CN116635043A - 用于治疗egfr阳性癌症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了包含第一活化剂受体和第二抑制性受体的免疫细胞，以及制备和使用其治疗癌症的方法。

Description

用于治疗EGFR阳性癌症的组合物和方法

相关申请

本申请要求于2020年8月20日提交的美国临时申请第63/068,249号；于2020年10月26日提交的美国临时申请第63/105,639号；和于2021年8月6日提交的美国临时申请第63/230,632号的优先权，其各自的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本申请总体上涉及用于细胞治疗应用的工程化受体和包含所述受体的免疫细胞组合物。

对序列表的引用

序列表段落申请含有已经通过EFS-WEB以ASCII格式提交的序列表，并且通过引用将其全文并入本文。所述ASCII副本创建于2021年8月17日，被命名为A2BI_021_02WO_SeqList_ST25.txt，并且大小为675KB。

背景技术

细胞疗法是治疗各种疾病，特别是癌症的有力工具。在常规的过继性细胞疗法中，将免疫细胞工程化以表达特异性受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其通过受体与靶细胞表达的配体的相互作用将免疫细胞的活性导向细胞靶。鉴定合适的靶分子仍然具有挑战性，因为许多靶分子在正常组织中表达。当移植细胞靶向表达靶分子的正常组织时，这种表达可能会导致毒性。因此，本领域需要用于通过过继性细胞疗法治疗疾病，特别是癌症的组合物和方法。

发明内容

本公开提供了用于增加过继性细胞疗法中使用的免疫细胞的特异性的组合物和方法。本公开提供了包含双受体系统的免疫细胞，该双受体系统增加了免疫细胞对表达靶抗原的靶细胞的特异性。免疫细胞包含第一活化剂受体，其响应于第一受体与靶抗原的结合而活化免疫细胞。免疫细胞进一步包含对非靶抗原特异性的第二抑制性受体。当第二受体与非靶抗原结合时，甚至当第一受体与靶抗原结合时，该第二受体抑制免疫细胞的活化。

在一个方面，本公开提供了一种免疫细胞，其包含：a.)第一受体，其包含对表皮生长因子受体(EGFR)特异性的细胞外配体结合结构域；和b.)第二受体，其包含对由于杂合性丢失而在EGFR+癌症中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中第一受体是响应于EGFR的活化剂受体；并且其中第二受体是响应于非靶抗原的抑制性受体。

在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合MHC蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A、HLA-B或HLA-C蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*02。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-C*07或HLA-B*07。

在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含如公开于表5中的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表5的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。

在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:101-106或SEQ ID NO:106-112的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表5的CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。

在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含选自表4中公开的多肽序列的多肽序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:89-100中任一个；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

在一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，其包含选自表3所示序列组的一组重链互补决定区(HC-CDR)；和/或可变轻链(VL)部分，其包含来自表3所示序列组的一组轻链互补决定区(LC-CDR)；或在每个CDR中具有至多1、2、3、4个取代、插入或缺失的CDR序列。

在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，其具有选自表2所示的VH序列的序列；和/或包含表2所示的序列的可变轻链(VL)部分；或与其具有至少70％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。

在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含选自表1所示序列组的序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:9-18组成的组的scFv序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

在一些实施例中，第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1细胞内结构域包含与SEQ ID NO:129至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。

在一些实施例中，第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:133至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。

在一些实施例中，第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。

在一些实施例中，第二受体包含LILRB1细胞内结构域、LILRB1跨膜结构域、LILRB1铰链结构域、任何这些的功能变体或其组合。在一些实施例中，LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:128或与SEQ ID NO:128至少95％相同的序列。

在一些实施例中，EGFR+癌细胞是肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺导管癌细胞、结肠直肠癌细胞、头颈癌细胞、食道和胃腺癌细胞、卵巢癌细胞、多形性成胶质细胞瘤细胞、宫颈鳞状细胞癌细胞、肾癌细胞、乳头状肾癌细胞、肾透明细胞癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、胆管癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、肉瘤细胞、甲状腺癌细胞、胸腺癌细胞、胃癌细胞或子宫癌细胞。

在一些实施例中，EGFR+癌细胞是不表达HLA-A*02的EGFR+/HLA-A*02-癌细胞；或衍生自不表达HLA-A*02的HLA-A*02+个体的癌细胞。在一些实施例中，EGFR+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自EGFR+/HLA-A*02+细胞。

在一些实施例中，在具有杂合性丢失的EGFR/HLA-A*02-癌细胞存在下，第一受体和第二受体一起特异性活化免疫细胞。

在一些实施例中，在未通过杂合性丢失而丢失HLA-A*02的EGFR+细胞存在下，第一受体和第二受体一起不特异性活化免疫细胞。

在一些实施例中，免疫细胞是T细胞、巨噬细胞、NK细胞、iNKT细胞或γδT细胞。在一些实施例中，T细胞是CD8+CD4-T细胞。

在一些实施例中，免疫细胞进一步包含减少或消除的MHC I类基因的表达和/或功能。

在一些实施例中，MHC I类基因是β-2-微球蛋白(B2M)。

在一些实施例中，免疫细胞进一步包含多核苷酸，其包含干扰RNA，该干扰RNA包含与B2M mRNA(SEQ ID NO:172)的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi导的B2M mRNA的降解。在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含：a.)第一序列，其从5'端至3'端具有与B2M mRNA的序列互补的序列；以及b.)第二序列，其从5'端至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。

在一些实施例中，免疫细胞包含对编码B2M(SEQ ID NO:170)的序列的一种或多种修饰，其中一种或多种修饰减少B2M的表达和/或消除其功能。在一些实施例中，一种或多种修饰包含编码B2M的内源性基因的一种或多种失活突变。在一些实施例中，一种或多种失活突变包含缺失、插入、取代或移码突变。在一些实施例中，用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入一种或多种失活突变，该引导核酸特异性靶向编码B2M(SEQ ID NO:170)的内源性基因的序列。

在一些实施例中，MHC I类基因是HLA-A*02。

在一些实施例中，免疫细胞进一步包含多核苷酸，其包含干扰RNA，该干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA(SEQ ID NO:171)的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNA干扰(RNAi)介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)，其包含：a.)第一序列，其从5'端至3'端具有与HLA-A*02mRNA的序列互补的序列；以及b.)第二序列，其从5'端至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。

在一些实施例中，免疫细胞包含对编码HLA-A*02(SEQ ID NO:169)的内源性基因的序列的一种或多种修饰，其中一种或多种修饰降低HLA-A*02的表达和/或消除其功能。在一些实施例中，一种或多种修饰包含编码HLA-A*02的内源性基因的一种或多种失活突变。在一些实施例中，一种或多种失活突变包含缺失、插入、取代或移码突变。在一些实施例中，用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入一种或多种失活突变，该引导核酸特异性靶向编码HLA-A*02的内源性基因的序列。

在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:177，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:174或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:177，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:175，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:174，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:175，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:176，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:176，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，免疫细胞进一步包含T2A自切割肽，其中T2A自切割肽包含SEQID NO:178，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，免疫细胞进一步包含干扰RNA，其中干扰RNA包含SEQ ID NO:179，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，免疫细胞是自体的。在一些实施例中，免疫细胞是同种异体的。

在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述的免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少90％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施例中，本文所述的药物组合物用作治疗EGFR+癌症的药物。

在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，该多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：a.)第一受体，其包含对内皮生长因子受体(EGFR)特异性的细胞外配体结合结构域；和b.)第二受体，其包含对由于杂合性丢失而在EGFR+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中第一受体是响应于EGFR+癌细胞上的EGFR的活化剂受体；并且其中第二受体是响应于非靶抗原的抑制性受体。

在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含用于生成本文所述的免疫细胞的一种或多种多核苷酸，该多核苷酸包含编码第一受体和第二受体的多核苷酸序列。

在本公开的多核苷酸或多核苷酸系统的一些实施例中，该多核苷酸或多核苷酸系统包含编码对B2M特异性的shRNA的序列。在一些实施例中，编码第一受体、第二受体和对B2M特异性的shRNA的序列由相同的多核苷酸编码。

在一个方面，本公开提供了一种载体，其包含本文所述的一种或多种多核苷酸。

在一个方面，本公开提供了一种杀死在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的EGFR+癌细胞的方法，其包含向受试者施用有效量的本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物。

在一些实施例中，EGFR+癌细胞是肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺导管癌细胞、结肠直肠癌细胞、头颈癌细胞、食道和胃腺癌细胞、卵巢癌细胞、多形性成胶质细胞瘤细胞、宫颈鳞状细胞癌细胞、肾癌细胞、乳头状肾癌细胞、肾透明细胞癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、胆管癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、肉瘤细胞、甲状腺癌细胞、胸腺癌细胞、胃癌细胞或子宫癌细胞。在一些实施例中，EGFR+癌细胞是肺癌细胞。

在一些实施例中，EGFR+癌细胞是不表达HLA-A*02的EGFR+/HLA-A*02-癌细胞；或衍生自不表达HLA-A*02的HLA-A*02+个体的癌细胞。在一些实施例中，EGFR+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自EGFR+/HLA-A*02+细胞。

在一个方面，本公开提供了一种治疗患有在编码非靶抗原的基因座处具有杂合性丢失的EGFR+肿瘤的受试者体内EGFR+癌症的方法，其包含向受试者施用有效量的本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物。

在一些实施例中，受试者是患有表达EGFR并且已经缺失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者。

在一些实施例中，受试者是患有表达EGFR并且已经缺失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02患者。

在一个方面，本公开提供了一种治疗受试者体内癌症的方法，其包含：a.)确定受试者的非恶性细胞和癌细胞中的非靶抗原的基因型或表达水平；b.)确定受试者的癌细胞中的EGFR的表达水平；和c.)如果非恶性细胞表达非靶抗原并且癌细胞不表达非靶抗原，并且癌细胞是EGFR阳性的，则向受试者施用有效量的本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物。

在一些实施例中，施用本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物减小了受试者体内肿瘤的大小。

在一些实施例中，肿瘤减小了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施例中，肿瘤被消除。

在一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物阻止了受试者体内肿瘤的生长。在一些实施例中，施用本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物减少了受试者体内肿瘤的数目。

在一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物导致受试者体内癌细胞而非正常细胞的选择性杀伤。在一些实施例中，至少约60％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约65％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约70％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约75％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约80％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约85％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约90％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％的被杀死的细胞是癌细胞。

在一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物导致杀死受试者的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的癌细胞。在一些实施例中，癌细胞包含肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺导管癌细胞、结肠直肠癌细胞、头颈癌细胞、食道和胃腺癌细胞、卵巢癌细胞、多形性成胶质细胞瘤细胞、宫颈鳞状细胞癌细胞、肾癌细胞、乳头状肾癌细胞、肾透明细胞癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、胆管癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、肉瘤细胞、甲状腺癌细胞、胸腺癌细胞、胃癌细胞或子宫癌细胞。在一些实施例中，与施用包含第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用免疫细胞或药物组合物对受试者产生更少的副作用。

在一个方面，本公开提供了一种制备多种免疫细胞的方法，其包含：a.)提供多种免疫细胞，和b.)用本文所述的多核苷酸系统或本文所述的载体转化多种免疫细胞。

在一个方面，本公开提供了一种包含本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒进一步包含使用说明书。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由专利局在请求和支付必要费用后提供。

图1A是示出了表达EGFR CAR活化剂和HLA-A*02LIR-1阻断剂的Jurkat细胞被EGFR+/HLA-A*02-HeLa靶细胞活化但不被EGFR+/HLA-A*02+HeLa靶细胞活化的图。

图1B是一对荧光活化细胞分选(FACS)图，示出了Jurkat细胞上活化剂(CT479)和阻断剂(C1765)受体的表达。

图1C是一对示出了活化剂抗原(EGFR)和阻断剂抗原(HLA-A*02)在HeLa细胞上表达的图。使用BB7.2抗体检测HLA-A*02表达。

图2A示出了HLA-A*02在用HLA-A*02转导的HeLa细胞和HCT116细胞上的表达。用分选的抗HLA-A2抗体BB7.2和FAC标记HeLa和HCT1116细胞。绿色：未标记的HeLa；橙色：未标记的HCT116；蓝色：用BB7.2标记的野生型HCT116；红色：用HLA-A*02转导并用BB7.2标记的Hela细胞。

图2B示出了EGFR在HeLa细胞和HCT116细胞上的表达。Hela和HCT1116细胞用抗EGFR抗体标记。绿色：未标记的HeLa；橙色：未标记的HCT1116；蓝色：用抗EGFR标记的野生型HCT116；红色：用HLA-A*02转导并用抗EGFR标记的Hela细胞。

图3A示出了当共培养HCT116靶细胞时表达EGFR CAR的Jurkat细胞的EGFR CAR活化。

图3B示出了Jurkat细胞的EGFR CAR活化可以被HLA-A*02LIR-1抑制性受体阻断。当Jurkat细胞与表达EGFR和HLA-A*02的HCT116靶细胞一起呈递时，Jurkat细胞共表达EGFRCAR和HLA-A*02LIR-1抑制性受体导致CAR E_最大偏移大约1.8倍。

图3C示出了当与HeLa靶细胞共培养时表达EGFR CAR的Jurkat细胞的EGFR CAR活化。

图3D示出了Jurkat细胞的EGFR CAR活化可以被HLA-A*02LIR-1抑制性受体阻断。当Jurkat细胞与表达EGFR和HLA-A*02的HeLa靶细胞一起呈递时，Jurkat细胞共表达EGFRCAR和HLA-A*02LIR-1抑制性受体导致CAR E_最大偏移大约5.4倍。

图4A示出了在基于珠的测定中滴定活化剂抗原以确定活化剂抗原的最佳量。

图4B示出了在基于珠的测定中滴定阻断剂抗原以确定活化剂与阻断剂抗原的最佳比例。

图5是示出了当HLA-A*02scFv LIR1抑制剂与不同的EGFR scFv CAR活化剂一起用于原代T细胞时，观察到不同阻断程度的一系列图和表。

图6A是示出了当两种不同的HLA-A*02scFv LIR1抑制剂与不同的EGFR scFv CAR活化剂一起用于原代T细胞时，观察到不同阻断程度的一系列图。

图6B是示出了当不同对的活化和抑制性受体共表达时活化和抑制性受体的敏感性的一系列图。通过mRNA滴定改变靶细胞上的活化剂或非靶抗原的量。

图6C是示出了表达EGFR靶向活化剂受体和人源化抑制性受体或鼠抑制性受体的细胞对靶细胞的最大特异性杀伤(％)的一系列图。还示出了每对活化剂和抑制性受体的靶肿瘤细胞对正常细胞的选择性比率。

图7是示出了与HeLa细胞以1:1的比例共培养的表达EGFR scFv CAR或EGFR scFvCar和HLA-A*02scFv LIR1抑制性受体的T细胞的细胞毒性的一系列图。A肿瘤细胞：表达EGFR但不表达HLA-A*02的Hela细胞；AB正常细胞：表达EGFR和HLA-A*02的Hela细胞；A-B-正常细胞：不表达EGFR或HLA-A*02的Hela细胞；B正常细胞：表达HLA-A*02但不表达EGFR的Hela细胞。Y轴示出了绿色区域，其在测定中与健康HeLa细胞成比例。UTD：未转导。

图8是示出了表达阻断剂和活化剂受体的原代T细胞的富集(顶行)和表达EGFRscFv CAR或EGFR scFv CAR和HLA-A*02scFv LIR1抑制性受体的这些T细胞与表达EGFR(靶A)或EGFR和HLA-A*02(靶AB)的HeLa细胞以1:1混合后的细胞毒活性的一系列图。

图9是示出了表达EGFR scFv CAR或EGFR scFv CAR和HLA-A*02scFv LIR1抑制性受体的T细胞与表达EGFR、HLA-A*02或两者的HeLa细胞以1:1混合后的细胞毒性的一系列图。A肿瘤细胞：表达EGFR但不表达HLA-A*02的Hela细胞；AB正常细胞：表达EGFR和HLA-A*02的Hela细胞；B正常细胞：表达HLA-A*02但不表达EGFR的Hela细胞。Y轴示出了绿色区域，其在测定中与健康HeLa细胞成比例。UTD：未转导。

图10是示出了表达EGFR scFv CAR或EGFR scFv CAR和HLA-A*02scFv LIR1抑制性受体的T细胞与表达EGFR(靶A)或EGFR和HLA-A*02(靶AB)的HCT.116细胞以1:1混合后的细胞毒性的一系列图。

图11A是一系列荧光活化细胞分选(FACS)图，示出了表达不同EGFR scFv CAR和HLA-A*02scFv LIR1抑制剂的T细胞与表达单独EGFR活化剂(靶A)、单独抑制剂靶(靶B)或活化剂和抑制剂靶(靶AB)的HeLa细胞孵育后，T细胞对EGFR scFv CAR活化剂受体的表达。

图11B是示出了在暴露于靶细胞之前，以及在与仅表达活化剂配体的靶细胞(靶A)，或表达活化剂和阻断剂配体两者的靶细胞(靶AB)共培养120小时之后，活化剂受体表达的量化图。

图12A是示出了与表达EGFR(靶A)、HLA-A*02(靶B)、相同细胞上的EGFR和HLA-A*02的组合(靶AB)的HeLa细胞群体、不同细胞上的表达靶A和靶AB的HeLa细胞的混合群体，或不同细胞上的表达靶B和靶AB的HeLa细胞的混合群体共培养后，表达EGFR scFv CAR(CT-482)活化剂和HLA-A*02scFv LIR1抑制剂(C1765)的T细胞上的活化剂受体的细胞表面表达的图。

图12B是示出了与表达EGFR(靶A)、HLA-A*02(靶B)、相同细胞上的EGFR和HLA-A*02的组合(靶AB)的HeLa细胞群体、不同细胞上的表达靶A和靶AB的HeLa细胞的混合群体，或不同细胞上的表达靶B和靶AB的HeLa细胞的混合群体共培养后，表达EGFR scFv CAR(CT-482)活化剂和HLA-A*02scFv LIR1抑制剂(C1765)的T细胞上的抑制性受体的细胞表面表达的图。

图13是确定T细胞的细胞毒性或阻断活性是否可逆的实验图。

图14A是示出了细胞毒性和阻断活性是可逆的并且对应于活化剂表面表达的一系列图。在第1轮中T细胞与EGFR+/HLA-A2+靶细胞共培养，然后在接下来的几轮中切换到交替靶细胞。在顶部：示出了T细胞对靶HeLa细胞的杀伤百分比。在底部：通过FACS测定的活化剂和抑制性受体表达。

图14B是示出了细胞毒性和阻断活性是可逆的并且对应于活化剂表面表达的一系列图。在第1轮中T细胞与EGFR+/HLA-A2-靶细胞共培养，然后在接下来的几轮中切换到交替靶细胞。在顶部：示出了T细胞对靶HeLa细胞的杀伤百分比。在底部：通过FACS测定的活化剂和抑制性受体表达。

图15A是示出了EGFR活化剂CAR在细胞表面的表达被表达活化剂和抑制剂配体的靶细胞的存在可逆地下调的图。

图15B是示出了当仅存在活化剂靶细胞，或不存在表达活化剂和阻断剂靶的靶细胞时，细胞表面上的EGFR活化剂CAR表达快速恢复的一系列图。

图16示出了当活化剂和抑制剂抗原以顺式存在于珠上时，而不是当活化剂和抑制剂抗原以反式存在于珠上时，使用基于珠的测定表达EGFR scFv CAR的Jurkat细胞的活化可以被基于pMHC HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体阻断。

图17A示出了使用表达HLA-A*02的SiHa靶细胞(SiHa A02)，但不表达HLA-A*02的SiHa细胞(SiHa WT)，基于pMHC HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体可以阻断EGFR scFvCAR对Jurkat细胞的活化。

图17B示出了使用表达HLA-A*02的HeLa靶细胞(HeLa A02)，但不表达HLA-A*02的HeLa细胞(HeLa WT)，基于pMHC HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体可以阻断EGFR scFvCAR对Jurkat细胞的活化。

图18是示出了用于鉴定潜在的非靶抗原候选基因的生物信息学搜索过程的图。

图19是示出了用于测定体内表达EGFR靶向活化剂受体和抑制性受体的免疫细胞的效力和选择性的实验设计的图。

图20A是示出了用编码HLA-A*11的mRNA转染的HeLa细胞在mRNA滴定测定中JurkatNFAT萤光素酶(JNL)细胞抑制的图。用连续稀释的HLA-A*11mRNA转染Hela细胞，用具有scFvHLA-A*11#4的EGFR活化CAR+/-HLA-A*11抑制性受体瞬时转染JNL细胞。共培养6小时后评估功能反应。

图20B示出了HLA-A*11#4抑制性受体的分子/细胞敏感性(IC50)。

图21是示出了HLA-B*07-scFv-LIR1抑制性受体抑制由共表达的EGFR靶向活化剂受体介导的免疫细胞活化的图。

图22是示出了包含本文公开的载体的原代T细胞中EGFR活化剂受体(仅EGFR-CAR)和EGFR活化剂/HLA-A抑制性受体对的表达的一系列图。示出了在富集前(富集前)和富集后(富集后)表达一种或两种受体的细胞的百分比，其中富集选择表达受体的细胞。受体对由两个单独的载体(双载体)或一个载体(单载体)表达。

图23A是示出了表达EGFR活化剂受体和HLA-A*02scFv LIR1抑制剂受体的免疫细胞对HeLa靶细胞或HCT116靶细胞的特异性杀伤百分比的一系列图。靶细胞表达EGFR抗原(A)，或同时表达EGFR抗原和HLA-A*02非靶抗原(B)。表达活化剂/抑制剂受体对的免疫细胞与靶细胞以1:1的比例孵育。

图23B是示出了在癌细胞和正常细胞的混合培养物中表达EGFR活化剂受体和HLA-A*02scFv LIR1抑制剂受体的免疫细胞对靶细胞的特异性和选择性杀伤的图和系列图像。UTD＝免疫细胞无活化剂或抑制剂受体；CAR＝仅表达活化剂受体的免疫细胞；Tmod＝表达活化剂和抑制剂受体的免疫细胞。在右侧图像中：绿色＝正常细胞；红色＝肿瘤细胞。

图24是示出了表达EGFR活化剂受体(CAR)或EGFR活化剂受体和HLA-A*02抑制剂受体(Tmod)的Jurkat细胞(效应细胞)中选择性细胞活化的图。将Jurkat细胞与一组表达HLA-A*02(有或没有EGFR表达)的靶细胞系一起孵育。当与不表达EGFR的靶细胞或表达HLA-A*02的细胞共培养时，Tmod Jurkat效应细胞不显示脱靶活化。

具体实施方式

本文提供了使用免疫细胞治疗癌症的组合物和方法，免疫细胞包含响应于癌症和正常细胞之间的配体的基因表达差异的双受体系统。这些表达上的差异可能是由于癌细胞中杂合性的丢失。替代地，表达的差异可能是因为基因表达在癌细胞中不表达，或在癌细胞中以低于正常细胞的水平表达。双受体系统在免疫细胞中表达，例如在过继性细胞疗法中使用的免疫细胞，并且将这些免疫细胞的活性靶向表现出杂合性丢失或表达差异的癌细胞。在这种双受体系统中，第一受体(活化剂受体，有时在本文中称为A模块)活化或促进免疫细胞的活化，而第二受体(抑制性受体，有时在本文中称为阻断剂或抑制剂受体，或B模块)起抑制第一受体活化免疫细胞的作用。每个受体含有结合特异性配体的配体结合结构域(LBD)。在配体结合时来自两种受体的信号被免疫细胞整合。第一受体和第二受体的配体在癌症和正常细胞中的差异表达，例如通过编码抑制性配体的基因座在癌细胞中的杂合性丢失，或转录水平的差异，介导免疫细胞被表达第一活化剂配体但不表达第二抑制性配体的靶癌细胞活化。

在本文提供的组合物和方法的特定实施例中，包含本文所述的双受体系统的免疫细胞用于治疗表皮生长因子受体(EGFR)阳性癌症。这包括肺癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌、头颈癌和结肠直肠癌。在EGFR阳性癌症的情况下，活化剂受体的靶抗原是EGFR或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。EGFR在多种正常组织(如上皮组织、间充质组织和神经元组织)中表达，并且在正常细胞过程(如细胞增殖和分化以及发育)中起主要作用。由于其在某些肿瘤中的表达，EGFR是一种有吸引力的肿瘤特异性抗原，如果这些癌细胞可以用合适的治疗剂特异性靶向，其可以介导EGFR+肿瘤的选择性杀伤。然而，在非癌(非靶)细胞中的正常EGFR表达已经阻止EGFR有效用于靶向疗法，如过继性细胞疗法。皮肤和胃肠道毒性阻碍了EGFR阳性癌症中EGFR的有效靶向。通过将EGFR活化剂受体与抑制性受体配对，本文提供的方法增加了EGFR靶向过继性细胞疗法的特异性并且降低了与这些疗法相关的有害作用，如剂量限制性毒性。

在一些实施例中，活化剂的配体是与I类MHC复合的EGFR肽。在本文所述的方法中，这种EGFR靶向活化剂受体与抑制性受体配对，其通过阻断活化剂对正常EGFR阳性组织的细胞溶解作用而增加活化剂的安全窗口。然而，由于肿瘤细胞不表达抑制剂或阻断剂受体的配体，活化剂受体仍然指导由包含双受体系统的免疫细胞靶向杀伤肿瘤细胞。第二抑制性受体的靶由EGFR阳性组织(如上皮组织)表达，但在癌细胞中不表达，并且抑制性受体将这种“非靶抗原”识别为抑制性刺激。第二抑制性受体的示例性靶由肺上皮组织表达，并且由于杂合性(LOH)而从EGFR阳性癌细胞中丢失，在癌细胞中留下单个等位基因形式，其可以经由抑制性受体上的等位基因特异性配体结合结构域与其它等位基因区分开。抑制性受体的示例性靶包括但不限于主要组织相容性复合物(MHC)蛋白，如人白细胞抗原A(HLA-A)、HLA-B、HLA-C和其它HLA。HLA由变异基因编码，如HLA-A*01、HLA-A*02、HLA*A03、HLA-C*07等，其可以通过杂合性丢失从EGFR阳性癌细胞中丢失。替代地，抑制性受体的其它示例性靶包括聚集蛋白亚家族成员12COLEC12、APC下调1(APCDD1)和C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)。这些中的每一种具有共同的非同义变体形式，在其可接近抗体的细胞外结构域中具有氨基酸改变，其可用作细胞整合体的B模块靶，该细胞整合体被设计成用由活化剂受体(如EGFR或EGFR pMHC响应性活化剂受体)活化的工程化T细胞安全地治疗患有EGFR阳性癌症的患者。本公开的组合物和方法可以减少或消除由正常组织表达EGFR引起的DLT。本公开提供了使用过继性细胞疗法通过添加第二抑制性受体靶向癌细胞中的EGFR以治疗EGFR阳性癌症的方法，第二抑制性受体在第二配体(不同于EGFR的配体，称为“非靶抗原”)的存在下阻断过继性免疫细胞的活化。使用本文所述的组合物和方法，表达EGFR的肿瘤细胞受到表达两种受体的过继性免疫细胞攻击，因为这些肿瘤细胞仅表达活化剂配体EGFR。相反，表达EGFR加上非靶抗原(替代地称为“阻断剂抗原”)的正常细胞被保护免受过继性免疫细胞的影响。抑制性受体对正常细胞上的非靶抗原应答，从而阻止EGFR靶向的活化剂受体对免疫细胞的活化。这种双重靶向方法产生了治疗窗口，其将允许在EGFR阳性癌症患者中安全且有效地施用EGFR定向细胞疗法。

本公开提供了允许使用有效的EGFR CAR和TCR的方法和组合物，这些有效的EGFRCAR和TCR诱导靶向毒性，并且通过减轻其毒性使这些EGFR靶向受体可用作治疗剂。

