CN116761817A - 用于治疗间皮素阳性癌症的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗间皮素阳性癌症的组合物和方法 Download PDF

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CN116761817A CN202180051026.7A CN202180051026A CN116761817A CN 116761817 A CN116761817 A CN 116761817A CN 202180051026 A CN202180051026 A CN 202180051026A CN 116761817 A CN116761817 A CN 116761817A
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C·A·卡姆
D·T·瓦尔沙维亚克
T·托卡特利安
A·汉堡
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Abstract

本公开提供了包含对间皮素特异性的第一活化剂受体和对已在间皮素阳性癌细胞中丢失的配体特异性的第二抑制性受体的免疫细胞，以及制备和使用其治疗癌症的方法。

Description

用于治疗间皮素阳性癌症的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月30日提交的美国临时申请第63/085,971号和于2020年8月20日提交的美国临时申请第63/068,245号的优先权，其各自通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及过继性细胞疗法和癌症治疗学的领域。
通过引用并入序列表
序列表段落申请含有已经通过EFS-WEB以ASCII格式提交的序列表，并且通过引用将其全文并入本文。所述ASCII副本创建于2021年8月17日，被命名为A2BI_019_03WO_SeqList_ST25.txt，并且大小为1.08MB。
背景技术
细胞疗法是治疗各种疾病，特别是癌症的有力工具。在常规过继性细胞疗法中，将免疫细胞工程化以表达特异性受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其通过受体与靶细胞表达的配体的相互作用将免疫细胞的活性导向细胞靶。鉴定合适的靶分子仍然具有挑战性，因为许多靶分子在正常组织中表达。当移植细胞靶向表达靶分子的正常组织时，这种表达可能会导致毒性。因此，本领域需要用于通过过继性细胞疗法治疗疾病，特别是癌症的组合物和方法。
在1992年提出间皮素(MSLN)作为癌症靶(Chang等人，《癌症研究(Cancer Res)》52:181-86)，然而仍然没有利用MSLN的可行疗法。它不仅在大多数间皮瘤上表达，而且在卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌和肺腺癌的大亚型中也表达。(Hassan等人《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》34:4171-79)在正常成人中，MSLN仅存在于间皮中，间皮本身可能是非必需的组织。已经测试了几种针对MSLN的研究疗法；例如，免疫毒素缀合物、抗体-药物缀合物、双特异性抗体、CAR-T和杂合TCR-scFv。
所有有效的全身施用疗法都是有毒的。因此，本领域需要与MSLN(+)癌症治疗相关的组合物和方法。
发明内容
本文提供了与MSLN(+)癌症治疗相关的组合物和方法。有利地，本文公开的组合物和方法可以利用杂合性丢失(LOH)来解决MSLN(+)癌症。在一些情况下，本文公开的组合物和方法可以通过将MSLN靶向的活化剂受体与阻断剂受体配对来避免对正常组织的全身毒性。在不受理论束缚的情况下，由编码阻断剂抗原的基因座处的LOH引起的阻断剂抗原在肿瘤和正常组织中表达的差异可赋予对肿瘤杀伤的高选择性。
本公开提供了免疫细胞，其包含：(a)第一受体，其包含对间皮素(MSLN)特异性的细胞外配体结合结构域；和(b)第二受体，其包含对MSLN+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中第一受体是响应于MSLN的活化剂受体；并且其中第二受体是响应于非靶抗原的抑制性受体。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，非靶抗原通过杂合性丢失而在MSLN+癌细胞中丢失。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A、HLA-B或HLA-C蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*02。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含如公开于表6中的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表6或表7的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:42-47或SEQ ID NO:48-53的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于SEQ ID NO:42-47或SEQ ID NO:48-53的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含选自表5中公开的多肽序列的多肽序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:30-41中任一个，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含如公开于表2中的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表2的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含以下：包含表3中所示序列的可变重链(VH)部分和包含表4中所示序列的可变轻链(VL)部分；或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，其包含SEQ ID NO:233或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列；以及可变轻链(VL)部分，其包含SEQ ID NO:279或与其具有85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:3-6、80和154-215组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ IDNO:171的scFv序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体包含铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施例中，铰链结构域包含CD8α铰链结构域。在一些实施例中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:7的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:11的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ活化结构域。在一些实施例中，细胞内结构域包含SEQID NO:285的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:303的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1细胞内结构域包含与SEQ ID NO:70至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:74至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含与SEQ ID NO:73至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含LILRB1细胞内结构域、LILRB1跨膜结构域、LILRB1铰链结构域、任何这些的功能变体或其组合。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域、LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:71或与SEQ ID NO:71至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含SEQ ID NO:348的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，MSLN+癌细胞是间皮瘤癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、结肠直肠癌细胞、食道癌细胞、头颈癌细胞、肾癌细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞或胆管癌细胞，或表达MSLN的任何癌细胞。在一些实施例中，MSLN+癌细胞是间皮瘤癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞或肺腺癌细胞。
在一些实施例中，MSLN+癌细胞是上皮癌细胞。上皮癌是起源于上皮细胞的癌症。在一些实施例中，MSLN+上皮癌是癌。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，MSLN+癌细胞是不表达HLA-A*02的MSLN+/HLA-A*02-癌细胞。在一些实施例中，MSLN+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自MSLN+/HLA-A*02+细胞。在一些实施例中，在具有杂合性丢失的MSLN+/HLA-A*02-癌细胞存在下，第一受体和第二受体一起特异性活化免疫细胞。在一些实施例中，在未通过杂合性丢失而丢失HLA-A*02的MSLN+细胞存在下，第一受体和第二受体一起不特异性活化免疫细胞。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，T细胞是CD8+CD4-T细胞。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，MHC I类基因是β-2-微球蛋白(B2M)。在一些实施例中，免疫细胞进一步包含干扰RNA，该干扰RNA包含与B2M mRNA的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA包含选自表13所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的B2M mRNA的降解。在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含：(a)第一序列，其从5'端至3'端具有与B2M mRNA的序列互补的序列；以及(b)第二序列，其从5'端至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。在一些实施例中，shRNA由包含序列GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:349)或GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ ID NO:350)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列的序列编码。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，MHC I类基因是β-2-微球蛋白(B2M)。在一些实施例中，免疫细胞包含对编码B2M的序列的一种或多种修饰，其中一种或多种修饰降低B2M的表达和/或消除其功能。在一些实施例中，一种或多种修饰包含编码B2M的内源性基因的一种或多种失活突变。在一些实施例中，一种或多种失活突变包含缺失、插入、取代或移码突变。在一些实施例中，用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导物核酸(gNA)的复合物中引入一种或多种失活突变，该引导核酸特异性靶向编码B2M的内源性基因的序列。在一些实施例中，gNA包含选自表12所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，MHC I类基因是HLA-A*02。在一些实施例中，免疫细胞包含多核苷酸，其包含干扰RNA，该干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNA干扰(RNAi)介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)，其包含：(a)第一序列，其从5'端至3'端具有与HLA-A*02mRNA的序列互补的序列；以及(b)第二序列，其从5'端至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。在一些实施例中，shRNA包含14中所示的序列。在一些实施例中，免疫细胞包含对编码HLA-A*02的内源性基因的序列的一种或多种修饰，其中一种或多种修饰降低HLA-A*02的表达和/或消除其功能。在一些实施例中，一种或多种修饰包含编码HLA-A*02的内源性基因的一种或多种失活突变。在一些实施例中，用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入一种或多种失活突变，该引导核酸特异性靶向编码HLA-A*02的内源性基因的序列。在一些实施例中，gNA包含表11中所示的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:164的序列，并且第二受体包含SEQ ID NO:52的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，免疫细胞包含由包含GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:349)或GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ ID NO:350)的序列或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列编码的shRNA。在一些实施例中，第一受体和第二受体由单个多核苷酸编码，并且其中编码第一受体和第二受体的序列由编码自切割多肽的序列分开。在一些实施例中，自切割多肽包含T2A自切割多肽，其包含序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:351)。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞是自体的。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞是同种异体的。
本公开提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的免疫细胞，用作治疗MSLN+癌症的药物。
本公开提供了一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，该多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：(a)第一受体，其包含对间皮素(MSLN)特异性的细胞外配体结合结构域；和(b)第二受体，其包含对已经在MSLN+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中第一受体是响应于MSLN+癌细胞上的MSLN的活化剂受体；并且其中第二受体是响应于非靶抗原的抑制性受体。
在本公开的多核苷酸或多核苷酸系统的一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含用于生成本公开的免疫细胞的一种或多种多核苷酸，该多核苷酸包含编码第一受体和第二受体的多核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码对B2M特异性的shRNA的序列。在一些实施例中，编码第一受体、第二受体和对B2M特异性的shRNA的序列由相同的多核苷酸编码。在一些实施例中，(a)编码对B2M特异性的shRNA的序列包含GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:349)或GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ ID NO:350)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；(b)编码第一受体的序列包含编码SEQ ID NO:303的多肽的序列，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；和(c)编码第二受体的序列包含编码SEQ ID NO:348的多肽的序列，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列。
本公开提供了一种载体，其包含本公开的一种或多种多核苷酸。
本公开提供了杀死在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的MSLN+癌细胞的方法，其包含向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。
本公开提供了治疗患有在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的MSLN+肿瘤的受试者体内MSLN+癌症的方法，其包含向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。
本公开提供了治疗受试者体内癌症的方法，其包含：(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞的HLA-A基因型或表达；(b)任选地，确定受试者的多种癌细胞中的MSLN的表达；以及(c)如果正常细胞表达HLA-A*02并且多种癌细胞不表达HLA-A*02，并且多种癌细胞是MSLN阳性的，则向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。
在本公开的方法的一些实施例中，受试者是患有表达MSLN(MSLN+)并且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者。在一些实施例中，受试者是患有表达MSLN并且已经丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02患者。在一些实施例中，癌症包含
间皮瘤癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、结肠直肠癌或胆管癌。在一些实施例中，癌症包含间皮瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌或肺腺癌。在一些实施例中，癌症在受试者体内复发。在一些实施例中，癌症对一种或多种先前施用的抗癌疗法是难治性的。在一些实施例中，癌症是转移性的。
在本公开的方法的一些实施例中，癌细胞包含不表达HLA-A*02的MSLN+/HLA-A*02-癌细胞。在一些实施例中，MSLN+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自MLSN+/HLA-A*02+细胞。在一些实施例中，在MSLN+/HLA-A*02-癌细胞存在下，第一受体和第二受体一起特异性活化免疫细胞。在一些实施例中，在未丢失HLA-A*02的MSLN+细胞存在下，第一受体和第二受体一起不特异性活化免疫细胞。
在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物减小了受试者体内肿瘤的大小。在一些实施例中，肿瘤减小了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施例中，肿瘤被消除。
在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物阻止了受试者体内肿瘤的生长。
在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物减少了受试者体内肿瘤的数目。
在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物导致受试者体内癌细胞而非正常细胞的选择性杀伤。在一些实施例中，至少约60％的被杀死的细胞是癌细胞，约65％的被杀死的细胞是癌细胞，约70％的被杀死的细胞是癌细胞，约75％的被杀死的细胞是癌细胞，约80％的被杀死的细胞是癌细胞，约85％的被杀死的细胞是癌细胞，约90％的被杀死的细胞是癌细胞，约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％的被杀死的细胞是癌细胞。在一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物导致杀死受试者的至少约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的癌细胞。
在本公开的方法的一些实施例中，与施用包含第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用免疫细胞或药物组合物对受试者产生更少的副作用。
本公开提供了制备多种免疫细胞的方法，其包含：(a)提供多种免疫细胞，以及(b)用本公开的多核苷酸、多核苷酸系统或载体转化多种免疫细胞。
本公开提供了试剂盒，其包含本公开的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，试剂盒进一步包含使用说明书。
附图说明
图1是示出了来自TCGA数据库的阻断剂候选基因的表达的表格。(*)表示先前鉴定为在间皮中表达的基因。
图2是示出了间皮素(MSLN)在正常组织中表达的图。
图3是示出了MSLN在TCGA癌症(具有肿瘤和正常样品)中的表达的图。缩写：BLCA(膀胱癌)、BRCA(乳腺癌)、CESC(宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌)、CHOL(胆管癌)、COAD(结肠腺癌)、ESCA(食管癌)、GBM(多形性成胶质细胞瘤)、HNSC(头颈鳞状细胞癌)、KICH(肾嫌色细胞癌)、KIRP(肾乳头状细胞癌)、LIHC(肝细胞癌)、LUAD(肺腺癌)、LUSC(肺鳞状细胞癌)、PAAD(胰腺癌)、PRAD(前列腺癌)、PCPG(嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)、READ(直肠腺癌)、SARC(肉瘤)、SKCM(皮肤黑色素瘤)、THCA(甲状腺癌)、THYM(胸腺瘤)、STAD(胃腺癌)、UCEC(子宫内膜癌)。
图4是示出了CCLE细胞系中MSLN表达的图。
图5是示出了正常组织中LRRN4表达的图。
图6是示出了LRRN4在TCGA癌症(具有肿瘤和正常样品)中的表达的图。
图7是示出了LRRN4在TCGA肿瘤中的表达的图。
图8是示出了LRRN4在CCLE细胞系中的表达的图。
图9是示出了10个富含亮氨酸的重复序列(LRR)和纤连蛋白III型结构域相对于LRRN4的跨膜结构域的分布的图。这些结构域中的大多数可能位于细胞表面。
图10A示出了基于pMHC HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体在基于无细胞珠的测定中可以抑制Jurkat细胞的顺式活化。
图10B示出了使用白血病细胞系K562作为靶细胞，基于pMHC HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体可以通过MSLN scFv CAR抑制Jurkat细胞的活化。
图11是示出了基于pMHC HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体可以抑制Jurkat细胞的活化的图(左)和图表(右)，如通过使用基于pMHC HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体和HLA-A*02+HeLa和SiHa细胞作为靶细胞的MSLN scFv CAR对IFNγ的倍数诱导所测量的。
图12示出了基于pMHC HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体使用HLA-A*02+SiHa细胞而非HLA-A*02-SiHa细胞抑制MSLN CAR活化剂的杀伤。
图13是用于鉴定由于杂合性丢失而在癌细胞中丢失的潜在抑制性受体靶的生物信息学流水线的图。
图14是用于鉴定癌细胞中不表达的潜在抑制性受体靶的生物信息学流水线。
图15A是示出了HLA-A*02阻断剂抑制针对MSLN(一种高密度抗原)的MSLN CAR活化剂的一对图。用与表达MSLN或MSLN和HLA-A*02的K562细胞共培养的MSLN LBD1-CAR或MSLNLBD1-CAR和A2-LIR-1转染的Jurkat细胞显示仅在HLA-A*02存在下用A2-LIR-1阻断剂阻断高密度抗原的活化。
图15B是示出了HLA-A*02阻断剂抑制针对MSLN(一种高密度抗原)的MSLN CAR活化剂的一对图。在HLA-A*02存在下用A2-LIR-1阻断剂阻断MSLN LBD1-CAR T细胞对内源性MSLN+HeLa细胞的杀伤。
图15C是示出了HLA-A*02阻断剂抑制针对MSLN(一种高密度抗原)的MSLN CAR活化剂的一对图。示出了MSLN LBD2-CAR T细胞对内源性MSLN+HeLa细胞的杀伤。A2-LIR-1阻断剂对T细胞杀伤的作用部分受活化剂LBD控制，这表明可能需要进一步优化阻断剂模块或活化剂/阻断剂对。
图16是示出了在表达MSLN和HLA-A*02的HeLa细胞存在下，HLA-A*02LIR1抑制性受体(PA2.1，小鼠和人源化的)有效阻断表达MSLN第3代CAR的T细胞的杀伤的一系列图。顶行：MSLN+HLA-A*02+HeLa靶细胞；底行：MSLN+HLA-A*02-HeLa细胞(对照)。鼠SS1第3代CAR(右上，方框)提供了比人源化M5和人源化SS1 CAR更好的窗口。
图17是示出了在MSLN+HLA-A*02+Capan-2细胞存在下，HLA-A*02LIR1抑制性受体(PA2.1，小鼠和人源化的)有效阻断表达MSLN第3代CAR的T细胞的杀伤的一系列图。
图18是示出了表达具有鼠SS1scFv的第2代CAR的T细胞对天然为MSLN+HLA-A*02+的MSLN+HLA-A*02+HeLa细胞(左)或HCT116野生型(WT)细胞的杀伤被HLA-A*02scFv LIR1抑制性受体有效阻断的一对图。
图19是一系列荧光活化细胞分选(FACS)图，示出了在有和没有HLA-A*02scFvLIR-1阻断剂共转导的情况下，T细胞对鼠SS1第二代CAR的表达。
图20A是示出了LIR-1铰链对HLA-A*02抑制性受体阻断KRAS TCR活化Jurkat细胞的能力的影响的图。H：铰链，T：跨膜结构域，ICD：细胞内结构域，s：短。图20B更详细地描述了LIR-1构建体。具有较短LIR-1铰链的人源化PA2.1和人源化BB7.2的阻断类似于原始的更长铰链。
图20B是示出了表达KRAS TCR活化剂和HLA-A*02scFv LIR-1抑制性受体的Jurkat细胞的EC50偏移(+/-HLA-A*02靶细胞)的图和表，抑制性受体如在底部表中示出(SEQ IDNO:352-356)。
图21A是示出了LIR-1铰链对HLA-A*02抑制性受体阻断KRAS TCR活化Jurkat细胞的能力的影响的图。H：铰链，TM：跨膜结构域，ICD：细胞内结构域，s：短；tr：截短。图21B更详细地描述了LIR-1构建体。具有稍长铰链的小鼠PA2.1在T2-Jurkat测定中的功能类似于原始的LIR-1铰链。
图21B是示出了表达KRAS TCR活化剂和HLA-A*02scFv LIR-1抑制性受体的Jurkat细胞的EC50偏移(+/-HLA-A*02靶细胞)的图和一对表，抑制性受体如在底部表中示出(SEQID NO:357-361)，长度如左表所示。
图22A和图22B示出了用两种靶实现选择性细胞毒性的Tmod方法(Tmod是指表达活化剂和抑制性受体的组合的免疫细胞)。图22A示出了肺(和其它重要器官)被MSLN(+)间皮衬里包围，对MSLN靶向的药物产生高的靶上、肿瘤外毒性风险。通过选择HLA-A*02杂合的患者，其肿瘤已经通过LOH丢失了该等位基因，有机会靶向MSLN活化的CAR-T细胞以特异性杀死肿瘤细胞并使正常间皮免受伤害。图22B示出了MSLN靶向的Tmod构建体(Tmod是指成对的活化剂和抑制性受体)的分子组成。这两种受体在单个构建体中共表达，编码的融合蛋白在细胞中切割以生成活化剂和阻断剂。
图23A、图23B、图23C和图23D示出了选择性MSLN结合剂的分离和表征。靶上探针标记可溶性MSLN(百普赛斯生物科技公司(Acro Bio))；用于反选择的脱靶探针是可溶性CEA和EGFR蛋白的混合物。图23A示出了IgG文库的富集。图23B示出了scFv文库的富集。图23C示出了Jurkat细胞中MSLN CAR(Gen3)的表面表达。用CAR构建体转染细胞并用蛋白L或单体可溶性MSLN染色(参见方法)。基准和CAR1-6表达直方图被标记。PE，藻红蛋白；NA，中性抗生物素蛋白；SA，链霉抗生物素蛋白。“靶上NGS”对应于收集并进行DNA测序以确定个体独特型富集的细胞群体。图23D示出了MSLN结合剂在固态Jurkat细胞测定中的表征，其中MSLN蛋白附着于表面(参见Hamburger等人，2020)。在Jurkat细胞中瞬时转染携带不同scFv的62个CAR构建体(Gen3)以表达CAR，并在6小时后评估对表面结合的重组人sMSLN(百普赛斯生物科技公司)的功能应答。大多数导致一定程度的应答。
图24A示出了MSLN CAR对基准CAR M5、SS1和m912的敏感性。除SS1(Gen2)外，所有构建体均为Gen3。在6小时共培养测定中测量Jurkat细胞剂量-应答(RLU)以评估敏感性：(1)使用滴定的编码MSLN的mRNA转染HEK293细胞；(2)QIFIKIT(定量分析试剂盒，安捷伦科技公司(Agilent))用于将基于流式细胞术的表面表达转化为MSLN分子/细胞；以及(3)通过拟合剂量-应答曲线计算6种新型的和三种基准CAR的分子/细胞敏感性(EC50)。对于那些敏感性低于测定检测限的CAR，EC50报告为<3000MSLN分子/细胞。还记录了每个构建体的最大信号(E最大)。实验重复1至4次。
图24B示出了CAR3选择性。MSLN CAR3选择性的实例以M5CAR为基准。在Jurkat细胞功能测定中通过MSLN(+)或MSLN(-)细胞系测量CAR的活化。对于MSLN(+)细胞系，通过MSLN敲除生成变异的MSLN(-)版本用于比较。关于更详细的脱靶表征，参见图32B。
图25A示出了通过用MSLN mAb染色和流式细胞术评估的人细胞系中MSLN的表达。K562显示出对抗MSLN抗体的一些交叉反应性，尽管没有观察到对CAR3或M5基准CAR的功能反应性。
图25B示出了绘制的MSLN和A*02mRNA(CCLE)和蛋白质(QIFIKIT)的水平，显示了相关性。使用标准曲线计算蛋白质和mRNA水平之间的转化率(参见下文实例8的方法)。
图26A示出了本研究中使用的细胞系的概述。在各种癌细胞系中MSLN和A*02的表面密度的定量，以及在正常肺组织(GTEx)中相应报告的mRNA水平。使用QIFIKIT(定量分析试剂盒，安捷伦科技公司)定量工程化和野生型肿瘤细胞系的表面MSLN和A*02。当细胞系HLA-A单倍型对A*02是杂合的时，将TPM值除以2。注意，在某些情况下，HLA-A等位基因拷贝数是未知的。MS751+转导的A*02(438TPM)的TPM值通过使用标准曲线测量其表面A*02蛋白水平来估计。用HLA-A*02转导的细胞系比表达内源性蛋白质水平的细胞系更好地模拟了正常肺组织的A*02:MSLN比率(粗体黑框)。TPM，每百万转录物；na，不适用；A*02:HLA-A*02。
图26B示出了使用QIFIKIT定量MSLN分子/细胞。使用抗人MSLN小鼠抗体克隆618923(R&D系统公司)染色约100,000个细胞。洗涤细胞后，用抗小鼠IgG F(ab')2二抗(英杰公司(Invitrogen)A21237)染色细胞和QIFI珠。使用QIFI抗原标准曲线定量表面上MSLN分子的数目。
图27A示出了Jurkat细胞功能测试中MSLN CAR Tmod构建体的表征。将六种源自HuTARG的MSLN活化剂(CAR1-6)和基准CAR M5和SS1活化剂与A*02阻断剂(实心圆)或空载体对照(空心圆)配对。将表达CAR+/-阻断剂的Jurkat NFAT荧光素酶细胞与用A*02:01mRNA滴定转染的野生型内源性MSLN(+)HeLa细胞共培养。共培养6小时后评估功能反应(RLU)。使用QIFIKIT定量表面上的滴定抗原分子。IC50(分子/细胞)值示于图中。CAR1-6是Gen3；CAR M5和SS1是Gen2。
图27B示出了MSLN(-)HeLa靶细胞中MSLN和A*02mRNA的二维滴定，以确定Jurkat细胞中MSLN CAR3 Tmod构建体的EC50。用连续稀释的MSLN mRNA和恒定的A*02mRNA转染MSLN(-)HeLa靶细胞，并且瞬时转染Jurkat细胞以表达MSLN CAR3和A*02阻断剂。共培养6小时后评估功能反应(RLU)。
图27C示出了用连续稀释的A*02mRNA和恒定的MSLN mRNA转染MSLN(-)HeLa靶细胞，以确定Jurkat细胞中MSLN CAR3 Tmod构建体的IC50。
图28A示出了MSLN和A*02mRNA和蛋白质的标绘水平。构建体在正常(GTEx数据库)和肿瘤组织和细胞系(TCGA、CCLE数据库)中相对于MSLN和HLA-A表达水平的EC50和IC50。使用图25B中所示的标准曲线计算蛋白质和mRNA水平之间的转化；方法)。图中示出的Hela和MS751 A*02转基因细胞系变体更好地模拟了正常组织中的活化剂和阻断剂靶比率。
图28B示出了原代T细胞中的MSLN CAR和CAR3Tmod细胞毒性。如图所示，用CAR或Tmod转导的原代T细胞与肿瘤或正常靶细胞以效应物：靶(E:T)＝1:1共培养48小时。A*02:MSLN(B:A)靶抗原比率范围为2-27:1。M5是Gen2 CAR；所有其它是Gen3。肿瘤＝MSLN(+)A*02(-)靶细胞；正常＝MSLN(+)A*02(+)靶细胞。
图29A示出了在细胞毒性测定中与A*02阻断剂配对的引导CAR3受体与基准CAR的比较。SS1 CAR是Gen2构建体；其它是Gen3。使用2个单独的慢病毒载体用各种CAR+/-A*02阻断剂转导的原代T细胞与内源性MSLN(+)A*02(-)肿瘤或MSLN(+)A*02(+)正常HeLa细胞一起培养以评估细胞毒性。通过用未转导的T细胞稀释将转导的原代T细胞标准化为恒定的活化剂或活化剂-阻断剂双阳性群体百分比[15％A(+)或A(+)B(+)]细胞，最终有效效应物：靶(E:T)比率为0.6:1或0.3:1。当T细胞也表达A*02阻断剂时，在A*02抗原存在下，这两种E:T比率都导致选择性杀伤。
图29B示出了与肿瘤或正常靶细胞共培养48小时后分泌的IFN-g。
图30A示出了在混合的肿瘤和正常细胞共培养物中，MSLN CAR3Tmod细胞选择性地杀死RFP(+)肿瘤细胞并使GFP(+)正常细胞免受伤害。由于HeLa细胞系的粘附性质，被杀死的靶倾向于以簇的形式保留在表面上。白色箭头指向一些被杀死的RFP(+)肿瘤细胞的实例。E:T 0.6:1和正常：肿瘤＝1:1的实例。
图30B示出了在混合的正常和肿瘤共培养物中的细胞毒性，其中E:T＝1:1，正常：肿瘤＝9:1(其它比率见图31B)。用CAR3或CAR3 Tmod构建体转导的原代T细胞与HeLa靶细胞共培养48小时，并使用分别在MSLN(+)A*02(+)正常细胞系和MSLN(+)A*02(-)肿瘤细胞系中表达的GFP和RFP成像。
图31A示出了在混合的肿瘤和正常细胞共培养物中，MSLN CAR3Tmod细胞选择性地杀死RFP(+)肿瘤细胞。用CAR3 Tmod构建体转导的原代T细胞与HeLa细胞共培养48小时，并使用分别在MSLN(+)A*02(+)正常细胞系和MSLN(+)A*02(-)肿瘤细胞系中表达的GFP和RFP成像。
图31B示出了在混合的正常和肿瘤共培养中CAR3和CAR3Tmod的细胞毒性，其中正常：肿瘤范围为9:1至1:9；E:T＝0.6:1。
图32A示出了MSLN CAR3Tmod构建体介导选择性的、持久性的和可逆的细胞毒性。CAR3或CAR3 Tmod转导的原代T细胞与肿瘤或正常靶细胞以E:T＝1.2:1共培养48小时。然后收集T细胞，去除死的或未粘附的靶细胞，并再次接种到新鲜的肿瘤或正常靶细胞上，持续另外48小时。RACA，重复抗原攻击测定。R1，第1轮；R2，第2轮。
图32B示出了在Jurkat细胞功能测定中对MSLN(+)和MSLN(-)对照靶细胞的子集的MSLN CAR3 Tmod构建体选择性，其未示出脱靶活性(参见下文实例8的方法)。柱高度对应于技术复制的平均值。
图33A示出了RACA(重复抗原攻击测定)和可逆性测定的示意图。CAR3或CAR3Tmod转导的原代T细胞与肿瘤或正常靶以E:T＝1.2:1共培养48小时。然后收集T细胞，去除任何死亡或脱落的靶细胞，并再次接种到新鲜肿瘤或正常靶上，持续另外48小时。
图33B示出了可溶性循环MSLN(sMSLN)不影响CAR-T活性。M5基准CAR或CAR3对肿瘤或正常靶细胞的急性细胞毒性不受500ng/mL sMSLN(百普赛斯生物科技公司)存在的影响。
图33C示出了用标记的sMSLN单体或四聚体对瞬时转染的CAR(+)Jurkat细胞的染色，通过流式细胞术分析显示sMSLN在结构上是完整的并且能够结合受体。
图34A、图34B和图34C示出了Tmod构建体在异种移植模型中介导肿瘤细胞的选择性杀伤。图34A示出了双侧翼肿瘤和正常MS751异种移植模型的示意图。图34B示出了在色标右侧的生物发光值，以光子/sec/cm2/sr的通量单位表示。第0天＝T细胞注射前；第8天和第15天＝T细胞注射后。图34C示出了通过测径测量评估的移植物大小(参见下文实例8的结果)。
图35A、图35B和图35C示出了MSLN CAR Tmod在异种移植模型中选择性地杀死肿瘤。图35A示出了用MSLN CAR或CAR3 Tmod转导的原代T细胞与HLA-A KO肿瘤或A*02转基因正常MS751靶细胞在体外以E:T＝1.4:1共培养48小时。M5是Gen2CAR；所有其它是Gen3。肿瘤＝MSLN(+)A*02(-)靶细胞；正常＝MSLN(+)A*02(+)靶细胞。图35B示出了图34C所示数据的单个小鼠异种移植物生长曲线。图35C示出了T细胞注射后正常和肿瘤细胞的BLI定量。
图36示出了A*02阻断剂在A*02(+)或(-)T细胞中的顺式结合消除了功能。由于自体A*02的顺式结合，A*02四聚体对A*02(+)Jurkat细胞和原代T细胞中阻断剂的结合显著降低。结合降低(由于阻断剂的可用性降低)与阻断剂活性降低相关。以E:T＝0.5:1示出细胞毒性测定。
图37A、图37B和图37C示出了MSLN Tmod系统可以扩展到自体T细胞。图37A示出了A*02(+)供体中自体A*02的顺式结合消除了通过CRISPR与A*02四聚体B2M敲除(KO)的结合，恢复了如通过与A*02四聚体的结合所证明的阻断剂可用性，类似于在A*02(-)供体中观察到的水平。图37B示出了细胞毒性测定，其示出用肿瘤(实线)或正常(空心)靶细胞培养的仅活化剂和MSLN SS1 CAR Tmod原代T细胞。MSLN SS1CAR Tmod构建体杀死MSLN(+)A*02(-)肿瘤HeLa靶细胞，但在存在自体A*02时由于顺式结合而不再阻断。对于A*02(+)供体，仅通过B2M CRISPR KO实现阻断。E:T＝1.2:1。图37C示出了48小时的代表性图像。
图38A示出了通过多轮细胞分选从scFv文库中富集抗HLA-A*11结合剂。靶上探针标记HLA-A*11四聚体；脱靶蛋白是不相关的MHC四聚体的混合物。
图38B示出了mRNA滴定测定中的Jurkat细胞活化：用连续稀释的HLA-A*11mRNA转染Hela靶细胞，并瞬时转染Jurkat细胞以表达HLA-A*11CAR4。共培养6小时后评估功能反应(RLU)。PE，藻红蛋白。
图39A示出了表达MSLN CAR3和A*03、A*11或B*07阻断剂构建体的Jurkat细胞在内源性MSLN(+)HeLa靶细胞上存在增加的阻断剂抗原时被阻断。
图39B和图39C示出了MSLN CAR3+A*11阻断剂的原代T细胞细胞毒性测定。用CAR3和A*11:01定向阻断剂转导的原代T细胞用A*11:01有效地阻断HeLa靶细胞，并与仅含CAR的细胞一样有效地杀死野生型HeLa细胞。将转导的原代T细胞与HeLa细胞在有或没有HLA-A*11:01的情况下以E:T＝0.8:1共培养。注意，这里使用的肿瘤和正常靶细胞都表达GFP。图39C示出了图39B在48小时的代表性共培养图像。
具体实施方式
本文提供了使用免疫细胞治疗癌症的组合物和方法，免疫细胞包含响应于癌症和正常(即健康或野生型)细胞之间的配体的基因表达差异的双受体系统。这些表达上的差异可能是由于癌细胞中杂合性的丢失。替代地，表达的差异可能是因为基因表达在癌细胞中不表达，或在癌细胞中以低于正常细胞的水平表达。双受体系统在免疫细胞中表达，例如在过继性细胞疗法中使用的免疫细胞，并且将这些免疫细胞的活性靶向表现出杂合性丢失或表达差异的癌细胞。在这种双受体系统中，第一受体(活化剂受体，有时在本文中称为A模块)活化或促进免疫细胞的活化，而第二受体(抑制性受体，有时在本文中称为阻断剂、抑制剂受体或B模块)起抑制第一受体活化免疫细胞的作用。每个受体含有结合特异性配体的配体结合结构域(LBD)。在配体结合时来自两种受体的信号被免疫细胞整合。第一受体和第二受体的配体在癌症和正常细胞中的差异表达，例如通过编码抑制性配体的基因座在癌细胞中的杂合性丢失，或转录水平的差异，介导免疫细胞被表达第一活化剂配体但不表达第二抑制性配体的靶癌细胞活化。
来自大规模染色体缺失的杂合性丢失(LOH)是肿瘤中遗传差异的来源。LOH是肿瘤发生中的常见事件，其几乎影响基因组中的每个基因座，在平均肿瘤中大约20％的基因显示LOH。LOH提供了以确定的方式区分肿瘤与正常组织的方法，因为可以发现其中所有恶性细胞都缺乏某些种系等位基因的肿瘤。经历LOH的一个基因座是人白细胞抗原(HLA)基因座，其编码多态性的、丰富的、普遍存在的表面抗原。本文所述的双受体系统采用一种受体来活化暴露于肿瘤抗原阳性肿瘤细胞的T细胞(有时称为“活化模块”)，并采用第二种受体来防止在表面阻断剂抗原(如HLA-A*02蛋白)存在下免疫细胞的活化。本文所述的双受体系统(有时在本文中称为“Tmod”)具有作为细胞疗法的其它有利性质，包括但不限于免疫细胞的可逆活化/阻断，以及在肿瘤和“正常”细胞的混合物中的选择性。
在本文提供的组合物和方法的具体实施例中，包含本文所述的双受体系统的免疫细胞用于治疗间皮素(MSLN)阳性癌症。这包括间皮瘤癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、结肠直肠癌或胆管癌。在一些实施例中，癌症在受试者体内复发。在一些实施例中，癌症对一种或多种先前施用的抗癌疗法是难治性的。在一些实施例中，癌症是转移性的。在MSLN阳性癌症的情况下，活化剂受体的靶抗原是MSLN或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。MSLN在正常脂肪、输卵管、肺和唾液腺组织等中表达(图2)。由于其在某些肿瘤中的表达，MSLN是一种有吸引力的肿瘤特异性抗原，如果这些癌细胞可以用合适的治疗剂特异性靶向，则其可以介导MSLN+肿瘤的选择性杀伤。然而，非癌(非靶)细胞中正常的MSLN表达已经阻止MSLN有效用于靶向疗法，如过继性细胞疗法。通过将MSLN活化剂受体与抑制性受体配对，本文提供的方法增加了过继性细胞疗法的特异性并降低了与这些疗法相关的有害作用，如剂量限制性毒性。
在一些实施例中，活化剂的配体是与MHC I类复合的MSLN肽。在本文所述的方法中，这种MSLN靶向活化剂受体与抑制性受体配对，其通过阻断活化剂对正常MSLN阳性组织的细胞溶解作用而增加活化剂的安全窗口。然而，由于肿瘤细胞不表达抑制剂或阻断剂受体的配体，活化剂受体仍然指导由包含双受体系统的免疫细胞靶向杀伤肿瘤细胞。第二抑制性受体的靶由MSLN阳性组织(如肺、间皮和脂肪组织)表达，但在癌细胞中不表达，并且抑制性受体将这种“非靶抗原”识别为抑制性刺激。第二抑制性受体的示例性靶由肺组织表达，并且由于杂合性丢失(LOH)或其它机制而从MSLN阳性癌细胞中丢失，在癌细胞中留下单个等位基因形式，其可以经由抑制性受体上的等位基因特异性配体结合结构域与其它等位基因区分开。抑制性受体的示例性靶包括但不限于主要组织相容性复合物(MHC)蛋白，如人白细胞抗原A(HLA-A)、HLA-B、HLA-C和其它HLA。HLA由变异基因编码，如HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-C*07等，其可以通过杂合性丢失而从MSLN阳性癌细胞中丢失。替代地，抑制性受体的其它示例性靶包括但不限于细胞间粘附分子1(ICAM1)、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)和C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)。这些中的每一种具有共同的非同义变体形式，在其可接近抗体的细胞外结构域中具有氨基酸改变，其可用作细胞整合体的抑制性受体或阻断剂受体靶，该细胞整合体被设计成用由活化剂受体(如MSLN或MSLN pMHC反应性活化剂受体)活化的工程化T细胞安全地治疗患有MSLN阳性癌症的患者。
本公开的组合物和方法可以减少或消除由MSLN在正常组织上的表达引起的剂量限制性毒性(DLT)。本公开提供了使用过继性细胞疗法通过添加第二抑制性受体靶向癌细胞中的MSLN以治疗MSLN阳性癌症的方法，第二抑制性受体在第二配体(不同于MSLN的配体，称为非靶抗原或替代地，阻断剂抗原)的存在下阻断过继性免疫细胞的活化。使用本文所述的组合物和方法，表达MSLN的肿瘤细胞受到表达两种受体的过继性细胞(如免疫细胞)攻击，因为这些肿瘤细胞仅表达活化剂配体MSLN。相反，表达MSLN加上非靶抗原的正常细胞被保护免受过继性免疫细胞的影响。对正常细胞上的非靶抗原的抑制性受体应答阻止了MSLN靶向的活化剂受体对免疫细胞的活化。这种双重靶向方法产生了治疗窗口，其将允许在MSLN阳性癌症患者中安全且有效地施用MSLN定向细胞疗法。
本公开提供了允许使用有效的MSLN CAR和TCR的方法和组合物，这些有效的MSLNCAR和TCR诱导靶向毒性，并且通过减轻其毒性使这些MSLN靶向受体可用作治疗剂。
在变化形式中，本文所述的组合物和方法可用于杀死靶细胞和/或治疗其中非靶抗原的表达因杂合性丢失以外的原因而部分或完全降低的受试者，这些原因包括但不限于编码非靶抗原的序列中的部分基因缺失、表观遗传沉默和点突变或截短突变。
定义
在更详细地阐述本公开之前，提供本文使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在特定实施例的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，下面定义以下术语。其它定义在本公开内容中阐述。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
如本文所用，术语“分离的”意指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随它的组分的材料。在特定实施例中，术语“获得的”或“衍生的”与分离的同义使用。
术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人。也包括体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。本文所用的“受试者”、“患者”或“个体”包括表现出可用本文预期的载体、组合物和方法治疗的疼痛的任何动物。合适的受试者(例如，患者)包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(如猫或狗)。包括非人灵长类动物，优选地包括人患者。
本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括任何有益或期望的效果，甚至可以包括症状的最小改善。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病状或其相关症状。
如本文所用，“预防(prevent)”和如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等类似词语表示用于预防、抑制或降低疾病症状的可能性的方法。它还指延迟疾病或病状的发作或复发或延迟疾病症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病发作或复发之前降低疾病的强度、作用、症状和/或负担。
如本文所用，术语“量”是指实现有益或期望的预防或治疗结果(包括临床结果)的病毒的“有效量(an amount effective)”或“有效量(an effective amount)”。
病毒或细胞的“治疗有效量”可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及病毒或细胞在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过病毒或细胞的任何毒性或有害效果的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。
