BR112019020001A2 - linhagens celulares estimuladoras para expansão ex vivo e ativação de células exterminadoras naturais - Google Patents
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Abstract
a presente invenção se refere a populações de células geneticamente modificadas derivadas de células imortalizadas/cancerígenas que não expressam moléculas mhc de classe i, mas que são modificadas para expressar il-15 ligada à membrana, ligante 4-1 bbl ligado à membrana, e pelo menos uma outra molécula ligada à membrana, como uma interleucina ou um anticorpo anti-cd3. a co-cultura das células mencionadas com uma população de células imunes resulta na ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes. populações expandidas de células nk derivadas da co-cultura de uma cultura de células mistas com linhagens de células estimuladoras podem ser usadas em métodos de tratamento de câncer ou doenças infecciosas. em uma modalidade separada, uma pluralidade de ácidos nucleicos para uso na preparação de população de células modificadas são fornecidos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: LINHAGENS CELULARES ESTIMULADORAS PARA EXPANSÃO EX VIVO E ATIVAÇÃO DE CÉLULAS EXTERMINADORAS NATURAIS
PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA No. 62/477.311, depositado em 27 de março de 2017, cuja totalidade é incorporada por referência neste documento.
ANTECEDENTES [002] A emergência e persistência de muitas doenças são caracterizadas por uma resposta imune insuficiente a células aberrantes, incluindo células malignas e infectadas por vírus. A imunoterapia é o uso e a manipulação do sistema imunológico do paciente para o tratamento de várias doenças.
SUMÁRIO [003] A imunoterapia apresenta um novo avanço tecnológico no tratamento de doença, em que as células imunes são modificadas para expressar certas moléculas direcionadoras e/ou efetoras que identificam e reagem especificamente às células doentes ou danificadas. Isso representa um avanço promissor devido, pelo menos em parte, ao potencial de direcionar especificamente células doentes ou danificadas, em oposição a abordagens mais tradicionais, como a quimioterapia, onde todas as células são impactadas, e o resultado desejado é que células saudáveis suficientes
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2/65 sobrevivam para permitir que o paciente viva. As abordagens de imunoterapia que empregam a transferência adotiva de células Exterminadoras Naturais (NK) para pacientes estão atualmente em desenvolvimento. No entanto, esses tratamentos requerem um grande número de células NK puras ex vivo adequadas para manipulação genética e aplicações clínicas. Métodos e composições (e usos dos mesmos) são aqui divulgados para a expansão e ativação ex vivo de células NK a partir de uma cultura celular mista.
[004] Uma variedade de tipos de células modificadas, construtos de DNA e métodos para expandir e ativar células NK são aqui fornecidos. Por exemplo, em várias modalidades, é fornecida uma população de células geneticamente modificada que não expressa moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) I, em que a co-cultura da referida população de células modificadas com uma população de células imunes resulta na ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes. Em várias modalidades, a população de células modificadas é derivada de uma linhagem celular que é imortal. Por exemplo, uma linhagem celular que exibe uma ou mais características de uma célula imortal enquanto em cultura. Em várias modalidades, a população de células modificadas é derivada de uma linhagem celular que é naturalmente imortal (por exemplo, linhagens de células tronco). Em várias
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3/65 modalidades, a população de células modificadas é derivada de uma linhagem imortalizada (por exemplo, células cancerígenas). Em algumas modalidades, a população de células modificadas é derivada de células que foram imortalizadas por engenharia (por exemplo, modificadas geneticamente para alterar a expressão da telomerase). Em algumas modalidades, a população de células modificadas é derivada de uma célula cancerígena. Em várias modalidades, a população de células modificadas é modificada para expressar um ou mais fatores ligados à membrana que facilitam e/ou melhoram a ativação e/ou expansão das células NK. Por exemplo, em várias modalidades, as células modificadas expressam interleucina-15 ligada à membrana (mbIL15). Em modalidades ainda adicionais, a população de células modificadas é modificada para expressar o ligante 4-1BB ligado à membrana (4-1BBL), além de ou no lugar de mbIL15. Em outras modalidades, a população de células modificadas é modificada para expressar pelo menos uma interleucina ligada à membrana adicional que estimula a ativação de células imunes, além de ou no lugar de mbIL15, 4-1BBL e/ou outros fatores de ativação/expansão.
