CN116724052A - 用于治疗ceacam阳性癌症的组合物和方法 - Google Patents

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徐菡
M·L·桑德伯格
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Abstract

本公开提供了包含对CEA特异性的第一活化剂受体和第二抑制性受体的免疫细胞，以及制备和使用其治疗癌症的方法。

Description

用于治疗CEACAM阳性癌症的组合物和方法
相关申请
本申请要求于2020年8月20日提交的美国临时申请第63/068,244号的优先权和权益，其内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及过继性细胞疗法和癌症治疗学的领域。
通过引用并入序列表
序列表段落申请含有已经通过EFS-WEB以ASCII格式提交的序列表，并且通过引用将其全文并入本文。所述ASCII副本创建于2021年8月17日，被命名为A2BI_022_01WO_SeqList_ST25.txt，并且大小为914KB。
背景技术
细胞疗法是治疗各种疾病，特别是癌症的有力工具。在常规过继性细胞疗法中，将免疫细胞工程化以表达特异性受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其通过受体与靶细胞表达的配体的相互作用将免疫细胞的活性导向细胞靶。鉴定合适的靶分子仍然具有挑战性，因为许多靶分子在正常组织中表达。当移植细胞靶向表达靶分子的正常组织时，这种表达可能会导致毒性。因此，本领域需要用于通过过继性细胞疗法治疗疾病，特别是癌症的组合物和方法。
发明内容
本公开提供了用于增加过继性细胞疗法中使用的免疫细胞的特异性的组合物和方法。本公开提供了包含双受体系统的免疫细胞，该双受体系统增加了免疫细胞对表达靶抗原的靶细胞的特异性。免疫细胞包含第一活化剂受体，其响应于第一受体与靶抗原的结合而活化免疫细胞。免疫细胞进一步包含对非靶抗原特异性的第二抑制性受体。当第二受体与非靶抗原结合时，甚至当第一受体与靶抗原结合时，该第二受体抑制免疫细胞的活化。
本公开提供了一种免疫细胞，其包含：(a)第一受体，其包含对CEA细胞粘附分子5(CEA)特异性的细胞外配体结合结构域；和(b)第二受体，其包含对CEA+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中第一受体是响应于CEA的活化剂受体；并且其中第二受体是响应于非靶抗原的抑制性受体。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，非靶抗原通过杂合性丢失而在CEA+癌细胞中丢失。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A、HLA-B或HLA-C蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*02。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含如公开于表6中的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表6的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:103-108或SEQ ID NO:109-114的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于SEQ ID NO:103-108或SEQ ID NO:109-114的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含选自表5中公开的多肽序列的多肽序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:91-102中任一个，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分和可变轻链(VL)部分，可变重链(VH)部分包含选自由SEQ ID NO:55-58组成的组的一组重链互补决定区(HC-CDR)，可变轻链(VL)部分包含选自由SEQ ID NO:59-63组成的组的一组轻链互补决定区；或相对于SEQ ID NO:55-58或SEQ ID NO:59-63具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分和可变轻链(VL)部分，可变重链(VH)部分包含一组包含SEQ ID NO:55-57的重链互补决定区(HC-CDR)，可变轻链(VL)部分包含一组包含SEQ ID NO:59、61和63的轻链互补决定区；或相对于SEQ ID NO:55-57或SEQ ID NO:59、61和63具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，可变重链(VH)部分包含SEQ ID NO:144或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列；以及可变轻链(VL)部分，其包含SEQ ID NO:148或与其具有85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:66-70组成的组的序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:68的scFv序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，第一受体包含铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施例中，铰链结构域包含CD8α铰链结构域。在一些实施例中，CD8α链结构域包含SEQ ID NO:71的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:75的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ活化结构域。在一些实施例中，细胞内结构域包含SEQ ID NO:158的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:52的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1细胞内结构域包含与SEQ ID NO:131至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:135至少90％、至少95、至少97、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含与SEQ ID NO:134至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含LILRB1细胞内结构域、LILRB1跨膜结构域、LILRB1铰链结构域、任何这些的功能变体或其组合。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域、LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:132或与SEQ ID NO:132至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第二受体包含SEQ ID NO:164的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，CEA+癌细胞是胰腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、头颈癌细胞、胆囊癌细胞、弥漫性大B细胞癌细胞或急性髓性白血病癌细胞。在一些实施例中，CEA+癌细胞是肺癌细胞、结肠直肠癌细胞或胰腺癌细胞。在一些实施例中，CEA+癌细胞是不表达HLA-A*02的CEA+/HLA-A*02-癌细胞。在一些实施例中，CEA+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自CEA+/HLA-A*02+细胞。在一些实施例中，在具有杂合性丢失的CEA+/HLA-A*02-癌细胞存在下，第一受体和第二受体一起特异性活化免疫细胞。在一些实施例中，在未通过杂合性丢失而丢失HLA-A*02的CEA+细胞存在下，第一受体和第二受体一起不特异性活化免疫细胞。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，T细胞是CD8+CD4-T细胞。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，MHC I类基因是β-2-微球蛋白(B2M)。在一些实施例中，免疫细胞进一步包含多核苷酸，其包含干扰RNA，该干扰RNA包含与B2M mRNA的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA包含选自表11所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的B2M mRNA的降解。在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含：(a)第一序列，其从5'端至3'端具有与B2MmRNA的序列互补的序列；以及(b)第二序列，其从5'端至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。在一些实施例中，shRNA由包含序列GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:179)或GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ ID NO:180)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列的序列编码。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，MHC I类基因是β-2-微球蛋白(B2M)。在一些实施例中，免疫细胞进一步包含对编码B2M的序列的一种或多种修饰，其中一种或多种修饰降低B2M的表达和/或消除其功能。在一些实施例中，一种或多种修饰包含编码B2M的内源性基因的一种或多种失活突变。在一些实施例中，一种或多种失活突变包含缺失、插入、取代或移码突变。在一些实施例中，用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入一种或多种失活突变，该引导核酸特异性靶向编码B2M的内源性基因的序列。在一些实施例中，gNA包含选自表10所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，MHC I类基因是HLA-A*02在一些实施例中，免疫细胞进一步包含多核苷酸，其包含干扰RNA，该干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNA干扰(RNAi)介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)，其包含：(a)第一序列，其从5'端至3'端具有与HLA-A*02mRNA的序列互补的序列；以及(b)第二序列，其从5'端至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。在一些实施例中，shRNA包含选自由表12所示序列组成的组的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，MHC I类基因是HLA-A*02在一些实施例中，免疫细胞包含对编码HLA-A*02的内源性基因的序列的一种或多种修饰，其中一种或多种修饰降低HLA-A*02的表达和/或消除其功能。在一些实施例中，一种或多种修饰包含编码HLA-A*02的内源性基因的一种或多种失活突变。在一些实施例中，用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入一种或多种失活突变，该引导核酸特异性靶向编码HLA-A*02的内源性基因的序列。在一些实施例中，gNA包含表9中所示的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:52的序列，并且第二受体包含SEQ ID NO:164的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，免疫细胞包含由包含GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:179)的序列或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列编码的shRNA。在一些实施例中，第一受体和第二受体由单个多核苷酸编码，并且其中编码第一受体和第二受体的序列由编码自切割多肽的序列分开。在一些实施例中，自切割多肽包含T2A自切割多肽，其包含序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:181)。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞是自体的。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞是同种异体的。
本公开提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的免疫细胞，用作治疗CEA+癌症的药物。
本公开提供了一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，该多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：(a)第一受体，其包含对CEA细胞粘附分子5阳性(CEA)特异性的细胞外配体结合结构域；和(b)第二受体，其包含对已经在CEA+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中第一受体是响应于CEA+癌细胞上的CEA的活化剂受体；并且其中第二受体是响应于非靶抗原的抑制性受体。
在本公开的多核苷酸或多核苷酸系统的一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含用于生成本公开的免疫细胞的一种或多种多核苷酸，该多核苷酸包含编码第一受体和第二受体的多核苷酸序列。
在本公开的多核苷酸或多核苷酸系统的一些实施例中，该多核苷酸或多核苷酸系统包含编码对B2M特异性的shRNA的序列。在一些实施例中，编码第一受体、第二受体和对B2M特异性的shRNA的序列由相同的多核苷酸编码。在一些实施例中，(a)编码对B2M特异性的shRNA的序列包含
GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:179)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；(b)编码第一受体的序列包含SEQ ID NO:143，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；和(c)编码第二受体的序列包含SEQ ID NO:165，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列。
本公开提供了包含载体，其包含本公开的一种或多种多核苷酸。
本公开提供了杀死在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的CEA+癌细胞的方法，其包含向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。
本公开提供了治疗患有在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的CEA+肿瘤的受试者体内CEA+癌症的方法，其包含向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。
本公开提供了治疗受试者体内癌症的方法，其包含：(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞的HLA-A基因型或表达；(b)任选地，确定受试者的多种癌细胞中的CEA的表达；以及(c)如果正常细胞表达HLA-A*02并且多种癌细胞不表达HLA-A*02，并且多种癌细胞是CEA阳性的，则向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。
在本公开的方法的一些实施例中，受试者是患有表达CEA(CEA+)并且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者。在一些实施例中，受试者是患有表达CEA并且已经丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02患者。在一些实施例中，癌症包含胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、食道癌、胃癌、头颈癌、胆囊癌、弥漫性大B细胞癌或急性髓性白血病。在一些实施例中，癌症包含肺癌、结肠直肠癌或胰腺癌。
在本公开的方法的一些实施例中，癌细胞包含不表达HLA-A*02的CEA+/HLA-A*02-癌细胞。在一些实施例中，CEA+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自CEA+/HLA-A*02+细胞。在一些实施例中，在CEA+/HLA-A*02-癌细胞存在下，第一受体和第二受体一起特异性活化免疫细胞。在一些实施例中，在未丢失HLA-A*02的CEA+细胞存在下，第一受体和第二受体一起不特异性活化免疫细胞。
在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物减小了受试者体内肿瘤的大小。在一些实施例中，肿瘤减小了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施例中，肿瘤被消除。在一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物阻止了受试者体内肿瘤的生长。在一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物减少了受试者体内肿瘤的数目。
在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物导致受试者体内癌细胞而非正常细胞的选择性杀伤。在一些实施例中，至少约60％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约65％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约70％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约75％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约80％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约85％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约90％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％的被杀死的细胞是癌细胞。在一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物导致杀死受试者的至少约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的癌细胞。
在本公开的方法的一些实施例中，与施用包含第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用免疫细胞或药物组合物对受试者产生更少的副作用。
本公开提供了制备多种免疫细胞的方法，其包含：(a)提供多种免疫细胞，以及(b)用本公开的多核苷酸、多核苷酸系统或载体转化多种免疫细胞。
本公开提供了试剂盒，其包含本公开的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，试剂盒进一步包含使用说明书。
附图说明
图1是与TNFRS11(RANKL)结合的TNFRSF11A(RANK)的晶体结构，示出了变体TNFRSF11A表位在蛋白质表面上，并且可能易被抗体接近。
图2示出了人整联蛋白α-E(ITGAE)(SEQ ID NO:182)与人整联蛋白α-X(ITGAX、P20702、ITAX_HUMAN)(SEQ ID NO:183)的比对。ITGAE rs1716 R950W(MAF 0.2654，来自1000基因组计划)和rs2976230V1019A/V1019G(MAF 0.282，来自1000基因组计划)中的SNP变体以方框示出。
图3是ITGAX的非活性构象的晶体结构，其与ITGAE具有27％的同一性。ITGAE SNP的位置如标记所示。
图4是一个表，示出了可以用CEA TCR与RANK阻断剂受体组合治疗的可寻址结肠直肠癌(CRC)患者群体估计为2,000至5,000名患者，这取决于使用哪种RANK变体。在该表中，可治疗的患者的上述小计为5000至11000，并且包括高CEA+患者的百分比，如前所述。接受治疗的患者计算为：HLA-A*02载体频率(0.5)x随机丢失(0.5)x RANK变体het频率(0.2-0.5)x癌症RANK LOH频率＝[0.05-0.125]x LOH频率。
图5示出了CEA(CEACAM5)在正常组织中的表达。
图6示出了TNFRSF11A(RANK)在正常组织中的表达。
图7示出了CEA在所有TCGA癌症(具有肿瘤和正常样品)中的表达。缩写：BLCA(膀胱癌)、BRCA(乳腺癌)、CESC(宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌)、CHOL(胆管癌)、COAD(结肠腺癌)、ESCA(食管癌)、GBM(多形性成胶质细胞瘤)、HNSC(头颈鳞状细胞癌)、KICH(肾嫌色细胞癌)、KIRP(肾乳头状细胞癌)、LIHC(肝细胞癌)、LUAD(肺腺癌)、LUSC(肺鳞状细胞癌)、PAAD(胰腺癌)、PRAD(前列腺癌)、PCPG(嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)、READ(直肠腺癌)、SARC(肉瘤)、SKCM(皮肤黑色素瘤)、THCA(甲状腺癌)、THYM(胸腺瘤)、STAD(胃腺癌)、UCEC(子宫内膜癌)。
图8示出了TNFGSF11A在TCGA癌症(具有肿瘤和正常样品)中的表达。
图9是示出了根据癌症部位在美国估计的死亡的表格，统计取自美国癌症协会(American Cancer Society)。
图10是示出了HLA-A*02抑制性受体可以阻断CEA CAR对Jurkat细胞的活化的一系列图。
图11是示出了用于鉴定潜在的非靶抗原(阻断剂)候选基因的生物信息学搜索过程的图。
图12是示出了使用杂合性丢失(LOH)区分肿瘤和正常组织的一对图。工程化的免疫细胞杀死肿瘤但使正常细胞免受伤害。在示例性实施例的情况下，免疫细胞表达CEACAR，活化剂抗原是CEA，阻断剂抗原是HLA-A*02。选择肿瘤中具有HLA-A*02种系杂合性和HLA-A*02克隆性LOH的患者。
图13是示出了本公开的示例性双受体系统的分子组成的图，其包含CEA CAR和HLA-A*02scFv LILRB1抑制性受体。
图14示出了HeLa细胞中CEA和HLA-A*02抗原的表达。A*02：HLA-A*02。
图15示出了在Jurkat细胞中CEA活化剂和HLA-A*02LILRB1抑制性受体的功能，使用工程化的HeLa细胞作为细胞毒性的靶。A*02：HLA-A*02；Tmod：细胞表达CEA CAR和HLA-A*02抑制性受体；CAR：细胞仅表达CEA CAR。
图16示出了来自HeLa细胞上单一供体的供体T细胞中CEA活化剂和HLA-A*02LILRB1抑制性受体的功能。Tmod：细胞表达CEA CAR和HLA-A*02抑制性受体；CAR：细胞仅表达CEA CAR。
图17示出了来自四个供体的T细胞中的CEA活化剂和HLA-A*02LILRB1抑制性受体在HeLa细胞上的功能。Tmod：细胞表达CEACAR和HLA-A*02抑制性受体；CAR：细胞仅表达CEACAR。靶细胞是仅表达CEA或CEA和HLA-A*02的HeLa细胞。
图18示出了HeLa细胞中CEA和HLA-A*02通过mRNA滴定的细胞表面表达。A*02：HLA-A*02。
图19示出了使用具有稳定表达的CEA活化剂和HLA-A*02阻断剂受体的Jurkat效应细胞测量的CEA CAR活化剂和HLA-A*02LILRB1阻断剂敏感性作为HeLa细胞中CEA表面分子数目的函数。
图20示出了表达CEA CAR Tmod(CEA CAR和HLA-A*02和LILRB1抑制性受体)、仅CAR和CEA TCR的原代T细胞的活化剂和阻断剂的敏感性。示出了CEA CAR，具有HLA-A*02阻断剂(Tmod)的CEA CAR和CEA TCR的活化剂(右)的剂量应答曲线，而抑制性受体(阻断剂)的剂量应答曲线仅针对CEA CAR和具有HLA-A*02阻断剂(Tmod)的CEA CAR。A*02：HLA-A*02。
图21示出了预测CEA CAR和HLA-A*02抑制性受体的组合杀死肿瘤，同时保护正常组织。TPM：每百万转录物；A*02：HLA-A*02；LOH：杂合性丢失。
图22示出了用于将分子/细胞转化为TPM值的标准曲线。CEA标准曲线(左)中的数据示出了来自Bacac等人2016，《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》22，3286-3297的CEA细胞表面表达相对于来自GTEx数据库的mRNA(TPM)作图。TPM：每百万转录物。
图23示出了CEA和HLA-A*02在H508和SW1463细胞系上的表面表达。WT：野生型；KO：所指示的基因被敲除。
图24示出了衍生自三个HLA-A*02(-)供体的表达CEA Tmod的细胞(表达CEA CAR和HLA-A*02scFv抑制性受体的细胞)的细胞毒性数据，用结肠直肠细胞系作为靶进行测定。A*02：HLA-A*02。
图25示出了使用用CEA TCR或Tmod双受体系统转导的HLA-A*02(+)供体T细胞，在不同E:T比率下CEA CAR Tmod和TCR T杀伤肿瘤和正常细胞的时间进程。
图26示出了表达CEA CAR Tmod双受体系统的效应细胞与表达CEA TCR的细胞相似地杀死肿瘤细胞，但是在杀死CEA(+)HLA-A*02(+)正常H508靶细胞方面活性低约70倍。肿瘤：CEA(+)HLA-A*02(-)靶细胞；仅B：靶细胞仅表达HLA-A*02；正常：CEA(+)HLA-A*02(+)靶细胞。
图27示出了当以1:1比率存在于混合的肿瘤和正常细胞培养物中时，表达CEA CARTmod双受体的效应细胞的选择性细胞毒性。肿瘤细胞是稳定表达GFP(绿色)的H508CEA(+)HLA-A*02(-)细胞。正常细胞是稳定表达RFP(红色)的H508 CEA(+)HLA-A*02(+)细胞。T细胞来自HLA-A*02(+)供体D12333。比例尺为500微米。
图28示出了在肿瘤：正常靶细胞的1:1混合物中表达CEA CAR和HLA-A*02抑制性受体(Tmod)的特异性杀伤效应细胞的总结。H508靶细胞基因型如图26所示，没有添加IL-2。供体T细胞是HLA-A*02(+)，供体183534除外。
图29示出了连续共培养的靶细胞的图像。对于细胞毒性测定，转导T细胞，富集阻断剂抗原，并从一种特定类型的靶细胞转移到下一种。正常细胞和肿瘤细胞都用GFP标记，但红色伪色用于显现肿瘤细胞，绿色用于正常细胞。比例尺表示500微米。
图30示出了CEA CAR Tmod表达细胞和CEA CAR表达细胞在重复抗原攻击中的时间进程。水平箭头表示从靶细胞类型(肿瘤或正常H508)的转移。用CEA CAR或Tmod双受体转导的供体T细胞是HLA-A*02(+)(D12333)。
图31示出了可溶性CEA(sCEA；10ug/mL)的存在对H508细胞中的CEA CAR Tmod细胞毒性没有显著影响。肿瘤、正常和B的基因型如下：肿瘤：CEA(+)HLA-A*02(-)靶细胞；正常：CEA(+)HLA-A*02(+)靶细胞；B：CEA(-)HLA-A*02(+)靶细胞。
图32示出了用表达CEA CAR Tmod双受体的效应T细胞和CEA(+)靶细胞系进行的细胞毒性测定。对于靶细胞共培养，E:T为3:1，使用H508靶细胞。B仅指CEA(-)HLA-A*02(+)细胞。
图33示出了用表达CEA CAR Tmod双受体的效应T细胞和CEA(+)靶细胞系进行的细胞毒性测定。对于靶细胞共培养，E:T为3:1，使用SW1463靶细胞。仅B，CEA(-)HLA-A*02(+)靶细胞。
图34示出了表达CEA Tmod双受体的效应T细胞(使用单独的活化剂和阻断剂慢病毒载体转导细胞)能够相对于正常细胞选择性杀死结肠直肠癌细胞系H508中的肿瘤。与基准CEA TCR相比，表达Tmod受体的T细胞对正常细胞同样敏感，但更具选择性。T细胞衍生自HLA-A*02(-)供体(D4809)。
图35示出了在HLA-A*02(-)供体细胞(D4809)中表达CEA Tmod双受体(通过2个单独的慢病毒载体递送)的效应T细胞的可逆细胞毒性的定量。在第1轮中首先将T细胞暴露于肿瘤或正常细胞，然后在第2轮中分别暴露于正常或肿瘤细胞，并测量选择性肿瘤对正常细胞杀伤。WT：野生型；A2KO：HLA-A*02敲除。
图36示出了使用细胞系组的CEA CAR Tmod双受体脱靶选择性的Jurkat细胞测定，该细胞系组被选择为代表大于90％的成人组织基因表达。将表达Tmod受体的Jurkat效应细胞与表26所述的单个靶细胞系共培养。用2ug CEA mRNA或天然表达的CEA转染代表肿瘤细胞的阳性对照细胞系。正常细胞是CEA(-)HLA-A*02(+)。水平虚线位于来自单独Jurkat细胞(表达Tmod受体)的数据的平均值+2倍标准偏差(SD)处。每个孔中共培养10,000(10K)个Jurkat细胞和10K个靶细胞。左柱状图：表达具有CEA+HLA-A*02(-)细胞的Tmod双受体的Jurkat细胞；中间柱状图：表达具有CEA(-)靶细胞的Jurkat细胞的CAR；右柱状图，表达具有CEA(-)HLA-A*02(+)靶细胞的两种受体的Jurkat细胞。阴性对照在灰色框中。
图37示出了表达来自3个HLA-A*02(+)供体的CEA CAR Tmod双受体的效应T细胞的细胞毒性数据的总结。UTD，未转导。
图38示出了使用原代T效应细胞的选择性数据的总结。
图39示出了用表达CEA CAR或CEA Tmod双受体的人T细胞进行的小鼠异种移植研究的设计。示出了异种移植实验设计和肿瘤体积对时间的关系。
图40示出了在小鼠异种移植研究中通过测径测量的肿瘤体积。误差条是SEM。N＝7只小鼠/组(盐水和UTD组或未诱导组中5只)；异种移植物＝表达萤火虫荧光素酶的H508结肠癌细胞系；剂量＝2E7人T细胞/小鼠，通过尾静脉注射。BLI变化％＝100倍(BLI第t天至BLI第35天)/(BLI第35天)。右下y轴上的-100％表示生物发光信号为零；即，没有任何残留肿瘤细胞的证据。用hCD3 mAb检测小鼠血液中的人T细胞。
图41示出了用于测量生物发光(lucerifase)随时间变化的每组五只小鼠的图像(图40中小鼠的子集)。一只Tmod小鼠(左侧第2只，第64天)没有错误地接受BLI底物。
图42示出了每只小鼠5E6 T细胞的T细胞剂量的异种移植研究结果。底部中间的图示出了来自上图的重新绘制的数据，以更高的分辨率显示肿瘤体积。UTD：非转导；CAR，单独用CEA CAR转导的T细胞；Tmod，用CEA CAR和HLA-A*02scFv LILRB1抑制性受体转导的T细胞。
图43示出了来自小鼠异种移植研究的个体肿瘤数据。浅灰色细线：个体小鼠；黑色粗线：均值；垂直虚线：T细胞注射日(第35天)。UTD，未转导的T细胞；CAR，用CEA CAR转导的T细胞，Tmod，用CEA CAR和HLA-A*02ScFv LILRB1抑制性受体两者转导的T细胞；生理盐水，注射生理盐水对照的小鼠。
图44示出了异种移植研究中个体小鼠的生物发光(BLI)。％BLI如图40所述测定。UTD，未转导的T细胞；CAR，用CEA CAR转导的T细胞，Tmod，用CEA CAR和HLA-A*02ScFvLILRB1抑制性受体两者转导的T细胞；生理盐水，注射生理盐水对照的小鼠。
图45示出了来自异种移植研究的小鼠脾脏的细胞分析。T细胞注射后30天收获细胞。
图46是示出了HLA-A*02抗原如何与HLA-A*02(+)T细胞中的HLA-A*02Tmod阻断剂受体以顺式结合，以相对于正常细胞以反式阻碍阻断剂受体结合/功能的图。这种作用可以通过标记的HLA-A*02四聚体和通过功能测定检测。
图47示出了使用引导RNA(gRNA)与B2M和B2M shRNA的CRISPR降低细胞表面上的HLA表达并增加HLA-A*02(+)T细胞中的阻断剂受体可用性。
图48示出了B2M shRNA构建体对表达CEA CAR和HLA-A*02scFvLILRB1抑制性受体(Tmod)的第一代自体T细胞的顺式结合的影响。
图49示出了急性细胞毒性测定中的细胞因子分泌。肿瘤细胞为CEA(+)HLA-A*02(-)H508细胞；正常细胞为CEA(+)HLA-A*02(+)H508细胞；L.D.，检测限＝背景+每次测定的3倍标准偏差。
图50示出了当使用HeLa靶细胞测定时，HLA-A*02LILRB1抑制性受体在HLA-A*02(+)和HLA-A*02(-)Jurkat细胞中同样敏感。
图51示出了B2M shRNA在表达HLA-A*02scFv LILRB1抑制性受体的T细胞中的共表达使受体不与原代T细胞上的探针结合。
图52示出了急性细胞毒性测定中的细胞因子分泌。肿瘤，CEA(+)HLA-A*02(-)H508细胞；正常CEA(+)HLA-A*02(+)H508细胞；L.D.，检测限＝背景+每次测定的3倍标准偏差。
图53是总结本文所述的一些实施例的双受体系统的性质的表。
具体实施方式
本文提供了使用免疫细胞治疗癌症的组合物和方法，免疫细胞包含响应于癌症和正常野生型细胞之间的配体的基因表达差异的双受体系统。这些表达上的差异可能是由于癌细胞中杂合性的丢失。替代地，表达的差异可能是因为基因表达在癌细胞中不表达，或在癌细胞中以低于正常细胞的水平表达。双受体系统在免疫细胞中表达，例如在过继性细胞疗法中使用的免疫细胞，并且将这些免疫细胞的活性靶向表现出杂合性丢失或表达差异的癌细胞。在这种双受体系统中，第一受体(活化剂受体，有时在本文中称为A模块)活化或促进免疫细胞的活化，而第二受体(抑制性受体，有时在本文中称为阻断剂或抑制剂受体，或B模块)起抑制第一受体活化免疫细胞的作用。每个受体含有结合特异性配体的配体结合结构域(LBD)。在配体结合时来自两种受体的信号被免疫细胞整合。第一受体和第二受体的配体在癌症和正常细胞中的差异表达，例如通过编码抑制性配体的基因座在癌细胞中的杂合性丢失，或转录水平的差异，介导免疫细胞被表达第一活化剂配体但不表达第二抑制性配体的靶癌细胞活化。
在本文提供的组合物和方法的特定实施例中，包含本文所述的双受体系统的免疫细胞用于治疗CEA细胞粘附分子5(CEA)阳性癌症。这包括胃肠(GI)道的CEA阳性癌症。在CEA阳性癌症的情况下，活化剂受体的靶抗原是CEA或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。CEA在正常成人中主要在GI组织中作为表面蛋白表达，其可以从膜裂解并以可溶形式释放。由于其在GI肿瘤中的选择性表达，长期以来一直被认为是一种有吸引力的肿瘤特异性抗原，如果CEA阳性癌细胞可以用适当的治疗剂特异性靶向，则其可以介导GI肿瘤的选择性杀伤。此外，CEA基因产物是癌症的有吸引力的靶，因为其在几乎所有结肠直肠肿瘤(和其它实体瘤的大亚组)中的高表达和在成人组织中的有限表达。然而，非癌(非靶)细胞中的正常CEA表达已经阻止CEA有效用于靶向疗法，如过继性细胞疗法。已经在临床上测试了几种针对CEA的治疗剂，并且发现它们诱导结肠炎作为剂量限制性毒性(DLT)。在2011年，一项针对与HLA-A*02复合的CEA肽(即，pMHC)的鼠TCR临床研究在第1期研究(n＝3)中因对结肠的局部毒性而停止(Parkhurst等人《分子治疗(Molecular Therapy)》201119(3)：P620-626；Parkhurst等人《临床癌症研究》2009年1月1日；15(1):169-180)。DLT以2-4E8细胞/患者的显著低剂量发生。
肿瘤亚群中的HLA杂合基因丢失可用于保护患者免受靶上、肿瘤外毒性。通过使活化剂受体与抑制性受体配对，本文提供的方法增加过继性细胞疗法的特异性并且降低与这些疗法相关的有害作用，如剂量限制性毒性。包含CEA活化剂受体和HLA-A*02特异性抑制性受体的免疫细胞在体外和体内选择性地杀死A*02(-)肿瘤细胞。这些免疫细胞与临床活性CEA TCR-T细胞一样有效，但对缺乏HLA-A*02的肿瘤细胞具有高度选择性。与抑制性受体配对的CEA CAR是实体瘤治疗候选物，其活性由肿瘤细胞中缺失的基因指导，使得可以保护正常组织免受CEA介导的细胞毒性。
在一些实施例中，活化剂的配体是与I类MHC复合的CEA肽，例如包含HLA-A*02的MHC复合物。在本文所述的方法中，这种CEA靶向活化剂受体与抑制性受体配对，其通过阻断活化剂对正常CEA阳性组织的细胞溶解作用而增加活化剂的安全窗口。不希望受理论束缚，这些组织被认为主要在胃肠道中。然而，由于肿瘤细胞不表达抑制剂或阻断剂受体的配体，活化剂受体仍然指导由包含双受体系统的免疫细胞靶向杀伤肿瘤细胞。第二抑制性受体的靶由胃肠(GI)组织表达，但在癌细胞中不表达，并且抑制性受体将这种“非靶抗原”识别为抑制性刺激。第二抑制性受体的示例性靶在正常GI上皮细胞的表面上表达，并且通过杂合性丢失(LOH)或其它机制而从GI肿瘤细胞中丢失，在癌细胞中留下单个等位基因形式，其可以通过抑制性受体上的等位基因特异性配体结合结构域与其它等位基因区分开。抑制性受体的示例性靶包括但不限于主要组织相容性复合物(MHC)蛋白，如人白细胞抗原A(HLA-A)、HLA-B、HLA-C和其它HLA。HLA由变异基因编码，如HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-C*07等，其可以通过杂合性丢失而从CEA阳性癌细胞中丢失。替代地，抑制性受体的其它示例性靶包括但不限于TNF受体超家族成员11a(TNFRSF11A，也称为RANK)、整联蛋白亚基αE(ITGAE)、胆碱能受体烟碱β1亚基(ACHRB或CHRNB)、瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1(TRPV1)和清除剂受体F类成员1(SREC或SCARF)。这些中的每一种具有共同的非同义变体形式，在其可接近抗体的细胞外结构域中具有氨基酸改变，其可用作细胞整合体的B模块靶，该细胞整合体被设计成用由活化剂受体(如CEA或CEA pMHC响应性活化剂受体)活化的工程化T细胞安全地治疗GI癌症患者。
本公开的组合物和方法可以减少或消除由CEA在正常GI组织上的表达引起的剂量限制性毒性(DLT)。不希望受理论束缚，认为CEA的表达虽然有限，但在GI道中足够高以诱导严重的不良事件，这些不良事件已阻止CEA作为临床中过继性细胞疗法或免疫疗法的靶的进一步发展。本公开提供了使用过继性细胞疗法通过添加第二抑制性受体靶向癌细胞中的CEA以治疗CEA阳性癌症的方法，第二抑制性受体在第二配体(不同于CEA的配体，称为非靶抗原或替代地，阻断剂抗原)的存在下阻断过继性免疫细胞的活化。使用本文所述的组合物和方法，表达CEA的肿瘤细胞受到表达两种受体的过继性免疫细胞攻击，因为这些肿瘤细胞仅表达活化剂配体CEA。相反，表达CEA加上非靶抗原(替代地称为“阻断剂抗原”)的正常细胞被保护免受过继性免疫细胞的影响。对正常细胞上的非靶抗原的抑制性受体应答阻止了CEA靶向的活化剂受体对免疫细胞的活化。这种双重靶向方法产生了治疗窗口，其将允许在CEA阳性癌症患者中安全且有效地施用CEA定向细胞疗法。
本公开提供了允许使用有效的CEA CAR和TCR的方法和组合物，这些有效的CEACAR和TCR诱导靶向毒性，并且通过减轻其毒性使这些CEA靶向受体可用作治疗剂。在临床中已经测试过的现有疗法(包括细胞和大分子疗法)都没有提供保护正常CEA阳性组织的机制。
在变化形式中，本文所述的组合物和方法可用于杀死靶细胞和/或治疗其中非靶抗原的表达因杂合性丢失以外的原因而部分或完全降低的受试者，这些原因包括但不限于编码非靶抗原的序列中的部分基因缺失、表观遗传沉默和点突变或截短突变。
定义
在更详细地阐述本公开之前，提供本文使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在特定实施例的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，下面定义以下术语。其它定义在本公开内容中阐述。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
如本文所用，术语“分离的”意指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随它的组分的材料。在特定实施例中，术语“获得的”或“衍生的”与分离的同义使用。
术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人。也包括体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。本文所用的“受试者”、“患者”或“个体”包括表现出可用本文预期的载体、组合物和方法治疗的疼痛的任何动物。合适的受试者(例如，患者)包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(如猫或狗)。包括非人灵长类动物，优选地包括人患者。
本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括任何有益或期望的效果，甚至可以包括症状的最小改善。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病状或其相关症状。
如本文所用，“预防(prevent)”和如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等类似词语表示用于预防、抑制或降低疾病症状的可能性的方法。它还指延迟疾病或病状的发作或复发或延迟疾病症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病发作或复发之前降低疾病的强度、作用、症状和/或负担。
如本文所用，术语“量”是指实现有益或期望的预防或治疗结果(包括临床结果)的病毒的“有效量(an amount effective)”或“有效量(an effective amount)”。
病毒或细胞的“治疗有效量”可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及病毒或细胞在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过病毒或细胞的任何毒性或有害效果的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。
生理反应(例如，电生理活性或细胞活性)的“增加的”或“增强的”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括增加1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括在1之间和1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)未处理细胞中的活性水平。
生理反应(例如，电生理活性或细胞活性)的“降低的”或“减少的”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括降低1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括在1之间和1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)未处理细胞中的活性水平。
“维持(maintain)”或“保存(preserve)”或“维持(maintenance)”或“无变化”或“无显著变化”或“无显著降低”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的响应相当的生理反应。可比较的应答是与参考应答没有显著差异或可测量的差异的应答。
通常，“序列同一性”或“序列同源性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应关系。通常，用于确定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二个核苷酸或氨基酸序列进行比较。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过测定它们的“同一性百分比”进行比较。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并乘以100。同一性百分比也可以例如通过使用高级BLAST计算机程序(包括2.2.9版，可从国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)获得)比较序列信息来确定。BLAST程序基于Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:2264-2268(1990)的比对方法并讨论于Altschul等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410(1990)；Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊》90:5873-5877(1993)；和Altschul等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402(1997)。简言之，BLAST程序将同一性定义为相同比对符号(通常为核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列中符号的总数。该程序可用于测定所比较蛋白质全长的同一性百分比。提供默认参数以优化使用短查询序列的搜索，例如在blastp程序中。该程序还允许使用SEG过滤器来屏蔽由Wootton和Federhen，《计算机与化学(Computersand Chemistry)》17:149-163(1993)的SEG程序确定的查询序列的区段。所需序列同一性程度的范围为大约80％至100％和其间的整数值。通常，公开的序列和要求保护的序列之间的同一性百分比是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
如本文所用，“多核苷酸系统”是指一种或多种多核苷酸。一种或多种多核苷酸可以被设计成与特定应用协同工作，或产生所需的转化细胞。
本文使用的术语“外源性”是指源自生物体外部的任何分子，包括核酸、蛋白质或肽、小分子化合物等。相反，术语“内源性”是指源自生物体内部(即，由生物体天然产生)的任何分子。
术语“MOI”在本文中用于指感染复数，其为药剂(例如病毒颗粒)与感染靶(例如细胞)的比率。
在本说明书中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。术语“约”，当紧接在数字或数值之前时，意指数字或数值的范围最多±10％。
如本文所用，“靶细胞”是指通过过继性细胞疗法靶向的细胞。例如，靶细胞可以是癌细胞，其可以被过继性细胞疗法的移植T细胞杀死。本公开的靶细胞表达如本文所述的靶抗原，但不表达非靶抗原。
如本文所用，“非靶细胞”是指不被过继性细胞疗法靶向的细胞。例如，在靶向癌细胞的过继性细胞中，正常、健康、非癌细胞是非靶细胞。受试者体内一些或全部非靶细胞可以表达靶抗原和非靶抗原两者。受试者体内非靶细胞可以表达非靶抗原，而不管这些细胞是否也表达靶抗原。
如本文所用，“非靶等位基因变体”是指其产物由非靶细胞表达但不由靶细胞表达的基因的等位基因。例如，非靶等位基因变体是由受试者的正常非癌细胞表达，但不由受试者的癌细胞表达的基因的等位基因。非靶等位基因变体的表达可以通过任何机制在癌细胞中丢失，包括但不限于编码非靶等位基因变体的基因的杂合性丢失、突变或表观遗传修饰。
