KR101991555B1 - 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 표면에서 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR을 공발현시키는 세포를 제공하며, 여기서 각각의 CAR은 (i) 항원 결합 도메인; (ii) 스페이서 (iii) 경막 도메인; 및 (iv) 엔도도메인을 포함하고, 제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하며, 제1 CAR의 스페이서는 제2 CAR의 스페이서와 상이하고, 제1 또는 제2 CAR 중 하나는 활성화 엔도도메인을 포함하는 활성화 CAR이고 다른 하나의 CAR은 결찰-오프 억제성 엔도도메인을 포함하는 억제성 CAR이다.

Description

세포{CELL}
본 발명은 1종 초과의 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 세포에 관한 것이다. 이 세포는 표적 세포에 의한 2 이상의 항원의 발현(또는 비발현)의 차등적 패턴 덕분에 표적 세포를 특이적으로 인식할 수 있다.
치료적 단일클론 항체(mAb), 면역접합 mAb, 방사능접합 mAb, 및 이특이적 T-세포 인게이저를 포함하여, 수많은 면역치료제가 암 치료를 위해 설명되어 왔다.
전형적으로, 이들 면역치료제는 단일 항원을 표적으로 하며, 예를 들어 리툭시맙은 CD20을 표적으로 삼고, 미엘로타르그는 CD33을 표적으로 하며, 알렘투주맙은 CD52를 표적으로 한다.
그러나, 단일 항원의 존재(또는 부재)가 특이성 결여를 야기할 수 있는, 암을 효과적으로 설명하는 것은 비교적 드물다.
대부분의 암은 단일 항원을 기반으로 정상 조직으로부터 분화될 수 없다. 그러한 이유로, 상당한 "온-표적 오프-종양" 독성이 발생되어 정상 조직이 이러한 요법에 의해 손상된다. 예를 들어, 리툭시맙을 사용해 B-세포 림프종을 치료하기 위해 CD20을 표적화하면, 전체 정상 B-세포 구획이 고갈되고, 만성 림프성 백혈병을 치료하기 위해 CD52를 표적화하면, 전체 림프성 구획이 고갈되며, 급성 골수성 백혈병 치료를 위해 CD33을 표적화하면, 전체 골수성 구획이 손상된다. "온-표적 오프-종양" 독성의 예상되는 문제는 임상 실험에 의해 증명되었다. 예를 들어, ERBB2를 표적으로 삼는 접근법은 폐 및 간으로 전이된 결장 암 환자를 사망에 이르게 하였다. ERBB2는 일부 환자의 경우 결장암에서 과발현되지만, 심장 및 정상 혈관 구조를 포함해 몇몇 정상 조직에서도 발현된다.
일부 암의 경우, 2종의 암 항원의 존재를 표적화하는 것이 1종을 표적화하는 것보다 더 선택적이고 따라서 더 효과적일 수 있다. 예를 들어, B-만성 림프성 백혈병(B-CLL)은 현재 CD19를 표적으로 하여 치료되는 일반적인 백혈병이다. 이는 림프종을 치료하지만 또한 전체 B-세포 구획을 고갈시키므로 이 치료는 상당히 독성 효과가 있다. B-CLL은 CD5 및 CD19가 공발현되는 흔치않은 표현형을 갖는다. CD5 및 CD19를 발현하는 세포만을 표적화하여서, 온-표적 오프-종양 독성을 상당히 감소시키는 것이 가능하다.
따라서 많은 암과 연관된 마커 발현의 복잡한 패턴을 반영하여 더욱 표적화시킬 수 있는 면역치료제가 필요하다.
키메라 항원 수용체(CAR)
키메라 항원 수용체는 단일클론 항체(mAb)의 특이성을 T-세포의 이펙터 기능에 그라프트시킨 단백질이다. 그들의 일반적인 형태는 T-세포 생존 및 활성화 신호를 전달하는 복합(compound) 엔도도메인에 모두 연결된, 경막(transmembrane) 도메인, 스페이서, 항원 인식 아미노 말단을 갖는 제I형 경막 도메인 단백질이다(도 1A 참조).
이들 분자의 가장 일반적인 형태는 신호전달 엔도도메인에 스페이서 및 경막 도메인을 통해 융합된, 표적 항원을 인식하는 단일클론 항체로부터 유도된 단쇄 가변 단편(scFv)의 융합체이다. 이러한 분자는 그 표적의 scFv에 의한 인식에 대응하여 T-세포 활성화를 일으킨다. T 세포가 이러한 CAR을 발현하는 경우, 이들은 표적 항원을 발현하는 표적 세포를 인식하여 사멸시킨다. 몇몇 CAR은 종양 연관 항원에 대해 개발되었고, 이러한 CAR-발현 T 세포를 사용하는 입양 전달 접근법이 현재 다양한 암 치료를 위해 임상 실험 중이다.
하지만, CAR-발현 T 세포의 사용은 온-표적, 오프 종양 독성과 또한 연관된다. 예를 들어, 신장 세포 암종을 치료하기 위해 카르복시 언히드라아제-IX(CAIX)를 표적화하는 CAR-기반 접근법은 담도 상피 세포에 대한 특이적 공격에 의해 야기되는 것으로 여겨지는 간 독성을 일으켰다(Lamers et al (2013) Mol. Ther. 21:904-912).
이중 표적화 CAR 접근법
"온 표적, 오프 종양" 독성 문제를 해결하기 위해서, CAR T 세포는 이중 항원 특이성을 갖게 개발되었다. "이중 표적화" 접근법에서는, 2종의 상보성 CAR이 동일한 T-세포 개체군에서 공발현되는데, 각각 상이한 종양 표적에 대해 유도되고 상보성 신호를 제공하도록 조작되었다.
Wlikie 등(2012 J Clin Immunol 32:1059-1070)은 Erb-특이적 및 MUC1-특이적 CAR이 공발현되는 이중 표적화 접근법을 설명한다. ErbB2-특이적 CAR은 CD3ζ 신호만을 제공하고 MUC1-특이적 CAR은 CD28 공자극성 신호만을 제공한다.
상보성 신호전달이 양쪽 항원의 존재 시에 발생하여, IL-2를 생성시키는 것으로 확인되었다. 그러나, IL-2 생성은 신호전달이 융합된 CD28 + CD3ζ 엔도도메인에 의해 전달되는 대조군 CAR-조작된 T 세포와 비교시 대단치않았다.
유사한 접근법을 Kloss 등(2013 Nature Biotechnol. 31:71-75)이 기술하였는데, 여기서는 CD-19 특이적 CAR이 사용되었고 PSMA에 특이적인 키메라 공자극성 수용체와 조합된 CD3ζ-매개 활성화 신호가 제공된다. 이러한 '공동(co)-CAR' 디자인의 경우, CAR T-세포는 하나의 항원을 갖는 표적 세포를 만나면 활성화 신호를 받고, 다른 항원을 갖는 표적 세포를 만나면 공자극성 신호를 받으며, 오직 양쪽 항원을 보유하는 표적 세포를 만날시 활성화 및 공자극성 신호 둘 모두를 받는다.
이는 2종 항원을 보유하는 표적 세포에만 CAR 활성을 제한하려는 초기 시도를 제시한다. 그러나 이러한 시도는 제한적이다: CAR T-세포 활성이 2종 항원 모두를 발현하는 표적에 대해 최대이지만, CAR T-세포는 여전히 활성화 CAR에 의해 인식되는 항원만을 발현하는 표적을 사멸시키게 되고, 또한, 공자극은 표적 세포의 방출 이후 길게 지속되는 T-세포에 대한 장기간의 영향을 초래한다. 그러므로, 이중-양성에 대한 것과 균등한 단일-항원 양성 T-세포에 대한 활성이 예를 들어 단일-양성 조직이 이중 양성 종양에 인접하거나, 또는 이중 양성 종양으로부터의 이동 경로에 존재하는 경우에 가능할 수 있다.
따라서 T-세포 활성화가 2종 항원 둘 모두를 발현하는 표적 세포에 전적으로 제한되는 온-표적 오프-종양 독성이 감소된 개선된 CAR-기반 치료 접근법이 요구된다.
[도면의 간단한 설명]
도 1 : (a) CAR의 개략적인 구조: 결합 도메인은 항원을 인식하고; 스페이서는 세포 표면으로부터 결합 도메인을 상승시키며; 경막 도메인은 단백질을 막에 고정시키고 엔도도메인은 신호를 전달한다. (b) 내지 (d): CAR 엔도도메인의 상이한 세대 및 순열: (b) 초기 디자인은 FcεR1-γ 또는 CD3ζ 엔도도메인을 통해 단독으로 ITAM 신호를 전달하였지만, 이후 디자인은 시스로 추가적인 (c) 1종 또는 (d) 2종의 공자극성 신호를 전달한다.
도 2: 본 발명을 예시하는 계략적인 다이아그램.
본 발명은 표적 세포 항원 발현의 논리 규칙에 대응하도록 조작된 T-세포에 관한 것이다. 이는 가상적인 FACS 산점도를 이용해 최적으로 예시하였다. 표적 세포 개체군은 항원 "A" 및 "B" 둘 모두, 이들 중 하나를 발현하거나 또는 전혀 발현하지 않는다. 상이한 표적 개체군(적색으로 표시)은 상이한 게이트에 의해 연결된 CAR 쌍이 형질도입된 T-세포에 의해 사멸된다. OR 게이팅된 수용체에서, 단일-양성 및 이중-양성 세포 둘 모두 사멸된다. AND 게이팅된 수용체에서는, 오직 이중-양성 표적 세포만 사멸된다. AND NOT 게이팅의 경우, 이중-양성 표적은 보존되는 반면 단일-양성은 표적화된다.
도 3: 표적 세포 개체군의 생성.
SupT1 세포를 표적 세포로 사용하였다. 이들 세포는 CD19, CD33 또는 CD19 및 CD33 둘 모두를 발현하도록 형질도입시켰다. 표적 세포는 적절한 항체로 염색하고 유세포측정법으로 분석하였다.
도 4: OR 게이트용 카세트 디자인.
단일 오픈 리딩 프레임은 2종의 단백질을 생성시키는 인프레임 FMD-2A 서열을 갖는 2개 CAR을 제공한다. 신호1은 IgG1에서 유래된 신호 펩티드(그러나 임의의 효과적인 신호 펩티드일 수 있음)이다. scFv1은 CD19를 인식하는 단쇄 가변 절편이다(그러나 임의의 바람직한 임의적인 표적을 인식하는 scFv 또는 펩티드 루프 또는 리간드 또는 사실 임의의 도메인일 수 있음). STK는 CD8 줄기부(stalk)이지만 임의의 적합한 세포외 도메인일 수 있다. CD28tm은 CD28 경막 도메인이지만 임의의 안정한 제I형 단백질 경막 도메인일 수 있고 CD3Z는 CD3 제타 엔도도메인이지만 ITAM을 포함하는 임의의 엔도도메인일 수 있다. 신호2는 CD8에서 유도된 신호 펩티드이지만 신호과 DNA 서열이 다른 임의의 효과적인 신호 펩티드일 수 있다. scFv는 CD33을 인식하지만 scFv1처럼 임의적이다. HC2CH3는 인간 IgG1의 힌지-CH2-CH3이지만 제1 CAR에서 사용된 스페이서와 교차쌍을 이루지 않은 임의의 세포외 도메인일 수 있다. CD28tm' 및 CD3Z'는 CD28tm 및 CD3Z와 동일한 단백질 서열을 코딩하지만 상동성 재조합을 방지하기 위해 코돈-워블링된다(wobbled)).
도 5: OR 게이트용 키메라 항원 수용체(CAR)의 개략적인 대표도.
자극성 CAR은 N-말단의 A) 인간 CD8의 세포외 힌지 영역이 후속되는 항-CD19 scFv 또는 B) 인간 IgG1의 세포외 힌지, CH2 및 CH3(FcR 결합이 감소되도록 pvaa 돌연변이를 함유)가 후속되는 항-CD33 scFv로 이루어지도록 구성되었다. 2개 수용체는 인간 CD28 경막 도메인 및 인간 CD3 제타(CD247) 세포내 도메인을 포함한다. "S"는 디설피드 결합의 존재를 의미한다.
도 6: 한 T-세포의 표면 상에 2개 CAR의 공발현을 도시한 발현 데이타.
도 7: OR 게이트의 기능적 분석.
OR 게이트 구성체를 발현하는 이펙터 세포(5x104 세포)는 다양한 수의 표적 세포와 코인큐베이트(co-incubate)시켰고 16시간 후에 ELISA를 통해 IL-2를 분석하였다. 그래프는 3중 실험으로부터의 화학적 자극(PMA 및 로노마이신)에 의한 이펙터 세포 단독의 평균 최대 IL-2 분비 및 임의의 자극없이 이펙터 세포로부터의 평균 배경값 IL-2를 보여준다.
도 8: 양쪽 AND 게이트를 발현시키는데 사용된 카세트의 2가지 버젼의 만화도.
활성화 및 억제 CAR은 FMD-2A 서열을 사용해 다시 한번 공발현시켰다. 신호1은 IgG1에서 유래된 신호 펩티드이다(그러나 임의의 효과적인 신호 펩티드일 수 있음), scFv1은 CD19를 인식하는 단쇄 가변 절편이다(그러나 임의의 바람직한 임의적인 표적을 인식하는 scFv 또는 펩티드 루프 또는 리간드 또는 사실 임의의 도메인일 수 있음). STK는 CD8 줄기부이지만 임의의 부피가 크지 않은 세포외 도메인일 수 있다. CD28tm은 CD28 경막 도메인이지만 임의의 안정한 제I형 단백질 경막 도메인일 수 있고 CD3Z는 CD3 제타 엔도도메인이지만 ITAM을 함유하는 임의의 엔도도메인일 수 있다. 신호2는 CD8에서 유래된 신호 펩티드이지만 신호1과 DNA 서열이 다른 임의의 효과적인 신호 펩티드일 수 있다. scFv는 CD33을 인식하지만 scFv1처럼 임의적이다. HC2CH3는 인간 IgG1의 힌지-CH2-CH3이지만 임의의 부피가 큰 세포외 도메인일 수 있다. CD45 및 CD148은 각각 CD45 및 CD148의 경막 및 엔도도메인이지만 임의의 이러한 부류의 단백질로부터 유도될 수 있다.
도 9: AND 게이트에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)의 단백질 구조에 대한 개략적인 대표도.
자극성 CAR은 N-말단 항-CD19 scFv 도메인과 후속되는 인간 CD8의 세포외 줄기 영역, 인간 CD28 경막 도메인 및 인간 CD3제타(CD247) 세포내 도메인으로 이루어진다. 2종의 억제성 CAR을 시험하였다. 이들은 N-말단 항-CD33 scFv 도메인과 후속되는 인간 IgG1의 세포외 힌지, CH2 및 CH3(FcR 결합이 감소되도록 pvaa 돌연변이를 함유) 영역과 이어서 인간 CD148 또는 인간 CD45의 경막 및 세포내 도메인으로 이루어진다. "S"는 디설피드 결합의 존재를 표시한다.
도 10: 활성화 및 억제성 CAR의 공발현
BW5147 세포가 이펙터 세포로 사용되었고 형질도입되어서 2종의 활성화 항-CD19 CAR 및 억제성 항-CD33 CAR 중 하나를 발현하였다. 이펙터 세포를 CD19-마우스-Fc 및 CD33-토끼-Fc와 적절한 2차 항체로 염색하고 유세포측정법으로 분석하였다.
도 11: AND 게이트의 기능적 분석
A) CD148 또는 B) CXD445 세포내 도메인을 갖는 활성화 항-CD19 CAR 및 억제성 항-CD33 CAR을 발현하는 이펙터 세포(5x104 세포)를 다양한 수의 표적 세포와 코인큐베이트시키고 16시간 후에 ELISA에 의해 분석하였다. 그래프는 3중 중복실험을 통해 화학적 자극에 의한 이펙터 세포 단독의 최대 IL-2 분비 및 임의의 자극없는 이펙터 세포로부터의 배경값 IL-2를 나타낸다.
도 12: AND NOT 게이트를 생성시키는데 사용된 카세트의 3가지 버젼을 도시한 만화도.
활성화 및 억제 CAR을 FMD-2A 서열을 사용해 다시 한번 공발현시켰다. 신호1은 IgG1에서 유래된 신호 펩티드이다(그러나 임의의 효과적인 신호 펩티드일 수 있음). scFv1은 CD19를 인식하는 단쇄 가변 절편이다(그러나 임의의 바람직한 임의적 표적을 인식하는 scFv 또는 펩티드 루프 또는 리간드 또는 사실 임의의 도메인일 수 있음). STK는 인간 CD8 줄기부이지만 임의의 부피가 크지 않은 세포외 도메인일 수 있다. CD28tm은 CD28 경막 도메인이지만 임의의 안정한 제I형 단백질 경막 도메인일 수 있고 CD3Z는 CD3 제타 엔도도메인이지만 ITAM을 함유하는 임의의 엔도도메인일 수 있다. 신호2는 CD8에서 유래된 신호 펩티드이지만 신호1과 DNA 서열이 상이한 임의의 효과적인 신호 펩티드일 수 있다. scFv는 CD33을 인식하지만 scFv1처럼 임의적이다. muSTK는 마우스 CD8 줄기부이지만, 공국재화(co-localise)하나 활성화 CAR과 교차쌍을 이루지 않는 임의의 스페이서일 수 있다. dPTPN6은 PTPN6의 포스파타아제 도메인이다. LAIR1은 LAIR1의 경막 및 엔도도메인이다. 2Aw는 FMD-2A 서열의 코돈-워블링된 버젼이다. SH2-CD148는 CD148의 포스파타아제 도메인과 융합된 PTPN6의 SH2 도메인이다.
도 13: NOT AND 게이트를 위한 키메라 항원 수용체(CAR)의 개략적인 대표도.
A) N-말단 항-CD19 scFv 도메인과 후속되는 인간 CD8의 줄기부 영역, 인간 CD28 경막 도메인 및 인간 CD247 세포내 도메인으로 이루어진 자극성 CAR. B) N-말단 항-CD33 scFv 도메인과 후속되는 마우스 CD8의 줄기부 영역, 마우스 CD8의 경막 영역 및 PTPN6의 포스파타아제 도메인으로 이루어진 억제성 CAR. C) N-말단 항-CD33 scFv 도메인과 후속되는 마우스 CD8의 줄기부 영역 및 LAIR1의 경막 및 세포내 절편으로 이루어진 억제성 CAR. D) PTPN6 SH2 도메인 및 CD148 포스파타아제 도메인의 융합 단백질과 공발현되는 것을 제외하고 이전 CAR과 동일한 억제성 CAR.