[005] Em algumas modalidades, a população de células modificadas compreende pelo menos uma primeira pluralidade de células que expressa mbIL15 e uma segunda pluralidade de células que expressa 4-1BBL, de modo que a
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4/65 população como um todo expressa mbIL15 e 4-1BBL. Em outras modalidades, a população de células modificadas compreende uma pluralidade de células que expressam mbIL15 e 4-1BBL. Em ainda outras modalidades, a população de células modificadas compreende algumas células que expressam mbIL15, algumas células que expressam 4-1BBL e algumas células que expressam ambas. Em algumas modalidades, outros ligantes e/ou fatores de ativação podem ser adicionalmente expressados em adição a ou em vez de mbIL15 e/ou 4-1BBL.
[006] Em várias modalidades, a mbIL15 expressada pela população de células modificadas é codificado por uma sequência de ácido nucleico que compreende a SEQ ID NO. 1. Em várias modalidades, o 4-1BBL expressado pela população de células modificadas é codificado por uma sequência de ácido nucleico que compreende a SEQ ID NO. 13.
[007] Dependendo da modalidade, cada uma das moléculas ligadas à membrana é acoplada a um domínio transmembranar. Em várias modalidades, o domínio transmembranar da CD8a humana é usado para ligar as moléculas à membrana. Em várias modalidades, o domínio transmembranar da CD8a humana compreende a sequência da SEQ ID NO. 18. Outros domínios transmembranares também são usados, dependendo da modalidade, por exemplo, outros domínios receptores ou de sinalização (opcionalmente truncados)
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5/65 conhecidos por residirem em ou através de uma membrana celular podem ser usados.
[008] Em várias modalidades, a população de células modificadas é derivada de uma linhagem celular selecionada a partir do grupo que consiste em células K562, linhagem celular de tumor de Wilms HFWT, linhagem celular de tumor endometrial HHUA, linhagem celular de melanoma HMV-II, linhagem celular de hepatoblastoma HuH-6, linhagens celulares de carcinoma de células pequenas do pulmão Lu-130 ou Lu-134-A, linhagens de células de neuroblastoma NB19 ou NB69, linhagem de células de carcinoma de testículo embrionário NEC14, linhagem de células de carcinoma cervical TCO-2 e linhagem de células de neuroblastoma TNB1. Em várias modalidades, a população geral é derivada de duas ou mais das linhagens celulares acima (ou outras) e combinada para produzir uma população de células que permite a ativação/expansão inesperadamente aprimorada de células imunes, como células NK.
[009] Em várias modalidades, a população de células modificadas não possui expressão de moléculas de MHC II. Em várias modalidades, a população de células modificadas é derivada de células K562.
[0010] Dependendo da modalidade, uma população de células modificadas como aqui divulgada expressa uma ou mais moléculas de interleucina. Em várias modalidades, a
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6/65 interleucina compreende IL12A, ou um fragmento do mesmo. Em várias modalidades, a IL12A compreende a sequência da SEQ ID NO. 4 (ou fragmento da mesma). Em uma modalidade, a interleucina compreende IL12B, ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade, o IL12B compreende a sequência da SEQ ID NO. 6 (ou fragmento da mesma). Em várias modalidades, a interleucina compreende IL12A e IL12B, ou fragmentos dos mesmos. Em tais modalidades, a IL12A e IL12B podem ser orientados no polinucleotídeo em uma orientação A-B, B-A, AB-A-B, A-B-B-A, B-A-A-B em repetições duplicadas, triplicadas ou maiores.
[0011] Em várias modalidades, a população de células modificadas expressa ainda IL18 ligado à membrana (mbIL18), ou fragmento do mesmo. Em várias modalidades, a IL18 compreende a sequência da SEQ ID NO. 8. Em ainda outras modalidades, a população de células modificadas expressa ainda IL21 ligada à membrana (mbIL21), ou fragmento da mesma. Em uma modalidade, a IL21 compreende a sequência da SEQ ID NO. 10, ou um fragmento da mesma.
