HPV16-específicos.

Exemplo 10 - Avaliação da imunogenicidade

[00115] Em um estudo similar àquele descrito no Exemplo 9, os títulos neutralizadores foram determinados por diluição seriada de soros contendo anticorpos contra HPV16 ou BPV. Os resultados descritos na Tabela 2 mostram que anticorpos contra HPV16 neutralizam apenas HPV16. Além disso, anticorpos contra BPV neutralizam apenas BPV. Portanto, não ocorre reatividade cruzada dos anticorpos para HVP16 contra BPV nem de anticorpos para BPV contra HPV16.Tabela 2

Exemplo 11 - Estudo de ligação

[00116] O objetivo deste Exemplo era avaliar a ligação de nanopartículas semelhantes a vírus contendo proteínas do capsídeo do vírus do papiloma humano 16 (HPV16), proteínas do capsídeo variantes HPV16/31 L1, e proteínas do capsídeo do vírus do papiloma bovina (BPV) a vários tipos de células cancerosas. Além disso, nanopartículas semelhantes a vírus contendo proteínas do capsídeo L1 e L2, ou apenas proteínas do capsídeo L1, foram testadas para determinar se havia uma dependência de L2 para a ligação de nanopartículas semelhantes a vírus a células cancerosas. Os resultados deste estudo mostram que a ligação de nanopartículas semelhantes a vírus de BPV e de nanopartículas semelhantes a vírus de HPV são equiparáveis.

[00117] Um grande painel de linhagens celulares foram rastreadas, que incluíam: linhagens celulares diversas (por exemplo, 293TT, HaCaT, PAM-212 e TC-1), linhagens celulares de câncer cervical (por exemplo, HeLa, SiHa, CaSki e C-33A), linhagens celulares de câncer de ovário (por exemplo, MOSEC, SHIN-3, SK-OV-3, WF-3, ES-2, A2780, OVCAR-3 e OVCAR-4), linhagens celulares de melanoma (por exemplo, B16F10, SKMEL-2, SKMEL-5, SKMEL-28 e UACC), linhagens celulares de melanoma ocular (por exemplo, 92.1, MKT-BR, OCM-1 e UW-1), linhagens celulares de câncer de pulmão (por exemplo, NCI-H23, NCI-H322M, NCI-H460 e NCI-H522), linhagens celulares de câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, CAL-33 (HPV- ), FaDu (HPV-), HSC-3 (HPV-), SNU-1076 (HPV-), UM-SCC-47 (HPV+), UPCI-SSC-90 (HPV+) e UPCI-SCC-154 (HPV+), e linhagens celulares de câncer de bexiga (por exemplo, 5637, J82, RT112, SCaBER, SVHUC, T24, UMUC-3, UMUC-5).

[00118] Antes da experiência, as nanopartículas semelhantes a vírus foram conjugadas a AlexaFluor488 para possibilitar uma análise fácil e direta da ligação das nanopartículas semelhantes a vírus à superfície celular. AlexaFluor488 foi fixado à nanopartícula semelhante a vírus usando-se a química do N-hidroxissuccinimida (NHS) éster, que não interfere na ligação. Cada uma das nanopartículas semelhantes a vírus foi testada a uma concentração de 10 μg/ml, 1 μg/ml e 0.1 μ/ml.

[00119] As células foram tripsinizadas para serem removidas da superfície plástica de placas de cultura de tecido, lavadas e deixadas se recuperarem por 4 horas a 37 °C em meio de crescimento sobre uma plataforma oscilante. As células foram então lavadas, contadas e colocadas em uma placa de fundo de redondo de 96 poços a 1 x 105 células/poço em solução salina tamponada com fosfato (PBS)/2% de soro fetal bovino (FBS). As nanopartículas semelhantes a vírus foram adicionadas às células em um volume final de 100 μl de PBS/2% de FBS. Nanopartículas semelhantes a vírus pré-incubadas com heparina (1 mg/ml, 1 hora, 4 °C) também foram adicionadas ao s poços como controles. As células e as nanopartículas semelhantes a vírus foram então incubadas por 1 hora a 4 °C (no escuro), lava das duas vezes com PBS/2% de FBS e fixadas com 4% de paraformaldeído por 15 minutos à temperatura ambiente. As células foram por fim novamente lavadas e ressuspendidas em 200 μl de PBS/2% de FBS e analisadas em um BD FACS CANTO™ II (BD Biosciences, San Jose, CA) usando BD FACSDIVA™ (BD Biosciences, San Jose, CA) e o software FlowJo.

[00120] Os resultados usando as linhagens celulares TC-1, HeLa, SK-OV-3, SKMEL-28, 92.1, NCI-H322M, HSC-3, UPCI-SCC-154 e T24 estão apresentados como histogramas na figura 12. Como evidente pela figura 12, todas as nanopartículas semelhantes a vírus, independente de seu sorotipo ou constituição (L1 versus L1/L2) ligaram-se a células cancerosas no ensaio de ligação. Além disso, a heparina compete pela ligação, demonstrando que a ligação de nanopartículas semelhantes a vírus é específica e HSPG-dependente.

Exemplo 12 - Tempo de Biodistribuição

[00121] O objetivo deste Exemplo era avaliar a localização do tumor e o tempo de depuração das nanopartículas semelhantes a vírus subsequente à injeção intravenosa em animais portadores de tumor.

[00122] Nanopartículas semelhantes a vírus purificadas foram preparadas marcando-se as nanopartículas semelhantes a vírus (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e HPV L2) com o corante IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX) a uma proporção de nanopartículas semelhantes a vírus:corante de 1:500. As nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis foram purificadas por ultracentrifugação em gradientes de densidade usando-se o meio de gradientes de densidade OPTIPREP™.

[00123] Tumores foram gerados em camundongos C57Bl/6 albinos por injeção subcutânea de 2 x 105 células cancerosas TC-1 em 100 μ l de PBS. Depois de cerca de duas semanas, os animais foram randomizados em grupos de tratamento. Os animais portadores de tumor receberam por injeção intravenosa seja PBS ou 200 μ g das nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis em um volume de 100 μ l. Doze ou vinte e quatro horas após a injeção, os animais foram abatidos por eutanásia. Subsequente à eutanásia, o tecido tumoral foi recolhido e imagens foram feitas por fluorescência do corante IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX), indicando a presença das nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis.