도 14: NOT AND 게이트의 기능적 분석
A) 전체 길이 SHP-1 또는 B) SHP-1의 절두형(truncated)을 발현하는 이펙터 세포(5x104 세포)를 다양한 수의 표적 세포와 코인큐베이트시키고 16시간 후에 ELISA를 통해 IL-2를 분석하였다. 그래프는 3중 반복 실험에 의한 화학적 자극(PMA 및 로노마이신)에 의한 이펙터 세포 단독의 평균 최대 IL-2 분비 및 임의 자극없이 이펙터 세포로부터의 평균 배경값 IL-2를 나타낸다.
도 15: OR 게이트의 아미노산 서열.
도 16: CD148 및 CD145 기반 AND 게이트의 아미노산 서열.
도 17: 2종 AND NOT 게이트의 아미노산 서열.
도 18: AND 게이트 기능의 정밀분석.
A. AND 게이트의 원형은 우측에 예시하였고 CD19, CD33 단일 및 CD19, CD33 이중 양성 표적에 대응한 그 기능은 좌측에 도시하였다. B. scFv를 교환하여서 활성화 엔도도메인이 CD33에 의해 촉발되고 억제성 엔도도메인이 CD19에 의해 활성화된다. 이러한 AND 게이트는 이런 scFv 교환에도 불구하고 기능성이 유지된다. C. CD8 마우스 줄기부가 억제성 CAR의 스페이서의 Fc로 치환되었다. 이러한 개질에 의해서, 게이트는 CD19 단독 양성 또는 CD19, CD22 이중 양성 표적에 대한 대응이 실패한다.
도 19: 인공 표적 세포 상에서 표적 항원의 발현
A. SupT1 세포에서 유래된 인공 표적 세포의 원본 세트의 CD33 대비 CD19의 유세포측정 산점도를 도시한다. 좌측에서 우측으로: 이중 음성 SupT1 세포, CD19에 양성, CD33에 양성, 및 CD19와 CD33 둘 모두에 양성인 SupT1 세포. B. CD19 AND GD2 게이트를 시험하기 위해 생성시킨 인공 표적 세포의 CD2 대비 CD19의 유세포측정 산점도를 도시한다: 좌측에서 우측으로: 음성 SupT1 세포, CD19 발현하는 SupT1 세포, GD2 양성이 되는 GD2 및 GM3 신타아제가 형질도입된 SupT1 세포 및 GD2 및 CD19 둘 모두에 대해 양성인 GD2 및 GM3 신타아제를 비롯하여 CD19가 형질도입된 SupT1 세포. C. CD19 AND EGFRvIII 게이트를 시험하기 위해 생성된 인공 표적의 EGFRvIII 대비 CD19의 유세포측정 산점도를 도시한다. 좌측에서 우측으로: 음성 SupT1 세포, CD19를 발현하는 SupT1 세포, EGFRvIII이 형질도입된 SupT1 세포 및 CD19와 EGFRvIII 둘 모두가 형질도입된 SupT1 세포. D. CD19 AND CD5 게이트를 시험하기 위해 생성된 인간 표적의 CD5 대비 CD19의 유세포측정 산점도를 도시한다. 좌측에서 우측으로: 음성 293T 세포, CD19가 형질도입된 293T 세포, CD5가 형질도입된 293T 세포, CD5와 CD19 벡터 둘 모두가 형질도입된 293T 세포.
도 20: AND 게이트의 일반화가능성
A. 3종의 새로운 CAR: CD19 AND GD2, CD19 AND EGFRvIII, CD19 AND CD5이 생성되도록, CD33의 본래 특이성으로부터 제2 CAR 특이성이 변화되도록 개질된 AND 게이트의 만화도. B. CD19 AND GD2 AND 게이트: 좌측: AND 게이트의 발현은 CD19 CAR에 대해 재조합 CD19-Fc 염색(x-축), 대 GD2 CAR에 대해 항-인간 Fc 염색(Y-축)으로 도시하였다. 우측: 단일 양성 및 이중 양성 표적에 대응한 기능. C. CD19 AND EGFRvIII AND 게이트: 좌측: AND 게이트의 발현은 CD19 CAR에 대해 재조합 CD19-Fc 염색(x-축), 대 EGFRvIII CAR에 대해 항-인간-Fc 염색(Y-축)으로 도시하였다. 우측: 단일 양성 및 이중 양성 표적에 대응한 기능. D. CD19 AND CD5 AND 게이트: 좌측: AND 게이트의 발현은 CD19 CAR에 대해 재조합 CD19-Fc 염색(x-축), 대 CD5 CAR에 대해 항-인간-Fc 염색(Y-축)으로 도시하였다. 우측: 단일 양성 및 이중 양성 표적에 대응한 기능.
도 21: AND NOT 게이트의 기능
AND NOT 게이트의 3가지 구현물의 기능을 도시한다. 시험한 게이트의 만화도를 우측에 도시하였고, 단일 양성 및 이중 양성 표적에 대응한 기능을 좌측에 도시하였다. A. 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 ITAM 함유 활성화 엔도도메인을 가지며; 공발현되는 제2 CAR은 CD33을 인식하고, 마우스 CD8 줄기부 스페이서를 갖고 PTPN6 포스파타아제 도메인을 포함하는 엔도도메인을 갖는, PTPN6 기반 AND NOT 게이트. B. ITIM 기반 AND NOT 게이트는 엔도도메인이 LAIR1 유래 엔도도메인으로 치환된 것을 제외하고, PTPN6 게이트와 동일하다. C. CD148 부스팅된 AND NOT 게이트는 PTPN6 SH2 및 CD148의 엔도도메인 간에 추가의 융합체가 발현되는 것을 제외하고는 ITIM 기반 게이트와 동일하다. 3종 게이트 모두 예상한 대로 CD19에 대응(반응)하여 활성화되지만 CD19와 CD33 함께에는 반응하지 않는다.
도 22: PTPN6 기반 AND NOT 게이트 기능의 정밀분석
원본(본래) PTPN6 기반 AND NOT 게이트를 이 모델을 검증하기 위해 몇몇 대조군과 비교하였다. 시험한 게이트의 만화도는 우측에 도시하였고, 단일 양성 및 이중 양성 표적에 대응한 기능은 좌측에 도시하였다. A. 원본 AND NOT 게이트로서, 제1 CAR이 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 ITAM 함유 활성화 엔도도메인을 가지며; 공발현되는 제2 CAR은 CD33을 인식하고, 마우스 CD8 줄기부 스페이서를 가지며 PTPN6 포스파타아제 도메인을 포함하는 엔도도메인을 갖는다. B. 마우스 CD8 줄기부 스페이서가 Fc 스페이서로 치환되게 개질된 AND NOT 게이트. C . PTPN6 포스파타아제 도메인이 CD148 유래 엔도도메인으로 치환되도록 개질된 AND NOT 게이트. 원본 AND NOT 게이트(A)는 예상대로 CD19에 대응하여 촉발되게 기능하지만, CD19와 CD33 둘모두에 대응하지는 않는다. B.의 게이트는 CD19 단독 또는 CD19와 CD33 함께에 대응하여 둘 모두를 촉발시킨다. C.의 게이트는 하나 또는 양 표적에 대응하여 촉발되지 않는다.
도 23: LAIR1 기반 AND NOT 게이트의 정밀분석
CD19 양성, CD33 양성 및 CD19, CD33 이중 양성 표적에 대한 기능적 활성을 도시한다. A. 원본 ITIM 기반 AND NOT 게이트의 구조 및 활성. 이 게이트는 2개의 CAR로 구성된다: 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 ITAM 함유 엔도도메인을 가지며; 제2 CAR은 CD33을 인식하고, 마우스 CD8 줄기부 스페이서 및 ITIM 함유 엔도도메인을 갖는다. B. 마우스 CD8 줄기부 스페이서가 Fc 도메인으로 치환된 대조군 ITIM 기반 게이트의 구조 및 활성. 이 게이트는 2개의 CAR로 구성된다: 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 ITAM 함유 엔도도메인을 가지며; 제2 CAR은 CD33을 인식하고, Fc 스페이서 및 ITIM 함유 엔도도메인을 갖는다. 두 게이트는 CD19 단독 양성 표적에 반응하지만, 원본 게이트만이 CD19 및 CD33 이중 양성 표적에 대응해서 불활성이다.
도 24: CAR 논리 게이트의 동역학적 분리 모델(kinetic segregation model)
AND 게이트, NOT AND 게이트 및 대조군의 동역학적 분리 및 양태의 모델. CAR은 CD19 또는 CD33을 인식한다. 면역학적 시냅스는 표적 세포막을 나타내는 파란선과 T-세포막을 나타내는 빨간선 사이로 가정할 수 있다. '45'는 T-세포 상에 존재하는 천연 CD45 단백질이다. 'H8'은 스페이서와 같은 인간 CD8 스페이서를 갖는 CAR 엑토도메인이다. 'Fc'는 스페이서와 같은 인간 HCH2CH3을 갖는 CAR 엑토도메인이다. 'M8'은 스페이서와 같은 마우스 CD8 줄기부를 갖는 CAR 엑토도메인이다. '19'는 표적 세포 표면 상의 CD19를 나타낸다. '33'은 표적 세포 표면 상의 CD33을 나타낸다. 기호 '
Figure 112016059208634-pct00001
'는 ITAMS를 함유하는 활성화 엔도도메인을 나타낸다. 기호'θ'는 느린 동력학의 포스파타아제 - PTPN6 또는 ITIM의 촉매 도메인을 포함하는 것과 같은 '결찰 온' 도메인을 나타낸다. 기호 '
Figure 112016059208634-pct00002
'는 빠른 동역학의 포스파타아제 - CD45 또는 CD148의 엔도도메인과 같은 '결찰 오프' 엔도도메인을 나타낸다. 이 기호는 그 잠재적인 활성을 강조하기 위해서 도면에서 확대하였다.
(a) 제1 CAR이 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 활성화 엔도도메인을 가지며; 제2 CAR이 CD33을 인식하고, Fc 스페이서 및 CD148 엔도도메인을 갖는 CAR 쌍을 포함하는 기능적 AND 게이트의 상정된 양태를 도시한다;
(b) 대조군 AND 게이트의 상정된 양태를 도시한다. 여기서, 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 활성화 엔도도메인을 가지며, 제2 CAR은 CD33을 인식하지만, 마우스 CD8 줄기부 스페이서 및 CD148 엔도도메인을 갖는다;
(c) 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 활성화 엔도도메인을 가지며, 제2 CAR은 CD33을 인식하고, 마우스 CD8 줄기부 스페이서 및 PTPN6 엔도도메인을 갖는 CAR 쌍을 포함하는 기능적 AND NOT의 양태를 도시한다;
(d) 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 활성화 엔도도메인을 가지며, 제2 CAR은 CD33을 인식하지만, Fc 스페이서 및 PTPN6 엔도도메인을 갖는 CAR 쌍을 포함하는 대조군 AND NOT 게이트의 상정된 양태를 도시한다.
제1 컬럼에서, 표적 세포는 CD19 및 CD33 둘모두에 음성이다. 제2 컬럼에서, 표적은 CD19 음성 및 CD33 양성이다. 제3 컬럼에서, 표적 세포는 CD19 양성 및 CD33 음성이다. 제4 컬럼에서, 표적 세포는 CD19 및 CD33 둘 모두에 양성이다.
도 25: APRIL-기반 CAR의 디자인.
CAR 디자인은 항원 결합 도메인으로 작용하도록, BCMA, TACI 및 프로테오글리칸과 상호작용하는, APRIL(A proliferation-inducing ligand)의 개질 형태로 scFv가 치환되게 개질되었다: APRIL은 프로테오글리칸 결합 아미노-말단이 부재하도록 절단되었다. 단백질이 세포 표면으로 향하도록 신호 펩티드를 절두된 APRIL 아미노-말단에 부착시켰다. 3종의 CAR이 이러한 APRIL 기반 결합 도메인으로 생성되었다: A. 제1 CAR에서, 인간 CD8 줄기부 도메인이 스페이서 도메인으로 사용되었다. B. 제2 CAR에서, IgG1 유래 힌지가 스페이서 도메인으로 사용되었다. C. 제3 CAR에서, Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해서 Hombach 등(2010 Gene Ther. 17: 1206-1213)이 기술한 pva/a 돌연변이로 개질된 인간 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인이 스페이서로서 사용되었다(이후 Fc-pvaa라고 함). 모든 CAR에서, 이들 스페이서는 CD28 경막 도메인에 연결되고 이어서 CD28, OX40 및 CD3-제타 엔도도메인의 융합체를 함유하는 3부분 엔도도메인에 연결되었다(Pule et al, Molecular therapy, 2005: Volume 12; Issue 5; Pages 933-41).
도 26: 상기 3종 APRIL-CAR의 아미노산 서열과 주석
A: CD8 줄기부 APRIL CAR의 아미노산 서열을 주석을 달아 도시한다; B: APRIL IgG1 힌지 기반 CAR의 아미노산 서열을 주석을 달아 도시한다; C: APRIL Fc-pvaa 기반 CAR의 아미노산 서열을 주석을 달아 도시한다.
도 27: 상이한 APRIL 기반 CAR의 발현 및 리간드 결합
A. 수용체는 레트로바이러스 유전자 벡터 중 마커 유전자 절두형 CD34와 함께 공발현시켰다. 형질도입된 세포에서 마커 유전자의 발현은 형질도입을 확인시켜준다. B. T-세포는 CD8 줄기부 스페이서, IgG1 힌지 또는 Fc 스페이서를 갖는 APRIL 기반 CAR이 형질도입되었다. 이들 수용체가 세포 표면 상에서 안정하게 발현될 수 있는지 여부를 시험하기 위해서, T-세포를 항-APRIL-바이오틴/스트렙타비딘 APC 및 항-CD34로 염색시켰다. 유세포분석을 수행하였다. APRIL은 3종 CAR에서 세포 표면 상에서 균등하게 검출되어서 그들이 균등하게 안정하게 발현됨을 시사하였다. C. 다음으로, TACI 및 BCMA를 인식하는 CAR의 능력을 확인하였다. 형질도입된 T-세포를 항-마우스 2차 및 항-CD34와 함께 마우스 IgG2a Fc 융합체에 융합된 재조합 BCMA 또는 TACI로 염색하였다. 모든 3종의 수용체 형태가 BCMA 및 TACI 둘 모두에 결합하는 것으로 확인되었다. 놀라운 발견은 BCMA와의 결합이 TACI 보다 커보인다는 것이다. 추가의 놀라운 발견은 모든 3종의 CAR이 균등하게 발현되었지만, CD8 줄기부 및 IgG1 힌지 CAR이 Fc 스페이서를 갖는 것보다 BCMA 및 TACI를 인식하는데 더 나은 것으로 나타났다는 것이다.
도 28: 상이한 CAR 구성체의 기능
3종의 상이한 APRIL 기반 CAR을 가지고 기능적 분석을 수행하였다. 상이한 CAR을 발현시키기 위해 형질도입하거나, 또는 비형질도입(NT)된 정상 도너 말초 혈액 T-세포. 형질도입은 균등한 역가 상등액을 사용해 수행하였다. 이들 T-세포를 비특이적 NK 활성을 제거하기 위해 CD56 고갈시키고 이펙터로 사용하였다. BCMA 또는 TACI를 발현시키기 위해 형질도입되거나, 또는 도입되지 않은(NT) SupT1 세포를 표적으로 사용하였다. 데이타는 5회의 독립적인 실험의 평균 및 표준 편차로 나타냈다. A. BCMA 및 TACI 발현 T-세포의 특이적 사멸은 크롬 방출을 사용해 확인하였다. B. 인터페론-μ 방출을 또한 확인하였다. 표적 및 이펙터를 1:1 비율로 공배양(co-culture)하였다. 24시간 후, 상등액 중 인터페론-μ를 ELISA를 통해 분석하였다. C. CAR T-세포의 증식/생존은 또한 추가 6일 동안 인큐베이트시킨 동일한 공배양물 중 CAR T-세포의 수를 계측하여 확인하였다. 모든 3 CAR은 BCMA 및 TACI 발현 표적에 대한 반응을 유도한다. BCMA에 대한 반응은 TACI에 대한 것보다 컸다.
도 29: 초대 세포에서 AND 게이트 기능성
PBMC를 혈액으로부터 단리하고 PHA 및 IL-2를 사용해 자극시켰다. 2일 후 세포를 레트로넥틴 코팅된 플레이트 상에서 CD19:CD33 AND 게이트 구성체를 함유하는 레트로바이러스로 형질도입시켰다. 5일에, AND 게이트 구성체에 의해 번역된 CAR 둘 다의 발현도를 유세포측정법을 통해 평가하였고 세포는 CD56+ 세포가 고갈되었다(주로 NK 세포). 6일에 PBMC를 1:2의 이펙터 대 표적 세포 비율로 표적 세포와 공배양물에 넣었다. 8일에, 상등액을 모으고 ELISA를 통해서 IFN-감마 분비를 분석하였다.
도 30: 큰 크기의 가능한 스페이서 도메인의 체계/선택을 도시한다. CD3-제타의 엑토도메인을 가장짧은 가능한 스페이서로 제안하였고, 이어서 (b) IgG1 힌지, (c) 마우스 또는 인간 CD8 줄기부 및 CD28 엑토도메인은 크기 및 공분리(co-segregate)에서 중간으로 간주한다. (d) IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인은 보다 크고 부피가 더 크며, (e) IgM의 힌지, CH2, CH3 및 CH4 도메인은 여전히 더 크다. 표적 분자의 특성, 및 결합 도메인의 에피토프를 고려하면, 시냅스 형성 시 함께 분리되거나 또는 떨어져 분리되는 CAR 신호전달 시스템을 생성하는데 이러한 체계를 사용하는 것이 가능하다.
도 31: 논리 게이팅된 CAR T-세포를 구축하기 위한 디자인 규칙
OR, AND NOT 및 AND 게이팅된 CAR을 상층에 표적 세포, 그리고 중간에 시냅스와 하층에 T-세포의 그림 형태로 도시한다. 표적 세포는 임의적인 표적 항원 A, 및 B를 발현한다.
T-세포는 항-A 및 항-B 인식 도메인, 스페이서 및 엔도도메인을 포함하는 2종의 CAR을 발현한다. OR 게이트는 (1) 단순하게 항원 인식 및 CAR 활성화를 허용하는 스페이서, 및 (2) 활성인자/엔도도메인을 갖는 양쪽 CAR을 요구한다; AND NOT 게이트는 (1) 둘 모두의 항원 인식 시 CAR 둘 다의 공분리를 일으키는 스페이서 및 (2) 활성화 엔도도메인을 갖는 CAR과, 그 엔도도메인이 약한 포스파타아제를 포함하거나 또는 동원하는 다른 하나의 CAR을 요구한다; AND 게이트는 (1) 양 항원의 인식시 면역학적 시냅스의 상이한 부분으로 CAR 둘 다의 분리를 일으키는 스페이서 및 (2) 활성화 엔도도메인을 갖는 하나의 CAR, 및 그 엔도도메인이 강력한 포스파타아제를 포함하는 다른 하나의 CAR을 요구한다.