[0012] Em várias modalidades, as células expressam IL22 ligado à membrana (mbIL22), ou fragmento do mesmo. Em uma modalidade, a IL22 compreende a sequência da SEQ ID NO. 12, ou um fragmento da mesma. Como discutido acima, as combinações de várias interleucinas podem ser expressas, em uma variedade de combinações, repetições, tripletos etc. Em
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7/65 várias modalidades, esses padrões repetidos de expressão nos polinucleotídeos produzem ativação e/ou expansão inesperadamente aprimoradas das células NK.
[0013] Em várias modalidades, as células modificadas podem compreender ainda um anticorpo anti-CD3 ligado à membrana (mba-CD3), um fragmento de anticorpo ou scFv. Em uma modalidade, o mba-CD3 é um anticorpo monoclonal. Em várias dessas modalidades, o mba-CD3 tem como alvo um epítopo dentro da sequência de ácido nucleico do CD3 épsilon da SEQ ID NO. 15. Em modalidades adicionais, o mba-CD3 é um scFv. Em uma modalidade, o scFv compreende a sequência da SEQ ID NO. 17.
[0014] Também são fornecidos neste documento, como discutido em mais detalhes abaixo, métodos para expandir células imunes, os métodos compreendendo a co-cultura de uma amostra de sangue compreendendo células imunes com qualquer uma das populações de células modificadas aqui divulgadas. Em várias modalidades, as células imunes são células Exterminadoras Naturais (NK).
[0015] De acordo com várias modalidades, é fornecida uma população de células geneticamente modificadas derivada de uma célula cancerígena, em que a população de células modificadas é modificada para expressar um, dois ou mais de: interleucina-15 ligada à membrana (mbIL15), ligante 4-1BB ligado à membrana (4-1BBL) e pelo menos uma interleucina
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8/65 ligada à membrana adicional que estimula a ativação de células imunes e em que a co-cultura da população de células modificadas com uma população de células imunes resulta na ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes. Em várias modalidades, a população de células geneticamente modificadas não expressa moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) I.
[0016] Também prevista em várias modalidades é uma população de células geneticamente modificadas que não expressa moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) I, a população de células modificadas sendo derivada de uma célula cancerígena, a população de células modificadas sendo modificada para expressar mbIL15, 4- 1BBL, um anticorpo anti-CD3 ligado à membrana (mba-CD3) que estimula a ativação de células imunes e em que a co-cultura da população de células modificadas com uma população de células imunes resulta na ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes.
[0017] Em várias modalidades, as células modificadas são modificadas para expressar uma interleucina ligada à membrana adicional que compreende IL12A, ou um fragmento da mesma. Em uma modalidade, a IL12A ligada à membrana compreende a sequência da SEQ ID NO. 4. Em uma modalidade, a IL12A ligada à membrana tem a sequência da SEQ ID NO. 4. Em várias modalidades, a interleucina ligada à membrana
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9/65 adicional compreende IL12B, ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade, a IL12B ligada à membrana compreende a sequência da SEQ ID NO. 6. Em uma modalidade, a IL12B ligada à membrana tem a sequência da SEQ ID NO. 6. Em várias modalidades, a interleucina ligada à membrana adicional compreende IL12A ligada à membrana e IL12B ligada à membrana ou fragmentos dos mesmos. Além disso, qualquer uma dessas modalidades de células modificadas pode compreender ainda a expressão da IL18 ligada à membrana (mbIL18), ou um fragmento da mesma. Em uma modalidade, a IL18 ligada à membrana compreende a sequência da SEQ ID NO. 8. Em uma modalidade, a IL18 ligada à membrana tem a sequência da SEQ ID NO. 8.