如本文所用，当关于配体结合结构域(如抗原结合结构域)使用时，“特异于”或“特异性结合于”是指对指定靶具有高特异性的配体结合结构域。抗体特异性可被视为配体结合结构域与相应配体之间的拟合优度，或配体结合结构域区分相似或甚至不相似配体的能力的量度。与特异性相比，亲和力是配体结合结构域与配体之间的结合强度的量度，使得低亲和力配体结合结构域结合微弱，而高亲和力配体结合结构域结合牢固。对靶等位基因特异性的配体结合结构域是能够区分基因的不同等位基因的配体结合结构域。例如，对HLA-A*02特异性的配体结合结构域将不结合，或仅微弱地结合其它HLA-A等位基因，如HLA-A*01或HLA-A*03。本领域技术人员将理解，配体结合结构域可以被称为对特定靶是特异性的，并且仍然具有低水平的与一种或多种不影响其在本文所述的受体系统中的功能的额外靶的结合。
如本文所用，“靶抗原”，无论使用术语抗原或特定抗原的名称提及，是指由靶细胞(如癌细胞)表达的抗原。靶抗原的表达不限于靶细胞。靶抗原可以由受试者体内癌细胞和正常的非癌细胞表达。
如本文所用，“非靶抗原”(或“阻断剂抗原”)无论使用术语抗原或特定抗原的名称提及，是指由正常非癌细胞表达且在癌细胞中不表达的抗原。这种表达差异允许抑制性受体在非靶细胞存在下而不是在靶细胞存在下抑制免疫细胞活化。
多态性是指一个群体中核苷酸序列的两种或多种变体的存在。多态性可以包含一个或多个碱基改变、插入、重复或缺失。多态性包括例如简单序列重复(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)，其为当腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)的单核苷酸改变时发生的变异。
如本文所用，“亲和力”是指配体与受体上的单个配体结合位点的结合强度，例如针对本文中所述的任何受体的抗原结合结构域的抗原。配体结合结构域可以与其配体具有较弱的相互作用(低亲和力)或较强的相互作用(高亲和力)。
Kd或解离常数是一种平衡常数，其测量较大物体可逆地分离成较小组分的倾向，例如当包含受体及其同源配体的大分子复合物分离成配体和受体时。当Kd高时，这意味着需要高浓度的配体来占据受体，并且受体对配体的亲和力低。相反，低Kd意味着配体对受体具有高亲和力。
如本文所用，“响应”或“响应于”的受体是指包含细胞内结构域的受体，其当与配体(即抗原)结合时生成对应于细胞内结构域的已知功能的信号。与靶抗原结合的活化剂受体可以生成引起表达活化剂受体的免疫细胞活化的信号。与非靶抗原结合的抑制性受体可以生成抑制信号，其阻止或减少表达活化剂受体的免疫细胞的活化。受体的反应性及其活化或抑制表达受体的免疫细胞的能力可以通过本领域已知的和本文所述的任何方法测定，包括但不限于报告基因测定和细胞毒性测定。
如本文所用，免疫细胞的“活化”或“被活化”的免疫细胞是能够执行免疫应答的一种或多种特征性功能的免疫细胞。这些功能包括增殖、细胞因子释放和细胞毒性，即杀死靶细胞。活化的免疫细胞表达对本领域技术人员显而易见的标记。例如，活化的T细胞可以是表达CD69、CD71、CD25和HLA-DR中的一种或多种。当表达活化剂受体(例如CEACAR)的免疫细胞对受体与靶细胞表达的靶抗原(例如CEA)的结合产生应答时，其可以被活化剂受体活化。“靶抗原”也可以称为“活化剂抗原”，并且可以由靶细胞分离或表达。当抑制性受体对非靶抗原(例如HLA-A*02)的结合有响应时，甚至当活化剂受体与靶活化剂配体结合时，表达抑制性受体的免疫细胞的活化也可以被阻止。“非靶抗原”也可以称为“抑制性配体”或“阻断剂”，并且可以由靶细胞分离或表达。
免疫细胞上的受体表达可以通过报告本文所述的活化剂受体和抑制性受体的存在的测定进行验证。例如，可以用标记的分子(例如荧光团标记的受体特异性抗体或荧光团标记的受体特异性配体)对免疫细胞群体进行染色，并使用荧光活化细胞分选(FACS)流式细胞术进行定量。该方法允许免疫细胞群体中免疫细胞的百分比表征为表达活化剂受体、抑制性受体或两种受体。本文所述免疫细胞表达的活化剂受体和抑制性受体的比例可以通过例如数字液滴PCR进行测定。这些方法可用于表征用于产生和制造本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒的细胞群体。对于本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒，应理解表达活化剂受体和抑制性受体两者的免疫细胞的合适百分比是针对本文所述的方法特异性确定的。例如，表达活化剂受体和抑制性受体的免疫细胞的合适百分比可以是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。例如，表达活化剂受体和抑制性受体的免疫细胞的合适百分比可以是至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％。例如，免疫细胞中活化剂受体与抑制性受体的合适比例可以是约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4或约1:5。应理解，纯化、富集和/或耗竭步骤可用于免疫细胞群体以满足本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适值。
本文所述的免疫细胞表达的应答受体可以通过测量预期由受体的细胞内结构域生成的信号的生成的测定进行验证。报告细胞系，如Jurkat-荧光素酶NFAT细胞(Jurkat细胞)可用于表征应答受体。Jurkat细胞衍生自T细胞并包含稳定整合的活化T细胞核因子(NFAT)-诱导型荧光素酶报告系统。NFAT是免疫细胞活化所需的转录因子家族，其活化可用作T细胞活化的信号标记。可以用本文所述的活化剂受体和/或抑制性受体转导或转染Jurkat细胞。如果Jurkat细胞表达荧光素酶报告基因，则活化剂受体对配体的结合有应答，应答的水平可以通过报告基因表达的水平来确定。萤光素酶的存在可以使用任何已知的萤光素酶检测试剂(如萤光素)来测定。如果当在Jurkat细胞中与活化剂受体共表达时，抑制性受体对配体的结合有应答，它阻止正常应答的免疫细胞表达对活化剂受体应答的荧光素酶。例如，可以通过观察以下各项在表达活化剂和抑制剂两者的Jurkat细胞中确定和定量抑制性受体的响应性：1)Jurkat细胞在存在活化剂受体配体和不存在抑制性受体配体的情况下表达荧光素酶；和2)在活化剂受体配体和抑制性受体配体存在下，Jurkat细胞中的荧光素酶表达减少或消除。该方法可用于测定活化剂受体以及活化剂受体和抑制性受体的特异性对的敏感性、效力和选择性。可以使用剂量-应答实验通过EC50或IC50值定量敏感性、效力和选择性，其中将活化剂受体配体和/或抑制性受体配体滴定到表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的Jurkat细胞培养物中。替代地，EC50和IC50值可以在表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特定对的免疫细胞(例如Jurkat细胞或原代免疫细胞)与表达增加量的活化剂配体或抑制剂配体的靶细胞的共培养物中测定。通过例如将编码mRNA的活化剂配体或抑制剂配体滴定到靶细胞中，或使用天然表达不同水平的靶配体的靶细胞，可以在靶细胞中实现活化剂配体或抑制剂配体的增加量。使用表达不同量的靶配体和非靶配体的靶细胞测定的活化剂和抑制性受体的示例性合适的EC50和IC50值包括活化剂受体的每百万260个转录物(TPM)或更低的EC50，例如10至260TPM之间的EC50，以及抑制性受体的10TPM或更低的IC50，例如1至5TPM的IC50。
表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的本文所述的免疫细胞的活化可以进一步通过在与所述免疫细胞共孵育后测量靶细胞活力的测定来确定。免疫细胞，有时称为效应细胞，与表达活化剂受体配体、抑制性受体配体或活化剂和抑制性受体配体两者的靶细胞共孵育。共孵育后，使用测量细胞培养物中活力的任何方法测量靶细胞的活力。例如，可以使用线粒体功能测定来确定活力，该线粒体功能测定使用四唑盐底物来测量活性线粒体酶。也可以使用基于成像的方法确定活力。靶细胞可以表达荧光蛋白，如绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。总细胞荧光的降低表明靶细胞活力的降低。在与表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的免疫细胞一起孵育后，靶细胞活力的降低解释为靶细胞介导的免疫细胞的活化。免疫细胞选择性的测量也可以使用这种方法来确定。如果观察到以下情况，则表达一对活化剂和抑制性受体的免疫细胞是选择性的：1)在表达活化剂受体配体但不表达抑制性受体配体的靶细胞中活力降低；2)在表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞中活力不降低。从这些测量中，可以得到“特异性杀伤”值，其将基于靶细胞活力的降低作为阴性对照(不表达活化剂受体的免疫细胞)的百分比来定量免疫细胞活化的百分比。此外，从这些测量值可以推导出“选择性比率”值，其表示在不存在抑制性受体配体的情况下在表达活化剂受体配体的靶细胞中观察到的特异性杀伤与在表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞中观察到的特异性杀伤的比率。该方法可用于表征用于产生和制备本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒的细胞群体。
免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值可以是例如以下标准：1)在不存在抑制性受体配体的情况下，在表达活化剂受体配体的免疫细胞和靶细胞的48小时共孵育后，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的特异性杀伤；和2)对表达活化剂受体配体和抑制性受体配体的靶细胞的特异性杀伤小于或等于40％、小于或等于35％、小于或等于30％、小于或等于25％、小于或等于20％、小于或等于15％、小于或等于10％、小于或等于5％、小于或等于3％或小于或等于1％。
作为另一个实例，免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值可以是以下标准：1)30％至99％、40％至99％、50％至99％、55％至95％、60％至95％、60％至90％、50％至80％、50％至70％或50％至60％的表达活化剂配体但不表达抑制剂配体的靶细胞被杀死；和2)1％至40％、3％至40％、5％至40％、5％至30％、10％至30％、15％至30％或5％至20％的表达活化剂配体和抑制剂配体的靶细胞被杀死。
作为又一实例，免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值可以是例如以下标准：1)在不存在抑制性受体配体的情况下，在表达活化剂受体配体的免疫细胞和靶细胞的48小时共孵育后，至少50％的特异性杀伤；和2)对表达活化剂受体配体和抑制性受体配体的靶细胞的特异性杀伤小于或等于20％。作为另一个实例，免疫细胞能够在6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时或60小时的时间段内杀死至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的表达活化剂配体而不表达抑制剂配体的靶细胞，同时在同一时间段内杀死少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％、少于3％或少于1％的表达活化剂和抑制剂配体的靶细胞。
对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％至至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至多约50％、至多约55％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％或至多约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％。可以在免疫细胞与靶细胞共孵育约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时、约66小时或约72小时后测定免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值。
对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％至至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至多约50％、至多约55％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％或至多约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％。可以在免疫细胞与靶细胞共孵育约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时、约66小时或约72小时后测定免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值。
如本文所用，术语“功能变体”是指与亲本蛋白质相比具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失并且保留亲本蛋白质的一种或多种所需活性的蛋白质。功能性变体可以是保留亲本蛋白质的一种或多种所需活性的蛋白质片段(即具有N-和/或C-末端缺失的变体)。
本文提及的所有出版物和专利通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及不是并且不应被视为承认或任何形式的暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。
活化剂受体
本公开提供了第一受体，其包含对靶抗原特异性的第一细胞外配体结合结构域，该靶抗原包含癌细胞特异性抗原或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。第一受体是活化剂受体，并且在第一受体的细胞外配体结合结构域结合靶抗原时介导表达第一受体的免疫细胞的活化。第一受体对靶抗原(即活化剂配体)有应答。例如，当靶抗原与第一受体结合或接触时，第一受体在第一受体的细胞外配体结合结构域结合靶抗原时响应并活化表达第一受体的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，第一受体是T细胞受体(TCR)。
在一些实施例中，第一受体是人源化的。如本文所用，“人源化”是指用同源或功能等同的人序列替换分离自或衍生自非人物种的转基因中的序列或亚序列。例如，人源化抗体可以通过将小鼠CDR移植到人构架序列中，随后用某些人构架残基回代来自源抗体的相应小鼠残基来产生。
活化剂靶
在一些实施例中，第一受体的靶抗原是癌细胞特异性抗原。由靶癌细胞表达的任何细胞表面分子可以是第一受体配体结合结构域的合适的靶抗原。例如，细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、细胞外结构域、涉及趋化性的分子、糖蛋白、G蛋白偶联受体、跨膜、神经递质受体或电压门控离子通道可用作靶抗原。
在一些实施例中，靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。由靶癌细胞表达并由主要组织相容性复合物I类(MHC-I)在癌细胞表面作为肽抗原(pMHC)呈递的任何分子可以是第一受体细胞外配体结合结构域的合适的靶抗原。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。
主要组织相容性复合物I类(MHC-I)是向免疫系统细胞展示抗原、引发免疫应答的蛋白质复合物。对应于MHC-I的人白细胞抗原(HLA)是HLA-A、HLA-B和HLA-C。
包含HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G中任一种的癌细胞特异性pMHC抗原被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，癌细胞特异性抗原包含HLA-A。HLA-A受体是包含重α链和较小β链的异二聚体。α链由HLA-A的变体编码，而β链(β2-微球蛋白)是不变的。有几千个HLA-A基因变体，所有这些都落入本公开的范围内。在一些实施例中，MHC-I包含人白细胞抗原A*02等位基因(HLA-A*02)。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原包含HLA-B。HLA-B基因的数百种形式(等位基因)是已知的，其中每一种都被赋予特定的编号(如HLA-B27)。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原包含HLA-C。HLA-C属于HLA I类重链同种同源物。该I类分子是由重链和轻链(β-2微球蛋白)组成的异二聚体。本领域已知超过100种HLA-C等位基因。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是结肠直肠癌抗原。在一些实施例中，结肠直肠癌抗原包含CEA或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。CEA是由多种癌细胞表达的180-kDa糖蛋白肿瘤相关蛋白。CEA是由重复的免疫球蛋白结构域组成的GPI锚定的粘附分子。其用作结肠癌中的生物标记，既可作为诊断，也可作为治疗应答的替代物。表达CEA的癌症包括腺癌、结肠直肠癌和选择的其它上皮癌，包括结肠直肠腺癌。然而，CEA也在整个胃肠道的多种正常上皮细胞中表达，例如在结肠隐窝上三分之一的高度分化的上皮细胞中表达(参见图7中CEA的表达)。
CEA的所有同种型被设想为本公开的癌细胞特异性抗原。CEA同种型1描述于NCBI记录号NP_001278413.1中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，CEA包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，CEA包含与SEQ ID NO:1共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。CEA同种型2描述于NCBI记录号NP_001295327.1中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，CEA包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，CEA包含与SEQ ID NO:15共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是衍生自CEA的肽抗原。在一些实施例中，肽抗原包含与SEQ ID NO:1的亚序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，肽抗原包含与SEQID NO:1的亚序列相同的序列。示例性CEA肽抗原包括SEQ ID NO:1(IMIGVLVGV)的氨基酸691-699、SEQ ID NO:1(YLSGANLNL)的氨基酸605-613、和SEQ ID NO:1(GVLVGVALI)的氨基酸694-702。在一些实施例中，CEA肽抗原包含或基本上由SEQ ID NO:1(IMIGVLVGV)的氨基酸691-699组成。在一些实施例中，肽抗原包含与SEQ ID NO:15的亚序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，肽抗原包含与SEQ ID NO:15的亚序列相同的序列。在一些实施例中，CEA肽抗原与MHC-I复合。在一些实施例中，MHC-I包含人白细胞抗原A*02等位基因(HLA-A*02)。
细胞外配体结合结构域
本公开提供了第一受体，其包含对靶抗原特异性的第一细胞外配体结合结构域。在一些实施例中，靶抗原包含癌细胞特异性抗原。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是CEA或与MHC-I复合的CEA衍生的肽抗原，并且第一受体的配体结合结构域识别并结合CEA抗原。
可以以配体依赖性方式调节受体活性的任何类型的配体结合结构域被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，配体结合结构域是抗原结合结构域。示例性抗原结合结构域尤其包括scFv、SdAb、仅Vβ结构域以及衍生自TCRα和β链可变结构域的TCR抗原结合结构域。
任何类型的抗原结合结构域都设想在本公开的范围内。
例如，第一细胞外配体结合结构域可以是连续多肽链的一部分，包括例如仅Vβ结构域、单结构域抗体片段(sdAb)或重链抗体HCAb、衍生自鼠、人源化或人抗体的单链抗体(scFv)(Harlow等人，1999，载于：《使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:ALaboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约；Harlow等人，1989，载于：《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港，纽约；Houston等人，1988，《美国国家科学院院刊》85:5879-5883；Bird等人，1988，《科学(Science)》242:423-426)。在一些方面，第一细胞外配体结合结构域包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含抗体片段。在进一步的方面，第一细胞外配体结合结构域包含抗体片段，该抗体片段包含scFv或sdAb。
本文所用的术语“抗体”是指衍生自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，其特异性结合抗原。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白或其片段，并且可以衍生自天然或重组来源。
术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指抗体或其重组变体的至少一个部分，其含有抗原结合结构域，即完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶(如抗原及其定义的表位)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、单链(sc)Fv(“scFv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(缩写为“sdAb”)(VL或VH)、骆驼科VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单个多肽链，并且其中scFv保留其来源的完整抗体的特异性。
关于抗体的“重链可变区”或“VH”(或在单结构域抗体的情况下，例如，纳米抗体，则为“VHH”)是指重链的片段，其含有插入在称为构架区的侧翼伸展之间的三个CDR，这些构架区通常比CDR更高度保守并且形成支架以支持CDR。
除非另有说明，否则本文所用的scFv可以具有任一顺序的VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N-末端和C-末端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
在一些实施例中，活化剂和/或抑制性受体的抗原结合结构域包含scFv。在一些实施例中，scFv包含通过接头连接的VL和VH区。在一些实施例中，接头包含甘氨酸丝氨酸接头，例如GGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:146)。在一些实施例中，scFv进一步在scFv的N末端包含信号序列。示例性信号序列包括
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(SEQ ID NO:184)，其由
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO:185)编码。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中较小的一种。κ(“K”)和λ(“λ”)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应当解释为是指通过合成编码抗体的DNA分子而生成的抗体，并且该DNA分子表达抗体蛋白，或特定于该抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域可获得且熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得的。
术语“Vβ结构域”、“仅Vβ结构域”、“β链可变结构域”或“单可变结构域TCR(svd-TCR)”是指基本上由单个T细胞受体(TCR)β可变结构域组成的抗原结合结构域，该单个T细胞受体(TCR)β可变结构域在不存在第二TCR可变结构域的情况下特异性结合抗原。仅Vβ结构域使用互补决定区(CDR)接合抗原。每个仅Vβ结构域含有三个补体决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。可以组合额外元件，条件是Vβ结构域被配置以在不存在第二TCR可变结构域的情况下结合表位。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)或β链可变结构域(Vβ)。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
在一些实施例中，第一细胞外配体结合结构域包含结合CEA抗原的TCR配体结合结构域。在一些实施例中，CEA抗原与MHC-I复合，并且MHC-I包含HLA-A*02等位基因。结合并识别CEA MHC-I HLA-A*02抗原的示例性TCR抗原结合结构域描述于Parkhurst等人《分子治疗》2011 19(3)：P620-626，其内容通过引用并入本文。识别与HLA-A*02MHC-I复合的SEQ IDNO:1(IMIGVLVGV)的氨基酸691-699的示例性TCR细胞外配体结合结构域包含TRAV8-1*01和TRAJ6*01的TCRα结构域，以及TRBV26*01、TRBD1*01、TRBJ2-7*01和TRBC2的TCRβ结构域。
识别包含IMIGVLVGV(SEQ ID NO:2)的CEA MHC-I HLA-A*02抗原的示例性CDR如下表1所示。
表1.MHC-I HLA-A*02+CEA的CDR(IMIGVLVGV(SEQ ID NO:2))
在一些实施例中，第一细胞外配体结合结构域包含选自SEQ ID NO:3-12的补体决定区(CDR)或与其具有至少85％或至少95％同一性的序列。
在一些实施例中，第一受体的配体结合结构域包含TCR配体结合结构域。在一些实施例中，TCRα链可变结构域包含TSITA(SEQ ID NO:3)的CDR-1、IRSNER(SEQ ID NO:4)的CDR-2和包含ATDLTSGGNYK(SEQ ID NO:5)、ATDFTSGGNYK(SEQ ID NO:6)、ATDLTTGGNYK(SEQID NO:7)或ATDFTTGGNYK(SEQ ID NO:8)的CDR-3；并且TCRβ链可变结构域包含KGHPV(SEQID NO:9)的CDR-1、FQNQEV(SEQ ID NO:10)的CDR-2和ASSLGLGDYEQ(SEQ ID NO:11)或ASSLGTGDYEQ(SEQ ID NO:12)的CDR-3，或与其具有至少85％或至少95％同一性的序列。在一些实施例中，TCRα链可变结构域包含SEQ ID NO:9的CDR-1、SEQ ID NO:10的CDR-2和SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的CDR-3；并且TCRβ链可变结构域包含SEQ ID NO:3的CDR-1、SEQID NO:4的CDR-2和包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的CDR-3，或与其具有至少85％或至少95％同一性的序列。
包含来自表1的CDR的示例性TCRα和β链示于下表2中。CDR在表2的序列中加下划线。在表2中，TCRα和TCRβ链被P2A自切割肽(ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:186))和GSG接头分开。
表2.MHC-I HLA-A*02+CEA(IMIGVLVGV(SEQ ID NO:2))TCR序列
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在一些实施例中，第一受体包含与SEQ ID NO:16-31或36-51中任一个的序列或亚序列至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或至少99.5％相同的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:16-31或36-51中任一个的序列或亚序列。
在一些实施例中，第一受体包含TCRα链，该TCRα链包含或基本上由SEQ ID NO:16-31中任一个的氨基酸1-270，或与其至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或至少99.5％相同的序列组成。在一些实施例中，第一受体包含TCRα链，该TCRα链包含或基本上由SEQ ID NO:16-31中任一个的氨基酸1-270组成。
在一些实施例中，第一受体包含TCRβ链，该TCRβ链包含或基本上由SEQ ID NO:16-31中任一个的氨基酸293-598，或与其至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或至少99.5％相同的序列组成。在一些实施例中，第一受体包含TCRβ链，该TCRβ链包含或基本上由SEQ ID NO:16-31中任一个的氨基酸293-598组成。
在一些实施例中，第一受体包含TCRα链和TCRβ链，该TCRα链包含SEQ ID NO:16-31中任一个的氨基酸1-270，该TCRβ链包含SEQ ID NO:16-31中任一个的氨基酸293-598。
在一些实施例中，第一受体包含TCRα链，该TCRα链包含或基本上由SEQ ID NO:36-51中任一个的氨基酸1-268，或与其至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或至少99.5％相同的序列组成。在一些实施例中，第一受体包含TCRα链，该TCRα链包含或基本上由SEQ ID NO:36-51中任一个的氨基酸1-268组成。
在一些实施例中，第一受体包含TCRβ链，该TCRβ链包含或基本上由SEQ ID NO:36-51中任一个的氨基酸291-596，或与其至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或至少99.5％相同的序列组成。在一些实施例中，第一受体包含TCRβ链，该TCRβ链包含或基本上由SEQ ID NO:36-51中任一个的氨基酸291-596组成。
在一些实施例中，第一受体包含TCRα链和TCRβ链，该TCRα链包含SEQ ID NO:36-51中任一个的氨基酸1-268，该TCRβ链包含SEQ ID NO:36-51中任一个的氨基酸291-596。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域是scFv。在一些实施例中，scFv结构域结合CEA。在一些实施例中，scFv是CAR的配体结合结构域。包含CEA靶向scFv结构域的示例性CAR序列示于下表3中。在表3中，CDR序列加下划线。
表3.具有靶向CEA的scFv的示例性CAR
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在一些实施例中，CEA scFv包含EFGMN(SEQ ID NO:55)的CDR-H1、WINTKTGEATYVEEFKG(SEQ ID NO:56)的CDR-H2、WDFAYYVEAMDY(SEQ ID NO:57)或WDFAHYFQTMDY(SEQ ID NO:58)的CDR-H3、KASQNVGTNVA(SEQ ID NO:59)或KASAAVGTYVA(SEQID NO:60)的CDR-L1、SASYRYS(SEQ ID NO:61)或SASYRKR(SEQ ID NO:62)的CDR-L2和HQYYTYPLFT(SEQ ID NO:63)的CDR-L3或与其具有至少85％或至少95％同一性的序列。在一些实施例中，CEA scFv包含EFGMN(SEQ ID NO:55)的CDR-H1、WINTKTGEATYVEEFKG(SEQ IDNO:56)的CDR-H2、WDFAYYVEAMDY(SEQ ID NO:57)或WDFAHYFQTMDY(SEQ ID NO:58)的CDR-H3、KASQNVGTNVA(SEQ ID NO:59)或KASAAVGTYVA(SEQ ID NO:60)的CDR-L1、SASYRYS(SEQID NO:61)或SASYRKR(SEQ ID NO:62)的CDR-L2和HQYYTYPLFT(SEQ ID NO:63)的CDR-L3。在一些实施例中，CEA scFv包含EFGMN(SEQ ID NO:55)的CDR-H1、WINTKTGEATYVEEFKG(SEQ IDNO:56)的CDR-H2、WDFAYYVEAMDY(SEQ ID NO:57)的CDR-H3、KASQNVGTNVA(SEQ ID NO:59)的CDR-L1、SASYRYS(SEQ ID NO:61)的CDR-L2和HQYYTYPLFT(SEQ ID NO:63)的CDR-L3。在一些实施例中，CEA scFv包含EFGMN(SEQ ID NO:55)的CDR-H1、WINTKTGEATYVEEFKG(SEQ ID NO:56)的CDR-H2、WDFAYYVEAMDY(SEQ ID NO:57)的CDR-H3、KASAAVGTYVA(SEQ ID NO:60)的CDR-L1、SASYRKR(SEQ ID NO:62)的CDR-L2和HQYYTYPLFT(SEQ ID NO:63)的CDR-L3。在一些实施例中，CEA scFv包含EFGMN(SEQ ID NO:56)的CDR-H1、WINTKTGEATYVEEFKG(SEQ ID NO:56)的CDR-H2、WDFAHYFQTMDY(SEQ ID NO:58)的CDR-H3、KASAAVGTYVA(SEQ ID NO:60)的CDR-L1、SASYRKR(SEQ ID NO:62)的CDR-L2和HQYYTYPLFT(SEQ ID NO:63)的CDR-L3。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分和可变轻链(VL)部分，可变重链(VH)部分包含选自由SEQ ID NO:55-58组成的组的一组重链互补决定区(HC-CDR)，可变轻链(VL)部分包含选自由SEQ ID NO:59-63组成的组的一组轻链互补决定区；或相对于SEQ ID NO:55-58或SEQ ID NO:59-63具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分和可变轻链(VL)部分，可变重链(VH)部分包含一组包含SEQ ID NO:55-57的重链互补决定区(HC-CDR)，可变轻链(VL)部分包含一组包含SEQ ID NO:59、61和63的轻链互补决定区；或相对于SEQ ID NO:55-57或SEQ ID NO:59、61和63具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分和可变轻链(VL)部分，可变重链(VH)部分包含一组包含SEQ ID NO:55-57的重链互补决定区(HC-CDR)，可变轻链(VL)部分包含一组包含SEQ ID NO:59、61和63具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
识别CEA的示例性scFv示于下表4中。加下划线表示CDR序列。
表4.靶向CEA的示例性scFv
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在一些实施例中，CEA scFv包含选自由SEQ ID NO:64-70组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，CEA scFv包含或基本上由选自由SEQ ID NO:64-70组成的组的序列组成。其它示例性抗CEA抗体序列提供于Stewart等人《癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)》47:299-306(1999)；WO 1999/043817 A1；US 2002/0018750 A1；US 2011/0104148A1；US2016/0108131A1；US20160075795 A1；US 2019/0185583A1；US 2020/0123270A1；WO 2020/259550A1；WO 2021/053587A1；WO 2021/110647A1；为了提供抗CEA VH、VL、scFv和/或配体结合结构域序列，其内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，其包含SEQ ID NO:144或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列；以及可变轻链(VL)部分，其包含SEQ ID NO:148或与其具有85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，其包含SEQ ID NO:144；以及可变轻链(VL)部分，其包含SEQID NO:148。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域进一步包含VH和VL部分之间的接头。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:66-70组成的组的序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:68的scFv序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:68的scFv序列。
在一些实施例中，本文提供的抗原结合结构域的CDR中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)氨基酸残基被另一个氨基酸取代。在同一氨基酸家族内的取代的意义上，该取代可以是“保守的”。天然存在的氨基酸可以分为以下四个家族，并且保守取代将在这些家族内发生：(1)具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(2)具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；(3)具有不带电荷的极性侧链的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；和(4)具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。通过添加、缺失或取代氨基酸来改变抗体的CDR的氨基酸序列，可以获得各种效果，例如增加对靶抗原的结合亲和力。
嵌合抗原受体(CAR)
本公开提供了第一活化剂受体和包含其的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体。
本文所用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”可以指衍生自T细胞受体的人工受体，并且包括将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程化受体。CAR可以用于赋予单克隆抗体对T细胞的特异性，从而允许生成大量的特异性T细胞，例如用于过继性细胞疗法。在具体的实施例中，CAR指导细胞对例如肿瘤相关抗原的特异性。示例性CAR包含细胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在一些实施例中，CAR进一步包含铰链结构域。在特定方面，CAR包含衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合体，其融合到CD3跨膜结构域和胞内结构域。其它CAR设计的特异性可以衍生自受体的配体(例如，肽)。在某些情况下，CAR包含用于额外共刺激信号传导的结构域，例如CD3、4-1BB、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些情况下，分子可以与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像的报告基因、在添加前药后有条件地消融T细胞的基因产物、归巢受体、细胞因子和细胞因子受体。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域融合到CAR的细胞外结构域。
在一些实施例中，本公开的CAR包含细胞外铰链区。铰链区的掺入可能影响CAR-T细胞的细胞因子产生并改善CAR-T细胞的体内扩增。示例性的铰链可以分离自或衍生自IgD和CD8结构域，例如IgG1。在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。
在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。在一些实施例中，CD8α铰链包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:71)。在一些实施例中，CD8α铰链包含SEQ ID NO:71。在一些实施例中，CD8α铰链基本上由SEQ ID NO:71组成。在一些实施例中，CD8α铰链由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT(SEQ IDNO:72)。在一些实施例中，CD8α铰链由SEQ ID NO:72编码。
在一些实施例中，CD8α铰链由与SEQ ID NO:156的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CD8α由SEQ ID NO:156编码。
在一些实施例中，CD28铰链包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:73)。在一些实施例中，CD28铰链包含或基本上由SEQID NO:73组成。在一些实施例中，CD28铰链由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
TGTACCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，CD28铰链由SEQ ID NO:74编码。
本公开的CAR可以被设计成包含与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些实施例中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。例如，包含CD28共刺激结构域的CAR也可以使用CD28跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。当来源是天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区可以分离自或衍生自(即至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或免疫球蛋白(如IgG4)。替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个端发现。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选地长度为2至10个氨基酸，可以在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在本公开的CAR的一些实施例中，CAR包含CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:75)。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:75组成。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
TTCTGGGTGCTGGTCGTTGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG(SEQ ID NO:76)。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由SEQ ID NO:76编码。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由与SEQ ID NO:157的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由SEQ ID NO:157编码。
在本公开的CAR的一些实施例中，CAR包含IL-2Rβ跨膜结构域。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI(SEQ ID NO:77)。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:77组成。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：ATTCCGTGGC TCGGCCACCTCCTCGTGGGC CTCAGCGGGG CTTTTGGCTT CATCATCTTA GTGTACTTGC TGATC(SEQ ID NO:78)。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域由SEQ ID NO:78编码。
本公开的CAR的细胞质结构域或其它细胞内信号传导结构域负责活化其中放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特定功能。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整链。在一些情况下，可以组合多个细胞内结构域以实现本公开的CAR-T细胞的期望功能。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的一个或多个细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本公开的CAR中的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列，其在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
因此，本公开的CAR的细胞内结构域包含至少一个细胞质活化结构域。在一些实施例中，细胞内活化结构域确保存在活化CAR T细胞的效应子功能所必需的T细胞受体(TCR)信号传导。在一些实施例中，至少一种细胞质活化是CD247分子(CD3ζ)活化结构域、刺激性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)KIR2DS2活化结构域，或12kDa的DNAX-活化蛋白(DAP12)活化结构域。
在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:79)。
在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含或基本上由SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGCGTAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGACTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:80)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由SEQ ID NO:80编码。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由与SEQ ID NO:163的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由SEQ ID NO:163编码。