본 발명자는 세포, 예컨대 T 세포에 의해 발현시, 적어도 2 표적 항원의 특정 발현 패턴을 검출할 수 있는, "논리-게이팅된" 키메라 항원 수용체의 패턴을 개발하였다. 적어도 2 표적 항원을 항원 A 및 항원 B로 임의적으로 표시하면, 다음의 3가지 가능한 선택권이 존재한다:
"OR 게이트" - 항원 A 또는 항원 B 중 어느 하나가 표적 세포 상에 존재시 T 세포가 촉발된다. "AND 게이트" - 항원 A 및 B 둘 모두가 표적 세포 상에 존재할때만 T 세포가 촉발된다. "AND NOT 게이트" - 항원 A가 단독으로 표적 세포에 존재하면 T 세포가 촉발되지만, 항원 A 및 B 둘 모두가 표적 세포 상에 존재하면 그렇지 않다.
이들 CAR 조합을 발현하는 조작된 T 세포는 그들의 2 또는 그 이상의 마커의 특정 발현(또는 발현 결여)을 기반으로, 암 세포에 정교하게 특이적이도록 맞춰질 수 있다.
따라서 제1 측면에서, 본 발명은 세포 표면에서 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR을 공발현하는(co-express) 세포를 제공하고, 각각의 CAR은
(i) 항원 결합 도메인;
(ii) 스페이서;
(iii) 경막 도메인; 및
(iv) 세포내 T 세포 신호전달 도메인(엔도도메인)
을 포함하고, 제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하며, 제1 CAR의 스페이서는 제2 CAR의 스페이서와 상이하여서, 제1 및 제2 CAR이 이종이량체를 형성하지 않고, 제1 또는 제2 CAR 중 하나는 활성화 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 활성화 CAR이고 나머지 CAR은 "결찰-오프"(본원에 정의한 바와 같음) 억제성 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 억제성 CAR이다.
세포는 면역 이펙터 세포, 예컨대 T-세포 또는 자연 살해(NK) 세포일 수 있다. T 세포와 연관하여 본원에 언급한 특징들은 다른 면역 이펙터 세포, 예컨대 NK 세포에 균등하게 적용된다.
제1 CAR의 스페이서는 제2 CAR의 스페이서와 상이한 길이 및/또는 전하 및/또는 형상 및/또는 입체형태(configuration) 및/또는 글리코실화(당화)를 나타내며, 이에 제1 CAR 및 제2 CAR이 그들의 각각의 표적 항원에 결합시, 제1 CAR 및 제2 CAR이 T 세포 상에서 공간적으로 분리된다. 그들 각각의 항원에 대한 제1 및 제2 CAR의 결찰은 면역학적 시냅스에서 함께 또는 개별적으로 구획화되게하여서 활성화의 제어를 일으킨다. 이는 T-세포 활성화의 동역학적 분리 모델을 고려시 이해될 것이다(이하를 참조함).
제1 스페이서 또는 제2 스페이서는 CD8 줄기부를 포함하고 다른 스페이서는 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
본 발명에서, "AND" 게이트와 관련하여, 제1 또는 제2 CAR 중 하나는 활성화 엔도도메인을 포함하는 활성화 CAR이고, 다른 CAR은 억제성 엔도도메인을 포함하는 "결찰-오프" 억제성 CAR이다. 결찰-오프 억제성 CAR은 억제성 CAR 결찰 부재시에 활성화 CAR에 의해 T-세포 활성화를 억제하지만, 억제성 CAR이 결찰된 경우 활성화 CAR에 의해 T-세포 활성화를 유의하게 억제하지 않는다.
제1 CAR의 스페이서는 제2 스페이서와 길이 및/또는 전하 및/또는 형상 및/또는 입체형태 및/또는 글리코실화가 상이하므로, CAR 둘 모두가 결찰시 그들은 분리된다. 이는 억제성 CAR이 활성화 CAR로부터 공간적으로 분리되도록 하여서, T 세포 활성화가 일어날 수 있다. 따라서 T 세포 활성화는 오직 두 동족 항원을 보유하는 표적 세포에 대응(반응)하여 일어난다.
억제성 엔도도메인은 수용체-유사 티로신 포스파타아제, 예컨대 CD148 또는 CD45 유래의 엔도도메인 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
제1 CAR의 항원 결합 도메인은 CD5에 결합하고 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19에 결합할 수 있다. 이는 만성 림프성 백혈병(CLL)을 표적화하는데 사용된다. 이 질환은 CD19를 단독으로 표적화하여 치료할 수 있지만, 전체 B-세포 구획이 고갈된다. CLL 세포는 CD5 및 CD19를 공발현시키는 점에서 흔치않다. AND 게이트와 항원의 이러한 쌍을 표적화하는 것은 특이성을 증가시키고 독성을 감소시킨다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에서 정의한 바와 같이 제1 및 제2 키메라 항원 수용체(CAR) 둘 모두를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
그에 따른 핵산 서열은 다음의 구조를 가질 수 있다: AgB1-스페이서1-TM1-endo1-coexpr-AgB2-스페이서2-TM2-endo2
여기서
AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이며; TM1은 제1 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo1은 제1 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이며; coexpr은 두 CAR의 공발현을 허용하는 핵산 서열(예를 들어, 절단 부위)이고; AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이며; TM2은 제2 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo2는 제2 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이며;
여기서 핵산 서열은, T 세포에서 발현시, 제1 및 제2 CAR이 T 세포 표면에서 공발현되도록 절단 부위에서 절단되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이다.
두 CAR의 공발현을 가능케하는 핵산 서열은 자가 절단 펩티드 또는 두 CAR을 공발현하는 대안적인 수단 예컨대 내부 리보솜 진입 서열 또는 제2 프로모터 또는 당분야의 숙련가가 동일 벡터로부터 2 단백질을 발현시킬 수 있는 다른 수단을 가능케하는 서열을 코딩할 수 있다.
대체 코돈(alternative codon)이 상동성 재조합을 피하기 위해서, 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 서열 영역에 사용될 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 키트를 제공한다:
(i)본 발명의 제1 측면에서 정의한 바와 같은 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제1 핵산 서열로서, 이 핵산 서열은 다음의 구조를 갖는 것인 서열:
AgB1-스페이서1-TM1-endo1
(여기서, AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이며; TM1은 제1 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo1은 제1 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열임); 및
(ii) 본 발명의 제1 측면에서 정의한 바와 같은 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 다음의 구조를 갖는 것인 핵산 서열:
AgB2-스페이서2-TM2-endo2
(여기서, AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이며; TM2는 제2 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo2는 제2 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열임).
제4 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 및 상기 정의된 바와 같은 제1 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 키트를 제공한다.
벡터는 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 트랜스포손 벡터일 수 있다. 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
벡터는 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 트랜스포손 벡터일 수 있다.
제6 측면에서, 본 발명은 2 이상의 항원의 복합 패턴이 표적 세포상에서 인식될 수 있는 방식으로 2 이상의 CAR의 공발현을 포함한다.
제7 측면에서, 본 발명은 제1 및 제2 CAR을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열(들); 또는 상기 정의된 바와 같은 1 이상의 벡터(들)을 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 본 발명의 제1 측면에 따른 T 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
T 세포는 환자, 관련 또는 미관련 조혈 이식 도너, 완전하게 미연관된 도너에서, 제대혈에서 단리되거나, 배아 세포주로부터 분화시키거나, 유도성 전구 세포주로부터 분화되거나, 또는 형질전환된 T 세포주에서 유래된 샘플일 수 있다.
제8 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 복수의 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
제9 측면에서, 본 발명은 피험체에게 본 발명의 제8 측면에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
(i) 상기 열거된 바와 같은 T 세포의 단리 단계;
(ii) 제1 및 제2 CAR을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열(들) 또는 이러한 핵산 서열(들)을 포함하는 1 이상의 벡터(들)로 T 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계; 및
(iii) 피험체에서 (ii)로부터의 T 세포를 투여하는 단계.
질환은 암일 수 있다.
제10 측면에서, 본 발명은 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 제8 측면에 따른 약학 조성물을 제공한다.
질환은 암일 수 있다.
제11 측면에서, 본 발명은 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 발명의 제1 측면에 따른 T 세포의 용도를 제공한다.
질환은 암일 수 있다.
본 발명은 또한
a) 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
b) 제2 CAR을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열;
c) 두 CAR이 개별 독립체로서 발현되도록, 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 위치된 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열
을 포함하는 핵산 서열을 제공한다.
대체 코돈이 동일하거나 또는 유사한 아미노 서열(들)을 코딩하는 영역 내 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열의 1 이상의 부분(들)에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 세포를 제공한다.
본 발명의 동역학적-분리 기반 AND 게이트는 이전에 설명된 "공동-CAR", 즉 2 항원이 T 세포에 대해 활성화 또는 공자극성 신호를 공급하는 2 CAR에 의해 인식되는 이중 표적화 접근법보다 상당한 기술적 장점을 제공한다.
공동-CAR 접근법의 경우, 2종의 항원을 보유하는 표적 세포에 대해 최고 활성을 예상하였지만, 활성화 CAR에 의해 인식되는 항원만을 보유하는 조직에 대해 상당한 활성을 기대할 수 있다. 이러한 활성은 적어도 1 세대 CAR의 그것으로 기대할 수 있다. 1세대 CAR은 상당한 독성을 야기하였다: 예를 들어 예상치않게 담즙 상피 상에서 발현되는 카본산 언히드라아제 IX를 인식하는 1 세대 CAR의 임상 실험에서 담즙 독성이 관찰되었다(Rotterdam ref). 주목할 것은, 말단 분화된 이펙터가 공자극성 신호를 필요로하지 않거나 또는 그에 대응하지 않아서, 임의의 말단 분화된 CAR T-세포가 공자극성 CAR 신호가 없음에도 불구하고 최대로 작용하였다.
또한, 공자극성 신호가 T 세포 개체군에 대하여 장기 지속 효과를 초래한다. 이러한 효과는 T-세포/표적 시냅스 상호작용보다 길게 오래간다. 결과적으로, 종양 내에서 완전하게 활성화되고 이동한 CAR T-세포는 단일 항원 보유 정상 조직에 대해 최대로 강력한 활성을 가질 수 있다. 이러한 "스필-오버(spill-over)" 효과는 종양 내, 그 근처 또는 종양으로부터 배출되는 조직에서 가장 현저할 수 있다. 사실, CAR 활성화가 아니라 개별 수용체를 통해서 관여하는 공자극성 신호에 의해 1세대 CAR의 활성이 강화된다는 개념을 기초로하는 전략이 제안되었고 시험되었다(Rossig, Blood. 2002 Mar 15;99(6):2009-16.).
따라서 공동-CAR 접근법은 단일 항원을 발현하는 정상 조직에 대한 독성의 제거가 아니라 잘해봐야 감소시키는 정도로 예상할 수 있다. 본 발명은 T-세포 촉발 자체를 조절하기 위해서 T-세포/표적 세포 간에 형성된 면역학적 시냅스에서 동역학적 분리를 사용한다. 결과적으로 제2 항원의 부재하에서 촉발의 단단하고 절대적인 제어가 달성된다. 따라서, T-세포 활성화의 총합은 2종의 항원 모두를 발현하는 표적 세포에 국한되고, AND 게이트는 이펙터 세포 유형이나 분화 상태와 무관하게 기능해야 하며, "스필-오버' 이펙트 AND 게이트 T-세포 활성화가 가능하지 않다.
본 발명의 추가 측면
본 발명은 또한 다음의 번호매긴 단락에 열거한 측면들에 관한 것이다:
1. 세포 표면에서 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR을 공발현하는 T 세포로서, 각각의 CAR은
(i) 항원 결합 도메인;
(ii) 스페이서;
(iii) 경막 도메인; 및
(iv) 엔도도메인
을 포함하고,
제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하며, 제1 CAR의 스페이서는 제2 CAR의 스페이서와 상이하고 제1 또는 제2 CAR 중 하나는 활성화 엔도도메인을 포함하는 활성화 CAR이고 나머지 CAR은 활성화 엔도도메인을 포함하는 활성화 CAR 또는 결찰-온 또는 결찰-오프 억제성 엔도도메인을 포함하는 억제성 CAR인 T 세포.
2. 단락 1에 따른 T 세포로서, 제1 CAR의 스페이서는 제2 CAR의 스페이서와 길이 및/또는 전하 및/또는 크기 및/또는 입체형태 및/또는 글리코실화가 상이하여서, 제1 CAR 및 제2 CAR이 그들의 각각의 표적 항원에 결합시, 제1 CAR 및 제2 CAR이 T 세포막 상에서 공간적으로 분리되는 것인 T 세포.
3. 단락 2에 따른 T 세포로서, 제1 스페이서 또는 제2 스페이서는 CD8 줄기부를 포함하고 나머지 스페이서는 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 T 세포.
4. 단락 1에 따른 T 세포로서, 제1 및 제2 CAR 둘 모두는 활성화 CAR인 T 세포.
5. 단락 4에 따른 T 세포로서, 하나의 CAR은 CD19에 결합하고 나머지 CAR은 CD20에 결합하는 것인 T 세포.
6. 단락 2 또는 3에 따른 T 세포로서, 제1 또는 제2 CAR 중 하나는 활성화 엔도도메인을 포함하는 활성화 CAR이고, 나머지 CAR은 결찰-오프 억제성 엔도도메인을 포함하는 억제성 CAR이며, 억제성 CAR은 억제성 CAR 결찰 부재하에서 활성화 CAR에 의한 T-세포 활성화를 억제하지만, 억제성 CAR이 결찰되면 활성화 CAR에 의한 T-세포 활성화를 유의하게 억제하지 않는 것인 T 세포.
7. 단락 6에 따른 T 세포로서, 억제성 엔도도메인은 CD148 또는 CD45 유래의 엔도도메인의 전부 또는 일부분을 포함하는 것인 T 세포.
8. 단락 6 또는 7에 따른 T 세포로서, 제1 CAR의 항원 결합 도메인은 CD5에 결합하고 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하는 것인 T 세포.
9. 단락 1에 따른 T 세포로서, 제1 및 제2 스페이서는 제1 및 제2 CAR의 교차-쌍형성(cross-pairing)을 방지하도록 충분히 상이하지만 결찰 후 제1 및 제2 CAR의 공국재화를 일으키기에 충분히 유사한 것인 T 세포.
10. 단락 9에 따른 T 세포로서, 제1 또는 제2 CAR 중 하나는 활성화 엔도도메인을 포함하는 활성화 CAR이고, 나머지 CAR은 결찰-온 억제성 엔도도메인을 포함하는 억제성 CAR이며, 이 억제성 CAR은 억제성 CAR 결찰 부재하에서 활성화 CAR에 의한 T-세포 활성화를 충분히 억제하지 않지만, 억제성 CAR이 결찰시 활성화 CAR에 의한 T-세포 활성화를 억제하는 것인 T 세포.
11. 단락 10에 따른 T 세포로서, 결찰-온 억제성 엔도도메인은 포스파타아제의 적어도 일부분을 포함하는 것인 T 세포.
12. 단락 11에 따른 T 세포로서, 결찰-온 억제성 엔도도메인은 PTPN6의 전부 또는 일부분을 포함하는 것인 T 세포.
13. 단락 10에 따른 T 세포로서, 결찰-온 억제성 엔도도메인은 적어도 하나의 ITIM 도메인을 포함하는 것인 T 세포.
14. 단락 13에 따른 T 세포로서, 결찰-온 억제성 엔도도메인의 활성은 PTPN6-CD45 또는 PTPN6-CD148 융합 단백질의 공발현에 의해 강화되는 것인 T 세포.
15. 단락 10 내지 14 중 어느 하나에 따른 T 세포로서, 활성화 엔도도메인을 포함하는 CAR은 CD33에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고 결찰-온 억제성 엔도도메인을 포함하는 CAR은 CD34에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 T 세포.
16. 2 이상의 항원의 개별 패턴을 보유하는 세포, 예컨대 T 세포에 의해 특이적으로 자극되도록 전술한 단락에서 정의한 바와 같은 2 이상의 CAR을 포함하는 T 세포.
17. 단락 1 내지 16 중 어느 하나에서 정의한 바와 같은 제1 및 제2 키메라 항원 수용체(CAR) 둘 모두를 코딩하는 핵산 서열.
18. 단락 17에 따른 핵산 서열로서, 다음의 구조를 갖는 것인 핵산 서열:
AgB1-스페이서1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-스페이서2-TM2-endo2
여기서,
AgB1은 제1 CAR의 항언-결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이며; TM1은 제1 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo1은 제1 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; coexpr은 CAR 둘 다의 공발현을 가능하게 하는 핵산 서열이며, AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고; TM2는 제2 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo2는 제2 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이며;
이러한 핵산 서열은, T 세포에서 발현시, 제1 및 제2 CAR이 T 세포 표면에서 공발현되도록 절단 부위에서 절단되는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 핵산.
19. 단락 18에 따른 핵산 서열로서, coexpr은 자가 절단 펩티드를 포함하는 서열을 코딩하는 것인 핵산 서열.
20. 단락 18 또는 19에 따른 핵산 서열로서, 대체 코돈이 상동성 재조합을 피하기 위해서, 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 서열의 영역에서 사용되는 것인 핵산 서열.
21. (i) 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제1 핵산 서열로서, 다음의 구조를 갖는 것인 핵산 서열:
AgB1-스페이서1-TM1-endo1
(여기서, AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이며; TM1은 제1 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo1은 제1 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열임); 및
(ii) 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 다음의 구조를 갖는 것인 핵산 서열:
AgB2-스페이서2-TM2-endo2
(여기서, AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이며; TM2는 제2 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo2는 제2 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열임)
을 포함하는 키트.
22. 단락 21에 정의된 바와 같은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 및 단락 21에 정의된 바와 같은 제1 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 키트.
23. 단락 22에 따른 키트로서, 벡터는 통합성(integrating) 바이러스 벡터 또는 트랜스포손인 키트.
24. 단락 17 내지 20 중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
25. 단락 24에 따른 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터 또는 트랜스포손.
26. 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 T 세포의 제조 방법으로서, 단락 17 내지 20 중 어느 하나에 따른 핵산; 단락 21에 정의된 바와 같은 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열; 및/또는 단락 22에 정의된 바와 같은 제1 벡터 및 제2 벡터 또는 단락 24 또는 단락 25에 따른 벡터를 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
27. 단락 24에 따른 방법으로서, T 세포는 피험체로부터 단리된 샘플에서 유래된 것인 제조 방법.
28. 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 복수의 T 세포를 포함하는 약학 조성물.
29. 질환의 치료 및/또는 예방 방법으로서, 단락 28에 따른 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 치료 및/또는 예방 방법.