生理反应(例如，电生理活性或细胞活性)的“增加的”或“增强的”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括增加1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括在1之间和1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)未处理细胞中的活性水平。
生理反应(例如，电生理活性或细胞活性)的“降低的”或“减少的”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括降低1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括在1之间和1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)未处理细胞中的活性水平。
“维持(maintain)”或“保存(preserve)”或“维持(maintenance)”或“无变化”或“无显著变化”或“无显著降低”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的响应相当的生理反应。可比较的应答是与参考应答没有显著差异或可测量的差异的应答。
通常，“序列同一性”或“序列同源性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应关系。通常，用于确定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二个核苷酸或氨基酸序列进行比较。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过测定它们的“同一性百分比”进行比较。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并乘以100。同一性百分比也可以例如通过使用高级BLAST计算机程序(包括2.2.9版，可从国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)获得)比较序列信息来确定。BLAST程序基于Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:2264-2268(1990)的比对方法并讨论于Altschul等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410(1990)；Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊》90:5873-5877(1993)；和Altschul等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402(1997)。简言之，BLAST程序将同一性定义为相同比对符号(通常为核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列中符号的总数。该程序可用于测定所比较蛋白质全长的同一性百分比。提供默认参数以优化使用短查询序列的搜索，例如在blastp程序中。该程序还允许使用SEG过滤器来屏蔽由Wootton和Federhen，《计算机与化学(Computersand Chemistry)》17:149-163(1993)的SEG程序确定的查询序列的区段。所需序列同一性程度的范围为大约80％至100％和其间的整数值。通常，公开的序列和要求保护的序列之间的同一性百分比是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
如本文所用，“多核苷酸系统”是指一种或多种多核苷酸。一种或多种多核苷酸可以被设计成与特定应用协同工作，或产生所需的转化细胞。
本文使用的术语“外源性”是指源自生物体外部的任何分子，包括核酸、蛋白质或肽、小分子化合物等。相反，术语“内源性”是指源自生物体内部(即，由生物体天然产生)的任何分子。
术语“MOI”在本文中用于指感染复数，其为药剂(例如病毒颗粒)与感染靶(例如细胞)的比率。
在本说明书中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。术语“约”，当紧接在数字或数值之前时，意指数字或数值的范围为±10％。
如本文所用，“靶细胞”是指通过过继性细胞疗法靶向的细胞。例如，靶细胞可以是癌细胞，其可以被过继性细胞疗法的移植T细胞杀死。本公开的靶细胞表达如本文所述的靶抗原，但不表达非靶抗原。
如本文所用，“非靶细胞”是指不被过继性细胞疗法靶向的细胞。例如，在靶向癌细胞的过继性细胞中，正常、健康、非癌细胞是非靶细胞。受试者体内一些或全部非靶细胞可以表达靶抗原和非靶抗原两者。受试者体内非靶细胞可以表达非靶抗原，而不管这些细胞是否也表达靶抗原。
如本文所用，“非靶等位基因变体”是指其产物由非靶细胞表达但不由靶细胞表达的基因的等位基因。例如，非靶等位基因变体是由受试者的正常非癌细胞表达，但不由受试者的癌细胞表达的基因的等位基因。非靶等位基因变体的表达可以通过任何机制在癌细胞中丢失，包括但不限于编码非靶等位基因变体的基因的杂合性丢失、突变或表观遗传修饰。
如本文所用，当关于配体结合结构域(如抗原结合结构域)使用时，“特异于”或“特异性结合于”是指对指定靶具有高特异性的配体结合结构域。抗体特异性可被视为配体结合结构域与相应配体之间的拟合优度，或配体结合结构域区分相似或甚至不相似配体的能力的量度。与特异性相比，亲和力是配体结合结构域与配体之间的结合强度的量度，使得低亲和力配体结合结构域结合微弱，而高亲和力配体结合结构域结合牢固。对靶等位基因特异性的配体结合结构域是能够区分基因的不同等位基因的配体结合结构域。例如，对HLA-A*02特异性的配体结合结构域将不结合，或仅微弱地结合其它HLA-A等位基因，如HLA-A*01或HLA-A*03。本领域技术人员将理解，配体结合结构域可以被称为对特定靶是特异性的，并且仍然具有低水平的与一种或多种不影响其在本文所述的受体系统中的功能的额外靶的结合。
如本文所用，“靶抗原”，无论使用术语抗原或特定抗原的名称提及，是指由靶细胞(如癌细胞)表达的抗原。靶抗原的表达不限于靶细胞。靶抗原可以由受试者体内癌细胞和正常的非癌细胞表达。
如本文所用，“非靶抗原”(或“阻断剂抗原”)无论使用术语抗原或特定抗原的名称提及，是指由正常非癌细胞表达且在癌细胞中不表达的抗原。这种表达差异允许抑制性受体在非靶细胞存在下而不是在靶细胞存在下抑制免疫细胞活化。
多态性是指一个群体中核苷酸序列的两种或多种变体的存在。多态性可以包含一个或多个碱基改变、插入、重复或缺失。多态性包括例如简单序列重复(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)，其为当腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)的单核苷酸改变时发生的变异。
如本文所用，“亲和力”是指配体与受体上的单个配体结合位点的结合强度，例如针对本文中所述的任何受体的抗原结合结构域的抗原。配体结合结构域可以与其配体具有较弱的相互作用(低亲和力)或较强的相互作用(高亲和力)。
Kd或解离常数是一种平衡常数，其测量较大物体可逆地分离成较小组分的倾向，例如当包含受体及其同源配体的大分子复合物分离成配体和受体时。当Kd高时，这意味着需要高浓度的配体来占据受体，并且受体对配体的亲和力低。相反，低Kd意味着配体对受体具有高亲和力。
如本文所用，“响应”或“响应于”的受体是指包含细胞内结构域的受体，其当与配体(即抗原)结合时生成对应于细胞内结构域的已知功能的信号。与靶抗原结合的活化剂受体可以生成引起表达活化剂受体的免疫细胞活化的信号。与非靶抗原结合的抑制性受体可以生成抑制信号，其阻止或减少表达活化剂受体的免疫细胞的活化。受体的反应性及其活化或抑制表达受体的免疫细胞的能力可以通过本领域已知的和本文所述的任何方法测定，包括但不限于报告基因测定和细胞毒性测定。
如本文所用，免疫细胞或“活化”或“被活化”的免疫细胞是指能够执行免疫应答的一种或多种特征性功能的免疫细胞。这些功能包括增殖、细胞因子释放和细胞毒性，即杀死靶细胞。活化的免疫细胞表达对本领域技术人员显而易见的标记。例如，活化的T细胞可以表达CD69、CD71、CD25和HLA-DR中的一种或多种。当表达活化剂受体(例如MSLN CAR)的免疫细胞对受体与靶细胞表达的靶抗原(例如MSLN)的结合产生应答时，其可以被活化剂受体活化。“靶抗原”也可以称为“活化剂抗原”，并且可以由靶细胞分离或表达。当抑制性受体对非靶抗原(例如HLA-A*02)有响应时，甚至当活化剂受体与靶活化剂配体结合时，表达抑制性受体的免疫细胞的活化也可以被阻止。“非靶抗原”也可以称为“抑制性配体”或“阻断剂”，并且可以由靶细胞分离或表达。
免疫细胞上的受体表达可以通过报告本文所述的活化剂受体和抑制性受体的存在的测定进行验证。例如，可以用标记的分子(例如荧光团标记的受体特异性抗体或荧光团标记的受体特异性配体)对免疫细胞群体进行染色，并使用荧光活化细胞分选(FACS)流式细胞术进行定量。该方法允许免疫细胞群体中免疫细胞的百分比表征为表达活化剂受体、抑制性受体或两种受体。本文所述免疫细胞表达的活化剂受体和抑制性受体的比例可以通过例如数字液滴PCR进行测定。这些方法可用于表征用于产生和制造本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒的细胞群体。对于本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒，应理解表达活化剂受体和抑制性受体两者的免疫细胞的合适百分比是针对本文所述的方法特异性确定的。例如，表达活化剂受体和抑制性受体的免疫细胞的合适百分比可以是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。作为另一个实例，50％至99％之间、60％至95％之间、65％至95％之间、65％至90％之间、70％至90％之间、75％至90％之间、75％至85％之间、80％至99％之间、85％至99％之间、90％至99％之间或95％至99％之间的免疫细胞可以表达活化剂受体和抑制性受体两者。例如，免疫细胞中活化剂受体与抑制性受体的合适比例可以是约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4或约1:5。应理解，纯化、富集和/或耗竭步骤可用于免疫细胞群体以满足本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适值。
本文所述的免疫细胞表达的应答受体可以通过测量预期由受体的细胞内结构域生成的信号的生成的测定进行验证。报告细胞系，如Jurkat-荧光素酶NFAT细胞(Jurkat细胞)可用于表征应答受体。Jurkat细胞衍生自T细胞并包含稳定整合的活化T细胞核因子(NFAT)-诱导型荧光素酶报告系统。NFAT是免疫细胞活化所需的转录因子家族，其活化可用作T细胞活化的信号标记。可以用本文所述的活化剂受体和/或抑制性受体转导或转染Jurkat细胞。如果Jurkat细胞表达荧光素酶报告基因，则活化剂受体对配体的结合有应答，应答的水平可以通过报告基因表达的水平来确定。萤光素酶的存在可以使用任何已知的萤光素酶检测试剂(如萤光素)来测定。如果当在Jurkat细胞中与活化剂受体共表达时，抑制性受体对配体的结合有应答，它阻止正常应答的免疫细胞表达对活化剂受体应答的荧光素酶。例如，可以通过观察以下各项在表达活化剂和抑制剂两者的Jurkat细胞中确定和定量抑制性受体的响应性：1)Jurkat细胞在存在活化剂受体配体和不存在抑制性受体配体的情况下表达荧光素酶；和2)在活化剂受体配体和抑制性受体配体存在下，Jurkat细胞中的荧光素酶表达减少或消除。该方法可用于测定活化剂受体以及活化剂受体和抑制性受体的特异性对的敏感性、效力和选择性。可以使用剂量-应答实验通过EC50或IC50值定量敏感性、效力和选择性，其中将活化剂受体配体和/或抑制性受体配体滴定到表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的Jurkat细胞培养物中。替代地，EC50和IC50值可以在表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特定对的免疫细胞(例如Jurkat细胞或原代免疫细胞)与表达增加量的活化剂配体或抑制剂配体的靶细胞的共培养物中测定。通过例如将编码mRNA的活化剂配体或抑制剂配体滴定到靶细胞中，或使用天然表达不同水平的靶配体的靶细胞，可以在靶细胞中实现活化剂配体或抑制剂配体的增加量。使用表达不同量的靶配体和非靶配体的靶细胞测定的活化剂和抑制性受体的示例性合适EC50和IC50值包括活化剂受体的每百万10个转录物(TPM)或更低的EC50，例如2至10TPM之间的EC50，以及抑制性受体的25TPM或更低的IC50，例如5至21TPM的IC50。
表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的本文所述的免疫细胞的活化可以进一步通过在与所述免疫细胞共孵育后测量靶细胞活力的测定来确定。免疫细胞，有时称为效应细胞，与表达活化剂受体配体、抑制性受体配体或活化剂和抑制性受体配体两者的靶细胞共孵育。共孵育后，使用测量细胞培养物中活力的任何方法测量靶细胞的活力。例如，可以使用线粒体功能测定来确定活力，该线粒体功能测定使用四唑盐底物来测量活性线粒体酶。也可以使用基于成像的方法确定活力。靶细胞可以表达荧光蛋白，如绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。总细胞荧光的降低表明靶细胞活力的降低。在与表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的免疫细胞一起孵育后，靶细胞活力的降低解释为靶细胞介导的免疫细胞的活化。免疫细胞选择性的测量也可以使用这种方法来确定。如果观察到以下情况，则表达一对活化剂和抑制性受体的免疫细胞是选择性的：1)在表达活化剂受体配体但不表达抑制性受体配体的靶细胞中活力降低；2)在表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞中活力不降低。从这些测量中，可以得到“特异性杀伤”值，其将基于靶细胞活力的降低作为阴性对照(不表达活化剂受体的免疫细胞)的百分比来定量免疫细胞活化的百分比。此外，从这些测量值可以推导出“选择性比率”值，其表示在不存在抑制性受体配体的情况下在表达活化剂受体配体的靶细胞中观察到的特异性杀伤与在表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞中观察到的特异性杀伤的比率。该方法可用于表征用于产生和制备本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒的细胞群体。免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值可以是例如以下标准：1)在不存在抑制性受体配体的情况下，在表达活化剂受体配体的免疫细胞和靶细胞的48小时共孵育后，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的特异性杀伤；和2)对表达活化剂受体配体和抑制性受体配体的靶细胞的特异性杀伤小于或等于40％、小于或等于35％、小于或等于30％、小于或等于25％、小于或等于20％、小于或等于15％、小于或等于10％、小于或等于5％、小于或等于3％或小于或等于1％。
作为另一个实例，免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值可以是以下标准：1)30％至99％、40％至99％、50％至99％、55％至95％、60％至95％、60％至90％、50％至80％、50％至70％或50％至60％的表达活化剂配体但不表达抑制剂配体的靶细胞被杀死；和2)1％至40％、3％至40％、5％至40％、5％至30％、10％至30％、15％至30％或5％至20％的表达活化剂配体和抑制剂配体的靶细胞被杀死。作为又一实例，免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值可以是例如以下标准：1)在不存在抑制性受体配体的情况下，在表达活化剂受体配体的免疫细胞和靶细胞的48小时共孵育后，至少50％的特异性杀伤；和2)对表达活化剂受体配体和抑制性受体配体的靶细胞的特异性杀伤小于或等于20％。作为另一个实例，免疫细胞能够在6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时或60小时的时间段内杀死至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的表达活化剂配体而不表达抑制剂配体的靶细胞，同时在同一时间段内杀死少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％、少于3％或少于1％的表达活化剂和抑制剂配体的靶细胞。
对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％至至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至多约50％、至多约55％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％或至多约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％。可以在免疫细胞与靶细胞共孵育约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时、约66小时或约72小时后测定免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值。
对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％至至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至多约50％、至多约55％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％或至多约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％。可以在免疫细胞与靶细胞共孵育约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时、约66小时或约72小时后测定免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值。
如本文所用，术语“功能变体”是指与亲本蛋白质相比具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失并且保留亲本蛋白质的一种或多种所需活性的蛋白质。功能变体可以是保留亲本蛋白质的一种或多种所需活性的蛋白质片段(即具有N-和/或C-末端缺失的变体)。
本文提及的所有出版物和专利通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及不是并且不应被视为承认或任何形式的暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。
活化剂受体
本公开提供了第一受体，其包含对靶抗原特异性的第一细胞外配体结合结构域，该靶抗原包含癌细胞特异性抗原或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。第一受体是活化剂受体，并且在第一受体的细胞外配体结合结构域结合靶抗原时介导表达第一受体的免疫细胞的活化。第一受体对靶抗原(即活化剂配体)有应答。例如，当靶抗原与第一受体结合或接触时，第一受体在第一受体的细胞外配体结合结构域结合靶抗原时响应并活化表达第一受体的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，第一受体是T细胞受体(TCR)。
在一些实施例中，第一受体是人源化的。如本文所用，“人源化”是指用同源或功能等同的人序列替换分离自或衍生自非人物种的转基因中的序列或亚序列。例如，人源化抗体可以通过将小鼠CDR移植到人构架序列中，随后用某些人构架残基回代来自源抗体的相应小鼠残基来产生。
活化剂靶
在一些实施例中，第一受体的靶抗原是癌细胞特异性抗原。由靶癌细胞表达的任何细胞表面分子可以是第一受体配体结合结构域的合适的靶抗原。例如，细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、细胞外结构域、涉及趋化性的分子、糖蛋白、G蛋白偶联受体、跨膜、神经递质受体或电压门控离子通道可用作靶抗原。
在一些实施例中，靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。由靶癌细胞表达并由主要组织相容性复合物I类(MHC-I)在癌细胞表面作为肽抗原(pMHC)呈递的任何分子可以是第一受体细胞外配体结合结构域的合适的靶抗原。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是间皮素(MSLN)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。
主要组织相容性复合物I类(MHC-I)是向免疫系统细胞展示抗原、引发免疫应答的蛋白质复合物。对应于MHC-I的人白细胞抗原(HLA)是HLA-A、HLA-B和HLA-C。
包含HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G中任一种的癌细胞特异性pMHC抗原被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，癌细胞特异性抗原包含HLA-A。HLA-A受体是包含重α链和较小β链的异二聚体。α链由HLA-A的变体编码，而β链(β2-微球蛋白)是不变的。有几千个HLA-A基因变体，所有这些都落入本公开的范围内。在一些实施例中，MHC-I包含人白细胞抗原A*02等位基因(HLA-A*02)。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原包含HLA-B。HLA-B基因的数百种形式(等位基因)是已知的，其中每一种都被赋予特定的编号(如HLA-B*27)。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原包含HLA-C。HLA-C属于HLA I类重链同种同源物。该I类分子是由重链和轻链(β-2微球蛋白)组成的异二聚体。本领域已知超过100种HLA-C等位基因。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是卵巢癌抗原、胰腺癌抗原、肺癌抗原、结肠直肠癌抗原或间皮瘤抗原。在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是结肠直肠癌抗原。在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是MSLN或其肽抗原。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是MSLN或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。MSLN是一种40KDa蛋白质，其通常在间皮细胞以及肺、输卵管、唾液腺和脂肪组织中表达(图2)。MSLN在多种人肿瘤类型中表达，包括间皮瘤癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、结肠直肠癌或胆管癌。在一些实施例中，癌症在受试者体内复发。在一些实施例中，癌症对一种或多种先前施用的抗癌疗法是难治性的。在一些实施例中，癌症是转移性的。
MSLN的所有同种型被设想为本公开的癌细胞特异性抗原。MSLN同种型1前蛋白描述于NCBI记录号NP_005814.2中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，MSLN包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，MSLN包含与SEQ ID NO:1共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
MSLN同种型2前蛋白描述于NCBI记录号NP_037536.2中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，MSLN包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，MSLN包含与SEQ ID NO:2共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是衍生自MSLN的肽抗原。在一些实施例中，肽抗原包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的亚序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，肽抗原包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的亚序列相同的序列。
细胞外配体结合结构域
本公开提供了第一受体，其包含对靶抗原特异性的第一细胞外配体结合结构域。在一些实施例中，靶抗原包含癌细胞特异性抗原。
在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是MSLN或与MHC-I复合的MSLN衍生的肽抗原，并且第一受体的配体结合结构域识别并结合MSLN抗原。
可以以配体依赖性方式调节受体活性的任何类型的配体结合结构域被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，配体结合结构域是抗原结合结构域。示例性抗原结合结构域尤其包括scFv、SdAb、仅Vβ结构域以及衍生自TCRα和β链可变结构域的TCR抗原结合结构域。
任何类型的抗原结合结构域都设想在本公开的范围内。
例如，第一细胞外配体结合结构域可以是连续多肽链的一部分，包括例如仅Vβ结构域、单结构域抗体片段(sdAb)或重链抗体HCAb、衍生自鼠、人源化或人抗体的单链抗体(scFv)(Harlow等人，1999，载于：《使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:ALaboratoryManual)》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约；Harlow等人，1989，载于：《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港，纽约；Houston等人，1988，《美国国家科学院院刊》85:5879-5883；Bird等人，1988，《科学(Science)》242:423-426)。在一些方面，第一细胞外配体结合结构域包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含抗体片段。在进一步的方面，第一细胞外配体结合结构域包含抗体片段，该抗体片段包含scFv或sdAb。
本文所用的术语“抗体”是指衍生自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，其特异性结合抗原。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白或其片段，并且可以衍生自天然或重组来源。
术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指抗体或其重组变体的至少一个部分，其含有抗原结合结构域，即完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶(如抗原及其定义的表位)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、单链(sc)Fv(“scFv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(缩写为“sdAb”)(VL或VH)、骆驼科VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单个多肽链，并且其中scFv保留其来源的完整抗体的特异性。
关于抗体的“重链可变区”或“VH”(或在单结构域抗体的情况下，例如，纳米抗体，则为“VHH”)是指重链的片段，其含有插入在称为构架区的侧翼伸展之间的三个CDR，这些构架区通常比CDR更高度保守并且形成支架以支持CDR。
除非另有说明，否则本文所用的scFv可以具有任一顺序的VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N-末端和C-末端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
在一些实施例中，活化剂和/或抑制性受体的抗原结合结构域包含scFv。在一些实施例中，scFv包含通过接头连接的VL和VH区。在一些实施例中，接头包含甘氨酸丝氨酸接头，例如GGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:152)。在一些实施例中，scFv进一步在scFv的N末端包含信号序列。示例性信号序列包括MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(SEQ ID NO:362)，其由ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO:153)编码。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中较小的一种。κ(“K”)和λ(“λ”)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应当解释为是指通过合成编码抗体的DNA分子而生成的抗体，并且该DNA分子表达抗体蛋白，或特定于该抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域可获得且熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得的。
术语“Vβ结构域”、“仅Vβ结构域”、“β链可变结构域”或“单可变结构域TCR(svd-TCR)”是指基本上由单个T细胞受体(TCR)β可变结构域组成的抗原结合结构域，该单个T细胞受体(TCR)β可变结构域在不存在第二TCR可变结构域的情况下特异性结合抗原。仅Vβ结构域使用互补决定区(CDR)接合抗原。每个仅Vβ结构域含有三个补体决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。可以组合额外元件，条件是Vβ结构域被配置以在不存在第二TCR可变结构域的情况下结合表位。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)或β链可变结构域(Vβ)。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含scFv抗原结合结构域。示例性的MSLN scFv如下表1所示。
表1：示例性MSLN scFv结构域
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在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域是scFv。在一些实施例中，scFv结构域结合MSLN。在一些实施例中，scFv是CAR的配体结合结构域。对MSLN特异性的示例性scFv结构域如上文表1所示。在表1中，加下划线表示CDR序列。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含与SEQ ID NO:3-6、80或154-215的序列或表1中所示的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的抗原结合结构域。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:3-6、80或154-215的序列，如表1所示。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的结合结构域。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含结合结构域，其包含SEQ ID NO:171的序列。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含与SEQ ID NO:3-6中任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的scFv抗原结合结构域。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含scFv抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:3-6或80中任一个的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域基本上由选自由SEQ ID NO:3-6或80组成的组的序列组成。
表2：MSLN互补决定区(CDR)序列
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在表2中，与所示重链(HC)CDR配对的轻链(LC)CDR在左列中表示。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表2中所示的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3(例如，表2的第#1行、第#2行、第#3行等的HC CDR 1、HC CDR2和HC CDR3)或相对于表2的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表2中所示的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3(例如，表2的A行、B行或C行的LC CDR 1、LC CDR2和LC CDR3)或相对于表2的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表2中所示的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3(例如，表2的第#1行、第#2行、第#3行等的HC CDR 1、HC CDR2和HC CDR3)。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表2中所示的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3(例如，表2的A行、B行或C行的LC CDR 1、LC CDR2和LC CDR 3)。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表2中所示的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3(例如，第1行中所示的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，以及A行中的LC CDR 1、LC CDR2和LC CDR 3)。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表2中所示的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3(例如，表2的第#1行、第#2行、第#3行等的HC CDR 1、HC CDR2和HC CDR3)或相对于表2的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表2中所示的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3(例如，表2的A行、B行或C行的LC CDR 1、LC CDR2和LC CDR 3)或相对于表2的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表2中所示的一个或多个HC CDR和表2中所示的一个或多个LC CDR。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含(i)表2的一行中所示的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3(例如，表2的第#1行、第#2行、第#3行等的HC CDR 1、HC CDR2和HC CDR 3)和(ii)表2的一行中所示的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3(例如，表2的A行、B行或C行的LC CDR 1、LC CDR2和LC CDR 3)。在每种情况下，HC CDR可以与任何LC CDR配对，因为重链和轻链具有相似性，通过常规测试来确认所需的表达和结合活性；然而，一些实施例的重链和轻链之间的优选配对示于表2的右列中。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含以下：HC CDR1，其包含SGDYYWS(SEQ ID NO:438)的序列；HC CDR2，其包含YIYYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO:454)的序列；以及HC CDR3，其包含CAREDVVKGAFDIW(SEQ ID NO:533)的序列，或相对于其具有至多1、2或3个氨基酸取代、插入或缺失的CDR序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含以下：HC CDR1，其包含SGDYYWS(SEQ ID NO:438)的序列；HC CDR2，其包含YIYYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO:454)的序列；以及HC CDR3，其包含CAREDVVKGAFDIW(SEQ IDNO:533)的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含以下：LC CDR1，其包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO:535)的序列；LC CDR2，其包含AASSLQS(SEQ ID NO:539)的序列；以及LC CDR3，其包含QQSYSTPLT(SEQ ID NO:542)的序列，或相对于其具有至多1、2或3个氨基酸取代、插入或缺失的CDR序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含以下：LC CDR1，其包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO:535)的序列；LC CDR2，其包含AASSLQS(SEQ ID NO:539)的序列；以及LC CDR3，其包含QQSYSTPLT(SEQ ID NO:542)的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含以下：HC CDR1，其包含SGDYYWS(SEQ ID NO:438)的序列；HC CDR2，其包含YIYYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO:454)的序列；HC CDR3，其包含CAREDVVKGAFDIW(SEQ ID NO:533)的序列；LC CDR1，其包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO:535)的序列；LC CDR2，其包含AASSLQS(SEQ ID NO:539)的序列；以及LC CDR3，其包含QQSYSTPLT(SEQ ID NO:542)的序列，或相对于其具有至多1、2或3个氨基酸取代、插入或缺失的CDR序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含以下：HC CDR1，其包含SGDYYWS(SEQ ID NO:438)的序列；HC CDR2，其包含YIYYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO:454)的序列；HC CDR3，其包含CAREDVVKGAFDIW(SEQ ID NO:533)的序列；LC CDR1，其包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO:535)的序列；LC CDR2，其包含AASSLQS(SEQ ID NO:539)的序列；以及LC CDR3，其包含QQSYSTPLT(SEQ ID NO:542)的序列。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含scFv。在一些实施例中，scFv包含重链，其包含选自GYTMN(SEQ ID NO:448)、LITPYNGASSYNQKFRG(SEQ ID NO:470)和GGYDGRGFDY(SEQ ID NO:534)的序列的CDR。在一些实施例中，重链包含GYTMN(SEQ IDNO:448)、LITPYNGASSYNQKFRG(SEQ ID NO:470)和GGYDGRGFDY(SEQ ID NO:534)的序列。在一些实施例中，scFv包含轻链，其包含选自SASSSVSYMH(SEQ ID NO:538)、DTSKLAS(SEQ ID NO:541)和QQWSGYPLT(SEQ ID NO:545)的序列的CDR。在一些实施例中，轻链包含SASSSVSYMH(SEQ ID NO:538)、DTSKLAS(SEQ ID NO:541)和QQWSGYPLT(SEQ ID NO:545)的序列。
对MSLN特异性的抗原结合结构域的示例性重链和轻链的序列示于下表3和4中。优选实施例中与重链配对的轻链示于表3的右侧。
表2：重链可变片段(VH)序列
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表3：轻链可变片段(VL)序列
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表3中所示的可变重链区(VH)序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含与表3中所示的VH具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含表4中所示的可变轻链区(VL)序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含与表4中所示的VL具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL序列。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含VH，其(i)包含表2中所示的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列(例如，表2的第#1行、第#2行、第#3行等的HC CDR 1、HC CDR2和HC CDR 3)并且(ii)与表3中所示的VH序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域(i)包含表2的一行中所示的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列(例如，表2的A行、B行或C行的LC CDR 1、LC CDR2和LC CDR 3)和表4中所示的VL序列，并且(ii)与表4中所示的VL具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含(i)表3中所示的VH序列或与表3中所示的VH具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH序列，以及(ii)表4中所示的VL序列或与表4中所示的VL具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL。在每种情况下，VH可以与任何VL配对，因为重链和轻链具有相似性，通过常规测试来确认所需的表达和结合活性；然而，表3和表4之间的优选配对示于表3的“LC”列，对应于表4的#列。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:233的VH序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:233的VH序列。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:279的VL序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:279的VL序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:233的VH序列和SEQ ID NO:279的VL序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施例中，VH和VL对于接头是分开的，例如包含GGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:152)的序列的接头。VH和VL可以处于任何取向，例如VH、接头、VL；或替代地，VL、接头、VH。
在一些实施例中，本文提供的抗原结合结构域的CDR中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)氨基酸残基被另一个氨基酸取代。在同一氨基酸家族内的取代的意义上，该取代可以是“保守的”。天然存在的氨基酸可以分为以下四个家族，并且保守取代将在这些家族内发生：(1)具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(2)具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；(3)具有不带电荷的极性侧链的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；和(4)具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。通过添加、缺失或取代氨基酸来改变抗体CDR的氨基酸序列，可以获得各种效果，例如增加对靶抗原的结合亲和力。
嵌合抗原受体(CAR)
本公开提供了第一活化剂受体和包含其的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体。
本文所用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”可以指衍生自T细胞受体的人工受体，并且包括将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程化受体。CAR可以用于赋予单克隆抗体对T细胞的特异性，从而允许生成大量的特异性T细胞，例如用于过继性细胞治疗。在具体的实施例中，CAR指导细胞对例如肿瘤相关抗原的特异性。示例性CAR包含细胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在一些实施例中，CAR进一步包含铰链结构域。在特定方面，CAR包含衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合体，其融合到CD3跨膜结构域和胞内结构域。其它CAR设计的特异性可以衍生自受体的配体(例如，肽)。在某些情况下，CAR包含用于额外共刺激信号传导的结构域，例如CD3、4-1BB、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些情况下，分子可以与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像的报告基因、在添加前药后有条件地消融T细胞的基因产物、归巢受体、细胞因子和细胞因子受体。
在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域融合到CAR的细胞外结构域。
在一些实施例中，本公开的CAR包含细胞外铰链区。铰链区的掺入可能影响CAR-T细胞的细胞因子产生并改善CAR-T细胞的体内扩增。示例性的铰链可以分离自或衍生自IgD和CD8结构域，例如IgG1。在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。
在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。在一些实施例中，CD8α铰链包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:7)。在一些实施例中，CD8α铰链包含SEQ ID NO:7。在一些实施例中，CD8α铰链基本上由SEQID NO:7组成。在一些实施例中，CD8α铰链由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT(SEQ IDNO:8)。在一些实施例中，CD8α铰链由SEQ ID NO:8编码。
在一些实施例中，CD28铰链包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:9)。在一些实施例中，CD28铰链包含或基本上由SEQ IDNO:9组成。在一些实施例中，CD28铰链由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
TGTACCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC(SEQ ID NO:10)。在一些实施例中，CD28铰链由SEQ ID NO:10编码。