已知单独通过TCR生成的信号通常不足以完全活化T细胞，也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的序列(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的序列(次级细胞质信号传导序列)。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。在一些实施例中，ITAM含有通过任何两个其它氨基酸(YxxL/I(SEQ ID NO:983)与亮氨酸或异亮氨酸分开的酪氨酸。在一些实施例中，细胞质结构域含有1、2、3、4或5个ITAM。含有细胞质结构域的示例性ITAM是CD3ζ活化结构域。可用于本公开的CAR中的含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的其它实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(SEQ ID NO:81)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含SEQ ID NO:81。在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域基本上由氨基酸序列
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(SEQ ID NO:81)组成。
在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGACGCC CCCGCGTACC AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGCTCAATCTAGG ACGAAGAGAG GAGTACGATG TTTTGCACAT GCAGGCCCTG CCCCCTCGC(SEQ ID NO:82)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由SEQ ID NO:82编码。
在一些实施例中，CAR的细胞质结构域可以被设计为包含CD3ζ信号传导结构域本身或与在本公开的CAR的上下文中有用的任何其它期望的细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激结构域。共刺激结构域是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。此类分子的实例包括共刺激结构域，其选自由以下组成的组：IL-2Rβ、Fc受体γ(FcRγ)、Fc受体β(FcRβ)、CD3g分子γ(CD3γ)、CD3δ、CD3ε、CD5分子(CD5)、CD22分子(CD22)、CD79a分子(CD79a)、CD79b分子(CD79b)、癌胚抗原相关细胞粘附分子3(CD66d)、CD27分子(CD27)、CD28分子(CD28)、TNF受体超家族成员9(4-1BB)、TNF受体超家族成员4(OX40)、TNF受体超家族成员8(CD30)、CD40分子(CD40)、程序性细胞死亡1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2分子(CD2)、CD7分子(CD7)、TNF超家族成员14(LIGHT)、杀伤细胞凝集素样受体C2(NKG2C)和CD276分子(B7-H3)c-刺激结构域，或其功能变体。在一些实施例中，本公开的CAR的细胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域分离自或衍生自CD28。
在一些实施例中，本公开的CAR的细胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域分离自或衍生自CD28。在一些实施例中，CD28共刺激结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:83)。在一些实施例中，CD28共刺激结构域包含或基本上由SEQ ID NO:83)组成。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
AGGAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGAGGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCTCCCAGGGATTTCGCCGCCTACCGGAGC(SEQ ID NO:84)。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由SEQ ID NO:84编码。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由与SEQ ID NO:160的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由SEQ IDNO:160编码。
在一些实施例中，共刺激结构域分离自或衍生自4-1BB。在一些实施例中，4-1BB共刺激结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:161)。在一些实施例中，4-1BB共刺激结构域包含或基本上由
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:161)组成。在一些实施例中，4-1BB共刺激结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGGCCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:162)。
在一些实施例中，CAR的细胞内结构域包含CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ活化结构域。在一些实施例中，CAR的细胞内结构域包含以下序列：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:158)，或与其具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性的序列。在一些实施例中，CAR的细胞内结构域由SEQ ID NO:159，或与其具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性的序列编码。在一些实施例中，CAR的细胞内结构域由SEQ ID NO:159编码。
本公开的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适接头的实例。示例性接头包含序列GGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:146)。
本公开的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适接头的实例。
T细胞受体(TCR)
本公开提供了第一活化剂受体和包含其的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是T细胞受体(TCR)。
用于本公开的包含细胞内结构域的示例性TCR描述于2020年9月6日提交的PCT/US2020/045250中，其内容通过引用并入本文。
如本文所用，“TCR”(有时也称为“TCR复合物”或“TCR/CD3复合物”)是指包含TCRα链、TCRβ链和一种或多种不变CD3链(ζ、γ、δ和ε)(有时称为亚基)的蛋白质复合物。TCRα和β链可以是二硫键连接的，以作为异二聚体结合肽-MHC复合物。一旦TCRα/β异二聚体与肽-MHC结合，相关不变CD3亚基中TCR复合物的构象变化被诱导，这导致它们磷酸化并与下游蛋白质缔合，从而转导初级刺激信号。在示例性的TCR复合物中，TCRα和TCRβ多肽形成异二聚体，CD3ε和CD3δ形成异二聚体，CD3ε和CD3γ形成异二聚体，两个CD3ζ形成同二聚体。
任何合适的配体结合结构域可以融合到本文所述TCR的细胞外结构域、铰链结构域或跨膜。例如，配体结合结构域可以是抗体或TCR的抗原结合结构域，或包含抗体片段、仅Vβ结构域、线性抗体、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施例中，配体结合结构域融合到一个或多个TCR亚基的一个或多个细胞外结构域或跨膜结构域。TCR亚基可以是TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ或CD3ζ。例如，配体结合结构域可以融合到TCRα或TCRβ，或者配体结合的部分可以融合到两个亚基，例如配体结合结构域的部分可以融合到TCRα和TCRβ两者。
TCR亚基包括TCRα、TCRβ、CD3ζ、CD3δ、CD3γ和CD3ε。TCRα、TCRβ链、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ或其片段或衍生物中的任一种或多种可以融合到能够提供本公开的刺激信号的一个或多个结构域，从而增强TCR功能和活性。
从任何来源分离或衍生的TCR跨膜结构域被设想在本公开的范围内。跨膜结构域可以衍生自天然或重组来源。当来源是天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。
在一些实施例中，每当TCR复合物已经与靶结合时，跨膜结构域能够向细胞内结构域发送信号。具体使用的跨膜结构域可至少包括例如TCR的α、β或ζ链、CD3δ、CD3ε或CD3γ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜区。
在一些实施例中，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附着于TCR多肽的细胞外区，例如TCRα或β链的抗原结合结构域。例如，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链或CD8a铰链。在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。
在一些实施例中，细胞外配体结合结构域附着于TCR的一个或多个跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRα跨膜结构域、TCRβ跨膜结构域或两者。在一些实施例中，跨膜包含CD3ζ跨膜结构域。
跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个额外的氨基酸，例如，与衍生跨膜的蛋白质的细胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多15个氨基酸)和/或与衍生跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区相关的一个或多个额外的氨基酸(例如，细胞内区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多15个氨基酸)。
在一些实施例中，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
当存在时，跨膜结构域可以是天然TCR跨膜结构域、来自异源膜蛋白的天然跨膜结构域或人工跨膜结构域。跨膜结构域可以是膜锚定结构域。在没有限制的情况下，天然或人工跨膜结构域可以包含约20个氨基酸的疏水α-螺旋，通常在跨膜区段侧翼带有正电荷。跨膜结构域可以具有一个跨膜区段或多于一个跨膜区段。跨膜结构域/区段的预测可以使用公众可获得的预测工具(例如TMHMM，Krogh等人《分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)》2001；305(3):567-580；或TMpred，Hofmann和Stoffel《霍佩赛勒生物化学(Biol.Chem.Hoppe-Seyler)》1993；347:166)。膜锚定系统的非限制性实例包括血小板衍生生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚(翻译后添加到信号序列)等。
在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRα跨膜结构域。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW(SEQ ID NO:85)。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:85组成。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域由以下序列编码：
GTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGG(SEQ ID NO:86)。
在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRβ跨膜结构域。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO:87)。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:87组成。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域由以下序列编码：
ACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTG(SEQ ID NO:88)。
本公开的TCR可以包含一个或多个细胞内结构域。在一些实施例中，细胞内结构域包含一个或多个能够向跨膜结构域提供刺激信号的结构域。在一些实施例中，细胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一细胞内结构域和能够提供刺激信号的第二细胞内结构域。在其它实施例中，细胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一、第二和第三细胞内结构域。能够提供刺激信号的细胞内结构域选自由以下组成的组：CD28分子(CD28)结构域、LCK原癌基因、Src家族酪氨酸激酶(Lck)结构域、TNF受体超家族成员9(4-1BB)结构域、TNF受体超家族成员18(GITR)结构域、CD4分子(CD4)结构域、CD8a分子(CD8a)结构域、FYN原癌基因、Src家族酪氨酸激酶(Fyn)结构域、T细胞受体相关蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)结构域、用于活化T细胞的接头(LAT)结构域、淋巴细胞胞质蛋白2(SLP76)结构域、(TCR)α、TCRβ、CD3δ、CD3γ和CD3ε细胞内结构域。
在一些实施例中，细胞内结构域包含至少一个细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域生成促进细胞功能的信号，例如含有TCR的细胞(例如，表达TCR的T细胞)的免疫效应子功能。在一些实施例中，本公开的第一受体的细胞内结构域包括至少一个细胞内信号传导结构域。例如，CD3γ、δ或ε的细胞内结构域包含信号传导结构域。
在一些实施例中，细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域分离自或衍生自相同的蛋白质，例如T细胞受体(TCR)α、TCRβ、CD3δ、CD3γ、CD3ε或CD3ζ。
用于本公开的活化剂受体中的细胞内结构域的实例包括TCRα、TCRβ、CD3ζ和4-1BB的细胞质序列，以及在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导的细胞内信号传导共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域。示例性的初级细胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的蛋白质的结构域。
在一些实施例中，细胞内结构域包含CD3δ细胞内结构域、CD3ε细胞内结构域、CD3γ细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域、TCRα细胞内结构域或TCRβ细胞内结构域。
在一些实施例中，细胞内结构域包含TCRα细胞内结构域。在一些实施例中，TCRα细胞内结构域包含Ser-Ser。在一些实施例中，TCRα细胞内结构域由TCCAGC序列编码。
在一些实施例中，细胞内结构域包含TCRβ细胞内结构域。在一些实施例中，TCRβ细胞内结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性或与其相同的氨基酸序列：MAMVKRKDSR(SEQ ID NO:89)。在一些实施例中，TCRβ细胞内结构域包含或基本上由SEQID NO:89组成。在一些实施例中，TCRβ细胞内结构域由以下序列编码：
ATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGA(SEQ ID NO:90)。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含至少一个刺激性细胞内结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(如CD3δ、CD3γ和CD3ε细胞内结构域)和一个额外的刺激性细胞内结构域(如共刺激结构域)。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(如CD3δ、CD3γ和CD3ε细胞内结构域)和两个额外的刺激性细胞内结构域。
示例性的共刺激细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的蛋白质的结构域。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体，以及DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)4-1BB(CD137、TNF受体超家族成员9)和CD28分子(CD28)。共刺激蛋白可以由以下蛋白质家族表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化NK细胞受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、特异性结合CD83、CD4的配体等。共刺激结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分，或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能变体。
在一些实施例中，刺激结构域包含共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域包含CD28或4-1BB共刺激结构域。CD28和4-1BB是完全T细胞活化所需的且已知增强T细胞效应子功能的充分表征的共刺激分子。例如，CD28和4-1BB已经在嵌合抗原受体(CAR)中用于促进细胞因子释放、细胞溶解功能和持久性，优于仅含有CD3ζ信号传导结构域的第一代CAR。同样地，在TCR中包括共刺激结构域，例如CD28和4-1BB结构域，可以增加T细胞效应子功能，并在不存在共刺激配体的情况下特异性地允许共刺激，共刺激配体通常在肿瘤细胞表面上下调。在一些实施例中，刺激结构域包含CD28细胞内结构域或4-1BB细胞内结构域。
抑制性受体
本公开提供了第二受体，其包含对已经在癌细胞中丢失的非靶抗原(如基因的等位基因变体)特异性的细胞外配体结合结构域。非靶等位基因变体可以通过任何机制在癌细胞中丢失，例如但不限于影响非靶等位基因变体表达的表观遗传变化、编码非靶等位基因变体的基因的突变、调节非靶等位基因变体表达的细胞信号传导的破坏、染色体丢失、基因组基因座的部分或完全缺失、通过修饰核酸或异染色质的基因沉默，或通过其它机制的表达丢失。在本文公开的组合物和方法的变化形式中，治疗的细胞或受试者可能由于非遗传改变而表现出非靶等位基因变体的表达丢失。因此，本公开提供了用于杀死细胞和/或治疗因任何原因(包括但不限于杂合性丢失)而缺乏非靶抗原表达的受试者的组合物和方法。
非靶抗原可以是蛋白质或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽，其中非靶抗原包含多态性。因为非靶抗原是多态性的，所以编码非靶抗原的基因的单个拷贝的丢失(其可能通过癌细胞中杂合性的丢失而发生)产生保留基因的其它多态性变体但已经丢失了非靶抗原的癌细胞。例如，在HLA基因座具有HLA-A*02和HLA-A*01等位基因的受试者可能患有仅缺失HLA-A*02等位基因的癌症。在这样的受试者中，HLA-A*01蛋白仍然存在，但不被遇到癌细胞的免疫细胞的抑制性受体识别，因为抑制剂受体被设计成对HLA-A*02(或其它非靶抗原)特异性。在正常的非恶性细胞中，存在HLA-A*02(或其它非靶抗原)并抑制工程化免疫细胞的活化。在杂合性丢失的癌细胞中，HLA-A*02等位基因变体(或其它非靶抗原)丢失。被工程化以表达抑制性受体的免疫细胞不接收来自抑制性受体的抑制性信号，因为抑制性受体仅对癌细胞上不存在的HLA-A*02(或其它非靶抗原)有应答。通过这种机制，免疫细胞被选择性地活化，并选择性地杀死表达CEA但由于杂合性丢失而丢失HLA-A*02(或另一种非靶抗原)的癌细胞。这里使用HLA-A作为实例。群体中其它MHC基因和其它非MHC基因也发生类似的多态性变异。因此，本公开提供了第二受体，其包含对选自TNFRSF11A、ACHRB、ITGAE、TRPV1和SREC或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中非靶抗原包含多态性，以及包含第二受体的免疫细胞。
在一些实施例中，第二受体是抑制性嵌合抗原受体(抑制性受体)。
在一些实施例中，第二受体是抑制性受体。在一些实施例中，第二受体是人源化的。
在一些实施例中，第二受体包含SEQ ID NO:164，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，174或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
本公开提供了第二受体，其为抑制性受体，包含能够区分非靶抗原的单个氨基酸变体等位基因的细胞外配体结合。这种区分非靶抗原的等位基因变体的能力允许第二受体在表达由配体结合结构域识别的等位基因的非靶细胞存在下抑制包含第二受体的免疫细胞的活化。然而，在丢失等位基因的靶细胞(例如通过杂合性丢失而丢失基因的一个等位基因的癌细胞)的存在下，不抑制免疫细胞的活化。
本公开提供了第二受体，其为抑制性受体，包含能够区分非靶抗原的不同表达水平的细胞外配体结合。这允许第二受体在表达第二受体配体的非靶细胞存在下抑制包含第二受体的免疫细胞的活化，但允许免疫细胞在表达低水平或不表达第二受体配体的癌细胞存在下活化。
抑制剂配体
在一些实施例中，非靶抗原不由靶细胞表达，而由非靶细胞表达。在一些实施例中，非靶抗原由健康细胞，即不是癌细胞的细胞表达。在一些实施例中，靶细胞是通过杂合性丢失(LOH)而丢失非靶抗原表达的多种癌细胞。在一些实施例中，非靶细胞是表达靶抗原和非靶抗原两者的多个健康细胞(即非癌、正常或健康细胞)。
非靶细胞表达但靶细胞不表达的任何细胞表面分子可以是第二受体细胞外配体结合结构域的合适的非靶抗原。例如，细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、细胞外结构域、涉及趋化性的分子、糖蛋白、G蛋白偶联受体、跨膜、神经递质受体或电压门控离子通道可用作非靶抗原。
在一些实施例中，非靶抗原选自由TNFRSF11A、ACHRB、ITGAE、TRPV1和SREC的多态性变体组成的组。在一些实施例中，非靶抗原是包含与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的TNFRSF11A、ACHRB、ITGAE、TRPV1或SREC的多态性残基的抗原肽。
在一些实施例中，靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。
包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E中的任一种的非靶MHC-1(pMHC)抗原被设想在本公开的范围内。
在一些实施例中，非靶抗原包含主要组织相容性复合物(MHC)蛋白。在一些实施例中，MHC是MHC I类。在一些实施例中，MHC I类蛋白包含人白细胞抗原(HLA)蛋白。在一些实施例中，非靶抗原包含选自由HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E组成的组的HLA I类蛋白的等位基因。在一些实施例中，HLA-A等位基因包含HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03或HLA-A*11。在一些实施例中，HLA-B等位基因包含HLA-B*07。在一些实施例中，HLA-C等位基因包含HLA-C*07。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A的等位基因。在一些实施例中，HLA-A的等位基因包含HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03或HLA-A*11。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*69。
在一些实施例中，非靶抗原包含等位基因HLA-B。在一些实施例中，HLA-B的等位基因包含HLA-B*11。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C的等位基因。在一些实施例中，HLA-C等位基因包含HLA-C*07。
在一些实施例中，非靶抗原选自由TNFRSF11A、ACHRB、ITGAE、TRPV1和SREC组成的组。CEA和TNFRSF11A(RANK)在T细胞中低/不存在，因此避免了其它配体的顺式攻击。TNFRSF11A基因座的LOH频率极高(直肠癌中约90％)。
在一些实施例中，非靶抗原包含TNFRSF11A或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人TNFRSF11A位于Chr18q:35,237,593-37,208,541并且在结肠直肠癌细胞中经常通过LOH丢失。
野生型人TNFRSF11A同种型1描述于NCBI记录号NP_003830.1中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，TNFRSF11A包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，TNFRSF11A包含与SEQ ID NO:13共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。TNFRSF11A的多态性残基在SEQ ID NO:13中标记为粗体和下划线。
在一些实施例中，非靶抗原包含TNFRSF11A的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自TNFRSF11A的肽，其包含TNFRSF11A的多态性残基。TNFRSF11A的多态性残基包括SEQ ID NO:13的氨基酸残基141和192。在一些实施例中，非靶抗原包含TNFRSF11A的肽，其包含SEQ IDNO:13的氨基酸141(rs35211496，H141Y)或192(rs1805034，V192A)。
在一些实施例中，TNFRSF11A的多态性包含TNFRSF11A的H141/A192V等位基因。在一些实施例中，TNFRSF11A的多态性包含以下序列：
在一些实施例中，TNFRSF11A的多态性包含TNFRSF11A的H141Y/A192等位基因。在一些实施例中，TNFRSF11A的多态性包含以下序列：
在一些实施例中，TNFRSF11A的多态性包含TNFRSF11A的H141Y/A192V等位基因。在一些实施例中，TNFRSF11A的多态性包含以下序列：
在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:13的第192位处具有A的TNFRSF11A多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:13的第192位具有A的TNFRSF11A配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:13的第192位处具有V的TNFRSF11A配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:13的第192位处具有V的TNFRSF11A多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:13的第192位处具有V的TNFRSF11A配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:13的第192处具有A的TNFRSF11A配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:13的第141位处具有H的TNFRSF11A多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:13的第141位处具有H的TNFRSF11A配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:13的第141位处具有Y的TNFRSF11A配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:13的第141位处具有Y的TNFRSF11A多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:13的第141位处具有Y的TNFRSF11A配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:13的第141位处具有H的TNFRSF11A配体的亲和力。
小鼠TNFRSF11A同种型1描述于NCBI记录号AH19185.1中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，TNFRSF11A包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，TNFRSF11A包含与SEQ ID NO:32共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。TNFRSF11A的多态性残基在SEQ ID NO:32中标记为粗体和下划线。
在一些实施例中，非靶抗原包含TNFRSF11A的多态性。TNFRSF11A的多态性残基包括SEQ ID NO:32的142和193。在一些实施例中，非靶抗原包含TNFRSF11A的肽，其包含SEQID NO:32的氨基酸142或193。
在一些实施例中，非靶抗原包含整联蛋白α-e(ITGAE)或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。ITGAE在细胞外结构域中包含两种多态性：具有0.2654的次要等位基因频率(MAF)的R950W(rs1716)和具有0.282的MAF的V1019A/V1019G(rs2976230)。
人ITGAE(R950/V10109)描述于NCBI记录号NP_002199.3中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，ITGAE包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，ITGAE包含与SEQ ID NO:14共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。ITGAE的多态性残基在SEQ ID NO:14中标记为粗体和下划线。
在一些实施例中，ITGAE的多态性包含ITGAE的R950W/V1019等位基因。在一些实施例中，ITGAE的多态性包含以下序列：
(多态性氨基酸粗体并加下划线)(SEQ ID NO:232)。
在一些实施例中，ITGAE的多态性包含ITGAE的R950/V1019A等位基因。在一些实施例中，ITGAE的多态性包含以下序列：
/>
(多态性氨基酸粗体并加下划线)(SEQ ID NO:233)。
在一些实施例中，ITGAE的多态性包含ITGAE的R950/V1019G等位基因。在一些实施例中，ITGAE的多态性包含以下序列：
(多态性氨基酸粗体并加下划线)(SEQ ID NO:234)。
在一些实施例中，ITGAE的多态性包含ITGAE的R950W/V1019等位基因。在一些实施例中，ITGAE的多态性包含以下序列：
/>
(多态性氨基酸粗体并加下划线)(SEQ ID NO:235)。
在一些实施例中，ITGAE的多态性包含ITGAE的R950W/V1019A等位基因。在一些实施例中，ITGAE的多态性包含以下序列：
(多态性氨基酸粗体并加下划线)(SEQ ID NO:236)。
在一些实施例中，ITGAE的多态性包含ITGAE的R950W/V1019G等位基因。在一些实施例中，ITGAE的多态性包含以下序列：
/>
(多态性氨基酸粗体并加下划线)(SEQ ID NO:237)。
在一些实施例中，非靶抗原包含ITGAE的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自ITGAE的肽，其包含ITGAE的多态性残基。ITGAE的多态性残基包括SEQ ID NO:14的氨基酸950和1019。在一些实施例中，非靶抗原包含ITGAE的肽，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸950或1019。
在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:14的第950位处具有R的ITGAE多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:14的第950位处具有R的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:14的第950位处具有W的ITGAE配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:14的第950位处具有W的ITGAE多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:14的第950位处具有W的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:14的第950处具有R的ITGAE配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:14的第1019位处具有V的ITGAE多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有V的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有A或G的ITGAE配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:14的第1019位处具有A的ITGAE多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ IDNO:14的第1019位处具有A的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有V或G的ITGAE配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:14的第1019位处具有G的ITGAE多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有G的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有V或A的ITGAE配体的亲和力。
在一些实施例中，非靶抗原包含ACHRB(也称为CHRNB或CHRNB1)或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人ACHRB描述于NCBI记录号NP_000738.2中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，ACHRB包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，ACHRB包含与SEQ ID NO:33共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。ACHRB的多态性残基在SEQ ID NO:33中标记为粗体和下划线。
在一些实施例中，非靶抗原包含ACHRB的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自ACHRB的肽，其包含ACHRB的多态性残基。ACHRB的多态性残基包括SEQ ID NO:33的32。在一些实施例中，非靶抗原包含ACHRB的肽，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸32。在一些实施例中，非靶抗原包含ACHRB的肽，其在SEQ ID NO:33的氨基酸32处包含E。在一些实施例中，非靶抗原包含ACHRB的肽，其在SEQ ID NO:33的氨基酸32处包含G。
在一些实施例中，非靶抗原包含TRPV1或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人TRPV1描述于NCBI记录号NP_542435.2中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，TRPV1包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，TRPV1包含与SEQ ID NO:34共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少94％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。TRPV1的多态性残基在SEQ ID NO:34中标记为粗体和下划线。
在一些实施例中，非靶抗原包含TRPV1的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自TRPV1的肽，其包含TRPV1的多态性残基。TRPV1的多态性残基包括SEQ ID NO:34的第585、459和469位。在一些实施例中，非靶抗原包含TRPV1的肽，其包含SEQ IDNO:34的氨基酸585、459或469。在一些实施例中，非靶抗原包含TRPV1的肽，其在SEQ ID NO:34的氨基酸585处包含I。在一些实施例中，非靶抗原包含TRPV1的肽，其在SEQ ID NO:34的氨基酸585处包含V。
在一些实施例中，非靶抗原包含SREC或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人SREC同种型1描述于NCBI记录号NP_003684.2中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，SREC包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，SREC包含与SEQ ID NO:35共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少94％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。SREC的多态性残基在SEQ ID NO:35中标记为粗体和下划线。
在一些实施例中，非靶抗原包含SREC的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自SREC的肽，其包含SREC的多态性残基。SREC的多态性残基包括SEQ ID NO:35的第339和425位。在一些实施例中，非靶抗原包含SREC的肽，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸339或425。在一些实施例中，非靶抗原包含SREC的肽，其在SEQ ID NO:35的氨基酸425处包含A。在一些实施例中，非靶抗原包含SREC的肽，其在SEQ ID NO:35的氨基酸425处包含V。
在一些实施例中，非靶抗原包含C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人CXCL16前体描述于NCBI记录号NP_001094282.1，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，CXCL16包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自CXCL16的肽，其包含CXCL16的多态性残基。CXCL16的多态性残基包括SEQ ID NO:136的第142和200位。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其包含SEQ ID NO:136的氨基酸142或200。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:136的氨基酸200处包含A。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:136的氨基酸200处包含V。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:136的氨基酸142处包含I。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:136的氨基酸142处包含T。
在一些实施例中，非靶抗原包含集合素亚家族成员12(COLEC12)或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人COLEC12描述于NCBI记录号NP_569057.2中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，COLEC12包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，COLEC12包含与SEQ ID NO:137共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少94％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。COLEC12的多态性残基在SEQ ID NO:137中标记为粗体和下划线。
在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自COLEC12的肽，其包含COLEC12的多态性残基。COLEC12的多态性残基包括SEQ ID NO:137的第522位。在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的肽，其包含SEQ ID NO:137的氨基酸522。在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的肽，其在SEQ ID NO:137的氨基酸522处包含S。在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的肽，其在SEQ ID NO:137的氨基酸522处包含P。
在一些实施例中，非靶抗原包含APC下调1(APCDD1)或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。示例性的人APCDD1描述于UniProtKB记录号Q8J025中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，APCDD1包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的多态性。APCDD1的示例性多态性包括rs3748415，其可以是SEQ ID NO:138的第150位处的V、I或L。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其包含SEQ ID NO:138的氨基酸150。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:138的氨基酸150处包含V。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:138的氨基酸150处包含I。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:138的氨基酸150处包含L。
另一示例性的人APCDD1描述于UniProtKB记录号V9GY82中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，APCDD1包含以下氨基酸序列：
APCDD1的示例性多态性包括rs1786683，其可以是SEQ ID NO:139的第165位处的Y或S。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其包含SEQ ID NO:139的氨基酸165。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:139的氨基酸165处包含Y。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:139的氨基酸165处包含S。
另一示例性的人APCDD1描述于UniProt记录号J3QSE3中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，APCDD1包含以下氨基酸序列：
APCDD1的示例性多态性包括rs9952598，其可以是SEQ ID NO:140的第28位处的Q或R。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其包含SEQ ID NO:140的氨基酸28。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:140的氨基酸28处包含Q。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:140的氨基酸28处包含R。
在一些实施例中，APCDD1包含与SEQ ID NO:138-140中的任一个共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少94％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。APCDD1的多态性残基在SEQ ID NO:138-140中标记为粗体和下划线。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。用于本文所述实施例的结合或识别特定HLA等位基因的各种单可变结构域描述于表5中。此类scFv包括，例如但不限于，以下小鼠和人源化scFv抗体，其以非肽依赖性方式结合HLA等位基因，如下表5所示(下划线为互补决定区)：
表5.HLA scFv结合结构域