30. 다음의 단계들을 포함하는, 단락 29에 따른 방법:
(i) 피험체로부터 T 세포 함유 샘플을 단리하는 단계;
(ii) 단락 17 내지 20 중 어느 하나에 따른 핵산 서열; 단락 21에 정의된 바와 같은 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열; 단락 22 또는 23에 정의된 바와 같은 제1 벡터 및 제2 벡터 또는 단락 24 또는 25에 따른 벡터로 T 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계; 및
(iii) 피험체에게 (ii) 유래의 T 세포를 투여하는 단계.
31. 단락 29 또는 30에 따른 방법으로서, 질환은 암인 방법.
32. 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 단락 28에 따른 약학 조성물.
33. 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 T 세포의 용도.
키메라 항원 수용체(CAR)
도 1에 개략적으로 도시한, CAR은 세포외 항원-인식 도메인(바인더)을 세포내 신호전달 도메인(엔도도메인)에 연결시키는 키메라 I형 경막 단백질이다. 바인더는 전형적으로 단일클론 항체(mAb)에서 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)이지만, 항체-유사 항원 결합 부위를 포함하는 다른 형태를 기반으로 할 수 있다. 스페이서 도메인은 일반적으로 막에서 바인더를 단리하고 그것이 적합하게 배향되도록 하는데 필수적이다. 사용되는 일반적인 스페이서 도메인은 IgG1의 Fc이다. 보다 치밀한 스페이서가, 예를 들어 항원에 따라서, CD8α 유래의 줄기부 및 심지어 단지 IgG1 힌지 단독이 충분할 수 있다. 경막 도메인은 세포막에 단백질을 정박시키고 엔도도메인에 스페이서를 연결한다.
초기 CAR 디자인은 FcεR1 또는 CD3ζ의 γ 사슬의 세포내 부분에서 유래된 엔도도메인을 가졌다. 결과적으로, 이들 1세대 수용체는 동족 표적 세포의 T 세포 사멸을 촉발시키는데는 충분하지만, 증식되고 생존하도록 T 세포를 완전하게 활성화시키는데는 실패한, 면역학적 신호1을 전달하였다. 이러한 한계를 극복하기 위해서, 복합 엔도도메인이 구축되었다: CD3ζ의 그것에 T 세포 공자극성 분자의 세포내 부분의 융합은 항원 인식 후 동시적으로 활성화 및 공자극성 신호를 전달할 수 있는 2세대 수용체를 생성시킨다. 가장 일반적으로 사용되는 공자극성 도메인은 CD28의 것이다. 이는 T 세포 증식을 촉발시키는, 가장 강력한 공자극성 신호 - 즉 면역학적 신호2를 공급한다. TNF 수용체 패밀리 엔도도메인, 예컨대 생존 신호를 전달하는 밀접하게 관련된 OX40 및 41BB를 포함하는, 일부 수용체가 또한 기술되었다. 활성화, 증식 및 생존 신호를 전달할 수 있는 엔도도메인을 갖는 보다 더 강력한 3세대 CAR을 이제 설명한다.
CAR-코딩 핵산은 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 사용해 T 세포에 전달될 수 있다. 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 방식으로 대량의 암-특이적 T 세포가 입양 세포 전달을 위해 생성될 수 있다. CAR이 표적 항원에 결합시, 이는 그것이 발현되는 T 세포에 활성화 신호를 전달시킨다. 따라서, CAR은 표적 항원을 발현하는 종양 세포에 대해서 T 세포의 특이성 및 세포독성을 유도한다.
본 발명의 제1 측면은 진실표: 표 1, 2, 및 3에 상세히 설명한 바와 같이 논리 게이트의 방식으로 표적 세포 상의 바람직한 발현 패턴을 T 세포가 인식할 수 있도록 제1 CAR 및 제2 CAR을 공발현시키는 T 세포에 관한 것이다.
제1 및 제2(및 경우에 따라 후속) CAR은
(i) 항원 결합 도메인;
(ii) 스페이서;
(iii) 경막 도메인; 및
(iii) 세포내 도메인
을 포함한다.
CAR OR 게이트에 대한 진실표
항원 A 항원 B 반응
부재 부재 비활성화
부재 존재 활성화
존재 부재 활성화
존재 존재 활성화
CAR AND 게이트에 대한 진실표
항원 A 항원 B 반응
부재 부재 비활성화
부재 존재 비활성화
존재 부재 비활성화
존재 존재 활성화
CAR AND NOT 게이트에 대한 진실표
항원 A 항원 B 반응
부재 부재 비활성화
부재 존재 비활성화
존재 부재 활성화
존재 존재 비활성화
본 발명의 T 세포의 제1 및 제2 CAR은 절단 부위와 함께, CAR 둘 다를 포함하는 폴리펩티드로서 생산될 수 있다.
서열번호 1 내지 5는 각각 2 CAR을 포함하는 이러한 폴리펩티드의 예를 제공한다. 따라서 이러한 CAR은 단일 CAR에 상응하는, 다음의 아미노산 서열 중 하나 또는 다른 부분을 포함한다.
서열번호 1은 CD19 OR CD33을 인식하는 CAR OR 게이트이다.
서열번호 2는 CD148 포스파타아제를 사용하는 CD19 AND CD33을 인식하는 CAR AND 게이트이다.
서열번호 3은 CD45 포스파타아제를 사용하는 CD19 AND CD33을 인식하는 CAR AND 게이트의 대안적인 실행물이다.
서열번호 4는 PTPN6 포스파타아제를 기반으로 CD19 AND NOT CD33을 인식하는 CAR AND NOT 게이트이다.
서열번호 5는 CD19 AND NOT CD33을 인식하며 LAIR1에서 유래된 ITIM 함유 엔도도메인을 기반으로 하는 CAR AND NOT 게이트의 대안적인 실행물이다.
서열번호 6은 CD19 AND NOT CD33을 인식하며 PTPN6-CD148 융합 단백질을 ITIM 함유 엔도도메인에 동원시키는 CAR AND NOT 게이트의 추가적인 대안적 실행물이다.
Figure 112016059208634-pct00003
Figure 112016059208634-pct00004
Figure 112016059208634-pct00005
Figure 112016059208634-pct00006
Figure 112016059208634-pct00007
CAR은 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로 도시한 서열의 CAR-코딩 부분의 변이체를 포함할 수 있으나, 단 변이체 서열은 요구되는 특성을 갖는 CAR이다.
서열 정렬 방법은 당분야에 잘 알려져 있고 적합한 정렬 프로그램을 사용해 수행한다. 서열 동일성 %는 그들을 최적으로 정렬시 2 서열간에 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기의 백분율을 의미한다. 뉴클레오티드 및 단백질 서열 상동성 또는 동일성은 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 공공으로 입수할 수 있는, 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST 프로그램(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biotechnology Information)과 같은 표준 알고리즘을 사용해 결정할 수 있다. 서열 동일성 또는 상동성을 결정하는 다른 알고리즘은 LALIGN (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/ 및 http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/nucleotide.html), AMAS(Analysis of Multiply Aligned Sequences, at http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/Amas/amas.html), FASTA (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/), Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), SIM (http://web.expasy.org/sim/), 및 EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss needle/nucleotide.html)을 포함한다.
CAR 논리 OR 게이트
이 실시양태에서, 본 발명의 제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고 CAR 둘다는 활성화 엔도도메인을 포함한다. CAR 둘 다는 2종의 상이한 수용체의 교차-쌍형성을 방지하도록 상이한 스페이서 도메인을 갖는다. 따라서 T 세포는 항원 중 어느 하나 또는 둘 모두의 인식시 활성화되도록 조작될 수 있다.
이는 골디-콜드만 가설에 의해 제안된 바와 같은 분야에서 유용하다: 단일 항원의 단독 표적화는 대부분의 암에서 고유한 높은 돌연변이 비율에 기인한 상기 항원의 조정에 의해 종양 탈출을 일으킬 수 있다. 2종 항원을 동시에 표적화하여, 이러한 탈출 가능성을 기하급수적으로 감소시킨다.
다양한 종양 연관 항원이 이하의 표 4에 나타낸 바와 같이 알려져 있다. 소정 질환의 경우, 제1 CAR 및 제2 CAR은 그 질환과 연관된 2종의 다른 TAA에 결합된다. 이러한 방식으로, 제2 항원이 또한 표적화되므로, 단일 항원의 조정에 의한 종양 탈출이 방지된다. 예를 들어, B-세포 악성종양을 표적화시, CD19 및 CD20 둘 모두가 동시에 표적화될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기 두 CAR이 이종이량체화되지 않는 것이 중요하다.
암 유형 TAA
미만성 거대 B-세포 림프종 CD19, CD20
유방암 ErB2, MUC1
AML CD13, CD33
신경아세포종 GD2, NCAM
B-CLL CD19, CD52
직결장암 폴레이트 결합 단백질, CA-125
동역학적 분리 모델
AND 게이트 및 AND NOT 게이트를 생성시키기 위한 CAR의 후속 쌍형성은 T 세포 활성화의 동역학적 분리 모델(KS)를 기반으로 한다. 이는 T 세포 수용체에 의한 항원 인식이 어떻게 하류 활성화 신호로 전환되는지를 설명하는, 실험적 데이타로 뒷받침된 기능적 모델이다. 간략하게: 기저 상태에서, T 세포막 상의 신호전달 성분은 역학적으로 항상성이어서 탈인산화된 ITAM가 인산화 ITAM보다 선호된다. 이는 lck와 같은 막-속박된 키나아제 상에서 경막 CD45/CD148 포스파타아제의 보다 큰 활성에 기인한다. T 세포가 동족 항원의 T 세포 수용체(또는 CAR) 인식을 통해 표적 세포를 관여시킬 경우, 조밀한 면역학적 시냅스가 형성된다. 이러한 T 세포 및 표적 막의 밀접한 병치는 시냅스에 맞춰질 수 없는 그들의 거대한 엑토도메인으로 인해 CD45/CD148를 배제한다. 포스파타아제 부재하에서, 시냅스 내에 고농도의 T 세포 수용체 연관 ITAM의 분리는 인산화 ITAM이 선호되는 상태를 유도시킨다. ZAP70은 인산화 ITAM의 한계치를 인식하고 T 세포 활성화 신호를 전파시킨다. T 세포 활성화에 대한 이러한 발전된 이해는 본 발명에 의해 활용된다. 구체적으로, 본 발명은 상이한 길이 및/또는 벌크 및/또는 전하 및/또는 입체형태 및/또는 글리코실화의 엑토도메인이 시냅스 형성시 어떻게 차등적인 분리를 일으키는지에 대한 이해를 기초로 한다.
CAR 논리 AND 게이트
본 실시양태에서, 하나의 CAR은 활성화 엔도도메인을 포함하고 하나의 CAR은 억제성 엔도도메인을 포함하여서 억제성 CAR이 항구적으로 제1 활성화 CAR을 억제하지만, 그 동족 항원의 인식시에는 활성화 CAR의 억제를 풀어준다. 이러한 방식으로, T-세포는 오직 표적 세포가 동족 항원 둘 모두를 발현하면 촉발되도록 조작될 수 있다. 이러한 양태는 ITAM 도메인을 함유하는 활성화 엔도도메인 예를 들어 CD3 제타의 엔도도메인을 포함하는 활성화 CAR, 및 ITAM을 탈인산화시킬 수 있는 포스파타아제 유래 엔도도메인(예를 들어, CD45 또는 CD148)을 포함하는 억제성 CAR에 의해 달성된다. 결정적으로, 양 CAR의 스페이서 도메인은 크기 및/또는 형상 및/또는 전하 등이 상당히 상이하다. 오직 활성화 CAR이 결찰된 경우, 억제성 CAR이 T 세포 표면 상에서 용해되어 활성화 CAR을 억제하는 시냅스의 안과 밖으로 분산될 수 있다. 양 CAR이 결찰되면, 스페이서 특성 차이로 인해서, 활성화 및 억제성 CAR은 활성화 CAR이 억제성 CAR에 의해 방해없이 T 세포 활성화를 촉발시킬 수 있게 차등적으로 분리된다.
이는 암요법 분야에서 상당한 활용성이 있다. 최근에, 면역요법은 전형적으로 단일 항원을 표적으로 삼는다. 대부분의 암은 단일 항원을 기반으로 정상 조직으로 부터 분화할 수 없다. 따라서, 상당한 "온-표적 오프-종양" 독성이 발생하여서 정상 조직이 이러한 요법에 의해 손상된다. 예를 들어, 리툭시맙을 사용해 B 세포 림프종을 치료하기 위해 CD20을 표적화하면, 전체 정상 B 세포 구획이 고갈된다. 예를 들어, 만성 림프성 백혈병 치료를 위해 CD52를 표적으로 삼으면, 전체 림프성 구획이 고갈된다. 예를 들어, 급성 골수성 백혈병 치료를 위해 CD33을 표적으로 하면, 전체 골수성 구획이 손상을 입는다. 항원 쌍에 활성을 제한시켜서, 보다 더 세련된 표적화, 및 독성이 덜한 요법이 개발될 수 있다. 실시예는 CD5 및 CD19 둘 모두를 발현하는 CLL의 표적화이다. 오직 소수 비율의 정상 B 세포만 이들 두 항원을 발현하여서, 논리 AND 게이트에 의한 2 항원 표적화의 오프-표적 독성이 각 항원을 개별적으로 표적화하는 것보다 실질적으로 낮다.
본 발명의 디자인은 Wilkie 등((2012). J. Clin. Immunol. 32, 1059-1070)이 설명하고 생체내에서 시험(Kloss et al (2013) Nat. Biotechnol. 31, 71-75)된 이전 실행에 상당히 개선을 가하였다. 이러한 실행에서, 제1 CAR은 활성화 엔도도메인을 포함하고, 제2 CAR은 공자극성 도메인을 포함한다. 이러한 방식에서, T 세포는 오직 2 항원이 존재할 경우 활성화 및 공자극성 신호를 받는다. 그러나, T-세포는 여전히 제1 항원의 단독 존재에서 활성화되어 오프-표적 독성에 대한 가능성이 발생된다. 또한, 본 발명의 실행은 세포가 항원의 복합 패턴을 이해할 수 있도록 복수의 복합 연결 게이트를 허용한다.
암 유형 항원
만성 림프성 백혈병 CD5, CD19
신경아세포종 ALK, GD2
신경교종 EGFR, 비멘틴
다발성 골수종 BCMA, CD138
신장세포 암종 카르본산 언히드라아제 IX, G250
T-ALL CD2, N-카데린
전립선 암 PSMA, 헵신(또는 그외)
CAR 논리 AND NOT 게이트
이 실시예에서, 하나의 CAR은 활성화 엔도도메인을 포함하고 하나의 CAR은 억제성 엔도도메인을 포함하여서 이러한 억제성 CAR은 오직 그 동족 항원을 인식하는 경우에만 활성화된다. 따라서 이러한 방식으로 조작된 T-세포는 제1 항원의 단독 존재에 대응하여 활성화되지만 양 항원이 존재하는 경우에는 활성화되지 않는다. 본 발명은 제1 CAR과 공국재화하는 스페이서를 갖는 억제성 CAR에 의해 실시되지만 억제성 CAR의 어떠한 포스파타아제 활성도 그다지 강력하지 않아서 용해되어 억제하거나, 또는 억제성 도메인은 사실 억제성 CAR이 그 동족 표적을 인식시 단독으로 포스파타아제를 동원한다. 이러한 엔도도메인을 본원에서 "결찰-온" 또는 반-억제성이라고 한다.
본 발명은 종양 연관 항원의 존재 및 정상 조직 상에 발현되는 항원의 상실에 의해 정상 조직과 종양을 구별할 수 있을 때 표적화를 개량하는데서 사용된다. AND NOT 게이트는 그 정상 세포가 또한 활성화 엔도도메인을 포함하는 CAR에 의해 인식되는 항원을 발현하는, 정상 세포에 의해 발현되는 항원을 표적화할 수 있게 하므로 종양학 분야에서 상당히 유용하다. 이러한 항원의 예에는 정상 줄기 세포 및 급성 골수성 백혈병(AML) 세포에 의해 발현되는 CD33이 있다. CD34는 줄기 세포 상에서 발현되지만 전형적으로 AML 세포 상에서는 발현되지 않는다. CD33 AND NOT CD34를 인식하는 T 세포는 백혈병 세포를 파괴하지만 정상 줄기 세포는 면하게 한다.
AND NOT 게이트에 사용할 수 있는 가능한 항원 쌍을 하기 표 6에 나타내었다.
질환 TAA TAA 발현 정상 세포 암 세포가 아닌 정상 세포에 의해 발현되는 항원
AML CD33 줄기 세포 CD34
골수종 BCMA 수지상 세포 CD1c
B-CLL CD160 자연 살해 세포 CD56
전립선암 PSMA 신경 조직 NCAM
장암 A33 정상 장 상피 HLA 클래스 I
복합(compound) 게이트
상기 성분들을 이용하는 동역학적 분리 모델은 복합 게이트가, 예를 들어 2 이상의 표적 항원의 패턴에 대응하여 촉발되는 T 세포를 만들 수 있게 한다. 예를 들어, 3종의 항원이 존재할 때만 (A AND B AND C) 촉발되는 T 세포를 만드는 것이 가능하다. 여기서, 세포는 3종의 CAR을 발현하고, 각각은 항원 A, B, 및 C를 인식한다. 하나의 CAR은 흥분성이고 둘은 억제성이며, 이 각각은 차등적 분리를 일으키는 스페이서 도메인을 갖는다. 오직 모든 3종이 결찰될 때, T 세포가 활성화된다. 추가 예: (A OR B) AND C: 여기서, 항원 A 및 B를 인식하는 CAR은 활성성이고 공국재화하는 스페이서를 가지는 한편, 항원 C를 인식하는 CAR은 억제성이고 상이한 공분리를 일으키는 스페이서를 갖는다. 추가 예(A AND NOT B) AND C: 여기서 항원 A에 대한 CAR은 활성화 엔도도메인을 가지며 조건적으로 억제성인 엔도도메인을 갖는 항원 B에 대한 CAR과 공국재화한다. 항원 C에 대한 CAR은 A 또는 B로부터 차등적으로 분리되는 스페이서를 가지며 억제성이다. 사실, 보다 더 복잡한 불(boolean) 논리가 임의 개수의 CAR 및 스페이서를 갖는 본 발명의 이들 단순 성분들로 프로그래밍될 수 있다.
신호 펩티드
본 발명의 T 세포의 CAR은 신호 펩티드를 포함하여서 CAR이 세포, 예컨대 T 세포 내부에서 발현되면, 발생기 단백질이 세포질 망상구조로 가서 이후 세포 표면으로 가고, 거기서 발현된다.