[0018] Em modalidades ainda adicionais, as células modificadas expressam IL21 ligada à membrana (mbIL21), ou um fragmento do mesmo. Em várias modalidades, a IL21 ligada à membrana tem a sequência da SEQ ID NO. 10, ou um fragmento da mesma. Ou em combinação com IL21, ou isoladamente, várias modalidades fornecem células modificadas que expressam IL22 ligada à membrana (mbIL22), ou um fragmento do mesmo. Em várias modalidades, a IL22 ligada à membrana tem a sequência da SEQ ID NO. 12, ou um fragmento da mesma.
[0019] Além disso, várias modalidades fornecem células modificadas que expressam um anticorpo anti-CD3 ligado à membrana (mba-CD3), um fragmento de anticorpo ou um construto variável de fragmento de cadeia única (scFv). Em
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10/65 uma modalidade, o mba-CD3 é um anticorpo monoclonal. Em várias modalidades, o mba-CD3 tem como alvo um epítopo dentro da sequência de ácido nucleico da porção CD3 de um receptor de célula T. Por exemplo, em uma modalidade, uma ou mais subunidades delta, épsilon ou gama do receptor CD3 são direcionadas pelo anticorpo anti-CD3 ligado à membrana. Em uma modalidade, a subunidade épsilon do receptor CD3 da SEQ ID NO. 15 é direcionado pelo anticorpo ligado à membrana expressado nas células modificadas. Em várias modalidades, o mba-CD3 é um scFv. Em uma modalidade, o scFv compreende,
| consiste essencialmente em ou | consiste na | sequência | da | SEQ | ||
| ID | NO. 17. | Em uma modalidade, | o scFv tem a | sequência | da | SEQ |
| ID | NO. 17. | |||||
| [0020] | 1 Além disso, | em várias | modalidades, | é |
fornecida uma célula estimuladora que é projetada para expressar a subunidade alfa do receptor de IL15 com uma alta afinidade por IL15, permitindo que ela envolva e apresente IL15 solúvel na superfície da célula. Também podem ser utilizadas combinações de qualquer uma das interleucinas ou anticorpos adicionais, dependendo da modalidade, para permitir essencialmente a engenharia modular de uma célula estimuladora que fornece expansão e ativação inesperadamente superiores de células NK.
[0021] Em várias modalidades, a população de células modificadas é derivada de uma linhagem celular, incluindo,
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11/65 mas não se limitando às seguintes: células K562, linhagem celular tumoral de Wilms HFWT), linhagem celular tumoral endometrial HHUA, linhagem celular de melanoma HMV-II, linhagem celular de hepatoblastoma HuH-6, linhagens celulares de carcinoma de células pequenas do pulmão Lu-130 ou Lu-134-A, linhagens celulares de neuroblastoma NB19 ou NB69, linhagem celular de carcinoma de testículo embrionário NEC14, linhagem celular de carcinoma cervical TCO-2 e linhagem celular de neuroblastoma TNB1. Em várias modalidades, as células modificadas não têm expressão de moléculas do MHC II. Em várias modalidades, as células modificadas são derivadas de células K562.
[0022] Dependendo da modalidade, a molécula ligada à membrana é conferida com a capacidade de se ligar à superfície da célula ao ser acoplada a um domínio transmembranar. O termo transmembrana deve receber seu significado comum e deve se referir a pelo menos uma porção de um polipeptídeo (por exemplo, domínio) que é incorporado em uma membrana celular. Em modalidades adicionais, pelo menos uma das moléculas ligadas à membrana pode ser acoplada a um único domínio transmembranar. Além disso, em várias modalidades, vários tipos ou várias cópias das moléculas ligadas à membrana podem ser acopladas a um domínio transmembranar. Além disso, em várias modalidades, vários tipos ou várias cópias de domínios transmembranares podem
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12/65 ser acoplados às moléculas ligadas à membrana. Em várias modalidades, a molécula ligada à membrana é acoplada a um domínio transmembranar da CD8a humana. Em várias modalidades, o domínio transmembranar da CD8a humana compreende a sequência da SEQ ID NO. 18. Em várias modalidades, o domínio transmembranar da CD8a humana tem a sequência da SEQ ID NO. 18. Em várias modalidades, a mbIL15 é codificada pelo ácido nucleico da SEQ ID NO. 1. Em várias modalidades, o mb4-lBBL é codificado pelo ácido nucleico da SEQ ID NO. 13. Em várias modalidades, a mbIL15 é codificada por uma sequência de ácido nucleico que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência da SEQ ID NO. 1. Em várias modalidades, o mb4-lBBL é codificado por uma sequência de ácido nucleico que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência da SEQ ID NO. 13.