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在一些实施例中，第二抑制性受体的配体结合结构域包含scFv。在一些实施例中，scFv结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*3、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07，并且包含选自SEQID NO:91-102、250-260、262、264、266、268、270、272、274、276和278-345的序列，或表5中所示的序列组，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，scFv结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*3、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07，并且包含选自表5中所示序列组的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含HLA-A*01scFv序列，其包含SEQ IDNO:337-345，如表5所示，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含HLA-A*02scFv序列，其包含SEQ ID NO:91-102，如表5所示，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*03，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含HLA-A*03scFv序列，其包含SEQ ID NO:323-336，如表5所示，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含HLA-A*11scFv序列，其包含SEQ ID NO:260、262、264、266、268、270、272、274或276，如表5所示，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B*07，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含HLA-B*07scFv序列，其包含SEQ ID NO:250-259，如表5所示，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C*07，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含HLA-C*07scFv序列，其包含SEQ IDNO:278-322，如表5所示，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07和HLA-C*07配体结合结构域的示例性重链和轻链CDR(分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)示于下表6中。
表6.对应于HLA抗原结合结构域的CDR
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在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A。在一些实施例中，第二抑制性受体的配体结合结构域包含HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03或HLA-A*11配体结合结构域，其包含表6中所示的CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B。在一些实施例中，第二抑制性受体的配体结合结构域包含HLA-B*07配体结合结构域，其包含表6中所示的CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C。在一些实施例中，第二抑制性受体的配体结合结构域包含HLA-C*07配体结合结构域，其包含表6中所示的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A、HLA-B或HLA-C蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*01互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-A*01CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*02。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*02互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-A*02CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:103-108或SEQ ID NO:109-114的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于SEQ ID NO:103-108或SEQ ID NO:109-114的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*03。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*03互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-A*03CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*11。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*11互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-A*11CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-B*07。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-B*07互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-B*07CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-C*07。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-C*07互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-C*07CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在任何配体结合结构域的进一步实施例中，每个CDR序列可以具有1、2、3或更多个取代、插入或缺失。CDR序列可以容许取代、缺失或插入。使用序列比对工具、常规实验和已知测定，本领域技术人员可以生成和测试在CDR序列中具有1、2、3或更多个取代、插入或缺失的变体序列，而无需过度实验。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*02配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*02的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*02。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含SEQ ID NO:91-102中任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含与SEQ ID NO:91-102中任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。
在一些实施例中，HLA-A*02scFv包含SEQ ID NO:103-114中任一个的互补性决定区(CDR)。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:103-114中任一个至少95％相同的序列。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:103-114中任一个相同的序列。在一些实施例中，抗原结合结构域的重链包含SEQ ID NO:103-114中任一个的重链CDR，并且其中抗原结合结构域的轻链包含SEQ ID NO:103-114中任一个的轻链CDR。在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含重链和轻链，并且重链包含选自SEQ ID NO:106-108和112-14的CDR，并且轻链包含选自SEQ ID NO:103-15和109-111的CDR。
在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含重链和轻链，并且重链包含与SEQID NO:91-102中任一个的重链部分至少95％相同的序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:91-102中任一个的轻链部分至少95％相同的序列。
在一些实施例中，重链包含与SEQ ID NO:91-102中任一个的重链部分相同的序列，并且其中轻链包含与SEQ ID NO:91-102中任一个的轻链部分相同的序列。
在一些实施例中，HLA-A*02scFv包含与SEQ ID NO:91-102中任一个至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或与其相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*02scFv包含与SEQ ID NO:91-102中任一个相同的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*01配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-A*1配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*01scFv包含表6中所示的HLA-A*1CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*03，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*03配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*03scFv包含表6中所示的HLA-A*03CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*111，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*11配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*11scFv包含表6所示的HLA-A*11CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B*07，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-B*07配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-B*07scFv包含如表6中所示的HLA-B*07CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C*07，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-C*07配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-C*07scFv包含如表6中所示的HLA-C*07CDR序列。
抑制性受体
本公开提供了作为抑制性嵌合抗原受体的第二受体。抑制性受体可以包含细胞外配体结合结构域，其结合并识别MHC-I复合物中的非靶抗原或其肽衍生物。
示例性的抑制性受体描述于2020年9月6日提交的PCT/US2020/045228、2020年12月11日提交的PCT/US2020/064607、2021年4月29日提交的PCT/US2021/029907和2020年11月10日提交的PCT/US2020/059856中，其各自的内容通过引用并入本文。
本文所用的术语“抑制性受体”是指与能够转导抑制或阻抑免疫细胞的免疫活性的抑制性信号的细胞内信号传导结构域融合的配体结合结构域。抑制性受体具有免疫细胞抑制潜能，并且与具有免疫细胞活化潜能的受体CAR不同且可区分。例如，CAR是活化受体，因为它们包括细胞内刺激和/或共刺激结构域。抑制性受体是含有细胞内抑制性结构域的抑制受体。
本文所用的“抑制性信号”是指导致免疫应答阻抑(例如，细胞因子产生减少或免疫细胞活化减少)的信号转导或免疫细胞中蛋白质表达的变化。抑制或阻抑免疫细胞可以是选择性的和/或可逆的，或者不是选择性的和/或可逆的。抑制性受体对非靶抗原(例如HLA-A*02)有应答。例如，当非靶抗原(例如HLA-A*02)结合或接触抑制性受体时，抑制性受体响应于非靶抗原与抑制性受体的细胞外配体结合结构域的结合而活化表达抑制性受体的免疫细胞中的抑制性信号。
本公开的抑制性受体可以包含细胞外配体结合结构域。可以以配体依赖性方式调节受体活性的任何类型的配体结合结构域被设想在本公开的范围内。
在一些实施例中，配体结合结构域是抗原结合结构域。示例性抗原结合结构域尤其包括scFv、SdAb、仅Vβ结构域以及衍生自TCRα和β链可变结构域的TCR抗原结合结构域。
任何类型的抗原结合结构域都设想在本公开的范围内。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域是scFv。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域融合到抑制性CAR的细胞外结构域。
在一些实施例中，本公开的抑制性受体包含细胞外铰链区。示例性的铰链可以分离自或衍生自IgD和CD8结构域，例如IgG1。在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。
本公开的抑制性受体可以被设计成包含与抑制性受体的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。当来源是天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区可以分离自或衍生自(即至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或免疫球蛋白(如IgG4)。替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个端发现。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选地长度为2至10个氨基酸，可以在抑制性受体的跨膜结构域和细胞内结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
本公开提供了包含细胞内结构域的抑制性受体。本公开的抑制性受体的细胞内结构域负责抑制包含抑制性受体的免疫细胞的活化，否则其将响应于第一受体的活化信号而被活化。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。在一些实施例中，包含ITIM的抑制性细胞内结构域可以分离自或衍生自免疫检查点抑制剂，如CTLA-4和PD-1。CTLA-4和PD-1是在T细胞表面表达的免疫抑制性受体，并且在减弱或终止T细胞应答中起关键作用。
在一些实施例中，抑制性细胞内结构域分离自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体和CD200受体1。在一些实施例中，TRAIL受体包括TR10A、TR10B或TR10D。
在一些实施例中，抑制性细胞内结构域分离自具有鞘糖脂微结构域1(PAG1)的磷蛋白膜锚。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域分离自白细胞免疫球蛋白样受体B1(LILRB1)。
在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白，例如人TRAIL受体、CTLA-4、PD-1、PAG1或LILRB1蛋白。
在一些实施例中，抑制性结构域包含细胞内结构域、跨膜结构域或其组合。在一些实施例中，抑制性结构域包含细胞内结构域、跨膜结构域、铰链区或其组合。
在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长细胞质尾2(KIR3DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长细胞质尾3(KIR3DL3)、白细胞免疫球蛋白样受体B1(LIR1，也称为LIR-1和LILRB1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、Fcγ受体IIB(FcgRIIB)、杀伤细胞凝集素样受体K1(NKG2D)、CTLA-4、含有合成共有区ITIM的结构域、ZAP70 SH2结构域(例如，N和C末端SH2结构域中的一者或两者)，或ZAP70 KI_K369A(激酶失活ZAP70)。
在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白质。
在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性结构域。在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性细胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到抑制性受体的细胞内结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到抑制性受体的跨膜结构域。
在一些实施例中，第二抑制性受体包含细胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域或其分离自或衍生自相同蛋白质(例如含ITIM的蛋白质)的部分。在一些实施例中，第二抑制性受体包含铰链区，其分离自或衍生自与细胞内结构域和/或跨膜结构域相同的蛋白质，例如含ITIM的蛋白质。
在一些实施例中，第二受体是包含抑制性结构域的TCR(抑制性TCR)。在一些实施例中，抑制性TCR包含抑制性细胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3γ或CD3ε或其一部分TCR的细胞内结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3γ或CD3ε的跨膜结构域。
在一些实施例中，第二受体是包含抑制性结构域的TCR(抑制性TCR)。在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自LILRB1。
LILRB1抑制性受体
本公开提供了包含LILRB1抑制性结构域和任选的LILRB1跨膜和/或铰链结构域或其功能变体的第二抑制性受体。与具有另一个跨膜结构域或另一个铰链结构域的参照抑制性受体相比，在抑制性受体中包括LILRB1跨膜结构域和/或LILRB1铰链结构域可以增加由抑制性受体生成的抑制性信号。包含LILRB1抑制性结构域的第二抑制性受体可以是CAR或TCR，如本文所述。如本文所述，任何合适的配体结合结构域可以融合到基于LILRB1的第二抑制性受体。
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LILRB1)，也称为白细胞免疫球蛋白样受体B1，以及ILT2、LIR1、MIR7、PIRB、CD85J、ILT-2、LIR-1、MIR-7和PIR-B，是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员。LILRB1蛋白属于LIR受体的亚家族B类。这些受体含有两至四个细胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和两至四个基于细胞质免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。LILRB1受体在免疫细胞上表达，其中它结合抗原呈递细胞上的MHC I类分子并转导抑制免疫应答刺激的负信号。LILRB1被认为调节炎症应答以及细胞毒性，并且在限制自身反应性中发挥作用。存在编码LILRB1的不同同种型的多种转录物变体，所有这些都被认为在本公开的范围内。
在本文所述的抑制性受体的一些实施例中，抑制性受体包含一个或多个分离自或衍生自LILRB1的结构域。在具有分离自或衍生自LILRB1的一个或多个结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域包含与SEQ ID NO:115的序列或亚序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或相同的氨基酸序列。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域包含与SEQ ID NO:115的序列或亚序列相同的氨基酸序列。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:115的序列或亚序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:115的序列或亚序列相同的氨基酸序列组成。
在具有分离自或衍生自LILRB1的一个或多个结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:116的序列或亚序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同的多核苷酸序列编码。
在具有LILRB1的一个或多个结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:116的序列或亚序列相同的多核苷酸序列编码。
在多个实施例中，提供了包含多肽的抑制性受体，其中多肽包含以下中的一种或多种：LILRB1铰链结构域或其功能变体；LILRB1跨膜结构域或其功能变体；和LILRB1细胞内结构域或包含至少一个或至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内结构域，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
本文所用的“基于免疫受体酪氨酸的抑制基序”或“ITIM”是指具有S/I/V/LxYxxI/V/L(SEQ ID NO:984)等共有序列的保守氨基酸序列，其存在于免疫系统的许多抑制性受体的细胞质尾。在具有ITIM的抑制性受体与其配体相互作用后，ITIM基序被磷酸化，使抑制性受体募集其它酶，如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，或称为SHIP的肌醇磷酸酶。
在一些实施例中，多肽包含细胞内结构域，其包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)、至少两个ITIM、至少3个ITIM、至少4个ITIM、至少5个ITIM或至少6个ITIM。在一些实施例中，细胞内结构域具有1、2、3、4、5或6个ITIM。
在一些实施例中，多肽包含细胞内结构域，其包含至少一个选自由以下组成的组的ITIM：由NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
在进一步的特定实施例中，多肽包含细胞内结构域，其包含至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
在一些实施例中，细胞内结构域包含两个ITIM，即NLYAAV(SEQ ID NO:117)和VTYAEV(SEQ ID NO:118)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:121至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:121相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含两个ITIM，即VTYAEV(SEQ ID NO:118)和VTYAQL(SEQ ID NO:119)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:122至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:122相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含两个ITIM，即VTYAQL(SEQ ID NO:119)和SIYATL(SEQ ID NO:120)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:123至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:123相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含以下ITIM：NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)，和VTYAQL(SEQ ID NO:119)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQID NO:124至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ IDNO:124相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含以下ITIM：VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQID NO:125至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ IDNO:125相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含以下ITIM：NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。在实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:126至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:126相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含与LILRB1细胞内结构域(SEQ ID NO:131)至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与LILRB1细胞内结构域(SEQ ID NO:131)相同的序列组成。
本公开的LILRB1细胞内结构域或其功能变体可以具有至少1个、至少2个、至少4个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个ITIM。在一些实施例中，LILRB1细胞内结构域或其功能变体具有2、3、4、5或6个ITIM。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含两个、三个、四个、五个或六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含至少三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含四个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含五个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含至少七个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
LILRB1蛋白具有称为D1、D2、D3和D4的四个免疫球蛋白(Ig)样结构域。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含LILRB1 D3D4结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1D3D4结构域包含与SEQ ID NO:127至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，LILRB1 D3D4结构域包含或基本上由SEQ ID NO:127组成。
在一些实施例中，多肽包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。在实施例中，LILRB1铰链结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或与其相同的序列。在实施例中，LILRB1铰链结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128至少95％相同的序列。
在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含与SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:127或SEQID NO:128相同的序列。
在一些实施例中，LILRB1铰链结构域基本上由与SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128相同的序列组成。
在一些实施例中，跨膜结构域是LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:135至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:135至少95％相同的序列。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域包含与SEQ ID NO:135相同的序列。在实施例中，LILRB1跨膜结构域基本上由与SEQ IDNO:135相同的序列组成。
在一些实施例中，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附着于第二抑制性受体的细胞外区，例如抗原结合结构域或配体结合结构域。例如，在一些实施例中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链、CD8a铰链或LILRB1铰链。
在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性结构域。在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性细胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自LILR1B。
包含LILRB1结构域组合的抑制性受体
在一些实施例中，本公开的基于LILRB1的抑制性受体包含多于一个LILRB1结构域或其功能等效物。例如，在一些实施例中，抑制性受体包含LILRB1跨膜结构域和细胞内结构域，或LILRB1铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
在具体的实施例中，抑制性受体包含LILRB1铰链结构域或其功能片段，和LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:129至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或与其相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:129至少95％相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQID NO:129相同的序列。
在进一步的实施例中，抑制性受体包含：LILRB1跨膜结构域或其功能变体，以及LILRB1细胞内结构域和/或包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内结构域，其中ITIM选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ IDNO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。在一些实施例中，多肽包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体，以及LILRB1细胞内结构域和/或包含至少两个ITIM的细胞内结构域，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAEV(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:120)。
在一些实施例中，抑制性受体包含LILRB1跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:130至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或与其相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:130至少95％相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:130相同的序列。
在优选的实施例中，抑制性受体包含：LILRB1铰链结构域或其功能变体；LILRB1跨膜结构域或其功能变体；以及LILRB1细胞内结构域和/或包含至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内结构域，其中每个ITIM独立地选自LYAAV(SEQ ID NO:117)、VTYAE(SEQ ID NO:118)、VTYAQL(SEQ ID NO:119)，和SIYATL(SEQ ID NO:11)。
在一些实施例中，抑制性受体包含与SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133至少95％相同，或与SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133至少99％相同，或与SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133相同的序列。
在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:129至少95％相同，或与SEQ ID NO:129至少99％相同，或与SEQ ID NO:129相同的序列。
在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:130至少99％相同，或与SEQ ID NO:130至少99％相同，或与SEQ ID NO:130相同的序列。
表7.示例性的基于LILRB1的抑制性受体的多肽序列
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多核苷酸和载体
本公开提供了编码本公开的第一受体和第二受体的序列的多核苷酸。本公开提供了包含本文所述的多核苷酸和载体的免疫细胞。
在一些实施例中，第一受体和/或第二受体的序列可操作地连接到启动子。在一些实施例中，编码第一受体的序列可操作地连接到第一启动子，编码第二受体的序列可操作地连接到第二启动子。
本公开提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。
在一些实施例中，第一受体由第一载体编码，第二受体由第二载体编码。在一些实施例中，两种受体均由单一载体编码。在一些实施例中，第一载体和/或第二载体包含shRNA，例如B2M shRNA。
在一些实施例中，两种受体均由单一载体编码。在一些实施例中，载体包含shRNA，例如B2M shRNA。
在一些实施例中，第一受体和第二受体由单一载体编码。使用单一载体编码多种多肽的方法是本领域普通技术人员已知的，尤其包括在不同启动子控制下编码多种多肽，或者如果使用单个启动子控制多种多肽的转录，使用编码内部核糖体进入位点(IRES)和/或自切割肽的序列。示例性的自切割肽包括T2A、P2A、E2A和F2A自切割肽。在一些实施例中，T2A自切割肽包含序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:489)。在一些实施例中，P2A自切割肽包含序列ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:186)。在一些实施例中，E2A自切割肽包含序列QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:490)。在一些实施例中，F2A自切割肽包含序列VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:491)。在一些实施例中，T2A自切割肽包含序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:489)。前述任一项也可以包括N末端GSG接头。例如，T2A自切割肽也可以包含序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:181)，其可以由序列GGATCCGGAGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACC CTGGCCCC(SEQ ID NO:492)编码。
在一些实施例中，载体是表达载体，即用于在合适的细胞中表达第一受体和/或第二受体。
衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体比衍生自肿瘤逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
编码受体的天然或合成核酸的表达通常通过将编码受体或其部分的核酸可操作地连接到启动子上，并将构建体整合到表达载体中来实现。载体可适用于真核生物的复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调控所需核酸序列表达的启动子。
编码受体的多核苷酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，可以将多核苷酸克隆到载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞，如免疫细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并描述于例如Sambrook等人(2001，《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》，纽约冷泉港实验室)和其它病毒学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个选择性标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。典型地，它们位于起始位点上游的30至110碱基对(bp)区域，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加到相隔50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用以活化转录。
合适启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延长生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、U6启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本公开不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本公开的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要这样的表达时，该分子开关能够开启与其可操作连接的多核苷酸序列的表达，或当不需要表达时，该分子开关能够关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估受体的表达，待引入细胞的表达载体也可以含有选择性标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择性标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择性标记和报告基因都可以与合适的调节序列侧接，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定可能转染或转导的细胞，并用于评估调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，其编码的多肽的表达通过一些容易检测的特性(例如，酶活性)来证明。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，可以使用已知技术制备或商购获得。通常，具有显示最高水平的报告基因表达的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
向细胞中引入和表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物方法将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人(2001，《分子克隆：实验室手册》，纽约冷泉港实验室)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来鉴定落入本公开范围内的试剂。
免疫细胞
本公开提供了包含本文所述的受体、载体和多核苷酸的免疫细胞。
在一些实施例中，免疫细胞包含：(a)第一受体，其包含对选自以下的靶抗原特异性的第一细胞外配体结合结构域：(i)癌细胞特异性抗原或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或(ii)CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；和(b)第二受体，其包含对选自TNFRSF11、ACHRB、ITGAE、TRPV1和SREC或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的第二细胞外配体结合，其中非靶抗原包含多态性。在一些实施例中，第一受体是CAR或TCR。在一些实施例中，第二受体是抑制性受体，如抑制性嵌合抗原受体或TCR。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与先天或适应性(获得性)免疫系统的细胞。示例性的先天免疫细胞包括吞噬细胞(如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)、自然杀伤(NK)细胞、多形核白细胞(如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，以及单核细胞(如单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞)。在获得性免疫中起作用的免疫细胞包括淋巴细胞，如T细胞和B细胞。
本公开提供了包含第一受体和第二受体的免疫细胞，第一受体包含SEQ ID NO:52的序列，第二受体包含SEQ ID NO:164的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，免疫细胞包含由包含GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:179)的序列或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列编码的shRNA。在一些实施例中，免疫细胞包含第一受体和第二受体，第一受体包含SEQ ID NO:52的序列，第二受体包含SEQ ID NO:164的序列和编码包含SEQID NO:179的序列的shRNA的序列。在一些实施例中，第一受体和第二受体由单个多核苷酸编码，并且其中编码第一受体和第二受体的序列由编码自切割多肽的序列分开。在一些实施例中，自切割多肽包含T2A自切割多肽，其包含序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:181)。
本公开提供了包含多肽的免疫细胞，多肽包含SEQ ID NO:141的序列，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:141。
本公开提供了包含多核苷酸的免疫细胞，多核苷酸包含SEQ ID NO:142的序列，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO:142。
如本文所用，“T细胞”是指一种来源于在胸腺中发育的骨髓前体的淋巴细胞类型。存在几种不同类型的在迁移至胸腺时发育的T细胞，其包括辅助性CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、记忆性T细胞、调节性CD4+T细胞和干记忆性T细胞。不同类型的T细胞可以由普通技术人员基于其标记的表达来区分。区分T细胞类型的方法对于普通技术人员来说是显而易见的。
在一些实施例中，第一受体和第二受体在靶细胞存在下一起特异性活化免疫细胞。
在一些实施例中，免疫细胞选自由T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞组成的组。在一些实施例中，免疫细胞是γδ(γδ)T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是不变T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是不变的自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。在一些实施例中，免疫细胞是B细胞。在一些实施例中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，免疫细胞是CD8-。在一些实施例中，免疫细胞是CD8+。在一些实施例中，免疫细胞是CD4+。在一些实施例中，免疫细胞是CD4-。在一些实施例中，免疫细胞是CD8-/CD4+。在一些实施例中，免疫细胞是CD8+CD4-T细胞。
在一些实施例中，免疫细胞是非天然的。在一些实施例中，免疫细胞是分离的。
用本公开的载体转化免疫细胞群体(如T细胞)的方法对本领域普通技术人员来说是显而易见的。例如，CD3+T细胞可以使用CD3+T细胞阴性分离试剂盒(美天旎公司(Miltenyi))根据制造商的说明书从PBMC中分离。在CD3/28Dynabead(1:1细胞与珠比)和300单位/mL的IL-2(美天旎公司)存在下，在补充有5％人A/B血清和1％Pen/strep的X-Vivo15培养基中以1x10^6个细胞/mL的密度培养T细胞。2天后，可以使用本领域已知的方法用病毒载体(如慢病毒载体)转导T细胞。在一些实施例中，病毒载体以5的感染复数(MOI)转导。然后在富集前将细胞在IL-2或其它细胞因子(如IL-7/15/21的组合)中再培养5天。分离和培养其它免疫细胞群体(如B细胞或其它T细胞群体)的方法对本领域普通技术人员来说是显而易见的。尽管该方法概述了潜在的方法，但是应当注意，这些方法正在快速发展。例如，外周血单核细胞的优异病毒转导可以在生长5天后实现，以生成>99％的CD3+高度转导的细胞群体。
活化和培养包含TCR、CAR、抑制性受体受体或编码其的载体的T细胞群体的方法对本领域普通技术人员将是显而易见的。
无论是在对T细胞进行遗传修饰以表达TCR之前还是之后，通常都可以使用例如在美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号、第10040846号；和美国专利申请公开2006/0121005号中描述的方法活化和扩增T细胞。
在一些实施例中，本公开的T细胞在体外扩增和活化。通常，本公开的T细胞通过与表面接触而在体外扩增，表面附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群体，例如通过与抗CD3抗体接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群体可以在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松Diaclone公司)，可以使用本领域公知的其它方法(Berg等人，《移植学会会报(Transplant Proc.)》30(8):3975-3977，1998；Haanen等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》190(9):13191328，1999；Garland等人，《免疫学方法杂志(J.ImmunolMeth.)》227(1-2):53-63，1999)。