[00124] A figura 13B mostra a fluorescência detectável do corante IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX) no tecido tumoral obtida no intervalo de tempo de 12 horas e 24 horas, ao passo que não foi detectada fluorescência no controle com PBS (intervalo de tempo de 12 horas). A fluorescência total quantitativa no tecido tumoral está plotada no gráfico apresentado na figura 14.

Exemplo 13 - Tempo de Biodistribuição

[00125] O objetivo deste Exemplo era avaliar a localização do tumor e o tempo de depuração das nanopartículas semelhantes a vírus subsequente à injeção intravenosa em animais portadores de tumor.

[00126] Nanopartículas semelhantes a vírus purificadas foram marcadas com AlexaFluor488 em lisado e purificadas por ultracentrifugação em gradientes de densidade usando-se o meio de gradientes de densidade OPTIPREP™.

[00127] Tumores foram gerados em camundongos C57Bl/6 albinos por injeção subcutânea de 2 x 105 células cancerosas TC-1 em 100 μ l de PBS. Depois de cerca de 2 semanas, 200 μ g das nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis foram distribuídos por injeção intravenosa em um volume de 100 μ l. Os tumores foram coletados nos seguintes intervalos de tempo subsequente à injeção das nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis: T=1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 e 72 horas. Depois da coleta, fragmentos dos tumores foram congelados para avaliação microscópica. Para esta avaliação microscópica, seções de tecido foram ainda coloridas. Soro policlonal de coelho contra HPV16 foi usado em conjunto com um anticorpo secundário AlexaFluor-488. Os vasos sanguíneos foram cocoloridos com um anticorpo anti-CD31 de rato e com um anticorpo secundário AlexaFluor-594 anti-rato. Os núcleos foram ainda realçados com DAPI.

[00128] Os dados (imagens in situ não mostradas) demonstram a presença das nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis no intervalo de tempo de 1 hora. A localização do sinal parecia estar associada nos vasos sanguíneos. O nível máximo de coloração pareceu ocorrer no intervalo de tempo de 8 horas, e no intervalo de tempo de 8 horas, as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis pareciam estar difundido-se de dentro dos vasos sanguíneos para as células tumorais. Finalmente, nos intervalos de tempo de 24 horas e 48 horas, parecia haver pouco sinal de nanopartículas semelhantes a vírus no tumor.

Exemplo 14 - Eficácia in vivo depois de administração sistêmica

[00129] O estudo apresentado neste Exemplo foi desenhado para medir a viabilidade tumoral 24 horas depois de um único tratamento. O estudo estabelece as normas para estudos in vivo de longo prazo.

[00130] O desenho completo do estudo está ilustrado na figura 15. Devido à gama de tamanhos dos tumores, os animais foram randomizados de modo que uma distribuição uniforme de tumores grandes e pequenos estivesse em cada grupo de n=3 nos grupos tratados com solução salina e n=5 nos grupos tratados com IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX)-nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis. As nanopartículas semelhantes a vírus foram administradas por via intravenosa 12 horas antes do tratamento com luz. Doses de cem microgramas (100 μg) e 200 μg foram testadas. O tratamento com luz incluir 25 J (62.3 s a 400 mW) ou 50 J (125 s a 400 mW). Depois de 24 horas, os tumores foram coletados e processados usando-se colagenase e DNase para gerar uma suspensão de células individuais. O corante amarelo BD LIVE/DEAD® foi então aplicado, e as células foram colocadas através de um FACS CANTO™ II. Os dados estão apresentados como percentagem de células mortas como indicado por um desvio na fluorescência no canal laranja Pacific (figura 16A).

[00131] Uma única dose de 200 μg de IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX)-nanopartículas (NPs) semelhantes a vírus fotossensíveis foi capaz de eliminar a maioria das células tumorais após tratamento com 50 J de luz (figura 16B e figura 17C). O nível de eliminação com 200 μg de NPs foi reduzido praticamente à metade quando os tumores foram tratados com 25 J de luz (figura 16B e figura 17B). 100 μg de NPs não foram suficientes para induzir eliminação com 25 J de luz (figura 16B e figura 17B); entretanto, uma certa morte tumoral foi observada a uma dose de 50 J (figura 16B e figura 17C). Este estudo forneceu as informações necessárias sobre a dosagem de IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX)-nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis e de luz para estudos in vivo.

Exemplo 15 - Estudo de Ativação do Sistema Imunológico

[00132] O modelo de tumor TC-1 oferece a possibilidade de examinar a indução imunológica anti-tumoral depois de tratamento com nanopartículas semelhantes a vírus em animais imunocompetentes. A linhagem de tumor TC-1 foi desenvolvida a partir de células epiteliais pulmonares C57Bl/6 imortalizadas com os oncogenes E6 e E7 de HPV16 assim como um gene mutado expressando c-Ha-Ras (Lin KY, et al., Cancer Research. 56(1):21-6, 1996). Estas células podem ser implantadas subcutaneamente ou, para o estudo de modelos metastáticos, elas podem ser injetadas intravenosamente para semear células nos pulmões. Há quase vinte anos estas células são usadas para testar a eficácia de vacinas terapêuticas à base de E6 e E7. E7 possui um epítopo MHC classe I distinto no fundo genético de camundongos C57Bl/6 que já foi mostrado ser protetor quando uma resposta de células T CD8 pode ser produzida contra ele (H-2Db, aa 49-57 RAHYNIVTF) (Feltkamp MC, et al. European Journal of Immunology. 23(9):2242-9, 1993). Estas respostas são detectadas tanto por coloração com tetrâmetro quanto por reestimulação das células com o peptídeo seguida por coloração de citocina intracelular.

[00133] Estudo de Dose-Resposta: Os animais foram inoculados subcutaneamente com 2 x 105 células TC-1 em 100 μl de PBS. Aproximadamente duas semanas depois da inoculação, os animais foram randomizados em seis grupos: (1) controles sem tratamento, (2) controles com 100 μg de nanopartículas semelhantes a vírus (contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2 marcadas com IRDye® 700DX) sem luz, (3) controles com PBS com 50 J/cm2 de luz, (4) 200 μg de nanopartículas semelhantes a vírus com 50 J/cm2 de luz, (5) 100 μg de nanopartículas semelhantes a vírus com 50 J/cm2 de luz e (6) 50 μg de nanopartículas semelhantes a vírus com 50 J/cm2 de luz. Os camundongos receberam PBS ou nanopartículas semelhantes a vírus por injeção intravenosa de um volume de 100 μl, e luz foi aplicado ao tumor 12 horas depois usando um laser de 690 nm. Os tumores foram coletados 24 horas depois, digeridos para gerar uma suspensão de células individuais, e coloridos com um corante de viabilidade para medir a percentagem de células mortas (figura 18, superior).