신호 펩티드의 코어는 단일 알파-헬릭스를 형성하는 경향이 있는 소수성 아미노산의 긴 스트렛치를 함유할 수 있다. 신호 펩티드는 전좌 동안 폴리펩티드의 적절한 토폴로지를 집행하는데 도움이 되는, 짧은 양으로 하전된 아미노산 스트렛치로 시작될 수 있다. 신호 펩티드의 말단에, 전형적으로 신호 펩티다아제가 인식하여 절단시키는 아미노산 스트렛치가 존재한다. 신호 펩티다아제는 전좌의 완료 동안 또는 그 이후에 절단되어서 자유 신호 펩티드 및 성숙한 단백질을 생성시킨다. 자유 신호 펩티드는 이후 특이적 프로테아제에 의해 분해된다.
신호 펩티드는 분자의 아미노 말단에 존재할 수 있다.
신호 펩티드는 서열번호 7, 8, 또는 9 또는 여전히 CAR의 세포 표면 발현을 일으키는 기능을 하는 한 5, 4, 3, 2, 또는 1 아미노산 돌연변이(삽입, 치환 또는 부가)를 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
서열번호 7: MGTSLLCWMALCLLGADHADG
서열번호 7의 신호 펩티드는 조밀하고 고도로 효율적이다. 신호 펩티다아제에 의한 효율적인 제거를 제공하는, 말단 글리신 뒤에 약 95% 절단이 이루어질 것으로 예측된다.
서열번호 8: MSLPVTALLLPLALLLHAARP
서열번호 8의 신호 펩티드는 IgG1에서 유래되었다.
서열번호 9: MAVPTQVLGLLLLWLTDARC
서열번호 9의 신호 펩티드는 CD8로부터 유래되었다.
제1 CAR의 신호 펩티드는 제2 CAR(및 제3 CAR 및 제4 CAR 등)의 신호 펩티드와 상이한 서열을 가질 수 있다.
항원 결합 도메인
항원 결합 도메인은 항원을 인식하는 CAR의 일부분이다. 수많은 항원 결합 도메인이 당분야에 알려져 있는데, 항체의 항원 결합 부위를 기초로 하는 것들, 항원 모방체, 및 T 세포 수용체를 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 단일클론 항체에서 유래된 단쇄 가변 단편(scFv), 표적 항원의 천연 리간드; 표적에 대해 충분한 친화성을 갖는 펩티드; 단일 도메인 항체; 인공 단일 바인더 예컨대 다르핀(디자인된 앵카이린 반복 단백질); 또는 T 세포 수용체 유래 단쇄를 포함할 수 있다.
항원 결합 도메인은 항체의 항원 결합 부위를 기초로 하지 않은 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 종양 세포 표면 수용체에 대한 가용성 리간드(예를 들어 가용성 펩티드 예컨대 사이토카인 또는 케모카인)인 단백질/펩티드를 기초로하는 도메인; 또는 종양 세포 상에서 발현되는 결합 쌍 대응물에 대한 수용체 또는 막 정박된 리간드의 세포외 도메인을 포함할 수 있다.
실시예 11 내지 13은 BCMA에 결합하는 CAR에 대한 것이고, 여기서 항원 결합 도메인은 BCMA에 대한 리간드인, APRIL를 포함할 수 있다.
항원 결합 도메인은 항원의 천연 리간드를 기초로 할 수 있다.
항원 결합 도메인은 조합 라이브러리 유래 친화성 펩티드 또는 새로 디자인된 친화성 단백질/펩티드를 포함할 수 있다.
스페이서 도메인
CAR은 항원 결합 도메인을 경막 도메인과 연결시키고 항원 결합 도메인을 엔도도메인으로부터 공간적으로 분리시키기 위한 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 탄성 스페이서가 항원 결합 도메인을 결합을 촉진시키는 상이한 방향으로 배향되도록 허용한다.
본 발명의 T 세포에서, 제1 및 제2 CAR은 상이한 스페이서 분자를 포함한다. 예를 들어, 스페이서 서열은 예를 들어, IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 인간 CD8 줄기부 또는 마우스 CD8 줄기부를 포함할 수 있다. 스페이서는 대안적으로, IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 CD8 줄기부와 유사한 길이 및/또는 도메인 간격 특성을 갖는 대체 링커를 포함할 수 있다. 인간 IgG1 스페이서는 Fc 결합 모티프를 제거하도록 변경될 수 있다.
이들 스페이스에 대한 아미노산 서열의 예를 아래에 제공한다:
Figure 112016059208634-pct00008
CAR이 전형적으로 동종이량체(도 1a 참조)이므로, 교차-쌍형성은 이종이량체 키메라 항원 수용체를 생성시킬 수 있다. 이는 다양한 이유로 바람직하지 않으며, 예를 들어, (1) 에피토프가 표적 세포 상에서 동일한 "수준"이 아니므로 교차-쌍 형성 CAR은 오직 하나의 항원에 결합할 수 있다; (2) 2종의 상이한 scFv 유래의 VH 및 VL은 교환될 수 있어서 표적을 인식하는 것을 실패하거나 또는 더 나쁘게는 기대치않고 예상치않은 항원을 인식할 수 있다. "OR" 게이트 및 "AND NOT" 게이트의 경우, 제1 CAR의 스페이서는 교차-쌍형성을 피하기 위해서 제2 CAR의 스페이서와 충분히 다르다. 제1 스페이서의 아미노산 서열은 제2 스페이서의 아미노산 수준에서 50%, 40%, 30% 또는 20% 미만의 동일성을 공유할 수 있다.
본 발명의 다른 측면(예를 들어, AND 게이트)에서, 제1 CAR의 스페이서는 상이한 길이, 및/또는 전하 및/또는 형상 및/또는 입체형태 및/또는 글리코실화를 가져서, 제1 및 제2 CAR 둘 모두가 그들의 표적 항원에 결합시, 스페이서 전하 또는 치수의 차이가 동역학적 분리 모델에 의해 예측되는 바와 같이 활성화를 일으키도록 막의 상이한 부분으로 2 유형의 CAR의 공간적 분리를 일으키게 된다. 이들 측면에서, 스페이서의 상이한 길이, 형상 및/또는 입체형태는 동족 표적 인식시 차등 분리가 허용되도록 표적 항원 상의 결합 에피토프 크기를 고려하여 주의깊게 선택한다. 예를 들어, IgG1 힌지, CD8 줄기부, IgG1 Fc, CD34의 엑토도메인, CD45의 엑토도메인이 차등적으로 분리될 것으로 예상된다.
차등적으로 분리시키고 그에 따라서 AND 게이트에 사용하기 적합한 스페이서 쌍의 예를 다음의 표에 도시한다:
Figure 112016059208634-pct00009
본 발명의 다른 측면(예를 들어, AND NOT 게이트)에서, 스페이서가 교차-쌍형성이 방지되도록 충분히 상이해야하지만, 공국재화할 정도로 충분히 유사해야 하는 것이 중요하다. 이종상동성(orthologous) 스페이서 서열의 쌍이 적용될 수 있다. 예로는 뮤린 및 인간 줄기부, 또는 대안적으로 단량체인 스페이서 도메인, 예를 들어 CD2의 엑토도메인이 있다.
공국재화하여서 AND NOT 게이트로 사용하기 적합한 스페이서 쌍의 예를 다음의 표에 나타내었다:
Figure 112016059208634-pct00010
상기 언급한 모든 스페이서 도메인은 동종이량체를 형성한다. 그러나, 그 기전은 동종이량체 수용체를 사용하는 것에 제한되지 않으며 스페이서가 충분히 강건하다면 단량체 수용체로 작용될 수 있다. 이러한 스페이서의 예로는 CD2 또는 절두형 CD22가 있다.
경막 도메인
경막 도메인은 막에 걸쳐진 CAR의 서열이다.
경막 도메인은 막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조일 수 있다. 이는 전형적으로 몇몇 소수성 잔기를 포함하는 알파 헬릭스이다. 임의의 경막 단백질의 경막 도메인은 본 발명의 경막부를 제공하는데 사용될 수 있다. 단백질의 경막 도메인의 존재 및 전장은 TMHMM 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk services TMHMM-2.0/)을 사용해 당분야의 숙련가가 결정할 수 있다. 또한, 단백질의 경막 도메인이 비교적 단순한 구조, 즉 막에 걸치기에 충분한 길이의 소수성 알파 헬릭스를 형성할 것으로 예상되는 폴리펩티드 서열임을 고려하면, 인공적으로 디자인된 TM 도메인도 사용할 수 있다(US 7052906 B1은 합성 경막 성분을 기술함).
경막 도메인은 양호한 수용체 안정성을 제공하는, CD28에서 유래될 수 있다.
활성화 엔도도메인
엔도도메인은 CAR의 신호-전달 부분이다. 항원 인식 후, 수용체 클러스터, 천연 CD45 및 CD148은 시냅스로부터 배제되고 신호를 세포에 전달한다. 가장 일반적으로 사용되는 엔도도메인 성분은 3 ITAM을 함유하는 CD3-제타의 것이다. 이는 항원 결합 후 T 세포에 활성화 신호를 전달한다. CD3-제타는 완전하게 유능한 활성화 신호를 제공하지 않고 추가적인 공자극성 신호전달을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 키메라 CD28 및 OX40은 증식/생존 신호를 전달하기 위해 CD3-제타와 사용되거나, 또는 모든 3종이 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 T 세포가 활성화 엔도도메인을 갖는 CAR을 포함하는 경우, 이는 CD3-제타 엔도도메인 단독, CD3-제타 엔도도메인과 CD28 또는 OX40의 그것 또는 CD28 엔도도메인 및 OX40 및 CD3-제타 엔도도메인을 포함할 수 있다.
ITAM 모티프를 함유하는 임의의 엔도도메인은 본 발명에서 활성화 엔도도메인으로 작용할 수 있다. 몇몇 단백질은 1 이상의 ITAM 모티프를 갖는 엔도도메인을 함유하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질의 예에는 몇가지 예를 들면 CD3 엡실론 사슬, CD3 감마 사슬 및 CD3 델타 사슬 등이 포함된다. ITAM 모티프는 시그니쳐 YxxL/I를 제공하는, 임의의 2종의 다른 아미노산에 의해 류신 또는 이소류신으로부터 떨어져있는 티로신으로 쉽게 인식될 수 있다. 전형적으로, 그러나 항상 그런것은 아니지만, 이들 모티프 중 2은 분자의 꼬리부에서 6 내지 8 아미노산만큼 떨어져있다(YxxL/Ix(6-8)YxxL/I). 따라서, 당분야의 숙련가는 활성화 신호를 전달하는 1 이상의 ITAM을 함유하는 존재하는 단백질을 쉽게 찾을 수 있다. 또한, 모티프가 단숙하고 복잡한 2차 구조가 필요하지 않은 점에서, 당분야의 숙련가는 활성화 신호를 전달하기 위한 인공적 ITAM을 함유하는 폴리펩티드를 디자인할 수 있다(예를 들어, 합성 신호전달 분자에 관한, WO 2000063372를 참조함).
활성화 엔도도메인을 갖는 CAR의 경막 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인(엔도도메인)은 서열번호 15, 16 또는 17로 나타낸 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
Figure 112016059208634-pct00011
변이체 서열은 그 서열이 효과적인 경막 도메인 및 효과적인 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 제공하는한, 서열번호 15, 16 또는 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
" 결찰 - 오프 " 억제성 엔도도메인
AND 게이트에 대해 상기 언급한 실시양태에서, CAR 중 하나는 억제성 엔도도메인을 포함하여서 그 억제성 CAR이 억제성 CAR 결찰 부재시에 활성화 CAR에 의한 T 세포 활성화를 억제시키지만, 억제성 CAR이 결찰된 경우 활성화 CAR에 의한 T 세포 활성화가 유이하게 억제되지 않는다. 이를 "결찰-오프" 억제성 엔도도메인이라고 한다.
이러한 경우에, 억제성 CAR의 스페이서는 활성화 CAR이 스페이서와 길이, 전하, 형상 및/또는 입체형태 및/또는 글리코실화가 상이하여서, 양 수용체가 결찰되면, 스페이서 치수의 차이가 면역학적 시냅스의 상이한 막 구획으로 활성화 CAR 및 억제성 CAR의 고립을 일으켜, 활성화 엔도도메인이 억제성 엔도도메인에 의한 억제로부터 해방된다.
결찰-오프 억제성 CAR에서 사용하기 위한 억제성 엔도도메인은 따라서 동일한 막 구획에 존재시(즉, 억제성 CAR에 대한 항원 부재하에서) 활성화 CAR에 의한 T 세포 신호전달을 억제하지만 억제성 CAR로부터 막의 별개 부분에 고립시에는 T 세포 신호전달을 유의하게 억제하지 않는 임의의 서열을 포함할 수 있다.
결찰-오프 억제성 엔도도메인은 티로신 포스파타아제, 예컨대 수용체-유사 티로신 포스파타아제이거나 또는 그를 포함할 수 있다. 억제성 엔도도메인은 오직 자극성 수용체가 결찰시 TCR 신호전달을 억제할 수 있는 임의의 티로신 포스파타아제이거나 또는 그를 포함할 수 있다. 억제성 엔도도메인은 오직 자극성 수용체가 결찰시 TCR 신호전달을 억제할 수 있는 인산화된 ITAM에 대해 충분히 빠른 촉매 속도의 임의의 티로신 포스파타아제이거나 또는 그를 포함할 수 있다.
예를 들어, AND 게이트의 억제성 엔도도메인은 CD148 또는 CD45의 엔도도메인을 포함할 수 있다. CD148 및 CD45는 TCR 신호전달 상류의 인산화된 티로신에 대해 천연적으로 작용하는 것으로 확인되었다.
CD148은 PLCγ1 및 LAT의 인산화 및 기능을 방해하여 TCR 신호전달을 음성적으로 조절하는 수용체-유사 단백질 티로신 포스파타아제이다.
모든 조혈 세포 상에 존재하는 CD45는 다시 PLCγ1을 인산화시켜서, 신호 전달 및 기능적 반응을 조절할 수 있는 단백질 티로신 포스파타아제이다.
억제성 엔도도메인은 수용체-유사 티로신 포스파타아제의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 포스파타아제는 T 세포 신호전달에 관여하는 성분들, 예컨대 PLCγ1 및/또는 LAT의 인산화 및/또는 기능을 방해할 수 있다.
CD45 및 CD148의 경막 및 엔도도메인을 각각 서열번호 18 및 19로 나타내었다.
Figure 112016059208634-pct00012
억제성 CAR은 서열번호 18 또는 19의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다(예를 들어, 엔도도메인의 포스파타아제 기능을 포함할 수 있음). 변이체가 활성화 CAR에 의한 T 세포 신호전달을 기본적으로 억제할 수 있는 능력을 보유하는 한, 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 이의 일부의 변이체를 포함할 수 있다.
다른 스페이서 및 엔도도메인은 예를 들어 본원에 예시된 모델 시스템을 사용해 시험될 수 있다. 표적 세포 개체군은 양 항원에 대해 음성(야생형), 둘 중 하나에 대해 양성 및 둘 모두에 대해 양성인 세포(예를 들어, CD19-CD33-, CD19+CD33-, CD19-CD33+ 및 CD19+CD33+)를 확립하기 위해 단독으로 또는 이중으로 SupT1 세포주 등과 같은 적합한 세포주를 형질도입시켜 생성시킬 수 있다. 활성화 시에 IL-2를 방출하는 T 세포 예컨대 마우스 T 세포주 BW5147에 CAR 쌍을 형질도입시키고 논리 게이트에서 기능하는 그들 능력을 IL-2 방출 측정을 통해 측정할 수 있다(예를 들어, ELISA에 의함). 예를 들어, CD148 및 CD45 엔도도메인 둘 모두는 CD3 제타 엔도도메인을 함유하는 활성화 CAR과 조합하여 억제성 CAR로서 기능할 수 있음을 실시예 4에 나타내었다. 이들 CAR은 AND 게이팅을 획득하기 위해서 한 CAR 상의 짧은/벌키하지 않은 CD8 줄기부 스페이서 및 다른 CAR 상의 벌키한 Fc 스페이서에 의존한다. 양 수용체가 결찰되면, 스페이서 치수의 차이가 상이한 막 구획으로 상이한 수용체의 고립을 일으켜서, CD148 또는 CD45 엔도도메인에 의한 억제로부터 CD3 제타 수용체를 해방시킨다. 이러한 방식으로, 활성화는 오직 양 수용체가 활성화되면 일어난다. 이러한 모듈 시스템을 사용하여 대안적인 스페이서 쌍 및 억제성 엔도도메인을 시험할 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 스페이서가 양 수용체의 결찰 후 고립이 이루어지지 않으면, 억제가 풀리지 않아서 활성화가 일어나지 않게된다. 시험 하의 억제성 엔도도메인이 비효율적이면, 활성화는 억제성 CAR의 결찰 상태와 무관하게 활성화 CAR의 결찰 존재하에서 예상된다.
" 결찰 -온" 엔도도메인
AND NOT 게이트에 대해 상기 언급한 실시양태에서, CAR 중 하나는 "결찰-온" 억제성 엔도도메인을 포함하여 이 억제성 CAR이 억제성 CAR 결찰 부재시에 활성화 CAR에 의한 T 세포 활성화를 유의하게 억제하지 않지만, 억제성 CAR이 결찰시 활성화 CAR에 의한 T 세포 활성화를 억제한다.
"결찰-온" 억제성 엔도도메인은 오직 자극성 수용체가 결찰되면 TCR 신호전달을 억제할 수 없는 티로신 포스파타아제이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
"결찰-온" 억제성 엔도도메인은 오직 자극성 수용체가 결찰시 TCR 신호전달을 억제할 수 없지만 시냅스에 집중시 TCR 신호전달을 억제할 수 있는 인산화된 ITAM에 대한 충분히 느린 촉매성 속도의 티로신 포스파타아제이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 시냅스에 집중은 억제성 수용체 결찰을 통해 획득된다.
티로신 포스파타아제가 "결찰-온" 억제성 엔도도메인에 대해 너무 빠른 촉매 속도를 가지면, "결찰-온" 억제성 엔도도메인에 대해 적합하도록 점돌연변이 및 짧은 링커(입체 방해를 야기)와 같은 개질을 통해 포스파타아제의 촉매 속도를 느리게 조율하는 것이 가능하다.
이러한 제1 실시양태에서, 엔도도메인은 ITAMS의 유의한 탈인산화가 오직 활성화 및 억제성 엔도도메인이 공국재화시에만 일어나도록, CD45 또는 CD148 보다 상당히 덜 활성적인 포스파타아제이거나 또는 그를 포함할 수 있다. 많은 적합한 서열이 당분야에 알려져 있다. 예를 들면, NOT AND 게이트의 억제성 엔도도메인은 단백질-티로신 포스파타아제 예컨대 PTPN6의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
단백질 티로신 포스파타아제(PTP)는 세포 성장, 분화, 유사분열 주기, 및 발암성 형질전환을 포함한, 다양한 세포 과정을 조절하는 신호전달 분자이다. 이러한 PTP의 N-말단부는 단백질 인산-티로신 결합 도메인으로 작용하고, 이 PTP와 그 기질의 상호작용을 매개하는, 2개의 탠덤 Src 상동성(SH2) 도메인을 함유한다. 이러한 PTP는 주로 조혈 세포에서 발현되고, 조혈 세포에서 다수의 신호전달 경로의 중요한 조절인자로서 기능한다.