在一些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，试剂可以与同一表面偶联(即，以“顺式”形式)或与不同的表面偶联(即，以“反式”形式)。替代地，一种试剂可以与表面偶联，另一种试剂在溶液中。在一些实施例中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，提供初级活化信号的试剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种试剂都可以在溶液中。在另一实施例中，试剂可以是可溶形式，然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或抗体或其它将结合到试剂的结合剂。关于这一点，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于活化和扩增本公开中的T细胞。
在一些实施例中，两种试剂固定在珠上，或者固定在同一珠上，即“顺式”，或者固定在分开的珠上，即“反式”。例如，提供初级活化信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以相等的分子量共固定到相同的珠上。在一个实施例中，对于CD4+T细胞扩增和T细胞生长，使用每种抗体以1:1的比例结合到珠上。在一些实施例中，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本公开的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于一。在本公开的某些实施例中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。
颗粒与细胞的比率为1:500至500:1以及其间的任何整数值可用于刺激T细胞或其它靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小尺寸的珠只能结合少数细胞，而较大的珠能结合许多细胞。在某些实施例中，细胞与颗粒的比率范围为1:100至100:1和其间的任何整数值，在进一步的实施例中，该比率包含1:9至9:1和其间的任何整数值，也可用于刺激T细胞。在一些实施例中，使用1:1的细胞与珠的比率。本领域技术人员将理解，多种其它比率可适用于本公开。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。
在本公开的其它实施例中，将细胞(如T细胞)与试剂包被的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在另一实施例中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是一起培养。在进一步的实施例中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，细胞表面蛋白可以通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁性珠与T细胞接触而连接。在一个实施例中，细胞(例如，CD4+T细胞)和珠(例如，比率为1:1的DYNABEADS CD3/CD28 T顺磁性珠)在缓冲液中混合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。在某些实施例中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施例中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用以1x106个细胞/mL的密度培养的细胞。
在一些实施例中，混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一实施例中，珠和T细胞一起培养2至3天。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(龙沙公司(Lonza)))，其可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一定量的足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。在一些实施例中，培养基包含补充有5％人A/B血清、1％青霉素/链霉素(pen/strep)和300单位/ml的IL-2(美天旎公司)的X-VIVO-15培养基。
将T细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
在一些实施例中，本公开的包含TCR、CAR和抑制性受体的T细胞是自体的。在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。免疫细胞(如T细胞)可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些实施例中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在本公开的某些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，如FicollTM分离，从收集自受试者的单位血液中获得T细胞。
在一些实施例中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续的处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代的实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可以缺少镁或者可以缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，如根据制造商的说明书通过使用半自动化的“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可以将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其它含或不含缓冲液的盐溶液。替代地，可以除去单采血液成分术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施例中，通过裂解红细胞和去除单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析从外周血淋巴细胞分离免疫细胞，如T细胞。免疫细胞的特定亚群，如T细胞、B细胞或CD4+T细胞，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一个实施例中，通过与抗CD4-缀合的珠孵育一段足以阳性选择所需的T细胞的时间来分离T细胞。
通过阴性选择富集免疫细胞群体，如T细胞群体，可以通过针对阴性选择细胞特有的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD 14、CD20、CD 11b、CD 16、HLA-DR和CD8的抗体。
为了通过阳性或阴性选择分离所需的免疫细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠)的浓度。在某些实施例中，可能需要显著降低珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。
在一些实施例中，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2至10℃或室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞或从中分离免疫细胞(如T细胞)的PBMC也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过除去细胞群体中的粒细胞和在一定程度上除去单核细胞而提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在本文中是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的蒸汽相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃或液氮中立即进行不受控冷冻。
本公开提供了表达本文所述的活化剂和/或阻断剂受体的免疫细胞，其中免疫细胞具有降低的主要组织相容性(MHC)I类复合物的表达和/或功能。
在一些实施例中，免疫细胞是自体的。例如，免疫细胞分离自或衍生自接受该细胞作为治疗方案的一部分的相同受试者。用对MHC I类抗原特异性的阻断剂受体修饰自体免疫细胞以降低MHC I类的表达和/或功能可能是有利的。不希望受理论束缚，修饰自体免疫细胞以降低MHC I类的表达和/或功能降低了阻断剂受体与免疫细胞表达的MHC I类的结合，无论是顺式还是反式。
在一些实施例中，免疫细胞都是同种异体的。同种异体免疫细胞可以衍生自供体，而不是施用免疫细胞的受试者。同种异体免疫细胞在细胞疗法中通常被称为“现成的”或“通用的”，因为同种异体细胞可能被制备和储存用于多种基因型的受试者。
降低MHC I类复合物的表达和/或功能的任何合适的方法都被设想在本公开的范围内，并且尤其包括敲低一种或多种编码MHC I类组分的RNA的干扰RNA的表达，或编码MHCI类组分的基因的修饰。本文所述的降低MHC I类复合物的表达和/或功能的方法适用于同种异体和自体免疫细胞。
主要组织相容性复合物(MHC)是脊椎动物基因组上编码适应性免疫系统所需的一组多肽的基因座。其中有MHC I类多肽，其包括HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因。MHC I类等位基因是高度多态性的并且在所有有核细胞中均表达。由HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因编码的MHC I类多肽与β2微球蛋白(B2M)形成异二聚体，并与细胞表面上的抗原复合存在。如本文所述，MHC I类基因或多肽可以指在MHC中发现的任何多肽或编码所述多肽的相应基因。在一些实施例中，本公开的免疫细胞被抑制剂配体灭活，该抑制剂配体包含MHC I类多肽，例如HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因。HLA-A等位基因可以是，例如但不限于，HLA-A*02、HLA-A*02:01、HLA-A*02:01:01、HLA-A*02:01:01:01，和/或编码与HLA-A*02蛋白相同或相似的蛋白的任何基因。因此，为了防止如本文所述的自分泌信号传导/结合，需要消除或减少由HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因编码的多肽在免疫细胞中的表达。
MHC I类多肽表达降低的免疫细胞
在一些实施例中，本文所述的免疫细胞被修饰以灭活或降低或消除编码内源性MHC I类多肽的等位基因的内源性基因的表达或功能。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A、HLA-B和/或HLA-C。HLA-A、HLA-B和HLA-C由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座编码。HLA-A、HLA-B和HLA-C中的每一种均包括许多变体等位基因，所有这些均被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A。在一些实施例中，编码MHCI类多肽的基因是HLA-A*02。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A*02:01。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A*02:01:01。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A*02:01:01:01。
在一些实施例中，修饰本文所述的遗传工程化的免疫细胞以减少或消除B2M基因产物的表达。β-2微球蛋白(B2M)基因编码与主要组织相容性复合物(MHC)I类(即MHC-I复合物)相关的蛋白质。MHC-I复合物是细胞表面抗原呈递所需的。当B2M缺失时，MHC-I复合物被破坏并且不起作用(Wang D等人《干细胞转译医学(Stem Cells Transl Med.)》4:1234-1245(2015))。此外，可以使用本领域已知的基因编辑技术高效地破坏B2M基因(Ren等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》23:2255-2266(2017))。减少或消除B2M可以减少或消除免疫细胞表面上的功能性MHC I。
本公开提供了用于编辑免疫细胞中的内源性靶基因的基因编辑系统。本公开提供了对靶基因序列特异性的干扰RNA。基因编辑系统，如CRISPR/Cas系统、TALEN和锌指，可用于生成双链断裂，其通过基因修复机制(如同源定向修复或非同源末端连接(NHEJ))可用于引入突变。断裂末端切除后的NHEJ或不适当的末端连接可用于引入缺失。在一些实施例中，靶基因包含编码MHC-I复合物亚基的基因。
靶基因序列包括但不限于启动子、增强子、内含子、外显子、内含子/外显子接合、转录产物(前mRNA、mRNA和剪接变体)和/或3'和5'非翻译区(UTR)。为了在本文所述的免疫细胞中进行遗传编辑的目的，可以靶向任何基因元件或基因元件的组合。对靶基因的修饰可以使用本领域已知的任何方法来完成，以编辑靶基因，导致靶基因或基因产物的表达或功能改变或破坏。
在一些实施例中，修饰编码MHC I类多肽的基因包含缺失全部或部分基因。在一些实施例中，修饰编码MHC I类多肽的基因包含在基因中引入突变。在一些实施例中，突变包含缺失、插入、取代或移码突变。在一些实施例中，修饰基因包含使用核酸引导的核酸内切酶。
本文所述靶基因的基因序列是本领域已知的。这些序列可以在公共数据库中找到，如NCBI基因库或NCBI核苷酸数据库。可以使用基因标识符找到序列，例如，HLA-A基因具有NCBI基因ID：3105，HLA-B基因具有NCBI基因ID：3106，HLA-C基因具有NCBI基因ID：3107，并且B2M基因具有NCBI基因ID：567和NCBI参考序列：NC_000015.10。也可以通过使用关键词搜索公共数据库来找到基因序列。例如，可以通过搜索关键词“HLA-A*02”、“HLA-A*02:01”、“HLA-A*02:01:01”或“HLA-A*02:01:01:01”在NCBI核苷酸数据库中找到HLA-A等位基因。这些序列可用于本领域已知的各种基因编辑技术中的靶向。表8提供了靶向用于本文所述修饰的HLA-A等位基因和B2M基因序列的非限制性示例性序列。
表8.示例性靶基因序列
B2M mRNA (SEQ ID NO:493)
B2M基因(基因库：567) (SEQ ID NO:494)
编码mRNA的HLA-A*02:01:01:01序列 (SEQ ID NO:495)
HLA-A*02(基因库：LK021978.1) (SEQ ID NO:496)
本领域普通技术人员将理解，T可以取代U以将RNA序列转化为DNA序列，反之亦然，并且两者都被设想为本公开的靶基因序列。
在一些实施例中，使用核酸引导的核酸内切酶在本文所述的免疫细胞中编辑靶基因。示例性核酸引导的核酸内切酶包括II类核酸内切酶，如CRISPR/Cas9。
本文所用的“CRISPR”或“CRISPR基因编辑”是指一组成簇的规则间隔的短回文重复序列，或包含这样一组重复序列的系统。本文所用的“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可用于沉默、敲除或突变靶基因。该系统是一种原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性，并提供一种获得性免疫。CRISPR/Cas系统已被修饰用于基因编辑。这是通过向真核细胞中引入一种或多种特别设计的引导核酸(gNA)，通常是引导RNA(gRNA)，以及与gNA形成核糖核蛋白复合物的合适的Cas核酸内切酶来实现的。gNA将gNA-核酸内切酶蛋白复合物引导至靶基因组位置，并且核酸内切酶在靶基因组位置引入链断裂。这种链断裂可以通过细胞机制修复，如非同源末端连接(导致缺失)或同源修复(可以生成插入)，从而将遗传修饰引入宿主细胞基因组。
CRISPR/Cas系统按类和按类型分类。2类系统目前代表分类为三种不同类型(II型、V型和VI型)的单一干扰蛋白。任何适合于基因编辑的2类CRISPR/Cas系统，例如II型、V型或VI型系统，被设想为在本公开的范围内。示例性的2类II型CRISPR系统包括Cas9、Csn2和Cas4。示例性的2类V型CRISPR系统包括Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i和Cas12k(C2c5)。示例性的2类VI型系统包括Cas13、Cas13a(C2c2)Cas13b、Cas13c和Cas13d。
CRISPR序列，有时称为CRISPR基因座，包含交替重复序列和间隔区。在天然存在的CRISPR中，间隔区通常包含细菌外源的序列，如质粒或噬菌体序列。如本文所述，间隔区序列也可以称为“靶向序列”。在用于遗传工程的CRISPR/Cas系统中，间隔区衍生自靶基因序列(gNA)。
示例性的2类II型CRISPR系统依赖于蛋白质Cas9，其是具有两个活性切割位点的核酸酶，双螺旋的每条链一个。组合Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA可用于基因编辑系统中。Pennisi(2013)《科学(Science)》341:833-836。在一些实施例中，用于修饰免疫细胞的Cas蛋白是Cas9。
因此，CRISPR/Cas系统可用于编辑靶基因，例如通过添加或删除碱基对，或引入过早终止从而降低靶的表达而靶向用于在本文所述的免疫细胞中编辑的基因。CRISPR/Cas系统也可以像RNA干扰一样使用，以可逆的方式关闭靶基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至靶基因启动子，空间阻断RNA聚合酶。
Cas蛋白可以衍生自任何细菌或古细菌Cas蛋白。任何合适的CRISPR/Cas系统均设想在本公开的范围内。在其它方面，Cas蛋白包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a(Cpf1)、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY、其同源物或其修饰形式中的一种或多种。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白、Cpf1蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas 5、Cas7、Cas8、Cas10，或这些蛋白的组合或复合物。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白。
用本领域已知的技术，例如美国公开号20140068797和Cong(2013)《科学》339:819-823中描述的技术，可以生成抑制靶基因的人工CRISPR/Cas系统。也可以生成抑制靶基因的本领域已知的其它人工CRISPR/Cas系统，例如，在Tsai(2014)《自然·生物技术(Nature Biotechnol.)》，32:6 569-576，美国专利第8,871,445号；第8,865,406号；第8,795,965号；第8,771,945号；和第8,697,359号中描述的。为特定Cas蛋白设计合适gNA的方法是本领域普通技术人员已知的。
本公开提供了可以将相关多肽(例如，核酸引导的核酸内切酶)的活性导向靶核酸基因组内的特定靶基因序列的基因靶向引导核酸(gNA)。基因组靶向核酸可以是RNA。基因组靶向RNA在本文中称为“引导RNA”或“gRNA”。引导RNA可以至少包含与感兴趣的靶核酸序列杂交的靶向序列和CRISPR重复序列。在一些II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA，在本文中也称为“支架”序列。在II型引导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和支架序列彼此杂交以形成双链体。在V型引导RNA(gRNA)中，crRNA形成双链体。在两种系统中，双链体可以结合定点多肽，使得引导RNA和定点多肽形成复合物。基因靶向核酸可以通过其与定点多肽的缔合而提供对复合物的靶特异性。因此，基因靶向核酸可以指导定点多肽的活性。
在一些实施例中，本公开提供了包含靶向序列和引导RNA支架序列的引导RNA，其中靶向序列与靶基因的序列互补。
示例性的引导RNA包括约15至20个碱基的靶向序列。如本领域普通技术人员所理解的，每个gRNA可以被设计成包括与其基因组靶序列互补的靶向序列。例如，可以将每种靶向序列(例如，表9中呈现的DNA序列的RNA版本，减去代表PAM位点的三个3'核苷酸)放入单个RNA嵌合体或crRNA中。
基因靶向核酸可以是双分子引导RNA。基因靶向核酸可以是单分子引导RNA。基因靶向核酸可以是本领域已知的任何已知构型的引导RNA，例如包括成对的gRNA，或在单个步骤中使用的多个gRNA。尽管从基因组序列中可以清楚地看出编码序列和剪接点在哪里，但基因表达所需的其它特征可能是特异的和不清楚的。
双分子引导RNA可以包含双链RNA。第一链包含5'至3'方向的序列、任选的间隔区延伸序列、靶向序列和最小CRISPR重复序列。第二链可以包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
II型系统中的单分子引导RNA(sgRNA)可以在5'至3'方向上包含任选的间隔区延伸序列、靶向序列、最小CRISPR重复序列、单分子引导接头、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸可以包含为引导RNA提供额外功能(例如，稳定性)的元件。单分子引导接头可以连接最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸可以包含一个或多个发夹。
在一些实施例中，引导RNA或单分子引导RNA(sgRNA)可以包含靶向序列和支架序列。在一些实施例中，支架序列是Cas9 gRNA序列。在一些实施例中，支架序列由包含与以下序列共享至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的DNA序列编码：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCT AGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO:497)。在一些实施例中，支架序列由包含GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO:497)的DNA序列编码。
在一些实施例中，例如其中CRISPR/Cas系统是Cas9系统的那些实施例，sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含20个核苷酸的靶向序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含少于20个核苷酸的靶向序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含多余20个的核苷酸靶向序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5'端具有17至30个核苷酸的可变长度靶向序列。
合适的支架序列和支架靶向序列的排列将取决于核酸内切酶的选择，并且是本领域技术人员已知的。
II型系统中的单分子引导RNA(sgRNA)，例如Cas9，可以在5'至3'方向包含最小CRISPR重复序列和靶向序列。
作为说明，在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统中使用的引导RNA，或其它更小的RNA可以通过化学方法容易地合成，如下文所示和在本领域中描述的。尽管化学合成方法不断扩大，但是当多核苷酸长度显著增加超过一百个左右的核苷酸时，通过如高效液相色谱(HPLC，其避免使用如PAGE的凝胶)的方法纯化这种RNA往往变得更具挑战性。一种用于生成更长RNA的方法是产生两个或多个连接在一起的分子。更长的RNA，如编码Cas9或Cpf1核酸内切酶的RNA，更易于酶促生成。可以在RNA的化学合成和/或酶促生成期间或之后引入各种类型的RNA修饰，例如增强稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度，和/或增强其它属性的修饰，如本领域所述。
gRNA的靶向序列与感兴趣的靶核酸中的序列杂交。基因组靶向核酸的靶向序列可以通过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。靶向序列的核苷酸序列可以根据感兴趣的靶核酸的序列而变化。
在本文所述的Cas9系统中，靶向序列可以被设计为与位于系统中使用的Cas9酶的PAM的反向补体的5'的靶核酸杂交。靶向序列可以完全匹配靶序列或可以具有错配。每种CRISPR/Cas系统蛋白可以在其在靶DNA中识别的特定方向和位置上具有特定PAM序列。例如，化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9在靶核酸中识别包含序列5'-NRG-3′的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由靶向序列靶向的靶核酸序列的3'。选择合适的PAM序列对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
靶序列与gRNA的靶向序列互补并杂交。靶核酸序列可以包含20个核苷酸。靶核酸可以包含少于20个核苷酸。靶核酸可以包含多于20个核苷酸。靶核酸可以至少包含：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。在一些实施例中，例如其中CRISPR/Cas系统是Cas9系统的那些实施例，靶核酸序列可以包含紧邻PAM序列的反向补体的第一核苷酸的5'的20个核苷酸。该靶核酸序列通常称为PAM链或靶链，而互补核酸序列通常称为非PAM链或非靶链。本领域技术人员将认识到靶向序列与靶核酸的非PAM链杂交，参见例如US20190185849A1。
在一些实例中，靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在一些实例中，靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％或100％。在一些实例中，靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比在靶核酸的互补链的靶序列的六个连续的最5'核苷酸上是100％。靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比在约20个连续核苷酸上可以是至少60％。靶向序列和靶核酸的长度可以相差1至6个核苷酸，其可以被认为是一个或多个凸起。
可以使用本领域普通技术人员已知的计算机程序来设计或选择靶向序列。计算机程序可以使用变量，如预测的解链温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、％GC、基因组出现的频率(例如，由于错配、插入或缺失而在一个或多个位点上相同或相似但不同的序列)、甲基化状态、SNP的存在等。可用的计算机程序可以将NCBI基因ID、官方基因符号、Ensembl基因ID、基因组坐标或DNA序列作为输入，并创建包含靶向指定为输入的适当基因组区的sgRNA的输出文件。计算机程序还可以提供统计学和分数的总结，表明sgRNA对靶基因的靶上和脱靶结合(Doench等人，《自然·生物技术》34:184-191(2016))。本公开提供了包含靶向序列的引导RNA。在一些实施例中，引导RNA进一步包含引导RNA支架序列。在一些实施例中，靶向序列与选自由HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M或其等位基因组成的组的靶基因的序列互补。在一些实施例中，靶基因是HLA-A基因。在一些实施例中，靶基因是HLA-B基因。在一些实施例中，靶基因是HLA-C基因。在一些实施例中，靶基因是HLA-A、HLA-B、HLA-C或其组合。在一些实施例中，靶向序列包含与表8中公开的序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性或与其相同的序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向内源性HLA-A基因座的序列。在一些实施例中，特异性靶向HLA-A基因座序列的gNA包含与选自表9中公开的序列的序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的序列。在一些实施例中，特异性靶向HLA-A基因座序列的gNA包含选自表9中公开的序列的序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02等位基因的序列。例如，gRNA特异性靶向并杂交于由所有HLA-A*02等位基因共享的序列，但不是HLA-A*02和HLA-A*03等位基因共享的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01:01等位基因的序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02的编码DNA序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向超过1000个HLA-A*02等位基因共享的编码DNA序列。在一些实施例中，特异性靶向大于1000个HLA-A*02等位基因中的编码DNA序列的gNA包含与选自SEQ ID NO:400-465的序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性或与其相同的序列。
表9至12中的序列以DNA序列表示。本领域技术人员将理解，胸腺嘧啶(T)可以在任何DNA序列(包括表9至12中所示的那些)中用尿嘧啶(U)代替，以得到相应的RNA序列。
表9.靶向HLA-A和HLA-A等位基因的示例性序列
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表9中公开的序列包括相应的基因组序列，包括PAM序列。技术人员将理解，gRNA的靶向序列不包括表9中序列的三个3'末端核苷酸，其代表gRNA的相应PAM位点。
本公开提供了包含对B2M基因特异性的靶向序列的gNA。在一些实施例中，gNA特异性靶向B2M基因的编码序列(CDS)序列。在一些实施例中，gNA包含靶向B2M基因启动子序列的序列。
在一些实施例中，gNA包含靶向序列和gNA支架序列。在一些实施例中，靶向序列包含表10中所示的序列，或与其共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性的序列。
在一些实施例中，靶向序列与B2M基因的序列互补。在一些实施例中，B2M基因包含与表8中所示的B2M序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性的序列。
表10.靶向B2M的示例性序列
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/>
在一些实施例中，使用TALEN基因编辑来编辑本文所述的免疫细胞。
“TALEN”或“TALEN基因编辑”是指类转录激活因子效应物核酸酶，其是用于编辑靶基因的人工核酸酶。
通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合人工产生TALEN。来源于黄单胞菌属细菌的类转录激活因子效应物(TALE)可以被工程化以结合任何所需的DNA序列，包括靶基因的一部分，如TCR亚基、MHC I类复合物组分或CD52。通过将工程化TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对任何所需DNA序列(包括靶基因序列)特异性的限制性酶。然后可以将它们引入细胞，其中它们可用于基因组编辑。
为了产生TALEN，TALE蛋白与核酸酶(N)融合，核酸酶是野生型或突变的折叠核酸内切酶。针对FokI在TALEN中的应用，已经进行了几种FokI突变；例如，这些提高了切割特异性或活性。
FokI结构域作为二聚体起作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于靶基因组中具有适当取向和间距的位点。TALE DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数目以及两个单独TALEN结合位点之间的碱基数目似乎是实现高水平活性的重要参数。
可以使用本领域已知的任何方法，包括使用模块化组件的各种方案，构建对靶基因中的序列特异性的TALEN。
在一些实施例中，使用ZFN基因编辑在本文所述的免疫细胞中编辑靶基因。
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“ZFN基因编辑”是指锌指核酸酶，一种可用于编辑靶基因的人工核酸酶。
与TALEN一样，ZFN包含与DNA结合结构域融合的折叠核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。
锌指是由一个或多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可以包含例如Cys2His2，并且可以识别大约3-bp的序列。已知特异性的各种锌指可以组合以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于生成识别特异性序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。
与TALEN一样，ZFN必须二聚化以切割DNA。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须结合DNA的相反链，它们的核酸酶适当地间隔开。
同样与TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果不正确地修复，其可以产生移码突变，导致细胞中靶基因或基因产物的表达和数量降低。ZFN也可用于同源重组以在靶基因中突变。
可以使用本领域已知的任何方法构建对靶基因中的序列特异性的ZFN。
在一些实施例中，使用RNA干扰降低一种或多种MCH-I组分的表达和功能。“RNAi”或“RNA干扰”是指由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。双链体RNA，如siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)、shRNA(短发夹RNA)、ddRNA(DNA定向RNA)、piRNA(Piwi相互作用RNA)或rasiRNA(重复相关siRNA)及其修饰形式，都能够介导RNA干扰。这些dsRNA分子可以是市售的或可以基于已知的序列信息设计和制备。这些分子的反义链可以包括RNA、DNA、PNA或其组合。DNA/RNA嵌合多核苷酸包括但不限于由抑制靶基因表达的DNA和RNA组成的双链多核苷酸。如本文所述，dsRNA分子还可以包括一个或多个修饰的核苷酸，其可以整合在一条或两条链上。
在RNAi基因沉默或敲低中，将包含与靶基因的一部分互补的第一(反义)链和与第一反义链完全或部分互补的第二(有义)链的dsRNA引入生物体中。在引入生物体后，靶基因特异性dsRNA被加工成相对小的片段(siRNA)，随后可分布在整个生物体中，降低靶基因的信使RNA，产生与靶基因完全或部分缺失产生的表型非常相似的表型。
细胞中的某些dsRNA可以经历Dicer酶(一种核糖核酸酶III酶)的作用。Dicer可以将dsRNA加工成较短的dsRNA片段，即siRNA。RNAi还涉及被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物。在被Dicer切割后，siRNA进入RISC复合物并直接切割具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA靶。siRNA的另一条链是过客链。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间。因此，siRNA可以通过以序列特异性方式介导RNA干扰来下调或敲低基因表达。
如本文关于RNA干扰所使用的，“靶基因”或“靶序列”是指其相应RNA被靶向以使用如本文所述的dsRNA或siRNA通过RNAi途径降解的基因或基因序列。示例性的靶基因序列示于表8中。为了靶向基因，例如使用siRNA，siRNA包含与靶基因或序列的至少一部分互补或基本上互补的反义区，以及与反义链互补的有义链。一旦引入细胞，siRNA指导RISC复合物切割包含靶序列的RNA，从而降解RNA。本公开提供了干扰RNA。本公开的双链RNA分子可以是本领域已知的任何类型的RNA干扰分子的形式。在一些实施例中，双链RNA分子是小干扰RNA(siRNA)。在其它实施例中，双链RNA分子是短发夹RNA(shRNA)分子。在其它实施例中，双链RNA分子是在细胞中加工以产生siRNA的Dicer底物。在其它实施例中，双链RNA分子是微小RNA前体分子的一部分。
在一些实施例中，shRNA具有适合作为Dicer底物的长度，其可以被加工以产生RISC活性siRNA分子。参见例如Rossi等人，US2005/0244858。
Dicer底物双链RNA(例如shRNA)可以具有足以被Dicer加工以产生活性siRNA的长度，并且可以进一步包括以下特性中的一种或多种：(i)Dicer底物shRNA可以是不对称的，例如，在反义链上具有3'突出端，(ii)Dicer底物shRNA可以在有义链上具有修饰的3'端，以指导Dicer结合的取向和dsRNA向活性siRNA的加工，例如掺入一个或多个DNA核苷酸，以及(iii)Dicer底物ds RNA的第一链和第二链的长度可以是21至30bp。
在一些实施例中，干扰RNA包含与B2M mRNA的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的B2M mRNA的降解。在一些实施例中，B2M mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，B2M mRNA序列包含非翻译区。
在一些实施例中，干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含非翻译区。
在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含第一序列，其从5'至3'端具有与B2M mRNA互补的序列；以及第二序列，其从5'至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。
在一些实施例中，第一序列是18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，第一序列与选自表11和12中所示序列的序列互补。在一些实施例中，第一序列具有大于或等于25％且小于60％的GC含量。在一些实施例中，第一序列与选自表11和12中所示序列的序列互补。在一些实施例中，第一序列不包含相同碱基的四个核苷酸或一连串七个C或G核苷酸碱基。在一些实施例中，第一序列是21个核苷酸。
与第一序列互补的示例性靶B2M序列示于表11中。
在一些情况下，第一序列可以与靶核酸序列具有100％同一性，即完全同一性、同源性、互补性。在其它情况下，在第一序列和靶核酸序列之间可能存在一个或多个错配。例如，在有义区和靶核酸序列之间可能存在1、2、3、4、5、6或7个错配。
表11中列出的序列以DNA序列表示。在表11中列出的所有序列中，胸腺嘧啶(T)可以被尿嘧啶(U)代替以得到靶mRNA序列的序列。
表11.与第一序列互补的示例性靶B2M序列
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编码B2M shRNA的示例性序列包含序列GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:179)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。编码B2M shRNA的另一个示例性序列包含序列GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ ID NO:180)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在一些实施例中，干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含非翻译区。
在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含第一序列，其从5'至3'端具有与HLA-A*02mRNA互补的序列；以及第二序列，其从5'至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。
与第一序列互补的示例性靶HLA序列示于表12中。
表12.与第一序列互补的示例性靶HLA序列
在一些实施例中，第一序列和第二序列被接头分开，接头有时被称为环。在一些实施例中，第一序列和第二序列两者都由一个单链RNA或DNA载体编码。在一些实施例中，环位于第一序列和第二序列之间。在这些实施例中，第一序列和第二序列杂交形成双链体区域。第一序列和第二序列通过接头序列连接，形成“发夹”或“茎-环”结构。shRNA可以在单链分子的相对端具有互补的第一序列和第二序列，使得分子可以与互补序列部分形成双链体区域，并且链在双链体区域的一端通过接头(即环序列)连接。接头或环序列可以是核苷酸或非核苷酸接头。接头可以通过共价键或非共价相互作用与第一序列和任选的第二序列相互作用。
任何合适的核苷酸环序列被设想在本公开的范围内。本公开的shRNA可以包括将shRNA的第一序列连接到shRNA的第二序列的核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸接头。核苷酸环序列可以是长度为≥2个核苷酸，例如长度为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。表14中公开了示例性的环序列。
在一些实施例中，shRNA进一步包含5'侧翼序列和3'侧翼序列。在一些实施例中，其中5'侧翼序列连接到第一序列的5'端，并且其中3'侧翼序列连接到第二序列的3'端。
不希望受理论束缚，认为具有与在微小RNA中发现的那些序列相似的5'和3'序列的侧翼shRNA茎环序列可以靶向用于通过内源性微小RNA加工机制加工的shRNA，增加shRNA加工的有效性。替代地，或另外，侧翼序列可以增加shRNA与聚合酶II或聚合酶III启动子的相容性，导致shRNA表达的更有效调节。
在一些实施例中，5'侧翼序列选自表13中所示的序列。示例性侧翼序列示于表13中。
表13.示例性侧翼序列
在一些实施例中，第一序列和第二序列存在于单链多核苷酸上，其中第一序列和第二序列相隔4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸，其中4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸形成shRNA中的环区。在一些实施例中，环区包含选自表14所示序列的序列。
表14.示例性环区序列
SEQ ID NO 环区序列
962 CGAA
963 UUCAAGA
964 AUAUUCA
965 UGUGCUGUC
966 CUCGAG
967 CUUCCUGUCAGA
968 CUUCCCUUUGUCAGA
969 GUGUUAUUCUUG
970 GUGUCUUAAUUG
971 GUGUUAGUCUUG
972 UCAAGAG
973 GGACAUCCAGGG
974 GUGAAGCCACAGAUG
975 GAUUCUAAAA
本公开的shRNA可以通过化学合成、通过体外转录，或通过用Dicer或具有类似活性的另一种合适的核酸酶切割较长的双链RNA而在外源生成。使用常规的DNA/RNA合成仪从受保护的核糖核苷亚磷酰胺产生的化学合成的siRNA可以从商业供应商获得，如密理博西格玛公司(Millipore Sigma)(得克萨斯州休斯顿)、Ambion公司(得克萨斯州奥斯汀)、英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)或Dharmacon公司(科罗拉多州拉斐特)。siRNA可以通过例如用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、层析或其组合来纯化。替代地，siRNA可以在很少(如果有的话)纯化的情况下使用，以避免由于样品加工造成的损失。
在一些实施例中，本公开的shRNA可以使用其中已经克隆了编码双链RNA的核酸的表达载体来产生，例如在合适的启动子的控制下。
药物组合物
本公开提供了包含免疫细胞和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，该免疫细胞包含本公开的第一受体和第二受体。
此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；和防腐剂。
在一些实施例中，免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少90％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。
治疗癌症
本文提供了杀死受试者体内多种癌细胞或治疗癌症的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的包含免疫细胞的组合物，该免疫细胞包含本公开的第一受体和第二受体。免疫细胞在同一细胞中表达两种受体。
癌症是一种异常细胞不受控制地分裂并扩散到附近组织的疾病。在一些实施例中，癌症包含液体肿瘤或固体肿瘤。示例性的液体肿瘤包括白血病和淋巴瘤。癌症几乎可以发生在身体的任何一个器官，包括上皮组织。其中多种癌细胞表达第一活化剂配体而不表达第二抑制剂配体的任何癌症被设想在本公开的范围内。例如，可以使用本文所述的方法治疗的CEA阳性癌症包括结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、肺腺癌、头颈癌、胆囊癌、弥漫性大B细胞癌或急性髓性白血病癌。
在一些实施例中，多种癌细胞表达靶抗原。在一些实施例中，受试者的多种癌细胞表达CEA。其细胞表达CEA，即CEA阳性的任何癌症被设想在本公开的范围内。示例性的CEA阳性癌症包括但不限于前列腺癌、卵巢癌、肺癌、甲状腺癌、胃肠癌、乳腺癌和肝癌。其它CEA阳性癌症包括结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、肺癌、头颈癌、胆囊癌、弥漫性大B细胞癌或急性髓性白血病癌。在一些实施例中，癌症包含结肠癌、肺癌或胰腺癌。在一些实施例中，CEA阳性癌症包含肺癌、结肠直肠癌。在一些实施例中，肺癌包含肺腺癌、小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施例中，肺癌包含肺腺癌。本文公开的组合物和方法可用于治疗复发性、难治性和/或转移性CEA阳性癌症。
本文提供了治疗患有CEA+肿瘤的受试者体内CEA+癌症的方法，该肿瘤在MHC I类基因座处具有杂合性丢失。在一些实施例中，该方法包含向受试者施用有效量的本文所述的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，该方法包含(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞的HLA-A、HLA-B或HLA-C基因型或表达；(b)确定受试者的多种癌细胞中的CEA的表达；以及(c)如果正常细胞表达HLA-A、HLA-B或HLA-C非靶抗原2并且多种癌细胞不表达HLA-A、HLA-B或HLA-C非靶抗原，并且多种癌细胞也是CEA阳性的，则向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，例如其中已知癌症为CEA+的那些实施例，该方法包含(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞的HLA-A、HLA-B或HLA-C基因型或表达；以及(b)如果正常细胞表达HLA-A、HLA-B或HLA-C非靶抗原并且多种癌细胞不表达非靶抗原，则向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。