在变化形式中，本文所述的组合物和方法可用于杀死靶细胞和/或治疗其中非靶抗原的表达因杂合性丢失以外的原因而部分或完全降低的受试者，这些原因包括但不限于部分基因缺失、表观遗传沉默、点突变、截短。

定义

在更详细地阐述本公开之前，提供本文使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在特定实施例的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，下面定义以下术语。其它定义在本公开内容中阐述。

如本文所用，术语“约”或“大约”是指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。

如本文所用，术语“分离的”意指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随它的组分的材料。在特定实施例中，术语“获得的”或“衍生的”与分离的同义使用。

术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人。也包括体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。本文所用的“受试者”、“患者”或“个体”包括表现出可用本文预期的载体、组合物和方法治疗的疼痛的任何动物。合适的受试者(例如，患者)包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(如猫或狗)。包括非人灵长类动物，优选地包括人患者。

本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括任何有益或期望的效果，甚至可以包括症状的最小改善。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病状或其相关症状。

如本文所用，“预防(prevent)”和如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等类似词语表示用于预防、抑制或降低疾病症状的可能性的方法。它还指延迟疾病或病状的发作或复发或延迟疾病症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病发作或复发之前降低疾病的强度、作用、症状和/或负担。

如本文所用，术语“量”是指实现有益或期望的预防或治疗结果(包括临床结果)的病毒的“有效量(an amount effective)”或“有效量(an effective amount)”。

病毒或细胞的“治疗有效量”可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及病毒或细胞在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过病毒或细胞的任何毒性或有害效果的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。

生理反应(例如，电生理活性或细胞活性)的“增加的”或“增强的”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括增加1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括在1之间和1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)未处理细胞中的活性水平。

生理反应(例如，电生理活性或细胞活性)的“降低的”或“减少的”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括降低1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括在1之间和1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)未处理细胞中的活性水平。

“维持(maintain)”或“保存(preserve)”或“维持(maintenance)”或“无变化”或“无显著变化”或“无显著降低”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的响应相当的生理反应。可比较的应答是与参考应答没有显著差异或可测量的差异的应答。

通常，“序列同一性”或“序列同源性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应关系。通常，用于确定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二个核苷酸或氨基酸序列进行比较。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过测定它们的“同一性百分比”进行比较。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并乘以100。同一性百分比也可以例如通过使用高级BLAST计算机程序(包括2.2.9版，可从国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)获得)比较序列信息来确定。BLAST程序基于卡林(Karlin)和阿特舒尔(Altschul)，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:2264-2268(1990)的比对方法并讨论于阿特舒尔等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410(1990)；卡林和阿特舒尔，《美国国家科学院院刊》90:5873-5877(1993)；和阿特舒尔等人，《核酸研究(NucleicAcids Res.)》25:3389-3402(1997)。简言之，BLAST程序将同一性定义为相同比对符号(通常为核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列中符号的总数。该程序可用于测定所比较蛋白质全长的同一性百分比。提供默认参数以优化使用短查询序列的搜索，例如在blastp程序中。该程序还允许使用SEG过滤器来屏蔽由伍顿(Wootton)和费德伦(Federhen)，《计算机与化学(Computers and Chemistry)》17:149-163(1993)的SEG程序确定的查询序列的区段。所需序列同一性程度的范围为大约80％至100％和其间的整数值。通常，公开的序列和要求保护的序列之间的同一性百分比是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。

如本文所用，“多核苷酸系统”是指一种或多种多核苷酸。一种或多种多核苷酸可以被设计成与特定应用协同工作，或产生所需的转化细胞。

本文使用的术语“外源性”是指源自生物体外部的任何分子，包括核酸、蛋白质或肽、小分子化合物等。相反，术语“内源性”是指源自生物体内部(即，由生物体天然产生)的任何分子。

术语“MOI”在本文中用于指感染复数，其为药剂(例如病毒颗粒)与感染靶(例如细胞)的比率。

在本说明书中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。

如本文所用，“靶细胞”是指通过过继性细胞疗法靶向的细胞。例如，靶细胞可以是癌细胞，其可以被过继性细胞疗法的移植T细胞杀死。本公开的靶细胞表达如本文所述的靶抗原，但不表达非靶抗原。

如本文所用，“非靶细胞”是指不被过继性细胞疗法靶向的细胞。例如，在靶向癌细胞的过继性细胞中，正常、健康、非癌细胞是非靶细胞。受试者体内一些或全部非靶细胞可以表达靶抗原和非靶抗原两者。受试者体内非靶细胞可以表达非靶抗原，而不管这些细胞是否也表达靶抗原。

如本文所用，“靶抗原”，无论使用术语抗原或特定抗原的名称提及，是指由靶细胞(如癌细胞)表达的抗原。靶抗原的表达不限于靶细胞。靶抗原可以由受试者体内癌细胞和正常的非癌细胞表达。

如本文所用，“非靶抗原”(或“阻断剂抗原”)无论使用术语抗原或特定抗原的名称提及，是指由正常非癌细胞表达且在癌细胞中不表达的抗原。这种表达差异允许抑制性受体在非靶细胞存在下而不是在靶细胞存在下抑制免疫细胞活化。

多态性是指一个群体中核苷酸序列的两种或多种变体的存在。多态性可以包含一个或多个碱基改变、插入、重复或缺失。多态性包括例如简单序列重复(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)，其为当腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)的单核苷酸改变时发生的变异。

如本文所用，“亲和力”是指配体与受体上的单个配体结合位点的结合强度，例如针对本文中所述的任何受体的抗原结合结构域的抗原。配体结合结构域可以与其配体具有较弱的相互作用(低亲和力)或较强的相互作用(高亲和力)。

Kd或解离常数是一种平衡常数，其测量较大物体可逆地分离成较小组分的倾向，例如当包含受体及其同源配体的大分子复合物分离成配体和受体时。当Kd高时，这意味着需要高浓度的配体来占据受体，并且受体对配体的亲和力低。相反，低Kd意味着配体对受体具有高亲和力。

如本文所用，“响应”或“响应于”的受体是指包含细胞内结构域的受体，其当与配体(即抗原)结合时生成对应于细胞内结构域的已知功能的信号。与靶抗原结合的活化剂受体可以生成引起表达活化剂受体的免疫细胞活化的信号。与非靶抗原结合的抑制性受体可以生成抑制信号，其阻止或减少表达活化剂受体的免疫细胞的活化。受体的反应性及其活化或抑制表达受体的免疫细胞的能力可以通过本领域已知的和本文所述的任何方法测定，包括但不限于报告基因测定和细胞毒性测定。

如本文所用，免疫细胞的“活化”或“被活化”的免疫细胞是能够执行免疫应答的一种或多种特征性功能的免疫细胞。这些功能包括增殖、细胞因子释放和细胞毒性，即杀死靶细胞。活化的免疫细胞表达对本领域技术人员显而易见的标记。例如，活化的T细胞可以表达CD69、CD71、CD25和HLA-DR中的一种或多种。当表达活化剂受体(例如EGFR CAR)的免疫细胞对靶抗原(例如EGFR)的结合产生响应时，其可以被活化剂受体活化。“靶抗原”也可以称为“活化剂抗原”，并且可以由靶细胞分离或表达。当抑制性受体对非靶抗原(例如HLA-A*02)的结合有响应时，甚至当活化剂受体与靶活化剂配体结合时，表达抑制性受体的免疫细胞的活化也可以被降低或阻止。“非靶抗原”也可以称为“抑制性配体”或“阻断剂”，并且可以由靶细胞分离或表达。

免疫细胞上的受体表达可以通过报告本文所述的活化剂受体和抑制性受体的存在的测定进行验证。例如，可以用标记的分子(例如荧光团标记的受体特异性抗体或荧光团标记的受体特异性配体)对免疫细胞群体进行染色，并使用荧光活化细胞分选(FACS)流式细胞术进行定量。该方法允许免疫细胞群体中免疫细胞的百分比表征为表达活化剂受体、抑制性受体或两种受体。本文所述免疫细胞表达的活化剂受体和抑制性受体的比例可以通过例如数字液滴PCR进行测定。这些方法可用于表征用于产生和制造本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒的细胞群体。对于本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒，应理解表达活化剂受体和抑制性受体两者的免疫细胞的合适百分比是针对本文所述的方法特异性确定的。例如，表达活化剂受体和抑制性受体的免疫细胞的合适百分比可以是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。例如，表达活化剂受体和抑制性受体的免疫细胞的合适百分比可以是至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％。例如，免疫细胞中活化剂受体与抑制性受体的合适比例可以是约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4或约1:5。应理解，纯化、富集和/或耗竭步骤可用于免疫细胞群体以满足本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适值。

本文所述的免疫细胞表达的应答受体可以通过测量预期由受体的细胞内结构域生成的信号的生成的测定进行验证。报告细胞系，如Jurkat-荧光素酶NFAT细胞(Jurkat细胞)可用于表征应答受体。Jurkat细胞衍生自T细胞并包含稳定整合的活化T细胞核因子(NFAT)-诱导型荧光素酶报告系统。NFAT是免疫细胞活化所需的转录因子家族，其活化可用作T细胞活化的信号标记。可以用本文所述的活化剂受体和/或抑制性受体转导或转染Jurkat细胞。如果Jurkat细胞表达荧光素酶报告基因，则活化剂受体对配体的结合有应答，应答的水平可以通过报告基因表达的水平来确定。萤光素酶的存在可以使用任何已知的萤光素酶检测试剂(如萤光素)来测定。如果当在Jurkat细胞中与活化剂受体共表达时，抑制性受体对配体的结合有应答，它阻止正常应答的免疫细胞表达对活化剂受体应答的荧光素酶。例如，可以通过观察以下各项在表达活化剂和抑制剂两者的Jurkat细胞中确定和定量抑制性受体的响应性：1)Jurkat细胞在存在活化剂受体配体和不存在抑制性受体配体的情况下表达荧光素酶；和2)在活化剂受体配体和抑制性受体配体存在下，Jurkat细胞中的荧光素酶表达减少或消除。该方法可用于测定活化剂受体以及活化剂受体和抑制性受体的特异性对的敏感性、效力和选择性。可以使用剂量反应实验通过EC50或IC50值定量敏感性、效力和选择性，其中将活化剂受体配体和/或抑制性受体配体滴定到表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的Jurkat细胞培养物中。替代地，EC50和IC50值可以在表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的免疫细胞(例如Jurkat细胞或原代免疫细胞)与表达增加量的活化剂配体或抑制剂配体的靶细胞的共培养物中测定。通过例如将编码mRNA的活化剂配体或抑制剂配体滴定到靶细胞中，或使用天然表达不同水平的靶配体的靶细胞，可以在靶细胞中实现活化剂配体或抑制剂配体的增加量。使用表达不同量的靶配体和非靶配体的靶细胞测定的活化剂和抑制性受体的示例性合适的EC50和IC50值包括活化剂受体的每百万260个转录物(TPM)或更低的EC50，例如10和260TPM之间的EC50，以及抑制性受体的10TPM或更低的IC50，例如1至5TPM的IC50。

表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的本文所述的免疫细胞的活化可以进一步通过在与所述免疫细胞共孵育后测量靶细胞活力的测定来确定。免疫细胞，有时称为效应细胞，与表达活化剂受体配体、抑制性受体配体或活化剂和抑制性受体配体两者的靶细胞共孵育。共孵育后，使用测量细胞培养物中活力的任何方法测量靶细胞的活力。例如，可以使用线粒体功能测定来确定活力，该线粒体功能测定使用四唑盐底物来测量活性线粒体酶。也可以使用基于成像的方法确定活力。靶细胞可以表达荧光蛋白，如绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。总细胞荧光的降低表明靶细胞活力的降低。在与表达活化剂受体或活化剂和抑制性受体的特异性对的免疫细胞一起孵育后，靶细胞活力的降低解释为靶细胞介导的免疫细胞的活化。免疫细胞选择性的测量也可以使用这种方法来确定。如果观察到以下情况，则表达一对活化剂和抑制性受体的免疫细胞是选择性的：1)在表达活化剂受体配体但不表达抑制性受体配体的靶细胞中活力降低；2)在表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞中活力不降低。从这些测量中，可以得到“特异性杀伤”值，其将基于靶细胞活力的降低作为阴性对照(不表达活化剂受体的免疫细胞)的百分比来定量免疫细胞活化的百分比。此外，从这些测量值可以推导出“选择性比率”值，其表示在不存在抑制性受体配体的情况下在表达活化剂受体配体的靶细胞中观察到的特异性杀伤与在表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞中观察到的特异性杀伤的比率。该方法可用于表征用于产生和制备本文所述的免疫细胞、药物组合物和试剂盒的细胞群体。免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值可以是例如以下标准：1)在不存在抑制性受体配体的情况下，在表达活化剂受体配体的免疫细胞和靶细胞的48小时共孵育后，至少50％的特异性杀伤；2)对表达活化剂受体配体和抑制性受体配体的靶细胞的特异性杀伤小于或等于20％。作为另一个实例，免疫细胞能够在6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时或60小时的时间段内杀死至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的表达活化剂配体而不表达抑制剂配体的靶细胞，同时在同一时间段内杀死少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％、少于3％或少于1％的表达活化剂和抑制剂配体的靶细胞。

对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％至至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至多约50％、至多约55％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％或至多约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％。可以在免疫细胞与靶细胞共孵育约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时、约66小时或约72小时后测定免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值。

对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％至至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至多约50％、至多约55％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％或至多约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％。可以在免疫细胞与靶细胞共孵育约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时、约66小时或约72小时后测定免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值。

对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％至至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，在不存在抑制性配体的情况下，表达活化剂配体的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以是例如至多约50％、至多约55％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％或至多约95％。对于免疫细胞、药物组合物和试剂盒而言，表达活化剂受体配体和抑制性受体配体两者的靶细胞的合适的特异性杀伤值可以小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％。可以在免疫细胞与靶细胞共孵育约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时、约66小时或约72小时后测定免疫细胞、药物组合物和试剂盒的合适的特异性杀伤值。

如本文所用，术语“功能变体”是指与亲本蛋白质相比具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失并且保留亲本蛋白质的一种或多种所需活性的蛋白质。功能变体可以是保留亲本蛋白质的一种或多种所需活性的蛋白质片段(即具有N-和/或C-末端缺失的变体)。

如本文所用，“非靶等位基因变体”是指其产物由非靶细胞表达但不由靶细胞表达的基因的等位基因。例如，非靶等位基因变体是由受试者的正常非癌细胞表达，但不由受试者的癌细胞表达的基因的等位基因。非靶等位基因变体的表达可以通过任何机制在癌细胞中丢失，包括但不限于编码非靶等位基因变体的基因的杂合性丢失、突变或表观遗传修饰。

如本文所用，当关于配体结合结构域(如抗原结合结构域)使用时，“特异于”或“特异性结合于”是指对指定靶具有高特异性的配体结合结构域。抗体特异性可被视为配体结合结构域与相应配体之间的拟合优度，或配体结合结构域区分相似或甚至不相似配体的能力的量度。与特异性相比，亲和力是配体结合结构域与配体之间的结合强度的量度，使得低亲和力配体结合结构域结合微弱，而高亲和力配体结合结构域结合牢固。对靶等位基因特异性的配体结合结构域是能够区分基因的不同等位基因的配体结合结构域。例如，对HLA-A*02特异性的配体结合结构域将不结合，或仅微弱地结合其它HLA-A等位基因，如HLA-A*01或HLA-A*03。在本文所述的活化剂和抑制性受体的上下文中，配体结合结构域介导免疫细胞应答的特异性活化或抑制。本领域技术人员将理解，配体结合结构域可以被称为对特定靶是特异性的，并且仍然具有低水平的与一种或多种不影响其在本文所述的受体系统中的功能的额外靶的结合。

本文提及的所有出版物和专利通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及不是并且不应被视为承认或任何形式的暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。

活化剂受体

本公开提供了第一受体，其包含对靶抗原特异性的第一细胞外配体结合结构域，该靶抗原包含癌细胞特异性抗原或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。第一受体是活化剂受体，并且在第一受体的细胞外配体结合结构域结合靶抗原时介导表达第一受体的免疫细胞的活化。第一受体对靶抗原(即活化剂配体)有应答。例如，当靶抗原与第一受体结合或接触时，第一受体在第一受体的细胞外配体结合结构域结合靶抗原时响应并活化表达第一受体的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，第一受体是T细胞受体(TCR)。

在一些实施例中，第一受体是人源化的。如本文所用，“人源化”是指用同源或功能等同的人序列替换分离自或衍生自非人物种的转基因中的序列或亚序列。例如，人源化抗体可以通过将小鼠CDR移植到人构架序列中，随后用某些人构架残基回代来自源抗体的相应小鼠残基来产生。

活化剂靶

根据本公开，第一受体的靶抗原是表皮生长因子受体(EGFR)，或与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的EGFR的肽抗原。

主要组织相容性复合物I类(MHC-I)是向免疫系统细胞展示抗原、引发免疫应答的蛋白质复合物。对应于MHC-I的人白细胞抗原(HLA)是HLA-A、HLA-B和HLA-C。

包含HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G中任一种的癌细胞特异性pMHC抗原被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，癌细胞特异性抗原包含HLA-A。HLA-A受体是包含重α链和较小β链的异二聚体。α链由HLA-A的变体编码，而β链(β2-微球蛋白)是不变的。有几千个HLA-A基因变体，所有这些都落入本公开的范围内。在一些实施例中，MHC-I包含人白细胞抗原A*02等位基因(HLA-A*02)。

在一些实施例中，癌细胞特异性抗原包含HLA-B。HLA-B基因的数百种形式(等位基因)是已知的，其中每一种都被赋予特定的编号(如HLA-B27)。

在一些实施例中，癌细胞特异性抗原包含HLA-C。HLA-C属于HLA I类重链同种同源物。该I类分子是由重链和轻链(β-2微球蛋白)组成的异二聚体。本领域已知超过100种HLA-C等位基因。

在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是肺癌抗原、成胶质细胞瘤抗原、乳腺癌抗原、头颈癌抗原或结肠直肠癌抗原。在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是结肠直肠癌抗原。在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是EGFR或其肽抗原。

在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是EGFR或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原。EGFR是一种跨膜蛋白，其是细胞外蛋白配体的表皮生长因子(EGF)家族的受体形式成员。EGFR在正常组织(如间充质组织、上皮组织和神经元组织)中广泛表达，并且在细胞增殖、分化和发育中起重要作用。EGFR也在多种实体瘤中高度表达，并且EGFR表达与肿瘤进展、化疗耐药性和不良预后相关。

EGFR的所有同种型和EGFR的临床相关突变(例如EGFRvIII、S468/492R)被设想为本公开的癌细胞特异性抗原。EGFR同种型a描述于NCBI记录号NP_005219.2中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，EGFR包含以下氨基酸序列：

EGFR同种型b描述于NCBI记录号NP_958439.1中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，EGFR包含以下氨基酸序列：

的序列互补的序列。

EGFR同种型c描述于NCBI记录号NP_958440.1中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，EGFR包含以下氨基酸序列：

EGFR同种型d描述于NCBI记录号NP_958441.1中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，EGFR包含以下氨基酸序列：

的序列互补的序列。

EGFR同种型e描述于NCBI记录号NP_001333826.1中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，EGFR包含以下氨基酸序列：

EGFR同种型f描述于NCBI记录号NP_001333827.1中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，EGFR包含以下氨基酸序列：

EGFR同种型h描述于NCBI记录号NP_001333829.1中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，EGFR包含以下氨基酸序列：

的序列互补的序列。

EGFR同种型i描述于NCBI记录号NP_001333870.1中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，EGFR包含以下氨基酸序列：

在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是衍生自EGFR的肽抗原。在一些实施例中，肽抗原包含与SEQ ID NO:1-8中任一个的序列或亚序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，肽抗原包含与SEQ ID NO:1-8或SEQ ID NO:918-919中任一个的亚序列相同的序列。

细胞外配体结合结构域

本公开提供了第一受体，其包含对靶抗原特异性的第一细胞外配体结合结构域。在一些实施例中，靶抗原包含癌细胞特异性抗原。

在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是EGFR或与MHC-I复合的EGFR衍生的肽抗原，并且第一受体的配体结合结构域识别并结合EGFR抗原。在一些实施例中，癌细胞特异性抗原是临床相关的EGFR突变体。例如，EGFR的突变变体可以是取代突变(例如外显子21中的L858R)、缺失突变(例如外显子19或外显子23中的EGFRvIII或缺失)，或EGFR基因的扩增突变。

可以以配体依赖性方式调节受体活性的任何类型的配体结合结构域被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，配体结合结构域是抗原结合结构域。示例性抗原结合结构域尤其包括scFv、SdAb、仅Vβ结构域以及衍生自TCRα和β链可变结构域的TCR抗原结合结构域。

任何类型的抗原结合结构域都设想在本公开的范围内。

例如，第一细胞外配体结合结构域可以是连续多肽链的一部分，包括例如仅Vβ结构域、单结构域抗体片段(sdAb)或重链抗体HCAb、衍生自鼠、人源化或人抗体的单链抗体(scFv)(哈洛(Harlow)等人，1999，载于：《使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:ALaboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约；哈洛等人，1989，载于：《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港，纽约；休斯顿(Houston)等人，1988，《美国国家科学院院刊》85:5879-5883；伯德(Bird)等人，1988，《科学(Science)》242:423-426)。在一些方面，第一细胞外配体结合结构域包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含抗体片段。在进一步的方面，第一细胞外配体结合结构域包含抗体片段，该抗体片段包含scFv或sdAb。

本文所用的术语“抗体”是指衍生自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，其特异性结合抗原。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白或其片段，并且可以衍生自天然或重组来源。

术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指抗体或其重组变体的至少一个部分，其含有抗原结合结构域，即完整抗体的抗原性决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶(如抗原及其定义的表位)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、单链(sc)Fv(“scFv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(缩写为“sdAb”)(VL或VH)、骆驼科VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单个多肽链，并且其中scFv保留其来源的完整抗体的特异性。

关于抗体的“重链可变区”或“VH”(或在单结构域抗体的情况下，例如，纳米抗体，则为“VHH”)是指重链的片段，其含有插入在称为构架区的侧翼伸展之间的三个CDR，这些构架区通常比CDR更高度保守并且形成支架以支持CDR。

除非另有说明，否则本文所用的scFv可以具有任一顺序的VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N-末端和C-末端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。

在一些实施例中，活化剂和/或抑制性受体的抗原结合结构域包含scFv。在一些实施例中，scFv包含通过接头连接的VL和VH区。在一些实施例中，接头包含甘氨酸丝氨酸接头，例如GGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:136)。在一些实施例中，scFv进一步在scFv的N末端包含信号序列。示例性信号序列包括

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(SEQ ID NO:137)，其由

ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO:138)或

ATGGATATGAGAGTGCCTGCCCAGCTGCTCGGACTGCTCCTTCTGTGGTTGAGAGGAGCTCGGTGC(SEQ ID NO:917)编码。

术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中较小的一种。κ(“K”)和λ(“λ”)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应当被解释为是指通过合成编码抗体的DNA分子而生成的抗体，并且该DNA分子表达抗体蛋白，或特定于该抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域可获得且熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得的。

术语“Vβ结构域”、“仅Vβ结构域”、“β链可变结构域”或“单可变结构域TCR(svd-TCR)”是指基本上由单个T细胞受体(TCR)β可变结构域组成的抗原结合结构域，该单个T细胞受体(TCR)β可变结构域在不存在第二TCR可变结构域的情况下特异性结合抗原。仅Vβ结构域使用互补决定区(CDR)接合抗原。每个仅Vβ结构域含有三个补体决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。可以组合额外元件，条件是Vβ结构域被配置以在不存在第二TCR可变结构域的情况下结合表位。

在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)或β链可变结构域(Vβ)。

在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。

在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含scFv抗原结合结构域。示例性EGFR scFv示于下表1中。

表1.EGFR scFv结构域

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在一些实施例中，活化剂配体是EGFR或其肽抗原，并且活化剂配体结合结构域包含EGFR结合结构域。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含SEQ ID No:9-18中任一个的序列。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含与SEQ ID NO:9-18中任一个至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域由选自由表1中序列组成的组的序列编码。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域由与来自表1的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的序列编码。应当理解，本公开的结合EGFR的scFv结构域可以与EGFR的一个或多个变体交叉反应。例如，scFv可以结合正常EGFR、EGFR变体或突变EGFR(例如EGFRvIII)中的至少一种。

在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含与SEQ ID NO:9-18中任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的scFv抗原结合结构域。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含scfv抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:9-18中任一个的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域基本上由选自由SEQ ID NO:9-18组成的组的序列组成。

表2.EGFR可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域

在一些实施例中，活化剂配体是EGFR或其肽抗原，并且活化剂配体结合结构域包含EGFR配体结合结构域。在一些实施例中，EGFR结合结构域包含选自表2中公开的组的VH和/或VL结构域或与其具有至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:19-24组成的组的VH结构域。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:19-24组成的组的VH或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:25-30组成的组的VL结构域。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:25-30组成的组的VL或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。

表3.EGFR抗原结合结构域CDR。

在一些实施例中，活化剂配体是EGFR或其肽抗原，并且活化剂配体结合结构域是EGFR配体结合结构域。在一些实施例中，EGFR结合结构域包含选自表3中公开的CDR组的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含与表3中公开的CDR具有至少95％序列同一性的CDR。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含选自SEQ ID NO:31-65的CDR。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含重链CDR 1(CDR H1)，其选自由SEQ IDNO:31-36组成的组。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含重链CDR 2(CDR H2)，其选自由SEQ ID NO:37-42中任一个的序列。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含重链CDR 3(CDR H3)，其选自由SEQ ID NO:43-48中任一个的序列。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含轻链CDR 1(CDR L1)，其选自由SEQ ID NO:49-54组成的组。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含轻链CDR 2(CDR L2)，其选自由SEQ ID NO:55-59中任一个的序列。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含轻链CDR 3(CDR L3)，其选自由SEQ ID NO:60-65中任一个的序列。在一些实施例中，EGFR配体结合结构域包含选自SEQ ID NO:31-36的CDR H1、选自SEQ ID NO:37-42的CDR H2、选自SEQ ID NO:43-48的CDR H3、选自SEQ IDNO:49-54的CDR L1、选自SEQ ID NO:55-59的CDR L2，和选自SEQ ID NO:60-65的CDR L3。

在一些实施例中，本文提供的抗原结合结构域的CDR中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)氨基酸残基被另一个氨基酸取代。在同一氨基酸家族内的取代的意义上，该取代可以是“保守的”。天然存在的氨基酸可以分为以下四个家族，并且保守取代将在这些家族内发生：(1)具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(2)具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；(3)具有不带电荷的极性侧链的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；和(4)具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。通过添加、缺失或取代氨基酸来改变抗体CDR的氨基酸序列，可以获得各种效果，例如增加对靶抗原的结合亲和力。

嵌合抗原受体(CAR)

本公开提供了第一活化剂受体和包含其的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体。

在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:175，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:176，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:177，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

本文所用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”可以指衍生自T细胞受体的人工受体，并且包括将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程化受体。CAR可以用于赋予单克隆抗体对T细胞的特异性，从而允许生成大量的特异性T细胞，例如用于过继性细胞疗法。在具体的实施例中，CAR指导细胞对例如肿瘤相关抗原的特异性。示例性CAR包含细胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在一些实施例中，CAR进一步包含铰链结构域。在特定方面，CAR包含衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合体，其融合到CD3跨膜结构域和胞内结构域。其它CAR设计的特异性可以衍生自受体的配体(例如，肽)。在某些情况下，CAR包含用于额外共刺激信号传导的结构域，如CD3、4-1BB、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些情况下，分子可以与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像的报告基因、在添加前药后有条件地消融T细胞的基因产物、归巢受体、细胞因子和细胞因子受体。

在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域融合到CAR的细胞外结构域。

在一些实施例中，本公开的CAR包含细胞外铰链区。铰链区的掺入可能影响CAR-T细胞的细胞因子产生并改善CAR-T细胞的体内扩增。示例性的铰链可以分离自或衍生自IgD和CD8结构域，例如IgG1。在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。