本公开的CAR可以被设计成包含与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些实施例中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。例如，包含CD28共刺激结构域的CAR也可以使用CD28跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。当来源是天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区可以分离自或衍生自(即至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或免疫球蛋白(如IgG4)。替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个端发现。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选地长度为2至10个氨基酸，可以在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在本公开的CAR的一些实施例中，CAR包含CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:11)。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:11组成。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
TTCTGGGTGCTGGTCGTTGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG(SEQ ID NO:12)。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由SEQ ID NO:12编码。
在本公开的CAR的一些实施例中，CAR包含IL-2Rβ跨膜结构域。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI(SEQ ID NO:13)。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:13组成。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
ATTCCGTGGC TCGGCCACCT CCTCGTGGGC CTCAGCGGGG CTTTTGGCTT CATCATCTTAGTGTACTTGC TGATC(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域由SEQ ID NO:14编码。
本公开的CAR的细胞质结构域或其它细胞内信号传导结构域负责活化其中放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特定功能。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整链。在一些情况下，可以组合多个细胞内结构域以实现本公开的CAR-T细胞的期望功能。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的一个或多个细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本公开的CAR中的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列，其在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
因此，本公开的CAR的细胞内结构域包含至少一个细胞质活化结构域。在一些实施例中，细胞内活化结构域确保存在活化CAR T细胞的效应子功能所必需的T细胞受体(TCR)信号传导。在一些实施例中，至少一种细胞质活化是CD247分子(CD3ζ)活化结构域、刺激性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)KIR2DS2活化结构域，或12kDa的DNAX-活化蛋白(DAP12)活化结构域。
在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:15)。
在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含或基本上由SEQ ID NO:15组成。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGCGTAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGACTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:16)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由SEQ ID NO:16)编码。
已知单独通过TCR生成的信号通常不足以完全活化T细胞，也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的序列(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的序列(次级细胞质信号传导序列)。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。在一些实施例中，ITAM含有通过任何两个其它氨基酸(YxxL/I(SEQ ID NO:546))与亮氨酸或异亮氨酸分开的酪氨酸。在一些实施例中，细胞质结构域含有1、2、3、4或5个ITAM。含有细胞质结构域的示例性ITAM是CD3ζ活化结构域。可用于本公开的CAR中的含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的其它实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(SEQ ID NO:17)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含SEQ ID NO:17。在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域基本上由氨基酸序列RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(SEQ ID NO:17)组成。在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGACGCC CCCGCGTACC AGCAGGGCCA GAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG GAGTACGATG TTTTGCACAT GCAGGCCCTG CCCCCTCGC(SEQ ID NO:18)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由SEQ ID NO:18编码。
在一些实施例中，CAR的细胞质结构域可以被设计为包含CD3ζ信号传导结构域本身或与在本公开的CAR的上下文中有用的任何其它期望的细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激结构域。共刺激结构域是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。此类分子的实例包括共刺激结构域，其选自由以下组成的组：IL-2Rβ、Fc受体γ(FcRγ)、Fc受体β(FcRβ)、CD3g分子γ(CD3γ)、CD3δ、CD3ε、CD5分子(CD5)、CD22分子(CD22)、CD79a分子(CD79a)、CD79b分子(CD79b)、癌胚抗原相关细胞粘附分子3(CD66d)、CD27分子(CD27)、CD28分子(CD28)、TNF受体超家族成员9(4-1BB)、TNF受体超家族成员4(OX40)、TNF受体超家族成员8(CD30)、CD40分子(CD40)、程序性细胞死亡1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2分子(CD2)、CD7分子(CD7)、TNF超家族成员14(LIGHT)、杀伤细胞凝集素样受体C2(NKG2C)和CD276分子(B7-H3)c-刺激结构域，或其功能变体。在一些实施例中，本公开的CAR的细胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域分离自或衍生自CD28。
在一些实施例中，本公开的CAR的细胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域分离自或衍生自CD28。在一些实施例中，CD28共刺激结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:19)。在一些实施例中，CD28共刺激结构域包含或基本上由SEQ ID NO:19组成。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：
AGGAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGAGGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCTCCCAGGGATTTCGCCGCCTACCGGAGC(SEQ ID NO:20)。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由SEQ ID NO:20编码。
在一些实施例中，共刺激结构域分离自或衍生自4-1BB。在一些实施例中，4-1BB共刺激结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:283)。在一些实施例中，4-1BB共刺激结构域包含或基本上由KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:283)组成。在一些实施例中，4-1BB共刺激结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGGCCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:284)。
在一些实施例中，CAR的细胞内结构域包含CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ活化结构域。在一些实施例中，CAR的细胞内结构域包含以下序列
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:285)，或与其具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性的序列。
本公开的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适接头的实例。示例性接头包含序列GGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:152)。
本公开的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适接头的实例。本公开的示例性全长活化剂受体描述于表20中。在一些实施例中，第一活化剂受体包含SEQ ID NO:286-347的序列，如表20所示，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一活化剂受体包含SEQ ID NO:286-347，如表20所示。在一些实施例中，第一活化剂受体包括SEQID NO:288的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一活化剂受体包括SEQ ID NO:297的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一活化剂受体包括SEQ IDNO:301的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一活化剂受体包括SEQ ID NO:302的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一活化剂受体包括SEQ ID NO:303的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一活化剂受体包括SEQ ID NO:314的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一活化剂受体包括SEQ ID NO:335的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一活化剂受体包括SEQ ID NO:340的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一活化剂受体包括SEQ ID NO:344的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
本公开的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适接头的实例。
T细胞受体(TCR)
本公开提供了第一活化剂受体和包含其的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是T细胞受体(TCR)。
如本文所用，“TCR”(有时也称为“TCR复合物”或“TCR/CD3复合物”)是指包含TCRα链、TCRβ链和一种或多种不变CD3链(ζ、γ、δ和ε)(有时称为亚基)的蛋白质复合物。TCRα和β链可以是二硫键连接的，以作为异二聚体结合肽-MHC复合物。一旦TCRα/β异二聚体与肽-MHC结合，相关不变CD3亚基中TCR复合物的构象变化被诱导，这导致它们磷酸化并与下游蛋白质缔合，从而转导初级刺激信号。在示例性的TCR复合物中，TCRα和TCRβ多肽形成异二聚体，CD3ε和CD3δ形成异二聚体，CD3ε和CD3γ形成异二聚体，两个CD3ζ形成同二聚体。
任何合适的配体结合结构域可以融合到本文所述TCR的细胞外结构域、铰链结构域或跨膜。例如，配体结合结构域可以是抗体或TCR的抗原结合结构域，或包含抗体片段、仅Vβ结构域、线性抗体、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施例中，配体结合结构域融合到一个或多个TCR亚基的一个或多个细胞外结构域或跨膜结构域。TCR亚基可以是TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ或CD3ζ。例如，配体结合结构域可以融合到TCRα或TCRβ，或者配体结合的部分可以融合到两个亚基，例如配体结合结构域的部分可以融合到TCRα和TCRβ两者。
TCR亚基包括TCRα、TCRβ、CD3ζ、CD3δ、CD3γ和CD3ε。TCRα、TCRβ链、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ或其片段或衍生物中的任一种或多种可以融合到能够提供本公开的刺激信号的一个或多个结构域，从而增强TCR功能和活性。
从任何来源分离或衍生的TCR跨膜结构域被设想在本公开的范围内。跨膜结构域可以衍生自天然或重组来源。当来源是天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。
在一些实施例中，每当TCR复合物已经与靶结合时，跨膜结构域能够向细胞内结构域发送信号。本公开中具体使用的跨膜结构域可以至少包括例如TCR的α、β或ζ链、CD3δ、CD3ε或CD3γ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜区。
在一些实施例中，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附着于TCR多肽的细胞外区，例如TCRα或β链的抗原结合结构域。例如，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链或CD8a铰链。在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。
在一些实施例中，细胞外配体结合结构域附着于TCR的一个或多个跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRα跨膜结构域、TCRβ跨膜结构域或两者。在一些实施例中，跨膜包含CD3ζ跨膜结构域。
跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个额外的氨基酸，例如，与衍生跨膜的蛋白质的细胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多15个氨基酸)和/或与衍生跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区相关的一个或多个额外的氨基酸(例如，细胞内区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多15个氨基酸)。
在一些实施例中，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
当存在时，跨膜结构域可以是天然TCR跨膜结构域、来自异源膜蛋白的天然跨膜结构域或人工跨膜结构域。跨膜结构域可以是膜锚定结构域。在没有限制的情况下，天然或人工跨膜结构域可以包含约20个氨基酸的疏水α-螺旋，通常在跨膜区段侧翼带有正电荷。跨膜结构域可以具有一个跨膜区段或多于一个跨膜区段。跨膜结构域/区段的预测可以使用公众可获得的预测工具(例如TMHMM，Krogh等人《分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)》2001；305(3):567-580；或TMpred，Hofmann和Stoffel《霍佩赛勒生物化学(Biol.Chem.Hoppe-Seyler)》1993；347:166)。膜锚定系统的非限制性实例包括血小板衍生生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚(翻译后添加到信号序列)等。
在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRα跨膜结构域。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW(SEQ ID NO:21)。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:21组成。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域由以下序列编码：
GTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGG(SEQ ID NO:22)。
在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRβ跨膜结构域。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO:23)。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:23组成。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域由以下序列编码：
ACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTG(SEQ ID NO:24)。
本公开的TCR可以包含一个或多个细胞内结构域。用于本公开的包含细胞内结构域的示例性TCR描述于2020年9月6日提交的PCT/US2020/045250中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，细胞内结构域包含一个或多个能够向跨膜结构域提供刺激信号的结构域。在一些实施例中，细胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一细胞内结构域和能够提供刺激信号的第二细胞内结构域。在其它实施例中，细胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一、第二和第三细胞内结构域。能够提供刺激信号的细胞内结构域选自由以下组成的组：CD28分子(CD28)结构域、LCK原癌基因、Src家族酪氨酸激酶(Lck)结构域、TNF受体超家族成员9(4-1BB)结构域、TNF受体超家族成员18(GITR)结构域、CD4分子(CD4)结构域、CD8a分子(CD8a)结构域、FYN原癌基因、Src家族酪氨酸激酶(Fyn)结构域、T细胞受体相关蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)结构域、用于活化T细胞的接头(LAT)结构域、淋巴细胞质蛋白2(SLP76)结构域、(TCR)α、TCRβ、CD3δ、CD3γ和CD3ε细胞内结构域。
在一些实施例中，细胞内结构域包含至少一个细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域生成促进细胞功能的信号，例如含有TCR的细胞(例如，表达TCR的T细胞)的免疫效应子功能。在一些实施例中，本公开的第一受体的细胞内结构域包括至少一个细胞内信号传导结构域。例如，CD3γ、δ或ε的细胞内结构域包含信号传导结构域。
在一些实施例中，细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域分离自或衍生自相同的蛋白质，例如T细胞受体(TCR)α、TCRβ、CD3δ、CD3γ、CD3ε或CD3ζ。
用于本公开的活化剂受体中的细胞内结构域的实例包括TCRα、TCRβ、CD3ζ和4-1BB的细胞质序列，以及在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导的细胞内信号传导共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域。示例性的初级细胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的蛋白质的结构域。
在一些实施例中，细胞内结构域包含CD3δ细胞内结构域、CD3ε细胞内结构域、CD3γ细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域、TCRα细胞内结构域或TCRβ细胞内结构域。
在一些实施例中，细胞内结构域包含TCRα细胞内结构域。在一些实施例中，TCRα细胞内结构域包含Ser-Ser。在一些实施例中，TCRα细胞内结构域由TCCAGC序列编码。
在一些实施例中，细胞内结构域包含TCRβ细胞内结构域。在一些实施例中，TCRβ细胞内结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性或与其相同的氨基酸序列：MAMVKRKDSR(SEQ ID NO:25)。在一些实施例中，TCRβ细胞内结构域包含或基本上由SEQID NO:25组成。在一些实施例中，TCRβ细胞内结构域由以下序列编码：
ATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGA(SEQ ID NO:26)。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含至少一个刺激性细胞内结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(如CD3δ、CD3γ和CD3ε细胞内结构域)和一个额外的刺激性细胞内结构域(如共刺激结构域)。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(如CD3δ、CD3γ和CD3ε细胞内结构域)和两个额外的刺激性细胞内结构域。
示例性的共刺激细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的蛋白质的结构域。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体，以及DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)4-1BB(CD137、TNF受体超家族成员9)和CD28分子(CD28)。共刺激蛋白可以由以下蛋白质家族表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化NK细胞受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、特异性结合CD83、CD4的配体等。共刺激结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分，或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能变体。
在一些实施例中，刺激结构域包含共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域包含CD28或4-1BB共刺激结构域。CD28和4-1BB是完全T细胞活化所需的且已知增强T细胞效应子功能的充分表征的共刺激分子。例如，CD28和4-1BB已经在嵌合抗原受体(CAR)中用于促进细胞因子释放、细胞溶解功能和持久性，优于仅含有CD3ζ信号传导结构域的第一代CAR。同样地，在TCR中包括共刺激结构域，例如CD28和4-1BB结构域，可以增加T细胞效应子功能，并在不存在共刺激配体的情况下特异性地允许共刺激，共刺激配体通常在肿瘤细胞表面上下调。在一些实施例中，刺激结构域包含CD28细胞内结构域或4-1BB细胞内结构域。
抑制性受体
本公开提供了第二受体，其包含对已经在癌细胞中丢失的非靶抗原(如基因的等位基因变体)特异性的细胞外配体结合结构域。非靶等位基因变体可以通过任何机制在癌细胞中丢失，例如但不限于影响非靶等位基因变体表达的表观遗传变化、编码非靶等位基因变体的基因的突变、调节非靶等位基因变体表达的细胞信号传导的破坏、染色体丢失、基因组基因座的部分或完全缺失、通过修饰核酸或异染色质的基因沉默，或通过其它机制的表达丢失。在本文公开的组合物和方法的变化形式中，治疗的细胞或受试者可能由于非遗传改变而表现出非靶等位基因变体的表达丢失。因此，本公开提供了用于杀死细胞和/或治疗因任何原因(包括但不限于杂合性丢失)而缺乏非靶抗原表达的受试者的组合物和方法。
非靶抗原可以是蛋白质或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽，其中非靶抗原包含多态性。因为非靶抗原是多态性的，所以编码非靶抗原的基因的单个拷贝的丢失(其可能通过癌细胞中杂合性的丢失而发生)产生保留基因的其它多态性变体但已经丢失了非靶抗原的癌细胞。例如，在HLA基因座具有HLA-A*02和HLA-A*01等位基因的受试者可能患有仅缺失HLA-A*02等位基因的癌症。在这样的受试者中，HLA-A*01蛋白仍然存在，但不被遇到癌细胞的免疫细胞的抑制性受体识别，因为抑制剂受体被设计成对HLA-A*02(或其它非靶抗原)特异性。在正常的非恶性细胞中，存在HLA-A*02(或其它非靶抗原)并抑制工程化免疫细胞的活化。在杂合性丢失的癌细胞中，HLA-A*02等位基因变体(或其它非靶抗原)丢失。被工程化以表达抑制性受体的免疫细胞不接收来自抑制性受体的抑制性信号，因为抑制性受体仅对癌细胞上不存在的HLA-A*02(或其它非靶抗原)有应答。通过这种机制，免疫细胞被选择性地活化，并选择性地杀死表达MSLN但由于杂合性丢失而丢失HLA-A*02(或另一种非靶抗原)的癌细胞。这里使用HLA-A作为实例。群体中其它MHC基因和其它非MHC基因也发生类似的多态性变异。因此，本公开提供了第二受体，其包含对选自细胞间粘附分子1(ICAM1)、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、富含亮氨酸重复神经元4(LRRN4)和尿路上皮特异蛋白3B(UPK3B)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中非靶抗原可以包含非同义的细胞外结构域多态性(例如，在ICAM1、COMT、CXCL16的细胞外结构域中)，以及包含其的免疫细胞。在一些实施例中，第二受体是抑制性嵌合抗原受体。替代地，非靶抗原可以包含其表达在肿瘤中丢失但存在于关键MSLN表达正常组织中的蛋白质(例如，LRRN4、UPK3B)。
示例性的抑制性受体描述于2020年9月6日提交的PCT/US2020/045228、2020年12月11日提交的PCT/US2020/064607、2021年4月29日提交的PCT/US2021/029907和2020年11月10日提交的PCT/US2020/059856中，其各自的内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，第二受体是人源化的。
本公开提供了第二受体，其为抑制性受体，包含能够区分非靶抗原的单个氨基酸变体等位基因的细胞外配体结合。这种区分非靶抗原的等位基因变体的能力允许第二受体在表达由配体结合结构域识别的等位基因的非靶细胞存在下抑制包含第二受体的免疫细胞的活化。然而，在丢失等位基因的靶细胞(例如通过杂合性丢失而丢失基因的一个等位基因的癌细胞)的存在下，不抑制免疫细胞的活化。
本公开提供了第二受体，其为抑制性受体，包含能够区分非靶抗原的不同表达水平的细胞外配体结合。这允许第二受体在表达第二受体配体的非靶细胞存在下抑制包含第二受体的免疫细胞的活化，但允许免疫细胞在表达低水平或不表达第二受体配体的癌细胞存在下活化。
抑制剂配体
在一些实施例中，非靶抗原不由靶细胞表达，而由非靶细胞表达。在一些实施例中，非靶抗原由健康细胞，即不是癌细胞的细胞表达。在一些实施例中，靶细胞是通过杂合性丢失(LOH)而丢失非靶抗原表达的多种癌细胞。在一些实施例中，非靶细胞是表达靶抗原和非靶抗原两者的多个健康细胞(即，非癌细胞)。
非靶细胞表达但靶细胞不表达的任何细胞表面分子可以是第二受体细胞外配体结合结构域的合适的非靶抗原。例如，细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、细胞外结构域、涉及趋化性的分子、糖蛋白、G蛋白偶联受体、跨膜、神经递质受体或电压门控离子通道可用作非靶抗原。
在一些实施例中，靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。
在一些实施例中，非靶抗原由于杂合性丢失而在癌细胞中丢失。由于杂合性丢失而在癌细胞中丢失的示例性非靶抗原包括ICAM1、COMT和CXCL16。在一些实施例中，非靶抗原选自由ICAM1、COMT和CXCL16的多态性变体组成的组。在一些实施例中，非靶抗原是包含与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的ICAM1、COMT或CXCL16的多态性残基的抗原肽。
包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E中的任一种的非靶主要组织相容性复合物I类MHC-I(或pMHC-I)抗原被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，非靶抗原包含主要组织相容性复合物(MHC)蛋白。在一些实施例中，MHC是MHC I类。在一些实施例中，MHC I类蛋白包含人白细胞抗原(HLA)蛋白。在一些实施例中，非靶抗原包含选自由HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E组成的组的HLA I类蛋白的等位基因。在一些实施例中，HLA-A等位基因包含HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03或HLA-A*11。在一些实施例中，HLA-B等位基因包含HLA-B*07。在一些实施例中，HLA-C等位基因包含HLA-C*07。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A的等位基因。在一些实施例中，HLA-A的等位基因包含HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03或HLA-A*11。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*69。在一些实施例中，非靶抗原包含人白细胞抗原A*02等位基因(HLA-A*02)。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B的等位基因。在一些实施例中，HLA-B的等位基因包含HLA-B*07。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C。在一些实施例中，HLA-C等位基因包含HLA-C*07。
在一些实施例中，非靶抗原包含与MHC－I复合的ICAM1或其抗原肽。人ICAM1经常通过癌细胞中的LOH损失。
野生型人ICAM1描述于NCBI记录号NP_000192.2中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，ICAM1包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，ICAM1包含与SEQ ID NO:27共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。ICAM1的多态性残基在SEQ ID NO:27中标记为粗体和下划线。例如，rs5498是在SEQ ID NO:27的第469位处的多态性，其可以是K或E。
在一些实施例中，非靶抗原包含ICAM1的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自ICAM1的肽，其包含ICAM1的多态性残基。ICAM1的多态性残基包括SEQ ID NO:27的氨基酸残基469。在一些实施例中，非靶抗原包含ICAM1的肽，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸469。在一些实施例中，非靶抗原在SEQ ID NO:27的第469位处包含K。在一些实施例中，非靶抗原在SEQID NO:27的第469位处包含E。
在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:27的第469位处具有K的ICAM1多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:27的第469位处具有K的ICAM1配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:27的第469位处具有E的ICAM1配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:27的第469位处具有E的ICAM1多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:27的第469位处具有E的ICAM1配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:27的第469位处具有K的ICAM1配体的亲和力。
在一些实施例中，非靶抗原包含COMT或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人COMT经常通过癌细胞中的LOH而丢失。
野生型人COMT描述于NCBI记录号NP_000192.2中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，COMT包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，COMT包含与SEQ ID NO:28共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。COMT的多态性残基在SEQ ID NO:28中标记为粗体和下划线。例如，V158M是SEQ ID NO:28的第158位处的多态性，其可以是V或M。
在一些实施例中，非靶抗原包含COMT的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自COMT的肽，其包含COMT的多态性残基。COMT 1的多态性残基包括SEQ ID NO:28的氨基酸残基158。在一些实施例中，非靶抗原包含COMT的肽，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸158。在一些实施例中，非靶抗原在SEQ ID NO:28的第158位处包含V。在一些实施例中，非靶抗原在SEQ IDNO:28的第158位处包含M。
在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:28的第158位处具有V的COMT多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:28的第158位处具有V的COMT配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:28的第158位处具有M的COMT配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含在SEQ ID NO:28的第158位处具有M的COMT多态性，并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:28的第158位处具有M的COMT配体的亲和力高于对在SEQID NO:28的第158位处具有V的COMT配体的亲和力。
在一些实施例中，非靶抗原包含C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人CXCL16前体描述于NCBI记录号NP_001094282.1，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，CXCL16包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自CXCL16的肽，其包含CXCL16的多态性残基。CXCL16的多态性残基包括SEQ ID NO:29的第142和200位。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸142或200。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:29的氨基酸200处包含A。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:29的氨基酸200处包含V。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:29的氨基酸142处包含I。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:29的氨基酸142处包含T。
在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的多态性。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:29的氨基酸200处包含A并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:29的第200位处具有A的CXCL16配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:29的第200位处具有V的CXCL16配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:29的氨基酸200处包含V并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:29的第200位处具有V的CXCL16配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:29的第200位处具有A的CXCL16配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:29的氨基酸142处包含I并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:29的第142位处具有I的CXCL16配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:29的第142位处具有T的CXCL16配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:29的氨基酸142处包含T并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:29的第142位处具有T的CXCL16配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:29的第142位处具有I的CXCL16配体的亲和力。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。用于本文所述实施例的结合或识别特定HLA等位基因的各种单可变结构域描述于表5中。(互补决定区用下划线标出)：
表5：HLA scFv结合结构域
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在一些实施例中，第二抑制性受体的配体结合结构域包含scFv。在一些实施例中，scFv结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*3、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07，并且包含选自表5中所示序列组的序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，scFv结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*3、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07，并且包含选自表5中所示序列组的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含表5中所示的HLA-A*01scFv序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含表5中所示的HLA-A*02scFv序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*03，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含表5中所示的HLA-A*03scFv序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含表5中所示的HLA-A*11scFv序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B*07，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含表5中所示的HLA-B*07scFv序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C*07，并且第二受体的非靶细胞外配体结合结构域包含表5中所示的HLA-C*07scFv序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07和HLA-C*07配体结合结构域的示例性重链和轻链CDR(分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)示于下表6中。
表6：对应于HLA抗原结合结构域的CDR
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在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A。在一些实施例中，第二抑制性受体的配体结合结构域包含HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03或HLA-A*11配体结合结构域，其包含表6或表7中所示的CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B。在一些实施例中，第二抑制性受体的配体结合结构域包含HLA-B*07配体结合结构域，其包含表6中所示的CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C。在一些实施例中，第二抑制性受体的配体结合结构域包含HLA-C*07配体结合结构域，其包含表6中所示的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A、HLA-B或HLA-C蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*01互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-A*01CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*02。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*02互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-A*02CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:103-108或SEQ ID NO:109-114的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于SEQ ID NO:103-108或SEQ ID NO:109-114的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*03。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*03互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-A*03CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*11。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*11互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表7中所公开；或相对于表7的HLA-A*11CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-B*07。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-B*07互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-B*07CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-C*07。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-C*07互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，如表6中所公开；或相对于表6的HLA-C*07CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
在任何配体结合结构域的进一步实施例中，每个CDR序列可以具有1、2、3或更多个取代、插入或缺失。CDR序列可以容许取代、缺失或插入。使用序列比对工具、常规实验和已知测定，本领域技术人员可以生成和测试在CDR序列中具有1、2、3或更多个取代、插入或缺失的变体序列，而无需过度实验。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*02配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*02的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*02。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含SEQ ID NO:30-41中任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含与SEQ ID NO:30-41中任一个的序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％相同的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:30的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:30的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含VL，其包含序列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTSGGGTKLEIK(SEQ ID NO:762)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含VH，其包含序列QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTSYHIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNVNTEYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCAREEITYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:763)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，VH和VL被接头分开，例如GGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:152)。在一些实施例中，VH和VL从N至C末端排序为VH、接头和VL。在一些实施例中，VH和VL从N至C末端排序为VL、接头和VH。