[00134] Diversos animais no grupo de dose alta apresentaram sintomas relacionados com a síndrome de lise tumoral, provavelmente devido à maciça e rápida necrose tumoral e liberação de componentes intracelulares no sistema dos animais. Embora nenhum camundongo no grupo de "100 μg de nanopartículas com 50 J/cm2 de luz" tenha morrido, os camundongos no grupo mostraram alguns sinais da doença (figura 18, superior). Os grupos de "100 μg de nanopartículas sem luz" e os grupos de "PBS com 50 J/cm2 de luz" não mostraram sinais da doença, indicando que a resposta observada devia-se à combinação das nanopartículas semelhantes a vírus e luz. Em geral, necrose estava aparente em todos os grupos que receberam as nanopartículas semelhantes a vírus e luz. Eliminação máxima ocorreu em todos os todos, e nenhuma dose-resposta foi observada (figura 18, inferior).

[00135] Estudo de Sobrevivência: Os animais foram inoculados subcutaneamente com 2 x 105 células TC-1 em 100 μl de PBS. Aproximadamente duas a três semanas depois da inoculação, os animais foram randomizados nos grupos de tratamento (25 μg de nanopartículas semelhantes a vírus) e no grupo de placebo (apenas PBS). Os camundongos receberam duas rodadas de tratamento, com intervalo de três dias. Era considerado um tratamento uma injeção intravenosa única de 100 μl de 25 μg de nanopartículas semelhantes a vírus ou de PBS estéril, seguido 12 horas mais tarde por tratamento com luz a 50 J/cm2 usando um laser de 690 nm. Os volumes tumorais eram medidos a cada 3-4 dias, e os animais eram abatidos por eutanásia quando seus tumores atingiam um tamanho >1500 mm3 (figura 19A).

[00136] O tratamento com nanopartículas semelhantes a vírus foi capaz de retardar o crescimento ou erradicar os tumores nos animais com tumores menores que 500 mm3 (figuras 19B e 19C). Não houver qualquer efeito sobre a cinética de crescimento do tumor no grupo de placebo. Os dois animais que começaram os menores tumores não mostraram evidência de tumor depois de 7 dias do primeiro tratamento, e três dos animais mostraram sinais de redução do tumor (figura 19C).

[00137] Estudo Imunológico: Para a leitura imunológica, sangue foi coletado no dia 0 (antes do primeiro tratamento) no dia 10 e no dia 17. As células sanguíneas vermelhas foram lisadas e as células restantes foram divididas em dois, e uma metade foi colorida para marcadores de superfície celular (tetrâmero de CD62L, CD127, CD103, CD69, CD4, CD8, CD3, H2-DbE7(49-57)). A outra metade foi reestimulada por 4.5 horas com o peptídeo 49-57 de HPV16 E7 seguida por coloração com anticorpos contra CD4, CD8 e IFN-gama assim como com um corante de viabilidade para distinguir as células vivas.

[00138] No sangue dos dois animais com crescimento tumoral controlado, foi possível detectar tanto "células T E7 tetrâmero+ CD8+" quanto "células CD8+ secretando INF-gama" (depois de reestimulação com o peptídeo E7), indicando que fora produzida uma resposta antitumoral em potencial (figura 19C).

Exemplo 16 -Análise Histológica

[00139] Os efeitos de nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2 conjugadas ao corante IR700) no nível histológico foram avaliados usando-se um modelo de xenoenxerto murino. Em resumo, 1.5 x 106 células de melanoma uveal 92.1 foram implantadas no espaço subcutâneo de flanco traseiro de camundongos nu/nu. Foi deixado que os tumores atingissem aproximadamente 200 mm3, quando então os animais foram tratados com uma injeção intravenosa de 200 μg de nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis. Doze horas após a injeção das nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis, o sítio do tumor foi irradiado com 50 J/cm2 de luz perto do infravermelho de 690 nm. Depois de mais 24 horas, os animais foram abatidos por eutanásia, o tecido tumoral foi excisado, fixado em formalina, incrustado em parafina e processado para exame histológico padrão.

[00140] As imagens com hematoxilina e eosina (H&E) revelaram um alto grau de necrose, quando comparado com controles não tratados (imagens não mostradas). O tumor tratado com nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis e laser tinham um aspecto pálido quando comparados com o tumor de controle. Ao exame com uma amplificação maior, as células dos tumores tratados nanopartícula semelhante a vírus fotossensíveis mostraram uma perda dramática de citoplasma em comparação com o tumor tratado de controle. Além disso, a extensão da necrose cobriu o tumor inteiro levando à conclusão que a luz NIR penetra através de toda a profundidade do tecido tumoral.

Exemplo 17 - Atividade das Nanopartículas Semelhantes a Vírus em um Modelo de Xenoenxerto Ortotópico de Melanoma Uveal

[00141] A malignidade primária mais comum do olho é o melanoma uveal (UM). Aproximadamente 2.000 pacientes apresentam-se anualmente nos Estados Unidos, com ocorrência mais frequente na Europa. Embora existam diversas opções de tratamento para UM, nenhum tratamento controla de forma confiável o crescimento do tumor, preserva a visão, e minimiza a ocorrência dos efeitos colaterais associados à radiação.

[00142] Fototerapia (PT) com nanopartículas semelhantes a vírus é uma nova terapias com alvo molecular contra o câncer que envolve um processo de dois estágios que requer a administração de droga e de fotoativação. A porção medicamentosa da PT com nanopartículas semelhantes a vírus é uma nanopartícula semelhante a vírus fotossensível (NP) conjugada a IRDye®700 DX, um corante do tipo ftalocianina perto do infravermelho (NIR) que age como fotossensibilizador, seguida pela aplicação de luz de NIR não térmica desenhada para tratar adultos com melanoma uveal primário.

[00143] No presente estudo a atividade anticâncer da nanopartícula semelhante a vírus fotossensível foi avaliada em um modelo de xenoenxerto ortotópica de melanoma uveal. Neste modelo, células de melanoma uveal humano foram implantadas no espaço coroidal de coelhos imunossuprimidos e deixadas crescer. Quando tumores estavam visíveis por fundoscopia, os animais foram distribuídos em grupos de tratamento ou de controle. Nos dois casos, os animais foram acompanhados por fundoscopia e ultrassom quanto ao crescimento progressivo do tumor ou quanto à resposta ao tratamento. Subsequente ao término do estudo, os olhos com tumor também foram examinados por patologia geral e histopatologia.