억제제 도메인은 PTPN6(서열번호 20)의 전부 또는 단지 포스파타아제 도메인(서열번호 21)을 포함할 수 있다.
Figure 112016059208634-pct00013
결찰-온 억제성 엔도도메인의 제2 실시양태는 ITIM(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition motif) 함유 엔도도메인 예컨대 CD22, LAIR-1, 킬러 억제성 수용체 패밀리(KIR), LILRB1, CTLA4, PD-1, BTLA 등에서 유래한 것들이다. 인산화되면, ITIM은 그 SH2 도메인을 통해 내생성 PTPN6을 동원한다. ITAM 함유 엔도도메인과 공국재화하면, 탈인산화가 일어나고 활성화 CAR이 억제된다.
ITIM은 면역계의 많은 억제성 수용체의 세포질 꼬리부에서 발견되는 보존적 아미노산 서열(S/I/V/LxYxxI/V/L)이다. 당분야의 숙련가는 ITIM을 함유하는 단백질 도 메인을 쉽게 찾을 수 있다. 인간 후보물 ITIM-함유 단백질의 목록은 단백질체-광범위 스캔을 통해 생성시켰다(Staub, et al (2004) Cell. Signal. 16, 435-456). 또한, 공통 서열이 잘 알려져 있고, 2차 구조가 거의 필요하지 않은 것으로 나타나므로, 당분야의 숙련가는 인공 ITIM를 생성시킬 수 있다.
PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 및 KIR3DL3 유래의 ITIM 엔도도메인을 각각 서열번호 22 내지 31에 나타내었다.
Figure 112016059208634-pct00014
Figure 112016059208634-pct00015
결찰-온 억제성 엔도도메인의 제3 실시양태는 융합 단백질과 공발현되는 ITIM 함유 엔도도메인이다. 융합 단백질은 단백질-티로신 포스파타아제의 적어도 일부분 및 수용체-유사 티로신 포스파타아제의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 융합체는 단백질-티로신 포스파타아제 유래의 1 이상의 SH2 도메인을 포함할 수 있다. 융합체는 단백질-티로신 포스파타아제 유래의 1 이상의 SH2 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합체는 PTPN6 SH2 도메인과 CD45 엔도도메인 사이에 또는 PTPN6 SH2 도메인과 CD148 엔도도메인 사이에 존재할 수 있다. 인산화되는 경우, ITIM 도메인은 융합 단백질을 동원하여 고도의 강력한 CD45 또는 CD148 포스파타아제를 활성화 엔도도메인에 가깝게 가져와서 활성화를 차단한다.
융합 단백질의 서열은 서열번호 32 및 33으로 열거한다.
Figure 112016059208634-pct00016
결찰-온 억제성 CAR은 서열번호 20 또는 21의 전부 또는 일부분을 포함할 수 있다. 서열번호 22 내지 31의 전부 또는 일부분을 포함할 수 있다. 서열번호 32 또는 33과 공발현되는 서열번호 22 내지 31의 전부 또는 일부분을 포함할 수 있다. 변이체가 억제성 CAR의 결찰 시 활성화 CAR에 의한 T 세포 신호전달을 억제하는 능력을 보유하는 한, 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 이의 부분의 변이체를 포함할 수 있다.
상기와 같이, 대안적인 스페이서 및 엔도도메인은 예를 들어 본원에 예시된 모델 시스템을 사용해 시험할 수 있다. PTPN6 엔도도메인이 CD3 제타 엔도도메인을 함유하는 활성화 CAR과 조합하여 반억제성 CAR로서 기능할 수 있음을 실시예 5에 나타내었다. 이들 CAR은 하나의 CAR 상의 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 다른 CAR 상의 마우스 CD8 줄기부 스페이서에 의존적이다. 이종상동성 서열이 교차 쌍형성을 방지한다. 그러나, 양 수용체가 결찰되는 경우, 스페이서간 유사성은 동일한 막 구획으로 상이한 수용체의 공분리를 일으킨다. 이는 PTPN6 엔도도메인에 의한 CD3 제타 수용체의 억제를 일으킨다. 오직 활성화 CAR이 결찰되면 PTPN6 엔도도메인은 T 세포 활성화를 방지할만큼 충분히 활성적이지 않다. 이러한 방식으로, 활성화는 활성화 CAR이 결찰되고 억제성 CAR이 결찰되지 않은 경우(AND NOT 게이팅)에만 일어난다. 이러한 모듈 시스템을 사용해 대안적인 스페이서 쌍 및 억제성 도메인을 시험할 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 스페이서가 양 수용체의 결찰 후 공분리되지 않으면, 억제가 효과적이지 않아서 활성화가 일어날 수 있다. 시험 중인 반억제성 엔도도메인이 비효율적이면, 활성화는 반억제성 CAR의 결찰 상태와 무관하게 활성화 CAR의 결찰 존재에서 예상된다.
공발현 부위
본 발명의 제2 측면은 제1 및 제2 CAR을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
핵산은 절단 부위에 의해 연결된 2 CAR 분자를 포함하는 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 절단 부위는 자가 절단성이어서, 폴리펩티드가 생성되면, 임의의 외부 절단 활성 필요없이 즉시 제1 및 제2 CAR로 절단된다.
다양한 자가 절단 부위가 알려져 있는데, 구제역 바이러스(FMDV) 2a 자가 절단 펩티드를 포함하며, 이는 하기 서열번호 34로 나타내었다:
서열번호 34
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP.
공발현 서열은 내부 리보솜 진입 서열(IRES)일 수 있다. 공발현 서열은 내부 프로모터일 수 있다.
세포
본 발명의 제1 측면은 세포 표면에 제1 CAR 및 제2 CAR을 공발현시키는 세포에 관한 것이다.
세포는 면역학적 세포와 같은, 세포 표면에서 CAR을 발현할 수 있는 임의의 진핵생물 세포일 수 있다.
구체적으로, 세포는 면역 이펙터 세포 예컨대 T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포일 수 있다.
T 세포 또는 T 림프구는 세포 매개 면역에서 중심 역할을 하는 림프구 유형이다. 그들은 세포 표면 상에 T-세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 다른 림프구, 예컨대 B 세포 및 자연 살해 세포(NK 세포)와 구별될 수 있다. 이하에 요약한 바와 같이, 다양한 유형의 T 세포가 존재한다.
헬퍼 T 헬퍼 세포(TH 세포)는 혈장 세포 및 기억 B 세포로 B 세포의 성숙화, 및 세포독성 T 세포 및 마크로파지의 활성화를 포함하여, 면역학적 과정의 다른 백혈구를 돕는다. TH 세포는 그들 표면에 CD4를 발현한다. TH 세포는 그들이 항원 제시 세포(APC)의 표면 상에 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원을 제시하는 경우에 활성화된다. 이들 세포는 상이한 유형의 면역 반응을 촉진하도록 상이한 사이토카인을 분비하는, TH1, TH2, TH3, TH17, Th9, 또는 TFH를 포함한, 몇몇 아형 중 하나로 분화될 수 있다.
세포독성 T 세포(TC 세포, 또는 CTL)는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 관여된다. CTL은 그들 표면에서 CD8을 발현한다. 이들 세포는 모든 유핵 세포의 표면에 존재하는, MHC 클래스 I과 연관된 항원에 결합하여 그들 표적을 인식한다. 조절성 T 세포에 의해 분비되는 IL-10, 아데노신 및 다른 분자를 통해서, CD8+ 세포는 자가면역 질환 예컨대 실험적 자가면역 뇌척수염을 방지하는, 아네르기 상태로 불활성화될 수 있다.
기억 T 세포는 감염이 해결된 후 장기간 지속되는 항원-특이적 T 세포의 서브셋이다. 이들은 그들의 동족 항원에 재노출시 대량의 이펙터 T 세포로 신속하게 확장되어서, 과거 감염에 대해 면역계에 "기억"을 제공한다. 기억 T 세포는 3종의 아형: 중심 기억 T 세포(TCM 세포) 및 2 유형의 이펙터 기억 T 세포(TEM 세포 및 TEMRA 세포)를 포함한다. 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있다. 기억 T 세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO을 발현한다.
이전에 억제인자 T 세포로 알려진, 조절성 T 세포(Treg 세포)는 면역학적 내성의 유지에 핵심적이다. 그들의 주요 역할은 면역 반응의 종료를 향해 T 세포 매개 면역성을 정지시키는 것과 흉선에서 음성 선별 과정을 벗어난 자가-반응성 T 세포를 억제하는 것이다.
주요한 2가지 부류의 CD4+ Treg 세포 - 천연 발생 Treg 세포 및 순응성 Treg 세포가 알려져 있다.
천연 발생 Treg 세포(CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포라고도 알려짐)는 흉선에서 발생하고 TSLP로 활성화되는 골수성(CD11c+) 및 플라스마사이토이드(CD123+) 수지상 세포 둘 모두와 발생기 T 세포 간 상호작용과 연관되어 있다.
천연 발생 Treg 세포는 FoxP3이라고 하는 세포내 분자의 존재에 의해 다른 T 세포와 구별할 수 있다. FOXP3 유전자의 돌연변이는 조절성 T 세포 발생을 방지하여서, 태아 자가면역 질환 IPEX을 야기시킨다.
순응성 Treg 세포(Tr1 세포 또는 Th3 세포라고도 함)는 정상 면역 반응 동안에 유래된다.
본 발명의 T 세포는 상기 언급한 임의의 T 세포 유형, 구체적으로 CTL일 수 있다.
자연 살해(NK) 세포는 선천적 면역계의 일부를 형성하는 세포융해 세포 유형이다. NK 세포는 MHC 독립적 방식으로 바이러스 감염된 세포로부터의 선천적 신호에 신속한 반응을 제공한다.
NK 세포(선천적 림프성 세포군에 속함)는 대형 과립 림프구(LGL)로 정의되고, B 및 T 림프구를 생성하는 공통 림프성 전구체에서 분화된 제3 종류의 세포를 구성한다. NK 세포는 이들이 이후 순환계로 진입하는 골수, 림프절, 비장, 편도선 및 흉선에서 분화되고 성숙하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 CAR 세포는 상기 언급한 임의의 세포 유형일 수 있다.
CAR-발현 세포, 예컨대 CAR-발현 T 또는 NK 세포는 환자 자신의 말초혈(제1 당사자)로부터, 또는 도너 말초혈(제2 당사자) 유래 조혈모세포 이식 환경에서, 또는 미관련 도너(제3 당사자) 유래 말초혈에서 생체외 생성시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 CAR 발현 T 세포 및/또는 CAR 발현 NK 세포를 포함하는 세포 조성물을 제공한다. 세포 조성물은 본 발명에 따른 핵산으로 생체외에서 혈액 샘플을 형질도입 또는 형질감염시켜 만들 수 있다.
다르게, CAR-발현 세포는 관련 세포 유형, 예컨대 T 세포로 유도성 전구체 세포 또는 배아 전구체 세포의 생체외 분화로부터 유도시킬 수 있다. 대안적으로 그 용해 기능을 보유하고 치료제로서 작용할 수 있는 불멸화 세포주 예컨대 T 세포주를 사용할 수 있다.
모든 이들 실시양태에서, CAR 세포는 바이러스 벡터에 의한 형질도입, DNA 또는 RNA의 형질감염을 포함한, 많은 수단 중 하나를 통해서 CAR을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 도입시켜 생성시킨다.
본 발명의 CAR T 세포는 피험체 유래의 생체외 T 세포일 수 있다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플 유래일 수 있다. T 세포는 예를 들어 항-CD3 단일클론 항체를 사용한 치료에 의해서, CAR-코딩 핵산을 형질도입시키기 전에 활성화 및/또는 확장될 수 있다.
본 발명의 CAR T 세포는
(i) 상기 열거된 피험체 또는 다른 공급원 유래의 T 세포-함유 샘플의 단리; 및
(ii) 제1 및 제2 CAR을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열(들)로 T 세포를 형질도입 또는 형질감염
에 의해 만들 수 있다.
이후 T 세포는 정제될 수 있으며, 예를 들어 제1 및 제2 CAR의 공발현을 기초로 선별될 수 있다.
핵산 서열
본 발명의 제2 측면은 본 발명의 제1 측면에서 정의한 바와 같이 제1 CAR 및 제2 CAR을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열(들)에 관한 것이다.
핵산 서열은 다음 서열 중 하나, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다:
서열번호 35 OR 게이트
서열번호 36 CD45를 사용하는 AND 게이트
서열번호 37 CD148을 사용하는 AND 게이트
서열번호 38 엔도도메인으로 PTPN6을 사용하는 AND NOT 게이트
서열번호 39 LAIR1 엔도도메인을 사용하는 AND NOT 게이트
서열번호 40 CD148 포스파타아제와 융합된 PTPN6 SH2 및 LAIR1을 사용하는 AND NOT 게이트
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핵산 서열은 서열번호 35, 36, 37, 38, 39 또는 40에 의해 코딩되는 바와 동일한 아미노산 서열을 코딩하지만, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다. 핵산 서열은 서열번호 35, 36, 37, 38, 39 또는 40과 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일성을 가지며, 단, 본 발명의 제1 측면에서 정의한 바와 같은 제1 CAR 및 제2 CAR을 코딩하는 것을 전제로 한다.
벡터
본 발명은 또한 1 이상의 CAR-코딩 핵산 서열(들)을 포함하는 벡터, 또는 벡터의 키트를 제공한다. 이러한 벡터는 제1 및 제2 CAR을 발현하도록 숙주 세포에 핵산 서열(들)을 도입하는데 사용될 수 있다.
벡터는 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포손 기반 벡터 또는 합성 mRNA일 수 있다.
벡터는 T 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 제1 측면에 따른 다수의 CAR-발현 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 약학 조성물은 부가적으로 약학적 허용 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 경우에 따라 1 이상의 추가적인 약학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 제제는 예를 들어, 정맥내 주입용으로 적합한 형태일 수 있다.
치료 방법
본 발명의 T 세포는 표적 세포, 예컨대 암세포를 사멸시킬 수 있다. 표적 세포는 정해진 항원 발현 패턴, 예를 들어 항원 A AND 항원 B의 발현; 항원 A OR 항원 B의 발현; 또는 항원 A AND NOT 항원 B의 발현 또는 이들 게이트의 복합적 반복에 의해 인식가능할 수 있다.
본 발명의 T 세포는 감염, 예컨대 바이러스 감염의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 T 세포는 병원성 면역 반응, 예를 들어 자가면역 질환, 알레르기 및 이식편 대 숙주 거부의 제어에 사용할 수 있다.
본 발명의 T 세포는 암성 질환, 예컨대 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막암, 신장암(신장세포), 백혈병, 폐암, 흑색종, 비호지킨 림프종, 췌장암, 전립선암 및 갑상선암의 치료에 사용될 수 있다.
양호한 선별적 단일 표적의 이용성이 제한적인 고형 종양의 치료에 특히 적합하다.
본 발명의 T 세포는 혀, 입 및 인두의 암을 포함한 구강 및 인두의 암; 식도, 위 및 직결장 암을 포함한 소화계의 암; 간세포 암종 및 담관암종을 포함한 간 및 담관의 암; 기관지암 및 후두의 암을 포함한 호흡계의 암; 골육종을 포함한 뼈 및 관절의 암; 흑색종을 포함한 피부의 암; 유방암; 여성의 자궁, 난소 및 경부 암, 남성의 전립선 및 고환 암을 포함한 생식계의 암; 신장 세포 암종 및 요관 또는 방광의 이행 세포 암종을 포함한 신장관의 암; 신경교종, 다형성 교아세포종 및 수모세포종을 포함한 뇌암; 갑상선암, 부신 암종 및 다발성 내분비 신생물 증후군과 연관된 암을 포함한 내분비계의 암; 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함한 림프종; 다발성 골수종 및 형질세포종; 급성 및 만성, 골수성 또는 림프성, 백혈병; 및 신경아세포종을 포함한 다른 그리고 비특정 부위의 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 T 세포를 사용한 치료는 종종 표준 접근법 사용시 발생되는 종양 세포의 탈출 또는 방출을 방지하는데 도움을 줄 수 있다.
본 발명을 이하 실시예를 통해 더욱 설명하며, 이는 본 발명을 수행하는 당분야의 숙련가 중 한명을 돕기위해 제공하고자 하며 본 발명의 범주를 임의의 방식으로 한정하려는 의도가 아니다.
실시예
실시예 1 - 표적 세포 개체군의 생성
본 발명의 원리를 증명하는 목적을 위해서, 항-CD19 및 항-CD33을 기반으로 하는 수용체를 임의적으로 선택하였다. 레트로바이러스 벡터를 사용하여, CD19 및 CD33을 클로닝하였다. 이들 단백질을 절단하여서 그들이 신호전달 하지 않고 장기간 동안 안정하게 발현될 수 있게 하였다. 다음으로, 이들 벡터를 사용하여 SupT1 세포주를 단일하게 또는 이중으로 형질도입시켜서 양 항원에 대한 음성(야생형), 둘 중 하나에 대해 양성 및 양쪽에 대해 양성인 세포를 확립시켰다. 발현 데이타를 도 3에 나타내었다.
실시예 2 - OR 게이트의 디자인 및 기능
OR 게이트를 구축하기 위해서, CD19 및 CD33을 인식하는 수용체 쌍을 공발현시켰다. 상이한 스페이서를 사용하여 교차-쌍형성을 방지하였다. 양 수용체는 표면 안정성을 개선시키기 위한 CD28 유래의 경막 도메인 및 단순 활성화 신호를 제공하기 위한 CD3 제타 유래의 엔도도메인을 갖는다. 이러한 방식으로, 독립적인 1세대 CAR 쌍을 공발현시켰다. 서열을 공발현시키기 위해 사용된 레트로바이러스 벡터 카세트는 양 수용체의 1:1 공발현이 가능하도록 구제역 2A 자가 절단 펩티드를 이용한다. 카세트 디자인은 도 4에 도시하였고, 단백질 구조는 도 5에 도시하였다. 상동성 영역의 뉴클레오티드 서열은 레트로바이러스 역전사 동안 재조합을 방지하기 위해서 코돈-워블링시켰다.