在一些实施例中，HLA-A*02scFv包含SEQ ID NO:42-53中任一个的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:42-53中任一个至少95％相同的序列。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:42-53中任一个相同的序列。在一些实施例中，抗原结合结构域的重链包含SEQ ID NO:42-53中任一个的重链CDR，并且其中抗原结合结构域的轻链包含SEQ ID NO:42-53中任一个的轻链CDR。在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含重链和轻链，并且重链包含选自SEQ ID NO:45-47和51-53的CDR，并且轻链包含选自SEQ ID NO:42-44和48-50的CDR。
在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含重链和轻链，并且重链包含与SEQID NO:30-41中任一个的重链部分至少95％相同的序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:30-41中任一个的轻链部分至少95％相同的序列。
在一些实施例中，重链包含与SEQ ID NO:30-41中任一个的重链部分相同的序列，并且其中轻链包含与SEQ ID NO:30-41中任一个的轻链部分相同的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*01配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*01scFv包含表6中所示的HLA-A*1CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*03，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*03配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*03scFv包含表6中所示的HLA-A*03CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-A*11配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*11scFv包含表7中所示的HLA-A*11CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B*07，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-B*07配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-B*07scFv包含如表6中所示的HLA-B*07CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C*07，并且第二受体的细胞外配体结合结构域包含HLA-C*07配体结合结构域。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含scFv结构域，其包含选自表5所示序列组的序列，或与其至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-C*07scFv包含如表6中所示的HLA-C*07CDR序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11。本领域已知的或本文公开的结合并识别HLA-A*11的各种单可变结构域适用于实施例中。此类scFv包括，例如但不限于，以下小鼠和人源化scFv抗体，其以上文表5中所示的非肽依赖性方式结合HLA-A*11。
HLA-A*11配体结合结构域的示例性重链和轻链CDR(分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)示于下表7中。表7中的任何VH CDR可以与表7中公开的VL CDR组合。
表7：示例性抗HLA-A*11CDR序列
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在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*11配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*11的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*11。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含SEQ ID NO:114-122中任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含与SEQ ID NO:114-122中任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。
在一些实施例中，HLA-A*11scFv包含SEQ ID NO:114-122中任一个的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:114-122中任一个至少95％相同的序列。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:114-122中任一个相同的序列。在一些实施例中，抗原结合结构域的重链包含SEQ ID NO:132-140中任一个的重链CDR，并且其中抗原结合结构域的轻链包含SEQ ID NO:141的轻链CDR。在一些实施例中，HLA-A*11抗原结合结构域包含重链和轻链，并且重链包含选自SEQ ID NO:92-110的一个、两个或三个CDR，并且轻链包含选自SEQ ID NO:111-113的一个、两个或三个CDR。
HLA-A*11抗原结合结构域的示例性重链和轻链序列提供于下表8中。在一些实施例中，HLA-A*11抗原结合结构域包含重链和轻链，并且重链包含与SEQ ID NO:132-140中任一个的重链部分至少95％相同的序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:141的轻链部分至少95％相同的序列。
在一些实施例中，重链包含与SEQ ID NO:114-122中任一个的重链部分相同的序列，并且其中轻链包含与SEQ ID NO:114-122中任一个的轻链部分相同的序列。
表8：示例性抗HLA-A*11重链和轻链序列
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差异表达的抑制剂配体
本公开提供了在癌细胞和正常细胞之间差异表达的抑制剂配体(非靶抗原)。
抑制性受体的活化由细胞表面上存在的非靶抗原介导。表达非靶抗原的细胞将基于非靶抗原的表达水平活化抑制性受体。在一些实施例中，非靶抗原由靶细胞和非靶细胞两者表达。然而，在这些实施例中，非靶细胞以比靶细胞更高的水平表达非靶抗原。由非靶细胞表达的较高水平的非靶抗原活化抑制性受体，从而阻止免疫细胞的活化。相反，由靶表达的较低水平的非靶抗原不足以活化抑制性受体，导致免疫细胞的活化。
在替代的实施例中，非靶抗原由非靶细胞表达，但不由靶细胞表达。在非靶抗原不表达的情况下，靶细胞活化靶受体，从而活化免疫细胞。
差异表达可以通过本领域已知的用于测量表达的任何技术来确定。这些技术尤其包括用于测量细胞中靶基因的mRNA和/或蛋白质水平的技术。测量样品中蛋白质水平的方法包括免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)和分析方法，如液相色谱-质谱(LC-MS)。测量mRNA水平的方法包括实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)以及高通量测序。可以在例如正常细胞和患病细胞(例如癌细胞)之间观察到表达差异。
非靶抗原对抑制性受体的活化可以根据本领域已知的各种方式发生。非靶抗原对抑制性受体的活化可以通过本领域已知的方法测定。例如，表达抑制性受体的细胞中的下游细胞内信号传导水平可以通过使用报告基因来测量。
不希望受理论束缚，非靶抗原的表达是否通过抑制性受体的活化抑制免疫细胞的活化可以根据非靶抗原与抑制剂受体的比例发生。非靶抗原和抑制性受体的表达水平及其比例可以通过本领域已知的方法测定，尤其包括免疫组织化学和荧光活化细胞分选术(FACS)。对靶细胞和非靶细胞上非靶抗原表达水平的分析可用于预测表达抑制性受体的免疫细胞的选择性靶向。非靶抗原在靶或非靶细胞上的低表达或无表达可以表明，例如，抑制性受体在本公开的免疫细胞中将不会被活化。
替代地，或另外，并且不希望受理论束缚，非靶抗原经由抑制性受体的活化对免疫细胞活化的抑制可以取决于非靶抗原对抑制性受体的亲和力。测量亲和力的方法是本领域已知的，并且尤其包括酶联免疫吸附测定法或放射免疫测定法。
替代地，或另外，并且不希望受理论束缚，非靶抗原经由抑制性受体的活化对免疫细胞活化的抑制可以根据抑制性受体和活化剂受体之间的串扰而发生，导致活化剂受体活性的下调。例如，非靶抗原对抑制性受体的活化可能导致免疫细胞表面上活化剂受体的表达降低。
在一些实施例中，非靶抗原在靶细胞中的表达水平低于正常细胞。在一些实施例中，非靶抗原由健康细胞，即不是癌细胞的细胞表达。在一些实施例中，靶细胞中的非靶抗原表达水平比非靶细胞中的低至少约10倍、低至少约30倍、低至少约50倍、低至少约70倍、低至少约90倍、低至少约100倍、低至少约110倍、低至少约150倍、低至少约200倍、低至少约250倍、低至少约300倍、低至少约350倍、低至少约400倍、低至少约450倍、低至少约500倍、低至少约600倍、低至少约700倍、低至少约800倍、低至少约900倍或低至少约1000倍。在一些实施例中，非靶抗原表达水平比多种健康细胞低约10倍、低约30倍、低约50倍、低约70倍、低约90倍、低约100倍或低约110倍。在一些实施例中，多种癌细胞中的非靶抗原表达水平比多种健康细胞中的低至少约5倍。在一些实施例中，靶细胞中的非靶抗原表达水平比非靶细胞低至少约5倍。在一些实施例中，靶细胞是低表达或不表达非靶抗原的多种癌细胞。
非靶细胞表达但靶细胞不表达(或以低水平表达)的任何细胞表面分子可以是第二受体细胞外配体结合结构域的合适的非靶抗原。例如，细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、细胞外结构域、涉及趋化性的分子、糖蛋白、G蛋白偶联受体、跨膜蛋白、神经递质受体或电压门控离子通道可用作非靶抗原。
在一些实施例中，非靶抗原选自由富含亮氨酸的重复神经元4(LRRN4)和尿路上皮特异蛋白B3(UPKB3)，或这些中任一种与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原组成的组。在一些实施例中，非靶抗原是LRRN4或其与MHC-I的复合物中的肽抗原。在一些实施例中，非靶抗原是UPKB3或其与MHC-I的复合物中的肽抗原。
在一些实施例中，靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。
包含HLA-A、HLA-B或HLA-C中的任一种的非靶MHC-I(pMHC)抗原被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C。
非靶抗原包含在癌细胞(例如肺癌细胞)中具有低表达或无表达但在正常组织(如正常肺组织)中表达的蛋白质。
在一些实施例中，非靶抗原包含LRRN4或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人LRRN4描述于NCBI记录号NP_689824.2中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，LRRN4包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，LRRN4包含与SEQ ID NO:75共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，LRRN4包含与SEQ ID NO:75相同的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含UPK3B或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。UPK3B的所有同种型均设想在本公开的范围内。人UPK3B同种型a前体描述于NCBI记录号NP_085047.1中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，UPK3B同种型a前体包含以下氨基酸序列：
人UPK3B同种型b前体描述于NCBI记录号NP_872625.1中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，UPK3B同种型b前体包含以下氨基酸序列：
人UPK3B同种型c前体描述于NCBI记录号NP_872624.1中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，UPK3B同种型c前体包含以下氨基酸序列：
人UPK3B同种型d前体描述于NCBI记录号NP_001334613.1中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，UPK3B同种型c前体包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，UPKB3包含与SEQ ID NO:76-79中任一个共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列或亚序列。在一些实施例中，UPKB3包含与SEQ ID NO:76-79相同的序列或亚序列。
抑制性嵌合抗原受体
本公开提供了作为抑制性嵌合抗原受体的第二受体。抑制性受体可以包含细胞外配体结合结构域，其结合并识别MHC-I复合物中的非靶抗原或其肽衍生物。
本文所用的术语“抑制性受体”是指与能够转导抑制或阻抑免疫细胞的免疫活性的抑制性信号的细胞内信号传导结构域融合的配体结合结构域。抑制性受体具有免疫细胞抑制潜能，并且与具有免疫细胞活化潜能的受体CAR不同且可区分。例如，CAR是活化受体，因为它们包括细胞内刺激和/或共刺激结构域。抑制性受体是含有细胞内抑制性结构域的抑制受体。
本文所用的“抑制性信号”是指导致免疫应答阻抑(例如，细胞因子产生减少或免疫细胞活化减少)的信号转导或免疫细胞中蛋白质表达的变化。抑制或阻抑免疫细胞可以是选择性的和/或可逆的，或者不是选择性的和/或可逆的。
本公开的抑制性受体可以包含细胞外配体结合结构域。可以以配体依赖性方式调节受体活性的任何类型的配体结合结构域被设想在本公开的范围内。抑制性受体对非靶抗原(例如HLA-A*02)有应答。例如，当非靶抗原(例如HLA-A*02)结合或接触抑制性受体时，抑制性受体响应于非靶抗原与抑制性受体的细胞外配体结合结构域的结合而活化表达抑制性受体的免疫细胞中的抑制性信号。
本公开的抑制性受体可以包含细胞外配体结合结构域。可以以配体依赖性方式调节受体活性的任何类型的配体结合结构域被设想在本公开的范围内。
在一些实施例中，配体结合结构域是抗原结合结构域。示例性抗原结合结构域尤其包括scFv、SdAb、仅Vβ结构域以及衍生自TCRα和β链可变结构域的TCR抗原结合结构域。
任何类型的抗原结合结构域都设想在本公开的范围内。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域是scFv。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域结合并识别细胞间粘附分子1(ICAM1)、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、富含亮氨酸重复神经元4(LRRN4)和尿路上皮特异蛋白3B UPK3B的多态性变体或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽，或HLA-A*02。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域是scFv。
在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域融合到抑制性受体的细胞外结构域。
在一些实施例中，本公开的抑制性受体包含细胞外铰链区。示例性的铰链可以分离自或衍生自IgD和CD8结构域，例如IgG1。在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。
本公开的抑制性受体可以被设计成包含与抑制性受体的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可以衍生自天然来源或合成来源。当来源是天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区可以分离自或衍生自(即至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或免疫球蛋白(如IgG4)。替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个端发现。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选地长度为2至10个氨基酸，可以在抑制性受体的跨膜结构域和细胞内结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
本公开提供了包含细胞内结构域的抑制性受体。本公开的抑制性受体的细胞内结构域负责抑制包含抑制性受体的免疫细胞的活化，否则其将响应于第一受体的活化信号而被活化。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。在一些实施例中，包含ITIM的抑制性细胞内结构域可以分离自或衍生自免疫检查点抑制剂，如CTLA-4和PD-1。CTLA-4和PD-1是在T细胞表面表达的免疫抑制性受体，并且在减弱或终止T细胞应答中起关键作用。
在一些实施例中，抑制性细胞内结构域分离自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体和CD200受体1。在一些实施例中，TRAIL受体包括TR10A、TR10B或TR10D。
在一些实施例中，抑制性细胞内结构域分离自具有鞘糖脂微结构域1(PAG1)的磷蛋白膜锚。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域分离自白细胞免疫球蛋白样受体B1(LILRB1)。
在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白，例如人TRAIL受体、CTLA-4、PD-1、PAG1或LILRB1蛋白。
在一些实施例中，抑制性结构域包含细胞内结构域、跨膜结构域或其组合。在一些实施例中，抑制性结构域包含细胞内结构域、跨膜结构域、铰链区或其组合。
在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长细胞质尾2(KIR3DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长细胞质尾3(KIR3DL3)、白细胞免疫球蛋白样受体B1(LIR1，也称为LIR-1和LILRB1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、Fcγ受体IIB(FcgRIIB)、杀伤细胞凝集素样受体K1(NKG2D)、CTLA-4、含有合成共有区ITIM的结构域、ZAP70 SH2结构域(例如，N和C末端SH2结构域中的一者或两者)，或ZAP70 KI_K369A(激酶失活ZAP70)。
在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白质。
在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性结构域。在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性细胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到抑制性受体的细胞内结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到抑制性受体的跨膜结构域。
在一些实施例中，第二抑制性受体包含细胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域或其分离自或衍生自相同蛋白质(例如含ITIM的蛋白质)的部分。在一些实施例中，第二抑制性受体包含铰链区，其分离自或衍生自与细胞内结构域和/或跨膜结构域相同的蛋白质，例如含ITIM的蛋白质。
在一些实施例中，第二受体是包含抑制性结构域的TCR(抑制性TCR)。在一些实施例中，抑制性TCR包含抑制性细胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3γ或CD3ε或其一部分TCR的细胞内结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3γ或CD3ε的跨膜结构域。
在一些实施例中，第二受体是包含抑制性结构域的TCR(抑制性TCR)。在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自LILRB1。
LILRB1抑制性受体
本公开提供了包含LILRB1抑制性结构域和任选的LILRB1跨膜和/或铰链结构域或其功能变体的第二抑制性受体。与具有另一个跨膜结构域或另一个铰链结构域的参照抑制性受体相比，在抑制性受体中包括LILRB1跨膜结构域和/或LILRB1铰链结构域可以增加由抑制性受体生成的抑制性信号。包含LILRB1抑制性结构域的第二抑制性受体可以是CAR或TCR，如本文所述。如本文所述，任何合适的配体结合结构域可以融合到基于LILRB1的第二抑制性受体。
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LILRB1)，也称为白细胞免疫球蛋白样受体B1，以及ILT2、LIR1、MIR7、PIRB、CD85J、ILT-2、LIR-1、MIR-7和PIR-B，是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员。LILRB1蛋白属于LIR受体的亚家族B类。这些受体含有两至四个细胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和两至四个基于细胞质免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。LILRB1受体在免疫细胞上表达，其中它结合抗原呈递细胞上的MHC I类分子并转导抑制免疫应答刺激的负信号。LILRB1被认为调节炎症应答以及细胞毒性，并且在限制自身反应性中发挥作用。存在编码LILRB1的不同同种型的多种转录物变体，所有这些都被认为在本公开的范围内。
在本文所述的抑制性受体的一些实施例中，抑制性受体包含一个或多个分离自或衍生自LILRB1的结构域。在具有分离自或衍生自LILRB1的一个或多个结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域包含与SEQ ID NO:54的序列或亚序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或相同的氨基酸序列。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域包含与SEQ ID NO:54的序列或亚序列相同的氨基酸序列。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:54的序列或亚序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:54的序列或亚序列相同的氨基酸序列组成。
在具有分离自或衍生自LILRB1的一个或多个结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:55的序列或亚序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同的多核苷酸序列编码。
在具有LILRB1的一个或多个结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:55的序列或亚序列相同的多核苷酸序列编码。
在各种实施例中，提供了包含多肽的抑制性受体，其中多肽包含以下中的一种或多种：LILRB1铰链结构域或其功能变体；LILRB1跨膜结构域或其功能变体；和LILRB1细胞内结构域或包含至少一个或至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内结构域，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
本文所用的“基于免疫受体酪氨酸的抑制基序”或“ITIM”是指具有S/I/V/LxYxxI/V/L(SEQ ID NO:547)等共有序列的保守氨基酸序列，其存在于免疫系统的许多抑制性受体的细胞质尾。在具有ITIM的抑制性受体与其配体相互作用后，ITIM基序被磷酸化，使抑制性受体募集其它酶，如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，或称为SHIP的肌醇磷酸酶。
在一些实施例中，多肽包含细胞内结构域，其包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)、至少两个ITIM、至少3个ITIM、至少4个ITIM、至少5个ITIM或至少6个ITIM。在一些实施例中，细胞内结构域具有1、2、3、4、5或6个ITIM。
在一些实施例中，多肽包含细胞内结构域，其包含至少一个选自由以下组成的组的ITIM：由NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)组成的ITIM。
在进一步的特定实施例中，多肽包含细胞内结构域，其包含至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
在一些实施例中，细胞内结构域包含两个ITIM，即NLYAAV(SEQ ID NO:56)和VTYAEV(SEQ ID NO:57)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:60至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:60相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含两个ITIM，即VTYAEV(SEQ ID NO:57)和VTYAQL(SEQ ID NO:58)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:61至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:61相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含两个ITIM，即VTYAQL(SEQ ID NO:58)和SIYATL(SEQ ID NO:59)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:62至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:62相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含以下ITIM：NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)，和VTYAQL(SEQ ID NO:58)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ IDNO:63至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:63相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含以下ITIM：VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ IDNO:64至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:64相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含以下ITIM：NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:65至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:65相同的序列组成。
在一些实施例中，细胞内结构域包含与LILRB1细胞内结构域(SEQ ID NO:70)至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与LILRB1细胞内结构域(SEQ ID NO:70)相同的序列组成。
本公开的LILRB1细胞内结构域或其功能变体可以具有至少1个、至少2个、至少4个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个ITIM。在一些实施例中，LILRB1细胞内结构域或其功能变体具有2、3、4、5或6个ITIM。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含两个、三个、四个、五个或六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含至少三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含四个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含五个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
在具体的实施例中，细胞内结构域包含至少七个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
LILRB1蛋白具有称为D1、D2、D3和D4的四个免疫球蛋白(Ig)样结构域。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含LILRB1 D3D4结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1D3D4结构域包含与SEQ ID NO:66至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，LILRB1 D3D4结构域包含或基本上由SEQ ID NO:66组成。
在一些实施例中，多肽包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。在实施例中，LILRB1铰链结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或与其相同的序列。在实施例中，LILRB1铰链结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67至少95％相同的序列。
在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:66或SEQID NO:67相同的序列。
在一些实施例中，LILRB1铰链结构域基本上由与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67相同的序列组成。
在一些实施例中，跨膜结构域是LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:74至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:74至少95％相同的序列。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域包含与SEQ ID NO:74相同的序列。在实施例中，LILRB1跨膜结构域基本上由与SEQ IDNO:74相同的序列组成。
在一些实施例中，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附着于第二抑制性受体的细胞外区，例如抗原结合结构域或配体结合结构域。例如，在一些实施例中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链、CD8a铰链或LILRB1铰链。
在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性结构域。在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性细胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自LILR1B。
包含LILRB1结构域组合的抑制性受体
在一些实施例中，本公开的基于LILRB1的抑制性受体包含多于一个LILRB1结构域或其功能等效物。例如，在一些实施例中，抑制性受体包含LILRB1跨膜结构域和细胞内结构域，或LILRB1铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
在具体的实施例中，抑制性受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体，和LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:68至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或与其相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:68至少95％相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ IDNO:68相同的序列。
在进一步的实施例中，抑制性受体包含：LILRB1跨膜结构域或其功能变体，以及LILRB1细胞内结构域和/或包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内结构域，其中ITIM选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ IDNO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。在一些实施例中，多肽包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体，以及LILRB1细胞内结构域和/或包含至少两个ITIM的细胞内结构域，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAEV(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
在一些实施例中，抑制性受体包含LILRB1跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:69至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或与其相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:69至少95％相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:69相同的序列。
在优选的实施例中，抑制性受体包含：LILRB1铰链结构域或其功能变体；LILRB1跨膜结构域或其功能变体；以及LILRB1细胞内结构域和/或包含至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内结构域，其中每个ITIM独立地选自LYAAV(SEQ ID NO:56)、VTYAE(SEQ ID NO:57)、VTYAQL(SEQ ID NO:58)，和SIYATL(SEQ ID NO:59)。
在一些实施例中，抑制性受体包含与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72至少95％相同，或与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72至少99％相同，或与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72相同的序列。
在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:68至少99％相同，或与SEQ ID NO:68至少99％相同，或与SEQ ID NO:68相同的序列。
在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:69至少99％相同，或与SEQ ID NO:69至少99％相同，或与SEQ ID NO:69相同的序列。
表9：示例性的基于LILRB1的抑制性受体的多肽序列
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本公开的示例性抑制性受体包含对HLA-A、HLA-B或HLA-C非靶抗原中的任一种特异性的scFv，其序列列于表5中，融合到LILRB1铰链、跨膜和细胞内结构域的N末端。在一些实施例中，LILRB1铰链包含SEQ ID NO:73的序列，LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:74的序列，并且LILRB1细胞内结构域包含SEQ ID NO:70的序列。例如，第二抑制性受体包含融合到SEQ ID NO:71的N末端的表5的scFv序列。
作为另一个实例，非靶抗原包含HLA-A*02，并且第二抑制性受体包含以下序列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTSGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTSYHIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNVNTEYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCAREEITYAMDYWGQGTSVTVSSYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH(SEQ ID NO:348)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02并且第二抑制性受体包含SEQ ID NO:348的序列。
多核苷酸和载体
本公开提供了编码本公开的第一受体和第二受体的序列的多核苷酸。本公开提供了包含本文所述的多核苷酸和载体的免疫细胞。
在一些实施例中，第一受体和/或第二受体的序列可操作地连接到启动子。在一些实施例中，编码第一受体的序列可操作地连接到第一启动子，编码第二受体的序列可操作地连接到第二启动子。
本公开提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。
在一些实施例中，第一受体由第一载体编码，第二受体由第二载体编码。在一些实施例中，两种受体均由单一载体编码。在一些实施例中，第一载体和/或第二载体包含shRNA，例如B2M shRNA。
在一些实施例中，两种受体均由单一载体编码。在一些实施例中，载体包含shRNA，例如B2M shRNA。
在一些实施例中，第一受体和第二受体由单一载体编码。使用单一载体编码多种多肽的方法是本领域普通技术人员已知的，尤其包括在不同启动子控制下编码多种多肽，或者如果使用单个启动子控制多种多肽的转录，使用编码内部核糖体进入位点(IRES)和/或自切割肽的序列。示例性的自切割肽包括T2A、P2A、E2A和F2A自切割肽。在一些实施例中，T2A自切割肽包含序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:764)。在一些实施例中，P2A自切割肽包含序列ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:765)。在一些实施例中，E2A自切割肽包含序列QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:766)。在一些实施例中，F2A自切割肽包含序列VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:767)。在一些实施例中，T2A自切割肽包含序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:764)。前述任一项也可以包括N末端GSG接头。例如，T2A自切割肽也可以包含序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:351)，其可以由序列GGATCCGGAGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACC CTGGCCCC(SEQ ID NO:768)编码。
在一些实施例中，载体是表达载体，即用于在合适的细胞中表达第一受体和/或第二受体。
衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体比衍生自肿瘤逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
编码受体的天然或合成核酸的表达通常通过将编码受体或其部分的核酸可操作地连接到启动子上，并将构建体整合到表达载体中来实现。载体可适用于真核生物的复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调控所需核酸序列表达的启动子。
编码受体的多核苷酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，可以将多核苷酸克隆到载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞，如免疫细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并描述于例如Sambrook等人(2001，《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》，纽约冷泉港实验室)和其它病毒学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个选择性标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。典型地，它们位于起始位点上游的30至110碱基对(bp)区域，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加到相隔50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用以活化转录。
合适启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延长生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、U6启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本公开不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本公开的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要这样的表达时，该分子开关能够开启与其可操作连接的多核苷酸序列的表达，或当不需要表达时，该分子开关能够关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估受体的表达，待引入细胞的表达载体也可以含有选择性标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择性标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择性标记和报告基因都可以与合适的调节序列侧接，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定可能转染或转导的细胞，并用于评估调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，其编码的多肽的表达通过一些容易检测的特性(例如，酶活性)来证明。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，可以使用已知技术制备或商购获得。通常，具有显示最高水平的报告基因表达的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
向细胞中引入和表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物方法将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人(2001，《分子克隆：实验室手册》，纽约冷泉港实验室)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来鉴定落入本公开范围内的试剂。
免疫细胞
本公开提供了包含本文所述的受体、载体和多核苷酸的免疫细胞。
在一些实施例中，免疫细胞包含：(a)第一受体，其包含对选自以下的靶抗原特异性的第一细胞外配体结合结构域：(i)癌细胞特异性抗原或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或(ii)MSLN或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；和(b)第二受体，其包含对选自细胞间粘附分子1(ICAM1)、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、富含亮氨酸重复神经元4(LRRN4)和尿路上皮特异蛋白3B UPK3B或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽或HLA-A*02的非靶抗原特异性的第二细胞外配体结合。在一些实施例中，第一受体是CAR或TCR。在一些实施例中，第二受体是抑制性受体，如抑制性嵌合抗原受体或TCR。
本公开提供了包含第一受体和第二受体的免疫细胞，第一受体包含SEQ ID NO:303的序列，第二受体包含SEQ ID NO:348的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，免疫细胞包含由包含SEQ ID NO:349或350的序列，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列编码的shRNA。在一些实施例中，免疫细胞包含第一受体和第二受体，第一受体包含SEQ ID NO:303的序列，第二受体包含SEQ ID NO:348的序列和编码包含SEQ ID NO:349或350的序列的shRNA的序列。在一些实施例中，第一受体和第二受体由单个多核苷酸编码，并且其中编码第一受体和第二受体的序列由编码自切割多肽的序列分开。在一些实施例中，自切割多肽包含T2A自切割多肽，其包含序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:351)。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与先天或适应性(获得性)免疫系统的细胞。示例性的先天免疫细胞包括吞噬细胞(如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)、自然杀伤(NK)细胞、多形核白细胞(如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，以及单核细胞(如单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞)。在获得性免疫中起作用的免疫细胞包括淋巴细胞，如T细胞和B细胞。