[00144] Este estudo foi realizado usando um total de 20 coelhos implantados com a linhagem celular 92.1 de melanoma uveal. Ao todo, 11 dos vinte animais desenvolveram tumores. Dois animais morreram de forma inesperada durante o período de acompanhamento antes do tratamento; estes animais foram usados como controles não tratados. Vários animais tinham tumores extraoculares que não foram tratados com laser; estes foram usados como controles internos. Os animais com tumores na câmara anterior foram excluídos do estudo.

[00145] Todos os tumores tratados mostraram uma resposta importante do tumor em comparação com os animais de controle, demonstrada por avaliação feita por fundoscopia, patologia geral e histopatologia. Os tecidos retinianos adjacentes aos tumores não foram afetados pelo tratamento.

[00146] Concluindo, com base na extensão da resposta do tumor e na necrose vista subsequente à administração de nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis e à administração de laser, a metodologia de tratamento oferecida nesta invenção pode ser usada no tratamento de tumores do tipo melanoma uveal.Programa de Estudo: Dois grupos de tratamento: 1) tratamento completo do tumor; 2) sem tratamento.Tabela 3 Métodos e Desenho Experimental: Sistema de Teste Tabela 4

Modelo Cultura de células

[00147] A linhagem celular 92.1 de melanoma uveal humano (courtesia do Dr. Jerry Y. Niederkorn, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX) foi cultivada a 37 °C em 5% CO2 em meio de cultura completo (RPMI-1640 com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina G, 250 ng/mL de anfotericina B, de 100 μg/mL de solução de estreptomicina).

Animais e indução de imunossupressão

[00148] Coelhos albinos Nova Zelândia com um peso inicial médio de aproximadamente 3 kg foram usados para este estudo. Os coelhos foram imunossuprimidos com injeções subcutâneas diárias de ciclosporina A (CsA; Sandimmune 50 mg/mL; Novartis Pharmaceuticals, Cambridge, MA, EUA). A administração de CsA foi mantida durante toda a experiência para impedir a regressão espontânea do tumor. O programa posológico foi 15 mg/kg ao dia por 3 dias antes da inoculação de células e depois disso por 4 semanas, seguido por 10 mg/kg ao dia até o fim da experiência. A dosagem foi ainda atenuada a critério do veterinário. As doses de CsA eram ajustadas diariamente de acordo com o peso corporal de cada animal. O peso corporal era medido diariamente, e afixado na área em que os coelhos estavam alojados.

[00149] Durante o acompanhamento, os animais foram monitorados diariamente quanto a sinais de toxicidade por CsA, tal como hipertrofia gengival, salivação, diarreia, e perda de peso. Se os animais mostrassem sinais prematuros de toxicidade por CsA (por exemplo perda de apetite), a equipe veterinária era imediatamente consultada sobre uma conduta de suporte, tal como administração de estimulador do apetite e melhorador da motilidade GI. O ajuste da dose injetável também era considerado de acordo com a recomendação do veterinário.

Implantação de células

[00150] No dia 3 depois do tratamento com CsA, os animais foram anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina (40 mg/kg) e xilazina (6 mg/kg). Depois da anestesia, 1-3 gotas de cloridrato de proparacaína a 0.5% foram aplicadas aos olhos direitos e 1.0 x 106 células 92.1 de melanoma uveal humano em um volume de 100 μl de suspensão foram injetadas no espaço supracoroidal do olho direito dos coelhos usando uma cânula curva. Em resumo, um pedaço de pano estéril foi colocado sobre o olho para evitar contaminação com pelos ou pestanas, e a conjuntiva com lavada com uma solução de betadina a 10%. Em seguida, o olho foi girado para a frente usando suturas abaixo dos músculos oculares, e depois de dissecar a conjuntiva, uma esclerotomia foi feita a aproximadamente 10 mm do limbo. A cânula foi então inserida na esclerotomia (1/3-1/2 de seu comprimento) e as células (100 μL contendo 1.0 x 10A6 células) foram injetadas no espaço supracoroidal. A agulha foi lentamente retraída, e as suturas fechando a esclerotomia foram apertadas para garantir refluxo mínimo no sítio de injeção. Uma gota de solução oftálmica antibiótica (poma de eritromicina) foi aplicada sobre o corte cirúrgico para prevenir infecção.

Condições de Alojamento, Alimentação, Água e Ambientais, Aclimatação

[00151] Os animais foram alojados em alojamento conjunto em grupos de 6 e alimentados com ração fresca, palatável, e nutricionalmente adequada ad libitum. Água limpa, potável, e não contaminada foi oferecida ad libitum. Os controles do ambiente foram ajustados de forma a manter temperaturas de 22 ± 4°C (68 ± 5°F) com umidade relativa de 50% ± 20%. Um ciclo de luz / escuridão de 12 horas foi mantido. Os animais foram aclimatados por pelo menos 5 dias depois de sua chegada nas instalações antes da avaliação da linha basal. Os animais foram distribuídos em grupos de teste depois das avaliações fundoscópicas da linha basal.Artigos Teste e de ControleTabela 5: Veículo do Artigo de TesteTabela 6: Artigo de TesteTabela 7: Laser

Preparação de Formulações de Dose

[00152] O artigo de teste foi diluído 1:1 em água estéril para injeção.

Administração de Artigos de Teste/Controle

[00153] Posologia: Nanopartícula semelhante a vírus fotossensível ou solução salina foi administrada por injeção intraocular no vítreo.

[00154] Administração de laser: Tratamento com laser foi aplicado usando-se um sistema de lâmpada de fenda com um laser Coherent Opal Photoactivator® distribuindo luz de 690 nm a uma potência de 600 mW por uma duração de 83 segundos para um fluxo ("fluence") total de 50 J/cm2. O tamanho do ponto de laser foi ajustado em um diâmetro de 5 mm e dessa forma, os tumores que mediam mais que esse tamanho foram tratados com laser com pontos sobrepostos. Nos casos em que não era possível delinear uma distinção nítida da borda do tumor devido a complicações oculares (por exemplo, vitrite, descolamento da retina), toda a área suspeita era tratada com laser.

[00155] Verificações de Mortalidade/ Morbidez: Todos os animais continuaram saudáveis durante o estudo, à exceção dos dois animais que morreram devido a complicações relacionadas com o uso de CsA (vide abaixo).