施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以减小受试者体内肿瘤的大小。在一些实施例中，相对于施用免疫细胞或药物组合物之前的肿瘤大小，肿瘤大小减小约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施例中，肿瘤被消除。
施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以阻止受试者体内肿瘤的生长。例如，免疫细胞或药物组合物可以杀死肿瘤细胞，使得肿瘤停止生长或大小减小。在一些情况下，免疫细胞或药物组合物可以预防额外肿瘤的形成，或减少受试者体内肿瘤的总数。
施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可能导致受试者体内癌细胞而非野生型细胞的选择性杀伤。在一些实施例中，约60％的被杀死的细胞是癌细胞，约65％的被杀死的细胞是癌细胞，约70％的被杀死的细胞是癌细胞，约75％的被杀死的细胞是癌细胞，约80％的被杀死的细胞是癌细胞，约85％的被杀死的细胞是癌细胞，约90％的被杀死的细胞是癌细胞，约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％的被杀死的细胞是癌细胞。
施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可能导致杀死受试者的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的癌细胞。
与施用包含第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以对受试者产生更少的副作用。例如，相对于在没有第二抑制性受体的情况下施用的CEA CAR或CEA TCR，施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以降低剂量限制性毒性。
在一些实施例中，多种癌细胞不表达TNFRSF11、ACHRB、ITGAE、TRPV1或SREC的多态性等位基因。例如，癌细胞通过在该基因座的杂合性丢失而丢失了TNFRSF11、ACHRB、ITGAE、TRPV1或SREC的等位基因。
本公开提供了治疗受试者体内癌症的方法，其包含：(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞在选自由rs1716(ITGAE R950W)、rs2976230(ITGAE V1019A/V1019G)、rs1805034(TNFRSF11A V192A)和rs35211496(TNFRSF11A H141Y)组成的组的多态性基因座处的基因型；(b)确定多种癌细胞中CEA的表达；以及(c)如果野生型细胞对于多态性基因座是杂合的并且多种癌细胞对于多态性基因座是半合子的，并且多种癌细胞是CEA阳性的，则向受试者施用多种免疫细胞，其中多种免疫细胞包含：(i)第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原特异性的细胞外配体结合结构域；以及(ii)第二受体，任选地为抑制性受体，其包含对选自TNFRSF11、ACHRB、ITGAE、TRPV1和SREC或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的细胞外配体结合，其中非靶抗原包含多态性。
对受试者的癌细胞和正常细胞进行SNP存在或不存在的基因分型的方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。SNP基因分型方法尤其包括基于PCR的方法，如双探针TaqMan测定、基于阵列的杂交方法和测序。
测量受试者的癌症或野生型细胞中靶抗原表达的方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。这些方法尤其包括测量RNA表达的方法，如RNA测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及测量蛋白质表达的方法，如基于免疫组织化学的方法。测量多种癌细胞中杂合性丢失的方法尤其包括使用本领域已知的方法对从癌细胞提取的基因组DNA进行高通量测序。
在一些实施例中，第一配体包含IMIGVLVGV(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，第一配体与包含人白细胞抗原A*02等位基因(HLA-A*02)的主要组织相容性复合物复合。
在一些实施例中，多种癌细胞在rs1805034处包含TNFRSF11A192A等位基因，并且第二受体的配体结合结构域对在SEQ ID NO:13的第192位处具有V的TNFRSF11A配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:13的第192处具有A的TNFRSF11A配体的亲和力。
在一些实施例中，多种癌细胞在rs1805034处包含TNFRSF11A 192V等位基因，并且第二受体的配体结合结构域对在SEQ ID NO:13的第192位处具有A的TNFRSF11A配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:13的第192位处具有V的TNFRSF11A配体的亲和力。
在一些实施例中，多种癌细胞在rs35211496处包含TNFRSF11A 141H等位基因，并且第二受体的配体结合结构域对在SEQ ID NO:13的第141位处具有Y的TNFRSF11A配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:13的第141位处具有H的TNFRSF11A配体的亲和力。
在一些实施例中，多种癌细胞在rs35211496处包含TNFRSF11A 141Y等位基因，并且其中第二受体的配体结合结构域对在SEQ ID NO:13的第141位处具有H的TNFRSF11A配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:13的第141位处具有Y的TNFRSF11A配体的亲和力。
在一些实施例中，多种癌细胞在rs1716处包含ITGAE 950R等位基因，并且第二受体的配体结合结构域对在SEQ ID NO:14的第950位处具有W的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:14的第950处具有R的ITGAE配体的亲和力。
在一些实施例中，多种癌细胞在rs1716处包含ITGAE 950W，并且第二受体的配体结合结构域对在SEQ ID NO:14的第950位处具有R的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ IDNO:14的第950位处具有W的ITGAE配体的亲和力。
在一些实施例中，多种癌细胞在rs2976230处包含ITGAE 1019V等位基因，并且第二受体的配体结合结构域对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有A或G的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有W的ITGAE配体的亲和力。
在一些实施例中，多种癌细胞在rs2976230处包含ITGAE 1019A等位基因，并且第二受体的配体结合结构域对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有V或G的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有A的ITGAE配体的亲和力。
在一些实施例中，多种癌细胞在rs2976230处包含ITGAE 1019G等位基因，并且第二受体的配体结合结构域对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有V或A的ITGAE配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:14的第1019位处具有G的ITGAE配体的亲和力。
在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。
在一些实施例中，免疫细胞是同种异体的或自体的。
在一些实施例中，与表达第一受体但不表达第二受体的免疫细胞相比，第二受体增加了免疫细胞对CEA阳性癌细胞的特异性。在一些实施例中，与表达第一受体但不表达第二受体的免疫细胞相比，免疫细胞具有降低的副作用。
治疗癌症可能导致肿瘤大小减小。肿瘤大小的减小也可以被称为“肿瘤消退”。优选地，治疗后，肿瘤大小相对于其治疗前的大小减小5％或更多；更优选地，肿瘤大小减小10％或更多；更优选地，减小20％或更多；更优选地，减小30％或更多；更优选地，减小40％或更多；甚至更优选地，减小50％或更多；并且最优选地，减小大于75％或更多。肿瘤的大小可以通过任何可重复的测量方式来测量。肿瘤的大小可以测量为肿瘤的直径。
治疗癌症可能导致肿瘤体积减小。优选地，治疗后，肿瘤体积相对于其治疗前的大小减少5％或更多；更优选地，肿瘤体积减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；并且最优选地，减少大于75％或更多。肿瘤体积可以通过任何可重复的测量方式来测量。
治疗癌症导致肿瘤数目减少。优选地，治疗后，肿瘤数目相对于治疗前的数目减少5％或更多；更优选地，肿瘤数目减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；并且最优选地，减少大于75％。肿瘤的数目可以通过任何可重复的测量方式来测量。肿瘤的数目可以通过对肉眼可见的肿瘤进行计数或在指定的放大倍数下进行计数来测量。优选地，指定的放大倍数是2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或50倍。
治疗癌症可能导致远离原发性肿瘤部位的其它组织或器官中转移病灶的数目减少。优选地，治疗后，转移病灶的数目相对于治疗前的数目减少5％或更多；更优选地，转移病灶的数目减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；并且最优选地，减少大于75％。转移病灶的数目可以通过任何可重复的测量方式来测量。转移病灶的数目可以通过对肉眼可见的转移病灶进行计数或在指定的放大倍数下进行计数来测量。优选地，指定的放大倍数是2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或50倍。
与仅接受载体的群体相比，治疗癌症可能导致接受治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；并且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。
与未治疗的受试者群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；并且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。
与接受使用不是本公开的化合物或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的药物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；并且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。
与仅接受载体的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的死亡率降低。与未治疗的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的死亡率降低。与接受使用不是本公开的化合物或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的药物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的死亡率降低。优选地，死亡率降低超过2％；更优选地，超过5％；更优选地，超过10％；并且最优选地，大于25％。治疗受试者群体的死亡率的降低可以通过任何可重复的方式测量。群体死亡率的降低可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后每单位时间的疾病相关死亡的平均数来测量。群体死亡率的降低也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后每单位时间的疾病相关死亡的平均数来测量。
治疗癌症可能导致肿瘤生长速率降低。优选地，治疗后，肿瘤生长速率相对于治疗前的数目降低至少5％；更优选地，肿瘤生长速率降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；并且最优选地，降低至少75％。肿瘤生长速率可以通过任何可重复的测量方式来测量。可以根据每单位时间肿瘤直径的变化测量肿瘤生长速率。
治疗癌症可能导致肿瘤再生长的减少。优选地，治疗后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于10％；更优选地，小于20％；更优选地，小于30％；更优选地，小于40％；更优选地，小于50％；甚至更优选地，小于50％；并且最优选地，小于75％。肿瘤再生长可以通过任何可重复的测量方式来测量。例如，通过测量治疗后的先前肿瘤收缩后肿瘤直径的增加来测量肿瘤再生长。停止治疗后肿瘤不再复发表明肿瘤再生长减少。
治疗或预防癌症可能导致细胞增殖速率降低。优选地，治疗后，细胞增殖速率降低至少5％；更优选地，至少10％；更优选地，至少20％；更优选地，至少30％；更优选地，至少40％；更优选地，至少50％；甚至更优选地，至少50％；并且最优选地，至少75％。细胞增殖速率可以通过任何可重复的测量方式来测量。例如，通过测量每单位时间组织样品中分裂细胞的数目来测量细胞增殖速率。
治疗或预防癌症可能导致增殖细胞的比例降低。优选地，治疗后，增殖细胞的比例降低至少5％；更优选地，至少10％；更优选地，至少20％；更优选地，至少30％；更优选地，至少40％；更优选地，至少50％；甚至更优选地，至少50％；并且最优选地，至少75％。增殖细胞的比例可以通过任何可重复的测量方式来测量。优选地，例如通过定量组织样品中分裂细胞的数目相对于未分裂细胞的数目来测量增殖细胞的比例。增殖细胞的比例可以等于有丝分裂指数。
治疗或预防癌症可能导致细胞增殖面积或区域的大小减小。优选地，治疗后，细胞增殖的面积或区域的大小相对于其治疗前的大小减小至少5％；更优选地，减小至少10％；更优选地，减小至少20％；更优选地，减小至少30％；更优选地，减小至少40％；更优选地，减小至少50％；甚至更优选地，减小至少50％；并且最优选地，减小至少75％。细胞增殖的面积或区域的大小可以通过任何可重复的测量方式来测量。细胞增殖面积或区域的大小可以测量为细胞增殖面积或区域的直径或宽度。
治疗或预防癌症可能导致具有异常外观或形态的细胞的数目或比例减少。优选地，在治疗后，具有异常形态的细胞的数目相对于其治疗前的大小减少至少5％；更优选地，减少至少10％；更优选地，减少至少20％；更优选地，减少至少30％；更优选地，减少至少40％；更优选地，减少至少50％；甚至更优选地，减少至少50％；并且最优选地，减少至少75％。异常的细胞外观或形态可以通过任何可重复的测量方式来测量。异常的细胞形态可以通过显微术来测量，例如使用倒置组织培养显微镜。异常的细胞形态可以表现为核多形性。
剂量和施用
本公开的免疫细胞和可以以多种方式施用，这取决于需要局部治疗还是全身治疗。
通常，施用可以是肠胃外的。
用于过继性细胞疗法的细胞施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238和Rosenberg的美国专利第4,690,915号。
本公开的组合物适合于肠胃外施用。如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括以受试者组织的物理破裂和通过组织中的破裂施用药物组合物为特征的任何施用途径，因此通常导致直接施用到血流中、肌肉中或内脏中。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物施用药物组合物、通过手术切口应用组合物、通过组织穿透性非手术伤口应用组合物等。特别地，肠胃外施用预期包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、瘤内、滑膜内注射或输注；以及肾透析输注技术。在一些实施例中，本公开的组合物的肠胃外施用包含静脉内或动脉内施用。
本公开提供了包含本公开的多种免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
适于肠胃外施用的药物组合物的制剂通常通常包含与药学上可接受的载体(如无菌水或无菌等渗盐水)组合的免疫细胞。此类制剂可以以适合于快速浓注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂型制备、包装或销售，如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳液、糊剂等。此类制剂可以进一步包含一种或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。肠胃外制剂还包括水溶液，其可以含有赋形剂，如盐、碳水化合物和缓冲剂。示例性的肠胃外施用形式包括在无菌水溶液(例如，丙二醇水溶液或葡萄糖水溶液)中的溶液或悬浮液。如果需要，此类剂型可以适当地缓冲。用于肠胃外施用的制剂可以配制为速释和/或缓释。改良释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序释放。
在一些实施例中，包含免疫细胞的配制组合物适于通过注射施用。在一些实施例中，包含免疫细胞的配制组合物适于通过输注施用。
可以方便地以单位剂型存在的本公开的药物组合物可以根据制药工业中熟知的常规技术制备。这些技术包括使免疫细胞与药物载体或赋形剂(如液体载体)缔合的步骤。
水性悬浮液可以进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。
本公开的组合物可以另外含有药物组合物中常规存在的其它辅助组分。因此，例如，组合物可以含有额外的相容的药物活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以含有可用于物理配制本公开的组合物的各种剂型的额外物质，如染料、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加此类物质时，此类物质不应过度干扰本公开的组合物的免疫细胞的生物活性。
制剂或组合物还可以含有一种以上的活性成分，用于用免疫细胞治疗的特定适应症、疾病或病状，其中各自的活性不会相互产生不利影响。这些活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施例中，药物组合物进一步包括其它药物活性剂或药物，如化疗剂。
在一些方面，药物组合物可以采用延时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得组合物的递送发生在待治疗部位致敏之前并且以足够的时间引起该部位致敏。许多类型的释放递送系统是可用的和已知的。这样的系统可以避免组合物的重复施用，从而增加受试者和医生的便利性。
施用可以在整个治疗过程中连续或间歇地以一个剂量进行。可以用治疗医生选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。
在一些实施例中，药物组合物含有治疗或预防癌症有效量的免疫细胞，如治疗有效量或预防有效量。在一些实施例中，治疗或预防功效通过定期评估治疗的受试者来监测。对于在数天、数周或数月内的重复施用，取决于病状，可以重复治疗直到出现期望的癌症体征或症状的抑制。然而，其它给药方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过组合物的单次快速浓注施用或输注或通过组合物的多次快速浓注施用或输注来递送。
细胞或细胞群体可以以一个或多个剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以在一段时间内以多于一个剂量施用。给施用时间在主治医师的判断范围内，并取决于患者的临床病状。
细胞或细胞群体可以从任何来源获得，如血库或供体，或患者本身。
有效量是指提供治疗或预防益处的量。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、并行治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的性质。在一些实施例中，肠胃外施用有效量的细胞或包含这些细胞的组合物。在一些实施例中，施用可以是静脉内施用。在一些实施例中，施用可以通过肿瘤内注射直接进行。
为了本公开的目的，可以使用一种测定来确定待施用于哺乳动物的起始剂量，该测定包含例如在将给定剂量的此类免疫细胞施用于哺乳动物后，比较靶细胞裂解或表达受体的免疫细胞分泌一种或多种细胞因子的程度，在一组哺乳动物中，每个哺乳动物被给予不同剂量的免疫细胞。
在一些实施例中，细胞作为联合治疗的一部分施用，如与另一种治疗干预(如抗体或工程化细胞或受体或试剂，如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序相继施用。在一些实施例中，本公开的免疫细胞与一种或多种额外的治疗剂共同施用或与另一种治疗干预联合施用，同时或以任何顺序相继施用。在一些情况下，免疫细胞与另一种疗法在足够接近的时间内共同施用，使得免疫细胞群体增强一种或多种额外治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施例中，免疫细胞在一种或多种额外治疗剂之前施用。在一些实施例中，免疫细胞在一种或多种额外治疗剂之后施用。
在实施例中，在施用(例如，输注)过继性免疫细胞之前、同时或之后向受试者施用淋巴细胞清除化疗。在实例中，在施用免疫细胞之前对受试者施用淋巴细胞清除化疗。例如，淋巴细胞清除化疗在过继性细胞输注前1至4天(例如，1、2、3或4天)结束。在实施例中，施用多剂量的过继性细胞，例如如本文所述。在实施例中，在施用(例如，输注)本文所述的免疫细胞之前、同时或之后向受试者施用淋巴细胞清除化疗。淋巴细胞清除的实例包括但不限于非清髓性淋巴细胞清除化疗、清髓性淋巴细胞清除化疗、全身照射等。淋巴细胞清除剂的实例包括但不限于抗胸腺细胞球蛋白、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD52抗体、抗CD2抗体、TCRαβ阻断剂、抗CD20抗体、抗CD19抗体、硼替佐米(Bortezomib)、利妥昔单抗(rituximab)、抗CD 154抗体、雷帕霉素(rapamycin)、CD3免疫毒素、氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、美法仑(melphalan)、莫需瘤(Mabthera)、他克莫司(Tacrolimus)、阿法赛特(alefacept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、OKT3、OKT4、OKT8、OKT11、芬戈莫德(fingolimod)、抗CD40抗体、抗BR3抗体、坎帕斯(Campath)-1H、抗CD25抗体、钙调磷酸酶抑制剂、麦考酚酯(mycophenolate)和类固醇(steroids)，其可以单独或组合使用。作为另一实例，淋巴细胞清除方案可以包括施用阿仑单抗、环磷酰胺、贝达莫司汀(benduamustin)、利妥昔单抗、喷司他丁(pentostatin)和/或氟达拉滨。淋巴细胞清除方案可以在一个或多个周期中施用，直到循环免疫细胞减少达到预期结果。在一些实施例中，淋巴细胞清除包含施用特异性靶向并减少或消除受试者体内CD52+细胞的药剂，并修饰免疫细胞以减少或消除CD52表达。
在一些实施例中，在施用(例如输注)过继性免疫细胞之前、同时或之后向受试者施用免疫刺激疗法。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含稳态细胞因子。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含免疫刺激分子。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-9或其功能片段。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-9或其组合。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2或其功能片段。
使用自体细胞进行过继性细胞疗法的方法包括从患者血液中分离免疫细胞，对分离的细胞进行一系列修饰，包括用一种或多种编码本文所述双受体系统的载体转导细胞，并将细胞施用于患者。从患有癌症或血液恶性肿瘤或处于癌症或血液恶性肿瘤风险中的受试者提供免疫细胞需要从患者血液中分离免疫细胞，并且可以通过本领域已知的方法实现，例如通过白细胞分离术。在白细胞分离术中，从受试者中抽取血液，分离外周血单核细胞(PBMC)，并将剩余的血液返回到受试者的循环中。将PBMC作为免疫细胞样品冷冻或冷藏保存，并提供用于进一步的加工步骤，例如本文所述的修饰。
在一些实施例中，本文所述的治疗受试者的方法包含对来自受试者的免疫细胞的修饰，修饰包括一系列修饰，包括富集和/或去除、活化、遗传修饰、扩增、配制和冷藏保存。
本公开提供了富集和/或去除步骤，其可以是例如本领域已知的洗涤和分级分离方法，用于制备用于下游程序(例如本文所述的修饰)的受试者PBMC。例如，但不限于，方法可以包括除去总红细胞和血小板污染物的装置、用于去除单核细胞和分离淋巴细胞的基于大小的细胞分级分离的系统，和/或允许富集特定T细胞亚群(例如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞)的系统。富集步骤后，将从受试者的PMBC中分离出免疫细胞的靶亚群用于进一步处理。本领域技术人员将理解，如本文提供的富集步骤也可以包括任何新发现的方法、装置、试剂或其组合。
本公开提供了活化步骤，其可以是本领域已知的诱导免疫细胞(例如T细胞)的活化的任何方法，活化是其离体扩增所需的。免疫细胞活化可以例如通过在树突细胞存在下培养受试者免疫细胞、在人工抗原呈递细胞(AAPC)存在下培养受试者免疫细胞，或在照射的K562衍生的AAPC存在下培养免疫细胞来实现。用于活化受试者免疫细胞的其它方法可以是，例如，在分离的活化因子和组合物(例如用活化因子官能化的珠、表面或颗粒)存在下培养免疫细胞。活化因子可以包括例如抗体，例如抗CD3和/或抗CD28抗体。活化因子还可以是例如细胞因子，例如白介素(IL)-2或IL-21。活化因子还可以是共刺激分子，例如CD40、CD40L、CD70、CD80、CD83、CD86、CD137L、ICOSL、GITRL和CD134L。本领域技术人员将理解，本文提供的活化因子也可以包括任何新发现的可以活化免疫细胞的活化因子、试剂、组合物或其组合。
本公开提供了用于修饰受试者免疫细胞的遗传修饰步骤。在一些实施例中，遗传修饰包含用包含与B2M或HLA-A互补的本文所述shRNA的载体转导免疫细胞。在一些实施例中，遗传修饰包含使用CRISPR/Cas介导的基因组工程修饰免疫细胞的基因组以诱导B2M或HLA-A中的突变。在一些实施例中，该方法包含用一种或多种编码活化剂和抑制性受体的载体转导免疫细胞，从而产生表达活化剂和抑制性受体的免疫细胞。
本公开提供了遗传修饰的受试者免疫细胞的扩增步骤。遗传修饰的受试者免疫细胞可以在本领域已知的任何免疫细胞扩增系统中扩增，以生成用于施用的治疗剂量的免疫细胞。例如，用于包含控制器泵的系统中的生物反应器袋和允许自动进料和废物去除的探针可用于免疫细胞扩增。在底部具有气体渗透膜的细胞培养瓶可用于免疫细胞扩增。本文提供的扩增步骤包括本领域已知的能够扩增用于临床用途的免疫细胞的任何此类系统。免疫细胞在培养系统中在专门配制用于扩增的培养基中扩增。也可以通过在如本文所述的活化因子的存在下培养本公开的免疫细胞来促进扩增。本领域技术人员将理解，本文提供的扩增步骤也可以包括任何新发现的可用于扩增免疫细胞的培养系统、培养基或活化因子。
本公开提供了用于扩增的遗传修饰的受试免疫细胞的配制和冷藏保存步骤。提供的配制步骤包括，例如，洗去用于本文所述的治疗方法的免疫细胞的制备和扩增的过量组分。本领域已知的与免疫细胞相容的任何药学上可接受的配制介质或洗涤缓冲液可用于洗涤、稀释/浓缩免疫细胞，并制备用于施用的剂量。配制介质对于免疫细胞的施用可以是可接受的，例如用于静脉内输注的晶体溶液。
冷藏保存可以任选地用于长期储存免疫细胞。可以使用本领域已知的方法实现冷藏保存，包括例如在含有冷藏保存组分的冷藏保存培养基中保存细胞。冷藏保存组分可以包括例如二甲亚砜或甘油。保存在冷藏保存培养基中的免疫细胞可以通过将保存温度降低至-80℃至-196℃进行冷藏保存。
在一些实施例中，治疗方法包含确定受试者的HLA种系类型。在一些实施例中，在骨髓中确定HLA种系类型。
在一些实施例中，治疗方法包含确定CEA的表达水平。在一些实施例中，在来自受试者的肿瘤组织样品中确定CEA的表达水平。在一些实施例中，使用下一代测序确定CEA的表达水平。在一些实施例中，使用RNA测序确定CEA的表达水平。在一些实施例中，使免疫组织化学确定CEA的水平。
在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*02抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*02杂合型并且具有HLA-A*02丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*01抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*01杂合型并且具有HLA-A*01丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*03的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*03杂合型并且具有HLA-A*03丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*07抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*07杂合型并且具有HLA-A*07丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-C*07抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-C*07杂合型并且具有HLA-C*07丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含在有需要的受试者中施用治疗有效剂量的包含HLA-B*07抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-B*07杂合型并且具有HLA-B*07丢失的癌细胞。
在各种实施例中，本公开提供了治疗患有表达CEA并且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者的方法；和/或治疗患有表达CEA并且已经丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02成年患者。
在一些实施例中，施用治疗有效剂量的本文所述的免疫细胞。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过静脉内注射施用。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过腹膜内注射施用。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞、约1×106个细胞、约2×106个细胞、约3×106个细胞、4×106个细胞、约5×106个细胞、约6×106个细胞、约7×106个细胞、约8×106个细胞、约9×106个细胞、约1×107、约2×107、约3×107、约4×107、约5×107、约6×107、约7×107、约8×107、约9×107、约1×108个细胞、约2×108个细胞、约3×108个细胞、约4×108个细胞、约5×108个细胞、约6×108个细胞、约7×108个细胞、约8×108个细胞、约9×108个细胞、约1×109个细胞、约2×109个细胞、约3×109个细胞、约3×109个细胞、约4×109个细胞、约5×109个细胞、约5×109个细胞、约6×109个细胞、约7×109个细胞、约8×109个细胞、约9×109个细胞、约1×1010个细胞、约2×1010个细胞、约3×1010个细胞、约4×1010个细胞、约5×1010个细胞、约6×1010个细胞、约7×1010个细胞、约8×1010个细胞，或约9×1010个细胞。
在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约9×1010个细胞、约1×106个细胞至约5×1010个细胞、约2×106个细胞至约5×109个细胞、约3×106个细胞至约5×109个细胞、约4×106个细胞至约3×109个细胞、约5×106个细胞至约2×109个细胞、约6×106个细胞至约1×109个细胞、0.5×106个细胞至约6×109个细胞、约1×106个细胞至约5×109个细胞、约2×106个细胞至约5×109个细胞、约3×106个细胞至约4×109个细胞、约4×106个细胞至约3×109个细胞、约5×106个细胞至约2×109个细胞、约6×106个细胞至约1×109个细胞、0.5×106个细胞至约6×108个细胞、约1×106个细胞至约5×108个细胞、约2×106个细胞至约5×108个细胞、约3×106个细胞至约4×108个细胞、约4×106个细胞至约3×108个细胞、约5×106个细胞至约2×108个细胞、约6×106个细胞至约1×108个细胞、约7×106个细胞至约9×108个细胞、约8×106个细胞至约8×108个细胞、约9×106个细胞至约7×108个细胞、约1×107个细胞至约6×108个细胞、约2×107个细胞至约5×108个细胞、约7×106个细胞至约9×107个细胞、约8×106个细胞至约8×107个细胞、约9×106个细胞至约7×107个细胞、约1×107个细胞至约6×107个细胞，或约2×107个细胞至约5×107个细胞。
在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×105个细胞至约9×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约1×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约5×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约1×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约6×108个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约9×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞至约1×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞至约5×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞至约1×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞至约6×108个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞至约9×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞至约1×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞至约5×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞至约1×109个细胞。在治疗剂量中提及的术语“约”可以是例如±0.5×106个细胞、±0.5×107个细胞或±0.5×108个细胞。
试剂盒和制品
本公开提供了包含编码本文所述的受体的多核苷酸和载体的试剂盒和制品，以及包含本文所述的受体的免疫细胞。在一些实施例中，试剂盒包含制品，如小瓶、注射器和使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含多核苷酸或载体，其包含编码本公开的一种或多种受体的序列。
在一些实施例中，试剂盒包含多种免疫细胞，该免疫细胞包含本文所述的第一受体和第二受体。在一些实施例中，多种免疫细胞包含多个T细胞。
在一些实施例中，试剂盒进一步包含使用说明书。
列举的实施例
可以参考以下说明性列举的实施例来理解本公开：
1.一种应答癌细胞中杂合性丢失的免疫细胞，其包含：(a)第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对选自以下的靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域：(i)癌细胞特异性抗原或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或(ii)CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；和(b)第二受体，任选地为抑制性受体，其包含对选自TNFRSF11A、ACHRB、ITGAE、TRPV1、SREC、CXCL16、COLEC12和APCDD1或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含多态性。
2.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是癌细胞特异性抗原。
3.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。
4.根据实施例2或实施例3所述的免疫细胞，其中所述癌细胞是结肠直肠癌细胞。
5.根据实施例2或实施例3所述的免疫细胞，其中所述癌细胞是胰腺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、肺腺癌细胞、头颈癌细胞、弥漫性大B细胞癌细胞或急性髓性白血病癌细胞。
6.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述癌细胞表达CEA。
7.根据实施例6所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是CEA。
8.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的CEA的肽抗原。
9.根据实施例1至8中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原由靶细胞表达。
10.根据实施例1至9中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原不由所述靶细胞表达。
11.根据实施例1至9中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原由健康细胞表达。
12.根据实施例1至11中任一项所述的免疫细胞，其中所述健康细胞表达所述靶抗原和所述非靶抗原两者。
13.根据实施例1至12中任一项所述的免疫细胞，其中在所述靶细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。
14.根据实施例13所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
15.根据实施例14所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。
16.根据实施例9至15中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶细胞包含结肠直肠癌细胞、胰腺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、肺腺癌细胞、头颈癌细胞、弥漫性大B细胞癌细胞或急性髓性白血病癌细胞。
17.根据实施例1至16中任一项所述的免疫细胞，其中所述CEA包含与SEQ ID NO:1共享至少95％同一性的序列。
18.根据实施例1至16中任一项所述的免疫细胞，其中CEA的所述肽抗原是IMIGVLVGV(SEQ ID NO:2)。
19.根据实施例1至18中任一项所述的免疫细胞，其中所述MHC-I包含人白细胞抗原A*02等位基因(HLA-A*02)。
20.根据实施例1至19中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是T细胞受体(TCR)。
21.根据实施例1至19中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。
22.根据实施例20或21所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)或β链可变结构域(Vβ)。
23.根据实施例20或21所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
24.根据实施例22或23所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自SEQ ID NO:3-12的补体决定区(CDR)。
25.根据实施例23所述的免疫细胞，其中：(a)所述TCRα链可变结构域包含TSITA(SEQ ID NO:3)的CDR-1、IRSNER(SEQ ID NO:4)的CDR-2和包含ATDLTSGGNYK(SEQ ID NO:5)、ATDFTSGGNYK(SEQ ID NO:6)、ATDLTTGGNYK(SEQ ID NO:7)或ATDFTTGGNYK(SEQ ID NO:8)的CDR-3；并且(b)所述TCRβ链可变结构域包含KGHPV(SEQ ID NO:9)的CDR-1、FQNQEV(SEQID NO:10)的CDR-2和ASSLGLGDYEQ(SEQ ID NO:11)或ASSLGTGDYEQ(SEQ ID NO:12)的CDR-3。
根据实施例23所述的免疫细胞，其中：(a)所述TCRα链可变结构域包含SEQ ID NO:9的CDR-1、SEQ ID NO:10的CDR-2和SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的CDR-3；并且(b)所述TCRβ链可变结构域包含SEQ ID NO:3的CDR-1、SEQ ID NO:4的CDR-2和包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的CDR-3。
根据实施例1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原是与SEQ ID NO:13共享至少95％同一性的TNFRSF11A抗原，并且所述多态性选自：(a)SEQ ID NO:13的第192位处的A或V，或(b)SEQ ID NO:13的第141位处的H或Y。
根据实施例1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原是与SEQ ID NO:14共享至少95％同一性的ITGAE抗原，并且所述多态性选自(a)SEQ ID NO:14的第950位处的R或W；或(b)SEQ ID NO:14的第1019位处的V、A或G。
29.一种应答癌细胞中杂合性丢失的免疫细胞，其包含：(a)第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原特异性的细胞外配体结合结构域；以及(b)第二受体，任选地为抑制性受体，其包含对非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含HLA-A*02。
30.根据实施例29所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域不识别包含HLA-A*02的MHC-I复合物中的CEA肽抗原。
31.根据实施例29或30所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)，或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
32.根据实施例29或30所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含scFv。
33.根据实施例32所述的免疫细胞，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:64-70中任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
34.根据实施例32所述的免疫细胞，其中所述scFv包含SEQ ID NO:64-70中任一个的序列。
35.根据实施例29至33所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:55-63组成的组的CDR。
36.根据实施例29至35中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)，或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
37.根据实施例29至35中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含scFv。
38.根据实施例37所述的免疫细胞，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:91-102中任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
39.根据实施例37所述的免疫细胞，其中所述scFv包含SEQ ID NO:91-102中任一个的序列。
40.根据实施例29至39中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:103-114组成的组的CDR。
41.根据实施例29至40中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。
42.根据实施例41所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域包含与SEQ IDNO:126至少95％相同的序列。
43.根据实施例29至42中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。
44.根据实施例43所述的免疫细胞，其中所述LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:135至少95％相同的序列。
45.根据实施例29至44中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。
46.根据实施例45所述的免疫细胞，其中所述LILRB1铰链结构域包含与SEQ IDNO:134、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128至少95％相同的序列。
47.根据实施例29至46中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域或其功能变体。
48.根据实施例47所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:130或与SEQ ID NO:130至少95％相同的序列。
49.根据实施例29至48中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞是结肠直肠癌细胞。