在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。在一些实施例中，CD8α铰链包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:66)。在一些实施例中，CD8α铰链包含SEQ ID NO:66。在一些实施例中，CD8α铰链基本上由SEQ ID NO:66组成。在一些实施例中，CD8α铰链由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：

ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT(SEQ IDNO:67)。在一些实施例中，CD8α铰链由SEQ ID NO:67编码。

在一些实施例中，CD28铰链包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:68)。在一些实施例中，CD28铰链包含或基本上由SEQID NO:68组成。在一些实施例中，CD28铰链由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：

TGTACCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC(SEQ ID NO:69)。在一些实施例中，CD28铰链由SEQ ID NO:69编码。

本公开的CAR可以被设计成包含与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些实施例中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。例如，包含CD28共刺激结构域的CAR也可以使用CD28跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。

跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。当来源是天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区可以分离自或衍生自(即至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或免疫球蛋白(如IgG4)。替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个端发现。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选地长度为2至10个氨基酸，可以在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。

在本公开的CAR的一些实施例中，CAR包含CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:70)。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:70组成。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：

TTCTGGGTGCTGGTCGTTGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG(SEQ ID NO:71)。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由SEQ ID NO:71编码。

在本公开的CAR的一些实施例中，CAR包含IL-2Rβ跨膜结构域。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI(SEQ ID NO:72)。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:72组成。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：

ATTCCGTGGC TCGGCCACCT CCTCGTGGGC CTCAGCGGGG CTTTTGGCTT CATCATCTTAGTGTACTTGC TGATC(SEQ ID NO:73)。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域由SEQ ID NO:73编码。

本公开的CAR的细胞质结构域或其它细胞内信号传导结构域负责活化其中放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特定功能。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整链。在一些情况下，可以组合多个细胞内结构域以实现本公开的CAR-T细胞的期望功能。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的一个或多个细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

用于本公开的CAR中的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列，其在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。

因此，本公开的CAR的细胞内结构域包含至少一个细胞质活化结构域。在一些实施例中，细胞内活化结构域确保存在活化CAR T细胞的效应子功能所必需的T细胞受体(TCR)信号传导。在一些实施例中，至少一种细胞质活化是CD247分子(CD3ζ)活化结构域、刺激性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)KIR2DS2活化结构域，或12kDa的DNAX-活化蛋白(DAP12)活化结构域。

在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含或基本上由SEQ ID NO:74组成。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGCGTAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGACTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:75)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由SEQ ID NO:75编码。

已知单独通过TCR生成的信号通常不足以完全活化T细胞，也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的序列(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的序列(次级细胞质信号传导序列)。

初级细胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。在一些实施例中，ITAM含有通过任何两个其它氨基酸(YxxL/I)(SEQ ID NO:157)与亮氨酸或异亮氨酸分开的酪氨酸。在一些实施例中，细胞质结构域含有1、2、3、4或5个ITAM。含有细胞质结构域的示例性ITAM是CD3ζ活化结构域。可用于本公开的CAR中的含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的其它实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。

在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(SEQ ID NO:76)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含SEQ ID NO:76。在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域基本上由

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(SEQ ID NO:76)的氨基酸序列组成。在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：

AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGACGCC CCCGCGTACC AGCAGGGCCA GAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG GAGTACGATG TTTTGCACAT GCAGGCCCTG CCCCCTCGC(SEQ ID NO:77)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由SEQ ID NO:77编码。

在一些实施例中，CAR的细胞质结构域可以被设计为包含CD3ζ信号传导结构域本身或与在本公开的CAR的上下文中有用的任何其它期望的细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激结构域。共刺激结构域是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。此类分子的实例包括共刺激结构域，其选自由以下组成的组：IL-2Rβ、Fc受体γ(FcRγ)、Fc受体β(FcRβ)、CD3g分子γ(CD3γ)、CD3δ、CD3ε、CD5分子(CD5)、CD22分子(CD22)、CD79a分子(CD79a)、CD79b分子(CD79b)、癌胚抗原相关细胞粘附分子3(CD66d)、CD27分子(CD27)、CD28分子(CD28)、TNF受体超家族成员9(4-1BB)、TNF受体超家族成员4(OX40)、TNF受体超家族成员8(CD30)、CD40分子(CD40)、程序性细胞死亡1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2分子(CD2)、CD7分子(CD7)、TNF超家族成员14(LIGHT)、杀伤细胞凝集素样受体C2(NKG2C)和CD276分子(B7-H3)c-刺激结构域，或其功能片段。在一些实施例中，本公开的CAR的细胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域分离自或衍生自CD28。

在一些实施例中，本公开的CAR的细胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域分离自或衍生自CD28。在一些实施例中，CD28共刺激结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:78)。在一些实施例中，CD28共刺激结构域包含或基本上由SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：

AGGAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGAGGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCTCCCAGGGATTTCGCCGCCTACCGGAGC(SEQ ID NO:79)。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由SEQ ID NO:79编码。本公开的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适接头的实例。

在一些实施例中，共刺激结构域分离自或衍生自4-1BB。在一些实施例中，4-1BB共刺激结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:159)。在一些实施例中，4-1BB共刺激结构域包含或基本上由

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:159)组成。在一些实施例中，4-1BB共刺激结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或与其相同的核苷酸序列编码：aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgaggccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagct gccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg(SEQ ID NO:160)。

在一些实施例中，CAR的细胞内结构域包含CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ活化结构域。在一些实施例中，CAR的细胞内结构域包含序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:158)，或与其具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性的序列。

本公开的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适接头的实例。示例性接头包含序列GGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:136)。

本公开的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适接头的实例。

T细胞受体(TCR)

本公开提供了第一活化剂受体和包含其的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是T细胞受体(TCR)。

用于本公开的包含细胞内结构域的示例性TCR描述于2020年9月6日提交的PCT/US2020/045250中，其内容通过引用并入本文。

如本文所用，“TCR”(有时也称为“TCR复合物”或“TCR/CD3复合物”)是指包含TCRα链、TCRβ链和一种或多种不变CD3链(ζ、γ、δ和ε)(有时称为亚基)的蛋白质复合物。TCRα和β链可以是二硫键连接的，以作为异二聚体结合肽-MHC复合物。一旦TCRα/β异二聚体与肽-MHC结合，相关不变CD3亚基中TCR复合物的构象变化被诱导，这导致它们磷酸化并与下游蛋白质缔合，从而转导初级刺激信号。在示例性的TCR复合物中，TCRα和TCRβ多肽形成异二聚体，CD3ε和CD3δ形成异二聚体，CD3ε和CD3γ形成异二聚体，两个CD3ζ形成同二聚体。

任何合适的配体结合结构域可以融合到本文所述TCR的细胞外结构域、铰链结构域或跨膜。例如，配体结合结构域可以是抗体或TCR的抗原结合结构域，或包含抗体片段、仅Vβ结构域、线性抗体、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。

在一些实施例中，配体结合结构域融合到一个或多个TCR亚基的一个或多个细胞外结构域或跨膜结构域。TCR亚基可以是TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ或CD3ζ。例如，配体结合结构域可以融合到TCRα或TCRβ，或者配体结合的部分可以融合到两个亚基，例如配体结合结构域的部分可以融合到TCRα和TCRβ两者。

TCR亚基包括TCRα、TCRβ、CD3ζ、CD3δ、CD3γ和CD3ε。TCRα、TCRβ链、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ或其片段或衍生物中的任一种或多种可以融合到能够提供本公开的刺激信号的一个或多个结构域，从而增强TCR功能和活性。

从任何来源分离或衍生的TCR跨膜结构域被设想在本公开的范围内。跨膜结构域可以衍生自天然或重组来源。当来源是天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。

在一些实施例中，每当TCR复合物已经与靶结合时，跨膜结构域能够向细胞内结构域发送信号。本公开中具体使用的跨膜结构域可以至少包括例如TCR的α、β或ζ链、CD3δ、CD3ε或CD3γ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜区。

在一些实施例中，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附着于TCR多肽的细胞外区，例如TCRα或β链的抗原结合结构域。例如，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链或CD8a铰链。在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。

在一些实施例中，细胞外配体结合结构域附着于TCR的一个或多个跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRα跨膜结构域、TCRβ跨膜结构域或两者。在一些实施例中，跨膜包含CD3ζ跨膜结构域。

跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个额外的氨基酸，例如，与衍生跨膜的蛋白质的细胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多15个氨基酸)和/或与衍生跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区相关的一个或多个额外的氨基酸(例如，细胞内区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多15个氨基酸)。

在一些实施例中，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。

当存在时，跨膜结构域可以是天然TCR跨膜结构域、来自异源膜蛋白的天然跨膜结构域或人工跨膜结构域。跨膜结构域可以是膜锚定结构域。在没有限制的情况下，天然或人工跨膜结构域可以包含约20个氨基酸的疏水α-螺旋，通常在跨膜区段侧翼带有正电荷。跨膜结构域可以具有一个跨膜区段或多于一个跨膜区段。跨膜结构域/区段的预测可以使用公众可获得的预测工具(例如TMHMM，克罗格(Krogh)等人《分子生物学杂志(Journal ofMolecular Biology)》2001；305(3):567-580；或TMpred，霍夫曼(Hofmann)和施托费尔(Stoffel)《霍佩赛勒生物化学(Biol.Chem.Hoppe-Seyler)》1993；347:166)。膜锚定系统的非限制性实例包括血小板衍生生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚(翻译后添加到信号序列)等。

在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRα跨膜结构域。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW(SEQ ID NO:80)。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域由以下序列编码：

GTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGG(SEQ ID NO:81)。

在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRβ跨膜结构域。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或与其相同的氨基酸序列：TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO:82)。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含或基本上由SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域由以下序列编码：

ACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTG(SEQ ID NO:83)。

本公开的TCR可以包含一个或多个细胞内结构域。在一些实施例中，细胞内结构域包含一个或多个能够向跨膜结构域提供刺激信号的结构域。在一些实施例中，细胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一细胞内结构域和能够提供刺激信号的第二细胞内结构域。在其它实施例中，细胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一、第二和第三细胞内结构域。能够提供刺激信号的细胞内结构域选自由以下组成的组：CD28分子(CD28)结构域、LCK原癌基因、Src家族酪氨酸激酶(Lck)结构域、TNF受体超家族成员9(4-1BB)结构域、TNF受体超家族成员18(GITR)结构域、CD4分子(CD4)结构域、CD8a分子(CD8a)结构域、FYN原癌基因、Src家族酪氨酸激酶(Fyn)结构域、T细胞受体相关蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)结构域、用于活化T细胞的接头(LAT)结构域、淋巴细胞质蛋白2(SLP76)结构域、(TCR)α、TCRβ、CD3δ、CD3γ和CD3ε细胞内结构域。

在一些实施例中，细胞内结构域包含至少一个细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域生成促进细胞功能的信号，例如含有TCR的细胞(例如，表达TCR的T细胞)的免疫效应子功能。在一些实施例中，本公开的第一受体的细胞内结构域包括至少一个细胞内信号传导结构域。例如，CD3γ、δ或ε的细胞内结构域包含信号传导结构域。

在一些实施例中，细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域分离自或衍生自相同的蛋白质，例如T细胞受体(TCR)α、TCRβ、CD3δ、CD3γ、CD3ε或CD3ζ。

用于本公开的活化剂受体中的细胞内结构域的实例包括TCRα、TCRβ、CD3ζ和4-1BB的细胞质序列，以及在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导的细胞内信号传导共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。

在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域。示例性的初级细胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的蛋白质的结构域。

在一些实施例中，细胞内结构域包含CD3δ细胞内结构域、CD3ε细胞内结构域、CD3γ细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域、TCRα细胞内结构域或TCRβ细胞内结构域。

在一些实施例中，细胞内结构域包含TCRα细胞内结构域。在一些实施例中，TCRα细胞内结构域包含Ser-Ser。在一些实施例中，TCRα细胞内结构域由TCCAGC序列编码。

在一些实施例中，细胞内结构域包含TCRβ细胞内结构域。在一些实施例中，TCRβ细胞内结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性或与其相同的氨基酸序列：MAMVKRKDSR(SEQ ID NO:84)。在一些实施例中，TCRβ细胞内结构域包含或基本上由SEQID NO:84组成。在一些实施例中，TCRβ细胞内结构域由以下序列编码：

ATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGA(SEQ ID NO:85)。

在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含至少一个刺激性细胞内结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(如CD3δ、CD3γ和CD3ε细胞内结构域)和一个额外的刺激性细胞内结构域(如共刺激结构域)。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(如CD3δ、CD3γ和CD3ε细胞内结构域)和两个额外的刺激性细胞内结构域。

示例性的共刺激细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的蛋白质的结构域。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体，以及DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)4-1BB(CD137、TNF受体超家族成员9)和CD28分子(CD28)。共刺激蛋白可以由以下蛋白质家族表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化NK细胞受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、特异性结合CD83、CD4的配体等。共刺激结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分，或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能变体。

在一些实施例中，刺激结构域包含共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域包含CD28或4-1BB共刺激结构域。CD28和4-1BB是完全T细胞活化所需的且已知增强T细胞效应子功能的充分表征的共刺激分子。例如，CD28和4-1BB已经在嵌合抗原受体(CAR)中用于促进细胞因子释放、细胞溶解功能和持久性，优于仅含有CD3ζ信号传导结构域的第一代CAR。同样地，在TCR中包括共刺激结构域，例如CD28和4-1BB结构域，可以增加T细胞效应子功能，并在不存在共刺激配体的情况下特异性地允许共刺激，共刺激配体通常在肿瘤细胞表面上下调。在一些实施例中，刺激结构域包含CD28细胞内结构域或4-1BB细胞内结构域。

抑制性受体

本公开提供了第二受体，其包含对已经在癌细胞中丢失的非靶抗原(如基因的等位基因变体)特异性的细胞外配体结合结构域。非靶等位基因变体可以通过任何机制在癌细胞中丢失，例如但不限于影响非靶等位基因变体表达的表观遗传变化、编码非靶等位基因变体的基因的突变、调节非靶等位基因变体表达的细胞信号传导的破坏、染色体丢失、基因组基因座的部分或完全缺失、通过修饰核酸或异染色质的基因沉默，或通过其它机制的表达丢失。在本文公开的组合物和方法的变化形式中，治疗的细胞或受试者可能由于非遗传改变而表现出非靶等位基因变体的表达丢失。因此，本公开提供了用于杀死细胞和/或治疗因任何原因(包括但不限于杂合性丢失)而缺乏非靶抗原表达的受试者的组合物和方法。

非靶抗原可以是蛋白质或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽，其中非靶抗原包含多态性。因为非靶抗原是多态性的，所以编码非靶抗原的基因的单个拷贝的丢失(其可能通过癌细胞中杂合性的丢失而发生)产生保留基因的其它多态性变体但已经丢失了非靶抗原的癌细胞。例如，在HLA基因座具有HLA-A*02和HLA-A*01等位基因的受试者可能患有仅缺失HLA-A*02等位基因的癌症。在这样的受试者中，HLA-A*01蛋白仍然存在，但不被遇到癌细胞的免疫细胞的抑制性受体识别，因为抑制剂受体被设计成对HLA-A*02(或其它非靶抗原)特异性。在正常的非恶性细胞中，存在HLA-A*02(或其它非靶抗原)并抑制工程化免疫细胞的活化。在杂合性丢失的癌细胞中，HLA-A*02等位基因变体(或其它非靶抗原)丢失。被工程化以表达抑制性受体的免疫细胞不接收来自抑制性受体的抑制性信号，因为抑制性受体仅对癌细胞上不存在的HLA-A*02(或其它非靶抗原)有应答。通过这种机制，免疫细胞被选择性地活化，并选择性地杀死表达EGFR但由于杂合性丢失而丢失HLA-A*02(或另一种非靶抗原)的癌细胞。这里使用HLA-A作为实例。群体中其它MHC基因和其它非MHC基因也发生类似的多态性变异。因此，在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12、APCDD1或CXCL16或HLA-A*02的多态性变体。在一些实施例中，非靶抗原是HLA I类等位基因或次要组织相容性抗原(MiHA)。在一些实施例中，HLA I类等位基因包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E。在一些实施例中，HLA I类等位基因是HLA-A*02。在一些实施例中，HLA-A*02非靶抗原由受试者的健康细胞表达。在一些实施例中，非靶抗原是非靶等位基因变体。在一些实施例中，非靶抗原不在受试者的癌细胞中表达。在一些实施例中，非靶抗原不在受试者体内肿瘤中的一部分细胞中表达。在一些实施例中，受试者体内癌细胞已经缺失了非靶抗原的表达。细胞中非靶抗原表达的丢失或表达的缺乏可以通过任何机制实现，例如但不限于影响非靶基因表达的表观遗传变化、编码非靶抗原的基因的突变，或调节非靶基因表达的细胞信号传导的破坏。

在一些实施例中，第二受体是抑制性嵌合抗原受体(即抑制性受体)。在一些实施例中，第二受体是抑制性受体。在一些实施例中，第二受体是人源化的。

在一些实施例中，第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，174或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

本公开提供了第二受体，其为抑制性受体，包含能够区分非靶抗原的单个氨基酸变体等位基因的细胞外配体结合。这种区分非靶抗原的等位基因变体的能力允许第二受体在表达由配体结合结构域识别的等位基因的非靶细胞存在下抑制包含第二受体的免疫细胞的活化。然而，在丢失等位基因的靶细胞(例如通过杂合性丢失而丢失基因的一个等位基因的癌细胞)的存在下，不抑制免疫细胞的活化。

本公开提供了第二受体，其为抑制性受体，包含能够区分非靶抗原的不同表达水平的细胞外配体结合。这允许第二受体在表达第二受体配体的非靶细胞存在下抑制包含第二受体的免疫细胞的活化，但允许免疫细胞在表达低水平或不表达第二受体配体的癌细胞存在下活化。

抑制剂配体

在一些实施例中，非靶抗原不由靶细胞表达，而由非靶细胞表达。在一些实施例中，非靶抗原由健康细胞，即不是癌细胞的细胞表达。在一些实施例中，靶细胞是通过杂合性丢失(LOH)而缺失非靶抗原表达的多种癌细胞。在一些实施例中，非靶细胞是表达靶抗原和非靶抗原两者的多个健康细胞(即，非癌、正常或健康细胞)。

非靶细胞表达但靶细胞不表达的任何细胞表面分子可以是第二受体细胞外配体结合结构域的合适的非靶抗原。例如，细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、细胞外结构域、涉及趋化性的分子、糖蛋白、G蛋白偶联受体、跨膜、神经递质受体或电压门控离子通道可用作非靶抗原。

在一些实施例中，靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。

在一些实施例中，非靶抗原由于杂合性丢失而在癌细胞中丢失。由于杂合性丢失而在癌细胞中丢失的示例性非靶抗原包括COLEC12、APCDD1、CXCL16和HLA-A*02。在一些实施例中，非靶抗原选自由COLEC12、APCDD1和CXCL166的多态性变体或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原或HLA-A*02组成的组。在一些实施例中，非靶抗原是包含与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的COLEC12、APCDD1和CXCL16的多态性残基的抗原肽。

包含HLA-A、HLA-B或HLA-C中的任一种的非靶MHC-1(MHC)抗原被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A。在一些实施例中，非靶抗原包含人白细胞抗原A*02等位基因产物(HLA-A*02)。在一些实施例中，非靶抗原包含人白细胞抗原A*69。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02。

在一些实施例中，非靶抗原包含C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人CXCL16前体描述于NCBI记录号NP_001094282.1，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，CXCL16包含以下氨基酸序列：

在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自CXCL16的肽，其包含CXCL16的多态性残基。CXCL16的多态性残基包括SEQ ID NO:86的第142和200位。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸142或200。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:86的氨基酸200处包含A。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:86的氨基酸200处包含V。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:86的氨基酸142处包含I。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:86的氨基酸142处包含T。

在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的多态性。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:86的氨基酸200处包含A并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:86的第200位处具有A的CXCL16配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:86的第200位处具有V的CXCL16配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:86的氨基酸200处包含V并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:86的第200位处具有V的CXCL16配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:86的第200位处具有A的CXCL16配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:86的氨基酸142处包含I并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:86的第142位处具有I的CXCL16配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:86的第142位处具有T的CXCL16配体的亲和力。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:86的氨基酸142处包含T并且第二受体包含配体结合结构域，其对在SEQ ID NO:86的第142位处具有T的CXCL16配体的亲和力高于对在SEQ ID NO:86的第142位处具有I的CXCL16配体的亲和力。

在一些实施例中，非靶抗原包含集合素亚家族成员12(COLEC12)或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。人COLEC12描述于NCBI记录号NP_569057.2中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，COLEC12包含以下氨基酸序列：

在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的多态性。例如，非靶抗原包含衍生自COLEC12的肽，其包含COLEC12的多态性残基。COLEC12的多态性残基包括SEQ ID NO:87的第522位。在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的肽，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸522。在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的肽，其在SEQ ID NO:87的氨基酸522处包含S。在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的肽，其在SEQ ID NO:87的氨基酸522处包含P。

在一些实施例中，非靶抗原包含APC下调1(APCDD1)或其与MHC-I的复合物中的抗原肽。示例性的人APCDD1描述于UniProtKB记录号Q8J025中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，APCDD1包含以下氨基酸序列：

在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的多态性。APCDD1的示例性多态性包括rs3748415，其可以是SEQ ID NO:88的第150位处的V、I或L。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸150。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:88的氨基酸150处包含V。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:88的氨基酸150处包含I。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:88的氨基酸150处包含L。

另一示例性的人APCDD1描述于UniProtKB记录号V9GY82中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，APCDD1包含以下氨基酸序列：

APCDD1的示例性多态性包括rs1786683，其可以是SEQ ID NO:133的第165位处的Y或S。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸165。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:134的氨基酸165处包含Y。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:134的氨基酸165处包含S。

另一示例性的人APCDD1描述于UniProt记录号J3QSE3中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，APCDD1包含以下氨基酸序列：

APCDD1的示例性多态性包括rs9952598，其可以是SEQ ID NO:135的第28位处的Q或R。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其包含SEQ ID NO:135的氨基酸28。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:135的氨基酸28处包含Q。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:135的氨基酸28处包含R。

在一些实施例中，APCDD1包含与SEQ ID NO:88或134-135中的任一个共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少94％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。APCDD1的多态性残基在SEQ ID NO:88或134-135中标记为粗体和下划线。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02。本领域已知的或本文公开的结合并识别HLA-A*02的各种单一可变结构域适用于实施例中。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B*07。本领域已知的或本文公开的结合并识别HLA-B*07的各种单一可变结构域适用于实施例中。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11。本领域已知的或本文公开的结合并识别HLA-A*11的各种单一可变结构域适用于实施例中。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01。本领域已知的或本文公开的结合并识别HLA-A*01的各种单一可变结构域适用于实施例中。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*03。本领域已知的或本文公开的结合并识别HLA-A*03的各种单一可变结构域适用于实施例中。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C*07。本领域已知的或本文公开的结合并识别HLA-C*07的各种单一可变结构域适用于实施例中。

此类scFv包括，例如但不限于，以下小鼠和人源化scFv抗体，其以下表4中所示的非肽依赖性方式结合非靶抗原(例如HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07)(其中指示了加下划线的互补决定区)：

表4.scFv结合结构域

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非靶配体结合结构域的示例性重链和轻链CDR(分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)示于下表5中。

表5.对应于抗原结合结构域的CDR

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在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*02配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*02的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*02。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含SEQ ID NO:89-100中任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含与SEQ ID NO:89-100中任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。

在一些实施例中，HLA-A*02scFv包含SEQ ID NO:101-112中任一个的互补性决定区(CDR)。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:101-112中任一个至少95％相同的序列。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:101-112中任一个相同的序列。在一些实施例中，抗原结合结构域的重链包含SEQ ID NO:101-112中任一个的重链CDR，并且其中抗原结合结构域的轻链包含SEQ ID NO:101-112中任一个的轻链CDR。在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含重链和轻链，并且重链包含选自SEQ ID NO:104-106和110-112的CDR，并且轻链包含选自SEQ ID NO:101-103和107-109的CDR。在任何配体结合结构域的进一步实施例中，每个CDR序列可以具有1、2、3或更多个取代、插入或缺失。CDR序列可以容许取代、缺失或插入。使用序列比对工具、常规实验和已知测定，本领域技术人员可以生成和测试在CDR序列中具有1、2、3或更多个取代、插入或缺失的变体序列，而无需过度实验。

在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含重链和轻链，并且重链包含与SEQID NO:89-100中任一个的重链部分至少95％相同的序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:89-100中任一个的轻链部分至少95％相同的序列。

在一些实施例中，重链包含与SEQ ID NO:89-100中任一个的重链部分相同的序列，并且其中轻链包含与SEQ ID NO:89-100中任一个的轻链部分相同的序列。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B*07，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-B*07配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-B*07的pMHC复合物中的肽结合HLA-B*07。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含表4中所示B7结合结构域中任一个的序列。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含与表4中所示HLA-B*07结合结构域中任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-B*07scFv包含表5中所示HLA-B*07互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-B*07scFv序列中任一个至少95％相同的序列。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-B*07scFv序列中任一个相同的序列。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*11配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*11的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*11。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含表4中所示HLA-A*11结合结构域中任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含与表4中所示HLA-A*11结合结构域中任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*11scFv包含表5中所示HLA-A*11互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-A*11scFv序列中任一个至少95％相同的序列。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-A*11scFv序列中任一个相同的序列。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*01配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*01的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*01。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含表4中所示HLA-A*01结合结构域中任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含与表4中所示HLA-A*01结合结构域中任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*01scFv包含表5中所示HLA-A*01互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-A*01scFv序列中任一个至少95％相同的序列。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-A*01scFv序列中任一个相同的序列。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*03，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*03配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*03的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*03。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含表4中所示HLA-A*03结合结构域中任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含与表4中所示HLA-A*03结合结构域中任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-A*03scFv包含表5中所示HLA-A*03互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-A*03scFv序列中任一个至少95％相同的序列。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-A*03scFv序列中任一个相同的序列。

在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C*07，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-C*07配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-C*07的pMHC复合物中的肽结合HLA-C*07。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含表4中所示HLA-C*07结合结构域中任一个的序列。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含与表4中所示HLA-C*07结合结构域中任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，HLA-C*07scFv包含表5中所示HLA-C*07互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-C*07scFv序列中任一个至少95％相同的序列。在一些实施例中，scFv包含与表4中所示HLA-C*07scFv序列中任一个相同的序列。

抑制性受体

本公开提供了作为抑制性嵌合抗原受体(即抑制性受体)的第二受体。抑制性受体可以包含细胞外配体结合结构域，其结合并识别MHC-I复合物中的非靶抗原或其肽衍生物。

示例性的抑制性受体描述于2020年9月6日提交的PCT/US2020/045228、2020年12月11日提交的PCT/US2020/064607、2021年4月29日提交的PCT/US2021/029907和2020年11月10日提交的PCT/US2020/059856中，其各自的内容通过引用并入本文。

非靶抗原可以是非靶等位基因变体。本文所用的“非靶等位基因变体”是指等位基因(例如MHC I类基因的等位基因变体)，其在靶细胞(例如癌细胞)中的表达由于杂合性丢失或表达丢失的另一机制而降低或消除，但在正常或健康细胞中表达或可检测地表达。

本文所用的术语“抑制性嵌合抗原受体”或“抑制性受体”是指与能够转导抑制或阻抑免疫细胞的免疫活性的抑制性信号的细胞内信号传导结构域融合的抗原结合结构域。抑制性受体具有免疫细胞抑制潜能，并且与具有免疫细胞活化潜能的受体CAR不同且可区分。例如，CAR是活化受体，因为它们包括细胞内刺激和/或共刺激结构域。抑制性受体是含有细胞内抑制性结构域的抑制受体。