실시예 3 - OR 게이트의 시험
양 CAR의 발현은 Fc에 융합된 동족 항원으로 염색시켜 T 세포 표면 상에서 시험하였다. 상이한 종의 Fc 도메인(CD19의 경우 마우스 및 CD33의 경우 토끼)을 사용하여, 상이한 형광단으로 접합된 상이한 2차 항체로 염색해 세포 표면 상에서 양 CAR의 공발현을 확인하였다. 이를 도 6에 도시하였다.
기능적 시험을 이후 마우스 T-세포주 BW5147를 사용해 수행하였다. 이 세포주는 활성화 시 IL2를 방출하여 간단한 정량적 판독을 가능케한다. 이들 T-세포를 상기 기술한 인공적 표적 세포의 증가량과 공배양시켰다. T-세포는 ELISA를 통해 측정된 IL2 방출로 도시한 바와 같이, 양 항원을 발현하는 표적 세포에 반응하였다. 두 CAR은 세포 표면 상에서 발현되는 것으로 확인되었고 T-세포는 항원 중 하나 또는 둘 모두에 반응하는 것으로 확인되었다. 이들 데이타를 도 7에 도시하였다.
실시예 4 - AND 게이트의 디자인 및 기능
AND 게이트는 단순 활성화 수용체를 기본적으로 활성을 억제하지만, 그 억제가 수용체 결찰시에는 꺼지는 수용체와 조합한다. 이는 짧은/벌키하지 않은 CD8 줄기부 스페이서 및 CD3 제타 엔도도메인을 갖는 표준 1세대 CAR을 그 엔도도메인이 CD148 또는 CD45 엔도도메인을 함유하는 벌키한 Fc 스페이서를 갖는 제2 수용체와 조합하여 얻었다. 두 수용체가 모두 결찰되면, 스페이서 치수의 차이가 상이한 막 구획으로 상이한 수용체의 고립을 일으켜서, CD148 또는 CD45 엔도도메인에 의한 억제로부터 CD3 제타 수용체를 해방시킨다. 이러한 방식으로, 활성화는 오직 2 수용체 모두가 활성화되는 경우에만 일어난다. CD148 및 CD45는 그들이 천연적으로 이러한 방식으로 기능하므로 이를 위해 선택되었다: 예를 들어, 매우 벌키한 CD45 엑토도메인은 면역학적 시냅스로부터 전체 수용체를 제외시킨다. 발현 카세트는 도 8에 도시하였고 이후 단백질은 도 9에 도시하였다.
상이한 특이성에 대한 표면 염색은 양 수용체 쌍이 도 10에 도시한 바와 같이 세포 표면 상에서 효과적으로 발현될 수 있음을 보여주었다. BW5147에서의 기능은 T 세포가 오직 2 항원 모두 존재 시에만 활성화됨을 보여주었다(도 11).
실시예 5 : AND 게이트의 일반화가능도 검증
관찰결과가 사용된 그들의 바인더 및 CD19/CD33의 일부 특이적 특징의 징후가 아님을 확인하기 위해서, 2종의 표적화 scFv를 교환하여서, 이제, 활성화(ITAM) 신호가 CD19 대신 CD33의 인식시 전달되고, 억제성(CD148) 신호는 CD33 대신, CD19의 인식시 전달되었다. CD45 및 CD148 엔도도메인이 기능적으로 유사한 것으로 간주되므로, 실험은 CD148 엔도도메인을 갖는 AND 게이트에 제한되었다. 이는 여전히 기능적 AND 게이트를 일으켜야 한다. T 세포는 CD19 또는 CD33 단독, 또는 둘 모두를 보유하는 표적으로 도전하는 새로운 논리 게이트를 발현한다. T-세포는 CD10 및 CD33 둘 모두를 발현하는 표적에 반응하지만, 이들 항원 중 오직 하나를 발현하거나 또는 전혀 발현하지 않는 표적에는 반응하지 않았다. 이는 AND 게이트가 여전히 이러한 형태로 기능함을 보여준다(도 18B).
동일한 세포주 상에서, 우리의 AND 게이트를 어떻게 일반화시킬 수 있는지를 확립하고자 하였다: AND 게이트는 상이한 표적에 걸쳐 일반화되어야 한다. 상대적인 항원 밀도, 동족 scFv 결합 동역학 및 scFv 결합 에피토프의 정밀한 거리를 고려하면 게이터의 신뢰성이 덜하거나 또는 보다 클 수 있지만, 광범위한 표적 및 바이터 세트를 사용하여 일부 AND 게이트 징후가 보일 것으로 예상된다. 이를 시험하기 위해서, 3종의 추가적인 AND 게이트를 생성시켰다. 다시, 실험은 AND 게이트의 CD148 버젼으로 제한하였다. 본래 CD148 AND 게이트 유래의 제2 scFv를 항-GD2 scFv huK666(서열번호 41 및 서열번호 42), 또는 항-CD5 scFv(서열번호 43 및 서열번호 44), 또는 항-EGFRvIII scFv MRU(서열번호 45 및 서열번호 46)로 치환하여 다음의 CAR AND 게이트를 생성시켰다: CD19 AND GD2; CD19 AND CD5; CD19 AND EGFRvIII. 다음의 인공적 항원 발현 세포주를 또한 생성시켰다: SupT1, 및 우리의 SupT1.CD19에 GM3 및 GD2 신타아제를 형질도입시켜서 SupT1.GD2 및 SupT1.CD19.GD2를 생성시켰다. SupT1 및 SupT1.CD19에 EGFRvIII을 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 형질도입시켜서 SupT1.EGFRvIII 및 SupT1.CD19.EGFRvIII을 생성시켰다. CD5가 SupT1 세포 상에서 발현되므로, 상이한 세포주를 사용하여 표적 세포를 생성시켰다: CD19 단독, CD5 단독 및 CD5 및 CD19 둘 모두를 함께 발현하는 293T 세포를 생성시켰다. 발현은 유세포측정법으로 확인하였다(도 19). 3종의 신규 CAR AND 게이트를 발현하는 T-세포를 SupT1.CD19 및 개별 동족 이중 양성 및 단일 양성 표적 세포로 공격하였다. 3종 AND 게이트 모두는 단일 양성 표적과 비교하여 이중 양성 세포주에 의한 감소된 활성화를 보여주었다(도 20). 이는 임의적 표적 및 동족 바인더에 대한 AND 게이트 디자인의 일반화가능성을 검증해준다.
실시예 6 : CAR AND 게이트의 동역학적 분리 모델의 실험적 증거
목적은 상이한 스페이서에 의해 야기되는 차등적 분리가 이들 논리 CAR 게이트를 생성시키는 능력 이면의 중심 기전임을 증명하는 것이다. 이 모델은 오직 활성화 CAR이 결찰되면, 강력한 억제성 '결찰 오프' 유형 CAR이 용해성으로 막에 존재하고 활성화 CAR을 억제할 수 있다. 양 CAR이 결찰되면, 두 CAR 스페이서가 충분히 다른 경우, 그들은 시냅스 내에서 분리되어 공국재화하지 않는다. 따라서, 핵심 요건은 스페이서가 충분히 다른 것이다. 모델이 올바르면, 양 스페이서가 충분히 유사한 경우라면 그들이 2 수용체가 결찰시 공국재화하여, 게이트가 기능 수행에 실패하게 된다. 이를 시험하기 위해서, 본래 CAR의 "벌키" Fc 스페이서를 마우스 CD8 스페이서로 치환시켰다. 이는 인간 CD8과 길이, 벌크 및 전하가 유사하지만 그래서 교차-쌍형성을 하지않을 것으로 예상되었다. 따라서, 새로운 게이트는 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 활성화 엔도도메인을 갖는 제1 CAR을 가지며, 한편, 제2 CAR은 CD33을 인식하고, 마우스 CD8 줄기부 스페이서 및 CD148 엔도도메인(도 18C)을 갖는다. T-세포를 형질도입시켜서 이러한 새로운 CAR 게이트를 발현시켰다. 이들 T 세포를 이어서 CD19 단독, CD33 단독 또는 CD19와 CD33을 함께 발현하는 SupT1 세포로 공격시켰다. T-세포는 본래 AND 게이트처럼 어떠한 항원을 단독으로 발현하는 SupT1 세포에 반응하지 않았다. 그러나, CAR T-세포는 2 항원 모두를 발현하는 SupT1 세포에 대한 반응에 실패하여, 모델이 확증되었다(도 18C). 기능적 AND 게이트는 면역학적 시냅스 내에 공국재화하지 않도록 두 CAR이 충분히 상이한 스페이서를 가질것을 요구한다(도 23A 및 B).
실시예 7 - AND NOT 게이트의 디자인 및 기능
포스파타아제 예컨대 CD45 및 CD148은 너무 강력해서 면역학적 시냅스로 소량이 들어가도 ITAM 활성화를 억제할 수 있다. 이는 논리 AND 게이트 억제의 기초이다. 다른 부류의 포스파타아제 예를 들어 PTPN6 및 관련 포스파타아제는 그만큼 강력하지 않다. 확산에 의한 소량의 PTPN6의 시냅스 진입은 활성화를 억제하지 않을 것으로 예상되었다. 또한, 억제성 CAR이 활성화 CAR과 충분히 유사한 스페이서를 가지면, 2 CAR이 결찰되는 경우 시냅스내에 공국재화할 것으로 예상되었다. 이러한 경우, 2 항원이 존재시 활성화로부터 ITAMS를 중지시키는데 대량의 억제성 엔도도메인이 충분하다. 이러한 방식으로 AND NOT 게이트를 생성시킬 수 있다.
NOT AND 게이트의 경우, 2차 신호는 활성화를 "거부(veto)"하는데 필요하다. 이는 억제성 신호를 면역학적 시냅스로 보내서, 예를 들어 PTPN6과 같은 효소의 포스파타아제로 보내서 일어난다. 따라서 본 발명자는 다음과 같은 초기 AND NOT 게이트를 생성시켰다; 2종의 CAR이 공발현되어서 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 활성화 엔도도메인을 가지며, PTPN6의 촉매 도메인을 포함하는 엔도도메인 및 마우스 CD8 줄기부 스페이서를 갖는 항-CD33 CAR과 공발현된다(서열번호 38, 도 13A와 B). 적합한 카세트를 도 12에 나타내었고 예비 기능 데이타는 도 14에 도시하였다.
또한, 대안적인 전략을 AND NOT 게이트를 생성시키기 위해 개발하였다. 면역티로시나아제 억제성 모티프(ITIM)는 ITAMS와 유사한 방식으로 활성화되며, 즉 그들은 클러스터링 및 포스파타아제 배지시 lck에 의해 인산화된다.
ZAP70 결합에 의한 활성화 촉발대신, 인산화된 ITIM은 그들의 동족 SH2 도메인을 통해 PTPN6과 같은 포스파타아제를 동원한다. ITIM은 활성화 및 억제성 CAR 상의 스페이서가 공국재화할 수 있는 한, 억제성 엔도도메인으로서 기능할 수 있다. 이러한 구축물을 생성시키기 위해서, AND NOT 게이트를 다음과 같이 생성시켰다: 2 CAR을 공발현시키며, 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 활성화 엔도도메인을 가지며, 공발현되는 항-CD33 CAR은 마우스 CD8 줄기부 스페이서 및 LAIR1에서 유래된 ITIM 함유 엔도도메인을 갖는다(서열번호 39, 도 13A와 C).
추가의, 보다 복잡한 AND NOT 게이트를 또한 개발하여서, ITIM이 추가적인 키메라 단백질: PTPN6의 SH2 도메인과 CD148의 엔도도메인의 세포내 융합체의 존재에 의해 강화된다. 이러한 디자인에서는 3종의 단백질이 발현되는데, 제1 단백질은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 활성화 엔도도메인을 가지며, 공발현되는 항-CD33 CAR은 마우스 CD8 줄기부 스페이서 및 LAIR1에서 유래된 ITIM 함유 엔도도메인을 갖는다. 추가의 2A 펩티드는 PTPN6-CD148 융합체의 공발현을 가능케한다(서열번호 40, 도 13A 및 D). 이들 AND NOT 게이트는 상이한 억제 범위를 가질 것으로 예상되었다: PTPN6-CD148 > PTPN6 > > ITIM.
T-세포에 이들 게이트를 형질도입시키고, CD19 또는 CD33 단독, 또는 CD19와 CD33 둘 모두를 함께 발현하는 표적으로 공격하였다. 모든 3 게이트는 오직 CD19만을 발현하는 표적에만 반응하였고, CD19와 CD33 둘 모두를 함께 발현하는 표적에는 반응하지 않아서(도 21), 모든 3종의 AND NOT 게이트가 기능적임을 확인하였다.
실시예 8 : PTPN6 기반 AND NOT 게이트의 동역학적 분리 모델의 실험적 증거.
AND NOT 게이트의 모델은 양 CAR에 사용되는 스페이서의 성질이 게이트의 올바른 기능에 중추적이라는 사실에 중점을 둔다. PTPN6을 갖는 기능적 AND NOT 게이트에서, CAR 스페이서 둘 모두는 두 CAR이 결찰시, 둘 모두가 시냅스에 공국재화하여 고농도라서 약한 PTPN6이더라도 활성화를 억제하는데 충분하도록 상당히 유사하다. 스페이서가 상이하면, 시냅스에서의 분리는 ITAM으로부터 PTPN6을 고립시켜서 활성화가 AND NOT 게이트를 파괴하게 허용한다. 이를 시험하기 위해서, 뮤린 CD8 줄기부 스페이서를 Fc의 그것으로 치환시킨 대조군을 생성시켰다. 이 경우, 시험 게이트는 2종의 CAR로 이루어지는데 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 ITAM 엔도도메인을 가지는 한편, 제2 CAR은 CD33을 인식하고, Fc 스페이서 및 PTPN6 유래의 포스파타아제를 포함하는 엔도도메인을 갖는다. 이 게이트는 CD19에 대응하여 활성화되지만, 또한 CD19와 CD33에 함께 반응하여 활성화된다(도 22B에서, 이 게이트의 기능을 본래 AND NOT 게이트, 및 실시예 6에 기술한 대조군 AND 게이트 변이체와 비교하였음). 이 실험 데이타는 PTPN6을 갖는 기능적 AND NOT 게이트의 경우, 공국재화하는 스페이서가 필요한 모델임을 입증하였다.
실시예 9 : ITIM 기반 AND NOT 게이트의 동역학적 분리 모델의 실험적 증거.
PTPN6 기반 AND NOT 게이트와 유사하게, ITIM 기반 게이트는 또한 AND NOT 게이트로 기능하기 위해서 면역학적 시냅스 내에 공국재화를 필요로한다. 이러한 가설을 입증하기 위해서, 대조군 ITIM 기반 게이트를 다음과 같이 생성시켰다: 2 CAR을 공발현시키는데, 제1 CAR은 CD19를 인식하고, 인간 CD8 줄기부 스페이서 및 활성화 엔도도메인을 가지며, 공발현되는 항-CD33 CAR은 Fc 스페이서 및 LAIR1 유래 ITIM 엔도도메인을 갖는다. 이 게이트의 활성은 본래 ITIM 기반 AND NOT 게이트와 비교하였다. 이 경우에, 개질된 게이트는 CD19 발현 표적에 대응하여 활성화되었고, 또한 CD19와 CD33 둘 다를 발현하는 세포에 대응하여 활성화되었다. 이들 데이타는 ITIM 기반 AND NOT 게이트가 동역학적 분리 모델을 따르며 기능적 게이트를 생성시키기 위해서는 올바른 스페이서가 선택되어야 함을 시사한다(도 23B).
실시예 10 : 동역학적 분리에 의해 생성된 CAR 논리 게이트 모델의 요약
동역학적-분리 모델의 최근 이해 및 본원에 기술한 실험 데이타를 기초로, 2-CAR 게이트 모델에 대한 요약을 도 24에 제시한다. 이 도면은 각각 상이한 항원을 인식하는 2 CAR을 발현하는 세포를 도시한다. CAR 중 하나 또는 둘 모두가 세포 상의 표적 항원을 인식하면, 시냅스가 형성되고 천연 CD45 및 CD148은 그들 엑토도메인의 벌크함 때문에 시냅스로부터 배제된다. 이는 T 세포 활성화를 위한 단계를 설정한다. 표적 세포가 오직 동족 항원만을 보유하는 경우에, 동족 CAR이 결찰되고 동족 CAR은 시냅스로 분리된다. 미결찰된 CAR은 T 세포막 상에서 용해 상태로 남고 시냅스 안과 밖으로 확산되어서 미결찰 CAR의 농도가 낮고 결찰된 CAR의 국소 고농도 영역이 형성된다. 이 경우에, 결찰된 CAR이 ITAM을 가지고 미결찰된 CAR이 CD148과 같이 '결찰 오프' 유형의 억제성 엔도도메인을 가지면, 미결찰 CAR의 양은 활성화를 억제시키기에 충분하고 게이트가 오프된다. 대조적으로, 결찰된 CAR이 ITAM을 가지고 미결찰된 CAR이 PTPN6과 같은 '결찰 온' 유형의 억제성 엔도도메인을 가지는 경우, 미결찰된 CAR의 양은 억제에 불충분하여 게이트가 온된다. 동족 항원 둘 모두를 보유하는 표적 세포에 의한 공격시, 2 동족 CAR이 결찰되고 면역학적 시냅스의 일부가 형성된다. 중요한 것은, CAR 스페이서가 충분히 유사하면, CAR은 시냅스에 공국재화하지만 CAR 스페이서가 충분히 상이하면 CAR은 시냅스 내에서 분리된다. 후자의 경우, 막 영역이 형성되는 한 CAR의 고농도가 존재하지만 다른 CAR은 부재하게 된다. 이 경우에 분리가 완벽하므로, 억제성 도메인이 '결찰 오프' 유형이더라도, 게이트가 온된다. 전자의 경우, 막 영역은 CAR 둘 모두의 고농도가 함께 혼합되면서 형성된다. 이 경우, 엔도도메인 둘 모두가 집중되므로, 억제성 엔도도메인이 '결찰 온' 유형이더라도, 게이트가 오프된다. 스페이서 및 엔도도메인의 올바른 조합을 선택함으로써, CAR T 세포에 논리가 프로그래밍될 수 있다.