[0023] Em várias modalidades, as populações de células modificadas previstas neste documento são adequadas para a expansão e/ou ativação de células imunes. A expansão de células, conforme aqui utilizado, recebe seu significado comum e se refere ao aumento no número de um tipo de célula característico, ou tipos de células, de uma população inicial de células, que pode ou não ser idêntica. As células iniciais usadas para expansão não precisam ser iguais às células geradas a partir da expansão. Por exemplo, as células expandidas podem ser produzidas pelo crescimento e
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13/65 diferenciação da população inicial de células modificadas. A ativação de células imunes, como aqui utilizado, se refere à capacidade das células imunes de responder e exibir, em um nível mensurável, uma função imune da célula correspondente conhecida por um especialista na técnica. Os métodos para medir a atividade das células imunes também são conhecidos por um especialista na técnica. Células imunes, conforme usados aqui, recebe seu significado comum e inclui quaisquer as células do sistema imunológico que podem ser analisadas, incluindo, entre outros, linfócitos B, também chamados de células B, linfócitos T, também chamados de células T, células exterminadoras naturais (NK), células exterminadoras ativadas por linfocinas (LAK), monócitos, macrófagos, neutrófilos, granulócitos, mastócitos, plaquetas, células de Langerhans, células tronco, células dendríticas, células mononucleares do sangue periférico, células infiltrativas de tumores (TIL), células imunes modificadas por genes, incluindo hibridomas, células imunes modificadas por drogas, e derivados, precursores ou progenitores dos tipos de células acima. Em várias modalidades, as células imunes expandidas e/ou ativadas são células NK. Conforme usado aqui, o termo Células Exterminadoras Naturais (células NK) recebe seu significado comum e se refere a um tipo de linfócito citotóxico do sistema imunológico que fornece respostas
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14/65 rápidas a células infectadas por virus e responde a células transformadas. Normalmente, as células imunes detectam peptídeos de patógenos apresentados pelas moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) na superfície das células infectadas, desencadeando a liberação de citocinas, causando lise ou apoptose. As células NK são únicas, no entanto, pois têm a capacidade de reconhecer células estressadas, independentemente da presença de peptídeos de patógenos nas moléculas do MHC. Em alguns aspectos, a célula NK é uma célula NK de mamífero. Exemplos de mamífero ou mamíferos incluem primatas (por exemplo, humanos), caninos, felinos, roedores, suínos, ruminantes e similares. Exemplos específicos incluem seres humanos, cães, gatos, cavalos, vacas, ovelhas, cabras, coelhos, porquinhos da índia, ratos e camundongos. Em um aspecto particular, a célula NK de mamífero é uma célula NK humana.
[0024] Em várias modalidades, a expansão e/ou ativação compreende co-cultivar uma amostra de sangue, tal como uma amostra de sangue periférico, compreendendo células NK com uma das populações de células modificadas previstas neste documento.
[0025] Em várias modalidades, as populações de células modificadas previstas neste documento podem ser preparadas por um método que compreende a transdução das células com um primeiro construto que codifica mbIL15,
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15/65 gerando assim uma primeira população de células transduzidas, expandindo a primeira população de células transduzidas, transduzindo a primeira população transduzida de células com um segundo construto que codifica 4-1BBL, gerando assim uma segunda população transduzida de células, transduzindo a segunda população transduzida de células com um terceiro construto que codifica pelo menos uma molécula adicional capaz de estimular células imunes, gerando assim uma terceira população transduzida de células e expansão da terceira população transduzida de células. Em várias modalidades, as populações de células modificadas previstas neste documento podem ser preparadas pela transdução simultânea de uma população de células com um primeiro construto que codifica mbIL15, um segundo construto que codifica 4-1BBL e um terceiro construto que codifica pelo menos uma molécula adicional capaz de estimular as células imunes. Em modalidades ainda adicionais, as populações de células modificadas previstas neste documento podem ser preparadas através da transdução de uma população de células com um único construto que codifica mbIL15, 4-1BBL e pelo menos uma molécula adicional capaz de estimular células imunes.