本文所用的“抑制性信号”是指导致免疫应答阻抑(例如，细胞因子产生减少或免疫细胞活化减少)的信号转导或免疫细胞中蛋白质表达的变化。抑制或阻抑免疫细胞可以是选择性的和/或可逆的，或者不是选择性的和/或可逆的。抑制性受体对非靶抗原(例如HLA-A*02)有应答。例如，当非靶抗原(例如HLA-A*02)结合或接触抑制性受体时，抑制性受体响应于非靶抗原与抑制性受体的细胞外配体结合结构域的结合而活化表达抑制性受体的免疫细胞中的抑制性信号。

本公开的抑制性受体可以包含细胞外配体结合结构域。可以以配体依赖性方式调节受体活性的任何类型的配体结合结构域被设想在本公开的范围内。

在一些实施例中，配体结合结构域是抗原结合结构域。示例性抗原结合结构域尤其包括scFv、SdAb、仅Vβ结构域以及衍生自TCRα和β链可变结构域的TCR抗原结合结构域。

任何类型的抗原结合结构域都设想在本公开的范围内。

在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域结合并识别COLEC12、APCDD1、CXCL16的多态性变体或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽，或HLA-A*02。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域是scFv。

在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域融合到抑制性受体的细胞外结构域。

在一些实施例中，本公开的抑制性受体包含细胞外铰链区。示例性的铰链可以分离自或衍生自IgD和CD8结构域，例如IgG1。在一些实施例中，铰链分离自或衍生自CD8α或CD28。

本公开的抑制性受体可以被设计成包含与抑制性受体的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。

跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。当来源是天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区可以分离自或衍生自(即至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或免疫球蛋白(如IgG4)。替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个端发现。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选地长度为2至10个氨基酸，可以在抑制性受体的跨膜结构域和细胞内结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。

本公开提供了包含细胞内结构域的抑制性受体。本公开的抑制性受体的细胞内结构域负责抑制包含抑制性受体的免疫细胞的活化，否则其将响应于第一受体的活化信号而被活化。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。在一些实施例中，包含ITIM的抑制性细胞内结构域可以分离自或衍生自免疫检查点抑制剂，如CTLA-4和PD-1。CTLA-4和PD-1是在T细胞表面表达的免疫抑制性受体，并且在减弱或终止T细胞应答中起关键作用。

在一些实施例中，抑制性细胞内结构域分离自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体和CD200受体1。在一些实施例中，TRAIL受体包括TR10A、TR10B或TR10D。

在一些实施例中，抑制性细胞内结构域分离自具有鞘糖脂微结构域1(PAG1)的磷蛋白膜锚。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域分离自白细胞免疫球蛋白样受体B1(LILRB1)。

在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白，例如人TRAIL受体、CTLA-4、PD-1、PAG1或LILRB1蛋白。

在一些实施例中，抑制性结构域包含细胞内结构域、跨膜结构域或其组合。在一些实施例中，抑制性结构域包含细胞内结构域、跨膜结构域、铰链区或其组合。

在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长细胞质尾2(KIR3DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长细胞质尾3(KIR3DL3)、白细胞免疫球蛋白样受体B1(LIR1，也称为LIR-1和LILRB1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、Fcγ受体IIB(FcgRIIB)、杀伤细胞凝集素样受体K1(NKG2D)、CTLA-4、含有合成共有区ITIM的结构域、ZAP70 SH2结构域(例如，N和C末端SH2结构域中的一者或两者)，或ZAP70 KI_K369A(激酶失活ZAP70)。

在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白质。

在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性结构域。在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性细胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到抑制性受体的细胞内结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到抑制性受体的跨膜结构域。

在一些实施例中，第二抑制性受体包含细胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域或其分离自或衍生自相同蛋白质(例如含ITIM的蛋白质)的部分。在一些实施例中，第二抑制性受体包含铰链区，其分离自或衍生自与细胞内结构域和/或跨膜结构域相同的蛋白质，例如含ITIM的蛋白质。

在一些实施例中，第二受体是包含抑制性结构域的TCR(抑制性TCR)。在一些实施例中，抑制性TCR包含抑制性细胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3γ或CD3ε或其一部分TCR的细胞内结构域。在一些实施例中，抑制性细胞内结构域融合到TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3γ或CD3ε的跨膜结构域。

在一些实施例中，第二受体是包含抑制性结构域的TCR(抑制性TCR)。在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自LILRB1。

LILRB1抑制性受体

本公开提供了包含LILRB1抑制性结构域和任选的LILRB1跨膜和/或铰链结构域或其功能变体的第二抑制性受体。与具有另一个跨膜结构域或另一个铰链结构域的参照抑制性受体相比，在抑制性受体中包括LILRB1跨膜结构域和/或LILRB1铰链结构域可以增加由抑制性受体生成的抑制性信号。包含LILRB1抑制性结构域的第二抑制性受体可以是CAR或TCR，如本文所述。如本文所述，任何合适的配体结合结构域可以融合到基于LILRB1的第二抑制性受体。

白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LILRB1)，也称为白细胞免疫球蛋白样受体B1，以及ILT2、LIR1、MIR7、PIRB、CD85J、ILT-2、LIR-1、MIR-7和PIR-B，是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员。LILRB1蛋白属于LIR受体的亚家族B类。这些受体含有两至四个细胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和两至四个基于细胞质免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。LILRB1受体在免疫细胞上表达，其中它结合抗原呈递细胞上的MHC I类分子并转导抑制免疫应答刺激的负信号。LILRB1被认为调节炎症应答以及细胞毒性，并且在限制自身反应性中发挥作用。存在编码LILRB1的不同同种型的多种转录物变体，所有这些都被认为在本公开的范围内。

在本文所述的抑制性受体的一些实施例中，抑制性受体包含一个或多个分离自或衍生自LILRB1的结构域。在具有分离自或衍生自LILRB1的一个或多个结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域包含与SEQ ID NO:113的序列或亚序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或相同的氨基酸序列。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域包含与SEQ ID NO:113的序列或亚序列相同的氨基酸序列。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:113的序列或亚序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:113的序列或亚序列相同的氨基酸序列组成。

在具有分离自或衍生自LILRB1的一个或多个结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与以下序列或亚序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同的多核苷酸序列编码：

在具有LILRB1的一个或多个结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:114的序列或亚序列相同的多核苷酸序列编码。

在各种实施例中，提供了包含多肽的抑制性受体，其中多肽包含以下中的一种或多种：LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体；LILRB1跨膜结构域或其功能变体；和LILRB1细胞内结构域或包含至少一个或至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内结构域，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

本文所用的“基于免疫受体酪氨酸的抑制基序”或“ITIM”是指具有S/I/V/LxYxxI/V/L(SEQ ID NO:423)等共有序列的保守氨基酸序列，其存在于免疫系统的许多抑制性受体的细胞质尾。在具有ITIM的抑制性受体与其配体相互作用后，ITIM基序被磷酸化，使抑制性受体募集其它酶，如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，或称为SHIP的肌醇磷酸酶。

在一些实施例中，多肽包含细胞内结构域，其包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)、至少两个ITIM、至少3个ITIM、至少4个ITIM、至少5个ITIM或至少6个ITIM。在一些实施例中，细胞内结构域具有1、2、3、4、5或6个ITIM。

在一些实施例中，多肽包含细胞内结构域，其包含至少一个选自由以下组成的组的ITIM：由NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)组成的ITIM。

在进一步的具体实施例中，多肽包含细胞内结构域，其包含至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

在一些实施例中，细胞内结构域包含两个ITIM，即NLYAAV(SEQ ID NO:115)和VTYAEV(SEQ ID NO:116)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:119至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:119相同的序列组成。

在一些实施例中，细胞内结构域包含两个ITIM，即VTYAEV(SEQ ID NO:116)和VTYAQL(SEQ ID NO:117)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:120至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:120相同的序列组成。

在一些实施例中，细胞内结构域包含两个ITIM，即VTYAQL(SEQ ID NO:117)和SIYATL(SEQ ID NO:118)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:121至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:121相同的序列组成。

在一些实施例中，细胞内结构域包含以下ITIM：NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)，和VTYAQL(SEQ ID NO:117)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQID NO:122至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ IDNO:122相同的序列组成。

在一些实施例中，细胞内结构域包含以下ITIM：VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。在一些实施例中，细胞内结构域包含与SEQID NO:123至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ IDNO:123相同的序列组成。

在一些实施例中，细胞内结构域包含以下ITIM：NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。在实施例中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:124至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与SEQ ID NO:124相同的序列组成。

在一些实施例中，细胞内结构域包含与LILRB1细胞内结构域(SEQ ID NO:129)至少95％相同的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含或基本上由与LILRB1细胞内结构域(SEQ ID NO:129)相同的序列组成。

本公开的LILRB1细胞内结构域或其功能变体可以具有至少1个、至少2个、至少4个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个ITIM。在一些实施例中，LILRB1细胞内结构域或其功能变体具有2、3、4、5或6个ITIM。

在具体的实施例中，细胞内结构域包含两个、三个、四个、五个或六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

在具体的实施例中，细胞内结构域包含至少三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

在具体的实施例中，细胞内结构域包含三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

在具体的实施例中，细胞内结构域包含四个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

在具体的实施例中，细胞内结构域包含五个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

在具体的实施例中，细胞内结构域包含六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

在具体的实施例中，细胞内结构域包含至少七个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

LILRB1蛋白具有称为D1、D2、D3和D4的四个免疫球蛋白(Ig)样结构域。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含LILRB1 D3D4结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1D3D4结构域包含与SEQ ID NO:125至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，LILRB1 D3D4结构域包含或基本上由SEQ ID NO:125组成。

在一些实施例中，多肽包含LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体。在实施例中，LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体包含与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:125或SEQ IDNO:126至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或与其相同的序列。在实施例中，LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体包含与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:125或SEQID NO:126至少95％相同的序列。

在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:125或SEQID NO:126相同的序列。

在一些实施例中，LILRB1铰链结构域基本上由与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126相同的序列组成。

在一些实施例中，跨膜结构域是LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:133至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:133至少95％相同的序列。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域包含与SEQ ID NO:133相同的序列。在实施例中，LILRB1跨膜结构域基本上由与SEQ IDNO:133相同的序列组成。

在一些实施例中，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附着于第二抑制性受体的细胞外区，例如抗原结合结构域或配体结合结构域。例如，在一些实施例中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链、CD8a铰链或LILRB1铰链。

在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性结构域。在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性细胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性结构域分离自或衍生自LILR1B。

包含LILRB1结构域组合的抑制性受体

在一些实施例中，本公开的基于LILRB1的抑制性受体包含多于一个LILRB1结构域或其功能等效物。例如，在一些实施例中，抑制性受体包含LILRB1跨膜结构域和细胞内结构域，或LILRB1铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。

在具体的实施例中，抑制性受体包含LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体，和LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:127至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或与其相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:127至少95％相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:127相同的序列。

在进一步的实施例中，抑制性受体包含：LILRB1跨膜结构域或其功能变体，以及LILRB1细胞内结构域和/或包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内结构域，其中ITIM选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ IDNO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。在一些实施例中，多肽包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体，以及LILRB1细胞内结构域和/或包含至少两个ITIM的细胞内结构域，其中每个ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:115)、VTYAEV(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

在一些实施例中，抑制性受体包含LILRB1跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:128至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或与其相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:128至少95％相同的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:128相同的序列。

在优选的实施例中，抑制性受体包含：LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体；LILRB1跨膜结构域或其功能变体；以及LILRB1细胞内结构域和/或包含至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内结构域，其中每个ITIM独立地选自LYAAV(SEQ IDNO:115)、VTYAE(SEQ ID NO:116)、VTYAQL(SEQ ID NO:117)，和SIYATL(SEQ ID NO:118)。

在一些实施例中，抑制性受体包含与SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131至少95％相同，或与SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131至少99％相同，或与SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131相同的序列。

在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:127至少99％相同，或与SEQ ID NO:127至少99％相同，或与SEQ ID NO:127相同的序列。

在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:128至少99％相同，或与SEQ ID NO:128至少99％相同，或与SEQ ID NO:128相同的序列。

表6.示例性的基于LILRB1的抑制性受体的多肽序列

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多核苷酸和载体

本公开提供了包含编码本公开的第一受体和第二受体的序列的序列的多核苷酸或多核苷酸系统。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统进一步包含本文所述的shRNA。本公开提供了包含本文所述的多核苷酸或多核苷酸系统的载体。本公开提供了包含本文所述的多核苷酸和载体的免疫细胞。

在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:180，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:181，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:182，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:183，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:184，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:185，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:187，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:189，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:191，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:193，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，第一受体和/或第二受体的序列可操作地连接到启动子。在一些实施例中，编码第一受体的序列可操作地连接到第一启动子，编码第二受体的序列可操作地连接到第二启动子。

本公开提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。

在一些实施例中，第一受体由第一载体编码，第二受体由第二载体编码。在一些实施例中，两种受体均由单一载体编码。

在一些实施例中，第一受体和第二受体由单一载体编码。使用单一载体编码多种多肽的方法是本领域普通技术人员已知的，尤其包括在不同启动子控制下编码多种多肽，或者如果使用单个启动子控制多种多肽的转录，使用编码内部核糖体进入位点(IRES)和/或自切割肽的序列。示例性的自切割肽包括T2A、P2A、E2A和F2A自切割肽。在一些实施例中，T2A自切割肽包含序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:430)。在一些实施例中，P2A自切割肽包含序列ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:431)。在一些实施例中，E2A自切割肽包含序列QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:432)。在一些实施例中，F2A自切割肽包含序列VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:433)。在一些实施例中，T2A自切割肽包含序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:430)。前述任一项也可以包括N末端GSG接头。例如，T2A自切割肽也可以包含序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:178)，其可以由序列GGATCCGGAGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACC CTGGCCCC(SEQ ID NO:434)编码。

在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:180，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:181，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:182，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:183，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ IDNO:184，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:185，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:187，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:189，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:191，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ IDNO:193，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:186的多肽序列，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:188的多肽序列，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:190的多肽序列，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:192的多肽序列，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:194的多肽序列，或与其共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，载体是表达载体，即用于在合适的细胞中表达第一受体和/或第二受体。

衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体比衍生自肿瘤逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。

编码受体的天然或合成核酸的表达通常通过将编码受体或其部分的核酸可操作地连接到启动子上，并将构建体整合到表达载体中来实现。载体可适用于真核生物的复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调控所需核酸序列表达的启动子。

编码受体的多核苷酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，可以将多核苷酸克隆到载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞，如免疫细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并描述于例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人(2001，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，纽约冷泉港实验室)和其它病毒学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个选择性标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。

已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。典型地，它们位于起始位点上游的30至110碱基对(bp)区域，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加到相隔50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用以活化转录。

合适启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延长生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、U6启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本公开不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本公开的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要这样的表达时，该分子开关能够开启与其可操作连接的多核苷酸序列的表达，或当不需要表达时，该分子开关能够关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估受体的表达，待引入细胞的表达载体也可以含有选择性标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择性标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择性标记和报告基因都可以与合适的调节序列侧接，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。

报告基因用于鉴定可能转染或转导的细胞，并用于评估调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，其编码的多肽的表达通过一些容易检测的特性(例如，酶活性)来证明。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，可以使用已知技术制备或商购获得。通常，具有显示最高水平的报告基因表达的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。

向细胞中引入和表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物方法将表达载体转移到宿主细胞中。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，萨姆布鲁克等人(2001，《分子克隆：实验室手册》，纽约冷泉港实验室)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来鉴定落入本公开范围内的试剂。

免疫细胞

本公开提供了包含本文所述的受体、载体和多核苷酸的免疫细胞。

在一些实施例中，免疫细胞包含：(a)第一受体，其包含对选自以下的靶抗原特异性的第一细胞外配体结合结构域：(i)癌细胞特异性抗原或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或(ii)EGFR或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；和(b)第二受体，其包含对非靶抗原特异性的第二细胞外配体结合，该非靶抗原的表达由于杂合性丢失或其它机制而从癌细胞缺失。在一些实施例中，非靶抗原选自CXCL16、COLEC12和APCDD1、HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07、HLA-C*07或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽。在一些实施例中，非靶抗原是HLA-A*02或其等位基因变体。在一些实施例中，第一受体是CAR或TCR。在一些实施例中，第二受体是抑制性受体。

在一些实施例中，免疫细胞包含shRNA。在一些实施例中，shRNA降低或消除B2M的表达。在一些实施例中，shRNA降低或消除HLA-A*02的表达。

在一些实施例中，免疫细胞包含对MHC I类基因或B2M基因的修饰。在一些实施例中，MHC I类基因是HLA-A*02或其等位基因变体。在一些实施例中，修饰降低或消除MHC I类基因或B2M基因的表达。

在一些实施例中，免疫细胞包含本文所述的多核苷酸或多核苷酸系统。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码本文所述的第一受体的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码本文所述的第二受体的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统编码本文所述的shRNA。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码本文所述的第一受体和本文所述的第二受体的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码本文所述的第一受体、本文所述的第二受体和本文所述的shRNA的序列。

如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与先天或适应性(获得性)免疫系统的细胞。示例性的先天免疫细胞包括吞噬细胞(如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)、自然杀伤(NK)细胞、多形核白细胞(如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，以及单核细胞(如单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞)。在获得性免疫中起作用的免疫细胞包括淋巴细胞，如T细胞和B细胞。

在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:177，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:174或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:177，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:175，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:174，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:175，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:176，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:176，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；并且第二受体包含SEQ ID NO:174，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，免疫细胞进一步包含T2A自切割肽，其中T2A自切割肽包含SEQID NO:178，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

在一些实施例中，免疫细胞进一步包含干扰RNA，其中干扰RNA包含SEQ ID NO:179，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

如本文所用，“T细胞”是指一种来源于在胸腺中发育的骨髓前体的淋巴细胞类型。存在几种不同类型的在迁移至胸腺时发育的T细胞，其包括辅助性CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、记忆性T细胞、调节性CD4+T细胞、NK T细胞、γδT细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞和干记忆性T细胞。不同类型的T细胞可以由普通技术人员基于其标记的表达来区分。区分T细胞类型的方法对于普通技术人员来说是显而易见的。

在一些实施例中，免疫细胞选自由T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞组成的组。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是B细胞。在一些实施例中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，免疫细胞是CD8-。在一些实施例中，免疫细胞是CD8+。在一些实施例中，免疫细胞是CD4+。在一些实施例中，免疫细胞是CD4-。在一些实施例中，免疫细胞是CD8-/CD4+。在一些实施例中，免疫细胞是CD8+CD4-T细胞。

在一些实施例中，免疫细胞是γδ(γδ)T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是不变T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是不变的自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。

在一些实施例中，第一受体和第二受体在靶细胞存在下一起特异性活化免疫细胞。

在一些实施例中，免疫细胞是非天然的。在一些实施例中，免疫细胞是分离的。

用本公开的载体转化免疫细胞群体(如T细胞)的方法对本领域普通技术人员来说是显而易见的。例如，CD3+T细胞可以使用CD3+T细胞阴性分离试剂盒(美天旎公司(Miltenyi))根据制造商的说明书从PBMC中分离。在CD3/28Dynabead(1:1细胞与珠比)和300单位/mL的IL-2(美天旎公司)存在下，在补充有5％人A/B血清和1％ Pen/strep的X-Vivo 15培养基中以1x 10^6个细胞/mL的密度培养T细胞。2天后，可以使用本领域已知的方法用病毒载体(如慢病毒载体)转导T细胞。在一些实施例中，病毒载体以5的感染复数(MOI)转导。然后在富集前将细胞在IL-2或其它细胞因子(如IL-7/15/21的组合)中再培养5天。分离和培养其它免疫细胞群体(如B细胞或其它T细胞群体)的方法对本领域普通技术人员来说是显而易见的。尽管该方法概述了潜在的方法，但是应当注意，这些方法正在快速发展。例如，外周血单核细胞的优异病毒转导可以在生长5天后实现，以生成>99％的CD3+高度转导的细胞群体。

活化和培养包含TCR、CAR、抑制性受体、受体或编码其的载体的T细胞群体的方法对于本领域普通技术人员将是显而易见的。

无论是在对T细胞进行遗传修饰以表达TCR之前还是之后，通常都可以使用例如在美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号、第10040846号；和美国专利申请公开2006/0121005号中描述的方法活化和扩增T细胞。

在一些实施例中，本公开的T细胞在体外扩增和活化。通常，本公开的T细胞通过与表面接触而在体外扩增，表面附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群体，例如通过与抗CD3抗体接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群体可以在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松Diaclone公司)，可以使用本领域公知的其它方法(伯格(Berg)等人，《移植学会会报(Transplant Proc.)》30(8):3975-3977，1998；哈恩(Haanen)等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》190(9):13191328，1999；加兰(Garland)等人，《免疫学方法杂志(J.Immunol Meth.)》227(1-2):53-63，1999)。

在一些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，试剂可以与同一表面偶联(即，以“顺式”形式)或与不同的表面偶联(即，以“反式”形式)。替代地，一种试剂可以与表面偶联，另一种试剂在溶液中。在一些实施例中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，提供初级活化信号的试剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种试剂都可以在溶液中。在另一实施例中，试剂可以是可溶形式，然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或抗体或其它将结合到试剂的结合剂。关于这一点，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于活化和扩增本公开中的T细胞。

在一些实施例中，两种试剂固定在珠上，或者固定在同一珠上，即“顺式”，或者固定在分开的珠上，即“反式”。例如，提供初级活化信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以相等的分子量共固定到相同的珠上。在一个实施例中，对于CD4+T细胞扩增和T细胞生长，使用每种抗体以1:1的比例结合到珠上。在一些实施例中，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本公开的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于一。在本公开的某些实施例中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。

颗粒与细胞的比率为1:500至500:1以及其间的任何整数值可用于刺激T细胞或其它靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小尺寸的珠只能结合少数细胞，而较大的珠能结合许多细胞。在某些实施例中，细胞与颗粒的比率范围为1:100至100:1和其间的任何整数值，在进一步的实施例中，该比率包含1:9至9:1和其间的任何整数值，也可用于刺激T细胞。在一些实施例中，使用1:1的细胞与珠的比率。本领域技术人员将理解，多种其它比率可适用于本公开。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。

在本公开的其它实施例中，将细胞(如T细胞)与试剂包被的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在另一实施例中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是一起培养。在进一步的实施例中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。

例如，细胞表面蛋白可以通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁性珠与T细胞接触而连接。在一个实施例中，细胞(例如，CD4+T细胞)和珠(例如，比率为1:1的DYNABEADS CD3/CD28 T顺磁性珠)在缓冲液中混合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。在某些实施例中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施例中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用以1x10⁶个细胞/mL的密度培养的细胞。

在一些实施例中，混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一实施例中，珠和T细胞一起培养2至3天。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(龙沙公司(Lonza)))，其可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一定量的足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。在一些实施例中，培养基包含补充有5％人A/B血清、1％青霉素/链霉素(pen/strep)和300单位/ml的IL-2(美天旎公司)的X-VIVO-15培养基。

将T细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％ CO2)。

在一些实施例中，本公开的包含TCR、CAR和抑制性受体的T细胞是自体的。在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。免疫细胞(如T细胞)可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些实施例中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在本公开的某些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，如Ficoll^TM分离，从收集自受试者的单位血液中获得T细胞。

在一些实施例中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续的处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代的实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可以缺少镁或者可以缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，如根据制造商的说明书通过使用半自动化的“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可以将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其它含或不含缓冲液的盐溶液。替代地，可以除去单采血液成分术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施例中，通过裂解红细胞和去除单核细胞，例如通过PERCOLL^TM梯度离心或通过逆流离心淘析从外周血淋巴细胞分离免疫细胞，如T细胞。免疫细胞的特定亚群，如T细胞、B细胞或CD4+T细胞，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一个实施例中，通过与抗CD4-缀合的珠孵育一段足以阳性选择所需的T细胞的时间来分离T细胞。

通过阴性选择富集免疫细胞群体，如T细胞群体，可以通过针对阴性选择细胞特有的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD 14、CD20、CD 11b、CD 16、HLA-DR和CD8的抗体。

为了通过阳性或阴性选择分离所需的免疫细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠)的浓度。在某些实施例中，可能需要显著降低珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。

在一些实施例中，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2至10℃或室温下孵育不同的时间长度。

用于刺激的T细胞或从中分离免疫细胞(如T细胞)的PBMC也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过除去细胞群体中的粒细胞和在一定程度上除去单核细胞而提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在本文中是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％ NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的蒸汽相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃或液氮中立即进行不受控冷冻。

本公开提供了表达本文所述的活化剂和/或抑制性受体的免疫细胞，其中免疫细胞具有降低的主要组织相容性(MHC)I类复合物的表达和/或功能。

在一些实施例中，免疫细胞是自体的。例如，免疫细胞分离自或衍生自接受该细胞作为治疗方案的一部分的相同受试者。用对MHC I类抗原特异性的抑制性受体修饰自体免疫细胞以降低MHC I类的表达和/或功能可能是有利的。不希望受理论束缚，修饰自体免疫细胞以降低MHC I类的表达和/或功能降低了抑制性受体与免疫细胞表达的MHC I类的结合，无论是顺式还是反式。

在一些实施例中，免疫细胞都是同种异体的。同种异体免疫细胞可以衍生自供体，而不是施用免疫细胞的受试者。同种异体免疫细胞在细胞疗法中通常被称为“现成的”或“通用的”，因为同种异体细胞可能被制备和储存用于多种基因型的受试者。

降低MHC I类复合物的表达和/或功能的任何合适的方法都被设想在本公开的范围内，并且尤其包括敲低一种或多种编码MHC I类组分的RNA的干扰RNA的表达，或编码MHCI类组分的基因的修饰。

主要组织相容性复合物(MHC)是脊椎动物基因组上编码适应性免疫系统所需的一组多肽的基因座。其中有MHC I类多肽，其包括HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因。MHC I类等位基因是高度多态性的并且在所有有核细胞中均表达。由HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因编码的MHC I类多肽与β2微球蛋白(B2M)形成异二聚体，并与细胞表面上的抗原复合存在。如本文所述，MHC I类基因或多肽可以指在MHC中发现的任何多肽或编码所述多肽的相应基因。在一些实施例中，本公开的免疫细胞被抑制剂配体灭活，该抑制剂配体包含MHC I类多肽，例如HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因。HLA-A等位基因可以是，例如但不限于，HLA-A*02、HLA-A*02:01、HLA-A*02:01:01、HLA-A*02:01:01:01，和/或编码与HLA-A*02蛋白相同或相似的蛋白的任何基因。因此，为了防止如本文所述的自分泌信号传导/结合，需要消除或减少由HLA-A、HLA-B和HLA-C及其等位基因编码的多肽在免疫细胞中的表达。

MHC I类多肽表达降低的免疫细胞

在一些实施例中，本文所述的免疫细胞被修饰以灭活或降低或消除编码内源性MHC I类多肽的等位基因的内源性基因的表达或功能。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A、HLA-B和/或HLA-C。HLA-A、HLA-B和HLA-C由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座编码。HLA-A、HLA-B和HLA-C中的每一种均包括许多变体等位基因，所有这些均被设想在本公开的范围内。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A。在一些实施例中，编码MHCI类多肽的基因是HLA-A*02。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A*02:01。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A*02:01:01。在一些实施例中，编码MHC I类多肽的基因是HLA-A*02:01:01:01。

在一些实施例中，修饰本文所述的基因工程化的免疫细胞以减少或消除B2M基因产物的表达。β-2微球蛋白(B2M)基因编码与主要组织相容性复合物(MHC)I类(即MHC-I复合物)相关的蛋白质。MHC-I复合物是细胞表面抗原呈递所需的。当B2M缺失时，MHC-I复合物被破坏并且不起作用(Wang D等人《干细胞转译医学(Stem Cells Transl Med.)》4:1234-1245(2015))。此外，可以使用本领域已知的基因编辑技术高效地破坏B2M基因(雷恩(Ren)等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》23:2255-2266(2017))。减少或消除B2M可以减少或消除免疫细胞表面上的功能性MHC I。