如本文所用，“T细胞”是指一种来源于在胸腺中发育的骨髓前体的淋巴细胞类型。存在几种不同类型的在迁移至胸腺时发育的T细胞，其包括辅助性CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、记忆性T细胞、调节性CD4+T细胞和干记忆性T细胞。不同类型的T细胞可以由普通技术人员基于其标记的表达来区分。区分T细胞类型的方法对于普通技术人员来说是显而易见的。
在一些实施例中，第一受体和第二受体在靶细胞存在下一起特异性活化免疫细胞。
在一些实施例中，免疫细胞是CD4+、CD8+、γδT细胞、不变T细胞、iNK细胞、NK细胞、巨噬细胞或其组合。在一些实施例中，免疫细胞是γδ(γδ)T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是不变T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是不变的自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是B细胞。在一些实施例中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，免疫细胞是CD8-。在一些实施例中，免疫细胞是CD8+。在一些实施例中，免疫细胞是CD4+。在一些实施例中，免疫细胞是CD4-。在一些实施例中，免疫细胞是CD8-/CD4+。在一些实施例中，免疫细胞是CD8+CD4-T细胞。
在一些实施例中，免疫细胞是非天然的。在一些实施例中，免疫细胞是分离的。
用本公开的载体转化免疫细胞群体(如T细胞)的方法对本领域普通技术人员来说是显而易见的。例如，CD3+T细胞可以使用CD3+T细胞阴性分离试剂盒(美天旎公司(Miltenyi))根据制造商的说明书从PBMC中分离。在CD3/28Dynabead(1:1细胞与珠比)和300单位/mL的IL-2(美天旎公司)存在下，在补充有5％人A/B血清和1％Pen/strep的X-Vivo15培养基中以1x 10^6个细胞/mL的密度培养T细胞。2天后，可以使用本领域已知的方法用病毒载体(如慢病毒载体)转导T细胞。在一些实施例中，病毒载体以5的感染复数(MOI)转导。然后在富集前将细胞在IL-2或其它细胞因子(如IL-7/15/21的组合)中再培养5天。分离和培养其它免疫细胞群体(如B细胞或其它T细胞群体)的方法对本领域普通技术人员来说是显而易见的。尽管该方法概述了潜在的方法，但是应当注意，这些方法正在快速发展。例如，外周血单核细胞的优异病毒转导可以在生长5天后实现，以生成>99％的CD3+高度转导的细胞群体。
活化和培养包含TCR、CAR、抑制性受体、受体或编码其的载体的T细胞群体的方法对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
无论是在对T细胞进行遗传修饰以表达TCR之前还是之后，通常都可以使用例如在美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号、第10040846号；和美国专利申请公开2006/0121005号中描述的方法活化和扩增T细胞。
在一些实施例中，本公开的T细胞在体外扩增和活化。通常，本公开的T细胞通过与表面接触而在体外扩增，表面附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群体，例如通过与抗CD3抗体接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群体可以在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松Diaclone公司)，可以使用本领域公知的其它方法(Berg等人，《移植学会会报(Transplant Proc.)》30(8):3975-3977，1998；Haanen等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》190(9):13191328，1999；Garland等人，《免疫学方法杂志(J.ImmunolMeth.)》227(1-2):53-63，1999)。
在一些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，试剂可以与同一表面偶联(即，以“顺式”形式)或与不同的表面偶联(即，以“反式”形式)。替代地，一种试剂可以与表面偶联，另一种试剂在溶液中。在一些实施例中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，提供初级活化信号的试剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种试剂都可以在溶液中。在另一实施例中，试剂可以是可溶形式，然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或抗体或其它将结合到试剂的结合剂。关于这一点，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于活化和扩增本公开中的T细胞。
在一些实施例中，两种试剂固定在珠上，或者固定在同一珠上，即“顺式”，或者固定在分开的珠上，即“反式”。例如，提供初级活化信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以相等的分子量共固定到相同的珠上。在一个实施例中，对于CD4+T细胞扩增和T细胞生长，使用每种抗体以1:1的比例结合到珠上。在一些实施例中，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本公开的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于一。在本公开的某些实施例中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。
颗粒与细胞的比率为1:500至500:1以及其间的任何整数值可用于刺激T细胞或其它靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小尺寸的珠只能结合少数细胞，而较大的珠能结合许多细胞。在某些实施例中，细胞与颗粒的比率范围为1:100至100:1和其间的任何整数值，在进一步的实施例中，该比率包含1:9至9:1和其间的任何整数值，也可用于刺激T细胞。在一些实施例中，使用1:1的细胞与珠的比率。本领域技术人员将理解，多种其它比率可适用于本公开。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。
在本公开的其它实施例中，将细胞(如T细胞)与试剂包被的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在另一实施例中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是一起培养。在进一步的实施例中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，细胞表面蛋白可以通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁性珠与T细胞接触而连接。在一个实施例中，细胞(例如，CD4+T细胞)和珠(例如，比率为1:1的DYNABEADS CD3/CD28 T顺磁性珠)在缓冲液中混合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。在某些实施例中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施例中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用以1x106个细胞/mL的密度培养的细胞。
在一些实施例中，混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一实施例中，珠和T细胞一起培养2至3天。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(龙沙公司(Lonza)))，其可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一定量的足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。在一些实施例中，培养基包含补充有5％人A/B血清、1％青霉素/链霉素(pen/strep)和300单位/ml的IL-2(美天旎公司)的X-VIVO-15培养基。
将T细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
在一些实施例中，本公开的包含TCR、CAR和抑制性受体的T细胞是自体的。在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。免疫细胞(如T细胞)可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些实施例中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在本公开的某些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，如FicollTM分离，从收集自受试者的单位血液中获得T细胞。
在一些实施例中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续的处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代的实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可以缺少镁或者可以缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，如根据制造商的说明书通过使用半自动化的“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可以将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其它含或不含缓冲液的盐溶液。替代地，可以除去单采血液成分术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施例中，通过裂解红细胞和去除单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析从外周血淋巴细胞分离免疫细胞，如T细胞。免疫细胞的特定亚群，如T细胞、B细胞或CD4+T细胞，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一个实施例中，通过与抗CD4-缀合的珠孵育一段足以阳性选择所需的T细胞的时间来分离T细胞。
通过阴性选择富集免疫细胞群体，如T细胞群体，可以通过针对阴性选择细胞特有的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD 14、CD20、CD 11b、CD 16、HLA-DR和CD8的抗体。
为了通过阳性或阴性选择分离所需的免疫细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠)的浓度。在某些实施例中，可能需要显著降低珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。
在一些实施例中，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2至10℃或室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞或从中分离免疫细胞(如T细胞)的PBMC也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过除去细胞群体中的粒细胞和在一定程度上除去单核细胞而提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在本文中是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的蒸汽相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃或液氮中立即进行不受控冷冻。
本公开提供了表达本文所述的活化剂和/或阻断剂受体的免疫细胞，其中免疫细胞具有降低的主要组织相容性(MHC)I类复合物的表达和/或功能。
在一些实施例中，免疫细胞是自体的。例如，免疫细胞分离自或衍生自接受该细胞作为治疗方案的一部分的相同受试者。用对MHC I类抗原特异性的阻断剂受体修饰自体免疫细胞以降低MHC I类的表达和/或功能可能是有利的。不希望受理论束缚，修饰自体免疫细胞以降低MHC I类的表达和/或功能降低了阻断剂受体与免疫细胞表达的MHC I类的结合，无论是顺式还是反式。
在一些实施例中，免疫细胞都是同种异体的。同种异体免疫细胞可以衍生自供体，而不是施用免疫细胞的受试者。同种异体免疫细胞在细胞疗法中通常被称为“现成的”或“通用的”，因为同种异体细胞可能被制备和储存用于多种基因型的受试者。
降低MHC I类复合物的表达和/或功能的任何合适的方法都被设想在本公开的范围内，并且尤其包括敲低一种或多种编码MHC I类组分的RNA的干扰RNA的表达，或编码MHCI类组分的基因的修饰。
主要组织相容性复合物(MHC)是脊椎动物基因组上编码适应性免疫系统所需的一组多肽的基因座。其中有MHC I类多肽，其包括HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因。MHC I类等位基因是高度多态性的并且在所有有核细胞中均表达。由HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因编码的MHC I类多肽与β2微球蛋白(B2M)形成异二聚体，并与细胞表面上的抗原复合存在。如本文所述，MHC I类基因或多肽可以指在MHC中发现的任何多肽或编码所述多肽的相应基因。在一些实施例中，本公开的免疫细胞被抑制剂配体灭活，该抑制剂配体包含MHC I类多肽，例如HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因。HLA-A等位基因可以是，例如但不限于，HLA-A*02、HLA-A*02:01、HLA-A*02:01:01、HLA-A*02:01:01:01，和/或编码与HLA-A*02蛋白相同或相似的蛋白的任何基因。因此，为了防止如本文所述的自分泌信号传导/结合，需要消除或减少由HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因编码的多肽在免疫细胞中的表达。
MHC I类多肽表达降低的免疫细胞
在一些实施例中，本文所述的免疫细胞被修饰以灭活或降低或消除编码内源性MHC I类多肽的等位基因的内源性基因的表达或功能。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A、HLA-B和/或HLA-C。HLA-A、HLA-B和HLA-C由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座编码。HLA-A、HLA-B和HLA-C中的每一种均包括许多变体等位基因，所有这些均被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A。在一些实施例中，编码MHCI类多肽的基因是HLA-A*02。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A*02:01。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A*02:01:01。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A*02:01:01:01。
在一些实施例中，修饰本文所述的遗传工程化的免疫细胞以减少或消除B2M基因产物的表达。β-2微球蛋白(B2M)基因编码与主要组织相容性复合物(MHC)I类(即MHC-I复合物)相关的蛋白质。MHC-I复合物是细胞表面抗原呈递所需的。当B2M缺失时，MHC-I复合物被破坏并且不起作用(Wang D等人《干细胞转译医学(Stem Cells Transl Med.)》4:1234-1245(2015))。此外，可以使用本领域已知的基因编辑技术高效地破坏B2M基因(Ren等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》23:2255-2266(2017))。减少或消除B2M可以减少或消除免疫细胞表面上的功能性MHC I。
本公开提供了用于编辑免疫细胞中的内源性靶基因的基因编辑系统。本公开提供了对靶基因序列特异性的干扰RNA。基因编辑系统，如CRISPR/Cas系统、TALEN和锌指，可用于生成双链断裂，其通过基因修复机制(如同源定向修复或非同源末端连接(NHEJ))可用于引入突变。断裂末端切除后的NHEJ或不适当的末端连接可用于引入缺失。在一些实施例中，靶基因包含编码MHC-I复合物亚基的基因。
靶基因序列包括但不限于启动子、增强子、内含子、外显子、内含子/外显子接合、转录产物(前mRNA、mRNA和剪接变体)和/或3'和5'非翻译区(UTR)。为了在本文所述的免疫细胞中进行遗传编辑的目的，可以靶向任何基因元件或基因元件的组合。对靶基因的修饰可以使用本领域已知的任何方法来完成，以编辑靶基因，导致靶基因或基因产物的表达或功能改变或破坏。
在一些实施例中，修饰编码MHC I类多肽的基因包含缺失全部或部分基因。在一些实施例中，修饰编码MHC I类多肽的基因包含在基因中引入突变。在一些实施例中，突变包含缺失、插入、取代或移码突变。在一些实施例中，修饰基因包含使用核酸引导的核酸内切酶。
本文所述靶基因的基因序列是本领域已知的。这些序列可以在公共数据库中找到，如NCBI基因库或NCBI核苷酸数据库。可以使用基因标识符找到序列，例如，HLA-A基因具有NCBI基因ID：3105，HLA-B基因具有NCBI基因ID：3106，HLA-C基因具有NCBI基因ID：3107，并且B2M基因具有NCBI基因ID：567和NCBI参考序列：NC_000015.10。也可以通过使用关键词搜索公共数据库来找到基因序列。例如，可以通过搜索关键词“HLA-A*02”、“HLA-A*02:01”、“HLA-A*02:01:01”或“HLA-A*02:01:01:01”在NCBI核苷酸数据库中找到HLA-A等位基因。这些序列可用于本领域已知的各种基因编辑技术中的靶向。表10提供了靶向用于本文所述修饰的HLA-A等位基因和B2M基因序列的非限制性示例性序列。
表10.示例性靶基因序列
B2M mRNA SEQ ID NO:769
B2M基因(基因库：567) SEQ ID NO:770
编码mRNA的HLA-A*02:01:01:01序列 SEQ ID NO:771
HLA-A*02(基因库：LK021978.1) SEQ ID NO:772
本领域普通技术人员将理解，T可以取代U以将RNA序列转化为DNA序列，反之亦然，并且两者都被设想为本公开的靶基因序列。
在一些实施例中，使用核酸引导的核酸内切酶在本文所述的免疫细胞中编辑靶基因。示例性核酸引导的核酸内切酶包括II类核酸内切酶，如CRISPR/Cas9。
本文所用的“CRISPR”或“CRISPR基因编辑”是指一组成簇的规则间隔的短回文重复序列，或包含这样一组重复序列的系统。本文所用的“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可用于沉默、敲除或突变靶基因。该系统是一种原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性，并提供一种获得性免疫。CRISPR/Cas系统已被修饰用于基因编辑。这是通过向真核细胞中引入一种或多种特别设计的引导核酸(gNA)，通常是引导RNA(gRNA)，以及与gNA形成核糖核蛋白复合物的合适的Cas核酸内切酶来实现的。gNA将gNA-核酸内切酶蛋白复合物引导至靶基因组位置，并且核酸内切酶在靶基因组位置引入链断裂。这种链断裂可以通过细胞机制修复，如非同源末端连接(导致缺失)或同源修复(可以生成插入)，从而将遗传修饰引入宿主细胞基因组。
CRISPR/Cas系统按类和按类型分类。2类系统目前代表分类为三种不同类型(II型、V型和VI型)的单一干扰蛋白。任何适合于基因编辑的2类CRISPR/Cas系统，例如II型、V型或VI型系统，被设想为在本公开的范围内。示例性的2类II型CRISPR系统包括Cas9、Csn2和Cas4。示例性的2类V型CRISPR系统包括Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i和Cas12k(C2c5)。示例性的2类VI型系统包括Cas13、Cas13a(C2c2)Cas13b、Cas13c和Cas13d。
CRISPR序列，有时称为CRISPR基因座，包含交替重复序列和间隔区。在天然存在的CRISPR中，间隔区通常包含细菌外源的序列，如质粒或噬菌体序列。如本文所述，间隔区序列也可以称为“靶向序列”。在用于遗传工程的CRISPR/Cas系统中，间隔区衍生自靶基因序列(gNA)。
示例性的2类II型CRISPR系统依赖于蛋白质Cas9，其是具有两个活性切割位点的核酸酶，双螺旋的每条链一个。组合Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA可用于基因编辑系统中。Pennisi(2013)《科学(Science)》341:833-836。在一些实施例中，用于修饰免疫细胞的Cas蛋白是Cas9。
因此，CRISPR/Cas系统可用于编辑靶基因，例如通过添加或删除碱基对，或引入过早终止从而降低靶的表达而靶向用于在本文所述的免疫细胞中编辑的基因。CRISPR/Cas系统也可以像RNA干扰一样使用，以可逆的方式关闭靶基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至靶基因启动子，空间阻断RNA聚合酶。
Cas蛋白可以衍生自任何细菌或古细菌Cas蛋白。任何合适的CRISPR/Cas系统均设想在本公开的范围内。在其它方面，Cas蛋白包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a(Cpf1)、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY、其同源物或其修饰形式中的一种或多种。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白、Cpf1蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas 5、Cas7、Cas8、Cas10，或这些蛋白的组合或复合物。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白。
用本领域已知的技术，例如美国公开号20140068797和Cong(2013)《科学》339:819-823中描述的技术，可以生成抑制靶基因的人工CRISPR/Cas系统。也可以生成抑制靶基因的本领域已知的其它人工CRISPR/Cas系统，例如，在Tsai(2014)《自然·生物技术(Nature Biotechnol.)》，32:6 569-576，美国专利第8,871,445号；第8,865,406号；第8,795,965号；第8,771,945号；和第8,697,359号中描述的。为特定Cas蛋白设计合适gNA的方法是本领域普通技术人员已知的。
本公开提供了可以将相关多肽(例如，核酸引导的核酸内切酶)的活性导向靶核酸基因组内的特定靶基因序列的基因靶向引导核酸(gNA)。基因组靶向核酸可以是RNA。基因组靶向RNA在本文中称为“引导RNA”或“gRNA”。引导RNA可以至少包含与感兴趣的靶核酸序列杂交的靶向序列和CRISPR重复序列。在一些II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA，在本文中也称为“支架”序列。在II型引导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和支架序列彼此杂交以形成双链体。在V型引导RNA(gRNA)中，crRNA形成双链体。在两种系统中，双链体可以结合定点多肽，使得引导RNA和定点多肽形成复合物。基因靶向核酸可以通过其与定点多肽的缔合而提供对复合物的靶特异性。因此，基因靶向核酸可以指导定点多肽的活性。
在一些实施例中，本公开提供了包含靶向序列和引导RNA支架序列的引导RNA，其中靶向序列与靶基因的序列互补。
示例性的引导RNA包括约15至20个碱基的靶向序列。如本领域普通技术人员所理解的，每个gRNA可以被设计成包括与其基因组靶序列互补的靶向序列。例如，可以将每种靶向序列(例如，表11和14中呈现的DNA序列的RNA版本，减去代表PAM位点的三个3'核苷酸)放入单个RNA嵌合体或crRNA中。
基因靶向核酸可以是双分子引导RNA。基因靶向核酸可以是单分子引导RNA。基因靶向核酸可以是本领域已知的任何已知构型的引导RNA，例如包括成对的gRNA，或在单个步骤中使用的多个gRNA。尽管从基因组序列中可以清楚地看出编码序列和剪接点在哪里，但基因表达所需的其它特征可能是特异的和不清楚的。
双分子引导RNA可以包含双链RNA。第一链包含5'至3'方向的序列、任选的间隔区延伸序列、靶向序列和最小CRISPR重复序列。第二链可以包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
II型系统中的单分子引导RNA(sgRNA)可以在5'至3'方向上包含任选的间隔区延伸序列、靶向序列、最小CRISPR重复序列、单分子引导接头、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸可以包含为引导RNA提供额外功能(例如，稳定性)的元件。单分子引导接头可以连接最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸可以包含一个或多个发夹。
在一些实施例中，引导RNA或单分子引导RNA(sgRNA)可以包含靶向序列和支架序列。在一些实施例中，支架序列是Cas9 gRNA序列。在一些实施方案中，支架序列由包含与以下序列共享至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的DNA序列编码：
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO:773)。在一些实施例中，支架序列由包含GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ IDNO:773)的DNA序列编码。
在一些实施例中，例如其中CRISPR/Cas系统是Cas9系统的那些实施例，sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含20个核苷酸的靶向序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含少于20个核苷酸的靶向序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含多余20个的核苷酸靶向序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5'端具有17至30个核苷酸的可变长度靶向序列。
合适的支架序列和支架靶向序列的排列将取决于核酸内切酶的选择，并且是本领域技术人员已知的。
II型系统中的单分子引导RNA(sgRNA)，例如Cas9，可以在5'至3'方向包含最小CRISPR重复序列和靶向序列。
作为说明，在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统中使用的引导RNA，或其它更小的RNA可以通过化学方法容易地合成，如下文所示和在本领域中描述的。尽管化学合成方法不断扩大，但是当多核苷酸长度显著增加超过一百个左右的核苷酸时，通过如高效液相色谱(HPLC，其避免使用如PAGE的凝胶)的方法纯化这种RNA往往变得更具挑战性。一种用于生成更长RNA的方法是产生两个或多个连接在一起的分子。更长的RNA，如编码Cas9或Cpf1核酸内切酶的RNA，更易于酶促生成。可以在RNA的化学合成和/或酶促生成期间或之后引入各种类型的RNA修饰，例如增强稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度，和/或增强其它属性的修饰，如本领域所述。
gRNA的靶向序列与感兴趣的靶核酸中的序列杂交。基因组靶向核酸的靶向序列可以通过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。靶向序列的核苷酸序列可以根据感兴趣的靶核酸的序列而变化。
在本文所述的Cas9系统中，靶向序列可以被设计为与位于系统中使用的Cas9酶的PAM的反向互补物的5'的靶核酸杂交。靶向序列可以完全匹配靶序列或可以具有错配。每种CRISPR/Cas系统蛋白可以在其在靶DNA中识别的特定方向和位置上具有特定PAM序列。例如，化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9在靶核酸中识别包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由靶向序列靶向的靶核酸序列的3'。选择合适的PAM序列对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
靶序列与gRNA的靶向序列互补并杂交。靶核酸序列可以包含20个核苷酸。靶核酸可以包含少于20个核苷酸。靶核酸可以包含多于20个核苷酸。靶核酸可以至少包含：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。在一些实施例中，例如其中CRISPR/Cas系统是Cas9系统的那些实施例，靶核酸序列可以包含紧邻PAM序列的反向互补物的第一核苷酸的5'的20个核苷酸。该靶核酸序列通常称为PAM链或靶链，而互补核酸序列通常称为非PAM链或非靶链。本领域技术人员将认识到靶向序列与靶核酸的非PAM链杂交，参见例如US20190185849A1。
在一些实例中，靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在一些实例中，靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％或100％。在一些实例中，靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比在靶核酸的互补链的靶序列的六个连续的最5'核苷酸上是100％。靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比在约20个连续核苷酸上可以是至少60％。靶向序列和靶核酸的长度可以相差1至6个核苷酸，其可以被认为是一个或多个凸起。
可以使用本领域普通技术人员已知的计算机程序来设计或选择靶向序列。计算机程序可以使用变量，如预测的解链温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、％GC、基因组出现的频率(例如，由于错配、插入或缺失而在一个或多个位点上相同或相似但不同的序列)、甲基化状态、SNP的存在等。可用的计算机程序可以将NCBI基因ID、官方基因符号、Ensembl基因ID、基因组坐标或DNA序列作为输入，并创建包含靶向指定为输入的适当基因组区的sgRNA的输出文件。计算机程序还可以提供统计学和分数的总结，表明sgRNA对靶基因的靶上和脱靶结合(Doench等人，《自然·生物技术》34:184-191(2016))。本公开提供了包含靶向序列的引导RNA。在一些实施例中，引导RNA进一步包含引导RNA支架序列。在一些实施例中，靶向序列与选自由HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M或其等位基因组成的组的靶基因的序列互补。在一些实施例中，靶基因是HLA-A基因。在一些实施例中，靶基因是HLA-B基因。在一些实施例中，靶基因是HLA-C基因。在一些实施例中，靶基因是HLA-A、HLA-B、HLA-C或其组合。在一些实施例中，靶向序列包含与表11和14中公开的序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性或与其相同的序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向内源性HLA-A基因座的序列。在一些实施例中，特异性靶向HLA-A基因座序列的gNA包含与选自表11中公开的序列的序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的序列。在一些实施例中，特异性靶向HLA-A基因座序列的gNA包含选自表11中公开的序列的序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02等位基因的序列。例如，gRNA特异性靶向并杂交于由所有HLA-A*02等位基因共享的序列，但不是HLA-A*02和HLA-A*03等位基因共享的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01:01等位基因的序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02的编码DNA序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向超过1000个HLA-A*02等位基因共享的编码DNA序列。在一些实施例中，特异性靶向大于1000个HLA-A*02等位基因中的编码DNA序列的gNA包含与选自表11中所示序列的序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性或与其相同的序列。
表11至14中的序列以DNA序列表示。本领域技术人员将理解，胸腺嘧啶(T)可以在任何DNA序列(包括表11至14中所示的那些)中用尿嘧啶(U)代替，以得到相应的RNA序列。
表11.靶向HLA-A和HLA-A等位基因的示例性序列
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表11中公开的序列包括相应的基因组序列，包括PAM序列。技术人员将理解，gRNA的靶向序列不包括表11中序列的三个3'末端核苷酸，其代表gRNA的相应PAM位点。
本公开提供了包含对B2M基因特异性的靶向序列的gNA。在一些实施例中，gNA特异性靶向B2M基因的编码序列(CDS)序列。在一些实施例中，gNA包含靶向B2M基因启动子序列的序列。
在一些实施例中，gNA包含靶向序列和gNA支架序列。在一些实施例中，靶向序列包含表12中所示的序列，或与其共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性的序列。
在一些实施例中，靶向序列与B2M基因的序列互补。在一些实施例中，B2M基因包含与表10中所示的B2M序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性的序列。
表12.靶向B2M的示例性序列
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在一些实施例中，使用TALEN基因编辑来编辑本文所述的免疫细胞。
“TALEN”或“TALEN基因编辑”是指类转录激活因子效应物核酸酶，其是用于编辑靶基因的人工核酸酶。
通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合人工产生TALEN。来源于黄单胞菌属细菌的类转录激活因子效应物(TALE)可以被工程化以结合任何所需的DNA序列，包括靶基因的一部分，如TCR亚基、MHC I类复合物组分或CD52。通过将工程化TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对任何所需DNA序列(包括靶基因序列)特异性的限制性酶。然后可以将它们引入细胞，其中它们可用于基因组编辑。
为了产生TALEN，TALE蛋白与核酸酶(N)融合，核酸酶是野生型或突变的折叠核酸内切酶。针对FokI在TALEN中的应用，已经进行了几种FokI突变；例如，这些提高了切割特异性或活性。
FokI结构域作为二聚体起作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于靶基因组中具有适当取向和间距的位点。TALE DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数目以及两个单独TALEN结合位点之间的碱基数目似乎是实现高水平活性的重要参数。
可以使用本领域已知的任何方法，包括使用模块化组件的各种方案，构建对靶基因中的序列特异性的TALEN。
在一些实施例中，使用ZFN基因编辑在本文所述的免疫细胞中编辑靶基因。
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“ZFN基因编辑”是指锌指核酸酶，一种可用于编辑靶基因的人工核酸酶。
与TALEN一样，ZFN包含与DNA结合结构域融合的折叠核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。
锌指是由一个或多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可以包含例如Cys2His2，并且可以识别大约3-bp的序列。已知特异性的各种锌指可以组合以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于生成识别特异性序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。
与TALEN一样，ZFN必须二聚化以切割DNA。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须结合DNA的相反链，它们的核酸酶适当地间隔开。
同样与TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果不正确地修复，其可以产生移码突变，导致细胞中靶基因或基因产物的表达和数量降低。ZFN也可用于同源重组以在靶基因中突变。
可以使用本领域已知的任何方法构建对靶基因中的序列特异性的ZFN。
在一些实施例中，使用RNA干扰降低一种或多种MCH-I组分的表达和功能。“RNAi”或“RNA干扰”是指由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。双链体RNA，如siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)、shRNA(短发夹RNA)、ddRNA(DNA定向RNA)、piRNA(Piwi相互作用RNA)或rasiRNA(重复相关siRNA)及其修饰形式，都能够介导RNA干扰。这些dsRNA分子可以是市售的或可以基于已知的序列信息设计和制备。这些分子的反义链可以包括RNA、DNA、PNA或其组合。DNA/RNA嵌合多核苷酸包括但不限于由抑制靶基因表达的DNA和RNA组成的双链多核苷酸。如本文所述，dsRNA分子还可以包括一个或多个修饰的核苷酸，其可以整合在一条或两条链上。
在RNAi基因沉默或敲低中，将包含与靶基因的一部分互补的第一(反义)链和与第一反义链完全或部分互补的第二(有义)链的dsRNA引入生物体中。在引入生物体后，靶基因特异性dsRNA被加工成相对小的片段(siRNA)，随后可分布在整个生物体中，降低靶基因的信使RNA，产生与靶基因完全或部分缺失产生的表型非常相似的表型。
细胞中的某些dsRNA可以经历Dicer酶(一种核糖核酸酶III酶)的作用。Dicer可以将dsRNA加工成较短的dsRNA片段，即siRNA。RNAi还涉及被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物。在被Dicer切割后，siRNA进入RISC复合物并直接切割具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA靶。siRNA的另一条链是过客链。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间。因此，siRNA可以通过以序列特异性方式介导RNA干扰来下调或敲低基因表达。
如本文关于RNA干扰所使用的，“靶基因”或“靶序列”是指其相应RNA被靶向以使用如本文所述的dsRNA或siRNA通过RNAi途径降解的基因或基因序列。示例性的靶基因序列示于表10中。为了靶向基因，例如使用siRNA，siRNA包含与靶基因或序列的至少一部分互补或基本上互补的反义区，以及与反义链互补的有义链。一旦引入细胞，siRNA指导RISC复合物切割包含靶序列的RNA，从而降解RNA。本公开提供了干扰RNA。本公开的双链RNA分子可以是本领域已知的任何类型的RNA干扰分子的形式。在一些实施例中，双链RNA分子是小干扰RNA(siRNA)。在其它实施例中，双链RNA分子是短发夹RNA(shRNA)分子。在其它实施例中，双链RNA分子是在细胞中加工以产生siRNA的Dicer底物。在其它实施例中，双链RNA分子是微小RNA前体分子的一部分。
在一些实施例中，shRNA具有适合作为Dicer底物的长度，其可以被加工以产生RISC活性siRNA分子。参见例如Rossi等人，US2005/0244858。
Dicer底物双链RNA(例如shRNA)可以具有足以被Dicer加工以产生活性siRNA的长度，并且可以进一步包括以下特性中的一种或多种：(i)Dicer底物shRNA可以是不对称的，例如，在反义链上具有3'突出端，(ii)Dicer底物shRNA可以在有义链上具有修饰的3'端，以指导Dicer结合的取向和dsRNA向活性siRNA的加工，例如掺入一个或多个DNA核苷酸，以及(iii)Dicer底物dsRNA的第一链和第二链的长度可以是21至30bp。
在一些实施例中，干扰RNA包含与B2M mRNA的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的B2M mRNA的降解。在一些实施例中，B2M mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，B2M mRNA序列包含非翻译区。
在一些实施例中，干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含非翻译区。
在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含第一序列，其从5'至3'端具有与B2M mRNA互补的序列；以及第二序列，其从5'至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。
在一些实施例中，第一序列是18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，第一序列与选自表13和14中所示序列的序列互补。在一些实施例中，第一序列具有大于或等于25％且小于60％的GC含量。在一些实施例中，第一序列与选自表13和14中所示序列的序列互补。在一些实施例中，第一序列不包含相同碱基的四个核苷酸或一连串七个C或G核苷酸碱基。在一些实施例中，第一序列是21个核苷酸。
与第一序列互补的示例性靶B2M序列示于表13中。
在一些情况下，第一序列可以与靶核酸序列具有100％同一性，即完全同一性、同源性、互补性。在其它情况下，在第一序列和靶核酸序列之间可能存在一个或多个错配。例如，在有义区和靶核酸序列之间可能存在1、2、3、4、5、6或7个错配。
表13中列出的序列以DNA序列表示。在表13中列出的所有序列中，胸腺嘧啶(T)可以被尿嘧啶(U)代替以得到靶mRNA序列的序列。
表13.与第一序列互补的示例性靶B2M序列
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编码B2M shRNA的示例性序列包含序列GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:349)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。编码B2MshRNA的另一个示例性序列包含序列GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ ID NO:350)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
在一些实施例中，干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含非翻译区。
在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含第一序列，其从5'至3'端具有与HLA-A*02mRNA互补的序列；以及第二序列，其从5'至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。
与第一序列互补的示例性靶HLA序列示于表14中。
表14.与第一序列互补的示例性靶HLA序列
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在一些实施例中，第一序列和第二序列被接头分开，接头有时被称为环。在一些实施例中，第一序列和第二序列两者都由一个单链RNA或DNA载体编码。在一些实施例中，环位于第一序列和第二序列之间。在这些实施例中，第一序列和第二序列杂交形成双链体区域。第一序列和第二序列通过接头序列连接，形成“发夹”或“茎-环”结构。shRNA可以在单链分子的相对端具有互补的第一序列和第二序列，使得分子可以与互补序列部分形成双链体区域，并且链在双链体区域的一端通过接头(即环序列)连接。接头或环序列可以是核苷酸或非核苷酸接头。接头可以通过共价键或非共价相互作用与第一序列和任选的第二序列相互作用。
任何合适的核苷酸环序列被设想在本公开的范围内。本公开的shRNA可以包括将shRNA的第一序列连接到shRNA的第二序列的核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸接头。核苷酸环序列可以是长度为≥2个核苷酸，例如长度为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。表16中公开了示例性的环序列。
在一些实施例中，shRNA进一步包含5'侧翼序列和3'侧翼序列。在一些实施例中，其中5'侧翼序列连接到第一序列的5'端，并且其中3'侧翼序列连接到第二序列的3'端。
不希望受理论束缚，认为具有与在微小RNA中发现的那些序列相似的5'和3'序列的侧翼shRNA茎环序列可以靶向用于通过内源性微小RNA加工机制加工的shRNA，增加shRNA加工的有效性。替代地，或另外，侧翼序列可以增加shRNA与聚合酶II或聚合酶III启动子的相容性，导致shRNA表达的更有效调节。
在一些实施例中，5'侧翼序列选自表15中所示的序列。示例性侧翼序列示于表15中。
表15.示例性侧翼序列
SEQ ID NO 5'侧翼序列
1232 GG
1233 ACACCAUGUUGCCAGUCUCUAGG
1234 UGAUAGCAAUGUCAGCAGUGCCU
1235 UAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAC
SEQ ID NO 3'侧翼序列
1236 UGGCGUCUGGCCCAACCACAC
1237 GUAAGGUUGACCAUACUCUAC
在一些实施例中，第一序列和第二序列存在于单链多核苷酸上，其中第一序列和第二序列相隔4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸，其中4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸形成shRNA中的环区。在一些实施例中，环区包含选自表16所示序列的序列。
表16.示例性环区序列
本公开的shRNA可以通过化学合成、通过体外转录，或通过用Dicer或具有类似活性的另一种合适的核酸酶切割较长的双链RNA而在外源生成。使用常规的DNA/RNA合成仪从受保护的核糖核苷亚磷酰胺产生的化学合成的siRNA可以从商业供应商获得，如密理博西格玛公司(Millipore Sigma)(得克萨斯州休斯顿)、Ambion公司(得克萨斯州奥斯汀)、英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)或Dharmacon公司(科罗拉多州拉斐特)。siRNA可以通过例如用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、层析或其组合来纯化。替代地，siRNA可以在很少(如果有的话)纯化的情况下使用，以避免由于样品加工造成的损失。
在一些实施例中，本公开的shRNA可以使用其中已经克隆了编码双链RNA的核酸的表达载体来产生，例如在合适的启动子的控制下。
药物组合物
本公开提供了包含免疫细胞和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，该免疫细胞包含本公开的第一受体和第二受体。
此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；和防腐剂。
在一些实施例中，免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少90％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。
治疗癌症
本文提供了杀死受试者体内多种癌细胞或治疗癌症的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的包含免疫细胞的组合物，该免疫细胞包含本公开的第一受体和第二受体。免疫细胞在同一细胞中表达两种受体。