50.根据实施例29至48中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞是胰腺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、肺腺癌细胞、头颈癌细胞、弥漫性大B细胞癌细胞或急性髓性白血病癌细胞。
51.根据实施例29至50中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原由靶细胞表达。
52.根据实施例29至51中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原不由所述靶细胞表达。
53.根据实施例51或52所述的免疫细胞，其中所述靶细胞是结肠直肠癌细胞、胰腺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、肺腺癌细胞、头颈癌细胞、弥漫性大B细胞癌细胞或急性髓性白血病癌细胞。
54.根据实施例29至53中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原由健康细胞表达。
55.根据实施例29至54中任一项所述的免疫细胞，其中所述健康细胞表达所述靶抗原和所述非靶抗原两者。
56.根据实施例29至55中任一项所述的免疫细胞，其中在所述靶细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。
57.根据实施例56所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
58.根据实施例57所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。
59.根据实施例29至58中任一项所述的免疫细胞，其中所述CEA包含与SEQ ID NO:1共享至少95％同一性的序列。
60.根据实施例29至59中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。
61.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据实施例1至60中任一项所述的免疫细胞。
62.根据实施例61所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
63.根据实施例61或62所述的药物组合物，其用作治疗癌症的药物。
64.一种多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：(a)第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对选自以下的靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域：(i)癌细胞特异性抗原或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或(ii)CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；和(b)第二受体，任选地为抑制性受体，其包含对选自TNFRSF11A、ACHRB、ITGAE、TRPV1、SREC、CXCL16、COLEC12和APCDD1或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含多态性。
65.一种多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：(a)第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原特异性的细胞外配体结合结构域；以及(b)第二受体，任选地为抑制性受体，其包含对非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含HLA-A*02。
66.一种载体，其包含根据实施例64或65所述的一种或多种多核苷酸。
67.一种杀死受试者体内多种癌细胞和/或治疗癌症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的根据实施例1至60中任一项所述的免疫细胞或根据实施例61至63中任一项所述的药物组合物。
68.根据实施例67所述的方法，其中多种癌细胞表达所述靶抗原。
69.根据实施例67或68所述的方法，其中多种癌细胞不表达所述非靶抗原。
70.根据实施例69所述的方法，其中所述多种癌细胞由于杂合性丢失(LOH)而丢失所述非靶抗原。
71.一种治疗受试者体内癌症的方法，其包含：(a)确定所述受试者的正常细胞和多种癌细胞在选自由rs1716(ITGAE R950W)、rs2976230(ITGAE V1019A/V1019G)、rs1805034(TNFRSF11A V192A)和rs35211496(TNFRSF11A H141Y)组成的组的多态性基因座处的基因型；(b)确定多种癌细胞中CEACAM5的表达；以及(c)如果所述正常细胞对于所述多态性基因座是杂合的并且所述多种癌细胞对于所述多态性基因座是半合子的，并且所述多种癌细胞是CEA阳性的，则向所述受试者施用多种免疫细胞，其中所述多种免疫细胞包含：(i)第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原特异性的细胞外配体结合结构域；以及(ii)第二受体，任选地为抑制性受体，其包含对选自TNFRSF11A、ACHRB、ITGAE、TRPV1和SREC或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含多态性。
72.一种治疗受试者体内癌症的方法，其包含：(a)确定所述受试者的正常细胞和多种癌细胞的HLA-A基因型或表达；(b)确定多种癌细胞中的CEA的表达；以及(c)如果所述正常细胞表达HLA-A*02并且所述多种癌细胞不表达HLA-A*02，并且所述多种癌细胞是CEA阳性的，则向所述受试者施用多种免疫细胞，其中所述多种免疫细胞包含：(i)第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对CEA细胞粘附分子5(CEA)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原特异性的细胞外配体结合结构域；以及(ii)第二受体，任选地为抑制性受体，其包含对非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含HLA-A*02。
73.一种制备多种免疫细胞的方法，其包含：(a)提供多种免疫细胞，以及(b)用根据实施例64或65所述的多核苷酸系统或根据实施例66所述的载体转化所述多种免疫细胞。
74.一种试剂盒，其包含根据实施例1至60中任一项所述的免疫细胞或根据实施例61至63中任一项所述的药物组合物。
75.根据实施例74所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书。
76.一种TCR，其包含：(1)TCRα链，其包含或基本上由SEQ ID NO:16-31中任一个的氨基酸1－270或与其至少95％相同的序列组成；和(2)TCRβ链，其包含或基本上由SEQ IDNO:16-31中任一个的氨基酸293-598或与其至少95％相同的序列组成
77.一种TCR，其包含：(a)包含SEQ ID NO:16的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQID NO:16的氨基酸293-598的TCRβ链；(b)包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:17的氨基酸293-598的TCRβ链；(c)包含SEQ ID NO:18的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:18的氨基酸293-598的TCRβ链；(d)包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:19的氨基酸293-598的TCRβ链；(e)包含SEQ ID NO:20的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:20的氨基酸293-598的TCRβ链；(f)包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:21的氨基酸293-598的TCRβ链；(g)包含SEQ IDNO:22的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:22的氨基酸293-598的TCRβ链；(h)包含SEQ ID NO:23的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:23的氨基酸293-598的TCRβ链；(i)包含SEQ ID NO:24的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:24的氨基酸293-598的TCRβ链；(j)包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:25的氨基酸293-598的TCRβ链；(k)包含SEQ ID NO:26的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:26的氨基酸293-598的TCRβ链；(l)包含SEQ ID NO:27的1氨基酸-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:27的氨基酸293-598的TCRβ链；(m)包含SEQ ID NO:28的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ IDNO:28的氨基酸293-598的TCRβ链；(n)包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:29的氨基酸293-598的TCRβ链；(o)包含SEQ ID NO:30的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:30的氨基酸293-598的TCRβ链；或(p)包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-270的TCRα链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸293-598的TCRβ链。
78.一种免疫细胞，其包含根据实施例76或77所述的TCR。
79.根据实施例78所述的免疫细胞，其进一步包含第二受体，任选地为抑制性受体，所述第二受体包含对选自TNFRSF11A、ACHRB、ITGAE、TRPV1、SREC、CXCL16、COLEC12和APCDD1或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含多态性。
实例
以下实例仅用于说明而不限制本发明的范围。在整个实例中，术语“阻断剂抗原”用于描述非靶抗原的实施例。
实例1：TNFRS11A作为阻断剂的鉴定
搜索GISTIC TCGA数据库以鉴定结肠直肠癌中由于杂合性丢失而丢失的区域。Chr18q:35,237,593-37,208,54被鉴定为结肠直肠癌中由于杂合性丢失而最频繁丢失的区域。对Chr.18q上编码的表面蛋白进行过滤，以筛选由正常结肠细胞表达的表面蛋白。
使用以下方法在这些表面蛋白的细胞外结构域中搜索非同义SNPS：
-下载了常见变体的NCBI dbSNP数据库(注意，对于NCBI，“常见”类别是基于种系来源并且在至少一个主要群体中具有>＝0.01的次要等位基因频率(MAF)，其中至少两个不相关的个体具有次要等位基因)
-该数据库仅分析了18号染色体和17号染色体的变体
-除去MAF<0.1的变体
-进行VEP(变体效应预测子)，并且仅保留在蛋白质编码区中的错义变体
-除去以下基因：
ο无跨膜结构域的基因
ο位于高尔基体、ER、线粒体、核内体、核膜的基因
ο在结肠中不高度表达的基因(GTEx表达水平<5TPM)
ο扩增而不是缺失的基因
-在TCGA拷贝数门户网站中检查候选基因的杂合性丢失
-在Ensembl基因组浏览器中检查候选基因的其它变体
ο如果存在变体，检查变异的位置(它是否在细胞外结构域中？)
过滤流水线的总结如下表15所示。
表15.鉴定17和18号染色体上的候选阻断剂靶。
CNA：拷贝数扩增
TPM：转录物/千碱基百万(基因型-组织表达，GTEx项目，gtexportal.org/home)
五个候选基因通过所有筛选。这五个基因的总结如下表16至19所示。
表16.表达。
表17.位置、特征和变化
MS：错义变体
Mod.：中度
PC：蛋白质编码
Pos.：位置
(*)表示具有所示氨基酸和密码子的蛋白质位置
MAF：次要等位基因频率
表18.拷贝数
条目名称 缺失频率，总体 Uniprot ECD残基范围
TNR11_HUMAN 0.6786 30-212
ACHB_HUMAN 0.5607 24-244
ITAE_HUMAN 0.5248 19-1124
TRPV1_HUMAN 0.5231 455-471
SREC_HUMAN 0.5162 20-421
表18中的结果来自TCGA拷贝数门户网站。
检查晶体结构以验证细胞外结构域SNP对抗体的可及性。
使用这些方法，TNFRS11A(RANK)被鉴定为与CEA TCR或CAR活化剂配对的阻断剂受体的靶。TNFRSF11A(RANK)受体在广泛的正常组织中表达，包括肠道。肠道表达包括在结肠中的表达，其中正常TNFRSF11A结肠表达的中位数是23个转录物/细胞。结肠中最大CRC CEA表达为8,780转录物/细胞。TNFRSF11A也在食道中表达。正常食道TNFRSF11A表达的中位数为2个转录物/细胞。食道中的最大EsCa CEA表达是6,208个转录物/细胞。TNFRSF11A编码结合RANKL(狄诺塞麦(denosumab)的靶)的616-残基蛋白。它包括28个氨基酸的信号肽、184个氨基酸的细胞外结构域、21个氨基酸的跨膜结构域和383个氨基酸的细胞内结构域。TNFRSF11A含有两种常见的非同义变体，MAF为0.4的rs1805034(V192A)和MAF约为0.2的rs35211496(H141Y)。
实例2：CEA CAR介导的Jurkat细胞活化被HLA-A*2抑制性受体阻断
细胞培养
编码NFAT荧光素酶报告基因的Jurkat细胞获自BPS Bioscience公司。在培养中，将Jurkat细胞维持在补充有10％FBS、1％Pen/Strep和0.4mg/mL G418/遗传霉素的RPMI培养基中。HeLa细胞按照ATCC的建议进行维持。
Jurkat细胞转染
根据制造商的方案，使用Jurkat细胞的设置通过100uL形式的4D-NucleofactorTM(龙沙公司(Lonza))瞬时转染Jurkat细胞。每1e6细胞用1至3ug活化剂构建体和1至3ug阻断剂构建体或空载体进行共转染，并在补充有20％热灭活FBS和0.1％Pen/Strep的RPMI培养基中回收。
Jurkat-NFAT-荧光素酶活化研究
将表达HLA-A*02、CEA或两者的HeLa细胞与Jurkat细胞共培养，并使用NFAT-荧光素酶报告系统测定Jurkat细胞活化。测定具有HLA-A-A*02抗原结合结构域和LIR-1ICD(C1765)的阻断剂受体阻断表达具有CEA scFv(CT618)的活化剂CAR的Jurkat细胞的活化的能力。用编码HLA-A*02+和/或CEA+的多核苷酸转导HeLa细胞以生成HLA-A*02+/CEA-HeLa细胞、HLA-A*02-/CEA+HeLa细胞和CEA+/HLA-A*02+HeLa细胞以用作Jurkat细胞活化测定的靶细胞。将这些HeLa细胞与Jurkat细胞共培养，并使用NFAT荧光素酶报告系统测定Jurkat细胞活化。结果如图10所示。如图10所示，当Jurkat细胞与CEA+/HLA-A*02+靶细胞一起培养时，HLA-A*02LIR1阻断剂可以抑制CEA scFv CAR对Jurkat细胞的活化。
实例3：额外阻断剂靶抗原的鉴定
使用与实例1中用于鉴定TNFRSF11A的生物信息学流水线相似的生物信息学流水线来鉴定额外的候选阻断剂靶。在人类基因组中搜索在结直肠癌中具有高杂合性丢失(大于0.5)的细胞外结构域中具有常见非同义变体的基因。在dbSNP中搜索具有非同义变体的基因，dbSNP是一种单核苷酸多态性数据库，其还包括小规模插入和缺失以及发表、群体频率、分子后果和基因组作图信息。常见变异被定义为在至少一个主要群体中具有大于或等于0.01的次要等位基因频率(MAF)并且在NCBI中具有至少两个不相关的具有次要等位基因的个体。大于或等于0.1的MAF作为常见变异的标准。焦点集中在染色体17和18上，因为这些染色体在结肠直肠癌中具有高LOH。如上所述，针对膜蛋白、结肠表达和细胞外结构域中常见的非同义变体筛选基因。图11示出了搜索过程的概要。
本分析中使用的其它数据库包括以下：Uniprot(通用蛋白质资源)，其是由EMBL-EBI、SIB和PIR托管的用于蛋白质序列和注释数据的资源。GTEx(基因型-组织表达)用作组织特异性基因表达和调节的公共资源。它含有来自近1000名个体的54个非患病组织部位的样品。TCGA(癌症基因组图谱)用作超过20,000种原发性癌症和跨越33种癌症类型的匹配正常样品的资源。TCGA-COADREAD数据集是结肠腺癌和直肠腺癌数据集。CCLE(癌症细胞系百科全书)含有关于57种结肠直肠癌(CRC)细胞系的信息。
RNASeqDB是来自GTEx和TCGA的处理数据的数据库，使用相同的流水线，其允许来自纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)的比较研究。分析来自GTEx的372份TCGA-COADREAD样品和339份正常结肠样品。
使用这些方法鉴定COLEC12、CXCL16和APCDD1作为潜在的阻断剂靶。表19总结了这些基因在结肠直肠癌中的表达数据。来自UCSC Xena浏览器(用于TCGA)和CCLE样品的表达数据。
表19.表达
表20总结了变体和次要等位基因频率。
表20.位置、特征和变化
表21.各种癌症中的LOH频率
实例4：对阻断剂靶抗原特异性的抗原结合结构域的鉴定
如果CDR序列未知，则对候选阻断剂抗原的公开可用抗体进行测序。如果没有针对候选阻断剂靶的抗体可用，则通过用纯化的蛋白质(例如，COLEC12、CXCL16、TNFRS11A和实例中描述的其他靶)免疫小鼠、大鼠或兔来生成这些抗体。来自免疫动物的血清用于筛选与阻断剂靶结合的mAb。使用huTARG系统也生成针对阻断剂靶的抗体。然后分离具有所需特异性的抗体并测序以确定CDR序列。
使用标准分子生物学技术，从抗体到阻断剂靶的CDR序列被用于生成scFv。使用标准分子生物学技术将候选scFv融合到抑制性受体铰链或跨膜结构域以生成抑制性受体。候选scFv也融合到活化剂受体铰链或跨膜结构域(例如，CAR)以生成全长活化剂受体，用作scFv结合靶抗原的阳性对照。候选scFv在抑制性受体环境中工作的能力在Jurkat细胞中使用NFAT-荧光素酶报告基因测定法进行测定。
实例5：实例6至11的方法
细胞系生成
按照供应商的说明培养靶细胞系。如表25所示的用于构建CEA(-)HLA-A*02(-)细胞系的遗传修饰使用CRIPSR/Cas9。引导RNA购自Synthego公司和/或IDT(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies))，并且靶向序列列于表22中。为了形成RNP复合物，在电穿孔之前将S.p.HiFi Cas9蛋白(IDT)与sgRNA以1:3摩尔比混合，使用4D核转染仪(龙沙公司)针对每种细胞系定制设置。
为了生成CEA(+)HLA-A*02(+)和CEA(+)HLA-A*02(-)HeLa细胞系，将含有或不含有编码HLA-A*02的质粒的编码CEA的pLenti质粒转染到HeLa细胞中。通过FACS富集表达CEA和/或HLA-A*02的稳定库，然后扩增。
为了建立HLA-A*02(+)K562和Colo668系，转导编码HLA-A*02重链的慢病毒以产生稳定库。为了生成CEA(+)靶细胞，除Colo668和H508外，所有CEA(-)靶细胞都用CEA mRNA(见下文)使用4D核转染仪转染，并在转染后1至3天内进行测定。编码海肾荧光素酶和RFP(顺式)的慢病毒购自Biosettia公司并转导以建立表达RFP的靶细胞的稳定库。通过FACS使用HLA-A*02抗体(BV421，BioLegend公司，目录号343326)或CEA抗体(R&D系统公司，MAB41281)富集靶敲除或过表达细胞系的靶阴性或靶阳性库。通过FACS选择靶细胞系的RFP表达库。
通过慢病毒转导，含有或不含有A*02阻断剂的CEA CAR在萤光素酶报告基因Jurkat细胞中稳定表达。
体外mRNA转录
在含有40mM Tris-HCL、10mM二硫苏糖醇、2mM亚精胺、0.002％Triton X-100、27mM乙酸镁、5mM CleanCap Cap 1AG三聚体(TriLink)，以及各5mM的ATP、CTP、GTP和假尿苷三磷酸(NEB)的25ul 1X反应缓冲液种合成mRNA。反应在37℃下用8U/μL T7 RNA聚合酶(NEB，M0460T)、0.002U/μL无机焦磷酸酶(NEB，M2403L)、1U/μL鼠RNase抑制剂(NEB，M0314L)和0.025μg/μL线性化T7模板的最终浓度进行2小时。在反应结束时在37℃下在1X DNase I缓冲液中添加0.4U/μL DNase I(NEB，M0303L)持续15分钟以除去模板。用大肠杆菌(E.coli)poly(A)聚合酶(NEB，M0276)根据制造商的方案进行RNA的poly(A)加尾，并通过供应商的清除试剂盒(NEB，T2040L)纯化RNA。将RNA用0.2U/μg南极磷酸酶(NEB，M0289L)在1倍南极磷酸酶缓冲液中处理1小时并用(NEB，T2040L)再纯化。通过纳米滴测量RNA浓度，并在1％琼脂糖凝胶上检测。
用于探针结合和受体表达的流式细胞术
使用生物素化蛋白L(赛默飞世尔(ThermoFisher)#29997)，随后荧光标记的链霉抗生物素蛋白(对于CAR)或荧光标记的抗鼠TRBV抗体(对于TCR，Biolegend公司Cl:H57-597)，通过流式细胞术评估CAR和TCR的表达。通过用生物素化的pMHC探针染色表达Tmod的Jurkat细胞来测定阻断剂-抗原结合，生物素化的pMHC探针是四聚的并且用缀合至适当荧光染料(Biolegend公司)的链霉抗生物素蛋白预标记。在4℃染色后，使用FACS Canto II流式细胞仪(BD生物科学公司)测定中值荧光强度(MFI)。
Jurkat细胞功能测定
在本研究中使用通过mRNA转染天然地、重组地或瞬时地表达活化剂和阻断剂抗原的靶细胞。如果使用mRNA转染，则每对靶细胞(HLA-A*02(-)和HLA-A*02(+))使用具有可变量CEA mRNA的4DNucleofactor(龙沙公司)进行电穿孔，从9倍稀释系列中的2μg mRNA开始，总共6至16个点。将电穿孔的细胞或天然/稳定表达靶抗原的细胞在正常组织培养条件下以10,000个细胞/孔的密度接种在384孔板(康宁公司(Corning)，目录号3570)中并生长18至20小时。将12,000个野生型或表达CEA CAR或CEA Tmod构建体的Jurkat细胞添加到靶细胞孔中并共培养6小时，然后添加荧光素底物以使用Tecan Infinite M1000测量荧光素酶信号。
为了定量CEA表达，将来自每个CEA mRNA滴定点的靶细胞接种在96孔板(康宁公司，目录号3610)中并生长18至20小时，然后收集细胞。根据制造商的方案使用CEA抗体(R&D系统公司，MAB41281)和QIFIKIT(安捷伦科技公司(Agilent)，K007811-8)定量CEA表达以确定表面CEA分子数。生成细胞表面数目对mRNA的标准曲线(见下文)。
EC50和IC50分子/细胞值向TPM的转化
为了生成蛋白质分子/细胞对TPM标准曲线，在多种细胞系上CEA或HLA-A*02的表面表达如上所述在内部测定或取自先前公布的结果。TPM值来自DepMap门户网站(depmap.org/portal/)。通过拟合分子/细胞＝k*TPM确定斜率(k)，并用于将分子/细胞中的EC50和IC50转化为TPM，以便与组织和细胞系抗原表达值进行比较。
原代T细胞生成和表征
的机构审查委员会(IRB)批准了原代T细胞和供体收集方案的知情同意书。/>均遵循HIPAA合规性和批准的方案(www.allcells.com/cell-tissue-procurement/donor-facilities/)。从购自/>的Leukopak纯化PBMC。除非另有说明，LymphoONETM培养基(宝生物(Takara)WK552)补充有1％人AB血清(GeminiBio公司100-512)。使人PBMC在LymphoONETM中生长，并按照制造商的指导方针(1:100稀释)用TransActTM(美天旎公司130-111-160)补充24小时，然后用单独的CEA CAR和编码CEA Tmod的慢病毒转导。在转导后24小时，将补充有IL-2(300IU/ml)的另外的LymphoONETM添加到转导的细胞中，该细胞在转移到24孔-Rex板(威尔逊-沃尔夫公司(Wilson Wolf)80192M)之前培养3天。每48小时添加新鲜的IL-2(300IU/ml)，在G-Rex板中扩增期间每7天更换培养基。如上所述，通过流式细胞术证实了原代细胞中转导的CAR或Tmod组分的表达和抗原结合。
对于体内研究，如上所述使用G-Rex10(威尔逊-沃尔夫公司80040S)或G-Rex100(威尔逊-沃尔夫公司80500)生成CEA CAR和CEA Tmod以适应在第3天开始的更大量的细胞。对T细胞进行计数，并且从第3天开始每隔一天更换培养基。在第9天富集表达CAR和Tmod的细胞。
为了富集表达CAR或Tmod双受体的群体，根据制造商的方案，将细胞用蛋白质L-生物素(赛默科技公司(Thermo Scientific)目录号29997)链霉抗生物素蛋白-PE或探头-生物素/链霉抗生物素蛋白-PE标记，随后用抗PE微珠(美天旎公司130-048-801)标记，并且随后使用Pro分离器(美天旎公司)富集。富集的细胞与收获前一样在G-Rex板中生长。
原代T细胞功能测定(急性)
表达GFP或RFP的靶细胞系对(HLA-A*02(-)和HLA-A*02(+))使用4D核转染仪以规定的量用CEA mRNA进行电穿孔，并如上所述进行培养，除了384孔PDL包被的板(葛莱纳(Greiner bio-one)，目录号781091)用于细胞成像。如果需要，将相同数目的细胞平行接种在另一个384孔板(康宁公司，目录号3570)中以测定细胞密度。第二天，按照制造商的说明通过细胞滴定辉光(普洛麦格(Promega)，G7570)测量靶细胞接种密度。在共培养前，通过流式细胞术测定CEA CAR阳性和CEA CAR/A*02阻断剂双阳性T细胞的百分比。如果需要，将未转导的T细胞与CEA CAR阳性库混合，以使阳性CEA CAR细胞的百分比与双阳性群体相匹配。靶细胞和T细胞共培养长达48小时。在共培养期间，在IncuCyte S3或微共焦成像仪(美谷分子仪器公司(Molecule Device Corporation))上用4倍物镜监测全孔萤光信号，并随时间记录总萤光面积或强度。与不含T细胞或与未转导的T细胞共培养的孔相比，CAR或Tmod共培养物中荧光信号的减少允许比较CEA活化剂和CEA Tmod构建体的细胞毒性。使用如上所述的QIFIKIT测定靶细胞上的CEA表达。
当使用混合靶细胞时，将具有GFP-海肾萤光素酶的正常CEA(+)A*02(+)靶细胞和用RFP-萤火虫萤光素酶工程化的肿瘤CEA(+)A*02(-)靶细胞以1:1的比例混合，并如上所述与富集的原代T细胞共培养。通过监测IncuCyte S3上的GFP和RFP信号损失来测定细胞毒性。
可逆性细胞毒性测定
将靶细胞系与T细胞在LymphoneONETM加1％人血清和1X P/S中共培养。简言之，将靶细胞以500,000个细胞/孔接种在6孔板中，用于系列转移实验的批量共培养。在384孔成像板中，以5,000个细胞/孔接种靶细胞并孵育过夜。第二天，将T细胞以3:1的标称效应物与靶(E:T)比率添加到共培养孔中(在6孔格式中1,500,000个细胞/孔；384孔格式中15,000个细胞/孔)。在S3平台(赛多利斯公司(Sartorius))上进行孵育/成像，在48小时内每2小时成像一次(跨越每轮连续共培养)；将6孔板在37℃下离线孵育。在每个48小时周期结束时，将T细胞与靶细胞分离并从6孔共培养物中收集；对这些T细胞进行计数并以均匀密度重悬于新鲜培养基中，以转移至(i)用于所示系列中的下一共培养物的大量靶细胞的新孔，和(ii)用于收集系列中的下一共培养物的数据的一组新的成像孔(384孔格式)。在第二轮中，将12孔板用于含有750,000个T细胞和250,000个靶细胞的批量共培养(E:T比率在整个系列中保持恒定；在整个研究中使用384孔格式的成像板共培养物，以15,000:5,000的标称E:T比率)。结果是一系列共培养，其中富集的原代T细胞与正常(CEA(+)HLA-A*02(+))然后与肿瘤(CEA(+)HLA-A*02(-))靶细胞交替培养，反之亦然。数据表示为特异性杀伤(％)，反映了与供体匹配的未转导T细胞相比，转导群体中靶细胞GFP信号的损失百分比。
异种移植研究
由勘探生物技术公司(Explora BioLabs)在机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案下进行体内实验。5至6周龄雌性NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)，JAX库存号005557小鼠购自杰克逊实验室(The Jackson Labs)。在研究开始之前，动物已经适应了至少3天的居住环境。
在适应居住环境后，给动物注射肿瘤细胞，如在建立适当细胞数的初步研究中所确定。使用萤火虫荧光素酶报告基因(见上文)工程化的野生型或等基因HLA-A*02(-)细胞系建立H508异种移植模型。将50％的2E7 H508细胞皮下注射到NSG小鼠的胁腹中。将“正常”细胞皮下注射到每只小鼠的右胁腹，将肿瘤细胞注射到每只小鼠的左胁腹。通过测径测量监测肿瘤生长。当肿瘤达到约100至200mm3的平均大小时，将动物随机分组并通过尾静脉施用T细胞。在T-细胞注射后，每周进行3次肿瘤测量，直到小鼠中的总肿瘤负荷达到2,000mm3。对每组7只小鼠中的5只小鼠进行生物发光定量。简言之，每只小鼠接受100ul皮下注射XenoLight D-荧光素钾盐(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)122799)，然后15分钟后使用光谱体内成像体系(珀金埃尔默公司)在其背侧成像。在整个研究期间，通过临床观察和定期对体重的影响监测动物的总体健康状况。
在T细胞注射后＝-1、2、9、16、30天和研究终止时收集血液和血清。在BDFACSCanto II上进行红细胞裂解后，对血液和脾脏中的T细胞进行染色。通过用针对小鼠CD45和Ter119的抗体染色排除小鼠细胞。人T细胞用人CD3、CD4和CD8的抗体染色。所有抗体的来源列于补充表23中。
表22.用于CRISPR/Cas9生成的CEA和HLA-A敲除的gRNA靶向序列
表23.实例7至11中使用的抗体和重组蛋白的概述
实例6：CEA嵌合抗原受体和LILRB1抑制性受体对的设计和活性
生成基于小鼠mAb的人源化scFv，小鼠mAb结合近膜CEA B3结构域中的细胞外表位。原始mAb被认为结合蛋白质脱落形式中不存在的表位，从而避免可溶性CEA对受体抑制的风险。CEA scFv与第3代CAR融合，该第3代CAR包括CD8α铰链、CD28跨膜结构域、4-1BB和CD3ζ细胞内结构域(图13)。序列如下表24所示。
在证实CAR活化剂单独的活性后，CEA CAR与HLA-A*02抑制性受体共表达，该抑制性受体是含有与LILRB1基因产物(LIR-1)的铰链、跨膜和信号传导结构域融合的HLA-A*02特异性scFv的构建体。LIR-1是免疫抑制性受体家族的成员并且在其信号传导结构域中含有4个ITIM。CAR和LIR-1抑制性受体在Jurkat和原代T细胞的表面上表达良好，并且两种受体使用经工程化以表达CEA、HLA-A*02或两者的HeLa靶细胞以很大程度上配体依赖性方式起作用(图14至17)。CEA和HLA-A*02在HeLa细胞中稳定表达，将其用标记的mAb染色并通过流式细胞术分析。使用QIFIKIT测定每种抗原的表面抗原密度(图14)。使用荧光活化流式细胞术(FACS)确认两种受体在转染的Jurkat细胞和转导的原代T效应细胞中的表达和富集。
除非另有说明，使用具有由含有可切割的T2A接头和降低β2微球蛋白(B2M)表达的shRNA表达盒的单一融合基因编码的两种受体模块的单一载体构建体转染Jurkat细胞，或转导原代效应T细胞。
在图15中，CEA CAR在与表达CEA和HLA-A*02两者的HeLa靶细胞共培养的Jurkat细胞中被特异性阻断。将含有NFAT-荧光素酶报告基因的Jurkat细胞工程化以稳定表达来自两个单独构建体的活化剂和阻断剂。
在图16和17中，用工程化的HeLa细胞靶测定表达两种受体的原代T细胞中的细胞毒性。在图16中，编码两种受体的单一慢病毒载体用于转导HLA-A*02(+)供体T细胞，其在测定前富集阻断剂阳性细胞。图16示出了一个供体(其为HL-A*02(+))，而图17示出了四个供体。
图17示出了来自其它供体的T细胞的结果。工程化的HeLa细胞再次用作细胞毒性的靶，并且原代T细胞用编码两种受体的单一慢病毒载体转导。在测定之前，使用阻断剂配体(HLAA*02pMHC)和蛋白质L进行富集。供体是A*02(+)，除了D183534是HLA-A*02(-)。
表24.CEA CAR和LILRB1抑制性受体的序列
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实例7：CEA CAR和LILRB1抑制性受体对的敏感性和选择性
对CEA活化剂的EC50和HLA-A*02LILRB1阻断剂受体的IC50进行定量。这些值可以与人肿瘤和正常组织的靶抗原表达值进行比较。
合成的mRNA用于控制HeLa靶细胞和变体上CEA和HLA-A*02抗原的表面水平，并结合Jurkat细胞中的功能测量(图18至19)。进行了使用原代T细胞细胞毒性测定的类似实验，并包括HLA-A*02限制性CEA TCR用于比较(图20)。CEA TCR描述于Parkhurst等人(2009)《临床癌症研究》15，169-180。Rosenberg及其同事证明这种TCR在临床中有活性，但由于结肠炎而终止(Parkhurst等人，2011，《分子治疗(Mol Ther)》19，620-626)。
在图20中，具有两种受体的HLA-A*02(+)供体T细胞与HeLa靶细胞共培养。对于EC50估计，在共培养前将不同量的CEA mRNA转染到CEA(-)HLA-A*02(-)或CEA(-)HLA-A*02(+)HeLa细胞中。为了产生匹配的替代“正常”细胞，共转染1μg A*02mRNA。最大杀伤(Kmax；相对于总靶细胞数归一化)对CEA mRNA量作图。以mRNA量和分子/细胞计算的EC50列于表25中。TCR EC50以CEA表面抗原/细胞给出，但实际的靶是CEA pMHC。对于IC50，在共培养前将不同量的HLA-A*02mRNA与125ng CEA mRNA共转染到细胞中。监测杀伤48小时。将相对于Kmax归一化的杀伤减少对A*02mRNA量作图。使用图22中的标准曲线，HLA-A*02阻断CEATmod的IC50为约6.8ng mRNA和约100K分子/细胞。使用标准曲线将mRNA水平(见图18)与表面蛋白分子相关联，结果如图19所示。这些实验证明在Jurkat细胞测定中测量的EC50和IC50与来自T细胞细胞毒性测定的等效敏感性参数相当。
图21示出了CEA和A*02抗原的CEA CAR和HLA-A*02抑制性受体EC50和IC50与肿瘤和正常表达值的图。在图21中，CEA标准曲线中的数据来自Bacac,M.等人(2016)《临床癌症研究》22，3286-3297。测定EC50和IC50值。肿瘤类型具有设定为0TPM的HLA-A表达说明通过LOH选择HLA-A*02(-)肿瘤。肿瘤数据来自TCGA数据库，并且正常组织数据来自GTEx数据库。
大多数正常组织表达CEA远低于双受体组合的EC50。例外是结肠和食道，它们落在图21中CEA EC50以上的象限中。然而，所有正常组织，包括结肠和食道，具有远高于阻断剂受体IC50的HL-A*02表达水平，并且被认为对于表达该受体组合的免疫细胞的CEA定向杀伤是安全的。许多实体瘤，特别是结肠直肠、胰腺和肺，表达高于EC50的CEA水平。预期这些恶性组织在缺乏HLA-A*02表达的情况下(即，当选择LOH时)活化表达两种受体的免疫细胞中的CEA CAR。
表征多种结肠癌细胞系以鉴定代表正常结肠中抗原表达天然水平的细胞系。选择结肠癌细胞系H508和SW1463(表26)。两者对于HLA-A*02都是杂合的并表达CEA。RNA-Seq数据集的比较显示，这些细胞系表达CEA和HLA-A的水平反映了这些基因在正常结肠中的表达。为了产生用作靶相关对照的靶细胞系，生成了缺乏HLA-A*02或CEA表达的H508和SW1463的基因敲除版本(图23)。如图23所示，遗传操作之前的H508和SW1463系具有与正常结肠组织相似的抗原数量和HLA-A*02:CEA表达比率。为了制备用于测试的变体，从CRISPR敲除获得HLA-A*02缺陷型细胞的稳定库，并在用CEA或HLA-A*02mAb染色后通过流式细胞术在此进行分析。所有细胞系均来自早期传代小瓶的新鲜解冻。
在原代T细胞细胞毒性测定中证实了CEA CAR Tmod细胞(表达双重CEA CAR和HLA-A*02scFv LILRB1抑制性受体系统的细胞)对具有内源性抗原表达的H508和SW1463结肠直肠癌系的选择性应答(图24)。在图24中，在没有背景减除的情况下绘制原始数据。还进行了使用背景(CEA(-)HLA-A*02(+)细胞，三角形)的时间进程。肿瘤和正常靶细胞是有或没有遗传修饰的H508和SW1463，如右图所示。使用两个单独的载体(一个用于活化剂受体，一个用于阻断剂受体)转导供体T细胞，而不使用shRNA敲低B2M。所有供体都是HLA-A*02(-)。
图24示出了Tmod双受体系统如何能够选择性杀伤H508靶细胞的实例。在图24中，使用三个NCI-H508-RFP靶细胞系：CEA+HLA-A*02(+)(正常，实心圆)，CEA-HLA-A*02(+)(正常，三角形)和CEA+HLA-A*02(-)(肿瘤，正方形)。以3:1的效应物与靶比率进行细胞毒性测定。基于转导的T细胞共培养物中存在的RFP或GFP信号的总像素面积确定特异性杀伤，并表示为相对于未转导的T细胞共培养物对照的百分比。
CEA CAR Tmod表达细胞和基准TCR两者在低E:T比率下表现出相当的靶选择性细胞毒性(图25)。在图25中，从特异性杀伤中减去CEA(-)HLA-A*02(+)靶细胞的背景杀伤。在缺乏功能性HLA-A*02基因的情况下，TCR甚至在E:T＝9:1时也是无活性的。在这个比率下，CEA CAR Tmod表达细胞表现出对HLA-A*02(-)靶细胞的选择性降低。Tmod表达细胞和TCR表达细胞之间的这种差异可能与供体单倍型部分相关，因为在HLA-A*02(-)供体中没有看到这种差异(图32至34)和/或它们各自靶：CEA CAR构建体的TCR和CEA表面抗原的pMHC的绝对抗原水平中的极端差异。
与TCR表达细胞不同，CEA CAR Tmod表达细胞能够仅基于阻断剂抗原的表达将CEA(+)HLA-A*02(-)肿瘤细胞与CEA(+)HLA-A*02(+)正常细胞区分开，表现出相对于E:T比率的约70倍的应答偏移(图26)。相反，TCR对正常细胞是非选择性的，这与其临床特征一致。
表25.与CEA和A*02抗原的正常结肠表达相比的CEA(+)靶细胞系
在表25中，H508和SW1463是具有天然CEA和HLA-A*02表达的结肠直肠癌细胞系。HeLa是宫颈癌细胞系，即CEA(-)和HLA-A*02(-)。HeLa细胞经基因工程改造以表达CEA和HLA-A*02。将细胞染色并如上所述计算分子/细胞。TPM用于HLA-A。MFI，中值荧光强度；TPM，每百万转录物；NA：不适用；ND，未做。
表26.14个细胞系中CEA和A*02(TPM)的表达
从DepMap获得基因表达信息。14个细胞系获自商业来源。通过使用CRISPR基因编辑敲除(KO)CEA和/或HL-A*02生成CEA(-)HLA-A*02(-)和CEA(-)HLA-A*02(+)等基因细胞系，并且在缺乏A*02的细胞系中，用表达A*02的慢病毒载体转导细胞。
实例8：混合和连续培养中的肿瘤辨别和可逆活化
在更具挑战性的体外功能测定中测试表达CEA CAR Tmod双受体系统(CEA CAR和HLA-A*02scFv LILRB1抑制性受体)的细胞的功能的一系列实验。首先，测试了在混合细胞培养物中表达这两种受体的细胞区分肿瘤和正常细胞的能力。野生型H508细胞用RFP标记以模拟正常细胞，HLA-A*02敲除(KO)等基因细胞用GFP标记并用于模拟肿瘤细胞。有色蛋白为体外细胞存活提供了方便的读数。将两种标记的细胞系以1:1的比例混合，并与表达两种Tmod受体的效应T细胞共培养。然后，通过显微镜观察靶细胞。虽然单独表达CEA CAR的T细胞完全杀死肿瘤和正常系，但表达CEA CAR和抑制性受体的T细胞仅杀死肿瘤细胞(图27至28)。
接着，测定CEA CAR Tmod双受体介导可逆活化的能力，即实体瘤细胞疗法的另一特性。在不同靶细胞存在下，即从肿瘤到正常或从正常到肿瘤，连续培养表达CEA CAR Tmod受体的效应T细胞，以模拟T细胞在体内通过异质环境移动的体验。表达Tmod双受体的效应T细胞能够在两个方向上在活化(ON)和阻断(OFF)状态之间顺序转换(图29至30、图35)。
最后，表达这两种受体的效应T细胞的敏感性不受外源可溶性CEA(sCEA)的影响，即使在患者血液中检测到最高水平(图31)。图31示出了来自一个HLA-A*02(+)供体(D12333)的代表性数据，测试了来自四个供体的T细胞。sCEA在较长的时间点活化来自所有4个供体的T细胞中的CEA CAR。sCEA(10ug/mL)的存在不会显著影响在多个供体中表达两种Tmod受体的效应T细胞的细胞毒性。有趣的是，CEA CAR似乎在更长的时间点对sCEA起反应。在表达两种Tmod受体的细胞中没有检测到可能来源于聚集在细胞表面上的CEA的这种活化。
实例9：针对不表达CEA的细胞系的脱靶反应性
对所有细胞疗法(包括这类疗法)的一个考虑是脱靶反应。因此，建立了一种测试功能性脱靶反应的方法，脱靶反应超过由活化剂-和阻断剂-抗原表达引起的靶特异性细胞选择性。值得注意的是，对于本文所述的双受体系统，临床靶向安全性(肿瘤对正常细胞)主要不是通过活化剂受体而是通过阻断剂受体实现的，阻断剂受体响应于其同源阻断剂抗原的存在或不存在。普遍表达阻断剂抗原HLA-A*02的正常细胞被保护免受细胞毒性，降低了靶上和肿瘤外的风险。这种安全机制还保护患者免受脱靶反应的影响。通过活化剂受体与脱靶分子的任何潜在接合的活化将被普遍存在的与阻断剂受体结合的HLA-A*02蛋白所抑制。
将人细胞系用作体内正常组织的替代物，并且组装了代表约90％成人基因表达水平>0.5转录物/细胞的不同细胞系组(表26)。使用转基因和基因敲除品系的组合生成阳性和阴性对照。没有CEA-靶细胞系在Jurkat效应细胞(表达CEA CAR Tmod受体构建体)中引发高于背景水平的显著应答(图36)。COLO 668细胞在表达CEA CAR的Jurkat细胞中刺激应答，但在表达两种受体的CEA CAR Tmod Jurkat细胞中不刺激应答。然而，在原代T细胞中，无论是单独的CAR，还是CAR与抑制性受体的组合，都没有观察到这种应答。这些发现表明，基于Jurkat细胞测定，表达CEA CAR Tmod的细胞具有低概率的脱靶功能活性。
使用相同的方法测试表达CEA CAR Tmod受体的原代T细胞的细胞毒性。选择CEACAR Tmod表达细胞杀死约50％CEA mRNA转染的阳性对照细胞系的时间点(K50；图37至38)。在图37中，针对表26中所述的细胞系组测试了T细胞。在A375和MS751细胞上测试一个HLA-A*02(-)供体。使用的E:T比率为3:1。选择表达Tmod双受体的细胞对肿瘤细胞的杀伤率达到大于或等于50％的时间(tK50)，以比较单独表达CEA CAR的T细胞、表达CEA CAR Tmod受体的T细胞和未转导的T细胞的杀伤％。作为阴性对照，CEA(-)细胞系与未转导的T细胞共培养。表达CEA CAR Tmod双受体的T细胞(以肿瘤细胞作为靶，即CEA(+)HLA-A*02(-)靶细胞)的平均50％靶细胞杀伤(K50)比未转导的T细胞共培养物的背景平均值高约6倍。
在图38中，以％表示的所有杀伤仅针对靶细胞(无T细胞)的生长进行归一化。来自一个细胞系(A375)的动力学数据的实例显示在左侧。用1ug CEA mRNA转染细胞系。所有数据来自E:T 3:1实验。选择Tmod细胞对肿瘤细胞达到大于或等于50％杀伤的时间，以比较CEA CAR、CEA CAR Tmod和未转导的T细胞的杀伤％。将对12个不同靶细胞系的所有供体测量结果(3至4个供体)合并用于右图。使用最高转染的CAR mRNA水平估计在具有肿瘤靶细胞[CEA(+)A*02(-)]的Tmod T细胞在K50的动态范围的高端(阳性对照)。用CEA(-)靶细胞从未转导的T细胞估计背景。从表达Tmod和CAR的Jurkat细胞与靶细胞(测试组)的单个细胞系平均值估计交叉反应性。
野生型CEA(+)H508引发来自CEA CAR-T细胞的强应答。用CEA CAR Tmod细胞和CEA(-)靶细胞没有检测到显著的脱靶应答。因此，原代T细胞细胞毒性测定没有产生CEA CARTmod构建体的脱靶活化的证据。值得注意的是，Jurkat和原代T细胞测定都可以在<100个分子/细胞的水平上检测功能性靶相互作用，至少比估计存在于H508细胞和正常结肠上皮表面的CEA低1,000倍。
实例10：小鼠模型中的肿瘤特异性功效
使用体内实验证实表达CEA CAR Tmod双受体的T细胞在小鼠异种移植物中的功能(图39)。编码CEA CAR或双受体系统的单一慢病毒载体用于转导来自HLA-A*02(-)供体的T细胞，而没有B2M shRNA。供体T细胞是HLA-A*02(-)(D4809)。选择用于异种移植研究的细胞系H508，以反映CEA和HLA-A*02的正常表达水平。使用两个剂量水平的CEA CAR T或CEA CARTmod细胞(来自HLA-A*02(-)供体)：每只小鼠5E6和2E7个细胞。在用IL-2扩大T细胞生产后，通过携带两种类型H508肿瘤的小鼠的尾静脉输注富集的慢病毒转导的原代T细胞，在每侧胁腹上一种：一种来自CEA(+)HLA-A*02(+)正常细胞以模拟正常结肠上皮，一种来自CEA(+)HLA-A*02(-)细胞以模拟肿瘤。
5E6剂量对CAR和Tmod构建体表现出较小且不一致的影响(图42)。然而，2E7剂量显示出显著的差异(图40至41)。在图40中，使用7只小鼠/组(除了5只在盐水组和UTD或未转导组中)。异种移植物来自经工程化以表达萤火虫荧光素酶的H508结肠癌细胞系。通过尾静脉注射给小鼠注射CEA CAR或CEA CAR Tmod双受体表达细胞，剂量为每只小鼠2E7个人T细胞。图40中的数据点针对每个群组示出直到组中的个体小鼠具有大肿瘤体积(>2000mm3总体积)的时间。单向误差条用于一些曲线以避免拥挤。误差条是平均值的标准误差。注射表达Tmod双受体的T细胞的组中的所有小鼠在约20天的额外时间内没有显示出肿瘤生长，这表明有疗效。CAR/正常移植物组中的一只小鼠逃脱并生长，导致平均值增加。
图42至43为个体肿瘤数据。如图43所示，一只CAR-T处理的动物，肿瘤有应答，但随后恢复生长。这可归因于在T细胞输注时动物中较大的肿瘤体积。正常移植物平均略大于肿瘤移植物，CAR-T细胞不能完全根除肿瘤。用表达CEA CAR的细胞和与HLA-A*02抑制性受体(Tmod细胞)组合的CEA CAR处理的动物均显CD3+T细胞减少。然而，用Tmod细胞处理的动物在较早的时间点开始降低CD3+T细胞的水平。在用表达Tmod双受体的T细胞注射的组中，在测定结束时T细胞计数的减少可能归因于一侧胁腹上肿瘤的完全消除和另一侧胁腹上移植物对抗原的有效阻断，导致有效活化剂信号传导的停止。
单独表达CEA CAR的细胞杀死肿瘤和正常移植物，而Tmod工程化的T细胞仅杀死HLA-A*02(-)肿瘤。正常HLA-A*02(+)H508细胞在小鼠中生长，类似于盐水处理的对照。肿瘤大小的测径测量通过生物发光来证实，在具有荷瘤的Tmod处理的小鼠的胁腹上没有检测到信号(图40至41)。由于未知原因，右胁腹的异种移植物平均略大于左胁腹的肿瘤。这导致用表达CEA CAR的T细胞和表达Tmod双受体的T细胞处理的肿瘤和正常H508细胞之间的微妙的明显功效差异。CAR和Tmod处理的小鼠在左胁腹显示非常相似的活性。尽管Tmod T细胞处理的组似乎是无肿瘤的，但是CAR-T组在携带正常移植物的右胁腹上具有残留的平均肿瘤体积，包括一个初始应答然后恢复生长的逃逸者(图43至44)。注射Tmod T细胞的一个肿瘤在像该组中的其它肿瘤一样被消除之前接近1cc。这些结果表明CEA CAR Tmod T细胞在体内以与体外相同的有效的肿瘤选择性方式起作用。