상기 본 발명자의 작업을 기반으로, 본 발명자는 논리 게이팅된 CAR 생성을 가능케하는 일련의 디자인 규칙을 수립하였다(도 31에 예시함). "항원 A OR 항원 B" 게이팅된 CAR T 세포를 생성하기 위해서, 항-A 및 항-B CAR은 (1) 각 CAR은 그 CAR이 기능하도록 간단히 항원 접근 및 시냅스 형성을 허용하는 스페이서를 가지며, (2) 각 CAR은 활성화 엔도도메인을 갖도록 생성되어야 한다. "항원 A AND NOT B" 게이팅된 CAR T-세포를 생성하기 위해서, 항-A 및 항-B CAR은 (1) CAR 둘 모두가 교차-쌍형성하지 않지만, 표적 세포 상에서 동족 항원 둘 모두의 인식시 CAR이 공분리되게하는 스페이서를 가지며, (2) 한 CAR은 활성화 엔도도메인을 갖고, 다른 CAR은 약한 포스파타아제(예를 들어, PTPN6)를 포함하거나 또는 동원하는 엔도도메인을 갖도록 생성되어야 한다. (3) "항원 A AND 항원 B" 게이팅된 CAR T 세포를 생성시키기 위해서, 항-A 및 항-B CAR은 (1) 하나의 CAR이 다른 CAR과 충분히 상이한 스페이서를 가져서 CAR 둘 모두가 표적 세포 상에서 동족 항원 둘 모두의 인식시 공분리되지 않고, (2) 하나의 CAR은 활성화 엔도도메인을 가지는 한편, 다른 CAR은 강력한 포스파타아제(예를 들어, CD45 또는 CD148의 그것)를 포함하는 엔도도메인을 갖도록 생성되어야 한다. 바람직한 효과를 달성하기 위해 올바른 스페이서는 표적 항원의 크기/형상 등(예를 들어, 도 30 참조) 및 표적 항원 상의 동족 에피토프의 위치를 고려할 뿐만 아니라 기지의 크기/형상 등을 갖는 스페이서 세트에서 선택할 수 있다.
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실시예 11 : APRIL 기반 CAR의 디자인 및 구축
그 천연 형태의 APRIL은 분비형 II형 단백질이다. CAR에 대한 BCMA 결합 도메인으로서 APRIL의 사용은 이러한 II형 분비 단백질의 I형 막결합 단백질로의 전환을 필요로하고 이러한 단백질이 안정하고 그 형태로 BCMA와의 결합성을 보유해야 한다. 후보 분자를 생성하기 위해서, APRIL의 아미노 말단의 최극단을 절단하여 프로테오글리칸과의 결합성을 제거하였다. 다음으로, 신호 펩티드를 부가하여, 발생기 단백질이 세포질 망상구조를 향하고 그에 따라 세포 표면으로 가게 하였다. 또한, 사용된 스페이서의 성질이 CAR의 기능을 변경시킬 수 있기 때문에, 3종의 상이한 스페이서 도메인을 시험하였다: (i) Fc 결합 모티프를 제거하도록 변경된 인간 IgG1 스페이서; (ii) CD8 줄기부; 및 (iii) IgG1 힌지 단독(도 25의 만화도 및 도 26의 아미노산 서열)을 포함하는 APRIL 기반 CAR을 생성시켰다. 이들 CAR은 이중시스트론 레트로바이러스 벡터(도 27A)에서 발현시켜서 마커 단백질 - 절두된 CD34가 편리한 마커 유전자로서 공발현되게 하였다.
실시예 12 : APRIL 기반 CAR의 발현 및 기능
이 실험의 목적은 구축된 APRIL 기반 CAR이 세포 표면 상에서 발현되는지 여부와 APRIL이 천연 단백질을 형성하도록 폴딩되는지 여부를 시험하는 것이다. T-세포에 이들 상이한 CAR 구축물을 형질도입하고 마커 유전자에 대한 염색과 함께, 시판되는 항-APRIL mAb를 사용해 염색하고, 유세포측정으로 분석하였다. 이 실험의 결과를 도 27B에 나타내었는데 여기서 APRIL 결합은 마크 유전자 형광발광에 대해 그래프화하였다. 이들 결과는 이 형태에서, APRIL 기반 CAR이 세포 표면 상에서 발현되고 APRIL은 항-APRIL mAb에 의해 인식되기에 충분히 폴딩됨을 보여주었다.
다음으로, 이 형태의 APRIL이 BCMA 및 TACI를 인식할 수 있는지 여부를 확인하였다. 재조합 BCMA 및 TACI는 마우스 IgG2a-Fc와의 융합체로 생성시켰다. 이들 재조합 단백질을 형질도입된 T 세포와 인큐베이트시켰다. 그 후에, 이 세포들을 세척하고, 항-마우스 형광단 접합된 항체 및 상이한 형광단에 접합된 마커 유전자 검출용 항체로 염색하였다. 세포를 유세포측정법으로 분석하고 결과를 도 27C에 나타내었다. 상이한 CAR은 BCMA 및 TACI 둘 모두에 결합할 수 있었다. 놀랍게도, CAR은 TACI 보다 BCMA에 더 양호하게 결합할 수 있었다. 또한, 놀라운 것은 CD8 줄기부 또는 IgG1 힌지 스페이서를 갖는 CAR이 Fc 스페이서를 갖는 CAR 보다 BCMA 및 TACI에 더 잘 결합할 수 있었다.
실시예 13 : APRIL 기반 키메라 항원 수용체는 BCMA 발현 세포에 대해 활성이다
정상 도너 유래의 T 세포에 상이한 APRIL CAR을 형질도입시키고 야생형, 또는 BCMA 및 TACI를 발현하도록 조작된 SupT1 세포에 대해 시험하였다. 몇몇 상이한 어세이를 사용해 기능을 확인하였다. 고전적인 크롬 방출 어세이를 수행하였다. 여기서 표적 세포(SupT1 세포)를 51Cr로 표지화하고 상이한 비율로 이펙터(형질도입된 T 세포)와 혼합하였다. 표적 세포의 용해는 공배양 상등액 중 51Cr을 계측하여 확인하였다(도 28A는 누적 데이타를 도시함).
또한, 1:1로 SupT1 세포와 배양한 T 세포 유래 상등액을 인터페론-감마에 대해 ELISA를 통해 분석하였다(도 28B는 누적 데이타를 도시함). SupT1 세포와 공배양 1주일 후 T 세포 증식 측정을 또한 수행하였다(도 28C). T-세포는 계측 비드로 보정된 유세포측정법에 의해 계측하였다. 이들 실험 데이타는 APRIL 기반 CAR이 BCMA 발현 표적을 사멸시킬 수 있음을 보여주었다. 또한, 이들 데이타는 CD8 줄기부 또는 IgG1 힌지 기반 CAR이 Fc-pvaa 기반 CAR 보다 양호하게 수행되었음을 보여주었다.
실시예 14 : 초대 세포에서 AND 게이트의 기능적 분석
PBMC를 혈액으로부터 단리하고 PHA 및 IL-2를 사용해 자극시켰다. 2일 후 테트라넥틴 코팅된 플레이트 상에서 세포에 CD19:CD33 AND 게이트 구축물 함유 레트로 바이러스를 형질도입시켰다. 5일에, AND 게이트 구축물에 의해 번역된 CAR 둘 다의 발현도를 유세포측정법을 통해 평가하고 세포는 CD56+ 세포를 고갈시켰다(주로 NK 세포). 6일에 PBMC는 1:2 이펙터 대 표적 세포 비율로 표적 세포와 공배양물에 위치시켰다. 8일에, 상등액을 모으로 ELISA를 통해 IFN-감마 분비를 분석하였다(도 29).
이들 데이타는 AND 게이트가 초대 세포에서 기능함을 입증한다.
상기 명세서에서 언급한 모든 출판물은 참조하여 본원에 편입된다. 본 발명의 기술된 방법 및 체계의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범주 및 사조를 벗어나지 않으면서 당분야의 숙련가에게 자명하다. 비록 본 발명을 특정 바람직한 실시양태에 관하여 설명하였지만, 청구한 본 발명은 이러한 특정 실시양태에 과도하게 한정되어서는 안됨을 이해해야 한다. 게다가, 분자 생물학, 세포 생물학 또는 관련 분야의 숙련가들에게 자명한 본 발명의 실시를 위해 설명한 모드의 다양한 변형을 이하 청구항의 범주에 포함시키고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> UCL Business PLC <120> T Cell <130> P103294PCT1 <150> GB 1410934.2 <151> 2014-06-19 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric antigen receptor (CAR) <400> 1 Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 50 55 60 Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly 100 105 110 Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 115 120 125 Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 145 150 155 160 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caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 2580 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 2640 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 2700 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc aaccggagaa caactacaag 2760 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 2820 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggccctg 2880 cacaatcact atacccagaa atctctgagt ctgagcccag gcaagaagga ccccaaggcg 2940 gtttttggct gtatctttgg tgccctggtt attgtgactg tgggaggctt catcttctgg 3000 agaaagaaga ggaaagatgc aaagaataat gaagtgtcct tttctcaaat taaacctaaa 3060 aaatctaagt taatcagagt ggagaatttt gaggcctact tcaagaagca gcaagctgac 3120 tccaactgtg ggttcgcaga ggaatacgaa gatctgaagc ttgttggaat tagtcaacct 3180 aaatatgcag cagaactggc tgagaataga ggaaagaatc gctataataa tgttctgccc 3240 tatgatattt cccgtgtcaa actttcggtc cagacccatt caacggatga ctacatcaat 3300 gccaactaca tgcctggcta ccactccaag aaagatttta ttgccacaca aggaccttta 3360 ccgaacactt tgaaagattt ttggcgtatg gtttgggaga aaaatgtata tgccatcatt 3420 atgttgacta aatgtgttga acagggaaga accaaatgtg aggagtattg gccctccaag 3480 caggctcagg actatggaga cataactgtg gcaatgacat cagaaattgt tcttccggaa 3540 tggaccatca gagatttcac agtgaaaaat atccagacaa gtgagagtca ccctctgaga 3600 cagttccatt tcacctcctg gccagaccac ggtgttcccg acaccactga cctgctcatc 3660 aacttccggt acctcgttcg tgactacatg aagcagagtc ctcccgaatc gccgattctg 3720 gtgcattgca gtgctggggt cggaaggacg ggcactttca ttgccattga tcgtctcatc 3780 taccagatag agaatgagaa caccgtggat gtgtatggga ttgtgtatga ccttcgaatg 3840 cataggcctt taatggtgca gacagaggac cagtatgttt tcctcaatca gtgtgttttg 3900 gatattgtca gatcccagaa agactcaaaa gtagatctta tctaccagaa cacaactgca 3960 atgacaatct atgaaaacct tgcgcccgtg accacatttg gaaagaccaa tggttacatc 4020 gcctaa 4026 <210> 45 <211> 1342 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single-chain variable fragment (scFv) SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aEGFRvIII-HCH2CH3pvaa-dCD148 <400> 45 Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu 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agccgagaag gaagaaccct 1200 caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1260 gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1320 acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgcctcc tcgcagagcc 1380 gagggcaggg gaagtcttct aacatgcggg gacgtggagg aaaatcccgg gcccatggag 1440 accgacaccc tgctgctgtg ggtgctgctg ctgtgggtgc ccggcagcac cggccaggtg 1500 aagctgcagc agagcggcgg aggcctggtg aagcccggcg ccagcctgaa gctgagctgc 1560 gtgaccagcg gcttcacctt ccggaagttc ggcatgagct gggtgcggca gaccagcgac 1620 aagcggctgg agtgggtggc cagcatcagc accggcggct acaacaccta ctacagcgac 1680 aacgtgaagg gccggttcac catcagccgg gagaacgcca agaacaccct gtacctgcag 1740 atgagcagcc tgaagagcga ggacaccgcc ctgtactact gcacccgggg ctacagcagc 1800 accagctacg ctatggacta ctggggccag ggcaccaccg tgacagtgag cagcggcgga 1860 ggaggcagtg gtgggggtgg atctggcgga ggtggcagcg acatcgagct gacccagagc 1920 cccgccagcc tgagcgtggc caccggcgag aaggtgacca tccggtgcat gaccagcacc 1980 gacatcgacg acgacatgaa ctggtaccag cagaagcccg 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gtcctcccga atcgccgatt 3720 ctggtgcatt gcagtgctgg ggtcggaagg acgggcactt tcattgccat tgatcgtctc 3780 atctaccaga tagagaatga gaacaccgtg gatgtgtatg ggattgtgta tgaccttcga 3840 atgcataggc ctttaatggt gcagacagag gaccagtatg ttttcctcaa tcagtgtgtt 3900 ttggatattg tcagatccca gaaagactca aaagtagatc ttatctacca gaacacaact 3960 gcaatgacaa tctatgaaaa ccttgcgccc gtgaccacat ttggaaagac caatggttac 4020 atcgcctaa 4029 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa may be Ser, Ile, Val or Leu <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be Ile, Val or Leu <400> 47 Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 48 <211> 1114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of a AND NOT gate (16076.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-muCD8STK-tm-dPTP N6) <400> 48 Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 50 55 60 Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly 100 105 110 Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 115 120 125 Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly 165 170 175 Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg 180 185 190 Lys Gly Leu Glu Trp 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Val Val Gly Gly Val 180 185 190 Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp 195 200 205 Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met 210 215 220 Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala 225 230 235 240 Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro 245 250 255 Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile 260 265 270 Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val 275 280 285 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 290 295 300 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 305 310 315 320 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 325 330 335 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 340 345 350 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 355 360 365 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 370 375 380 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 385 390 395 <210> 53 <211> 614 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APRIL-based (A proliferation-inducing ligand-based) CAR, APRIL Fc-pvaa based CAR <400> 53 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser 20 25 30 Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg 35 40 45 Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp 50 55 60 Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr 65 70 75 80 Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala 100 105 110 Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp 115 120 125 Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser 130 135 140 Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Ser Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 165 170 175 Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 180 185 190 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 195 200 205 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 210 215 220 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 225 230 235 240 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 245 250 255 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 260 265 270 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 275 280 285 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 290 295 300 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 305 310 315 320 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 325 330 335 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 340 345 350 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 355 360 365 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 370 375 380 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp 385 390 395 400 Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 405 410 415 Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 420 425 430 Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 435 440 445 Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 450 455 460 Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His 485 490 495 Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 500 505 510 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 515 520 525 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 530 535 540 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 545 550 555 560 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 565 570 575 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 580 585 590 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 595 600 605 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 610

Claims (26)

  1. 세포 표면에서 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR을 공발현하는 T 세포로서, 각각의 CAR은
    (i) 항원 결합 도메인;
    (ii) 스페이서;
    (iii) 경막 도메인; 및
    (iv) 엔도도메인
    을 포함하고,
    제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고,
    제1 및 제2 CAR 둘 모두가 그들의 표적 항원에 결합시, 스페이서 치수의 차이가 막의 상이한 부분으로 활성화 CAR 및 억제성 CAR의 공간적 분리를 일으키도록 제1 CAR의 스페이서가 제2 CAR의 스페이서와 상이하며,
    제1 또는 제2 CAR 중 하나는 활성화 엔도도메인을 포함하는 활성화 CAR이고, 다른 하나의 CAR은 결찰-오프(ligation-off) 억제성 엔도도메인을 포함하는 억제성 CAR이며,
    결찰-오프 억제성 엔도도메인은 CD148 또는 CD45 티로신 포스파타아제 도메인을 포함하는 것인 T 세포.
  2. 제1항에 있어서, 제1 스페이서 또는 제2 스페이서 중 어느 하나는 CD8 줄기부를 포함하고 다른 하나의 스페이서는 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 T 세포.
  3. 제1항에 있어서, 제1 CAR의 항원 결합 도메인은 CD5에 결합하고 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하는 것인 T 세포.
  4. 세포 표면에서 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR을 공발현하는 자연 살해(NK) 세포로서, 각각의 CAR은
    (i) 항원 결합 도메인;
    (ii) 스페이서;
    (iii) 경막 도메인; 및
    (iv) 엔도도메인
    을 포함하고,
    제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고,
    제1 및 제2 CAR 둘 모두가 그들의 표적 항원에 결합시, 스페이서 치수의 차이가 막의 상이한 부분으로 활성화 CAR 및 억제성 CAR의 공간적 분리를 일으키도록 제1 CAR의 스페이서가 제2 CAR의 스페이서와 상이하며,
    제1 또는 제2 CAR 중 하나는 활성화 엔도도메인을 포함하는 활성화 CAR이고, 다른 하나의 CAR은 결찰-오프(ligation-off) 억제성 엔도도메인을 포함하는 억제성 CAR이며,
    결찰-오프 억제성 엔도도메인은 CD148 또는 CD45 티로신 포스파타아제 도메인을 포함하는 것인 NK 세포.
  5. 제4항에 있어서, 제1 스페이서 또는 제2 스페이서 중 어느 하나는 CD8 줄기부를 포함하고 다른 하나의 스페이서는 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 NK 세포.
  6. 제4항에 있어서, 제1 CAR의 항원 결합 도메인은 CD5에 결합하고 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하는 것인 NK 세포.
  7. 제1항에 정의된 바와 같은 제1 및 제2 키메라 항원 수용체(CAR) 둘 모두를 코딩하는 핵산 분자.
  8. 제7항에 있어서, 핵산 분자가 다음의 구조:
    AgB1-스페이서1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-스페이서2-TM2-endo2
    를 가지며, 여기서,
    AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;
    TM1은 제1 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    endo1은 제1 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    coexpr은 CAR 둘 모두의 공발현을 가능하게 하는 핵산 서열이고;
    AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;
    TM2는 제2 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    endo2는 제2 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이며,
    핵산 분자는, T 세포에서 발현시, 제1 및 제2 CAR이 T 세포 표면에서 공발현되도록 절단 부위에서 절단되는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, coexpr은 자가 절단 펩티드를 포함하는 서열을 코딩하는 것인 핵산 분자.
  10. 제8항에 있어서, 상동성 재조합을 피하기 위해 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 서열의 영역에서 대체 코돈이 사용되는 것인 핵산 분자.
  11. (i) 제1항에 정의된 바와 같은 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제1 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자가 다음의 구조:
    AgB1-스페이서1-TM1-endo1
    을 가지며, 여기서 AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이며; TM1은 제1 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo1은 제1 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열인 제1 핵산 분자; 및
    (ii) 제1항에 정의된 바와 같은 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자가 다음의 구조:
    AgB2-스페이서2-TM2-endo2
    를 가지며, 여기서 AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; 스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이며; TM2는 제2 CAR의 경막 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고; endo2는 제2 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열인 제2 핵산 분자
    를 포함하는 키트.
  12. 제11항에 정의된 바와 같은 제1 핵산 분자를 포함하는 제1 벡터; 및 제11항에 정의된 바와 같은 제1 핵산 분자를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 키트.
  13. 제7항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터 또는 트랜스포손인 벡터.
  15. 제7항에 따른 핵산 분자; 제11항에 정의된 바와 같은 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자; 제12항에 정의된 바와 같은 제1 벡터 및 제2 벡터; 또는 제13항에 따른 벡터를 단리된 T 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 T 세포를 제조하는 방법.
  16. 제7항에 따른 핵산 분자; 제11항에 정의된 바와 같은 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자; 제12항에 정의된 바와 같은 제1 벡터 및 제2 벡터; 또는 제13항에 따른 벡터를 단리된 NK 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 제4항에 따른 NK 세포를 제조하는 방법.
  17. 제1항에 따른 복수의 T 세포를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  18. 제4항에 따른 복수의 NK 세포를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
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