本公开提供了用于编辑免疫细胞中的内源性靶基因的基因编辑系统。本公开提供了对靶基因序列特异性的干扰RNA。基因编辑系统，如CRISPR/Cas系统、TALEN和锌指，可用于生成双链断裂，其通过基因修复机制(如同源定向修复或非同源末端连接(NHEJ))可用于引入突变。断裂末端切除后的NHEJ或不适当的末端连接可用于引入缺失。在一些实施例中，靶基因包含编码MHC-I复合物亚基的基因。

靶基因序列包括但不限于启动子、增强子、内含子、外显子、内含子/外显子接合、转录产物(前mRNA、mRNA和剪接变体)和/或3'和5'非翻译区(UTR)。为了在本文所述的免疫细胞中进行遗传编辑的目的，可以靶向任何基因元件或基因元件的组合。对靶基因的修饰可以使用本领域已知的任何方法来完成，以编辑靶基因，导致靶基因或基因产物的表达或功能改变或破坏。

在一些实施例中，修饰编码MHC I类多肽的基因包含缺失全部或部分基因。在一些实施例中，修饰编码MHC I类多肽的基因包含在基因中引入突变。在一些实施例中，突变包含缺失、插入、取代或移码突变。在一些实施例中，修饰基因包含使用核酸引导的核酸内切酶。

本文所述靶基因的基因序列是本领域已知的。这些序列可以在公共数据库中找到，如NCBI基因库或NCBI核苷酸数据库。可以使用基因标识符找到序列，例如，HLA-A基因具有NCBI基因ID：3105，HLA-B基因具有NCBI基因ID：3106，HLA-C基因具有NCBI基因ID：3107，并且B2M基因具有NCBI基因ID：567和NCBI参考序列：NC_000015.10。也可以通过使用关键词搜索公共数据库来找到基因序列。例如，可以通过搜索关键词“HLA-A*02”、“HLA-A*02:01”、“HLA-A*02:01:01”或“HLA-A*02:01:01:01”在NCBI核苷酸数据库中找到HLA-A等位基因。这些序列可用于本领域已知的各种基因编辑技术中的靶向。表7提供了靶向用于本文所述修饰的HLA-A等位基因和B2M基因序列的非限制性示例性序列。

表7.示例性靶基因序列

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本领域普通技术人员将理解，T可以取代U以将RNA序列转化为DNA序列，反之亦然，并且两者都被设想为本公开的靶基因序列。

在一些实施例中，使用核酸引导的核酸内切酶在本文所述的免疫细胞中编辑靶基因。示例性核酸引导的核酸内切酶包括II类核酸内切酶，如CRISPR/Cas9。

本文所用的“CRISPR”或“CRISPR基因编辑”是指一组成簇的规则间隔的短回文重复序列，或包含这样一组重复序列的系统。本文所用的“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可用于沉默、敲除或突变靶基因。该系统是一种原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性，并提供一种获得性免疫。CRISPR/Cas系统已被修饰用于基因编辑。这是通过向真核细胞中引入一种或多种特别设计的引导核酸(gNA)，通常是引导RNA(gRNA)，以及与gNA形成核糖核蛋白复合物的合适的Cas核酸内切酶来实现的。gNA将gNA-核酸内切酶蛋白复合物引导至靶基因组位置，并且核酸内切酶在靶基因组位置引入链断裂。这种双链断裂可以通过细胞机制修复，如非同源末端连接(导致缺失)或同源修复(可以生成插入)，从而将遗传修饰引入宿主细胞基因组。

CRISPR/Cas系统按类和按类型分类。2类系统目前代表分类为三种不同类型(II型、V型和VI型)的单一干扰蛋白。任何适合于基因编辑的2类CRISPR/Cas系统，例如II型、V型或VI型系统，被设想为在本公开的范围内。示例性的2类II型CRISPR系统包括Cas9、Csn2和Cas4。示例性的2类V型CRISPR系统包括Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i和Cas12k(C2c5)。示例性的2类VI型系统包括Cas13、Cas13a(C2c2)Cas13b、Cas13c和Cas13d。

CRISPR序列，有时称为CRISPR基因座，包含交替重复序列和间隔区。在天然存在的CRISPR中，间隔区通常包含细菌外源的序列，如质粒或噬菌体序列。如本文所述，间隔区序列也可以称为“靶向序列”。在用于基因工程的CRISPR/Cas系统中，间隔区衍生自靶基因序列(gNA)。

示例性的2类II型CRISPR系统依赖于蛋白质Cas9，其是具有两个活性切割位点的核酸酶，双螺旋的每条链一个。组合Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA可用于基因编辑系统中。彭尼斯(Pennisi)(2013)《科学(Science)》341:833-836。在一些实施例中，用于修饰免疫细胞的Cas蛋白是Cas9。

因此，CRISPR/Cas系统可用于编辑靶基因，例如通过添加或删除碱基对，或引入过早终止从而降低靶的表达而靶向用于在本文所述的免疫细胞中编辑的基因。CRISPR/Cas系统也可以像RNA干扰一样使用，以可逆的方式关闭靶基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至靶基因启动子，空间阻断RNA聚合酶。

Cas蛋白可以衍生自任何细菌或古细菌Cas蛋白。任何合适的CRISPR/Cas系统均设想在本公开的范围内。在其它方面，Cas蛋白包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a(Cpf1)、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY、其同源物或其修饰形式中的一种或多种。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白、Cpf1蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas 5、Cas7、Cas8、Cas10，或这些蛋白的组合或复合物。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白。

使用本领域已知的技术，例如美国公开号20140068797和丛(Cong)(2013)《科学》339:819-823中描述的技术，可以生成抑制靶基因的人工CRISPR/Cas系统。也可以生成抑制靶基因的本领域已知的其它人工CRISPR/Cas系统，例如，在蔡(Tsai)(2014)《自然·生物技术(Nature Biotechnol.)》，32:6 569-576，美国专利第8,871,445号；第8,865,406号；第8,795,965号；第8,771,945号；和第8,697,359号中描述的。为特定Cas蛋白设计合适gNA的方法是本领域普通技术人员已知的。

本公开提供了可以将相关多肽(例如，核酸引导的核酸内切酶)的活性导向靶核酸基因组内的特定靶基因序列的基因靶向引导核酸(gNA)。基因组靶向核酸可以是RNA。基因组靶向RNA在本文中称为“引导RNA”或“gRNA”。引导RNA可以至少包含与感兴趣的靶核酸序列杂交的靶向序列和CRISPR重复序列。在一些II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA，在本文中也称为“支架”序列。在II型引导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和支架序列彼此杂交以形成双链体。在V型引导RNA(gRNA)中，crRNA形成双链体。在两种系统中，双链体可以结合定点多肽，使得引导RNA和定点多肽形成复合物。基因靶向核酸可以通过其与定点多肽的缔合而提供对复合物的靶特异性。因此，基因靶向核酸可以指导定点多肽的活性。

在一些实施例中，本公开提供了包含靶向序列和引导RNA支架序列的引导RNA，其中靶向序列与靶基因的序列互补。

示例性的引导RNA包括约15至20个碱基的靶向序列。如本领域普通技术人员所理解的，每个gRNA可以被设计成包括与其基因组靶序列互补的靶向序列。例如，可以将每种靶向序列(例如，表8中呈现的DNA序列的RNA版本，减去代表PAM位点的三个3'核苷酸)放入单个RNA嵌合体或crRNA中。

基因靶向核酸可以是双分子引导RNA。基因靶向核酸可以是单分子引导RNA。基因靶向核酸可以是本领域已知的任何已知构型的引导RNA，例如包括成对的gRNA，或在单个步骤中使用的多个gRNA。尽管从基因组序列中可以清楚地看出编码序列和剪接点在哪里，但基因表达所需的其它特征可能是特异的和不清楚的。

双分子引导RNA可以包含双链RNA。第一链包含5'至3'方向的序列、任选的间隔区延伸序列、靶向序列和最小CRISPR重复序列。第二链可以包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。

II型系统中的单分子引导RNA(sgRNA)可以在5'至3'方向上包含任选的间隔区延伸序列、靶向序列、最小CRISPR重复序列、单分子引导接头、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸可以包含为引导RNA提供额外功能(例如，稳定性)的元件。单分子引导接头可以连接最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸可以包含一个或多个发夹。

在一些实施例中，引导RNA或单分子引导RNA(sgRNA)可以包含靶向序列和支架序列。在一些实施例中，支架序列是Cas9 gRNA序列。在一些实施例中，支架序列由包含与以下序列共享至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的DNA序列编码：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO:435)。在一些实施例中，支架序列由包含

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO:435)的DNA序列编码。

在一些实施例中，例如其中CRISPR/Cas系统是Cas9系统的那些实施例，sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含20个核苷酸的靶向序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含少于20个核苷酸的靶向序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含多余20个的核苷酸靶向序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5'端具有17至30个核苷酸的可变长度靶向序列。

合适的支架序列和支架靶向序列的排列将取决于核酸内切酶的选择，并且是本领域技术人员已知的。

II型系统中的单分子引导RNA(sgRNA)，例如Cas9，可以在5'至3'方向包含最小CRISPR重复序列和靶向序列。

作为说明，在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统中使用的引导RNA，或其它更小的RNA可以通过化学方法容易地合成，如下文所示和在本领域中描述的。尽管化学合成方法不断扩大，但是当多核苷酸长度显著增加超过一百个左右的核苷酸时，通过如高效液相色谱(HPLC，其避免使用如PAGE的凝胶)的方法纯化这种RNA往往变得更具挑战性。一种用于生成更长RNA的方法是产生两个或多个连接在一起的分子。更长的RNA，如编码Cas9或Cpf1核酸内切酶的RNA，更易于酶促生成。可以在RNA的化学合成和/或酶促生成期间或之后引入各种类型的RNA修饰，例如增强稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度，和/或增强其它属性的修饰，如本领域所述。

gRNA的靶向序列与感兴趣的靶核酸中的序列杂交。基因组靶向核酸的靶向序列可以通过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。靶向序列的核苷酸序列可以根据感兴趣的靶核酸的序列而变化。

在本文所述的Cas9系统中，靶向序列可以被设计为与位于系统中使用的Cas9酶的PAM的反向互补物的5'的靶核酸杂交。靶向序列可以完全匹配靶序列或可以具有错配。每种CRISPR/Cas系统蛋白可以在其在靶DNA中识别的特定方向和位置上具有特定PAM序列。例如，化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9在靶核酸中识别包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由靶向序列靶向的靶核酸序列的3'。选择合适的PAM序列对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。

靶序列与gRNA的靶向序列互补并杂交。靶核酸序列可以包含20个核苷酸。靶核酸可以包含少于20个核苷酸。靶核酸可以包含多于20个核苷酸。靶核酸可以至少包含：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。在一些实施例中，例如其中CRISPR/Cas系统是Cas9系统的那些实施例，靶核酸序列可以包含紧邻PAM序列的反向互补物的第一核苷酸的5'的20个核苷酸。该靶核酸序列通常称为PAM链或靶链，而互补核酸序列通常称为非PAM链或非靶链。本领域技术人员将认识到靶向序列与靶核酸的非PAM链杂交，参见例如US20190185849A1。

在一些实例中，靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在一些实例中，靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％或100％。在一些实例中，靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比在靶核酸的互补链的靶序列的六个连续的最5'核苷酸上是100％。靶向序列和靶核酸之间的互补性百分比在约20个连续核苷酸上可以是至少60％。靶向序列和靶核酸的长度可以相差1至6个核苷酸，其可以被认为是一个或多个凸起。

可以使用本领域普通技术人员已知的计算机程序来设计或选择靶向序列。计算机程序可以使用变量，如预测的解链温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、％GC、基因组出现的频率(例如，由于错配、插入或缺失而在一个或多个位点上相同或相似但不同的序列)、甲基化状态、SNP的存在等。可用的计算机程序可以将NCBI基因ID、官方基因符号、Ensembl基因ID、基因组坐标或DNA序列作为输入，并创建包含靶向指定为输入的适当基因组区的sgRNA的输出文件。计算机程序还可以提供统计学和分数的总结，表明sgRNA对靶基因的靶上和脱靶结合(多恩奇(Doench)等人，《自然·生物技术》34:184-191(2016))。本公开提供了包含靶向序列的引导RNA。在一些实施例中，引导RNA进一步包含引导RNA支架序列。在一些实施例中，靶向序列与选自由HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M或其等位基因组成的组的靶基因的序列互补。在一些实施例中，靶基因是HLA-A基因。在一些实施例中，靶基因是HLA-B基因。在一些实施例中，靶基因是HLA-C基因。在一些实施例中，靶基因是HLA-A、HLA-B、HLA-C或其组合。在一些实施例中，靶向序列包含与表7中公开的序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性或与其相同的序列。

在一些实施例中，gNA特异性靶向内源性HLA-A基因座的序列。在一些实施例中，特异性靶向HLA-A基因座序列的gNA包含与选自表8中公开的序列的序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的序列。在一些实施例中，特异性靶向HLA-A基因座序列的gNA包含选自表8中公开的序列的序列。

在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02等位基因的序列。例如，gRNA特异性靶向并杂交于由所有HLA-A*02等位基因共享的序列，但不是HLA-A*02和HLA-A*03等位基因共享的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01:01等位基因的序列。

在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02的编码DNA序列。

在一些实施例中，gNA特异性靶向超过1000个HLA-A*02等位基因共享的编码DNA序列。在一些实施例中，特异性靶向大于1000个HLA-A*02等位基因中的编码DNA序列的gNA包含与选自SEQ ID NO:400-465的序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性或与其相同的序列。

表8.靶向HLA-A和HLA-A等位基因的示例性序列

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表8中公开的序列包括相应的基因组序列，包括PAM序列。技术人员将理解，gRNA的靶向序列不包括表8中序列的三个3'末端核苷酸，其代表gRNA的相应PAM位点。

本公开提供了包含对B2M基因特异性的靶向序列的gNA。在一些实施例中，gNA特异性靶向B2M基因的编码序列(CDS)序列。在一些实施例中，gNA包含靶向B2M基因启动子序列的序列。

在一些实施例中，gNA包含靶向序列和gNA支架序列。在一些实施例中，靶向序列包含表9中所示的序列，或与其共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性的序列。

在一些实施例中，靶向序列与B2M基因的序列互补。在一些实施例中，B2M基因包含与表7中所示的B2M序列共享约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性的序列。

表9.靶向B2M的示例性序列

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在一些实施例中，使用TALEN基因编辑来编辑本文所述的免疫细胞。

“TALEN”或“TALEN基因编辑”是指类转录激活因子效应物核酸酶，其是用于编辑靶基因的人工核酸酶。

通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合人工产生TALEN。来源于黄单胞菌属细菌的类转录激活因子效应物(TALE)可以被工程化以结合任何所需的DNA序列，包括靶基因的一部分，如TCR亚基、MHC I类复合物组分或CD52。通过将工程化TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对任何所需DNA序列(包括靶基因序列)特异性的限制性酶。然后可以将它们引入细胞，其中它们可用于基因组编辑。

为了产生TALEN，TALE蛋白与核酸酶(N)融合，核酸酶是野生型或突变的折叠核酸内切酶。针对FokI在TALEN中的应用，已经进行了几种FokI突变；例如，这些提高了切割特异性或活性。

FokI结构域作为二聚体起作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于靶基因组中具有适当取向和间距的位点。TALE DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数目以及两个单独TALEN结合位点之间的碱基数目似乎是实现高水平活性的重要参数。

可以使用本领域已知的任何方法，包括使用模块化组件的各种方案，构建对靶基因中的序列特异性的TALEN。

在一些实施例中，使用ZFN基因编辑在本文所述的免疫细胞中编辑靶基因。

“ZFN”或“锌指核酸酶”或“ZFN基因编辑”是指锌指核酸酶，一种可用于编辑靶基因的人工核酸酶。

与TALEN一样，ZFN包含与DNA结合结构域融合的折叠核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。

锌指是由一个或多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可以包含例如Cys2His2，并且可以识别大约3-bp的序列。已知特异性的各种锌指可以组合以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于生成识别特异性序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。

与TALEN一样，ZFN必须二聚化以切割DNA。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须结合DNA的相反链，它们的核酸酶适当地间隔开。

同样与TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果不正确地修复，其可以产生移码突变，导致细胞中靶基因或基因产物的表达和数量降低。ZFN也可用于同源重组以在靶基因中突变。

可以使用本领域已知的任何方法构建对靶基因中的序列特异性的ZFN。

在一些实施例中，使用RNA干扰降低一种或多种MCH-I组分的表达和功能。“RNAi”或“RNA干扰”是指由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。双链体RNA，如siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)、shRNA(短发夹RNA)、ddRNA(DNA定向RNA)、piRNA(Piwi相互作用RNA)或rasiRNA(重复相关siRNA)及其修饰形式，都能够介导RNA干扰。这些dsRNA分子可以是市售的或可以基于已知的序列信息设计和制备。这些分子的反义链可以包括RNA、DNA、PNA或其组合。DNA/RNA嵌合多核苷酸包括但不限于由抑制靶基因表达的DNA和RNA组成的双链多核苷酸。如本文所述，dsRNA分子还可以包括一个或多个修饰的核苷酸，其可以整合在一条或两条链上。

在RNAi基因沉默或敲低中，将包含与靶基因的一部分互补的第一(反义)链和与第一反义链完全或部分互补的第二(有义)链的dsRNA引入生物体中。在引入生物体后，靶基因特异性dsRNA被加工成相对小的片段(siRNA)，随后可分布在整个生物体中，降低靶基因的信使RNA，产生与靶基因完全或部分缺失产生的表型非常相似的表型。

细胞中的某些dsRNA可以经历Dicer酶(一种核糖核酸酶III酶)的作用。Dicer可以将dsRNA加工成较短的dsRNA片段，即siRNA。RNAi还涉及被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物。在被Dicer切割后，siRNA进入RISC复合物并直接切割具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA靶。siRNA的另一条链是过客链。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间。因此，siRNA可以通过以序列特异性方式介导RNA干扰来下调或敲低基因表达。

如本文关于RNA干扰所使用的，“靶基因”或“靶序列”是指其相应RNA被靶向以使用如本文所述的dsRNA或siRNA通过RNAi途径降解的基因或基因序列。示例性的靶基因序列示于表7中。为了靶向基因，例如使用siRNA，siRNA包含与靶基因或序列的至少一部分互补或基本上互补的反义区，以及与反义链互补的有义链。一旦引入细胞中，siRNA指导RISC复合物切割包含靶序列的RNA，从而降解RNA。本公开提供了干扰RNA。本公开的双链RNA分子可以是本领域已知的任何类型的RNA干扰分子的形式。在一些实施例中，双链RNA分子是小干扰RNA(siRNA)。在其它实施例中，双链RNA分子是短发夹RNA(shRNA)分子。在其它实施例中，双链RNA分子是在细胞中加工以产生siRNA的Dicer底物。在其它实施例中，双链RNA分子是微小RNA前体分子的一部分。

在一些实施例中，shRNA具有适合作为Dicer底物的长度，其可以被加工以产生RISC活性siRNA分子。参见例如罗西(Rossi)等人，US2005/0244858。

Dicer底物双链RNA(例如shRNA)可以具有足以被Dicer加工以产生活性siRNA的长度，并且可以进一步包括以下特性中的一种或多种：(i)Dicer底物shRNA可以是不对称的，例如，在反义链上具有3'突出端，(ii)Dicer底物shRNA可以在有义链上具有修饰的3'端，以指导Dicer结合的取向和dsRNA向活性siRNA的加工，例如掺入一个或多个DNA核苷酸，以及(iii)Dicer底物dsRNA的第一链和第二链的长度可以是21至30bp。

在一些实施例中，干扰RNA包含与B2M mRNA的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi导的B2M mRNA的降解。在一些实施例中，B2M mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，B2M mRNA序列包含非翻译区。

在一些实施例中，干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含非翻译区。

在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含第一序列，其从5'至3'端具有与B2M mRNA互补的序列；以及第二序列，其从5'至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。

在一些实施例中，第一序列是18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，第一序列与选自表10和11中所示序列的序列互补。在一些实施例中，第一序列具有大于或等于25％且小于60％的GC含量。在一些实施例中，第一序列与选自表10和11中所示序列的序列互补。在一些实施例中，第一序列不包含相同碱基的四个核苷酸或一连串七个C或G核苷酸碱基。在一些实施例中，第一序列是21个核苷酸。

与第一序列互补的示例性靶B2M序列示于表10中。

在一些情况下，第一序列可以与靶核酸序列具有100％同一性，即完全同一性、同源性、互补性。在其它情况下，在第一序列和靶核酸序列之间可能存在一个或多个错配。例如，在有义区和靶核酸序列之间可能存在1、2、3、4、5、6或7个错配。

表10中列出的序列以DNA序列表示。在表10中列出的所有序列中，胸腺嘧啶(T)可以被尿嘧啶(U)代替以得到靶mRNA序列的序列。

表10.与第一序列互补的示例性靶B2M序列。

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在一些实施例中，干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含非翻译区。

编码B2M shRNA的示例性序列包含序列

GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:179)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。编码B2MshRNA的另一个示例性序列包含序列

GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ ID NO:808)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

在一些实施例中，干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含第一序列，其从5'至3'端具有与HLA-A*02mRNA互补的序列；以及第二序列，其从5'至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。

与第一序列互补的示例性靶HLA序列示于表11中。

表11.与第一序列互补的示例性靶HLA序列

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在一些实施例中，第一序列和第二序列被接头分开，接头有时被称为环。在一些实施例中，第一序列和第二序列两者都由一个单链RNA或DNA载体编码。在一些实施例中，环位于第一序列和第二序列之间。在这些实施例中，第一序列和第二序列杂交形成双链体区域。第一序列和第二序列通过接头序列连接，形成“发夹”或“茎-环”结构。shRNA可以在单链分子的相对端具有互补的第一序列和第二序列，使得分子可以与互补序列部分形成双链体区域，并且链在双链体区域的一端通过接头(即环序列)连接。接头或环序列可以是核苷酸或非核苷酸接头。接头可以通过共价键或非共价相互作用与第一序列和任选的第二序列相互作用。

任何合适的核苷酸环序列被设想在本公开的范围内。本公开的shRNA可以包括将shRNA的第一序列连接到shRNA的第二序列的核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸接头。核苷酸环序列可以是长度为≥2个核苷酸，例如长度为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。表12中公开了示例性的环序列。

在一些实施例中，shRNA进一步包含5'侧翼序列和3'侧翼序列。在一些实施例中，其中5'侧翼序列连接到第一序列的5'端，并且其中3'侧翼序列连接到第二序列的3'端。

不希望受理论束缚，认为具有与在微小RNA中发现的那些序列相似的5'和3'序列的侧翼shRNA茎环序列可以靶向用于通过内源性微小RNA加工机制加工的shRNA，增加shRNA加工的有效性。替代地，或另外，侧翼序列可以增加shRNA与聚合酶II或聚合酶III启动子的相容性，导致shRNA表达的更有效调节。

在一些实施例中，5'侧翼序列选自表12中所示的序列。示例性侧翼序列示于表12中。

表12.示例性侧翼序列

SEQ ID NO	5'侧翼序列
		895	GG
896	ACACCAUGUUGCCAGUCUCUAGG
		897	UGAUAGCAAUGUCAGCAGUGCCU
898	UAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAC
		SEQ ID NO	3'侧翼序列
899	UGGCGUCUGGCCCAACCACAC
		900	GUAAGGUUGACCAUACUCUAC

在一些实施例中，第一序列和第二序列存在于单链多核苷酸上，其中第一序列和第二序列相隔4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸，其中4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸形成shRNA中的环区。在一些实施例中，环区包含选自表13所示序列的序列。

表13.示例性环区序列

本公开的shRNA可以通过化学合成、通过体外转录，或通过用Dicer或具有类似活性的另一种合适的核酸酶切割较长的双链RNA而在外源生成。使用常规的DNA/RNA合成仪从受保护的核糖核苷亚磷酰胺产生的化学合成的siRNA可以从商业供应商获得，如密理博西格玛公司(Millipore Sigma)(得克萨斯州休斯顿)、Ambion公司(得克萨斯州奥斯汀)、英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)或Dharmacon公司(科罗拉多州拉斐特)。siRNA可以通过例如用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、层析或其组合来纯化。替代地，siRNA可以在很少(如果有的话)纯化的情况下使用，以避免由于样品加工造成的损失。

在一些实施例中，本公开的shRNA可以使用其中已经克隆了编码双链RNA的核酸的表达载体来产生，例如在合适的启动子的控制下。

在一些实施例中，免疫细胞包含

药物组合物

本公开提供了包含免疫细胞和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，该免疫细胞包含本公开的第一受体和第二受体。

此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；和防腐剂。

在一些实施例中，免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少90％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。

治疗癌症

本文提供了杀死受试者体内多种癌细胞或治疗癌症的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的包含免疫细胞的组合物，该免疫细胞包含本公开的第一受体和第二受体。免疫细胞在同一细胞中表达两种受体。

癌症是一种异常细胞不受控制地分裂并扩散到附近组织的疾病。在一些实施例中，癌症包含液体肿瘤或固体肿瘤。癌症几乎可以发生在身体的任何一个器官，包括上皮组织。其中多种癌细胞表达第一活化剂配体而不表达第二抑制剂配体的任何癌症被设想在本公开的范围内。例如，可以使用本文所述的方法治疗的EGFR阳性癌症包括肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺导管癌、结肠直肠癌、头颈癌、食道和胃腺癌、卵巢癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈鳞状细胞癌、肾癌、乳头状肾癌、肾透明细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌、胸腺癌、胃癌或子宫癌，以及所有其它表达EGFR靶的肿瘤。本文公开的组合物和方法可用于治疗复发性、难治性和/或转移性EGFR阳性癌症。

在一些实施例中，多种癌细胞表达靶抗原。在一些实施例中，受试者的多种癌细胞表达EGFR。EGFR阳性癌症包括但不限于肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺导管癌、结肠直肠癌、头颈癌、食道和胃腺癌、卵巢癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈鳞状细胞癌、肾癌、乳头状肾癌、肾透明细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌、胸腺癌、胃癌或子宫癌。

在一些实施例中，多种癌细胞不表达COLEC12、APCDD1或CXCL16的多态性等位基因。在一些实施例中，多种癌细胞不表达非靶抗原。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*02。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*02的等位基因变体。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*01。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*03。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*11。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-B*07。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-C*07。例如，癌细胞通过在该基因座的杂合性丢失而丢失了COLEC12、APCDD1或CXCL16或HLA-A*02的等位基因。

施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以减小受试者体内肿瘤的大小。在一些实施例中，相对于施用免疫细胞或药物组合物之前的肿瘤大小，肿瘤大小减小约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施例中，肿瘤被消除。

施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以阻止受试者体内肿瘤的生长。例如，免疫细胞或药物组合物可以杀死肿瘤细胞，使得肿瘤停止生长或大小减小。在一些情况下，免疫细胞或药物组合物可以预防额外肿瘤的形成，或减少受试者体内肿瘤的总数。

施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可能导致受试者体内癌细胞而非正常细胞的选择性杀伤。在一些实施例中，约60％的被杀死的细胞是癌细胞，约65％的被杀死的细胞是癌细胞，约70％的被杀死的细胞是癌细胞，约75％的被杀死的细胞是癌细胞，约80％的被杀死的细胞是癌细胞，约85％的被杀死的细胞是癌细胞，约90％的被杀死的细胞是癌细胞，约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％的被杀死的细胞是癌细胞。

施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可能导致杀死受试者的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的癌细胞。

与施用包含第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以对受试者产生更少的副作用。例如，相对于在没有第二抑制性受体的情况下施用EGFR CAR或EGFR TCR，施用本文所述的免疫细胞或药物组合物可以降低剂量限制性毒性。