还测量了多种其它参数，包括输注的T细胞的血液计数。输注后两天，来自所有组的T细胞以预期浓度的1/10,000的水平存在，如果它们存活并留在血液中(图40)。然而，在用CEA CAR和CEA CAR Tmod T细胞处理的组中，T细胞计数随时间增加。最终CEA CAR TmodT细胞减少，同时肿瘤消除。CAR-T细胞保持更长的时间，大概是因为存在残留的CEA(+)HLA-A*02(+)移植细胞以提供抗原刺激。到输注后30天，已经下降到基线。在Tmod T细胞组中，异种移植物在小鼠的右胁腹继续生长，但它们表达HLA-A*02阻断剂抗原，有效地防止Tmod细胞的活化剂-抗原刺激。对小鼠的细胞、组织和器官进行若干其它分析(图45)。图45示出了大多数小鼠具有比CD8计数更高的CD4计数。在T细胞注射后30天，在CEA Tmod组中的两只小鼠的脾脏中观察到CD3(+)人T细胞的存在。小鼠通常是健康的并且保持与盐水和对照未转导的T细胞组相似的体重。
实例11：HLA-A*02顺式结合和自体疗法
HLA-A*02阻断剂受体原则上可以被自体T细胞中的内源性A*02顺式影响(图46)。因此，将亲本Jurkat细胞中的应答与经工程化以表达HLA-A*02的Jurkat系进行比较。与野生型HLA-A*02(-)亲本系相比，在HLA-A*02(+)转基因Jurkat系之间检测到的阻断剂受体表面表达水平几乎没有差异(图50)。阻断剂的IC50在HLA-A*02(+)和HLA-A*02(-)Jurkat细胞中也相似。
然而，在原代T细胞中结果是不同的。与HLA-A*02(-)供体相比，来自HLA-A*02(+)供体的T细胞在其表面表达较少的阻断剂受体(图47)。为了解决该差异，开发了一种靶向B2M的shRNA模块。B2M是HLA I类分子的共同轻链并且是它们在细胞表面上表达所需的。用CEA CAR Tmod受体转导的HLA-A*02(+)和HLA-A*02(-)供体细胞之间的HLA-A*02四聚体结合差异显著降低，结合水平接近用CRISPR处理的T细胞观察到的水平(图47和51)。如图47所示，B2M shRNA部分恢复探针结合。经由CRISPR/Cas9的B2M敲除类似地将探针结合恢复到与HLA-A*02(-)细胞中所见相同的水平。用泛HLA-I mAb W6/32检测HLA I类，用A*02四聚体检测阻断剂受体表达。图47中的单个点代表不同的供体。总共使用了8个供体：6个为HLA-A*02(+)的供体和2个为HLA-A*02(-)的供体。所有测试一式三份，并将平均值绘制为单个点。标记为Tmod_A2neg的组含有来自2个HLA-A*02(-)供体的数据，其中3个条件/构建体紧邻其左侧(仅Tmod、Tmod+CRISPR、Tmod+shRNA一起作图)。来自该实验的一个T细胞群体死亡并在此处和图48中被排除。
来自三个供体的T细胞中的B2M水平示于下表27中。提取来自未转导的T细胞和Tmod转导的T细胞的3个供体的总RNA(包括B2M shRNA)并逆转录成互补DNA。建立液滴数字聚合酶链反应以评估未转导的T细胞和A2B530中的B2M表达水平。将B2M mRNA表达水平相对于β肌动蛋白基因表达归一化。
表27.Tmod转导和未转导T细胞之间B2M的相对mRNA表达水平
在使用H508靶细胞的细胞毒性测定中，CEA CAR Tmod构建体在A*02(+)供体(n＝6)中如在A*02(-)供体(n＝2)中一样有效地杀死和阻断(图48)。这些数据与细胞因子释放相关(图49和52)。因此，含有B2M shRNA模块的CEA CAR Tmod构建体可以适合作为A*02杂合实体瘤患者亚组的自体T细胞疗法，该患者的肿瘤含有HLA-ALOH。
在图48中，具有B2M shRNA模块的Tmod在HLA-A*02(+)供体中的功能与其在HLA-A*02(-)供体中的功能无法区分。正常表示具有天然CEA和HLA-A*02表达的H508靶细胞；而肿瘤表示HLA-A*02缺失的H508靶细胞。48小时后以3:1的E:T进行测定。右边的图仅含有从左边图中的虚线框重新绘制的正常靶细胞数据。
在图49中，将来自CEA CAR Tmod表达细胞的细胞因子表达与CEA CAR表达细胞和表达基准TCR的细胞进行比较。供体D123333和D205586是HLA-A*02(+)，而供体D4809是HLA-A*02(-)。该数据集包括有和没有B2M shRNA的CEA Tmod受体的测试。IFN-g测定在10K pg/mL饱和。
其它细胞因子如图52所示。将表达CEA CAR Tmod受体的细胞与表达CEA CAR的细胞和表达基准TCR的细胞进行比较。供体1和2是HLA-A*02(+)；供体3是HLA-A*02(-)。数据包括无B2M shRNA的CEA Tmod受体的测试。

Claims (99)

1.一种免疫细胞，其包含：
a.第一受体，其包含对CEA细胞粘附分子5(CEA)特异性的细胞外配体结合结构域；以及
b.第二受体，其包含对在CEA+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，
其中所述第一受体是响应于CEA的活化剂受体；并且其中所述第二受体是响应于所述非靶抗原的抑制性受体。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原的表达在所述CEA+癌细胞中丢失。
3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的等位基因变体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A、HLA-B或HLA-C蛋白的等位基因变体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*02。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含如公开于表6中的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表6的所述CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:103-108或SEQ ID NO:109-114的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于SEQ ID NO:103-108或SEQ ID NO:109-114的所述CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自表5中公开的多肽序列的多肽序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:91-102中任一个，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分和可变轻链(VL)部分，所述可变重链(VH)部分包含选自由SEQ ID NO:55-58组成的组的一组重链互补决定区(HC-CDR)，所述可变轻链(VL)部分包含选自由SEQ ID NO:59-63组成的组的一组轻链互补决定区；或相对于SEQ ID NO:55-58或SEQ ID NO:59-63具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分和可变轻链(VL)部分，所述可变重链(VH)部分包含一组包含SEQ ID NO:55-57的重链互补决定区(HC-CDR)，所述可变轻链(VL)部分包含一组包含SEQ ID NO:59、61和63的轻链互补决定区；或相对于SEQ ID NO:55-57或SEQ ID NO:59、61和63具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含以下：可变重链(VH)部分，其包含SEQ ID NO:144或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列；以及可变轻链(VL)部分，其包含SEQ ID NO:148或与其具有85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:66-70组成的组的序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:68的scFv序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体包含铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
18.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述铰链结构域包含CD8α铰链结构域。
19.根据权利要求18所述的免疫细胞，其中所述CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:71的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
20.根据权利要求11至19中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
21.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中所述CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:75的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
22.根据权利要求11至210中任一项所述的免疫细胞，其中所述细胞内结构域包含CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ活化结构域。
23.根据权利要求22所述的免疫细胞，其中所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:158的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体包含SEQ ID NO:52的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。
26.根据权利要求25所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域包含与SEQ IDNO:131至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。
28.根据权利要求27所述的免疫细胞，其中所述LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:135至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。
30.根据权利要求29所述的免疫细胞，其中所述LILRB1铰链结构域包含与SEQ ID NO:134至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域、LILRB1跨膜结构域、LILRB1铰链结构域、任何这些的功能变体或其组合。
32.根据权利要求31所述的免疫细胞，其中所述LILRB1铰链结构域、LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:132或与SEQ ID NO:132至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含SEQ ID NO:164的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的免疫细胞，其中所述CEA+癌细胞是胰腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、头颈癌细胞、胆囊癌细胞、弥漫性大B细胞癌细胞或急性髓性白血病癌细胞。
35.根据权利要求34所述的免疫细胞，其中所述CEA+癌细胞是肺癌细胞、结肠直肠癌细胞或胰腺癌细胞。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的免疫细胞，其中所述CEA+癌细胞是不表达HLA-A*02的CEA+/HLA-A*02-癌细胞。
37.根据权利要求36所述的免疫细胞，其中所述CEA+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自CEA+/HLA-A*02+细胞。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的免疫细胞，其中在具有杂合性丢失的所述CEA+/HLA-A*02-癌细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的免疫细胞，其中在未通过杂合性丢失而丢失HLA-A*02的CEA+细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起不特异性活化所述免疫细胞。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
41.根据权利要求40所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的免疫细胞，其中MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。
43.根据权利要求42所述的免疫细胞，其中所述MHC I类基因是β-2-微球蛋白(B2M)。
44.根据权利要求43所述的免疫细胞，其进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸包含干扰RNA，所述干扰RNA包含与B2M mRNA的序列互补的序列。
45.根据权利要求44所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA包含选自表11所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。
46.根据权利要求44或45所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA能够诱导RNAi介导的所述B2M mRNA的降解。
47.根据权利要求46所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。
48.根据权利要求47所述的免疫细胞，其中所述shRNA包含：
a.第一序列，其从5'端至3'端具有与所述B2M mRNA的序列互补的序列；以及
b.第二序列，其从5'端至3'端具有与所述第一序列互补的序列，
其中所述第一序列和所述第二序列形成所述shRNA。
49.根据权利要求47或48所述的免疫细胞，其中所述shRNA由包含序列GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:179)或GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ ID NO:180)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列的序列编码。
50.根据权利要求43所述的免疫细胞，其包含对编码B2M的序列的一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰降低B2M的表达和/或消除其功能。
51.根据权利要求50所述的免疫细胞，其中所述一种或多种修饰包含编码B2M的内源性基因的一种或多种失活突变。
52.根据权利要求51所述的免疫细胞，其中所述一种或多种失活突变包含缺失、插入、取代或移码突变。
53.根据权利要求51或52中任一项所述的免疫细胞，其中用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入所述一种或多种失活突变，所述引导核酸特异性靶向编码B2M的所述内源性基因的序列。
54.根据权利要求53所述的免疫细胞，其中所述gNA包含选自表10所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。
55.根据权利要求42所述的免疫细胞，其中所述MHC I类基因是HLA-A*02。
56.根据权利要求55所述的免疫细胞，其进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸包含干扰RNA，所述干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA的序列互补的序列。
57.根据权利要求56所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA能够诱导RNA干扰(RNAi)介导的所述HLA-A*02mRNA的降解。
58.根据权利要求57所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)，其包含：
a.第一序列，其从5'端至3'端具有与所述HLA-A*02mRNA的序列互补的序列；以及
b.第二序列，其从5'端至3'端具有与所述第一序列互补的序列，
其中所述第一序列和所述第二序列形成所述shRNA。
59.根据权利要求55所述的免疫细胞，其包含对编码HLA-A*02的内源性基因的序列的一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰降低HLA-A*02的表达和/或消除其功能。
60.根据权利要求59所述的免疫细胞，其中所述一种或多种修饰包含编码HLA-A*02的所述内源性基因的一种或多种失活突变。
61.根据权利要求59或60所述的免疫细胞，其中用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入所述一种或多种失活突变，所述引导核酸特异性靶向编码HLA-A*02的所述内源性基因的序列。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体包含SEQ ID NO:52的序列，并且第二受体包含SEQ ID NO:164的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
63.根据权利要求62所述的免疫细胞，其包含由包含GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:179)的序列或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列编码的shRNA。
64.根据权利要求62或63所述的免疫细胞，其中所述第一受体和所述第二受体由单个多核苷酸编码，并且其中编码所述第一受体和所述第二受体的序列由编码自切割多肽的序列分开。
65.根据权利要求63所述的免疫细胞，其中所述自切割多肽包含T2A自切割多肽，其包含序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:181)。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是自体的。
67.根据权利要求1至65中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是同种异体的。
68.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至67中任一项所述的免疫细胞。
69.根据权利要求68所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
70.根据权利要求68或69所述的药物组合物，其用作治疗CEA+癌症的药物。
71.一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：
a.第一受体，其包含对CEA细胞粘附分子5阳性(CEA)特异性的细胞外配体结合结构域；以及
b.第二受体，其包含对在CEA+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，
其中所述第一受体是响应于所述CEA+癌细胞上的CEA的活化剂受体；并且其中所述第二受体是响应于所述非靶抗原的抑制性受体。
72.一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含用于生成根据权利要求1至67中任一项所述的免疫细胞的一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码第一受体和第二受体的多核苷酸序列。
73.根据权利要求71或72所述的多核苷酸或多核苷酸系统，其包含编码对B2M特异性的shRNA的序列。
74.根据权利要求73所述的多核苷酸或多核苷酸系统，其中编码所述第一受体、所述第二受体和对B2M特异性的所述shRNA的所述序列由相同的多核苷酸编码。
75.根据权利要求73或74所述的多核苷酸或多核苷酸系统，其中
a.编码对B2M特异性的所述shRNA的所述序列包含GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:
179)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；
b.编码所述第一受体的所述序列包含SEQ ID NO:143，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；以及
c.编码所述第二受体的所述序列包含SEQ ID NO:165，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列。
76.一种载体，其包含根据权利要求71至75中任一项所述的一种或多种多核苷酸。
77.一种杀死在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的CEA+癌细胞的方法，其包含向受试者施用有效量的根据权利要求1至67中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求68至70中任一项所述的药物组合物。
78.一种治疗患有在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的CEA+肿瘤的受试者体内CEA+癌症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至67中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求68至70中任一项所述的药物组合物。
79.一种治疗受试者体内癌症的方法，其包含：
a.确定所述受试者的正常细胞和多种癌细胞的HLA-A基因型或表达；
b.任选地，确定所述受试者的多种癌细胞中的CEA的表达；以及
c.如果所述正常细胞表达HLA-A*02并且所述多种癌细胞不表达HLA-A*02，并且所述多种癌细胞是CEA阳性的，则向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至65中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求66至68中任一项所述的药物组合物。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述受试者是患有表达CEA(CEA+)并且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者。
81.根据权利要求79所述的方法，其中所述受试者是患有表达CEA并且已经丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02患者。
82.根据权利要求79至81中任一项所述的方法，其中所述癌症包含胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、食道癌、胃癌、胆囊癌、头颈癌、弥漫性大B细胞癌或急性髓性白血病。
83.根据权利要求79至81中任一项所述的方法，其中所述癌症包含肺癌、结肠直肠癌或胰腺癌。
84.根据权利要求79至83中任一项所述的方法，其中所述癌细胞包含不表达HLA-A*02的CEA+/HLA-A*02-癌细胞。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述CEA+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自CEA+/HLA-A*02+细胞。
86.根据权利要求79至85中任一项所述的方法，其中在所述CEA+/HLA-A*02-癌细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。
87.根据权利要求79至86中任一项所述的方法，其中在未丢失HLA-A*02的CEA+细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起不特异性活化所述免疫细胞。
88.根据权利要求79至87中任一项所述的方法，其中施用根据权利要求1至58中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求59至61中任一项所述的药物组合物减小了所述受试者体内肿瘤的大小。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述肿瘤减小了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述肿瘤被消除。
91.根据权利要求88或权利要求89所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物阻止了所述受试者体内肿瘤的生长。
92.根据权利要求79至91中任一项所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物减少了所述受试者体内肿瘤的数目。
93.根据权利要求79至92中任一项所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物导致所述受试者体内癌细胞而非正常细胞的选择性杀伤。
94.根据权利要求93所述的方法，其中至少约60％的被杀死的细胞是癌细胞，约65％的被杀死的细胞是癌细胞，约70％的被杀死的细胞是癌细胞，约75％的被杀死的细胞是癌细胞，约80％的被杀死的细胞是癌细胞，约85％的被杀死的细胞是癌细胞，约90％的被杀死的细胞是癌细胞，约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％被杀死的细胞是癌细胞。
95.根据权利要求93所述的方法，其中施用所述免疫细胞或药物组合物导致杀死所述受试者的至少约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的所述癌细胞。
96.根据权利要求79至95中任一项所述的方法，其中与施用包含所述第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用所述免疫细胞或所述药物组合物对所述受试者产生更少的副作用。
97.一种制备多种免疫细胞的方法，其包含：
a.提供多种免疫细胞，以及
b.用根据权利要求71至75中任一项所述的多核苷酸系统或根据权利要求76所述的载体转化所述多种免疫细胞。
98.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至67中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求68至708中任一项所述的药物组合物。
99.根据权利要求98所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3188862A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 Carl Alexander Kamb Compositions and methods for treating mesothelin positive cancers
EP4097486A4 (en) 2020-08-20 2023-09-06 A2 Biotherapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF POSITIVE CANCERS AT CEACAM
WO2024036148A1 (en) * 2022-08-08 2024-02-15 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating blood cancers
CN115925923B (zh) * 2022-09-26 2023-09-15 吉林大学 一种催化Aβ42寡聚体降解的单链抗体、单链抗体基因及其应用

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5874540A (en) 1994-10-05 1999-02-23 Immunomedics, Inc. CDR-grafted type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibodies
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
AU752494B2 (en) 1998-02-25 2002-09-19 Dow Chemical Company, The High affinity humanized ANTI-CEA monoclonal antibodies
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
WO2001062895A2 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
CN100497389C (zh) 2001-06-13 2009-06-10 根马布股份公司 表皮生长因子受体(egfr)的人单克隆抗体
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
EP1742958B1 (en) 2004-03-15 2017-05-17 City of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
WO2006031221A1 (en) 2004-09-13 2006-03-23 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions comprising t cell receptors and methods of use thereof
US20120009162A1 (en) 2009-04-03 2012-01-12 Masaki Yasukawa T cell receptor and nucleic acid encoding the receptor
BR112012003983A2 (pt) 2009-08-31 2021-09-14 Roche Glycart Ag Molecula de ligação abm moleculas de ligação de antigenos abm variante polipeptideo isolado molecula de ligação de antigeneos humanizada anticorpo polinucleotideo isolado composição vetor celula hospedeira metodo de produção de abm metodo de indução da lise celular de tumor, metodo de diagnostico de doença em pacientes que possuem um cancer metodo de aumento de tempo de sobrevivencia em pacientes que possuem um cancer metodo de indução em pacientes de regressão de um motor uso abm e invenção
KR102062407B1 (ko) 2010-12-09 2020-01-03 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 키메릭 항원 수용체 변형 t 세포의 용도
NZ614125A (en) 2011-03-02 2015-07-31 Roche Glycart Ag Cea antibodies
WO2013054320A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Antibodies to carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (ceacam)
CN104159909A (zh) 2012-02-22 2014-11-19 宾夕法尼亚大学董事会 产生用于癌症治疗的t细胞持续性群体的组合物和方法
AU2013235726B2 (en) 2012-03-23 2017-04-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin chimeric antigen receptors
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
WO2014079886A1 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Sanofi Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
JP6552965B2 (ja) 2012-12-12 2019-07-31 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
RU2015140915A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
KR102466666B1 (ko) 2013-03-15 2022-11-15 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 면역치료용 조성물 및 방법
US10196444B2 (en) 2013-07-29 2019-02-05 Bluebird Bio, Inc. Multipartite signaling proteins and uses thereof
RU2717984C2 (ru) 2013-11-21 2020-03-27 ЮСиЭл БИЗНЕС ЛТД Клетка
KR20160113295A (ko) 2014-02-04 2016-09-28 카이트 파마 인코포레이티드 B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법
US11072644B2 (en) 2014-11-12 2021-07-27 Allogene Therapeutics, Inc. Inhibitory chimeric antigen receptors
AU2015367317A1 (en) 2014-12-17 2017-06-01 Cellectis Inhibitory chimeric antigen receptor (iCAR or N-CAR) expressing non-T cell transduction domain
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
JP6784687B2 (ja) 2015-02-24 2020-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 結合誘発型転写スイッチ及びその使用方法
BR112017018224A2 (pt) 2015-03-11 2018-04-17 Cellectis métodos para manipulação de célula t alogênica para aumentar sua persistência e/ou implante em pacientes
US20190119385A1 (en) 2015-03-27 2019-04-25 University Of Southern California Hla-g as a novel target for car t-cell immunotherapy
GB201509413D0 (en) 2015-06-01 2015-07-15 Ucl Business Plc Fusion protein
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
MA44314A (fr) 2015-11-05 2018-09-12 Juno Therapeutics Inc Récepteurs chimériques contenant des domaines induisant traf, et compositions et méthodes associées
EP3377523A4 (en) 2015-11-19 2019-06-19 The Regents of The University of California IMMUNITY CELL RECEIVERS REPRESSIBLE UNDER CONDITIONS AND METHODS OF USING THE SAME
US11530252B2 (en) 2015-11-23 2022-12-20 Trustees Of Boston University Methods and compositions relating to chimeric antigen receptors
CA3005482A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Innovative Targeting Solutions Inc. Single variable domain t-cell receptors
WO2017156484A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Bluebird Bio, Inc. Genome edited immune effector cells
US20190185849A1 (en) 2016-06-29 2019-06-20 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
SG11201901528RA (en) 2016-08-23 2019-03-28 Univ California Proteolytically cleavable chimeric polypeptides and methods of use thereof
WO2018058002A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Tcrs specific for minor histocompatibility (h) antigen ha-1 and uses thereof
WO2018061012A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd. A universal platform for car therapy targeting a novel antigenic signature of cancer
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
WO2018148454A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 The Regents Of The University Of California Chimeric t cell antigen receptors and methods of use thereof
SG11201908784TA (en) 2017-03-27 2019-10-30 Hoffmann La Roche Improved antigen binding receptor formats
CA3059444A1 (en) 2017-04-14 2018-10-18 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptor t cells targeting the tumor microenvironment
GB201707783D0 (en) 2017-05-15 2017-06-28 Autolus Ltd Cell
CA3062727A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Autolus Limited A cell comprising a chimeric antigen receptor (car)
GB201707779D0 (en) 2017-05-15 2017-06-28 Autolus Ltd Cell
TWI795415B (zh) 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
EP3684821A4 (en) 2017-09-19 2021-06-16 The University Of British Columbia ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND METHOD OF USING THEREOF
EP3688155B1 (en) 2017-09-28 2023-01-04 Immpact-Bio Ltd. A universal platform for preparing an inhibitory chimeric antigen receptor (icar)
WO2019084055A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 Massachusetts Institute Of Technology CLASSIFICATION OF GENETIC VARIATION FROM UNICELLULAR TRANSCRIPTOMS
EP3707166A4 (en) 2017-11-06 2021-11-24 Daniel J. Monticello CHIMERA ANTIGEN RECEPTOR SYSTEMS WITH DOMINANT NEGATIVE LIGAND
WO2019192972A1 (en) * 2018-04-04 2019-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Diagnostic assays to detect tumor antigens in cancer patients
WO2019241549A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 A2 Biotherapeutics, Inc. Foxp3-expressing car-t regulatory cells
EP3856236B1 (en) * 2018-09-28 2023-05-17 ImmPACT-Bio Ltd. Methods for identifying activating antigen receptor (acar)/inhibitory chimeric antigen receptor (icar) pairs for use in cancer therapies
EP3632461A1 (en) 2018-10-05 2020-04-08 St. Anna Kinderkrebsforschung A group of chimeric antigen receptors (cars)
CA3109747A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 St. Anna Kinderkrebsforschung A group of chimeric antigen receptors (cars)
AU2020226401A1 (en) * 2019-02-18 2021-10-14 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combinations of multiple chimeric antigen receptors for immunotherapy
JP2022539344A (ja) 2019-06-26 2022-09-08 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗ｃｅａ抗体及びその応用
MX2022001711A (es) 2019-08-09 2022-05-10 A2 Biotherapeutics Inc Receptores en la superficie celular que responden a la perdida de heterocigosidad.
WO2021030182A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 A2 Biotherapeutics, Inc. Bifunctional single variable domain t cell receptors and uses thereof
WO2021030153A2 (en) 2019-08-09 2021-02-18 A2 Biotherapeutics, Inc. Engineered t cell receptors and uses thereof
CN114786776A (zh) 2019-09-18 2022-07-22 拉姆卡普生物阿尔法股份公司 针对ceacam5和cd3的双特异性抗体
WO2021096868A1 (en) 2019-11-12 2021-05-20 A2 Biotherapeutics, Inc. Engineered t cell receptors and uses thereof
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
WO2021119489A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 A2 Biotherapeutics, Inc. Lilrb1-based chimeric antigen receptor
WO2021222576A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 A2 Biotherapeutics, Inc. Pag1 fusion proteins and methods of making and using same
WO2021252635A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cancers
WO2022036065A2 (en) 2020-08-13 2022-02-17 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cancers
EP4097486A4 (en) 2020-08-20 2023-09-06 A2 Biotherapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF POSITIVE CANCERS AT CEACAM
WO2022040470A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating ceacam positive cancers
EP4251176A1 (en) * 2020-11-24 2023-10-04 A2 Biotherapeutics, Inc. Adoptive cell therapy for treatment of cancer associated with loss of heterozygosity

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