癌症是一种异常细胞不受控制地分裂并扩散到附近组织的疾病。在一些实施例中，癌症包含液体肿瘤或固体肿瘤。示例性的液体肿瘤包括白血病和淋巴瘤。癌症几乎可以发生在身体的任何一个器官，包括上皮组织。其中多种癌细胞表达第一活化剂配体而不表达第二抑制剂配体的任何癌症被设想在本公开的范围内。例如，可以使用本文所述的方法治疗的MSLN阳性癌症包括间皮瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌、肺癌(如肺腺癌)、结肠直肠癌和胆管癌。
在一些实施例中，多种癌细胞表达靶抗原。在一些实施例中，受试者的多种癌细胞表达MSLN。MSNL阳性癌症包括间皮瘤癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、肺腺癌、结肠直肠癌或胆管癌，以及其它实体上皮肿瘤。表达MSLN的其它癌症包括复发性、难治性或转移性胃癌、食道癌、头颈癌和肾癌。在一些实施例中，MSLN阳性癌症包含上皮肿瘤，例如癌。
本文提供了治疗患有MSLN+肿瘤的受试者体内MSLN+癌症的方法，该肿瘤在MHC I类基因座处具有杂合性丢失。在一些实施例中，该方法包含向受试者施用有效量的本文所述的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，该方法包含(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞的HLA-A、HLA-B或HLA-C基因型或表达；(b)确定受试者的多种癌细胞中的MSLN的表达；以及(c)如果正常细胞表达HLA-A、HLA-B或HLA-C非靶抗原并且多种癌细胞不表达HLA-A、HLA-B或HLA-C非靶抗原，并且多种癌细胞也是MSLN阳性的，则向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，例如其中已知癌症为MSLN+的那些实施例，该方法包含(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞的HLA-A、HLA-B或HLA-C基因型或表达；以及(b)如果正常细胞表达HLA-A、HLA-B或HLA-C非靶抗原并且多种癌细胞不表达非靶抗原，则向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。
在一些实施例中，多种癌细胞不表达ICAM1、COMT或CXCL16的多态性等位基因。例如，癌细胞通过在该基因座的杂合性丢失而丢失了CAM1、COMT或CXCL16的等位基因。
在一些实施例中，多种癌细胞不表达LRRN4或UPK3B，或具有比正常细胞低的LRRN4或UPK3B表达。
本公开提供了治疗受试者体内癌症的方法，其包含：(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞在选自由ICAM1的多态性基因座、COMT的多态性基因座和CXCL16的多态性基因座组成的组的多态性基因座处的基因型；(b)确定多种癌细胞中MSLN的表达；以及(c)如果正常细胞对于多态性基因座是杂合的并且多种癌细胞对于多态性基因座是半合子的，并且多种癌细胞是MSLN阳性的，则向受试者施用多种免疫细胞，其中多种免疫细胞包含：(i)第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对MSLN或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原特异性的细胞外配体结合结构域；以及(ii)第二受体，任选地为抑制性嵌合抗原受体，其包含对选自ICAM1、COMT和CXCL16或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的细胞外配体结合，其中非靶抗原包含多态性。
对受试者的癌细胞和正常细胞进行SNP存在或不存在的基因分型的方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。SNP基因分型方法尤其包括基于PCR的方法，如双探针TaqMan测定、基于阵列的杂交方法和测序。
测量受试者的癌症或正常细胞中靶抗原表达的方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。这些方法尤其包括测量RNA表达的方法，如RNA测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及测量蛋白质表达的方法，如基于免疫组织化学的方法。测量多种癌细胞中杂合性丢失的方法尤其包括使用本领域已知的方法对从癌细胞提取的基因组DNA进行高通量测序。
本公开提供了治疗受试者体内癌症的方法，其包含测量多种癌细胞中的非靶抗原的表达水平，以及当多种癌细胞中的非靶抗原的表达水平低于多种癌细胞中的非靶抗原的表达水平低于多种健康细胞中的非靶抗原的表达水平时，治疗受试者。在一些实施例中，非靶抗原包含LRRN4或UPKB3，或LRRN4或UPKB3的肽抗原。在一些实施例中，该方法包含确定多种癌细胞中MSLN的表达；以及如果多种癌细胞具有非靶抗原的低表达或无表达，并且多种癌细胞是MSLN阳性的，则向受试者施用多种免疫细胞。
测量受试者的癌症或细胞中靶抗原表达的方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。这些方法尤其包括测量RNA表达的方法，如RNA测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及测量蛋白质表达的方法，如基于免疫组织化学的方法。
在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。
在一些实施例中，免疫细胞是同种异体的或自体的。
在一些实施例中，与表达第一受体但不表达第二受体的免疫细胞相比，第二受体增加了免疫细胞对MSLN阳性癌细胞的特异性。在一些实施例中，与表达第一受体但不表达第二受体的免疫细胞相比，免疫细胞具有降低的副作用。
施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以阻止受试者体内肿瘤的生长。例如，免疫细胞或药物组合物可以杀死肿瘤细胞，使得肿瘤停止生长或大小减小。在一些情况下，免疫细胞或药物组合物可以预防额外肿瘤的形成，或减少受试者体内肿瘤的总数。
施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可能导致受试者体内癌细胞而非野生型细胞的选择性杀伤。在一些实施例中，约60％的被杀死的细胞是癌细胞，约65％的被杀死的细胞是癌细胞，约70％的被杀死的细胞是癌细胞，约75％的被杀死的细胞是癌细胞，约80％的被杀死的细胞是癌细胞，约85％的被杀死的细胞是癌细胞，约90％的被杀死的细胞是癌细胞，约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％的被杀死的细胞是癌细胞。
施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可能导致杀死受试者的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的癌细胞。
与施用包含第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以对受试者产生更少的副作用。例如，相对于在没有第二抑制性受体的情况下施用MSLN CAR或MSLN TCR，施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以降低剂量限制性毒性。
治疗癌症可能导致肿瘤大小减小。肿瘤大小的减小也可以被称为“肿瘤消退”。优选地，治疗后，肿瘤大小相对于其治疗前的大小减小5％或更多；更优选地，肿瘤大小减小10％或更多；更优选地，减小20％或更多；更优选地，减小30％或更多；更优选地，减小40％或更多；甚至更优选地，减小50％或更多；并且最优选地，减小大于75％或更多。肿瘤的大小可以通过任何可重复的测量方式来测量。肿瘤的大小可以测量为肿瘤的直径。
治疗癌症可能导致肿瘤体积减小。优选地，治疗后，肿瘤体积相对于其治疗前的大小减少5％或更多；更优选地，肿瘤体积减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；并且最优选地，减少大于75％或更多。肿瘤体积可以通过任何可重复的测量方式来测量。
施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以减小受试者体内肿瘤的大小。在一些实施例中，相对于施用免疫细胞或药物组合物之前的肿瘤大小，肿瘤大小减小约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施例中，肿瘤被消除。
治疗癌症导致肿瘤数目减少。优选地，治疗后，肿瘤数目相对于治疗前的数目减少5％或更多；更优选地，肿瘤数目减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；并且最优选地，减少大于75％。肿瘤的数目可以通过任何可重复的测量方式来测量。肿瘤的数目可以通过对肉眼可见的肿瘤进行计数或在指定的放大倍数下进行计数来测量。优选地，指定的放大倍数是2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或50倍。
治疗癌症可能导致远离原发性肿瘤部位的其它组织或器官中转移病灶的数目减少。优选地，治疗后，转移病灶的数目相对于治疗前的数目减少5％或更多；更优选地，转移病灶的数目减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；并且最优选地，减少大于75％。转移病灶的数目可以通过任何可重复的测量方式来测量。转移病灶的数目可以通过对肉眼可见的转移病灶进行计数或在指定的放大倍数下进行计数来测量。优选地，指定的放大倍数是2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或50倍。
与仅接受载体的群体相比，治疗癌症可能导致接受治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；并且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。
与未治疗的受试者群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；并且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。
与接受使用不是本公开的化合物或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的药物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；并且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。
与仅接受载体的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的死亡率降低。与未治疗的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的死亡率降低。与接受使用不是本公开的化合物或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的药物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的死亡率降低。优选地，死亡率降低超过2％；更优选地，超过5％；更优选地，超过10％；并且最优选地，大于25％。治疗受试者群体的死亡率的降低可以通过任何可重复的方式测量。群体死亡率的降低可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后每单位时间的疾病相关死亡的平均数来测量。群体死亡率的降低也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后每单位时间的疾病相关死亡的平均数来测量。
治疗癌症可能导致肿瘤生长速率降低。优选地，治疗后，肿瘤生长速率相对于治疗前的数目降低至少5％；更优选地，肿瘤生长速率降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；并且最优选地，降低至少75％。肿瘤生长速率可以通过任何可重复的测量方式来测量。可以根据每单位时间肿瘤直径的变化测量肿瘤生长速率。
治疗癌症可能导致肿瘤再生长的减少。优选地，治疗后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于10％；更优选地，小于20％；更优选地，小于30％；更优选地，小于40％；更优选地，小于50％；甚至更优选地，小于50％；并且最优选地，小于75％。肿瘤再生长可以通过任何可重复的测量方式来测量。例如，通过测量治疗后的先前肿瘤收缩后肿瘤直径的增加来测量肿瘤再生长。停止治疗后肿瘤不再复发表明肿瘤再生长减少。
治疗或预防癌症可能导致细胞增殖速率降低。优选地，治疗后，细胞增殖速率降低至少5％；更优选地，至少10％；更优选地，至少20％；更优选地，至少30％；更优选地，至少40％；更优选地，至少50％；甚至更优选地，至少50％；并且最优选地，至少75％。细胞增殖速率可以通过任何可重复的测量方式来测量。例如，通过测量每单位时间组织样品中分裂细胞的数目来测量细胞增殖速率。
治疗或预防癌症可能导致增殖细胞的比例降低。优选地，治疗后，增殖细胞的比例降低至少5％；更优选地，至少10％；更优选地，至少20％；更优选地，至少30％；更优选地，至少40％；更优选地，至少50％；甚至更优选地，至少50％；并且最优选地，至少75％。增殖细胞的比例可以通过任何可重复的测量方式来测量。优选地，例如通过定量组织样品中分裂细胞的数目相对于未分裂细胞的数目来测量增殖细胞的比例。增殖细胞的比例可以等于有丝分裂指数。
治疗或预防癌症可能导致细胞增殖面积或区域的大小减小。优选地，治疗后，细胞增殖的面积或区域的大小相对于其治疗前的大小减小至少5％；更优选地，减小至少10％；更优选地，减小至少20％；更优选地，减小至少30％；更优选地，减小至少40％；更优选地，减小至少50％；甚至更优选地，减小至少50％；并且最优选地，减小至少75％。细胞增殖的面积或区域的大小可以通过任何可重复的测量方式来测量。细胞增殖面积或区域的大小可以测量为细胞增殖面积或区域的直径或宽度。
治疗或预防癌症可能导致具有异常外观或形态的细胞的数目或比例减少。优选地，在治疗后，具有异常形态的细胞的数目相对于其治疗前的大小减少至少5％；更优选地，减少至少10％；更优选地，减少至少20％；更优选地，减少至少30％；更优选地，减少至少40％；更优选地，减少至少50％；甚至更优选地，减少至少50％；并且最优选地，减少至少75％。异常的细胞外观或形态可以通过任何可重复的测量方式来测量。异常的细胞形态可以通过显微术来测量，例如使用倒置组织培养显微镜。异常的细胞形态可以表现为核多形性。
剂量和施用
本公开的免疫细胞和可以以多种方式施用，这取决于需要局部治疗还是全身治疗。
通常，施用可以是肠胃外的。
用于过继性细胞疗法的细胞施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238和Rosenberg的美国专利第4,690,915号。
本公开的组合物适合于肠胃外施用。如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括以受试者组织的物理破裂和通过组织中的破裂施用药物组合物为特征的任何施用途径，因此通常导致直接施用到血流中、肌肉中或内脏中。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物施用药物组合物、通过手术切口应用组合物、通过组织穿透性非手术伤口应用组合物等。特别地，肠胃外施用预期包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、瘤内、滑膜内注射或输注；以及肾透析输注技术。在一些实施例中，本公开的组合物的肠胃外施用包含静脉内或动脉内施用。
本公开提供了包含本公开的多种免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
适于肠胃外施用的药物组合物的制剂通常通常包含与药学上可接受的载体(如无菌水或无菌等渗盐水)组合的免疫细胞。这此类制剂可以以适合于快速浓注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂型制备、包装或销售，如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳液、糊剂等。此类制剂可以进一步包含一种或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。肠胃外制剂还包括水溶液，其可以含有赋形剂，如盐、碳水化合物和缓冲剂。示例性的肠胃外施用形式包括在无菌水溶液(例如，丙二醇水溶液或葡萄糖水溶液)中的溶液或悬浮液。如果需要，此类剂型可以适当地缓冲。用于肠胃外施用的制剂可以配制为速释和/或缓释。改良释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序释放。
在一些实施例中，包含免疫细胞的配制组合物适于通过注射施用。在一些实施例中，包含免疫细胞的配制组合物适于通过输注施用。
可以方便地以单位剂型存在的本公开的药物组合物可以根据制药工业中熟知的常规技术制备。这些技术包括使免疫细胞与药物载体或赋形剂(如液体载体)缔合的步骤。
水性悬浮液可以进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。
本公开的组合物可以另外含有药物组合物中常规存在的其它辅助组分。因此，例如，组合物可以含有额外的相容的药物活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以含有可用于物理配制本公开的组合物的各种剂型的额外物质，如染料、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加此类物质时，此类物质不应过度干扰本公开的组合物的免疫细胞的生物活性。
制剂或组合物还可以含有一种以上的活性成分，用于用免疫细胞治疗的特定适应症、疾病或病状，其中各自的活性不会相互产生不利影响。这些活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施例中，药物组合物进一步包括其它药物活性剂或药物，如化疗剂。
在一些方面，药物组合物可以采用延时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得组合物的递送发生在待治疗部位致敏之前并且以足够的时间引起该部位致敏。许多类型的释放递送系统是可用的和已知的。这样的系统可以避免组合物的重复施用，从而增加受试者和医生的便利性。
施用可以在整个治疗过程中连续或间歇地以一个剂量进行。可以用治疗医生选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。
在一些实施例中，药物组合物含有治疗或预防癌症有效量的免疫细胞，如治疗有效量或预防有效量。在一些实施例中，治疗或预防功效通过定期评估治疗的受试者来监测。对于在数天、数周或数月内的重复施用，取决于病状，可以重复治疗直到出现期望的癌症体征或症状的抑制。然而，其它给药方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过组合物的单次快速浓注施用或输注或通过组合物的多次快速浓注施用或输注来递送。
细胞或细胞群体可以以一个或多个剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以在一段时间内以多于一个剂量施用。施用时间在主治医师的判断范围内，并取决于患者的临床病状。
细胞或细胞群体可以从任何来源获得，如血库或供体，或患者本身。
有效量是指提供治疗或预防益处的量。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、并行治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的性质。在一些实施例中，肠胃外施用有效量的细胞或包含这些细胞的组合物。在一些实施例中，施用可以是静脉内施用。在一些实施例中，施用可以通过肿瘤内注射直接进行。
为了本公开的目的，可以使用一种测定来确定待施用于哺乳动物的起始剂量，该测定包含例如在将给定剂量的此类免疫细胞施用于哺乳动物后，比较靶细胞裂解或表达受体的免疫细胞分泌一种或多种细胞因子的程度，在一组哺乳动物中，每个哺乳动物被给予不同剂量的免疫细胞。
在一些实施例中，细胞作为联合治疗的一部分施用，如与另一种治疗干预(如抗体或工程化细胞或受体或试剂，如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序相继施用。在一些实施例中，本公开的免疫细胞与一种或多种额外的治疗剂共同施用或与另一种治疗干预联合施用，同时或以任何顺序相继施用。在一些情况下，免疫细胞与另一种疗法在足够接近的时间内共同施用，使得免疫细胞群体增强一种或多种额外治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施例中，免疫细胞在一种或多种额外治疗剂之前施用。在一些实施例中，免疫细胞在一种或多种额外治疗剂之后施用。
在实施例中，在施用(例如，输注)过继性免疫细胞之前、同时或之后向受试者施用淋巴细胞清除化疗。在实例中，在施用免疫细胞之前对受试者施用淋巴细胞清除化疗。例如，淋巴细胞清除化疗在过继性细胞输注前1至4天(例如，1、2、3或4天)结束。在实施例中，施用多剂量的过继性细胞，例如如本文所述。在实施例中，在施用(例如，输注)本文所述的免疫细胞之前、同时或之后向受试者施用淋巴细胞清除化疗。淋巴细胞清除的实例包括但不限于非清髓性淋巴细胞清除化疗、清髓性淋巴细胞清除化疗、全身照射等。淋巴细胞清除剂的实例包括但不限于抗胸腺细胞球蛋白、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD52抗体、抗CD2抗体、TCRαβ阻断剂、抗CD20抗体、抗CD19抗体、硼替佐米(Bortezomib)、利妥昔单抗(rituximab)、抗CD 154抗体、雷帕霉素(rapamycin)、CD3免疫毒素、氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、美法仑(melphalan)、莫需瘤(Mabthera)、他克莫司(Tacrolimus)、阿法赛特(alefacept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、OKT3、OKT4、OKT8、OKT11、芬戈莫德(fingolimod)、抗CD40抗体、抗BR3抗体、坎帕斯(Campath)-1H、抗CD25抗体、钙调磷酸酶抑制剂、麦考酚酯(mycophenolate)和类固醇(steroids)，其可以单独或组合使用。作为另一实例，淋巴细胞清除方案可以包括施用阿仑单抗、环磷酰胺、贝达莫司汀(benduamustin)、利妥昔单抗、喷司他丁(pentostatin)和/或氟达拉滨。淋巴细胞清除方案可以在一个或多个周期中施用，直到循环免疫细胞减少达到预期结果。在一些实施例中，淋巴细胞清除包含施用特异性靶向并减少或消除受试者体内CD52+细胞的药剂，并修饰免疫细胞以减少或消除CD52表达。
在一些实施例中，在施用(例如输注)过继性免疫细胞之前、同时或之后向受试者施用免疫刺激疗法。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含稳态细胞因子。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含免疫刺激分子。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-9或其功能片段。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-9或其组合。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2或其功能片段。
使用自体细胞进行过继性细胞疗法的方法包括从患者血液中分离免疫细胞，对分离的细胞进行一系列修饰，包括用一种或多种编码本文所述双受体系统的载体转导细胞，并将细胞施用于患者。从患有癌症或血液恶性肿瘤或处于癌症或血液恶性肿瘤风险中的受试者提供免疫细胞需要从患者血液中分离免疫细胞，并且可以通过本领域已知的方法实现，例如通过白细胞分离术。在白细胞分离术中，从受试者中抽取血液，分离外周血单核细胞(PBMC)，并将剩余的血液返回到受试者的循环中。将PBMC作为免疫细胞样品冷冻或冷藏保存，并提供用于进一步的加工步骤，例如本文所述的修饰。
在一些实施例中，本文所述的治疗受试者的方法包含对来自受试者的免疫细胞的修饰，修饰包括一系列修饰，包括富集和/或去除、活化、遗传修饰、扩增、配制和冷藏保存。
本公开提供了富集和/或去除步骤，其可以是例如本领域已知的洗涤和分级分离方法，用于制备用于下游程序(例如本文所述的修饰)的受试者PBMC。例如，但不限于，方法可以包括除去总红细胞和血小板污染物的装置、用于去除单核细胞和分离淋巴细胞的基于大小的细胞分级分离的系统，和/或允许富集特定T细胞亚群(例如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞)的系统。富集步骤后，将从受试者的PMBC中分离出免疫细胞的靶亚群用于进一步处理。本领域技术人员将理解，如本文提供的富集步骤也可以包括任何新发现的方法、装置、试剂或其组合。
本公开提供了活化步骤，其可以是本领域已知的诱导免疫细胞(例如T细胞)的活化的任何方法，活化是其离体扩增所需的。免疫细胞活化可以例如通过在树突细胞存在下培养受试者免疫细胞、在人工抗原呈递细胞(AAPC)存在下培养受试者免疫细胞，或在照射的K562衍生的AAPC存在下培养免疫细胞来实现。用于活化受试者免疫细胞的其它方法可以是，例如，在分离的活化因子和组合物(例如用活化因子官能化的珠、表面或颗粒)存在下培养免疫细胞。活化因子可以包括例如抗体，例如抗CD3和/或抗CD28抗体。活化因子还可以是例如细胞因子，例如白介素(IL)-2或IL-21。活化因子还可以是共刺激分子，例如CD40、CD40L、CD70、CD80、CD83、CD86、CD137L、ICOSL、GITRL和CD134L。本领域技术人员将理解，本文提供的活化因子也可以包括任何新发现的可以活化免疫细胞的活化因子、试剂、组合物或其组合。
本公开提供了用于修饰受试者免疫细胞的遗传修饰步骤。在一些实施例中，遗传修饰包含用包含与B2M或HLA-A互补的本文所述shRNA的载体转导免疫细胞。在一些实施例中，遗传修饰包含使用CRISPR/Cas介导的基因组工程修饰免疫细胞的基因组以诱导B2M或HLA-A中的突变。在一些实施例中，该方法包含用一种或多种编码活化剂和抑制性受体的载体转导免疫细胞，从而产生表达活化剂和抑制性受体的免疫细胞。
本公开提供了遗传修饰的受试者免疫细胞的扩增步骤。遗传修饰的受试者免疫细胞可以在本领域已知的任何免疫细胞扩增系统中扩增，以生成用于施用的治疗剂量的免疫细胞。例如，用于包含控制器泵的系统中的生物反应器袋和允许自动进料和废物去除的探针可用于免疫细胞扩增。在底部具有气体渗透膜的细胞培养瓶可用于免疫细胞扩增。本文提供的扩增步骤包括本领域已知的能够扩增用于临床用途的免疫细胞的任何此类系统。免疫细胞在培养系统中在专门配制用于扩增的培养基中扩增。也可以通过在如本文所述的活化因子的存在下培养本公开的免疫细胞来促进扩增。本领域技术人员将理解，本文提供的扩增步骤也可以包括任何新发现的可用于扩增免疫细胞的培养系统、培养基或活化因子。
本公开提供了用于扩增的遗传修饰的受试免疫细胞的配制和冷藏保存步骤。提供的配制步骤包括，例如，洗去用于本文所述的治疗方法的免疫细胞的制备和扩增的过量组分。本领域已知的与免疫细胞相容的任何药学上可接受的配制介质或洗涤缓冲液可用于洗涤、稀释/浓缩免疫细胞，并制备用于施用的剂量。配制介质对于免疫细胞的施用可以是可接受的，例如用于静脉内输注的晶体溶液。冷藏保存可以任选地用于长期储存免疫细胞。可以使用本领域已知的方法实现冷藏保存，包括例如在含有冷藏保存组分的冷藏保存培养基中保存细胞。冷藏保存组分可以包括例如二甲亚砜或甘油。保存在冷藏保存培养基中的免疫细胞可以通过将保存温度降低至-80℃至-196℃进行冷藏保存。
在一些实施例中，治疗方法包含确定受试者的HLA种系类型。在一些实施例中，在骨髓中确定HLA种系类型。
在一些实施例中，治疗方法包含确定MSLN的表达水平。在一些实施例中，在来自受试者的肿瘤组织样品中确定MSLN的表达水平。在一些实施例中，使用下一代测序确定MSLN的表达水平。在一些实施例中，使用RNA测序确定MSLN的表达水平。在一些实施例中，使用免疫组织化学确定MSLN的水平。
在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*02抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*02杂合型并且具有HLA-A*02丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*01抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*01杂合型并且具有HLA-A*01丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*03的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*03杂合型并且具有HLA-A*03丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*07抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*07杂合型并且具有HLA-A*07丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-C*07抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-C*07杂合型并且具有HLA-C*07丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含在有需要的受试者中施用治疗有效剂量的包含HLA-B*07抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-B*07杂合型并且具有HLA-B*07丢失的癌细胞。
在各种实施例中，本公开提供了治疗患有表达MSLN并且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者的方法；和/或治疗患有表达MSLN并丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02成年患者。
在一些实施例中，施用治疗有效剂量的本文所述的免疫细胞。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过静脉内注射施用。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过腹膜内注射施用。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞、约1×106个细胞、约2×106个细胞、约3×106个细胞、4×106个细胞、约5×106个细胞、约6×106个细胞、约7×106个细胞、约8×106个细胞、约9×106个细胞、约1×107、约2×107、约3×107、约4×107、约5×107、约6×107、约7×107、约8×107、约9×107、约1×108个细胞、约2×108个细胞、约3×108个细胞、约4×108个细胞、约5×108个细胞、约6×108个细胞、约7×108个细胞、约8×108个细胞、约9×108个细胞、约1×109个细胞、约2×109个细胞、约3×109个细胞、约3×109个细胞、约4×109个细胞、约5×109个细胞、约5×109个细胞、约6×109个细胞、约7×109个细胞、约8×109个细胞、约9×109个细胞、约1×1010个细胞、约2×1010个细胞、约3×1010个细胞、约4×1010个细胞、约5×1010个细胞、约6×1010个细胞、约7×1010个细胞、约8×1010个细胞，或约9×1010个细胞。
在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约9×1010个细胞、约1×106个细胞至约5×1010个细胞、约2×106个细胞至约5×109个细胞、约3×106个细胞至约5×109个细胞、约4×106个细胞至约3×109个细胞、约5×106个细胞至约2×109个细胞、约6×106个细胞至约1×109个细胞、0.5×106个细胞至约6×109个细胞、约1×106个细胞至约5×109个细胞、约2×106个细胞至约5×109个细胞、约3×106个细胞至约4×109个细胞、约4×106个细胞至约3×109个细胞、约5×106个细胞至约2×109个细胞、约6×106个细胞至约1×109个细胞、0.5×106个细胞至约6×108个细胞、约1×106个细胞至约5×108个细胞、约2×106个细胞至约5×108个细胞、约3×106个细胞至约4×108个细胞、约4×106个细胞至约3×108个细胞、约5×106个细胞至约2×108个细胞、约6×106个细胞至约1×108个细胞、约7×106个细胞至约9×108个细胞、约8×106个细胞至约8×108个细胞、约9×106个细胞至约7×108个细胞、约1×107个细胞至约6×108个细胞、约2×107个细胞至约5×108个细胞、约7×106个细胞至约9×107个细胞、约8×106个细胞至约8×107个细胞、约9×106个细胞至约7×107个细胞、约1×107个细胞至约6×107个细胞，或约2×107个细胞至约5×107个细胞。
在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×105个细胞至约9×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约1×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约5×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约1×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约6×108个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞至约9×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞至约1×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞至约5×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞至约1×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞至约6×108个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞至约9×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞至约1×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞至约5×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞至约1×109个细胞。在治疗剂量中提及的术语“约”可以是例如±0.5×106个细胞、±0.5×107个细胞或±0.5×108个细胞。
试剂盒和制品
本公开提供了包含编码本文所述的受体的多核苷酸和载体的试剂盒和制品，以及包含本文所述的受体的免疫细胞。在一些实施例中，试剂盒包含制品，如小瓶、注射器和使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含多核苷酸或载体，其包含编码本公开的一种或多种受体的序列。
在一些实施例中，试剂盒包含多种免疫细胞，该免疫细胞包含本文所述的第一受体和第二受体。在一些实施例中，多种免疫细胞包含多个T细胞。
在一些实施例中，试剂盒进一步包含使用说明书。
列举的实施例
可以参考以下说明性列举的实施例来理解本公开：
1.一种应答癌细胞中杂合性丢失的免疫细胞，其包含：
a.第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对选自以下的靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域：
i.癌细胞特异性抗原，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或
ii.间皮素(MSLN)，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；以及
b.第二受体，任选地为抑制性嵌合抗原受体，其包含对选自ICAM1、COMT和CXCL16或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含多态性。
2.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原通过杂合性丢失(LOH)而从所述癌细胞中丢失。
3.根据实施例1或2所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原是与SEQ ID NO:27共享至少95％同一性的ICAM1抗原并且所述多态性在SEQ ID NO:27的第469位处包含K或E。
4.根据实施例1或2所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原是与SEQ ID NO:28共享至少95％同一性的COMT抗原并且所述多态性在SEQ ID NO:28的第158位处包含V或M。
5.根据实施例1或2所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原是与SEQ ID NO:29共享至少95％同一性的CXCL16抗原并且所述多态性选自由以下组成的组：
a.SEQ ID NO:29的第142位处的I或T；以及
b.SEQ ID NO:29的第200位处的A或V。
6.根据实施例1至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原在非靶细胞中表达。
7.根据实施例1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶细胞表达靶抗原和所述非靶抗原两者。
8.一种对癌细胞中蛋白质的低表达或无表达有应答的免疫细胞，其包含：
a.第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对选自以下的靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域：
i.癌细胞特异性抗原，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或
ii.MSLN，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；以及
b.第二受体，任选地为抑制性嵌合抗原受体，其包含对选自LRRN4和UPK3B或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原由所述癌细胞以比由非靶细胞低的水平表达。
9.根据实施例8所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原不由所述癌细胞表达。
10.根据实施例9所述的免疫细胞，其中所述非靶细胞表达所述靶抗原和所述非靶抗原两者。
11.根据实施例1至10中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是癌细胞特异性抗原。
12.根据实施例11所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。
13.根据实施例1至12中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞是间皮瘤癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、结肠直肠癌细胞、食道癌细胞、头颈癌细胞、肾癌细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞或胆管癌细胞。
14.根据实施例1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞表达MSLN。
15.根据实施例1至14中任一项所述的免疫细胞，其中在所述癌细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。
16.根据实施例15所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
17.根据实施例16所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。
18.根据实施例1至17中任一项所述的免疫细胞，其中所述MSLN包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2共享至少95％同一性的序列。
19.根据实施例1至18中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是T细胞受体(TCR)。
20.根据实施例1至18中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。
21.根据实施例19或20所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)，或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
22.根据实施例19或20所述的免疫细胞，其中所述细胞外配体结合结构域包含scFv。
23.根据实施例22所述的免疫细胞，其中所述scFv包含选自由SEQ ID NO:3-6组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
24.根据实施例22所述的免疫细胞，其中所述scFv包含或基本上由选自由SEQ IDNO:3-6组成的组的序列组成。
25.一种应答癌细胞中杂合性丢失的免疫细胞，其包含：
a.第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对间皮素(MSLN)或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原特异性的细胞外配体结合结构域；以及
b.第二受体，任选地为抑制性嵌合抗原受体，其包含对非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含HLA-A*02。
26.根据实施例25所述的免疫细胞，其中所述第一受体的细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)，或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
27.根据实施例25所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含scFv。
28.根据实施例27所述的免疫细胞，其中所述scFv包含选自由SEQ ID NO:3-6组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
28.根据实施例27所述的免疫细胞，其中所述scFv包含或基本上由选自由SEQ IDNO:3-6组成的组的序列组成。
29.根据实施例25至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)，或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
30.根据实施例25至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含scFv。
31.根据实施例30所述的免疫细胞，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:30-41中任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
32.根据实施例30所述的免疫细胞，其中所述scFv包含或基本上由SEQ ID NO:30-41中任一个的序列组成。
33.根据实施例25至32中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:42-53组成的组的CDR。
34.根据实施例25至33中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。
35.根据实施例34所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域包含与SEQ IDNO:65至少95％相同的序列。
36.根据实施例25至35中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。
37.根据实施例36所述的免疫细胞，其中所述LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:74至少95％相同的序列。
38.根据实施例25至37中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体。
39.根据实施例38所述的免疫细胞，其中所述LILRB1铰链结构域包含与SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:81-84，或SEQ ID NO:90-91至少95％相同的序列。
40.根据实施例25至39中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域或其功能变体。
41.根据实施例40所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:69或与SEQ ID NO:69至少95％相同的序列。
42.根据实施例25至41中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞是间皮瘤癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、结肠直肠癌细胞、食道癌细胞、头颈癌细胞、肾癌细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞或胆管癌细胞。
43.其中所述癌细胞是结肠直肠癌细胞。
44.根据实施例25至43中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌症表达MSLN。
45.根据实施例25至44中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞不表达HLA-A*02。
46.根据实施例25至45中任一项所述的免疫细胞，其中非靶细胞表达MSLN和HLA-A*02。
47.根据实施例25至46中任一项所述的免疫细胞，其中在所述靶细胞的存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。
48.根据实施例47所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
49.根据实施例48所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。
50.根据实施例25至49中任一项所述的免疫细胞，其中所述MSLN包含与SEQ IDNO:1共享至少95％同一性的序列。
51.根据实施例25至50中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是嵌合抗原受体(CAR)或TCR。
52.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据实施例1至51中任一项所述的免疫细胞。
53.根据实施例52所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
54.根据实施例52或53所述的药物组合物，其用作治疗癌症的药物。
55.一种多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：
a.第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对选自以下的靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域：
i.癌细胞特异性抗原，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或
ii.MSLN，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；以及
b.第二受体，任选地为抑制性嵌合抗原受体，其包含对选自ICAM1、COMT和CXCL16或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含多态性。
56.一种多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：