[00156] Observações Clínicas: Todos os animais foram observados diariamente pela equipe das instalações dos animais; as observações eram registradas. A maioria dos animais apresentou um pouco de perda de peso e um pouco de perda de apetite, que foi atribuída à CsA.

Oftalmologia

[00157] Frequência: Exame oftalmológico por fundoscopia e ultrassom era realizado uma vez por semana.

[00158] Procedimento: O animal foi sedado e seu olho direito foi dilatado usando-se colírio de cloridrato de fenilefrina e tropicamida. Em seguida, um exame fundoscópico do olho foi feito usando-se um oftalmoscópio binocular indireto. O oftalmologista registrava todas as complicações oculares. Quando um tumor era identificado, o tamanho era estimado por comparação do mesmo com o disco ótico (diâmetro do disco [DD]; 1 DD = aproximadamente 1.75 mm). Para as leituras do ultrassom, imediatamente depois do exame do fundo do olho, uma sonda de ultrassom era aplicada ao olho para visualizar a localização do tumor determinada pelo exame do fundo do olho. As medições de ultrassom mostraram-se tecnicamente difíceis, principalmente porque alguns dos tumores estavam localizados perifericamente demais para serem visualizados de forma apropriada. Como resultado, nem sempre foi possível medir a maior dimensão do tumor; e na maioria dos casos somente a altura pôde ser quantificada.

Procedimentos Terminais e Patologia Anatômica

[00159] Mortes não programadas: Dos 20 animais usados neste estudo, um foi abatido por eutanásia devido à perda de peso (>20% do peso de quando chegou), de acordo com as diretrizes protocolares. Um animal morreu inesperadamente devido à estase gastrointestinal causada por toxicidade por CsA.

[00160] Eutanásia Programada: Ao término do estudo, os animais foram abatidos por eutanásia de acordo com as diretrizes da "American Veterinary Medical Association" (AVMA) aceitas. Os animais foram exsanguinados com anestesia usando-se uma combinação de cetamina-xilazina-acepromazina (0.75 mg/kg, 5mg/kg, e 20-35 mg/kg, respectivamente) e buprenorfina (0.2 mg/kg).

Resultados

[00161] Ao todo, 11 animais desenvolveram tumores histopatologicamente evidentes. Como mencionado anteriormente, dois animais morreram inesperadamente e foram usados como controles não tratados. 9 animais com diferentes tamanhos de tumor receberam tratamento com nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis. Um animal não foi incluído na avaliação devido à tensão do tumor no segmento anterior do equador que não pôde ser tratado com laser.

[00162] Para os animais que tinham tumores atrás do olho e receberam tratamento completo (nanopartícula semelhante a vírus fotossensível + laser) foi observada um resposta perceptível do tumor, que foi caracterizada por três elementos: 1) indução de extensiva necrose tumoral; 2) mudança no padrão de crescimento, de difuso para um "padrão tubular"; e 3) preservação da retina adjacente.Tabela 8

Controles Não Tratados

[00163] O coelho #14 foi abatido por eutanásia na 4a semana devido a uma perda de peso inaceitável (>20% do peso corporal inicial). O exame do fundo do olho para verificar a presença de tumor foi inconclusivo devido a uma volumosa hemorragia e descolamento da retina. Este animal não recebeu tratamento.

[00164] Ultrassom: Este coelho não passou por exame de ultrassom devido à época de sua morte.

[00165] Patologia geral/histopatologia: Na patologia geral, um tumor intraocular medindo 3 mm de altura (H) x 8 mm na maior dimensão do tumor (LTD), e na histopatologia um tumor intraocular medindo 2.2 mm H e 9.5 na maior dimensão do tumor, foram observados. Na patologia geral, um tumor extraocular medindo 1.4 mm de altura e 9.4 mm na maior dimensão do tumor foi observado. Aproximadamente 10% de ambos os tumores intraocular e extraocular estavam necróticos. Não foi detectado qualquer padrão tubular.

Tratamento Completo Coelho 9

[00166] O coelho #9 tinha um tumor clinicamente detectável no fundo de aproximadamente 1 DD de tamanho na semana 4, que foi tratado imediatamente. Na semana seguinte, foi estimado que o tumor media 0.5 DD. Na semana 6, foi estimado que o tumor media <0.5 DD e na semana final ele não foi detectado.

[00167] Ultrassom: Ultrassom não detectou o tumor na semana 3, mas na semana ("weight 4") uma massa medindo 1.04 mm de altura foi identificado. Nas semanas seguintes, as medições no ultrassom regrediram até que não foram mais visíveis a partir da semana 6.

[00168] Patologia geral/Histopatologia: Histopatologia não revelou qualquer tumor ou células. No entanto, cortes consecutivos do olho total e resultados imuno-histoquímicos estão pendentes até que este resultado seja confirmado.

Coelho 6

[00169] Havia suspeita clínica de um tumor na semana 4 (massa elevada abaixo da retina), mas hemorragia sub-retiniana, fluido, e descolamento da retina impediram a estimativa clínica do tamanho durante toda a experiência.

[00170] Ultrassom: Por ultrassom, na semana 3 foi detectada uma grande massa de 4.88 mm, que cresceu até 5.29 mm na semana 4, quando então começamos o tratamento. Na semana 5, o tumor media 4.88 mm, ao passo que nas semanas 6 e 7 o tumor media 4.02 e 4.98 mm, respectivamente.

[00171] Patologia geral/histopatologia: Na patologia geral, foram identificados dois tumores distintos: um tumor intraocular e um tumor da conjuntiva, este último com suspeita de ser resultado de refluxo durante a implantação de células. Devido à localização do tumor da conjuntiva, ele não foi tratado, e, por conseguinte, nós o consideramos como um controle interno. O tumor intraocular foi desagregado e media 7 mm H x 11 mm LTD. Também foi identificada uma extensão extraocular medindo 6 mm H x 9 LTD mm, que tinha uma textura característica. Na histopatologia, o tumor intraocular media 4.9 mm H x 8.3 LTD mm e estava >70% necrótico, com a maioria das células viáveis restantes formando o padrão tubular mencionado acima. O tumor da conjuntiva não tratado apresentou muito menos necrose (~15%) e o padrão tubular não era evidente.