本公开提供了治疗受试者体内癌症的方法，其包含：(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞在选自由COLEC12的多态性基因座、APCDD1的多态性基因座和CXCL16的多态性基因座或HLA-A*02基因座组成的组的多态性基因座处的基因型；(b)确定多种癌细胞中EGFR的表达；以及(c)如果正常细胞对于多态性基因座是杂合的并且多种癌细胞对于多态性基因座是半合子的或已经丢失了HLA-A*02，并且多种癌细胞是EGFR阳性的，则向受试者施用多种免疫细胞，其中多种免疫细胞包含：(i)第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对EGFR或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原特异性的细胞外配体结合结构域；以及(ii)第二受体，任选地为抑制性嵌合抗原受体(即抑制性受体)，其包含对选自COLEC12、APCDD1和CXCL16或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的抗原肽或HLA-A*02的非靶抗原特异性的细胞外配体结合，其中非靶抗原包含多态性。

对受试者的癌细胞和正常细胞进行SNP存在或不存在的基因分型的方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。SNP基因分型方法尤其包括基于PCR的方法，如双探针TaqMan测定、基于阵列的杂交方法和测序。

测量受试者的癌症或正常细胞中靶抗原表达的方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。这些方法尤其包括测量RNA表达的方法，如RNA测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及测量蛋白质表达的方法，如基于免疫组织化学的方法。测量多种癌细胞中杂合性丢失的方法尤其包括使用本领域已知的方法对从癌细胞提取的基因组DNA进行高通量测序。

测量受试者的癌症或正常细胞中靶抗原表达的方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。这些方法尤其包括测量RNA表达的方法，如RNA测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及测量蛋白质表达的方法，如基于免疫组织化学的方法。

在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。

在一些实施例中，免疫细胞是同种异体的或自体的。

在一些实施例中，与表达第一受体但不表达第二受体的免疫细胞相比，第二受体增加了免疫细胞对EGFR阳性癌细胞的特异性。在一些实施例中，与表达第一受体但不表达第二受体的免疫细胞相比，免疫细胞具有降低的副作用。

治疗癌症可能导致肿瘤大小减小。肿瘤大小的减小也可以被称为“肿瘤消退”。优选地，治疗后，肿瘤大小相对于其治疗前的大小减小5％或更多；更优选地，肿瘤大小减小10％或更多；更优选地，减小20％或更多；更优选地，减小30％或更多；更优选地，减小40％或更多；甚至更优选地，减小50％或更多；并且最优选地，减小大于75％或更多。肿瘤的大小可以通过任何可重复的测量方式来测量。肿瘤的大小可以测量为肿瘤的直径。

治疗癌症可能导致肿瘤体积减小。优选地，治疗后，肿瘤体积相对于其治疗前的大小减少5％或更多；更优选地，肿瘤体积减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；并且最优选地，减少大于75％或更多。肿瘤体积可以通过任何可重复的测量方式来测量。

治疗癌症导致肿瘤数目减少。优选地，治疗后，肿瘤数目相对于治疗前的数目减少5％或更多；更优选地，肿瘤数目减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；并且最优选地，减少大于75％。肿瘤的数目可以通过任何可重复的测量方式来测量。肿瘤的数目可以通过对肉眼可见的肿瘤进行计数或在指定的放大倍数下进行计数来测量。优选地，指定的放大倍数是2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或50倍。

治疗癌症可能导致远离原发性肿瘤部位的其它组织或器官中转移病灶的数目减少。优选地，治疗后，转移病灶的数目相对于治疗前的数目减少5％或更多；更优选地，转移病灶的数目减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；并且最优选地，减少大于75％。转移病灶的数目可以通过任何可重复的测量方式来测量。转移病灶的数目可以通过对肉眼可见的转移病灶进行计数或在指定的放大倍数下进行计数来测量。优选地，指定的放大倍数是2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或50倍。

与仅接受载体的群体相比，治疗癌症可能导致接受治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；并且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。

与未治疗的受试者群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；并且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。

与接受使用不是本公开的化合物或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的药物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；并且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。

与仅接受载体的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的死亡率降低。与未治疗的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的死亡率降低。与接受使用不是本公开的化合物或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的药物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可能导致治疗的受试者群体的死亡率降低。优选地，死亡率降低超过2％；更优选地，超过5％；更优选地，超过10％；并且最优选地，大于25％。治疗受试者群体的死亡率的降低可以通过任何可重复的方式测量。群体死亡率的降低可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后每单位时间的疾病相关死亡的平均数来测量。群体死亡率的降低也可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后每单位时间的疾病相关死亡的平均数来测量。

治疗癌症可能导致肿瘤生长速率降低。优选地，治疗后，肿瘤生长速率相对于治疗前的数目降低至少5％；更优选地，肿瘤生长速率降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；并且最优选地，降低至少75％。肿瘤生长速率可以通过任何可重复的测量方式来测量。可以根据每单位时间肿瘤直径的变化测量肿瘤生长速率。

治疗癌症可能导致肿瘤再生长的减少。优选地，治疗后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于10％；更优选地，小于20％；更优选地，小于30％；更优选地，小于40％；更优选地，小于50％；甚至更优选地，小于50％；并且最优选地，小于75％。肿瘤再生长可以通过任何可重复的测量方式来测量。例如，通过测量治疗后的先前肿瘤收缩后肿瘤直径的增加来测量肿瘤再生长。停止治疗后肿瘤不再复发表明肿瘤再生长减少。

治疗或预防癌症可能导致细胞增殖速率降低。优选地，治疗后，细胞增殖速率降低至少5％；更优选地，至少10％；更优选地，至少20％；更优选地，至少30％；更优选地，至少40％；更优选地，至少50％；甚至更优选地，至少50％；并且最优选地，至少75％。细胞增殖速率可以通过任何可重复的测量方式来测量。例如，通过测量每单位时间组织样品中分裂细胞的数目来测量细胞增殖速率。

治疗或预防癌症可能导致增殖细胞的比例降低。优选地，治疗后，增殖细胞的比例降低至少5％；更优选地，至少10％；更优选地，至少20％；更优选地，至少30％；更优选地，至少40％；更优选地，至少50％；甚至更优选地，至少50％；并且最优选地，至少75％。增殖细胞的比例可以通过任何可重复的测量方式来测量。优选地，例如通过定量组织样品中分裂细胞的数目相对于未分裂细胞的数目来测量增殖细胞的比例。增殖细胞的比例可以等于有丝分裂指数。

治疗或预防癌症可能导致细胞增殖面积或区域的大小减小。优选地，治疗后，细胞增殖的面积或区域的大小相对于其治疗前的大小减小至少5％；更优选地，减小至少10％；更优选地，减小至少20％；更优选地，减小至少30％；更优选地，减小至少40％；更优选地，减小至少50％；甚至更优选地，减小至少50％；并且最优选地，减小至少75％。细胞增殖的面积或区域的大小可以通过任何可重复的测量方式来测量。细胞增殖面积或区域的大小可以测量为细胞增殖面积或区域的直径或宽度。

治疗或预防癌症可能导致具有异常外观或形态的细胞的数目或比例减少。优选地，在治疗后，具有异常形态的细胞的数目相对于其治疗前的大小减少至少5％；更优选地，减少至少10％；更优选地，减少至少20％；更优选地，减少至少30％；更优选地，减少至少40％；更优选地，减少至少50％；甚至更优选地，减少至少50％；并且最优选地，减少至少75％。异常的细胞外观或形态可以通过任何可重复的测量方式来测量。异常的细胞形态可以通过显微术来测量，例如使用倒置组织培养显微镜。异常的细胞形态可以表现为核多形性。

剂量和施用

本公开的免疫细胞和可以以多种方式施用，这取决于需要局部治疗还是全身治疗。

通常，施用可以是肠胃外的。

用于过继性细胞疗法的细胞施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性T细胞治疗方法描述于例如格林贝格(Gruenberg)等人的美国专利申请公开号2003/0170238和罗森伯格(Rosenberg)的美国专利第4,690,915号。

本公开的组合物适合于肠胃外施用。如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括以受试者组织的物理破裂和通过组织中的破裂施用药物组合物为特征的任何施用途径，因此通常导致直接施用到血流中、肌肉中或内脏中。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物施用药物组合物、通过手术切口应用组合物、通过组织穿透性非手术伤口应用组合物等。特别地，肠胃外施用预期包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、瘤内、滑膜内注射或输注；以及肾透析输注技术。在一些实施例中，本公开的组合物的肠胃外施用包含静脉内或动脉内施用。

本公开提供了包含本公开的多种免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

适于肠胃外施用的药物组合物的制剂通常通常包含与药学上可接受的载体(如无菌水或无菌等渗盐水)组合的免疫细胞。此类制剂可以以适合于快速浓注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂型制备、包装或销售，如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳液、糊剂等。此类制剂可以进一步包含一种或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。肠胃外制剂还包括水溶液，其可以含有赋形剂，如盐、碳水化合物和缓冲剂。示例性的肠胃外施用形式包括在无菌水溶液(例如，丙二醇水溶液或葡萄糖水溶液)中的溶液或悬浮液。如果需要，此类剂型可以适当地缓冲。用于肠胃外施用的制剂可以配制为速释和/或缓释。改良释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序释放。

在一些实施例中，包含免疫细胞的配制组合物适于通过注射施用。在一些实施例中，包含免疫细胞的配制组合物适于通过输注施用。

可以方便地以单位剂型存在的本公开的药物组合物可以根据制药工业中熟知的常规技术制备。这些技术包括使免疫细胞与药物载体或赋形剂(如液体载体)缔合的步骤。

水性悬浮液可以进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。

本公开的组合物可以另外含有药物组合物中常规存在的其它辅助组分。因此，例如，组合物可以含有额外的相容的药物活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以含有可用于物理配制本公开的组合物的各种剂型的额外物质，如染料、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加此类物质时，此类物质不应过度干扰本公开的组合物的免疫细胞的生物活性。

制剂或组合物还可以含有一种以上的活性成分，用于用免疫细胞治疗的特定适应症、疾病或病状，其中各自的活性不会相互产生不利影响。这些活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施例中，药物组合物进一步包括其它药物活性剂或药物，如化疗剂。

在一些方面，药物组合物可以采用延时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得组合物的递送发生在待治疗部位致敏之前并且以足够的时间引起该部位致敏。许多类型的释放递送系统是可用的和已知的。这样的系统可以避免组合物的重复施用，从而增加受试者和医生的便利性。

施用可以在整个治疗过程中连续或间歇地以一个剂量进行。可以用治疗医生选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。

在一些实施例中，药物组合物含有治疗或预防癌症有效量的免疫细胞，如治疗有效量或预防有效量。在一些实施例中，治疗或预防功效通过定期评估治疗的受试者来监测。对于在数天、数周或数月内的重复施用，取决于病状，可以重复治疗直到出现期望的癌症体征或症状的抑制。然而，其它给药方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过组合物的单次快速浓注施用或输注或通过组合物的多次快速浓注施用或输注来递送。

细胞或细胞群体可以以一个或多个剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以在一段时间内以多于一个剂量施用。施用时间在主治医师的判断范围内，并取决于患者的临床病状。

细胞或细胞群体可以从任何来源获得，如血库或供体，或患者本身。

有效量是指提供治疗或预防益处的量。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、并行治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的性质。在一些实施例中，肠胃外施用有效量的细胞或包含这些细胞的组合物。在一些实施例中，施用可以是静脉内施用。在一些实施例中，施用可以通过肿瘤内注射直接进行。

为了本公开的目的，可以使用一种测定来确定待施用于哺乳动物的起始剂量，该测定包含例如在将给定剂量的此类免疫细胞施用于哺乳动物后，比较靶细胞裂解或表达受体的免疫细胞分泌一种或多种细胞因子的程度，在一组哺乳动物中，每个哺乳动物被给予不同剂量的免疫细胞。

在一些实施例中，细胞作为联合治疗的一部分施用，如与另一种治疗干预(如抗体或工程化细胞或受体或试剂，如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序相继施用。在一些实施例中，本公开的免疫细胞与一种或多种额外的治疗剂共同施用或与另一种治疗干预联合施用，同时或以任何顺序相继施用。在一些情况下，免疫细胞与另一种疗法在足够接近的时间内共同施用，使得免疫细胞群体增强一种或多种额外治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施例中，免疫细胞在一种或多种额外治疗剂之前施用。在一些实施例中，免疫细胞在一种或多种额外治疗剂之后施用。

在实施例中，在施用(例如，输注)过继性免疫细胞之前、同时或之后向受试者施用淋巴细胞清除化疗。在实例中，在施用免疫细胞之前对受试者施用淋巴细胞清除化疗。例如，淋巴细胞清除化疗在过继性细胞输注前1至4天(例如，1、2、3或4天)结束。在实施例中，施用多剂量的过继性细胞，例如如本文所述。在实施例中，在施用(例如，输注)本文所述的免疫细胞之前、同时或之后向受试者施用淋巴细胞清除化疗。淋巴细胞清除的实例包括但不限于非清髓性淋巴细胞清除化疗、清髓性淋巴细胞清除化疗、全身照射等。淋巴细胞清除剂的实例包括但不限于抗胸腺细胞球蛋白、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD52抗体、抗CD2抗体、TCRαβ阻断剂、抗CD20抗体、抗CD19抗体、硼替佐米(Bortezomib)、利妥昔单抗(rituximab)、抗CD 154抗体、雷帕霉素(rapamycin)、CD3免疫毒素、氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、美法仑(melphalan)、莫需瘤(Mabthera)、他克莫司(Tacrolimus)、阿法赛特(alefacept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、OKT3、OKT4、OKT8、OKT11、芬戈莫德(fingolimod)、抗CD40抗体、抗BR3抗体、坎帕斯(Campath)-1H、抗CD25抗体、钙调磷酸酶抑制剂、麦考酚酯(mycophenolate)和类固醇(steroids)，其可以单独或组合使用。作为另一实例，淋巴细胞清除方案可以包括施用阿仑单抗、环磷酰胺、贝达莫司汀(benduamustin)、利妥昔单抗、喷司他丁(pentostatin)和/或氟达拉滨。淋巴细胞清除方案可以在一个或多个周期中施用，直到循环免疫细胞减少达到预期结果。在一些实施例中，淋巴细胞清除包含施用特异性靶向并减少或消除受试者体内的CD52+细胞的药剂，并修饰免疫细胞以减少或消除CD52表达。

在一些实施例中，在施用(例如输注)过继性免疫细胞之前、同时或之后向受试者施用免疫刺激疗法。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含稳态细胞因子。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含免疫刺激分子。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-9或其功能片段。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-9或其组合。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2或其功能片段。

使用自体细胞进行过继性细胞疗法的方法包括从患者血液中分离免疫细胞，对分离的细胞进行一系列修饰，包括用一种或多种编码本文所述双受体系统的载体转导细胞，并将细胞施用于患者。从患有癌症或血液恶性肿瘤或处于癌症或血液恶性肿瘤风险中的受试者提供免疫细胞需要从患者血液中分离免疫细胞，并且可以通过本领域已知的方法实现，例如通过白细胞分离术。在白细胞分离术中，从受试者中抽取血液，分离外周血单核细胞(PBMC)，并将剩余的血液返回到受试者的循环中。将PBMC作为免疫细胞样品冷冻或冷藏保存，并提供用于进一步的加工步骤，例如本文所述的修饰。

在一些实施例中，本文所述的治疗受试者的方法包含对来自受试者的免疫细胞的修饰，修饰包括一系列修饰，包括富集和/或去除、活化、遗传修饰、扩增、配制和冷藏保存。

本公开提供了富集和/或去除步骤，其可以是例如本领域已知的洗涤和分级分离方法，用于制备用于下游程序(例如本文所述的修饰)的受试者PBMC。例如，但不限于，方法可以包括除去总红细胞和血小板污染物的装置、用于去除单核细胞和分离淋巴细胞的基于大小的细胞分级分离的系统，和/或允许富集或去除特定T细胞亚群(例如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞)的系统。富集步骤后，将从受试者的PMBC中分离出免疫细胞的靶亚群用于进一步处理。本领域技术人员将理解，如本文提供的富集步骤也可以包括任何新发现的方法、装置、试剂或其组合。

本公开提供了活化步骤，其可以是本领域已知的诱导免疫细胞(例如T细胞)的活化的任何方法，活化是其离体扩增所需的。免疫细胞活化可以例如通过在树突细胞存在下培养受试者免疫细胞、在人工抗原呈递细胞(AAPC)存在下培养受试者免疫细胞，或在照射的K562衍生的AAPC存在下培养免疫细胞来实现。用于活化受试者免疫细胞的其它方法可以是，例如，在分离的活化因子和组合物(例如用活化因子官能化的珠、表面或颗粒)存在下培养免疫细胞。活化因子可以包括例如抗体，例如抗CD3和/或抗CD28抗体。活化因子还可以是例如细胞因子，例如白介素(IL)-2或IL-21。活化因子还可以是共刺激分子，例如CD40、CD40L、CD70、CD80、CD83、CD86、CD137L、ICOSL、GITRL和CD134L。本领域技术人员将理解，本文提供的活化因子也可以包括任何新发现的可以活化免疫细胞的活化因子、试剂、组合物或其组合。

本公开提供了用于修饰受试者免疫细胞的遗传修饰步骤。在一些实施例中，遗传修饰包含用包含与B2M或HLA-A互补的本文所述shRNA的载体转导免疫细胞。在一些实施例中，遗传修饰包含使用CRISPR/Cas介导的基因组工程修饰免疫细胞的基因组以诱导B2M或HLA-A中的突变。在一些实施例中，该方法包含用一种或多种编码活化剂和抑制性受体的载体转导免疫细胞，从而产生表达活化剂和抑制性受体的免疫细胞。

本公开提供了遗传修饰的受试者免疫细胞的扩增步骤。遗传修饰的受试者免疫细胞可以在本领域已知的任何免疫细胞扩增系统中扩增，以生成用于施用的治疗剂量的免疫细胞。例如，用于包含控制器泵的系统中的生物反应器袋和允许自动进料和废物去除的探针可用于免疫细胞扩增。在底部具有气体渗透膜的细胞培养瓶可用于免疫细胞扩增。本文提供的扩增步骤包括本领域已知的能够扩增用于临床用途的免疫细胞的任何此类系统。免疫细胞在培养系统中在专门配制用于扩增的培养基中扩增。也可以通过在如本文所述的活化因子的存在下培养本公开的免疫细胞来促进扩增。本领域技术人员将理解，本文提供的扩增步骤也可以包括任何新发现的可用于扩增免疫细胞的培养系统、培养基或活化因子。

本公开提供了用于扩增的遗传修饰的受试免疫细胞的配制和冷藏保存步骤。提供的配制步骤包括，例如，洗去用于本文所述的治疗方法的免疫细胞的制备和扩增的过量组分。本领域已知的与免疫细胞相容的任何药学上可接受的配制介质或洗涤缓冲液可用于洗涤、稀释/浓缩免疫细胞，并制备用于施用的剂量。配制介质对于免疫细胞的施用可以是可接受的，例如用于静脉内输注的晶体溶液。

冷藏保存可以任选地用于长期储存免疫细胞。可以使用本领域已知的方法实现冷藏保存，包括例如在含有冷藏保存组分的冷藏保存培养基中保存细胞。冷藏保存组分可以包括例如二甲亚砜或甘油。保存在冷藏保存培养基中的免疫细胞可以通过将保存温度降低至-80℃至-196℃进行冷藏保存。

在一些实施例中，治疗方法包含确定受试者的HLA种系类型。在一些实施例中，在骨髓中确定HLA种系类型。

在一些实施例中，治疗方法包含确定EGFR的表达水平。在一些实施例中，在来自受试者的肿瘤组织样品中确定EGFR的表达水平。在一些实施例中，使用下一代测序确定EGFR的表达水平。在一些实施例中，使用RNA测序确定EGFR的表达水平。在一些实施例中，使用免疫组织化学确定EGFR的水平。

在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*02抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*02杂合型并且具有HLA-A*02丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*01抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*01杂合型并且具有HLA-A*01丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*03的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*03杂合型并且具有HLA-A*03丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-A*07抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-A*07杂合型并且具有HLA-A*07丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的包含HLA-C*07抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-C*07杂合型并且具有HLA-C*07丢失的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含在有需要的受试者中施用治疗有效剂量的包含HLA-B*07抑制性受体的免疫细胞，其中受试者被确定为HLA种系HLA-B*07杂合型并且具有HLA-B*07丢失的癌细胞。

在各种实施例中，本公开提供了治疗患有表达EGFR并且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者的方法；和/或治疗患有表达EGFR并丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02成年患者。

在一些实施例中，施用治疗有效剂量的本文所述的免疫细胞。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过静脉内注射施用。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过腹膜内注射施用。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁶个细胞、约1×10⁶个细胞、约2×10⁶个细胞、约3×10⁶个细胞、4×10⁶个细胞、约5×10⁶个细胞、约6×10⁶个细胞、约7×10⁶个细胞、约8×10⁶个细胞、约9×10⁶个细胞、约1×10⁷、约2×10⁷、约3×10⁷、约4×10⁷、约5×10⁷、约6×10⁷、约7×10⁷、约8×10⁷、约9×10⁷、约1×10⁸个细胞、约2×10⁸个细胞、约3×10⁸个细胞、约4×10⁸个细胞、约5×10⁸个细胞、约6×10⁸个细胞、约7×10⁸个细胞、约8×10⁸个细胞、约9×10⁸个细胞、约1×10⁹个细胞、约2×10⁹个细胞、约3×10⁹个细胞、约3×10⁹个细胞、约4×10⁹个细胞、约5×10⁹个细胞、约5×10⁹个细胞、约6×10⁹个细胞、约7×10⁹个细胞、约8×10⁹个细胞、约9×10⁹个细胞、约1×10¹⁰个细胞、约2×10¹⁰个细胞、约3×10¹⁰个细胞、约4×10¹⁰个细胞、约5×10¹⁰个细胞、约6×10¹⁰个细胞、约7×10¹⁰个细胞、约8×10¹⁰个细胞，或约9×10¹⁰个细胞。

在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁶个细胞至约9×10¹⁰个细胞、约1×10⁶个细胞至约5×10¹⁰个细胞、约2×10⁶个细胞至约5×10⁹个细胞、约3×10⁶个细胞至约5×10⁹个细胞、约4×10⁶个细胞至约3×10⁹个细胞、约5×10⁶个细胞至约2×10⁹个细胞、约6×10⁶个细胞至约1×10⁹个细胞、0.5×10⁶个细胞至约6×10⁹个细胞、约1×10⁶个细胞至约5×10⁹个细胞、约2×10⁶个细胞至约5×10⁹个细胞、约3×10⁶个细胞至约4×10⁹个细胞、约4×10⁶个细胞至约3×10⁹个细胞、约5×10⁶个细胞至约2×10⁹个细胞、约6×10⁶个细胞至约1×10⁹个细胞、0.5×10⁶个细胞至约6×10⁸个细胞、约1×10⁶个细胞至约5×10⁸个细胞、约2×10⁶个细胞至约5×10⁸个细胞、约3×10⁶个细胞至约4×10⁸个细胞、约4×10⁶个细胞至约3×10⁸个细胞、约5×10⁶个细胞至约2×10⁸个细胞、约6×10⁶个细胞至约1×10⁸个细胞、约7×10⁶个细胞至约9×10⁸个细胞、约8×10⁶个细胞至约8×10⁸个细胞、约9×10⁶个细胞至约7×10⁸个细胞、约1×10⁷个细胞至约6×10⁸个细胞、约2×10⁷个细胞至约5×10⁸个细胞、约7×10⁶个细胞至约9×10⁷个细胞、约8×10⁶个细胞至约8×10⁷个细胞、约9×10⁶个细胞至约7×10⁷个细胞、约1×10⁷个细胞至约6×10⁷个细胞，或约2×10⁷个细胞至约5×10⁷个细胞。

在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁵个细胞至约9×10¹⁰个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁶个细胞至约1×10¹⁰个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁶个细胞至约5×10⁹个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁶个细胞至约1×10⁹个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁶个细胞至约6×10⁸个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁶个细胞至约9×10¹⁰个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁷个细胞至约1×10¹⁰个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁷个细胞至约5×10⁹个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁷个细胞至约1×10⁹个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁷个细胞至约6×10⁸个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁸个细胞至约9×10¹⁰个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁸个细胞至约1×10¹⁰个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁸个细胞至约5×10⁹个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×10⁸个细胞至约1×10⁹个细胞。在治疗剂量中提及的术语“约”可以是例如±0.5×10⁶个细胞、±0.5×10⁷个细胞或±0.5×10⁸个细胞。

试剂盒和制品

本公开提供了包含编码本文所述的受体的多核苷酸和载体的试剂盒和制品，以及包含本文所述的受体的免疫细胞。在一些实施例中，试剂盒包含制品，如小瓶、注射器和使用说明书。

在一些实施例中，试剂盒包含多核苷酸或载体，其包含编码本公开的一种或多种受体的序列。

在一些实施例中，试剂盒包含多种免疫细胞，该免疫细胞包含本文所述的第一受体和第二受体。在一些实施例中，多种免疫细胞包含多个T细胞。

在一些实施例中，试剂盒进一步包含使用说明书。

列举的实施例

实施例1.一种免疫细胞，其包含：

a.)第一受体，其包含对表皮生长因子受体(EGFR)特异性的细胞外配体结合结构域；以及

b.)第二受体，其包含对由于杂合性丢失而在EGFR+癌症中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，

其中所述第一受体是响应于EGFR的活化剂受体；并且其中所述第二受体是响应于所述非靶抗原的抑制性受体。

实施例2.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合MHC蛋白的等位基因变体。

实施例3.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A、HLA-B或HLA-C蛋白的等位基因变体。

实施例4.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*02。

实施例5.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-C*07或HLA-B*07。

实施例6.根据实施例3至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含如公开于表5中的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表5的所述CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。

实施例7.根据实施例3至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:101-106或SEQ ID NO:106-112的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表5的所述CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。

实施例8.根据实施例3至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自表4中公开的多肽序列的多肽序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

实施例9.根据实施例4所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:89-100中任一个；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

实施例10.根据实施例1至9中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。

实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，其包含选自表3所示序列组的一组重链互补决定区(HC-CDR)；和/或可变轻链(VL)部分，其包含来自表3所示序列组的一组轻链互补决定区(LC-CDR)；或在每个CDR中具有至多1、2、3、4个取代、插入或缺失的CDR序列。

实施例12.根据实施例1至11中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，其具有选自表2中所示的VH序列的序列；和/或包含表2中所示的序列的可变轻链(VL)部分；或与其具有至少70％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。

实施例13.根据实施例1至12中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自表1中所示序列组的序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

实施例14.根据实施例1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:9-18组成的组的scFv序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

实施例15.根据实施例1至14中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。

实施例16.根据实施例15所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域包含与SEQ ID NO:129至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。

实施例17.根据实施例1至16中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。

实施例18.根据实施例17所述的免疫细胞，其中所述LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:133至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。

实施例19.根据实施例1至18中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。

实施例20.根据实施例19所述的免疫细胞，其中所述LILRB1铰链结构域包含与SEQID NO:132、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。

实施例21.根据实施例1至20中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域、LILRB1跨膜结构域、LILRB1铰链结构域、任何这些的功能变体或其组合。

实施例22.根据实施例21所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:128或与SEQ ID NO:128至少95％相同的序列。

实施例23.根据实施例1至22中任一项所述的免疫细胞，其中所述EGFR+癌细胞是肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺导管癌细胞、结肠直肠癌细胞、头颈癌细胞、食道和胃腺癌细胞、卵巢癌细胞、多形性成胶质细胞瘤细胞、宫颈鳞状细胞癌细胞、肾癌细胞、乳头状肾癌细胞、肾透明细胞癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、胆管癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、肉瘤细胞、甲状腺癌细胞、胸腺癌细胞、胃癌细胞或子宫癌细胞。