a.第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对选自以下的靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域：
i.癌细胞特异性抗原，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或
ii.MSLN，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；以及
b.第二受体，任选地为抑制性嵌合抗原受体，其包含对选自LRRN4和UPK3B或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原由所述癌细胞以比由非靶细胞低的水平表达。
57.一种多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：
a.第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对MSLN或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原特异性的细胞外配体结合结构域；以及
b.第二受体，任选地为抑制性嵌合抗原受体，其包含对非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中所述非靶抗原包含HLA-A*02。
58.一种载体，其包含根据实施例55至57中任一项所述的一种或多种多核苷酸。
59.一种杀死受试者体内多种癌细胞和/或治疗癌症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的根据实施例1至51中任一项所述的免疫细胞或根据实施例52至54中任一项所述的药物组合物。
60.根据实施例59所述的方法，其中多种癌细胞表达所述靶抗原。
61.根据实施例59或60所述的方法，其中多种癌细胞不表达所述非靶抗原。
62.一种制备多种免疫细胞的方法，其包含：
a.提供多种免疫细胞，以及
b.用根据实施例55至57中任一项所述的多核苷酸系统或根据实施例58所述的载体转化所述多种免疫细胞。
63.一种试剂盒，其包含根据实施例1至51中任一项所述的免疫细胞或根据实施例52至54中任一项所述的药物组合物。
62.根据实施例63所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书。
实例
以下实例仅用于说明而不限制本发明的范围。在整个实例中，术语“阻断剂抗原”用于描述非靶抗原的实施例。
实例1：差异表达的阻断剂的鉴定
使用生物信息学流水线鉴定候选阻断剂靶。简言之，如下所述，在公众可获得的表达数据库中搜索在肿瘤与正常结肠组织中表达丢失的基因。对这些基因进行膜蛋白过滤，并在TCGA-MESO数据集(间皮瘤)中表达。该过程的图在图14中示出。候选阻断剂靶在健康组织的间皮中表达，但在间皮素(MSLN)阳性癌症中不表达，这些癌症包括卵巢癌和胰腺癌，以及大约四分之三的肺癌和结肠直肠癌。
简言之，对人蛋白的总集合进行过滤以鉴定预测的细胞表面蛋白。使用癌症基因组图谱(TCGA)数据库检测这些蛋白质的表达。在间皮瘤中检测候选基因的表达，并且包括在大于50％的样品中表达大于2个转录物/千碱基百万(TPM)或大于5TPM的基因用于进一步分析。还评估了候选基因在结肠直肠、卵巢、胰腺和肺腺癌肿瘤中的表达，包括在这些肿瘤类型中表达小于2TPM的基因用于进一步分析。这些基因的概述如图1所示。图2示出了MSLN在正常组织中的RNA表达(数据来自基因型-组织表达，GTEx项目，gtexportal.org/home)。间皮素在正常脂肪、输卵管、肺和唾液腺组织中表达。因此，可以阻止MSLN CAR或TCR T细胞靶向这些组织的候选阻断剂也应在表达MSLN的健康组织中表达。
检测了肿瘤与正常组织中MSLN的表达(图3，TCGA数据库)。还检测了多种细胞系中的MSLN表达(图4，癌细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia)，或CCLE)。图4所示的细胞系表达等级顺序与图3所示的MSLN肿瘤等级表达大致相关。
LRRN4和UPK3B被鉴定为候选阻断剂靶。图5示出了来自GTex门户网站(www.gtexportal.org/home/)的正常组织中的LRRN表达，而图6和7示出了TCGA样品中的LRRN4表达，图8示出了CCLE细胞系中的LRRN4表达。从图5至7中可以看出，与MSLN一样，LRRN4在脂肪和肺组织中高度表达。此外，LRRN4具有大的细胞外结构域，其含有多个富含亮氨酸重复序列(LRR)和纤连蛋白III型结构域(图9)。
实例2：鉴定由于杂合性丢失而在癌细胞中丢失的候选阻断剂靶
使用生物信息学流水线鉴定由于杂合性丢失而在MSLN阳性癌症中丢失的候选阻断剂靶。
以下数据库用于鉴定候选阻断剂靶：dbSNP是一种单核苷酸多态性的数据库，其包括人单核苷酸变异和小规模插入和缺失以及发表、群体频率、分子后果和基因组作图信息。常见变异被定义为在至少一个主要群体中具有大于或等于0.01的次要等位基因频率(MAF)并且在NCBI中具有至少两个不相关的具有次要等位基因的个体。大于或等于0.1的MAF用作常见变异的标准。Uniprot(通用蛋白质资源)用作由EMBL-EBI、SIB和PIR托管的蛋白质序列和注释数据的资源。GTEx(基因型-组织表达)用作组织特异性基因表达和调节的公共资源。它含有来自近1000名个体的54个非患病组织部位的样品。TCGA(癌症基因组图谱)用作超过20,000种原发性癌症和跨越33种癌症类型的匹配正常样品的来源。CCLE(癌症细胞系百科全书)含有关于57种结肠直肠癌(CRC)细胞系的信息。Xena UCSC具有再归一化的TCGA和GTEx表达数据(FPKM)。Broad GDAC Firehose Legacy数据用于拷贝数分析。
下载NCBI dbSNP数据库并搜索常见变体。仅包括基于在肿瘤拷贝数门户网站中搜索鉴定的具有高杂合性丢失(大于或等于0.5)的染色体中的变体，除去具有小于0.1的次要等位基因频率的变体。VEP(变体效应预测因子)用于过滤蛋白质编码区中的错义变体。没有跨膜结构域的基因被除去，在间皮瘤中不高度表达(TCGA-MESO表达水平<5TPM)的基因也被除去。除去LOH频率小于或等于0.5的基因。除去表达高尔基体(Golgi)、ER、细胞核、细胞质、线粒体、螺旋体、溶酶体和前肽的基因。在TCGA拷贝数门户网站中检查LOH频率。
在Ensembl基因组浏览器或VEP分析输出中检查通过筛选的基因的其它变体，以及基因中变异的位置。11个基因通过所有筛选。图13示出了该过程的概要。
鉴定了靶向ICAM1、COMT和CXCL16的候选阻断剂。ICAM1、COMT和CXCL16在各种癌症中的LOH频率的总结示于下表17中。
表17：LOH的频率
表18：ICAM1、COMT和CXCL16变体的总结
基因名称 变体 蛋白质位置 变化 MAF
CXCL16 rs2277680，rs1050998 1.200，2.142 1.A/V，2.I/T 1.0.4615，2.0.4633
COMT rs4680 158 V/M 0.369
ICAM1 rs5498 469 K/E 0.359
实例3：阻断剂配体结合结构域的鉴定
如果CDR序列未知，则对候选阻断剂抗原的公开可用抗体进行测序。如果没有针对候选阻断剂靶的抗体可用，则通过用纯化的蛋白质(例如，ICAM1、CXCL16和COMT1)免疫小鼠、大鼠或兔来生成这些抗体。来自免疫动物的血清用于筛选与阻断剂靶结合的mAb。使用huTARGTM系统也生成针对阻断剂靶的抗体。然后分离具有所需特异性的抗体并测序以确定CDR序列。
使用标准分子生物学技术，从抗体到阻断剂靶的CDR序列被用于生成scFv。使用标准分子生物学技术将候选scFv融合到抑制剂受体铰链或跨膜结构域以生成抑制性受体。候选scFv也融合到活化剂受体铰链或跨膜结构域(例如，CAR)以生成全长活化剂受体，用作scFv结合靶抗原的阳性对照。候选scFv在抑制性受体环境中工作的能力在Jurkat细胞中使用NFAT-荧光素酶报告基因测定法进行测定。
实例4：HLA-A*02阻断剂可以阻断MSLN活化剂介导的Jurkat细胞活化
细胞培养
编码NFAT荧光素酶报告基因的Jurkat细胞获自BPS Bioscience公司。在培养中，将Jurkat细胞维持在补充有10％FBS、1％Pen/Strep和0.4mg/mL G418/遗传霉素的RPMI培养基中。本研究中使用的所有其它细胞系均获自ATCC，并按照ATCC的建议进行维持。
Jurkat细胞转染
根据制造商的方案使用以下设置通过100uL形式的Neon电穿孔系统(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))瞬时转染Jurkat细胞：3个脉冲，1500V，10毫秒。每1e6细胞用1至3ug活化剂CAR或TCR构建体和1至3ug阻断剂构建体或空载体进行共转染，并在补充有20％热灭活FBS和0.1％Pen/Strep的RPMI培养基中回收。
Jurkat-NFAT-荧光素酶活化研究
将Jurkat细胞重悬于15uL补充有10％热灭活FBS和0.1％Pen/Strep的RPMI中，添加到负载肽的珠中并共培养6小时。使用ONE-Step萤光素酶测定系统(BPS Bioscience公司)评估Jurkat发光。测定以技术重复进行。
原代T细胞转导、扩增和富集
将冷冻的PBMC在37℃水浴中解冻，并在含有1％人血清的LymphoONE(Takara公司)中以1e6个细胞/mL培养，并使用补充有IL-15(10ng/mL)和IL-21(10ng/mL)的1:100T细胞TransAct(美天旎公司)活化。24小时后，以MOI为5向PBMC中添加慢病毒。将PBMC再培养2至3天以使细胞在TransAct刺激下扩增。扩增后，根据制造商的说明书使用抗PE微珠(美天旎公司)富集活化剂和阻断剂转导的原代T细胞。简言之，将原代T细胞与CD19-Fc(R&D系统公司)在MACS缓冲液(0.5％BSA+2mM EDTA的PBS溶液)中以1:100稀释度在4℃下孵育30分钟。将细胞在MACS缓冲液中洗涤3次，并在MACS缓冲液中在4℃下在二抗(1:200)中孵育30分钟。然后将细胞在抗PE微珠中孵育并通过LS柱(美天旎公司)。
原代T细胞体外细胞毒性研究
为了用pMHC靶进行细胞毒性研究，将富集的原代T细胞与表达海肾荧光素酶(Biosettia公司)和GFP或RFP的SiHa或HeLa细胞一起孵育。使用海肾荧光素酶报告基因测定系统(普洛麦格(Promega))定量表达活荧光素酶的SiHa或HeLa细胞。将富集的原代T细胞与SiHa或HeLa(“肿瘤”细胞)或HLA-A*02转导的SiHa或HeLa细胞(“正常”细胞)一起孵育。将稳定表达GFP或RFP和海肾荧光素酶(Biosettia公司)的WT“肿瘤”SiHa或HeLa细胞或稳定表达RFP和荧光素酶(Biosettia公司)的HLA-A*02“正常”SiHa或HeLa细胞与未标记的原代T细胞一起使用IncuCyte活细胞成像仪成像。
使用NFAT萤光素酶测定法来测定表达MSLN CAR活化剂和基于pMHC HLA-A*02scFvLIR-1的抑制性受体的Jurkat效应细胞的活化。
用比率为1:4的活化剂：阻断剂DNA转染Jurkat细胞，并在基于无细胞珠的测定中测定活化(图10A)。用活化剂抗原或活化剂和阻断剂抗原装载珠，并且珠与Jurkat细胞的比例是不同的。在基于无细胞珠的测定中，当细胞与携带顺式pMHC HLA-A*02阻断剂和MSLN活化剂的珠接触时，基于pMHC HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体能够阻断Jurkat细胞的活化。珠上pMHC HLA-A*02阻断剂的存在能够将MSLN CAR的E最大偏移大于或等于12倍(图10A)。
使用慢性髓细胞性白血病细胞系K562测定用相同活化剂和阻断剂以1:4DNA比率转染的活化Jurkat细胞的活化。K562表达活化剂抗原MSLN。测定Jurkat效应细胞对用HLA-A*02转导以表达活化剂和阻断剂抗原(MSLN+HLA-A*02+)两者的K562细胞和表达活化剂但不表达阻断剂抗原的未转导K562(MSLN+HLA-A*02-)的应答。从图10B中可以看出，K562细胞对HLA-A*02+的表达能够使MSLN CAR E最大偏移大于5倍。
pMHC HLA-A*02抑制性受体通过MSNL scFv CAR阻断活化的能力也用效应原代T细胞和SiHa或HeLa靶细胞测定。SiHa和HeLa细胞内源性表达MSLN，并被转导以表达HLA-A*02抑制性受体靶。通过观察IFNγ的诱导倍数来测定原代效应T细胞的活化。如图11所示，当原代T细胞与表达HLA-A*02的SiHa或HeLa靶细胞一起呈递时，pMHC HLA-A*02LIR-1抑制性受体能够阻断原代T细胞的活化(分别大于10倍和5倍抑制)。
当T细胞与表达MSLN但不表达HLA-A*02的SiHa细胞一起呈递时，pMHC HLA-A*02抑制性受体也能够抑制表达MSLN scFv CAR和pMHC HLA-A*02LIR-1抑制性受体两者的T细胞的杀伤(图12)。
实例5：HLA-A*02阻断剂使用K562和HeLa靶细胞抑制针对MSLN的MSLN CAR活化剂
细胞培养
使用Jurkat效应细胞和K562靶细胞检测MSLN CAR活化剂和HLA-A02LIR-1抑制性受体(图15A)。还测定了表达MSLN CAR(具有两个不同的MSLN配体结合结构域)的MSLN CART细胞杀死表达阻断剂靶HLA-A*02的HeLa细胞的能力(图15B至15C)。MSLN配体代表可延伸到100,000表位/细胞范围内的表面抗原。在瞬时转染测定中使用不同的DNA浓度改变A与B模块表达的比率。活化剂和抑制性受体系统足够灵活以适应低和高靶密度，原则上允许优化pMHC靶以及非pMHC表面抗原。
编码NFAT荧光素酶报告基因的Jurkat细胞获自BPS Bioscience公司。本研究中使用的所有其它细胞系获自ATCC。在培养中，将Jurkat细胞维持在补充有10％FBS、1％Pen/Strep和0.4mg/mL G418/遗传霉素的RPMI培养基中。K562和HeLa细胞按照ATCC的建议进行维持。
MSLN抗原结合结构域
MSLN活化CAR scFv衍生自如Beatty等人WO2015/090230A1所述的人M5(LBD1)和如BioLuminate，2019(BioLuminate，版本3.6、版本3.6编辑，薛定谔公司(LLC)，纽约州纽约)和US 6,809,184 B1所述的人源化SS1(LBD2)。
Jurkat细胞转染和活化
根据制造商的方案使用以下设置通过100uL形式的Neon电穿孔系统(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))瞬时转染Jurkat细胞：3个脉冲，1500V，10毫秒。每1e6细胞用1至3ug活化剂构建体和1至3ug阻断剂构建体或空载体进行共转染，并在补充有20％热灭活FBS和0.1％Pen/Strep的RPMI培养基中回收。为了证实阻断剂表面表达，将Jurkat细胞用10ug/mL链霉抗生物素蛋白-PE-HLA-A*02-pMHC四聚体在4℃下在具有1％BSA的PBS中转染后18至24小时染色60分钟，并通过流式细胞术(BD FACS Canto II)表征。使用如实例4所述的NFAT-荧光素酶测定系统评估Jurkat细胞活化。
原代T细胞转导、扩增和富集
Leukopaks购自收集协议和捐赠者知情同意书由机构审查委员会(Institutional Review Board，IRB)批准，并受到严格监督。还遵循了HIPAA合规性和批准的协议。如实例4所述解冻和培养冷冻的PBMC。对于每种慢病毒，即包括活化剂或阻断剂受体的慢病毒载体，以MOI＝5同时共转染细胞。将PBMC再培养2至3天以使细胞在TransAct刺激下扩增。扩增后，根据制造商的说明书使用抗PE微珠(美天旎公司)通过阳性选择富集活化剂和阻断剂转导的原代T细胞的阻断剂阳性T细胞。简言之，将原代T细胞与10ug/mL链霉抗生物素蛋白-PE-HLA-A*02-pMHC四聚体在4℃下在MACS缓冲液(0.5％BSA+2mM EDTA的PBS溶液)中孵育60分钟。将细胞在MACS缓冲液中洗涤3次并通过LS柱(美天旎公司)以从未转导细胞和仅有活化剂的细胞中分离阻断剂阳性细胞(仅阻断剂细胞和活化剂+阻断剂细胞的混合物)。
原代T细胞体外细胞毒性研究
为了用pMHC靶进行细胞毒性研究，将富集的原代T细胞与表达海肾荧光素酶(Biosettia公司)的K562或HeLa靶细胞一起孵育。HLA-A*02阳性的靶细胞也表达GFP和萤火虫荧光素酶(Biosettia公司)，HLA-A*02阴性的靶细胞表达RFP和萤火虫荧光素酶。使用IncuCyte活细胞成像仪将靶细胞与未标记的原代T细胞一起成像。使用IncuCyte成像软件定量活靶细胞随时间的荧光强度。
实例6：第2代和第3代CAR架构中的小鼠SS1MSLN抗原结合结构域活化剂和HLA-A*02阻断剂
最初，靶向MSLN的人源化M5和SS1scFv与第三代CAR架构(CD28、4-1BB和CD3ζ)一起使用。测定了使用鼠SS1 scFv抗原结合结构域和第二代CAR架构(4-1BB和CD3ζ细胞内结构域)的效果。
用MSLN第三代CAR活化剂(具有CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内结构域的CAR)和使用PA2.1抗原结合结构域的HLA-A*02scFv LIR-1阻断剂转导HLA-A*02-供体T细胞。测定了具有人源化M5、人源化SS1和鼠SS1 scFv的MSLN CAR活化剂(表1)。HLA-A*02阻断剂序列描述于表1中。如实例4和5所述，用活化剂和/或阻断剂构建体转导T细胞、培养并富集。在转导后的第14天使用T细胞，并与MSLN+HeLa靶细胞一起以1:1的效应物：靶细胞比率培养。如实例4和5所述测定细胞毒性。图16示出了当HeLa细胞也表达HLA-A*02时，抑制剂受体能够有效阻断表达MSLN第三代CAR的T细胞对HeLa细胞的杀伤。此外，图16示出了鼠SS1第3代CAR(右上，方框)提供了比人源化M5和人源化SS1 CAR更好的窗口。注意，在图16中，C-0883是用作阳性对照的HLA-A*02CAR，其它序列描述于表19中。
还测定了表达MSLN活化剂和HLA-A*02LIR1阻断剂的T细胞选择性杀死MSLN+HLA-A*02-Capan细胞的能力(图17)。如实例4和5所述，用活化剂和/或阻断剂受体构建体转导T细胞、培养并富集。在转导后的第14天使用T细胞，并与Capan靶细胞一起以1:1的效应物：靶细胞比率培养。如实例4和5所述测定细胞毒性。图17示出了当Capan细胞也表达HLA-A*02时，抑制剂受体能够有效阻断表达MSLN第三代CAR的T细胞对Capan细胞的杀伤。
还在第2代CAR(具有4-1BB和CD3ζ细胞内结构域的CAR)中测定鼠SS1MSLN1scFv。图18示出了表达mSS1第2代CAR的T细胞对MSLN+HLA-A*02+_HeLa细胞和HCT116野生型细胞(其天然表达MSLN和HLA-A*02两者)的杀伤被HLA-A*02scFv LIR-1抑制性受体有效阻断。从图18可以看出，与具有BB7.2 scFv抗原结合结构域的抑制性受体相比，具有PA2.1 scFv抗原结合结构域的抑制性受体更有效地阻断第2代mSS1 CAR。还测定了抑制性受体中短和长LIR-1铰链序列的作用，以及HLA-A*02scFv中VH和VL结构域的排列。
通过FACS也证实了具有鼠SS1scFv的第2代CAR的表达，结果如图19所示。SS1抗原结合结构域用重组可溶性MSLN配体染色。
表19：构建体序列
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实例7：测定LIR-1铰链对阻断活性的影响
不同LIR-1铰链对HLA-A*02scFv LIR-1抑制性受体阻断表达KRAS TCR活化剂的Jurkat细胞杀伤的能力的影响使用上文描述的Jurkat NFat萤光素酶测定进行测定。如前所述，在Jurkat细胞中测定具有较短LIR-1铰链的人源化PA2.1 scFv LIR-1受体和人源化BB7.2 scFv LIR-1，结果如图20A至20B所示。用具有多种LIR-1衍生铰链的KRAS TCR活化剂受体和/或HLA-A*02scFv LIR-1抑制性受体(人源化PA2.1或人源化BB7.2)转染Jurkat细胞，方法如上文所述，并与HLA-A11阳性或HA-A11和HLA-A*02阳性的T2靶细胞共培养。具有较短和较长铰链的抑制性受体表现相似(图20A至B)。还测定了具有小鼠PA2.1 scFv和稍长铰链的抑制性受体，其功能类似于在T2-Jurkat测定中较短的LIR-1铰链(图21A至B)。铰链序列在图20B和图21B中以黑色示出，灰色SS代表抗原结合结构域和铰链之间的接头，灰色VIGIL代表LIR-1跨膜结构域的起点。抑制性受体的铰链、跨膜结构域和细胞内结构域都衍生自LIR-1。图20A至20B和21A至21B示出了LIR-1铰链长度可以变化而不会对LIR-1抑制性受体产生负面影响。当将编码LIR-1抑制性受体的核酸序列包装在慢病毒载体中用于递送时，较短的铰链可以提供优势。
实例8：新型抗MSLN抗体的鉴定
间皮素(MSLN)是一种在肺癌和许多其它实体瘤中表达的典型肿瘤相关抗原。然而，MSLN也在围绕和润滑重要内脏器官表面的正常间皮中表达。这种正常表达对于MSLN定向治疗产生严重炎症的显著风险。该实例描述了一种双受体(Tmod)系统，其利用癌细胞中HLA基因座处的常见LOH，允许T细胞识别肿瘤和正常组织之间的差异。用本实例中所述的MSLN CAR Tmod构建体工程化的T细胞含有：(i)MSLN活化的CAR；和(ii)由HLA-A*02门控的抑制性受体。不希望受理论束缚，即使在体外和异种移植模型中的混合细胞群体中，Tmod系统也有力地保护“正常”细胞。MSLN CAR也可以与其它HLA I类阻断剂配对，支持将该方法扩展到HLA-A*02杂合子以外的患者。由MSLN CAR Tmod构建体举例说明的Tmod机制可以提供替代途径来以比以前可能的更安全、更有效的方式利用实体瘤抗原，如MSLN。在1992年提出间皮素(MSLN)作为癌症靶[1]，然而仍然没有利用MSLN的可行疗法。它不仅在大多数间皮瘤上表达，而且在卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌和肺腺癌的大亚型中也表达[2]。在正常成人中，MSLN仅存在于间皮中，间皮本身可能是非必需的组织[2，3]。然而，靶向MSLN的免疫疗法具有对围绕重要内脏器官的MSLN(+)间皮细胞进行炎性攻击的风险[4]。已经测试了几种针对MSLN的研究疗法；例如，免疫毒素缀合物[5，6]，抗体-药物缀合物[7]，双特异性抗体[8]、CAR-T[9]和杂合TCR-scFv[10]。迄今为止所有有效的全身施用疗法都是有毒的。最近，报道了一种通过胸膜内输注递送MSLN CAR-T的方法[11]。
该实例描述了治疗MSLN(+)癌症的示例性方法，其不依赖于治疗剂的局部施用，而是利用LOH。该方法试图通过将靶向MSLN的CAR与阻断针对表达HLA-A*02等位基因的正常细胞的效应子功能的基于LIR-1的抑制性受体配对来避免对正常组织的全身毒性(22A至22B)。这种双受体构建体旨在治疗在其MSLN(+)肿瘤中具有HLA-A*02等位基因的LOH的遗传明确的癌症患者。由LOH引起的肿瘤与正常组织中HLA-A*02表达的差异产生了对效应细胞的全输入或无输入，据信其赋予对肿瘤杀伤的高选择性。
结果
有效的选择性MSLN CAR的分离和表征
为了鉴定在CAR中起作用的有效的、选择性的MSLN指导的配体结合结构域(LBD)，筛选编码IgG抗体(mAb)或scFv的哺乳动物表面展示文库(图23A至23B)。用荧光染料标记的可溶性生物素化MSLN用作探针以富集文库中通过FACS对MSLN染色的细胞。作为阴性探针，可溶性CEA和EGFR的混合物用于去除编码具有非特异性结合特性的mAb或scFv的细胞。在两轮MSLN结合富集后，选择62个单独的LBD，将其转化为scFv CAR，确认其在Jurkat细胞中的表面表达，并在固态Jurkat细胞测定中评估其功能活性(图23C至23D)。该步骤允许选择最敏感的选择性结合剂的子集用于进一步的功能表征。
虽然62种结合剂中的大多数导致对细胞表面展示的MSLN的功能应答，但选择六种用于进一步表征；序列结合剂CDR(重链(HC)CDR和轻链(LC)CDR)并在表2、表3(重链；VH)和表4(轻链；VL)中提供。在每种情况下，HC-CDR或VH可以与任何LC-CDR或VL配对，因为重链和轻链具有相似性，通过常规测试证实所需的表达和结合活性。
单链可变片段(scFv)可以通过在VH和VL区段之间插入接头(例如，GGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:152)或另一种合适的接头)形成VH-VL scFv来生产；或者，也可以替代地构建VL-VH scFv。轻链具有高度的序列相似性；生成全抗体的VL和VH的配对已经在没有过度实验的情况下确定。表1提供了示例性scFv，表3和4提供了示例性重链和轻链，表2提供了示例性CDR序列。下表20提供了使用MSLN scFv的示例性嵌合抗原受体的序列。
表20：包含单链可变片段(scFv)的受体序列
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六种结合剂表示为第三代(Gen3)嵌合抗原受体(CAR1-CAR6)[分别对应于表1至4和20中的#16、17、18、29、55和59]，其在Jurkat功能测定中与文献中的抗MSLN scFv(SS1、M5和m912)进行比较。CAR显示出一定范围的敏感性(EC50)和最大应答(E最大)(图24A)。除SS1(Gen2)外，所有构建体均为Gen3。在6小时共培养测定中测量Jurkat细胞剂量-应答(RLU)以评估敏感性：(1)使用滴定的编码MSLN的mRNA转染HEK293细胞；(2)QIFIKIT(定量分析试剂盒，)用于将基于流式细胞术的表面表达转化为MSLN分子/细胞；以及(3)通过拟合剂量-应答曲线计算6种新型的和三种基准CAR的分子/细胞敏感性(EC50)。对于那些敏感性低于测定检测限的CAR，EC50报告为<3000MSLN分子/细胞。还记录了每个构建体的最大信号(E最大)。实验重复1至4次。
表21示出了转导的原代T细胞对HeLa细胞的选择性窗口和杀伤效率。用活化剂和阻断剂+原代T细胞杀伤MSLN+A2-和MSLN+A2+HeLa细胞之间的选择性窗口的定量。杀伤效率描述了与活化剂+(仅)T细胞相比，活化剂和阻断剂+T细胞杀伤MSLN+A2-HeLa细胞的差异。计算两个测量值直至对应于观察到的80％最大杀伤的时间。
表21
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n/d＝由于整体杀伤不良而未确定
在Jurkat功能测定中，将六种结合剂(CAR1-6)与文献中的基准MSLN scFv(SS1、M5和m912)进行比较[12至14]。除Gen2 SS1外，所有均表达为Gen3 CAR。对于MSLN(+)靶细胞，使用用合成的MSLN mRNA转染的HEK293细胞。CAR显示出一定范围的敏感性(EC50)和最大应答(E最大)(图24A)。在六种结合剂中，除CAR 16之外的所有结合剂表现出比hM5和sSS1更高的敏感性。
简而言之，鉴定抗MSLN结合剂的广泛活动产生了在NGS筛选中鉴定的数百个序列，并产生了62个候选构建体，所有这些都结合MSLN。其中六种表现出优异的活性。CAR 18和CAR 29显示出优于比较CAR构建体的敏感性。
先前的工作表明E最大与受体的表面表达有关，EC50与其结合和信号转导性质有关，尤其是LBD[15，16]。使用标准曲线和必要的QIFIKIT方法将EC50从通过Jurkat细胞中的发光测量的相对应答转化为绝对分子/细胞[27]。基准CAR之一(m912)显示出较低的功能敏感性，EC50估计为约80K分子/细胞。其它基准和新型CAR的EC50范围向下约6K分子/细胞。在Jurkat细胞中测定为CAR的几种新型LBD的EC50低于检测限(<3K分子/细胞)。作为选择性的指标，测试了CAR3和基准M5对一组MSLN(+)和(-)细胞系的应答性。两种CAR都显示出MSLN特异性活化，并且对MSLN(-)系无活性(图24B和25A)。
MSLN Tmod构建体在Jurkat和原代T细胞中被HLA-A*02抗原有效阻断
CAR1-6和基准CAR作为Tmod构建体的组分进行测试，其中CAR与先前显示抑制Jurkat和原代T细胞中的功能应答的A*02定向抑制性受体或“阻断剂”配对[18]。该阻断剂包含融合到含有ITIM的LIR-1蛋白的铰链、跨膜和细胞内结构域的结合A*02的scFv(图22B)。作为靶细胞，我们使用表征MSLN表面表达的细胞系(图25A和25B、图26A和26B)。所有CAR以配体依赖性方式被A*02定向LIR-1阻断剂阻断(图27A)。由于高敏感性、选择性和与A*02阻断剂的有效功能配对的组合，选择CAR3作为MSLN Tmod前导活化剂构建体用于进一步研究。
在一系列定量mRNA滴定实验中详细检测了MSLN CAR3Tmod构建体在Jurkat细胞中的活化和阻断敏感性(图27B和27C)。对于靶细胞，使用宫颈癌HeLa细胞系，其与大多数其它癌细胞系一样表达内源性MSLN。该系是HLA-A*02(-)。为了控制MSLN水平，生成具有通过CRISPR失活的MSLN的变体。mRNA滴定实验使得能够估计MSLN CAR3 Tmod构建体的EC50和IC50，并且在来源于高质量公共数据库的正常和肿瘤组织上的抗原表达水平的背景下观察这些参数(图28A)。
为了进行这些比较，建立MSLN mRNA和表面蛋白水平之间的相关性作为第一步(图25B)。对HLA-A和用于绘制不同组织的HLA-A和MSLN水平相对于MSLN Tmod构建体的EC50和IC50的信息进行了同样的研究。大多数正常组织表达的MSLN水平远低于MSLN Tmod的EC50。相反，包括肺在内的某些组织以远远高于Tmod构建体的EC50的水平表达MSLN，因此被认为是缺乏有效阻断剂的高风险组织。然而，这些有风险的组织也表达高于Tmod IC50的HLA-A水平，表明它们将受到Tmod的A*02靶向的LIR-1阻断剂组分的保护而免受细胞毒性。在功能测定中用于模拟正常和肿瘤组织的细胞系(包括转基因HLA-A*02HeLa和MS751)也示出在图中。
然后在原代T细胞中测试MSLN CAR3Tmod构建体的行为。细胞毒性是主要读数，IFN-γ分泌作为次要量度。靶细胞是HeLa细胞和变体：(i)天然MSLN(+)A*02(-)HeLa细胞模拟无阻断剂抗原的肿瘤细胞；和(ii)转基因A*02(+)变体HeLa细胞模拟正常间皮细胞。不同构建体和靶细胞的组合证明，所有MSLN CAR Tmod构建体有效杀伤肿瘤细胞并以A*02配体依赖性方式阻断杀伤(图28B)。文献中的另外两种MSLN CAR(SS1和M5)用于比较(图29A)。通过IFN-γ释放来反映细胞毒性(图29B)。因此，由HLA-A*02定向阻断剂和不同MSLN CAR活化剂组成的Tmod构建体在Jurkat和原代T细胞测定中对MSLN(+)A*02(-)靶细胞表现出高效力和特异性。
MSLN CAR3Tmod构建体在混合细胞和系列培养物中介导选择性的、可逆的细胞毒 性
测试了在癌细胞治疗背景下重要的MSLN CAR3Tmod构建体的多种其它性质。该构建体在肿瘤和正常靶细胞的混合培养物中介导抗原选择性细胞毒性：用RFP标记的天然MSLN(+)HLA-A*02(-)HeLa细胞与用GFP标记的MSLN(+)A*02(+)细胞以不同比例混合。将这些共培养物暴露于用不同受体构建体工程化的T细胞并成像。仅含CAR的构建体被无差别地杀死，而Tmod构建体仅杀死天然HeLa肿瘤细胞，留下A*02(+)细胞未受伤害(图30A)。即使在正常：肿瘤细胞比例为9:1时也可以检测到选择性(图30B、图31A和31B)。
Tmod细胞在开(主动杀伤)和关(阻断)状态之间转换的能力使用细胞毒性测定作为读数进行检测。在这些实验中，转导的T细胞从一批靶细胞转移到另一批靶细胞(图32A、图33A)。Tmod细胞在暴露于静止的正常细胞2天后显示出活化和杀伤的能力。反之亦然。参与杀死肿瘤细胞的Tmod细胞能够在转移后和没有休止期的情况下快速转换到关状态并避免杀死正常细胞。切换状态的能力在总共四天的两个周期中得以保持。
研究了以高水平(中位数约200ng/ml；范围20至2,000ng/ml[19])存在于一些癌症患者血液中的可溶性MSLN(sMSLN)是否干扰MSLN CAR3 Tmod细胞。以500ng/ml添加到培养物中的sMSLN对CAR或Tmod T细胞的功能没有影响(图33B和33C)。总之，这些结果表明MSLNCAR3 Tmod在肿瘤和正常细胞的混合培养物中介导选择性的、可逆的细胞毒性，并且在一些癌症患者的血液中观察到的水平不受sMSLN的影响。所有这些特征都与细胞疗法一致，该疗法在选定的癌症患者中具有安全和有效的潜力。
MSLN CAR3Tmod细胞未显示可检测的脱靶活性
为了系统地研究MSLN CAR3Tmod细胞的脱靶反应性，通过一组靶细胞系对Jurkat细胞活化进行测试，该靶细胞系经选择以涵盖大多数成体基因表达(Wang等人，编制中；参见方法)。阳性对照用于证实效应细胞可以被MSLN(+)细胞系活化，阴性对照用于设定应答的基线(图26B；图32B)。在CAR3 Tmod Jurkat细胞中没有触发可检测的应答，尽管测定的灵敏度高，估计为约1,000个分子/细胞。
MSLN CAR3Tmod构建体在异种移植模型中介导肿瘤细胞的选择性杀伤
为了检测MSLN CAR3Tmod细胞的体内行为，使用小鼠异种移植模型。HeLa细胞在免疫受损(NSG)小鼠中生长不良，因此开发了另一种宫颈癌细胞系MS751作为移植的靶细胞。将天然MSLN用作活化剂抗原，并通过基因转移将阻断剂抗原HLA-A*02工程化，以更好地接近正常组织水平。在这些体内实验中，通过CRISPR敲除HLA-A*02生成的MSLN(+)A*02(-)MS751细胞模拟肿瘤，而MSLN(+)A*02(+)转基因变体模拟正常细胞。
用荧光素酶对细胞系进行工程化，以使生物发光能够成为肿瘤存活和生长的独立读数。小鼠(10只/组)在每组的一半小鼠的左胁腹植入肿瘤细胞，在其右胁腹植入正常细胞，另一半则相反，以控制侧腹生长变化(图34A)。在异种移植物的体积达到约100至150mm3后，经由尾静脉向小鼠输注2E7总T细胞/小鼠。在短暂的延迟后，CAR和Tmod构建体均杀死MSLN(+)A*02(-)肿瘤细胞，通过测径和生物发光强度测量，效果相当(图34B和34C、图35B和35C)。尽管只有CAR的T细胞以相同的效力杀死肿瘤和正常，但Tmod细胞仅杀死肿瘤移植物，反映了体外细胞毒性(图14A)。在Tmod细胞存在的情况下，正常细胞移植物的生长与用未转导的T细胞或盐水处理的对照组中的细胞生长相当。这些结果显着地证明了MSLN Tmod系统在哺乳动物体内的选择性，与已经观察到的其它活化剂-阻断剂对一致(Sandberg等人，提交；[18])。
MSLN CAR Tmod平台的扩展
使用靶向HLA-A*02的阻断剂提高了该阻断剂与自体T细胞中产生的内源性HLA-A*02分子顺式结合的可能性。实际上，与天然Jurkat A*02(-)细胞相比，在转染的转基因A*02(+)Jurkat细胞中观察到HLA-A*02四聚体结合的阻断剂结合降低(图36)。与A*02(-)供体T细胞相比，在来自用MSLN CAR3 Tmod或SS1 Tmod构建体转导的HLA-A*02(+)供体的原代T细胞中观察到类似的降低(图36、图37A)。更重要的是，相对于它们的A*02(-)对应物，在A*02(+)Jurkat和原代T细胞中，这种降低的结合翻译为较差的阻断剂功能(图36、图37B和37C)。这些观察结果说明了顺式结合如何对使用A*02定向阻断剂的自体MSLN CAR3 Tmod产物造成问题。
为了解决这个问题，我们开发了一种基于内源性β2微球蛋白(B2M)的CRISPR失活的解决方案。因为B2M是所有HLA I类表达所需的，所以这种方法有望减轻HLA-A*02的顺式结合效应。正如所预测的，在原代T细胞中敲除B2M将阻断剂结合和功能恢复到与A*02(-)供体T细胞相当的水平(图37A至37C)。因此，CRISPR介导的顺式结合的消除产生了MSLN Tmod细胞，其在HLA-A*02(+)供体中的功能特性与在HLA-A*02(-)供体中的功能无法区分。这些结果表明，MSLN CAR3 Tmod构建体可以适用于同种异体细胞疗法和自体产物，条件是采用一种方法来降低患者T细胞中A*02的表达。
MSLN CAR3可以与HLA-A*11定向阻断剂配对
MSLN CAR3Tmod构建体利用A*02定向阻断剂，其令人印象深刻的性能表明CAR3可能与其它HLA I类等位基因门控的阻断剂配对。如果为真，这将潜在地允许Tmod平台用于治疗对于HLA-A*02不是杂合的患者，其数量估计为群体的>60％[20]。为了证明MSLN Tmod系统的模块化概念，研究了亚洲人群中最常见的I类等位基因HLA-A*11[20]。使用与分离MSLNscFv所述相同的方法进行A*11选择性scFv的筛选(见下文的方法)。使用哺乳动物scFv展示文库的一系列富集步骤生成了几种A*11特异性scFv(图38A)。
在Jurkat细胞中，一种高性能的scFv(A*11-LBD4)与LIR-1融合并与MSLN CAR3活化剂配对。这种A*11阻断剂显示出良好的功能，根据mRNA滴定实验估计其IC50为约37,000分子/细胞(图38B)。最后，证实了与A*11阻断剂配对的MSLN CAR3在Jurkat细胞和原代T细胞中功能良好，其具有与利用HLA-A*02作为阻断剂抗原的MSLN CAR3TMod构建体相当的效力和阻断(图39A至39C)。受这些结果的鼓舞，我们将靶向A*03和B*07的两种其它抗HLA-I单克隆抗体转化为scFv，并将其作为MSLN Tmod阻断剂进行测试(图39A)。这些发现表明，Tmod系统是充分模块化的，以适应一种活化剂与多种阻断剂的配对，从而将细胞疗法平台的可及性扩展到更多的患者。
讨论
鉴于MSLN在成体内的分布[1,2,4]，阻断剂与靶向MSLN的活化剂一起发挥良好作用至关重要。本文描述的A*02阻断剂的性质表明，它将在广泛的MSLN抗原水平范围内抑制由CAR产生的活化信号。阻断剂也可能抑制CAR触发的其它来源的T细胞活化，包括脱靶。因为HLA阻断剂抗原在有核细胞中普遍表达，所以它应该在所有情况下提供抑制性信号，除非阻断剂抗原不存在，如在选择LOH的肿瘤中。如果刺激涉及正常细胞或细胞片段，则阻断剂也可以预防细胞因子释放综合征，这是T细胞疗法中观察到的毒性的持续来源[14,33]。
本文描述的MSLN候选疗法需要选择阻断剂-抗原等位基因是种系杂合的并且其肿瘤已经通过LOH丢失该等位基因的患者。幸运的是，最近已经开发了这样的诊断测试，其利用了DNA测序技术的巨大动力[27-29]。基于DNA序列的LOH检测具有足够的灵敏度以区分肿瘤中克隆性与亚克隆性LOH的大多数病例，从而丰富最有可能从疗法中获益的患者。由于这种诊断方法利用来自肿瘤的基因组序列，其检测任何等位基因变异并且不限制于HLA-A*02。本文所述的前导MSLN Tmod构建体适用于HLA-A*02(+)患者的亚组。为了将Tmod平台扩展到其它患者，我们已经证明MSLN CAR3活化剂可以与针对3种其它HLA-I等位基因产物(包括HLA-A*11)的阻断剂配对。A*11是大多数亚洲人群中最常见的HLA-I等位基因，在美国以外的世界部分地区代表着一个重要的受益机会。实际上，通过一系列针对世界上最常见的6至8中HLA-I等位基因的阻断剂，应该有可能覆盖在HLA基因座处具有LOH的大多数实体瘤——估计目前>15％的实体瘤死亡率[22，30]。此外，我们已经在平行的工作路线中显示，HLA-A*02阻断剂可以与其它活化剂有效地配对，这些活化剂包括针对另一种众所周知的肿瘤相关抗原CEA的CAR(Sandberg等人，编制中；31)。
模块化的Tmod系统利用细胞的能力——在治疗形式中是独特的——将多种信号整合到协调应答中，从而提供一种解决实体瘤疗法的基本障碍的方法[18，21，22]。疗法必须进入肿瘤并克服血癌不存在的障碍，在血癌中细胞疗法已被证明是有效的[23]。T细胞具有优于大多数其它形式(包括抗体)的优点，因为它们具有主动外渗和生物分布的天然机制(参见Mastrogiovanni等人的综述[24])。此外，本文描述的利用LOH的Tmod方法减轻了由大多数靶的正常组织表达引起的对实体瘤疗法的关键限制。尽管众所周知的非同质性，但大部分遗传变异出现在肿瘤的创始细胞中并存在于其所有后代中[25]。此类同质突变包括LOH，并且如果此类克隆性LOH可以经由诊断测试与肿瘤中后来出现的变异区分开来，则HLA基因座处的LOH异质性不应构成耐药性的来源[26]。与生成大多数新抗原的单核苷酸取代不同，LOH是不可逆事件，并且即使在通过疗法施加强选择压力后也应该是稳定的。最后，随着检查点抑制剂的使用越来越普遍，HLA-I丢失的速率将可能增加，从而进一步扩大可能受益于MSLN Tmod疗法的患者群[34]。
材料和方法
细胞系培养
细胞系购自ATCC(美国菌种保藏中心)并根据制造商的说明书进行处理：T2、Shp77、Raji、MS751、A-375、A-498、SW982、SW480、HeLa、NIH-OVCAR-3、HepG2、NCI-H508、LNCaP克隆FGC、K562、U2OS、BB7.1和GAP A3杂交瘤。编码NFAT萤光素酶报告基因的Jurkat细胞获自BPS Bioscience公司并维持在补充有10％热灭活(HIA)FBS(在56℃下灭活1小时)、1％青霉素和链霉素(pen/strep)和0.4mg/ml遗传霉素的RPMI中。从干细胞技术公司(StemCell Technologies)获得人外周血单核细胞(PBMC)，并在补充有5％HIA人AB血清的X-VIVO15(龙沙公司)中解冻，并按照制造商的建议用T细胞TransAct(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))活化。CAR或CAR Tmod单载体构建体的慢病毒转导(参见图1b，除非另有说明)在活化后24小时进行，培养物维持在补充有1％HIA人AB血清和300IU/mL IL-2的LymphoONE T细胞扩增培养基(宝生物工程株式会社(Takara Bio))中。
分子克隆和mRNA体外转录
如前所述9设计和构建活化和阻断CAR构建体。简言之，通过将抗MSLN scFv LBD融合到CD8α铰链、CD28跨膜(TM)和CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内结构域(ICD)来产生活化CAR。通过将分别衍生自单克隆抗体PA2.1[32]、GAP A3[36]或BB7.1[37]的抗LA-A*02、A*03或B*07scFv LBD融合到LIR-1的铰链、TM和ICD结构域来生成阻断CAR。使用金门克隆(GoldenGate cloning)将基因区段组合并插入慢病毒表达载体中的人EF1α启动子的下游。
对于信使RNA(mRNA)的制备，使用PCR生成用于体外合成mRNA的DNA模板。简言之，通过N-末端引物引入T7启动子，N-和C-末端引物均使用共同的突出端区域。使用T7ARCAmRNA试剂盒(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，E2060S)将PCR产物用作体外转录(IVT)的模板。IVT反应包含1x ARCA/NTP混合物、1.25mMΨ-UTP(TriLink)、25ug PCR产物模板和1x T7 RNA聚合酶。将IVT反应物在37℃下孵育2小时，然后将2uL的DNase I(新英格兰生物实验室，M0303S)添加到每种反应物中并在37℃下孵育15分钟。向IVT反应物中添加65uL水、10uL 10x聚腺苷酸化反应缓冲液(NEB M0276S)和5uL聚腺苷酸化酶(NEBM0276S)至约100uL的总体积。将反应物在37℃下孵育30分钟。根据制造商的方案，使用Monarch RNA清洗试剂盒(T2040L)清洗所得产物。
使用哺乳动物展示的MSLN和HLA-A*11结合剂生成
先前已经描述了使用HuTARG哺乳动物展示技术的结合剂生成(专利号：US8,012,714B2；Wang等人，印刷中)。对于MSLN结合剂的生成，可溶性MSLN(目录号MSN-H82E9)和无关的脱靶蛋白EGFR和CEA购自百普赛斯生物科技公司(Acro Biosystems)。使用荧光活化细胞分选(FACS)对HuTARG文库进行连续几轮的靶上富集和脱靶缺失。类似地进行HLA-A*11结合剂生成活动。使用HLA-A*11:01四聚体对HuTARG文库进行靶上富集，并使用4个不相关的HLAI类四聚体库进行脱靶缺失。在这两项活动的最后一轮中，收集靶上和脱靶结合细胞，并将RNA逆转录成cDNA。使用聚合酶链式反应(PCR)扩增含有互补决定区(CDR)的片段，并通过下一代测序(NGS)进行测序。通过比较输入和输出NGS计数选择感兴趣的结合剂。
MSLN表面定量
为了定量表面间皮素分子，首先用DPBS洗涤粘附细胞一次，然后用维尔烯(Versene)洗涤一次。用维尔烯包被细胞并在37℃下孵育约15分钟。孵育后，用力拍打烧瓶以促进完全分离。然后用DBPS以1:2的比例(维尔烯：DPBS)稀释细胞并进行计数。将300,000个细胞以500xg离心5分钟。将细胞重悬于300uL 1x FACS缓冲液(DPBS+1％BSA)中。将100uL等分试样分成2个v型底孔。将细胞用100uL FACS缓冲液再洗涤一次，然后用100uL的10ug/mL抗MSLN抗体(R&D系统公司，克隆618923)在冰上染色30分钟。初次染色后，添加50uL来自QIFIKIT(安捷伦公司(Agilent))的校准珠进行洗涤。将混合物用100uL FACS缓冲液洗涤两次，然后用100uL在FACS缓冲液中稀释2000倍的抗小鼠F(ab')2-山羊Alexa Fluor 647(英杰公司(Invitrogen))抗体在冰上染色45分钟。将染色的细胞和珠用100uL FACS缓冲液洗涤2次，然后重悬于100uL FACS缓冲液中以测量荧光。根据由QIFIKIT(安捷伦公司)提供的制造商的方案绘制各珠群体的中值荧光强度对分子数的校准曲线。通过将细胞的中值荧光强度拟合到用QIFIKIT珠生成的校准曲线上来测定内源性MSLN分子的数目。
MSLN活化剂和各种阻断剂敏感性测定
为了测定活化剂或阻断剂敏感性，将抗原以不同的浓度滴定到抗原(-)细胞系中。使用标准曲线的流式细胞术和QIFIKIT方法学[17]然后可用于计算绝对分子/细胞。然后通过发光测量分别在Jurkat细胞中表达的活化剂或阻断剂的EC50或IC50值。具体地，使用4D核转染试剂盒(龙沙公司)用抗原mRNA进行HEK293T或HeLa细胞转染。对于单抗原滴定(即，MSLN、HLA-A*02、HLA-A*11、HLA-A*03、HLA-B*07)，将mRNA在补充有分别用于HEK293T或HeLa细胞的补充溶液(完全缓冲液)的SE或SF缓冲液中稀释至1000ng/uL。通过将储备mRNA添加到等体积的完全缓冲液13次，将稀释的mRNA连续稀释2倍，第15个孔没有任何添加的mRNA。使用TrypLE Express(Gibco)从烧瓶中分离靶细胞。收获适当数量的细胞，然后以11.1e6活细胞/mL重悬于完全缓冲液中。将22.5uL重悬的细胞添加到2.5uL连续稀释的mRNA中，得到最终体积为25uL的细胞和mRNA混合物。使用用于HEK293T细胞的CM-130程序或用于HeLa细胞的CN-114程序，使用4D核转染仪对20uL该样品进行酶切。将细胞转移到280uL的MEM+10％FBS+0.1％P/S中。将15uL稀释的细胞转移到384孔板中并在37℃、5％CO2下孵育18至24小时。将剩余的稀释细胞转移到96孔板中，并保存用于第二天使用如上所述的QIFIKIT分析表面抗原表达。平行地，使用Neon电穿孔系统，使用以下参数，用每1e6个细胞1ug的适当CARDNA或每1e6个细胞4ug的CAR Tmod DNA(单载体构建体，除非另有说明)转染Jurkat-NFAT荧光素酶效应细胞：1500V，10ms，3个脉冲。将转染的细胞立即转移到补充有20％热灭活(HIA)FBS和0.1％pen/strep的预热的RPMI中，并在37℃、5％CO2下孵育18至24小时。接着，对Jurkat细胞进行计数并以0.67e6细胞/mL重悬于RPMI+10％HIA FBS和0.1％pen/strep中。然后将15uL的1e4重悬的Jurkat细胞与转染的细胞在384孔板中共培养6小时。使用ONE-Step萤光素酶测定系统(BPS Bioscience公司)测量萤光素酶活性。
对于包括MSLN和HLA-A*02的靶细胞共转染，使用上述方案，除了对mRNA稀释步骤进行微小调整。分别用Aldevron和TriLink制备编码HLA-A*02和MSLN的mRNA。简言之，为了生成EC50曲线，用MSLN mRNA进行14点2倍连续稀释。将该连续稀释与各种恒定量的A*02mRNA的四种稀释度中的每一种组合，使得MSLN mRNA的最高浓度为500ng/ul，并且A*02mRNA的浓度如下：500ng/uL，25ng/ul，1.25ng/uL和0ng/uL。为了生成IC50曲线，用A*02mRNA进行14点2倍连续稀释。将该连续稀释与各种恒定量的MSLN mRNA的四种稀释度中的每一种组合，使得A*02mRNA的最高浓度为500ng/uL，并且MSLN mRNA的浓度如下：125ng/uL，25ng/ul，5ng/uL和1ng/uL。
原代T细胞体外细胞毒性测定
如前所述评估用Gen2M5 CAR、MSLN CAR3或CAR3 Tmod单载体构建体转导的原代T细胞对MSLN(+)A*02(-)RFP(+)肿瘤或MSLN(+)A*02(+)GFP(+)正常靶细胞的杀伤[9]。简言之，将2,000个靶细胞接种在黑色透明底384孔板中的25uL完全LymphoOne培养基(含有1％HIA人AB血清)/孔中，并允许在37℃下用5％CO2粘附过夜。对于混合培养测定，在接种前将靶细胞以所需的比例预混合。在靶细胞接种后约16至18小时，对T细胞进行计数，以300xg离心10分钟，并以2,000个CAR(+)或Tmod(+)T细胞重悬于25uL完全LymphoOne培养基(不存在额外细胞因子)中，使有效效应物：靶(E:T)＝1:1(或根据所需的E:T更多或更少的浓度)并轻轻接种于靶细胞的顶部。对于包括sMSLN的实验，将T细胞重悬于含有1000ng/mL(2倍)可溶性单体MSLN(百普赛斯生物科技公司)的LymphoOne培养基中，在用靶细胞接种后最终浓度为500ng/mL。每份样品在一式三份的孔中进行测试。在共培养的30分钟内，使用Incucyte成像仪对板的GFP(+)或RFP(+)靶细胞表达进行成像，然后每2至4小时进行连续图像，持续48小时。使用Incucyte成像软件对靶细胞面积(即，每张图像的GFP(+)或RFP(+)总面积)进行定量。通过相对于每孔的时间＝0时的面积归一化来计算板接种变异性。然后将杀伤定量为CAR或Tmod T细胞孔与相应的未转导T细胞孔之间的面积差，相对于未转导T细胞孔归一化(杀伤％＝(A未转导－ACAR或Tmod)/A未转导)。