[00172] O objetivo deste estudo era explorar a atividade de nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis + luz NIR em um modelo de xenoenxerto ortotópico de melanoma uveal no olho de coelhos. Todos os tumores que receberam nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis + tratamento com laser responderam favoravelmente ao tratamento. Isto foi particularmente evidente para tumores de pequenos a médios que apresentaram encolhimento evidente do tumor como resposta ao tratamento e respostas histopatológicas completas. No coelho 9, por exemplo, que apresentou um tumor pequeno na semana 4, o tumor foi completamente erradicado nas duas primeiras doses do tratamento e não era mais detectável seja clinicamente ou histopatologicamente duas semanas após o segundo tratamento. Em tumores maiores, por exemplo, o coelho 4, a maior parte do tumor estava necrótica, isto é, um contraste acentuado com o controle não tratado (coelho 14), que só exibia necrose em aproximadamente 10% do volume do tumor, uma indicação nítida da eficácia do tratamento. Além disso, vários animais que tinham tumores intraoculares e que receberam tratamento completo tinha extensões extraoculares que não foram tratadas com laser; estas frações mostraram substancialmente menos necrose que as frações dos tumores tratados, o que constitui evidência adicional suportando a eficácia de nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis ativadas com laser para o tratamento de melanoma da úvea. As áreas da retina adjacentes aos tumores não foram afetadas pelo tratamento.

[00173] Com base na resposta do tumor intraocular subsequente ao tratamento, especialmente em comparação com os controles (frações extraoculares não tratadas), os dados apresentados neste relatório suportam uma atividade anticâncer seletiva e potente para as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis, na presença de um tumor, para o tratamento de melanoma ocular.

Exemplo 18 - Ensaio da potência in vitro comparando HPVL1 vs BPV L1

[00174] Nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis (por exemplo, nanopartículas semelhantes a vírus contendo uma combinação de proteínas variantes HPV16/31 L1 e proteínas HPV L2 conjugadas ao corante IR700) foram analisadas por um ensaio in vitro de extermínio de células. Células de melanoma uveal (por exemplo, linhagem celular OCM-1 ou 92.1) foram coletadas por métodos de rotina usando uma solução de EDTA e tripsina. Depois de removidas do plástico de cultura de tecido, as células foram suspendidas em meio de crescimento completo e deixadas recuperarem-se por aproximadamente 30 minutos a 37 °C. Durante este período de recuperação, diluições seriadas da nanopartícula semelhante a vírus fotossensível foram feitas em aproximadamente incrementos de ^ log (2000 pM, 600 pM, 200 pM, 60 pM, 20 pM, 6 pM, 2 pM e 0.6 pM) em PBS + 2% de soro bovino fetal. Subsequente ao período de recuperação, as células foram contadas, centrifugadas e suspendidas em PBS + 2% FBS até atingir uma densidade celular de 3x106/ml. Um volume igual de suspensão de células foi adicionado às diluições nanopartícula semelhante a vírus para dar 1.5x106 células por ml na concentração apropriada (1000 pM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 10 pM, 3 pM, 1 pM e 0.3 pM) de nanopartícula semelhante a vírus. Estas condições (por exemplo, 360 μl) foram incubadas em gelo por cerca de 1.5 a 2 horas.

[00175] Subsequente a esta incubação, os tubos foram centrifugados para que as células fossem coletadas e as células foram subsequentemente lavadas duas vezes com PBS + 2% FBS, sem as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis. Depois da centrifugação final, as células foram suspendidas en 200 μl de PBS + 2% FBS. 100 μl de cada amostra foram removidos e transferidos para o poço de uma placa ^ área de 96 poços. Cada amostra foi então irradiada com 25 J/cm2 (600 mW, 43 segundos) de luz perto do infravermelho (689 nm) usando um laser oftalmológico Coherent Opal Photoactivator. Subsequente à radiação, a amostra de células foi então transferida para outro tubo. Tanto as amostras irradiadas com luz quanto as não irradiadas foram colocadas a 37 °C por mais 1 a 2 horas.

[00176] Subsequente a esta incubação, uma amostra de células final de 20 μl foi misturada 1:1 com o corante AOPI (laranja de acridina e iodeto de propídio) e a viabilidade das células foi avaliada usando-se um Nexcelom Cellometer Auto 2000. A figura 20 mostra efeitos equiparáveis de BPVL1 e HPVL1 sobre a viabilidade celular à metade da concentração eficaz máxima (EC50) (BPVL1 = 88 pm; HPVL1 = 60.5 pm), indicando que as potências das moléculas fotossensíveis são equiparáveis entre si.

[00177] A figura 21 mostra uma amostra de células oriunda do ensaio de extermínio descrito na figura 20 analisada quanto à ligação das nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis. As células do ensaio de extermínio foram escaneadas em um escâner de placas de gel ("gel/plate scanner") Odyssey Clx. O Odyssey Clx foi especificamente projetado para a detecção e quantificação de uma série de corantes infravermelhos, inclusive o corante IR700 (por exemplo, IRDye® 700DX). Assim sendo, neste ensaio, as células que foram tratadas com concentrações diferentes das nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis mostram uma quantidade concentração-dependente de fluorescência associada às células, indicando que as células ligarem-se tanto à BPV-L1-IR700 quanto à HPV-L1-IR700.

Exemplo 19 - Atividade das nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis em um modelo de xenoenxerto de câncer de cabeça e pescoço.

[00178] Células de câncer de cabeça e pescoço foram implantadas no flanco dorsal lateral de camundongos nu/nu. Foi deixado que os tumores crescessem por duas semanas. Depois que o tumor atingiu um tamanho médio de 150 mm3, os animais foram randomizados em 6 grupos de estudo (7 animais por grupo), da seguinte maneira: solução salina; nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis (HPV16/31 L1/L2; dose de 200 μg); solução salina + luz NIR (50 J/cm2); nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis (dose de 200 μg) + luz NIR (50 J/cm2); nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis (dose de 100 μg) + luz NIR (50 J/cm2); e nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis (dose de 50 μg) + luz NIR (50 J/cm2). O tratamento com medicação e com luz NIR foi administrado a cada três dias. As medidas do tumor foram registradas a cada 3-5 dias.

[00179] Apesar de todos os controles não terem mostrado qualquer efeito substancial para seus respectivos tratamentos, ocorreu uma inibição significativa do crescimento do tumor observada em todas os grupos de doses (figura 22). A inibição do crescimento do tumor observada foi dose-dependente. Houve uma resposta dos tumores no grupo de dose alta. Dois animais morreram no grupo de tratamento com 200 μg associado à morte celular maciça e potenciais toxicidades relacionadas com a síndrome de lise tumoral.