实施例24.根据实施例23所述的免疫细胞，其中所述EGFR+癌细胞是肺癌细胞。

实施例25.根据实施例1至24中任一项所述的免疫细胞，其中所述EGFR+癌细胞是不表达HLA-A*02的EGFR+/HLA-A*02-癌细胞；或衍生自不表达HLA-A*02的HLA-A*02+个体的癌细胞。

实施例26.根据实施例25所述的免疫细胞，其中所述EGFR+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自EGFR+/HLA-A*02+细胞。

实施例27.根据实施例1至26中任一项所述的免疫细胞，其中在具有杂合性丢失的所述EGFR/HLA-A*02-癌细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。

实施例28.根据实施例1至27中任一项所述的免疫细胞，其中在未通过杂合性丢失而丢失HLA-A*02的EGFR+细胞的存在下，所述第一受体和所述第二受体一起不特异性活化所述免疫细胞。

实施例29.根据实施例1至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞、巨噬细胞、NK细胞、iNKT细胞或γδT细胞。

实施例30.根据实施例29所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。

实施例31.根据实施例1至30中任一项所述的免疫细胞，其中MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。

实施例32.根据实施例30所述的免疫细胞，其中所述MHC I类基因是β-2-微球蛋白(B2M)。

实施例33.根据实施例32所述的免疫细胞，其进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸包含干扰RNA，所述干扰RNA包含与B2M mRNA(SEQ ID NO:172)的序列互补的序列。

实施例34.根据实施例33所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA能够诱导RNAi介导的所述B2M mRNA的降解。

实施例35.根据实施例33所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。

实施例36.根据实施例35所述的免疫细胞，其中所述shRNA包含：

a.)第一序列，其从5'端至3'端具有与所述B2M mRNA的序列互补的序列；以及

b.)第二序列，其从5'端至3'端具有与所述第一序列互补的序列，

其中所述第一序列和所述第二序列形成所述shRNA。

实施例37.根据实施例32所述的免疫细胞，其包含对编码B2M(SEQ ID NO:170)的序列的一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰减少B2M的表达和/或消除其功能。

实施例38.根据实施例37所述的免疫细胞，其中所述一种或多种修饰包含编码B2M的内源性基因的一种或多种失活突变。

实施例39.根据实施例38所述的免疫细胞，其中所述一种或多种失活突变包含缺失、插入、取代或移码突变。

实施例40.根据实施例38至39中任一项所述的免疫细胞，其中用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入所述一种或多种失活突变，所述引导核酸特异性靶向编码B2M(SEQ ID NO:170)的所述内源性基因的序列。

实施例41.根据实施例31所述的免疫细胞，其中所述MHC I类基因是HLA-A*02。

实施例42.根据实施例41所述的免疫细胞，其进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸包含干扰RNA，所述干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA(SEQ ID NO:171)的序列互补的序列。

实施例43.根据实施例42所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA能够诱导RNA干扰(RNAi)介导的所述HLA-A*02mRNA的降解。

实施例44.根据实施例43所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)，其包含：

a.)第一序列，其从5'端至3'端具有与所述HLA-A*02mRNA的序列互补的序列；以及

b.)第二序列，其从5'端至3'端具有与所述第一序列互补的序列，

其中所述第一序列和所述第二序列形成所述shRNA。

实施例45.根据实施例41所述的免疫细胞，其包含对编码HLA-A*02(SEQ ID NO:169)的内源性基因的序列的一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰降低HLA-A*02的表达和/或消除其功能。

实施例46.根据实施例45所述的免疫细胞，其中所述一种或多种修饰包含编码HLA-A*02的所述内源性基因的一种或多种失活突变。

实施例47.根据实施例45或实施例46所述的免疫细胞，其中用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入所述一种或多种失活突变，所述引导核酸特异性靶向编码HLA-A*02的所述内源性基因的序列。

实施例48.根据实施例1所述的免疫细胞，其中：

a.)所述第一受体包含SEQ ID NO:177，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.)所述第二受体包含SEQ ID NO:174或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

实施例49.根据实施例1所述的免疫细胞，其中：

a.)所述第一受体包含SEQ ID NO:177，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.)所述第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

实施例50.根据实施例1所述的免疫细胞，其中：

a.)所述第一受体包含SEQ ID NO:175，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.)所述第二受体包含SEQ ID NO:174，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

实施例51.根据实施例1所述的免疫细胞，其中：

a.)所述第一受体包含SEQ ID NO:175，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.)所述第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

实施例52.根据实施例1所述的免疫细胞，其中：

a.)所述第一受体包含SEQ ID NO:176，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.)所述第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

实施例53.根据实施例1所述的免疫细胞，其中：

a.)所述第一受体包含SEQ ID NO:176，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.)所述第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

实施例54.根据实施例48至53中任一项所述的免疫细胞，其进一步包含T2A自切割肽，其中所述T2A自切割肽包含SEQ ID NO:178，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

实施例55.根据实施例48至54中任一项所述的免疫细胞，其进一步包含干扰RNA，其中所述干扰RNA包含SEQ ID NO:179，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

实施例56.根据实施例1至55中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是自体的。

实施例57.根据实施例1至55中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是同种异体的。

实施例58.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据实施例1至57中任一项所述的免疫细胞。

实施例59.根据实施例58所述的药物组合物，其中所述免疫细胞表达所述第一受体和所述第二受体两者。

实施例60.根据实施例59所述的药物组合物，其中至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的所述免疫细胞表达所述第一受体和所述第二受体两者。

实施例61.根据实施例59所述的药物组合物，其中至少90％的所述免疫细胞表达所述第一受体和所述第二受体两者。

实施例62.根据实施例58至61中任一项所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

实施例63.根据实施例58至62中任一项所述的药物组合物，其用作治疗EGFR+癌症的药物。

实施例64.一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：

a.)第一受体，其包含对内皮生长因子受体(EGFR)特异性的细胞外配体结合结构域；以及

b.)第二受体，其包含对由于杂合性丢失而在所述EGFR+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，

其中所述第一受体是响应于所述EGFR+癌细胞上的EGFR的活化剂受体；并且其中所述第二受体是响应于所述非靶抗原的抑制性受体。

实施例65.一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含用于生成根据实施例1至57中任一项所述的免疫细胞的一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码所述第一受体和所述第二受体的多核苷酸序列。

实施例66.一种载体，其包含根据实施例64或65所述的一种或多种多核苷酸。

实施例67.一种杀死在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的EGFR+癌细胞的方法，其包含向受试者施用有效量的根据实施例1至57中任一项所述的免疫细胞或根据实施例58至62中任一项所述的药物组合物。

实施例68.根据实施例67所述的方法，其中所述EGFR+癌细胞是肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺导管癌细胞、结肠直肠癌细胞、头颈癌细胞、食道和胃腺癌细胞、卵巢癌细胞、多形性成胶质细胞瘤细胞、宫颈鳞状细胞癌细胞、肾癌细胞、乳头状肾癌细胞、肾透明细胞癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、胆管癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、肉瘤细胞、甲状腺癌细胞、胸腺癌细胞、胃癌细胞或子宫癌细胞。

实施例69.根据实施例67所述的方法，其中所述EGFR+癌细胞是肺癌细胞。

实施例70.根据实施例67所述的方法，其中所述EGFR+癌细胞是不表达HLA-A*02的EGFR+/HLA-A*02-癌细胞；或衍生自不表达HLA-A*02的HLA-A*02+个体的癌细胞。

实施例71.根据实施例70所述的方法，其中所述EGFR+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自EGFR+/HLA-A*02+细胞。

实施例72.一种治疗患有在编码非靶抗原的基因座处具有杂合性丢失的EGFR+肿瘤的受试者体内EGFR+癌症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的根据实施例1至57中任一项所述的免疫细胞或根据实施例58至62中任一项所述的药物组合物。

实施例73.根据实施例72所述的方法，其中所述受试者是患有表达EGFR并且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者。

实施例74.根据实施例72所述的方法，其中所述受试者是患有表达EGFR并且已经丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02患者。

实施例75.一种治疗受试者体内癌症的方法，其包含：

a.)确定所述受试者的非恶性细胞和癌细胞中的非靶抗原的基因型或表达水平；

b.)确定所述受试者的癌细胞中的EGFR的表达水平；以及

c.)如果所述非恶性细胞表达所述非靶抗原并且所述癌细胞不表达所述非靶抗原，并且所述癌细胞是EGFR阳性的，则向所述受试者施用有效量的根据实施例1至57中任一项所述的免疫细胞或根据实施例58至62中任一项所述的药物组合物。

实施例76.根据实施例67至75中任一项所述的方法，其中施用根据实施例1至57中任一项所述的免疫细胞或根据实施例58至62中任一项所述的药物组合物减小了所述受试者体内肿瘤的大小。

实施例77.根据实施例76所述的方法，其中所述肿瘤减小了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

实施例78.根据实施例76所述的方法，其中所述肿瘤被消除。

实施例79.根据实施例67至75中任一项所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物阻止了所述受试者体内肿瘤的生长。

实施例80.根据实施例67至75中任一项所述的方法，其中施用根据实施例1至57中任一项所述的免疫细胞或根据实施例58至62中任一项所述的药物组合物减少了所述受试者体内肿瘤的数目。

实施例81.根据实施例67至80中任一项所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物导致所述受试者体内癌细胞而非正常细胞的选择性杀伤。

实施例82.根据实施例81所述的方法，其中至少约60％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约65％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约70％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约75％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约80％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约85％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约90％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％的被杀死的细胞是癌细胞。

实施例83.根据实施例81所述的方法，其中施用所述免疫细胞或药物组合物导致杀伤所述受试者的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的所述癌细胞。

实施例84.根据实施例67至83中任一项所述的方法，其中与施用包含所述第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用所述免疫细胞或所述药物组合物对所述受试者产生更少的副作用。

实施例85.一种制备多种免疫细胞的方法，其包含：

a.)提供多种免疫细胞，以及

b.)用根据实施例64或实施例65所述的多核苷酸系统或根据实施例66所述的载体转化所述多种免疫细胞。

实施例86.一种试剂盒，其包含根据实施例1至57中任一项所述的免疫细胞或根据实施例58至62中任一项所述的药物组合物。

实施例87.根据实施例86所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书。

实施例88.一种应答癌细胞中杂合性丢失的免疫细胞，其包含：

a.第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对选自以下的靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域：

i.癌细胞特异性抗原，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或

ii.表皮生长因子受体(EGFR)，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；以及

b.第二受体，任选地为抑制性受体，其包含对由于杂合性丢失而在所述癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域。

实施例89.根据实施例88所述的方法，其中所述非靶抗原包含多态性。

实施例90.根据实施例89所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原包含与SEQ ID NO:87共享至少95％同一性的COLEC12抗原并且所述多态性在SEQ ID NO:87的第522位处包含S或P。

实施例91.根据实施例89所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原包含与SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135共享至少95％同一性的APCDD1抗原，并且所述多态性选自由以下组成的组：

a.SEQ ID NO:88的第150位处的V、I或L；

b.SEQ ID NO:134的第165位处的Y或S；以及

c.SEQ ID NO:135的第28位处的Q或R。

实施例92.根据实施例89所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原包含与SEQ ID NO:86共享至少95％同一性的CXCL16抗原并且所述多态性选自由以下组成的组：

a.SEQ ID NO:86的第142位处的I或T；以及

b.SEQ ID NO:86的第200位处的A或V。

实施例93.根据实施例88或89所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原包含HLA-A*02。

实施例94.根据实施例88至93中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原由所述癌细胞表达。

实施例95.根据实施例88至94中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原不由所述癌细胞表达。

实施例96.根据实施例88至95中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原由非靶细胞表达。

实施例97.根据实施例88至96中任一项所述的免疫细胞，其中所述非靶细胞表达靶抗原和所述非靶抗原两者。

实施例98.根据实施例88至97中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是癌细胞特异性抗原。

实施例99.根据实施例88至98中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。

实施例100.根据实施例88至99中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞是肺癌细胞、成胶质细胞瘤细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞或结肠直肠癌细胞。

实施例101.根据实施例88至100中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞表达EGFR。

实施例102.根据实施例88至101中任一项所述的免疫细胞，其中在所述癌细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。

实施例103.根据实施例102所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞、巨噬细胞、NK细胞、iNKT细胞或γδT细胞。

实施例104.根据实施例103所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。

实施例105.根据实施例88至104中任一项所述的免疫细胞，其中所述EGFR包含与SEQ ID NO:1-8中任一个共享至少95％同一性的序列。

实施例106.根据实施例88至105中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是T细胞受体(TCR)。

实施例107.根据实施例88至106中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。

实施例108.根据实施例106或107所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)，或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。

实施例109.根据实施例106或107所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含scFv。

实施例110.根据实施例109所述的免疫细胞，其中所述scFv包含选自由SEQ IDNO:9-18组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

实施例111.根据实施例109所述的免疫细胞，其中所述scFv包含或基本上由选自由SEQ ID NO:9-18组成的组的序列组成。

实施例112.根据实施例106或107所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含VH和VL结构域。

实施例113.根据实施例112所述的免疫细胞，其中所述VH结构域包含选自由SEQID NO:19-24组成的组的序列，或表2中公开的VH序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

实施例114.根据实施例112所述的免疫细胞，其中所述VH结构域包含或基本上由选自由SEQ ID NO:19-24组成的组的序列组成，或表2中公开的VH序列。

实施例115.根据实施例112至114中任一项所述的免疫细胞，其中所述VL结构域包含选自由SEQ ID NO:25-30组成的组的序列，或表2中公开的VH序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

实施例116.根据实施例112至114中任一项所述的细胞，其中所述VL结构域包含或基本上由选自由SEQ ID NO:25-30组成的组的序列组成，或表2中公开的VL序列。

实施例117.根据实施例105至107中任中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:31-65组成的组的互补决定区(CDR)，或表3中公开的CDR序列。

实施例118.根据实施例88至117中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)，或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。

实施例119.根据实施例88或93至118中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含scFv。

实施例120.根据实施例119所述的免疫细胞，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:89-100中任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

实施例121.根据实施例119所述的免疫细胞，其中所述scFv包含或基本上由SEQID NO:89-100中任一个的序列组成。

实施例122.根据实施例88或93至118中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:101-112组成的组的CDR。

实施例123.根据实施例88至122中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。

实施例124.根据实施例123所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域包含与SEQ ID NO:124至少95％相同的序列。

实施例125.根据实施例88至124中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。

实施例126.根据实施例125所述的免疫细胞，其中所述LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:133至少95％相同的序列。

实施例127.根据实施例88至126中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体。

实施例128.根据实施例127所述的免疫细胞，其中所述LILRB1铰链结构域包含与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126至少95％相同的序列。

实施例129.根据实施例88至128中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域或其功能变体。

实施例130.根据实施例129所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:128或与SEQ ID NO:128至少95％相同的序列。

实施例131.根据实施例88至130中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞、巨噬细胞、NK细胞、iNKT细胞或γδT细胞。

实施例132.根据实施例131所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。

实施例133.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据实施例88至132任一项所述的免疫细胞。

实施例134.根据实施例133所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

实施例135.根据实施例133或134所述的药物组合物，其用作治疗癌症的药物。

实施例136.一种多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：

a.第一受体，任选地为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对选自以下的靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域：

i.癌细胞特异性抗原，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；或

ii.表皮生长因子受体(EGFR)，或其与主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的复合物中的肽抗原；以及

b.第二受体，任选地为抑制性受体，其包含对由于杂合性丢失而在所述癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域。

实施例137.根据实施例136所述的多核苷酸系统，其中所述非靶抗原包含多态性。

实施例138.根据实施例137所述的多核苷酸系统，其中所述非靶抗原是与SEQ IDNO:87共享至少95％同一性的COLEC12抗原并且所述多态性在SEQ ID NO:87的第522位处包含S或P。

实施例139.根据实施例137所述的多核苷酸系统，其中所述非靶抗原是与SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135共享至少95％同一性的APCDD1抗原，并且所述多态性选自由以下组成的组：

a.SEQ ID NO:88的第150位处的V、I或L；

b.SEQ ID NO:134的第165位处的Y或S；以及

c.SEQ ID NO:135的第28位处的Q或R。

实施例140.根据实施例137所述的多核苷酸系统，其中所述非靶抗原是与SEQ IDNO:86共享至少95％同一性的CXCL16抗原并且所述多态性选自由以下组成的组：

a.SEQ ID NO:86的第142位处的I或T；以及

b.SEQ ID NO:86的第200位处的A或V。

实施例141.根据实施例136或137所述的多核苷酸系统，其中所述非靶抗原是HLA-A*02。

实施例142.一种载体，其包含根据实施例136至141任一项所述的一种或多种多核苷酸。

实施例143.一种杀死受试者体内多种癌细胞和/或治疗癌症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的根据实施例88至132中任一项所述的免疫细胞或根据实施例46至48中任一项所述的药物组合物。

实施例144.根据实施例143所述的方法，其中多种癌细胞表达所述靶抗原。

实施例145.根据实施例143或144所述的方法，其中多种癌细胞不表达所述非靶抗原。

实施例146.一种制备多种免疫细胞的方法，其包含：

a.提供多种免疫细胞，以及

b.用根据实施例136至141中任一项所述的多核苷酸系统或根据实施例142所述的载体转化所述多种免疫细胞。

实施例147.一种试剂盒，其包含根据实施例88至132中任一项所述的免疫细胞或根据实施例133至135中任一项所述的药物组合物。

实施例148.根据实施例147所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书。

实例

以下实例仅用于说明而不限制本公开的范围。在整个实例中，术语“阻断剂抗原”用于描述非靶抗原的实施例。

实例1：鉴定由于杂合性丢失而在癌细胞中丢失的阻断剂靶

使用生物信息学管道鉴定候选阻断剂靶。在人类基因组中搜索在结直肠癌中具有高杂合性丢失(大于0.5)的细胞外结构域中具有常见非同义变体的基因。在dbSNP中搜索具有非同义变体的基因，dbSNP是一种单核苷酸多态性数据库，其还包括小规模插入和缺失以及发表、群体频率、分子后果和基因组作图信息。常见变异被定义为在至少一个主要群体中具有大于或等于0.01的次要等位基因频率(MAF)并且在NCBI中具有至少两个不相关的具有次要等位基因的个体。大于或等于0.1的MAF作为常见变异的标准。焦点集中在染色体17和18上，因为这些染色体在结肠直肠癌中具有高LOH。如上所述，针对膜蛋白、结肠表达和细胞外结构域中常见的非同义变体筛选基因。图18示出了搜索过程的概要。

本分析中使用的其它数据库包括以下：Uniprot(通用蛋白质资源)，其是由EMBL-EBI、SIB和PIR托管的用于蛋白质序列和注释数据的资源。GTEx(基因型-组织表达)用作组织特异性基因表达和调节的公共资源。它含有来自近1000名个体的54个非患病组织部位的样品。TCGA(癌症基因组图谱)用作超过20,000种原发性癌症和跨越33种癌症类型的匹配正常样品的资源。TCGA-COADREAD数据集是结肠腺癌和直肠腺癌数据集。CCLE(癌症细胞系百科全书)含有关于57种结肠直肠癌(CRC)细胞系的信息。

RNASeqDB是来自GTEx和TCGA的处理数据的数据库，使用相同的流水线，其允许来自纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)的比较研究。分析来自GTEx的372份TCGA-COADREAD样品和339份正常结肠样品。

COLEC12、CXCL16和APCDD1被鉴定为潜在的阻断剂靶。表14总结了这些基因在结肠直肠癌中的表达数据。来自UCSC Xena浏览器(用于TCGA)和CCLE样品的表达数据。

表14.表示

表15总结了变体和次要等位基因频率。

表15.位置、特征和变化

表16.各种癌症中的LOH频率

		LOH频率
					COLEC12	CXCL16	APCDD1
所有癌症	0.23	0.36	0.23
				CRC	0.59	0.58	0.6
肺	0.3	0.58	0.29
				胰腺	0.3	0.48	0.28
卵巢	0.39	0.74	0.36
				DBCL	0.15	0.23	0.13
血液	0.06	0.11	0.05
				变体	S/P	I/T	Y/S
MAF	0.63	0.46	0.25

实例2：阻断剂配体结合结构域的鉴定

如果CDR序列未知，则对候选阻断剂抗原的公开可用抗体进行测序。如果没有针对候选阻断剂靶的抗体可用，则通过用纯化的蛋白质(例如，COLEC12、CXCL16和实例中描述的其它靶)免疫小鼠、大鼠或兔来生成这些抗体。来自免疫动物的血清用于筛选与阻断剂靶结合的mAb。使用huTARG系统也生成针对阻断剂靶的抗体。然后分离具有所需特异性的抗体并测序以确定CDR序列。

使用标准分子生物学技术，从抗体到阻断剂靶的CDR序列被用于生成scFv。使用标准分子生物学技术将候选scFv融合到抑制性受体铰链或跨膜结构域以生成抑制性受体。候选scFv也融合到活化剂受体铰链或跨膜结构域(例如，CAR)以生成全长活化剂受体，用作scFv结合靶抗原的阳性对照。候选scFv在抑制性受体环境中工作的能力在Jurkat细胞中使用NFAT-荧光素酶报告基因测定法进行测定。

实例3：Jurkat和原代T细胞活化实验的方法

细胞培养

编码NFAT荧光素酶报告基因的Jurkat细胞获自BPS Bioscience公司。在培养中，将Jurkat细胞维持在补充有10％ FBS、1％ Pen/Strep和0.4mg/mL G418/遗传霉素的RPMI培养基中。本研究中使用的所有其它细胞系均获自ATCC，并按照ATCC的建议进行维持。

Jurkat细胞转染

根据制造商的方案使用以下设置通过100uL形式的Neon电穿孔系统(龙沙公司)瞬时转染Jurkat细胞：3个脉冲，1500V，10毫秒。每1e6细胞用1至3ug活化剂CAR或TCR构建体和1至3ug阻断剂构建体或空载体进行共转染，并在补充有20％热灭活FBS和0.1％ Pen/Strep的RPMI培养基中回收。

Jurkat-NFAT-荧光素酶活化研究

将Jurkat细胞重悬于15uL补充有10％热灭活FBS和0.1％ Pen/Strep的RPMI中，添加到负载肽的珠中并共培养6小时。使用ONE-Step萤光素酶测定系统(BPS Bioscience公司)评估Jurkat发光。测定以技术重复进行。

原代T细胞转导、扩增和富集

将冷冻的PBMC在37℃水浴中解冻，并在含有1％人血清的LymphoONE(Takara公司)中以1e6个细胞/mL培养，并使用补充有300IU/ml IL-2的1:100T细胞TransAct(美天旎公司)活化。24小时后，以MOI为5向PBMC中添加慢病毒。将PBMC再培养2至3天以使细胞在TransAct刺激下扩增。扩增后，根据制造商的说明书使用抗PE微珠(美天旎公司)富集活化剂和阻断剂转导的原代T细胞。简言之，将原代T细胞与EGFR-Fc(R&D系统公司)在MACS缓冲液(0.5％ BSA+2mM EDTA的PBS溶液)中以1:25稀释度在室温下孵育30分钟。将细胞在MACS缓冲液中洗涤3次，并在MACS缓冲液中于室温下在二抗(1:1200)中孵育30分钟。然后将细胞在抗PE微珠中孵育并通过LS柱(美天旎公司)。

原代T细胞体外细胞毒性研究

为了用pMHC靶进行细胞毒性研究，将富集的原代T细胞与表达GFP或RFP的HeLa或HCT116靶细胞一起孵育。对于“肿瘤”细胞，使用WT HeLa或HLA-A*02敲除的HCT116，对于“正常”细胞，使用HLA-A*02转导的HeLa或WT HCT116。使用IncuCyte活细胞成像仪对共培养物进行成像，并使用靶细胞荧光面积来定量活靶细胞。

实例4：HLA-A*02抑制性受体阻断EGFR介导的Jurkat细胞活化

具有HLA-A-A*02抗原结合结构域和LIR-1ICD(C1765或C2162)的抑制性受体阻断表达具有EGFR抗原结合结构域(例如CT479、CT486或CT489)的活化剂CAR的Jurkat细胞的活化的能力使用如前所述的NFAT-荧光素酶报告系统进行测定。正常HeLa肿瘤细胞(EGFR+和HLA-A*02-)用作靶细胞。EGFR+/HLA-A*02-HeLa细胞也用编码HLA-A*02+的多核苷酸转导以生成EGFR+/HLA-A*02+HeLa细胞，用作表达活化剂和阻断剂抗原的靶细胞。

如图1A所示，与不表达阻断剂的Jurkat细胞的CAR E最大相比，表达EGFR CAR(CT479)的Jurkat细胞中HLA-A*02LIR-1阻断剂(C1765)的表达将CAR E_最大偏移>5倍。

此外，随着靶细胞上HLA-A2表达水平的降低，观察到了较低的阻断。正常HCT116细胞是EGFR+和HLA-A*02+。使用抗EGFR抗体和抗HLA-A*02抗体(BB7.2)在用编码HLA-A*02多核苷酸的多核苷酸转导的HCT116细胞和HeLa细胞中测定EGFR和HLA-A*02的水平，随后进行FAC分选。如图2A和2B所示，HCT116细胞具有比转导的HeLa细胞更低水平的阻断剂HLA-A*02抗原。当表达EGFR CAR和HLA-A*02LIR-1阻断剂的Jurkat细胞与表达EGFR和HLA-A*02抗原的HCT116靶细胞一起呈递时，HLA-A*02LIR-1阻断剂的存在将EGFR CAR的E_最大偏移1.8倍(图3B)。相反，表达较高水平HLA-A*02抗原的转导HeLa细胞能够介导>5倍的EGFR CAR E_最大偏移(图1B、图17B和图3D)。作为对照，EGFR敲除的HCT116细胞的活化最小(图3A)。

使用EGFR CAR和HLA-A*02LIR-1阻断剂实现50％阻断所必需的阻断剂与活化剂的比率使用图4A和图4B中所示的基于珠的系统进行测定。

为了测定活化剂抗原的EC50，用不同浓度的活化剂抗原包被活化剂珠以测定EC50。将不相关的蛋白质添加到每种浓度中，使得总蛋白质浓度相同，并将恒定量的珠添加到表达EGFR CAR的Jurkat效应细胞中(图4A)。

为了测定阻断剂抗原IC50，用EC50浓度(在图4A中测定)的活化剂抗原包被珠，并用不同浓度的阻断剂抗原包被珠。以每种浓度添加不相关蛋白，使得总蛋白浓度保持相同，并将恒定量的珠添加到表达EGFR CAR或EGFR CAR和HLA-A*02LIR-1阻断剂的Jurkat效应细胞中(图4B)。

实例5：特异性受体对的表征

用EGFR scFv CAR活化剂(CT-479、CT-482、CT-486、CT-487、CT-488或CT-489，如图5和7至9所示)，或用EGFR scFv CAR活化剂和HLA-A*02PA2.1 scFv LIR1抑制剂(C1765或C2162)转染的T细胞与HeLa靶细胞共培养。正常HeLa细胞系表达EGFR但不表达HLA-A*02，被转导以表达HLA-A*02抑制性受体靶。将细胞以1:1的效应物与靶(E:T)的比例共培养。在图5的右下方，首先指示效应细胞受体表达，而HeLa细胞表达在括号中。从图5可以看出，当相同的HLA-A*02PA2.1 scFv LIR1抑制剂与不同的EGFR活化剂受体一起使用时，观察到不同程度的阻断。

还测定了HLA-A*02PA2.1 scFv LIR1抑制剂(C1765)阻断与表达EGFR(靶A)或EGFR和HLA-A*02(靶AB)的HCT.116细胞共培养的T细胞的EGFR scFv CAR活化的能力(图10)。与HeLa细胞一样，当相同的HLA-A*02PA2.1 scFv LIR1抑制剂与不同的EGFR活化剂受体一起使用时，观察到不同程度的阻断。