对于原代T细胞中的HLA-A*11阻断剂的评估，使用表达天然水平的MSLN和转基因HLA-A*11抗原的HeLa靶细胞，如上所述进行细胞毒性测定。
为了进一步评估共培养48小时后的细胞因子分泌和相对T细胞活化，将每个孔中含有T细胞的培养基混合并转移到v型底板中，以400xg离心5分钟。收集上清液并冷冻，直到根据制造商的说明书使用BD人IFN-γflex试剂盒进一步分析分泌的IFN-γ。然后对剩余的T细胞进行人CD3染色、洗涤，并通过流式细胞术对正向和侧向散射进行表征[35]。
重复抗原攻击测定(RACA)和可逆性测定
RACA和可逆性测定如先前所述(Wang等人，印刷中[18])进行，但有一些修改。简言之，CAR或Tmod转导的原代T细胞与MSLN(+)A*02(-)RFP(+)肿瘤或MSLN(+)A*02(+)GFP(+)正常靶细胞共培养，类似于上文所述，有效E:T＝1.2:1。在48小时的过程内以384孔板格式拍摄第1轮图像。还建立了具有250,000个靶细胞和300,000个CAR3(+)或CAR3 Tmod(+)T细胞的平行6孔板，以允许在各轮之间进行大量T细胞分离和转移。48小时后，将含有T细胞的培养基轻轻混合并转移到锥形管中。通过用10mM EDTA+0.5％BSA的PBS溶液冲洗1分钟，使与活靶细胞接合的剩余T细胞进一步解离，并与本体T细胞级分合并。然后将这些细胞(连同靶细胞碎片和脱落的靶细胞)离心、洗涤，并用抗MSLN、抗EGFR和抗N-钙粘着蛋白PE缀合的抗体的混合物染色以染色不需要的靶细胞。然后将这些靶细胞缀合到抗PE MACS珠上，随后通过LS柱去除，得到干净的T细胞级分。然后对T细胞进行计数并在第2轮(类似于第1轮)重新接种到新鲜肿瘤或正常靶细胞上。然后成像和定量完全按照第1轮中所做的那样进行。
MSLN敲除细胞系生成
为了开发内源性MSLN(+)细胞系的MSLN(-)细胞系对照，利用CRISPR策略靶向全长MSLN。靶向间皮素的不同外显子的两种Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA获自集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies，IDT)，其中sgRNA_1靶向外显子2，sgRNA_2靶向外显子16。将sgRNA在无核酸酶的水中再水合并与S.p.HiFi Cas9核酸酶V3(IDT)组合，产生9:1的sgRNA:Cas9摩尔比。将两种RNP溶液在室温下分别孵育10至20分钟，以允许每种引导物独立地与Cas9复合。随后将两种引导物的RNP复合物合并，按照制造商的说明添加到所需细胞中，并进行电穿孔。CRISPR后，将细胞按比例放大并在MSLN(-)群体(R&D，抗MSLN pAb或克隆#618923)上分选。然后在基于Jurkat细胞的测定中针对MSLN结合剂筛选批量分选的MSLN(-)细胞。
使用Jurkat细胞进行选择性筛选
为了研究MSLN CAR3Tmod细胞的脱靶反应性，针对一组不同的靶细胞系对Jurkat细胞活化进行测试，这些靶细胞系经选择以涵盖大多数成体基因表达，类似于其它地方所描述的(Wang等人，编制中)。阳性对照用于证实效应细胞可以被MSLN(+)细胞系活化，阴性对照用于设定应答的基线(参见图26B和28A的细胞系表征)。简言之，将Jurkat-NFAT-荧光素酶细胞瞬时转染以表达CAR或CAR3 Tmod，完全如上所述。平行地，将内源性MSLN(+)靶细胞连同使用如上所述的CRISPR生成的它们各自的MSLN(-)对照靶细胞以每孔15uL完全RPMI(含有10％FBS和1％P/S)中的1e4靶细胞以384孔板格式接种。转染后大约18小时，将1e4Jurkat细胞与每种靶细胞共培养，并在6小时后通过发光评估与Gen2 M5 CAR相比的活性。使用ONE-Step萤光素酶测定系统(BPS Bioscience公司)测量萤光素酶活性。
小鼠异种移植研究
由勘探生物技术公司(Explora BioLabs)在机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案下进行盲法体内实验。5至6周龄雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Dvs/SzJ(NSG-HLA-A2/HHD)小鼠购自杰克逊实验室(The Jackson Labs)。在研究开始之前，动物已经适应了居住环境。动物(10只/组)在每组的一半小鼠的右胁腹和左胁腹分别皮下植入100uL与Matrigel以1:1混合的5e6 MS751萤火虫荧光素酶(+)HLA-A KO肿瘤或海肾荧光素酶(+)A*02转基因正常细胞，另一半则相反，以控制胁腹生长变化。当每种肿瘤平均达到100至150mm3时(V＝L x W x W/2)，将动物随机分成5组(n＝10)，通过尾静脉施用2e7 T细胞或盐水对照。注射前，T细胞的CAR(+)或Tmod(+)为约60％。T细胞注射后，在研究期间每周3次通过测径测量移植物，每周1次用BLI测量移植物。在每次BLI期间，首先注射RediJect腔肠素h底物(珀金埃尔默(PerkinElmer))以观察海肾荧光素酶(+)正常细胞，随后在6小时后注射XenoLight D-荧光素钾盐(珀金埃尔默)以观察反侧面上的萤火虫荧光素酶(+)肿瘤细胞。
原代T细胞中B2M的CRISPR敲除
如上所述解冻并活化冷冻的PBMC。使用慢病毒(Alstem)以MOI为10在活化后24小时进行转导。转导后24小时，用CRISPR-Cas9:sgRNA复合物转染原代T细胞。简言之，收集细胞并用PBS洗涤，然后重悬于补充的P3核转染缓冲液(龙沙公司)中。将20pmol的Cas9(Synthego)与130pmol靶向B2M的sgRNA(Synthego)合并，并在添加到细胞之前在P3核转染缓冲液中孵育。将20uL细胞和核糖核蛋白(RNP)混合物转移到16孔Nucleocuvette比色皿条中，并使用刺激的T细胞程序(EO-115)用4D核转染仪进行电穿孔。在补充有5％HIA人AB血清和300IU/mL IL-2的100uL预热培养基X-VIVO 15(龙沙公司)中回收细胞。将PBMC在补充有1％HIA人AB血清和300IU/mL IL-2的LymphoONE T细胞扩增培养基(宝生物工程株式会社)中培养并扩增6天。扩增后，使用LS柱，根据生产商的说明书用抗PE微珠(美天旎公司)针对蛋白L-生物素：链霉抗生物素蛋白-PE富集阳性转导的原代T细胞。然后完全如上所述评估B2M KO原代T细胞的细胞毒性。
统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计分析。所有基于Jurkat细胞的体外研究(包括mRNA滴定实验)显示为技术重复的平均值±标准偏差(SD)，而基于原代T细胞的体外研究显示为技术三次重复的平均值±SD。在适用的情况下，技术复制品显示为单独的数据点，条形图表示平均值。除非另有说明，所有数据代表n＝2个实验重复的最小值。体内研究的数据显示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。对于mRNA滴定研究，使用四参数非线性回归分析拟合曲线。由曲线直接计算EC50和IC50值。除非另有说明，直接比较使用非配对参数t检验进行分析。
参考文献
1 Chang,K.、Pai,L.H.、Batra,J.K.、Pastan,I.和Willingham,M.C.，《表征卵巢癌和正常间皮上存在的单克隆抗体K1识别的抗原(CAK1)(Characterization of theantigen(CAK1)recognized by monoclonal antibody K1 present on ovarian cancersand normal mesothelium)》《癌症研究(Cancer Res)》52，181-186(1992)。
2 Hassan,R.等人《癌症的间皮素免疫疗法：黄金时间已经来到(MesothelinImmunotherapy for Cancer:Ready for Prime Time？)》《临床肿瘤学杂志(J ClinOncol)》34，4171-4179，doi:10.1200/JCO.2016.68.3672(2016)。
3 Bera,T.K.和Pastan,I.，《间皮素对于正常小鼠发育或繁殖不是必需的(Mesothelin is not required for normal mouse development or reproduction)》《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》20，2902-2906，doi:10.1128/MCB.20.8.2902-2906.2000(2000)。
4 O'Hara,M.H.、Stashwick,C.、Plesa,G.和Tanyi,J.L.，《克服表达间皮素的癌症患者car T细胞疗法的障碍(Overcoming barriers of car T-cell therapy in patientswith mesothelin-expressing cancers)》《免疫疗法(Immunotherapy)》9，767-780，doi:10.2217/imt-2017-0026(2017)。
5 Chowdhury,P.S.、Viner,J.L.、Beers,R.和Pastan,I.，《通过噬菌体展示从DNA免疫小鼠中分离对间皮素特异性的高亲和力稳定单链Fv并构建具有抗肿瘤活性的重组免疫毒素(Isolation of a high-affinity stable single-chain Fv specific formesothelin from DNA-immunized mice by phage display and construction of arecombinant immunotoxin with anti-tumor activity)》《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci U S A)》95，669-674，doi:10.1073/pnas.95.2.669(1998)。
6 Hassan,R.等人《SS1P的I期研究，SS1P是一种重组抗间皮素免疫毒素，通过快速浓注静脉输注给予患有表达间皮素的间皮瘤、卵巢癌和胰腺癌的患者(Phase I study ofSS1P,a recombinant anti-mesothelin immunotoxin given as a bolus I.V.infusionto patients with mesothelin-expressing mesothelioma,ovarian,and pancreaticcancers)》《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》13，5144-5149，doi:10.1158/1078-0432.CCR-07-0869(2007)。
7Golfier,S.等人《雷星-阿奈妥单抗：一种新型间皮素靶向抗体-药物缀合物治疗具有由旁观者效应促进的异质靶表达的肿瘤(Anetumab ravtansine:a novelmesothelin-targeting antibody-drug conjugate cures tumors with heterogeneoustarget expression favored by bystander effect)》《分子癌症治疗学(Mol CancerTher)》13，1537-1548，doi:10.1158/1535-7163.MCT-13-0926(2014)。
8Luke,J.J.等人《晚期实体瘤患者中ABBV-428(一种间皮素-CD40双特异性药物)的I期研究(Phase I study of ABBV-428,a mesothelin-CD40 bispecific,in patientswith advanced solid tumors)》《肿瘤免疫治疗杂志(J Immunother Cancer)》9，doi:10.1136/jitc-2020-002015(2021)。
9Beatty,G.L.等人《间皮素特异性嵌合抗原受体T细胞在1期试验中抗胰腺癌转移的活性(Activity of Mesothelin-Specific Chimeric Antigen Receptor T CellsAgainst Pancreatic Carcinoma Metastases in a Phase 1Trial)》《胃肠病学(Gastroenterology)》155，29-32，doi:10.1053/j.gastro.2018.03.029(2018)。
10Ding,J.等人《摘要2307：TC-210的临床前评估，一种间皮素特异性T细胞受体(TCR)融合构建体(TRuCTM)T细胞用于治疗实体瘤(Abstract 2307:Preclinicalevaluation of TC-210,a mesothelin-specific T cell receptor(TCR)fusionconstruct(TRuCTM)T cells for the treatment of solid tumors)》《癌症研究》79，2307-2307，doi:10.1158/1538-7445.Am2019-2307(2019)。
11Adusumilli,P.S.等人《靶向间皮素的CAR T细胞局部递送治疗胸膜癌：与抗PD-1药物联合应用的安全性和初步疗效(Regional delivery of mesothelin-targeted CART cells for pleural cancers:Safety and preliminary efficacy in combinationwith anti-PD-1 agent)》《临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology)》37，2511-2511，doi:10.1200/JCO.2019.37.15_suppl.2511(2019)。
12Feng,Y.等人《一种新型人单克隆抗体，其以高亲和力结合间皮素表达细胞，并通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性杀死它们(A novel human monoclonal antibodythat binds with high affinity to mesothelin-expressing cells and kills themby antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)》《分子癌症治疗学》8，1113-1118，doi:10.1158/1535-7163.MCT-08-0945(2009)。
13Klampatsa,A.、Dimou,V.和Albelda,S.M.，《靶向间皮素的CAR-T细胞疗法治疗实体肿瘤(Mesothelin-targeted CAR-T cell therapy for solid tumors)》《生物疗法专家观点(Expert Opin Biol Ther)》21，473-486，doi:10.1080/14712598.2021.1843628(2021)。
14Tanyi,J.L.等人《复发性卵巢癌患者经间皮素靶向CAR-T细胞治疗后可能出现房室细胞因子释放综合征(Possible Compartmental Cytokine Release Syndrome in aPatient With Recurrent Ovarian Cancer After Treatment With Mesothelin-targeted CAR-T Cells)》《免疫疗法杂志(J Immunother)》40，104-107，doi:10.1097/CJI.0000000000000160(2017)。
15James,S.E.等人《嵌合TCR触发的数学模型预测靶裂解的程度和TCR下调对其的损害(Mathematical modeling of chimeric TCR triggering predicts the magnitudeof target lysis and its impairment by TCR downmodulation)》《免疫学杂志(JImmunol)》184，4284-4294，doi:10.4049/jimmunol.0903701(2010)。
16Xu,H.等人《嵌合抗原受体在对抗原的急性T细胞应答中的构效关系(Structure-function relationships of chimeric antigen receptors in acute Tcell responses to antigen)》《分子免疫学杂志(Mol Immunol)》126，56-64，doi:10.1016/j.molimm.2020.07.020(2020)。
17Smith,K.B.和Ellis,S.A.《通过间接免疫荧光定量表面抗原程序的标准化(Standardisation of a procedure for quantifying surface antigens by indirectimmunofluorescence)》《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》228，29-36，doi:10.1016/s0022-1759(99)00087-3(1999)。
18Hamburger,A.E.等人《针对具有确定等位基因丢失的肿瘤的工程化T细胞(Engineered T cells directed at tumors with defined allelic loss)》《分子免疫学杂志》128，298-310，doi:10.1016/j.molimm.2020.09.012(2020)。
19Hassan,R.等人《抗间皮素免疫毒素SS1P与培美曲塞和顺铂联合用于胸膜间皮瘤的一线治疗以及肿瘤应答与血清间皮素，巨核细胞增强因子和癌抗原125的相关性的1期研究(Phase 1study of the antimesothelin immunotoxin SS1P in combination withpemetrexed and cisplatin for front-line therapy of pleural mesothelioma andcorrelation of tumor response with serum mesothelin,megakaryocytepotentiating factor,and cancer antigen 125)》《癌症(Cancer)》120，3311-3319，doi:10.1002/cncr.28875(2014)。
20Gragert,L.、Madbouly,A.、Freeman,J.和Maiers,M.，《来自整个美国供体登记的混合分辨率DNA分型的六基因座高分辨率HLA单体型频率(Six-locus high resolutionHLA haplotype frequencies derived from mixed-resolution DNA typing for theentire US donor registry)》《人类免疫学(Hum Immunol)》74，1313-1320，doi:10.1016/j.humimm.2013.06.025(2013)。
21Fedorov,V.D.、Themeli,M.和Sadelain,M.，《基于PD-1和CTLA-4的抑制性嵌合抗原受体转移脱靶免疫治疗应答(PD-1-and CTLA-4-based inhibitory chimericantigen receptors divert off-target immunotherapy responses)》《科学转化医学(Sci Transl Med)》5，215ra172，doi:10.1126/scitranslmed.3006597(2013)。
22Hwang,M.S.等人《靶向杂合性丢失进行癌症特异性免疫疗法(Targeting lossof heterozygosity for cancer-specific immunotherapy)》《美国国家科学院院刊》118，doi:10.1073/pnas.2022410118(2021)。
23Roex,G.等人《B细胞恶性血液病的嵌合抗原受体-T细胞疗法：关键临床试验数据的更新(Chimeric Antigen Receptor-T-Cell Therapy for B-Cell HematologicalMalignancies:An Update of the Pivotal Clinical Trial Data)》《药剂学(Pharmaceutics)》12，doi:10.3390/pharmaceutics12020194(2020)。
24Mastrogiovanni,M.、Juzans,M.、Alcover,A.和Di Bartolo,V.，《在T细胞迁移、活化和效应子功能中协调细胞骨架和分子运输(Coordinating Cytoskeleton andMolecular Traffic in T Cell Migration,Activation,and Effector Functions)》《细胞与发育生物学前沿(Front Cell Dev Biol)》8，591348，doi:10.3389/fcell.2020.591348(2020)。
25Lopez,S.等人《全基因组加倍和癌症进化中有害变化的累积之间的相互作用(Interplay between whole-genome doubling and the accumulation of deleteriousalterations in cancer evolution)》《自然遗传学(Nat Genet)》52，283-293，doi:10.1038/s41588-020-0584-7(2020)。
26Foo,J.和Michor,F.，《抗癌疗法获得性耐药性的演变(Evolution of acquiredresistance to anti-cancer therapy.)》《理论生物学杂志(J Theor Biol)》355，10-20，doi:10.1016/j.jtbi.2014.02.025(2014)。
27Beaubier,N.等人《tempus xT下一代靶向肿瘤测序分析的临床验证(Clinicalvalidation of the tempus xT next-generation targeted oncology sequencingassay)》《肿瘤靶标(Oncotarget)》10，2384-2396，doi:10.18632/oncotarget.26797(2019)。
28联盟，I.T.P.-C.A.o.W.G.，《全基因组的泛癌分析(Pan-cancer analysis ofwhole genomes)》《自然(Nature)》578，82-93，doi:10.1038/s41586-020-1969-6(2020)。
29Ford,L.、Wolford,J.E.、Brown,S.M.和Randall,L.M.，《关于FoundationFocusCDxBRCA测试的简介(A profile on the FoundationFocus CDxBRCA tests)》《分子诊断学专家评论(Expert Rev Mol Diagn)》20，285-292，doi:10.1080/14737159.2020.1701438(2020)。
30Beroukhim,R.等人《人类癌症中体细胞拷贝数改变的前景(The landscape ofsomatic copy-number alteration across human cancers)》《自然》463，899-905，doi:10.1038/nature08822(2010)。
31Gold,P.和Freedman,S.O.，《人类消化系统的特异性癌胚抗原(Specificcarcinoembryonic antigens of the human digestive system)》《实验医学杂志(J ExpMed)》122，467-481，doi:10.1084/jem.122.3.467(1965)。
32Parham,P.和Bodmer,W.F.，《抗人类组织相容性同种抗原HLA-A2的单克隆抗体(Monoclonal antibody to a human histocompatibility alloantigen,HLA-A2)》《自然》276，397-399，doi:10.1038/276397a0(1978)。
33.Tanyi,J.L.等人《复发性卵巢癌患者经间皮素靶向CAR-T细胞治疗后可能出现房室细胞因子释放综合征(Possible Compartmental Cytokine Release Syndrome in aPatient With Recurrent Ovarian Cancer After Treatment With Mesothelin-targeted CAR-T Cells)》《免疫疗法杂志》40，104-107(2017)。
34.Montesion,M.等人《体细胞HLAI类丢失是一种普遍的免疫逃避机制，其促进肿瘤突变负荷作为检查点抑制剂应答的生物标志物的用途(Somatic HLA Class I Loss Isa Widespread Mechanism of Immune Evasion Which Refines the Use of TumorMutational Burden as a Biomarker of Checkpoint Inhibitor Response)》《癌症研究》11，282-292(2021)。
35.Bohmer等人，《前向光散射是T细胞活化和增殖的简单量度，但并不普遍适用于双联体鉴别(Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation andproliferation but is not universally suited for doublet discrimination)》《血细胞计数(Cytometry)》79A(8):646-652(2011)。
36.Berger等人《HLA-A3的单克隆抗体(Monoclonal antibody to HLA-A3)》《杂交瘤(Hybridoma)》1(2):87-90(1982)。
37.Brodsky等人，《HLA系统分析用单克隆抗体(Monoclonal antibodies foranalysis of the HLA system)》《免疫学评论(Immunol Rev.)》47:3-61(1979)。

Claims (99)

1.一种免疫细胞，其包含：
a.第一受体，其包含对间皮素(MSLN)特异性的细胞外配体结合结构域；以及
b.第二受体，其包含对在MSLN+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，
其中所述第一受体是响应于MSLN的活化剂受体；并且其中所述第二受体是响应于所述非靶抗原的抑制性受体。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原通过杂合性丢失而在所述MSLN+癌细胞中丢失。
3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的等位基因变体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A、HLA-B或HLA-C蛋白的等位基因变体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*02。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含如公开于表6中的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表6或表7的所述CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:42-47或SEQ ID NO:48-53的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于SEQ ID NO:42-47或SEQ ID NO:48-53的所述CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自表5中公开的多肽序列的多肽序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:30-41中任一个，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含如公开于表2中的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表2的所述CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含以下：包含表3中所示序列的可变重链(VH)部分和包含表4中所示序列的可变轻链(VL)部分；或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含以下：可变重链(VH)部分，其包含SEQ ID NO:233或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列；以及可变轻链(VL)部分，其包含SEQ ID NO:279或与其具有85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:3-6、80和154-215组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:171的scFv序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体包含铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
18.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述铰链结构域包含CD8α铰链结构域。
19.根据权利要求18所述的免疫细胞，其中所述CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:7的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
20.根据权利要求11至19中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
21.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中所述CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:11的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
22.根据权利要求11至21中任一项所述的免疫细胞，其中所述细胞内结构域包含CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ活化结构域。
23.根据权利要求22所述的免疫细胞，其中所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:285的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体包含SEQ IDNO:303的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。
26.根据权利要求25所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域包含与SEQ IDNO:70至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。
28.根据权利要求27所述的免疫细胞，其中所述LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:74至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。
30.根据权利要求29所述的免疫细胞，其中所述LILRB1铰链结构域包含与SEQ IDNO:73至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域、LILRB1跨膜结构域、LILRB1铰链结构域、任何这些的功能变体或其组合。
32.根据权利要求31所述的免疫细胞，其中所述LILRB1铰链结构域、LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:71或与SEQ ID NO:71至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含SEQ IDNO:348的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的免疫细胞，其中所述MSLN+癌细胞是间皮瘤癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、结肠直肠癌细胞、食道癌细胞、头颈癌细胞、肾癌细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞或胆管癌细胞。
35.根据权利要求34所述的免疫细胞，其中所述MSLN+癌细胞是间皮瘤癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞或肺腺癌细胞。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的免疫细胞，其中所述MSLN+癌细胞是不表达HLA-A*02的MSLN+/HLA-A*02-癌细胞。
37.根据权利要求36所述的免疫细胞，其中所述MSLN+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自MSLN+/HLA-A*02+细胞。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的免疫细胞，其中在具有杂合性丢失的所述MSLN+/HLA-A*02-癌细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的免疫细胞，其中在未通过杂合性丢失而丢失HLA-A*02的MSLN+细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起不特异性活化所述免疫细胞。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
41.根据权利要求40所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的免疫细胞，其中MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。
43.根据权利要求42所述的免疫细胞，其中所述MHC I类基因是β-2-微球蛋白(B2M)。
44.根据权利要求43所述的免疫细胞，其进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸包含干扰RNA，所述干扰RNA包含与B2M mRNA的序列互补的序列。
45.根据权利要求44所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA包含选自表13所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。
46.根据权利要求44或45所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA能够诱导RNAi介导的所述B2M mRNA的降解。
47.根据权利要求46所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。
48.根据权利要求47所述的免疫细胞，其中所述shRNA包含：
a.第一序列，其从5'端至3'端具有与所述B2M mRNA的序列互补的序列；以及
b.第二序列，其从5'端至3'端具有与所述第一序列互补的序列，
其中所述第一序列和所述第二序列形成所述shRNA。
49.根据权利要求47或48所述的免疫细胞，其中所述shRNA由包含序列GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:349)或GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ IDNO:350)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列的序列编码。
50.根据权利要求43所述的免疫细胞，其包含对编码B2M的序列的一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰降低B2M的表达和/或消除其功能。
51.根据权利要求50所述的免疫细胞，其中所述一种或多种修饰包含编码B2M的内源性基因的一种或多种失活突变。
52.根据权利要求51所述的免疫细胞，其中所述一种或多种失活突变包含缺失、插入、取代或移码突变。
53.根据权利要求51或52中任一项所述的免疫细胞，其中用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入所述一种或多种失活突变，所述引导核酸特异性靶向编码B2M的所述内源性基因的序列。
54.根据权利要求53所述的免疫细胞，其中所述gNA包含选自表12所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。
55.根据权利要求42所述的免疫细胞，其中所述MHC I类基因是HLA-A*02。
56.根据权利要求55所述的免疫细胞，其进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸包含干扰RNA，所述干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA的序列互补的序列。
57.根据权利要求56所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA能够诱导RNA干扰(RNAi)介导的所述HLA-A*02mRNA的降解。
58.根据权利要求57所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)，其包含：
a.第一序列，其从5'端至3'端具有与所述HLA-A*02mRNA的序列互补的序列；以及
b.第二序列，其从5'端至3'端具有与所述第一序列互补的序列，
其中所述第一序列和所述第二序列形成所述shRNA。
59.根据权利要求55所述的免疫细胞，其包含对编码HLA-A*02的内源性基因的序列的一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰降低HLA-A*02的表达和/或消除其功能。
60.根据权利要求59所述的免疫细胞，其中所述一种或多种修饰包含编码HLA-A*02的所述内源性基因的一种或多种失活突变。
61.根据权利要求59或60所述的免疫细胞，其中用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入所述一种或多种失活突变，所述引导核酸特异性靶向编码HLA-A*02的所述内源性基因的序列。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体包含SEQ IDNO:164的序列，并且第二受体包含SEQ ID NO:52的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。
63.根据权利要求62所述的免疫细胞，其包含由包含GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:349)或GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ IDNO:350)的序列或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列编码的shRNA。
64.根据权利要求62或63所述的免疫细胞，其中所述第一受体和所述第二受体由单个多核苷酸编码，并且其中编码所述第一受体和所述第二受体的序列由编码自切割多肽的序列分开。
65.根据权利要求63所述的免疫细胞，其中所述自切割多肽包含T2A自切割多肽，其包含序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:351)。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是自体的。
67.根据权利要求1至65中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是同种异体的。
68.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至67中任一项所述的免疫细胞。
69.根据权利要求68所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
70.根据权利要求68或69所述的药物组合物，其用作治疗MSLN+癌症的药物。
71.一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：
a.第一受体，其包含对间皮素(MSLN)特异性的细胞外配体结合结构域；以及
b.第二受体，其包含对在MSLN+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，
其中所述第一受体是响应于所述MSLN+癌细胞上的MSLN的活化剂受体；并且
其中所述第二受体是响应于所述非靶抗原的抑制性受体。
72.一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含用于生成根据权利要求1至67中任一项所述的免疫细胞的一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码所述第一受体和所述第二受体的多核苷酸序列。
73.根据权利要求71或72所述的多核苷酸或多核苷酸系统，其包含编码对B2M特异性的shRNA的序列。
74.根据权利要求73所述的多核苷酸或多核苷酸系统，其中编码所述第一受体、所述第二受体和对B2M特异性的所述shRNA的所述序列由相同的多核苷酸编码。
75.根据权利要求73或74所述的多核苷酸或多核苷酸系统，其中
a.编码对B2M特异性的所述shRNA的所述序列包含GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:
349)或GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQID NO:350)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；
b.编码所述第一受体的所述序列包含编码多肽的序列，所述多肽包含SEQ IDNO:303，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；以及
c.编码所述第二受体的所述序列包含编码多肽的序列，所述多肽包含SEQ IDNO:348的序列，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列。
76.一种载体，其包含根据权利要求71至75中任一项所述的一种或多种多核苷酸。
77.一种杀死在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的MSLN+癌细胞的方法，其包含向受试者施用有效量的根据权利要求1至65中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求66至68中任一项所述的药物组合物。
78.一种治疗患有在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的MSLN+肿瘤的受试者体内MSLN+癌症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至67中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求68至70中任一项所述的药物组合物。
79.一种治疗受试者体内癌症的方法，其包含：
a.确定所述受试者的正常细胞和多种癌细胞的HLA-A基因型或表达；
b.任选地，确定所述受试者的多种癌细胞中的MSLN的表达；以及
c.如果所述正常细胞表达HLA-A*02并且所述多种癌细胞不表达HLA-A*02，并且所述多种癌细胞是MSLN阳性的，则向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至65中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求66至68中任一项所述的药物组合物。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述受试者是患有表达MSLN(MSLN+)并且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者。
81.根据权利要求79所述的方法，其中所述受试者是患有表达MSLN并且已经丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02患者。
82.根据权利要求79至81中任一项所述的方法，其中所述癌症包含间皮瘤癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、结肠直肠癌或胆管癌。
83.根据权利要求82中任一项所述的方法，其中所述癌症在受试者体内复发，所述癌症对一种或多种先前施用的抗癌疗法是难治性的，和/或所述癌症是转移性的。
84.根据权利要求79至83中任一项所述的方法，其中所述癌细胞包含不表达HLA-A*02的MSLN+/HLA-A*02-癌细胞。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述MSLN+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自MLSN+/HLA-A*02+细胞。
86.根据权利要求79至85中任一项所述的方法，其中在所述MSLN+/HLA-A*02-癌细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。
87.根据权利要求79至86中任一项所述的方法，其中在未丢失HLA-A*02的MSLN+细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起不特异性活化所述免疫细胞。
88.根据权利要求79至87中任一项所述的方法，其中施用根据权利要求1至58中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求59至61中任一项所述的药物组合物减小了所述受试者体内肿瘤的大小。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述肿瘤减小了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述肿瘤被消除。
91.根据权利要求88或权利要求89所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物阻止了所述受试者体内肿瘤的生长。
92.根据权利要求79至91中任一项所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物减少了所述受试者体内肿瘤的数目。
93.根据权利要求79至92中任一项所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物导致所述受试者体内癌细胞而非正常细胞的选择性杀伤。
94.根据权利要求93所述的方法，其中至少约60％的被杀死的细胞是癌细胞，约65％的被杀死的细胞是癌细胞，约70％的被杀死的细胞是癌细胞，约75％的被杀死的细胞是癌细胞，约80％的被杀死的细胞是癌细胞，约85％的被杀死的细胞是癌细胞，约90％的被杀死的细胞是癌细胞，约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％被杀死的细胞是癌细胞。
95.根据权利要求93所述的方法，其中施用所述免疫细胞或药物组合物导致杀死所述受试者的至少约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的所述癌细胞。
96.根据权利要求79至95中任一项所述的方法，其中与施用包含所述第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用所述免疫细胞或所述药物组合物对所述受试者产生更少的副作用。
97.一种制备多种免疫细胞的方法，其包含：
a.提供多种免疫细胞，以及
b.用根据权利要求71至75中任一项所述的多核苷酸系统或根据权利要求76所述的载体转化所述多种免疫细胞。
98.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至67中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求68至708中任一项所述的药物组合物。
99.根据权利要求98所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书。
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