Exemplo 20 - Produção de nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis

[00180] Para produzir as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis da presente invenção, HEK293F foram cultivadas em uma cultura em suspensão e foram transitoriamente transfectadas com um DNA plasmídico bicistrônico codificando proteínas capsídicas L1 (ou L1 e L2). Isto induz a formação de protocapsídeos (como descrito por Buck et. al. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, Dezembro 2007). Subsequente à recuperação e rompimento da massa celular, os protocapsídeos passaram por tratamento com benzonase para eliminar os contaminantes do DNA hospedeiro e por um subsequente processo de maturação in vitro para formar nanopartículas semelhantes a vírus estáveis para conjugação. Subsequente à purificação, as nanopartículas semelhantes a vírus foram quimicamente conjugadas com IR700 NHS éster para produzir as nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis. A figura 23 mostra uma representação esquemática de um processo de produção.

[00181] As nanopartículas semelhantes a vírus fotossensíveis produzidas pelo processo descrito neste Exemplo foram caracterizadas usando-se SDS-PAGE, SE-HPLC e DLS e mostram purezas de 90-95%. Histonas provenientes das células HEK293 estão presentes como parte da composição da nanopartícula semelhante a vírus e compreendem de 10-15% da proteína total da nanopartícula semelhante a vírus.

Sequências

[00182] Sequência nucleotídica da proteína variante HPV16/31 L1 (SEQ ID N°: 1) ATGAGCCTGTGGCTGCCCAGCGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCC CGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGGCCA GGACCAACATCTACTACCACGCCGGCACCAGCAGGCTGCTGGCC GTGGGCCACCCCTACTTCCCCATCAAGAAGCCCAACAACAACAAG ATCCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAG GATCCACCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCA GCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTG GGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCA GCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGCTGGACGACACCGAGAACGCC AGCGCCTACGCCGCCAACGCCGGCGTGGACAACAGGGAGTGCAT CAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCA AGCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCAGCCCCTGCAC CAACGTGGCCGTGAACCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGA TCAACACCGTGATCCAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTC GGCGCCATGGACTTCACCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGAGGT GCCCCTGGACATCTGCACCAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACAT CAAGATGGTGAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTACCT GAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACCTGTTCAACAGGGCCG GCGCCGTGGGCGAGAACGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGC AGCGGCAGCACCGCCACCCTGGCCAACAGCAACTACTTCCCCAC CCCCAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGACGCCCAGATCTTCAACA AGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATC TGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAG GAGCACCAACATGAGCCTGTGCGCCGCCATCAGCACCAGCGAGA CCACCTACAAGAACACCAACTTCAAGGAGTACCTGAGGCACGGC GAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACC CTGACCGCCGACGTGATGACCTACATCCACAGCATGAACAGCACC ATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCCTGCAGCCCCCCCCCGGCGG CACCCTGGAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCG CCTGCCAGAAGCACACCCCCCCCGCCCCCAAGGAGGACCCCCTG AAGAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGC GCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCA GGCCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAAGTTCACCCTGGGCAAGAGGA AGGCCACCCCCACCACCAGCAGCACCAGCACCACCGCCAAGAGG AAGAAGAGGAAGCTGTGA

[00183] Sequência nucleotídica de BPV1 L1 (SEQ ID N°: 2) ATGGCCCTCTGGCAGCAGGGGCAGAAACTCTACCTGCCACCCAC ACCCGTGTCAAAAGTCCTGTGTTCCGAGACATACGTCCAGCGGAA GTCAATCTTCTACCACGCCGAGACCGAAAGGCTCCTCACCATCGG CCACCCCTACTACCCCGTCAGCATTGGCGCTAAGACCGTGCCCAA AGTCTCCGCCAACCAATACCGCGTGTTCAAGATCCAGCTGCCCGA CCCAAACCAGTTCGCCCTGCCCGATCGCACCGTGCATAACCCCTC CAAGGAAAGACTCGTCTGGGCCGTGATCGGCGTCCAAGTCTCAC GGGGCCAACCCCTGGGCGGCACCGTGACCGGCCATCCAACCTTC AACGCCCTCCTGGACGCCGAGAACGTCAACCGGAAAGTCACAAC ACAAACCACCGACGATCGCAAGCAGACCGGGCTGGACGCCAAAC AGCAGCAAATCCTCCTCCTGGGGTGCACACCCGCTGAGGGCGAG TACTGGACCACCGCTCGGCCCTGCGTGACCGACAGGCTGGAGAA CGGGGCTTGTCCCCCCCTGGAGCTGAAGAATAAGCATATCGAGG ACGGCGACATGATGGAGATCGGCTTCGGCGCCGCTAACTTCAAG GAGATCAACGCCTCCAAGAGCGACCTGCCCCTGGATATCCAGAA CGAAATTTGTCTCTATCCCGATTATCTGAAGATGGCCGAAGATGC CGCCGGCAACTCAATGTTTTTCTTCGCCCGCAAGGAGCAAGTCTA CGTGCGGCATATTTGGACACGGGGCGGGAGCGAAAAGGAGGCTC CCACAACCGACTTCTACCTGAAAAACAACAAGGGCGACGCTACAC TGAAGATCCCATCCGTCCACTTCGGCTCCCCATCCGGGAGCCTC GTCAGCACCGACAACCAGATCTTCAACAGACCATATTGGCTGTTT AGGGCTCAAGGGATGAATAACGGCATCGCTTGGAACAACCTGCTC TTCCTGACCGTCGGCGATAACACCAGGGGCACCAACCTGACAATC TCCGTGGCTAGCGACGGCACACCCCTGACCGAATACGACTCAAG CAAGTTTAACGTGTATCACCGGCACATGGAGGAGTACAAACTGGC TTTCATCCTGGAACTGTGTAGCGTCGAGATTACCGCCCAGACCGT CAGCCACCTCCAGGGCCTGATGCCAAGCGTCCTGGAGAACTGGG AGATCGGCGTCCAACCACCAACAAGCAGCATCCTGGAAGATACAT ACAGATACATCGAAAGCCCCGCCACCAAGTGCGCCTCAAACGTGA TCCCCGCCAAGGAGGATCCCTACGCCGGCTTCAAATTCTGGAATA TCGACCTGAAGGAGAAACTGAGCCTCGATCTGGACCAGTTCCCAC TCGGCCGGCGGTTCCTGGCCCAACAGGGCGCTGGCTGCAGCAC CGTCCGGAAGAGGCGGATCTCACAAAAGACCAGTTCCAAACCCG CCAAGAAGAAGAAGAAGTAG

Claims (19)

1. Partícula semelhante a vírus endereçada a tumor, caracterizada pelo fato de que compreende de 50 a 1000 moléculas fotossensíveis conjugadas a proteínas de capsídeo de papiloma vírus, em que a citotoxicidade de moléculas fotossensíveis é ativada pela exposição a luz infravermelha, perto do infravermelho ou ultravioleta, em que as proteínas de capsídeo compreendem ou consistem em proteínas de capsídeo L1, ou compreendem uma combinação de proteínas de capsídeo L1 e L2.