还测定了当Jurkat细胞与HeLa靶细胞共培养时，HLA-A*02PA2.1 scFv LIR1抑制剂(C1765)阻断Jurkat细胞的EGFR scFv CAR活化的能力。结果如图2所示。与原代T细胞中的结果相似，当相同的HLA-A*02PA2.1 scFv LIR1抑制剂与不同的EGFR活化剂受体一起使用时，观察到不同程度的阻断。

在仅表达活化配体的靶细胞或表达活化配体和阻断配体两者的靶细胞存在下，在表达活化剂或特异性活化剂/阻断剂对的免疫细胞中测量免疫细胞活化(图6A)。计算测试的CAR活化剂和阻断剂对的选择性比率(SR)。通过计算在仅表达活化配体的靶细胞存在下表达活化剂/阻断剂对的免疫细胞的活化与在表达活化剂配体和阻断配体两者的靶细胞存在下表达活化剂/阻断剂对的免疫细胞的活化的比率来确定SR。选择的靶向EGFR的CAR活化剂与人源化阻断剂(C2162)或小鼠阻断剂(C1765)成对表达。在与人源化阻断剂配对的靶向EGFR的CAR活化剂中，对CT489的选择性比率达到24.2；对CT486的选择性比率达到17；对CT487的选择性比率达到5.0；并且对CT487的选择性比率达到5.0。在与小鼠阻断剂配对的靶向EGFR的CAR活化剂中，对CT489的选择性比率为21.6；对CT486的选择性比率为15.7；对CT487的选择性比率为18.4；并且对CT487的选择性比率为21.2(图6A)。还测定了每个EGFR靶向活化剂和抑制性受体对的最大特异性杀伤。对于所有配对，特异性杀伤超过约60％，表明阻断剂的选择不显著影响EGFR靶向活化剂受体的T细胞活化。然而，特异性活化剂和特异性阻断剂对的配对对选择性比率具有影响，表明通过促进特异性活化剂/抑制性受体对的脱靶杀伤是不可预测的。

在单独表达CAR活化剂或表达CAR活化剂和人源化阻断剂或表达小鼠阻断剂的免疫细胞中测定活化剂和阻断剂的敏感性(图6B)。为了测定活化剂的敏感性，将免疫细胞在EGFR阴性靶细胞存在下孵育。在孵育之前，用EGFR mRNA滴定靶细胞，导致EGFR表达水平增加(图6B，左图)。为了测定阻断剂的敏感性，在表达EGFR的HLA-A*02阴性靶细胞(约53,000个EGFR分子/细胞)存在下孵育免疫细胞。在孵育之前，用HLA-A*02mRNA滴定靶细胞，导致HLA-A*02表达水平增加(图6B，右图)。计算每种CAR活化剂和阻断剂与不同CAR活化剂组合的EC₅₀值(表5.1)。结果进一步证实特异性活化剂受体对抑制性受体敏感性有影响。

表5.1

活化剂	活化剂EC50(ng)	小鼠阻断剂EC50(ng)	人阻断剂EC50(ng)
				CT486	5,300	4,700	4,000
CT487	3,500	3,500	2,900
				CT488	4,700	4,700	3,500
CT489	3,100	4,200	3,200

实例6：抑制性受体可逆性降低T细胞中活化剂受体的表面水平

用EGFR scFv CAR活化剂(CT-479、CT-482、CT-486、CT-487或CT-488)和HLA-A*02PA2.1 scFv LIR1抑制剂(C1765)转导来自两个HLA-A*02阴性供体的原代T细胞。通过在阻断剂和活化剂受体上进行FACS分选，或通过对阻断剂和活化剂受体进行双柱纯化来富集转导的细胞。转导的T细胞与HeLa靶细胞共培养。正常HeLa细胞系表达EGFR但不表达HLA-A*02，但被转导以表达HLA-A*02抑制性受体靶。将细胞以1:1的效应物与靶(E:T)的比例共培养。120小时后，使用结合活化剂和抑制性受体的标记肽和荧光活化的细胞分选分析EGFRCAR活化剂的表面表达。与表达活化剂和阻断剂配体的HeLa细胞共培养后活化剂表面水平的变化对应于T细胞杀死靶细胞的能力(比较图5和图11A)。

将表达CT-482EGFR scFv CAR活化剂和HLA-A*02PA2.1 scFv LIR1抑制剂(C1765)组合的T细胞与表达EGFR(靶A)、HLA-A*02(靶B)、相同细胞上的EGFR和HLA-A*02的组合(靶AB)的HeLa细胞、不同细胞上的表达靶A和靶AB的HeLa细胞的混合群体，或不同细胞上的表达靶B和靶AB的HeLa细胞的混合群体共培养(图12A至12B)。将T细胞与HeLa靶细胞以效应细胞与靶细胞的比例为1:1培养。当T细胞与HeLa细胞的靶A+靶AB群体共培养时，活化剂的水平降低，然后恢复(图12A)。此外，活化剂和阻断剂抗原必须一起存在于同一细胞上，以触发效应T细胞上活化剂表面表达的丢失。与活化剂相反，阻断剂的表达在很大程度上没有变化(图12B)。

图13示出了确定T细胞的细胞毒性、阻断活性和活化剂受体表达的丢失是否可逆的实验示意图。将表达EGFR scFv CAR活化剂受体(CT-487)和HLA-A*02PA2.1 scFv LIR1(C1765)抑制性受体的T细胞与表达活化剂和抑制性受体靶(AB)两者的HeLa靶细胞共培养。共培养3天后，用抗EGFR柱除去HeLa细胞，并将T细胞针对活化剂和抑制性受体染色，或仅与表达EGFR活化剂靶的HeLa细胞再共培养3天。再共培养3天后，用抗EGFR柱再次除去HeLa细胞，将T细胞针对活化剂和抑制性受体染色，或在染色前与仅表达EGFR活化剂靶或活化剂和阻断剂靶(AB)两者的HeLa细胞再共培养3天。使用标记的EGFR和A2探针测定T细胞中活化剂和抑制性受体的存在(染色)，并使用荧光活化的细胞分选定量受体表达水平。实验结果示于图14A至14B中。如图14A至14B所示，T细胞与表达活化剂和抑制剂靶两者的HeLa细胞的共培养减少了EGFR活化剂染色(图14A至14B，左图)。当T细胞与表达活化剂(仅靶A)的HeLa细胞在第2轮共培养时，EGFR活化剂的表达增加。因此，活化剂表面丢失是可逆的并与T细胞的细胞毒性相一致。

图15A至15B示出了另一个实验的结果，其示出了活化剂受体表达的丢失是快速可逆的。当表达活化剂和抑制性受体两者的T细胞与表达活化剂和抑制剂配体两者的模型“正常”细胞共培养时，这些T细胞中活化剂CAR细胞表面表达减少。然而，当T细胞转换为与仅表达活化剂配体的模型“癌症”细胞共培养时，T细胞能够快速(在数小时内)恢复活化剂CAR的细胞表面表达。不存在表达活化剂和抑制剂配体的模型“正常”细胞也可以在相似的时间范围内恢复活化剂CAR的细胞表面表达，而不管是否存在肿瘤细胞。

实例7：基于HLA-A*02LIR-1的抑制性受体可以阻断EGFR CAR活化剂的活化

使用实例3中描述的NFAT荧光素酶测定法来测定表达EGFR CAR活化剂和基于pMHCHLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体(包含LIR-1铰链、跨膜和ICD)的Jurkat效应细胞的活化。

用活化剂和抑制性受体DNA转染Jurkat细胞，并在基于无细胞珠的测定中测定活化(图16)。用活化剂抗原、阻断剂抗原或活化剂和抑制剂抗原装载珠，并且珠与Jurkat细胞的比例是不同的。在基于无细胞珠的测定中，当细胞与携带顺式HLA-A*02阻断剂和EGFR活化剂的珠接触时，基于HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体能够阻断Jurkat细胞的活化，但当HLA-A*02阻断剂和EGFR活化剂为反式(在不同的珠上)时则不能。珠上HLA-A*02阻断剂的存在能够将EGFR CAR的E_最大偏移大于或等于9倍(图16)。

使用HeLa和SiHa细胞作为靶细胞，也测定了表达EGFR CAR活化剂和基于HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体的Jurkat细胞的活化。正常的HeLa和SiHa细胞系表达EGFR但不表达HLA-A*02(SiHa WT和HeLa WT)，但被转导以表达HLA-A*02抑制性受体靶(SiHa A02和HeLa A02)。从图17A和图17B中可以看出，使用SiHa靶细胞时，基于HLA-A*02scFv LIR-1的抑制性受体能够使EGFR E_最大偏移大于4倍(图17A)，使用HeLa靶细胞时，则偏移大于5倍(图17B)。

实例8：表达EGFR CAR活化剂和抑制性受体的T细胞的体内功效

在体内环境中建立了表达活化剂受体(EGFR CAR)和抑制性受体(阻断剂)对的免疫细胞的功效和肿瘤对正常细胞的选择性(图19)。使用代表“正常”细胞的人EGFR+/HLA-A*02+HeLa细胞和作为“肿瘤”细胞的同基因EGFR+/HLA-A*02(-)敲除HeLa细胞的NSG(NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ)中的鼠异种移植模型。通过比较活化剂/抑制性受体对正常细胞与肿瘤细胞的作用来建立体内治疗窗口。这些数据提供了对靶上、肿瘤外治疗窗口的体内支持。建立活化剂/抑制性受体对的最佳剂量，并优化其灵敏度和选择性。

体内模型包括右侧中的“正常”细胞和左侧中的“肿瘤”细胞的皮下异种移植物。在一系列时间点对动物施用表达活化剂受体、活化剂/抑制性受体对的免疫细胞或未诱导的对照细胞。

通过临床观察和对体重的影响监测动物的总体健康状况。通过测径和成像评估肿瘤异种移植物的大小。在每个时间点，通过流式细胞术计数人T细胞并评估表面标记，包括CD3、CD4、CD8、活化剂受体表达和抑制性受体表达。测定血清细胞因子水平，包括IFNγ和白介素-2(IL-2)。在寿命后分析中，方案指定的组织，包括注射部位和肿瘤，由ACVP委员会认证的病理学家通过组织学评估肿瘤浸润性T细胞和活化剂受体抗原(例如EGFR)和阻断剂抗原表达(例如HLA-A*02)。

实例9：B7和HLA-A*11是抑制性受体配体

通过将scFv#4(表)融合到衍生自LIR-1的铰链、TM和ICD而产生HLA-A*011抑制性受体。使用金门克隆(Golden Gate cloning)将基因区段组合并插入慢病毒表达质粒中含有的人EF1α启动子的下游。

如上所述用CAR活化剂或CAR活化剂和scFv#4HLA-A*11抑制性(阻断剂)受体转化Jurkat NFAT-荧光素酶效应细胞。HLA-A*011抑制性受体的序列如下表9.1所示，并与表达活化剂配体和HLA-A*011:01两者的HeLa细胞共培养。使用HeLa代替T2靶细胞进行NFAT-荧光素酶测定。

结果如图20A和图20B所示。如图20A所示，当scFv#4与LIR-1的铰链、TM和ICD结构域融合时，能够抑制与表达活化剂配体和HLA-A*011两者的靶细胞共培养的Jurkat效应细胞的活化。

表9.1.HLA-A*011抑制性受体序列。

使用mRNA转染的HeLa细胞在mRNA滴定测定中测量Jurkat NFAT荧光素酶(JNL)细胞活化。用连续稀释的编码HLA-B*07:02的mRNA转染Hela细胞。用EGFR活化CAR和HLA-B*07阻断剂(圆形)或阴性对照载体(三角形)瞬时转染JNL细胞。共培养6小时后评估功能反应。图21中所示的结果表明，在存在滴定的HLA-B*07:02时，HLA-B*07阻断剂阻断EGFR靶向CAR的活化，但在阻断剂不存在时不阻断。

实例10：原代T细胞中EGFR活化剂和HLA-A*02抑制性受体表达的表征

为了对EGFR活化剂进行染色，将原代T细胞与EGFR-Fc(R&D系统公司)在FACS缓冲液(1％ BSA的PBS溶液)中以1:25的稀释度在室温下孵育30分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤2次，并在FACS缓冲液中于室温下在抗Fc(1:100)中孵育30分钟。为了对HLA-A*02抑制性受体进行染色，将T细胞与HLA-A*02四聚体探针在室温下在FACS缓冲液中孵育30分钟。染色后通过流式细胞术分析受体表达。

用编码EGFR靶向活化剂受体和人或小鼠HLA-A*02靶向抑制性受体的多核苷酸转导原代T细胞。测试了几个特异性的EGFR靶向活化剂和HLA-A*02靶向抑制性受体对。用编码活化剂受体和抑制性受体两者的单一载体或两种载体进行转导，一种编码活化剂受体，一种编码抑制性受体。分析富集和未富集的细胞以确定表达活化剂和抑制剂受体两者的细胞的百分比(图22)。

在用两种载体转导的原代T细胞中，一种编码活化剂受体，一种编码抑制性受体，在富集前，转导的T细胞群体中表达两种受体的细胞百分比为约22.5％(图22A，左图)。富集后，转导的T细胞群体中表达两种受体的细胞百分比增加至约91.6％。

在用编码活化剂受体和抑制性受体两者的单一载体转导的原代T细胞中，转导的T细胞群体中表达两种受体的细胞百分比在富集前在约6.29％和13.2％之间。富集后，表达两种受体的细胞百分比为22.6％至82.8％。表达两种受体的细胞百分比取决于特异性活化剂和抑制性受体对。

实例11：表达活化剂和抑制性受体的原代T细胞中免疫细胞活化选择性的表征

对于选择性细胞毒性研究，将富集的原代T细胞与表达GFP或RFP的HeLa或HCT116靶细胞一起孵育。对于“肿瘤”细胞，使用WT HeLa或HLA-A*02敲除的HCT116，对于“正常”细胞，使用HLA-A*02转导的HeLa或WT HCT116。使用IncuCyte活细胞成像仪对共培养物进行成像，并使用靶细胞荧光面积定量活靶细胞(图23A)。为了测量混合靶培养物中的选择性细胞毒性，将用HLA-A*02转导的表达RFP的“肿瘤”WT HeLa细胞和表达GFP的“正常”HeLa细胞以1:1的比例混合。将富集的原代T细胞添加到混合的靶培养物中，并使用IncuCyte活细胞成像仪进行成像，并使用靶细胞荧光面积定量活靶细胞(图23B)。

图23A是示出了表达EGFR活化剂受体和HLA-A*02scFv LIR1抑制剂受体的免疫细胞对HeLa靶细胞或HCT116靶细胞的特异性杀伤百分比的一系列图。靶细胞表达EGFR抗原(A)、HLA-A*02非靶抗原(B)或两者(AB)。表达活化剂/抑制剂受体对的免疫细胞与靶细胞以1:1的比例孵育。

图23B是示出了在癌细胞和正常细胞的混合培养物中表达EGFR活化剂受体和HLA-A*02scFv LIR1抑制剂受体的免疫细胞对靶细胞的特异性和选择性杀伤的图和系列图像。UTD＝免疫细胞无活化剂或抑制剂受体；CAR＝仅表达活化剂受体的免疫细胞；Tmod＝表达活化剂和抑制剂受体的免疫细胞。

实例12：表达活化剂和抑制性受体的Jurkat细胞中免疫细胞活化选择性的表征

图24是示出了表达EGFR活化剂受体(CAR)或EGFR活化剂受体和HLA-A*02抑制剂受体(Tmod)的Jurkat细胞(效应细胞)中免疫细胞活化的图。将Jurkat细胞与一组表达HLA-A*02而无EGFR表达或表达HLA-A*02而有EGFR表达的靶细胞系一起孵育。通过使用CRISPR/Cas9敲除EGFR生成EGFR阴性细胞系。当与EGFR阴性细胞共培养时，Tmod Jurkat效应细胞不显示脱靶活化。

Claims (87)

1.一种免疫细胞，其包含：

a.第一受体，其包含对表皮生长因子受体(EGFR)特异性的细胞外配体结合结构域；以及

b.第二受体，其包含对由于杂合性丢失而在EGFR+癌症中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，

其中所述第一受体是响应于EGFR的活化剂受体；并且其中所述第二受体是响应于所述非靶抗原的抑制性受体。

2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合MHC蛋白的等位基因变体。

3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A、HLA-B或HLA-C蛋白的等位基因变体。

4.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*02。

5.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域特异性结合HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-C*07或HLA-B*07。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含如公开于表5中的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表5的所述CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。

7.根据权利要求3至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:101-106或SEQ ID NO:106-112的互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或相对于表5的所述CDR具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的CDR序列。

8.根据权利要求3至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自表4中公开的多肽序列的多肽序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

9.根据权利要求4所述的免疫细胞，其中所述第二受体的所述细胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:89-100中任一个；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体是嵌合抗原受体(CAR)。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，其包含选自表3所示序列组的一组重链互补决定区(HC-CDR)；和/或可变轻链(VL)部分，其包含来自表3所示序列组的一组轻链互补决定区(LC-CDR)；或在每个CDR中具有至多1、2、3、4个取代、插入或缺失的CDR序列。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含可变重链(VH)部分，其具有选自表2中所示的VH序列的序列；和/或包含表2中所示的序列的可变轻链(VL)部分；或与其具有至少70％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自表1所示序列组的序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一受体的所述细胞外配体结合结构域包含选自由SEQ ID NO:9-18组成的组的scFv序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域或其功能变体。

16.根据权利要求15所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域包含与SEQ IDNO:129至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。

18.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:133至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。

20.根据权利要求19所述的免疫细胞，其中所述LILRB1铰链结构域包含与SEQ IDNO:132、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二受体包含LILRB1细胞内结构域、LILRB1跨膜结构域、LILRB1铰链结构域、任何这些的功能变体或其组合。

22.根据权利要求21所述的免疫细胞，其中所述LILRB1细胞内结构域和LILRB1跨膜结构域包含SEQ ID NO:128或与SEQ ID NO:128至少95％相同的序列。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的免疫细胞，其中所述EGFR+癌细胞是肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺导管癌细胞、结肠直肠癌细胞、头颈癌细胞、食道和胃腺癌细胞、卵巢癌细胞、多形性成胶质细胞瘤细胞、宫颈鳞状细胞癌细胞、肾癌细胞、乳头状肾癌细胞、肾透明细胞癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、胆管癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、肉瘤细胞、甲状腺癌细胞、胸腺癌细胞、胃癌细胞或子宫癌细胞。

24.根据权利要求23所述的免疫细胞，其中所述EGFR+癌细胞是肺癌细胞。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的免疫细胞，其中所述EGFR+癌细胞是不表达HLA-A*02的EGFR+/HLA-A*02-癌细胞；或衍生自不表达HLA-A*02的HLA-A*02+个体的癌细胞。

26.根据权利要求25所述的免疫细胞，其中所述EGFR+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自EGFR+/HLA-A*02+细胞。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫细胞，其中在具有杂合性丢失的所述EGFR/HLA-A*02-癌细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起特异性活化所述免疫细胞。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的免疫细胞，其中在未通过杂合性丢失而丢失HLA-A*02的EGFR+细胞存在下，所述第一受体和所述第二受体一起不特异性活化所述免疫细胞。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞、巨噬细胞、NK细胞、iNKT细胞或γδT细胞。

30.根据权利要求29所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD8+CD4-T细胞。

31.根据权利要求1至30任一项所述的免疫细胞，其中MHC I类基因的表达和/或功能已被降低或消除。

32.根据权利要求30所述的免疫细胞，其中所述MHC I类基因是β-2-微球蛋白(B2M)。

33.根据权利要求32所述的免疫细胞，其进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸包含干扰RNA，所述干扰RNA包含与B2M mRNA(SEQ ID NO:172)的序列互补的序列。

34.根据权利要求33所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA能够诱导RNAi介导的所述B2MmRNA的降解。

35.根据权利要求33所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)。

36.根据权利要求35所述的免疫细胞，其中所述shRNA包含：

a.第一序列，其从5'端至3'端具有与所述B2M mRNA的序列互补的序列；以及

b.第二序列，其从5'端至3'端具有与所述第一序列互补的序列，

其中所述第一序列和所述第二序列形成所述shRNA。

37.根据权利要求32所述的免疫细胞，其包含对编码B2M(SEQ ID NO:170)的序列的一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰减少B2M的表达和/或消除其功能。

38.根据权利要求37所述的免疫细胞，其中所述一种或多种修饰包含编码B2M的内源性基因的一种或多种失活突变。

39.根据权利要求38所述的免疫细胞，其中所述一种或多种失活突变包含缺失、插入、取代或移码突变。

40.根据权利要求38至39中任一项所述的免疫细胞，其中用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入所述一种或多种失活突变，所述引导核酸特异性靶向编码B2M(SEQ ID NO:170)的所述内源性基因的序列。

41.根据权利要求31所述的免疫细胞，其中所述MHC I类基因是HLA-A*02。

42.根据权利要求41所述的免疫细胞，其进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸包含干扰RNA，所述干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA(SEQ ID NO:171)的序列互补的序列。

43.根据权利要求42所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA能够诱导RNA干扰(RNAi)介导的所述HLA-A*02mRNA的降解。

44.根据权利要求43所述的免疫细胞，其中所述干扰RNA是短发夹RNA(shRNA)，其包含：

a.第一序列，其从5'端至3'端具有与所述HLA-A*02mRNA的序列互补的序列；以及

b.第二序列，其从5'端至3'端具有与所述第一序列互补的序列，

其中所述第一序列和所述第二序列形成所述shRNA。

45.根据权利要求41所述的免疫细胞，其包含对编码HLA-A*02(SEQ ID NO:169)的内源性基因的序列的一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰降低HLA-A*02的表达和/或消除其功能。

46.根据权利要求45所述的免疫细胞，其中所述一种或多种修饰包含编码HLA-A*02的所述内源性基因的一种或多种失活突变。

47.根据权利要求45或权利要求46所述的免疫细胞，其中用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gNA)的复合物中引入所述一种或多种失活突变，所述引导核酸特异性靶向编码HLA-A*02的所述内源性基因的序列。

48.根据权利要求1至47中任一项所述的免疫细胞，其中：

a.所述第一受体包含SEQ ID NO:177，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.所述第二受体包含SEQ ID NO:174或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

49.根据权利要求1至47中任一项所述的免疫细胞，其中：

a.所述第一受体包含SEQ ID NO:177，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.所述第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

50.根据权利要求1至47中任一项所述的免疫细胞，其中：

a.所述第一受体包含SEQ ID NO:175，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.所述第二受体包含SEQ ID NO:174，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

51.根据权利要求1至47中任一项所述的免疫细胞，其中：

a.所述第一受体包含SEQ ID NO:175，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.所述第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

52.根据权利要求1至47中任一项所述的免疫细胞，其中：

a.所述第一受体包含SEQ ID NO:176，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.所述第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

53.根据权利要求1至47中任一项所述的免疫细胞，其中：

a.所述第一受体包含SEQ ID NO:176，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列；以及

b.所述第二受体包含SEQ ID NO:173，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

54.根据权利要求1至53中任一项所述的免疫细胞，其进一步包含T2A自切割肽，其中所述T2A自切割肽包含SEQ ID NO:178，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

55.根据权利要求1至54中任一项所述的免疫细胞，其进一步包含干扰RNA，其中所述干扰RNA包含SEQ ID NO:179，或与其共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

56.根据权利要求1至55中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是自体的。

57.根据权利要求1至55中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是同种异体的。

58.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至57中任一项所述的免疫细胞。

59.根据权利要求58所述的药物组合物，其中所述免疫细胞表达所述第一受体和所述第二受体两者。

60.根据权利要求59所述的药物组合物，其中至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的所述免疫细胞表达所述第一受体和所述第二受体两者。

61.根据权利要求59所述的药物组合物，其中至少90％的所述免疫细胞表达所述第一受体和所述第二受体两者。

62.根据权利要求58至61中任一项所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

63.根据权利要求58至62中任一项所述的药物组合物，其用作治疗EGFR+癌症的药物。

64.一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：

a.第一受体，其包含对内皮生长因子受体(EGFR)特异性的细胞外配体结合结构域；以及

b.第二受体，其包含对由于杂合性丢失而在所述EGFR+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，

其中所述第一受体是响应于所述EGFR+癌细胞上的EGFR的活化剂受体；并且

其中所述第二受体是响应于所述非靶抗原的抑制性受体。

65.一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含用于生成根据权利要求1至57中任一项所述的免疫细胞的一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码所述第一受体和所述第二受体的多核苷酸序列。

66.一种载体，其包含根据权利要求64或65所述的一种或多种多核苷酸。

67.一种杀死在MHC I类基因座处具有杂合性丢失的EGFR+癌细胞的方法，其包含向受试者施用有效量的根据权利要求1至57中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求58至62中任一项所述的药物组合物。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述EGFR+癌细胞是肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺导管癌细胞、结肠直肠癌细胞、头颈癌细胞、食道和胃腺癌细胞、卵巢癌细胞、多形性成胶质细胞瘤细胞、宫颈鳞状细胞癌细胞、肾癌细胞、乳头状肾癌细胞、肾透明细胞癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、胆管癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、肉瘤细胞、甲状腺癌细胞、胸腺癌细胞、胃癌细胞或子宫癌细胞。

69.根据权利要求67所述的方法，其中所述EGFR+癌细胞是肺癌细胞。

70.根据权利要求67所述的方法，其中所述EGFR+癌细胞是不表达HLA-A*02的EGFR+/HLA-A*02-癌细胞；或衍生自不表达HLA-A*02的HLA-A*02+个体的癌细胞。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述EGFR+/HLA-A*02-癌细胞通过在HLA-A处的杂合性丢失导致HLA-A*02丢失而衍生自EGFR+/HLA-A*02+细胞。

72.一种治疗患有在编码非靶抗原的基因座处具有杂合性丢失的EGFR+肿瘤的受试者体内EGFR+癌症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至57中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求58至62中任一项所述的药物组合物。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述受试者是患有表达EGFR并且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者。

74.根据权利要求72所述的方法，其中所述受试者是患有表达EGFR并且已经丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合HLA-A*02患者。

75.一种治疗受试者体内癌症的方法，其包含：

a.确定所述受试者的非恶性细胞和癌细胞中的非靶抗原的基因型或表达水平；

b.确定所述受试者的癌细胞中的EGFR的表达水平；以及

c.如果所述非恶性细胞表达所述非靶抗原并且所述癌细胞不表达所述非靶抗原，并且所述癌细胞是EGFR阳性的，则向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至57中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求58至62中任一项所述的药物组合物。

76.根据权利要求67至75中任一项所述的方法，其中施用根据权利要求1至57中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求58至62中任一项所述的药物组合物减小了所述受试者体内肿瘤的大小。

77.根据权利要求76所述的方法，其中所述肿瘤减小了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

78.根据权利要求76所述的方法，其中所述肿瘤被消除。

79.根据权利要求67至75中任一项所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物阻止了所述受试者体内肿瘤的生长。

80.根据权利要求67至75中任一项所述的方法，其中施用根据权利要求1至57中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求58至62中任一项所述的药物组合物减少了所述受试者体内肿瘤的数目。

81.根据权利要求67至80中任一项所述的方法，其中施用所述免疫细胞或所述药物组合物导致所述受试者体内癌细胞而非正常细胞的选择性杀伤。

82.根据权利要求81所述的方法，其中至少约60％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约65％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约70％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约75％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约80％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约85％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约90％的被杀死的细胞是癌细胞，至少约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％的被杀死的细胞是癌细胞。

83.根据权利要求81所述的方法，其中施用所述免疫细胞或药物组合物导致杀死所述受试者的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的所述癌细胞。

84.根据权利要求67至83中任一项所述的方法，其中与施用包含所述第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用所述免疫细胞或所述药物组合物对所述受试者产生更少的副作用。

85.一种制备多种免疫细胞的方法，其包含：

a.提供多种免疫细胞，以及

b.用根据权利要求64或权利要求65所述的多核苷酸系统或根据权利要求66所述的载体转化所述多种免疫细胞。

86.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至57中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求58至62中任一项所述的药物组合物。

87.根据权利要求86所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书。