2. Partícula semelhante a vírus, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as proteínas do capsídeo do vírus do papiloma são proteínas do capsídeo do vírus do papiloma não humano, por exemplo, proteínas do capsídeo do vírus do papiloma bovino, ou compreendem proteínas do capsídeo do vírus do papiloma humano.

3. Partícula semelhante a vírus, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as proteínas de capsídeo compreendem uma combinação de proteínas do capsídeo L1 e L2.

4. Partícula semelhante a vírus, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as proteínas de capsídeo L1 são codificadas pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1.

5. Partícula semelhante a vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que as moléculas fotossensíveis são covalentemente conjugadas às proteínas de capsídeo, por exemplo, conjugadas para resíduos de lisina das proteínas de capsídeo, por exemplo, conjugadas através de ligações amida covalentes.

6. Partícula semelhante a vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que as moléculas fotossensíveis não comprometem a ligação da partícula semelhante a vírus à superfície de células tumorais, por exemplo, proteoglicanas de heparan sulfato na superfície de células tumorais.

7. Partícula semelhante a vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que as moléculas fotossensíveis compreendem um corante fluorescente, um corante infravermelho, um corante perto do infravermelho, uma molécula de porfirina, uma molécula de clorofila, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais destes; e/ou são selecionadas a partir de um corante tipo ftalocianina, uma molécula de verteporfina e uma combinação de um corante tipo ftalocianina e uma molécula de verteporfina.

8. Uso de partículas semelhantes a vírus, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição para tratar ou diagnosticar um tumor, em que opcionalmente ainda compreende ainda ativar as moléculas fotossensíveis, por exemplo, em um comprimento de onda de luz que permite cruzamento intersistemas com oxigênio, dessa forma produzindo moléculas citotóxicas ou transferência direta de energia para danificar a membrana celular.

9. Uso de partículas semelhantes a vírus, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição para tratar ou diagnosticar um tumor, em que a partícula semelhante a vírus endereçada a tumor compreende de 50 a 1000 moléculas fotossensíveis conjugadas a proteínas de capsídeo de papiloma vírus, em que a citotoxicidade de moléculas fotossensíveis é ativada pela exposição a luz infravermelha, perto do infravermelho ou ultravioleta.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda ativar moléculas fotossensíveis a um comprimento de onda que torna as moléculas citotóxicas, dessa forma eliminando células do tumor, opcionalmente em que as moléculas fotossensíveis são ativadas por laser, por exemplo, um laser infravermelho, perto do infravermelho ou ultravioleta, por exemplo, um laser infravermelho que libera 5 J a 100 J, ou 50 J de energia, opcionalmente em que o laser é aplicado por 5 segundos a 5 minutos, e opcionalmente em que as moléculas fotossensíveis são ativadas 30 minutos a 48 horas depois da administração das partículas semelhantes a vírus.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor ocular, por exemplo, localizado no vítreo, espaço coroidal, íris, corpo ciliar, esclerótica, fóvea, retina, disco ótico ou nervo ótico; e/ou em que o tumor está localizado no pulmão, na pleura, fígado, pâncreas, estômago, esôfago, cólon, mama, ovário, próstata, cérebro, meninges, testículo, rins ou bexiga; e/ou em que o tumor está localizado na cabeça, pescoço, cérvice, laringe ou pele; opcionalmente em que o tumor é acessível sem intervenção cirúrgica.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor órfão, uma doença tumoral rara, ou o tumor é canceroso ou maligno, por exemplo, um tumor que é metastático, pré-canceroso, displásico ou apresenta células em crescimento suspeitas indicativas de transformação maligna.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que as proteínas de capsídeo são proteínas do capsídeo do vírus do papiloma compreendem proteínas do capsídeo do vírus do papiloma não humano, por exemplo, proteínas do capsídeo do vírus do papiloma bovino, e/ou em que as proteínas do capsídeo compreendem ou consistem em proteínas do capsídeo L1, ou compreendem uma combinação das proteínas do capsídeo L1 e L2.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que a partícula semelhante a vírus compreende proteínas do capsídeo do vírus do papiloma humano que não reagem de forma cruzada com anticorpos induzidos pelo vírus do papiloma humano (HPV) 16, VLPs do HPV 18, ou com anticorpos preexistentes induzidos por infecção pelo HPV, e opcionalmente apresentam imunogenicidade e/ou antigenicidade modificada.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que as moléculas fotossensíveis são conjugadas, por exemplo, covalentemente conjugadas, por exemplo, através de ligações amida covalentes, a proteínas de capsídeo da partícula semelhante a vírus, por exemplo, conjugadas aos resíduos de lisina das proteínas de capsídeo, e opcionalmente em que as moléculas fotossensíveis não comprometem a ligação da partícula semelhante a vírus à superfície de células tumorais, por exemplo, a proteoglicanas de heparan sulfato na superfície de células tumorais.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado pelo fato de que a partícula semelhante a vírus compreende de 100 a 1000 moléculas fotossensíveis, em que as moléculas fotossensíveis compreendem um corante fluorescente, um corante infravermelho, um corante perto do infravermelho, uma molécula de porfirina, uma molécula de clorofila, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais destes, opcionalmente em que as moléculas fotossensíveis são selecionadas a partir de um corante tipo ftalocianina, uma molécula de verteporfina e uma combinação de um corante tipo ftalocianina e uma molécula de verteporfina.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 16, caracterizado pelo fato de que as moléculas fotossensíveis compreendem um corante fluorescente, um corante infravermelho, um corante perto do infravermelho, uma molécula de porfirina, uma molécula de clorofila, uma combinação de quaisquer dois ou mais destes, opcionalmente em que as moléculas fotossensíveis são selecionadas a partir de um corante tipo ftalocianina, uma molécula de verteporfina e uma combinação de um corante tipo ftalocianina e uma molécula de verteporfina.

18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende partículas semelhantes a vírus, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a composição está na forma de uso para administração tópica, administração intraocular, administração intravítrea, administração supracoroidal, ou por implante ou por injeção.