[0026] Além disso, em várias modalidades, as populações de células modificadas podem ser preparadas por um método que compreende a transdução das células com um
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16/65 construto que codifica mbIL15, 4-1BB e um ou mais mbIL12A,
| mbIL12B, mbIL18, mbIL21, | mbIL22 e | mba- | - CD3 ou fragmentos dos | ||
| mesmos. | |||||
| [0027] | Também | é | fornecida | uma | pluralidade de ácidos |
| nucleicos, | para uso | na | geração | de | populações de células |
modificadas aqui divulgadas, compreendendo pelo menos 3 do grupo de ácidos nucleicos compreendendo um ácido nucleico que codifica mbIL15, um ácido nucleico que codifica 4-1BBL, um ácido nucleico que codifica mbIL12A, um ácido nucleico que codifica mbIL12B, um ácido nucleico que codifica mbIL18, um ácido nucleico que codifica mbIL21, um ácido nucleico que codifica mbIL22 e um ácido nucleico que codifica mba-CD3. Em várias modalidades, a pluralidade de ácidos nucleicos é opcionalmente configurada como um único construto (por exemplo, codificada ou operacionalmente ligada). Em várias modalidades, a pluralidade de ácidos nucleicos é configurada como parte de mais de um construto. Em várias modalidades, a mbIL15 é codificada pela SEQ ID NO. 1. Em várias modalidades, o 4-1BBL é codificado pela SEQ ID NO. 13. Em várias modalidades, o mbIL12A é codificado pela SEQ ID NO. 3. Em várias modalidades, o mbIL12B é codificado pela SEQ ID NO. 5. Em várias modalidades, o mbIL18 é codificado pela SEQ ID NO. 7. Em várias modalidades, o mbIL21 é codificado pela SEQ ID NO. 9 ou um fragmento do mesmo. Em várias modalidades, o mbIL22 é codificado pela SEQ ID NO. 11 ou um fragmento do
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17/65 mesmo. Em várias modalidades, o mba-CD3 é codificado pela SEQ ID NO. 16. Dependendo da modalidade, um ou mais dentre a pluralidade de ácidos nucléicos compreende opcionalmente uma marcação, como uma marcação FLAG, uma marcação HIS, GFP ou outras marcações e/ou marcadores conhecidos por um especialista na técnica.
[0028] Também é aqui fornecido, em várias modalidades, um método para expandir células NK, compreendendo a obtenção de uma amostra de sangue periférico compreendendo uma população mista de células imunes compreendendo células NK e células T, colocando em contato com a população mista de células com uma população de células modificadas que exibe expressão reduzida de MHC I e foi modificada para expressar interleucina-15 ligada à membrana (mbIL15), ligante 4-1BB (4-1BBL) e pelo menos uma molécula adicional que estimula a ativação de células imunes e cocultivando a população mista de células com as células modificadas por um período de tempo suficiente para expandir as células NK da população mista. Em várias modalidades, o método opcionalmente compreende adicionar IL2 ao meio usado na co-cultura. Em várias modalidades, o método opcionalmente compreende ainda remover células T da população mista antes ou depois da co-cultura. Os métodos para remover e/ou separar células T de uma população mista de células imunes
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18/65 compreendendo células NK e células T são bem conhecidos na técnica relevante.
[0029] Em uma modalidade, é fornecida uma linhagem celular modificada compreendendo células de leucemia mieloide K562 que não possuem as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade I que são geneticamente modificadas para expressar interleucina-15 ligada à membrana, ligante 4-1BB e anti-CD3 ligado à membrana. Os termos geneticamente modificados e geneticamente manipulados devem receber seu significado comum, devem ser usados de forma intercambiável e devem se referir ao uso da biotecnologia para manipular um ou mais aspectos de pelo menos uma parte do genoma de um organismo.
[0030] Em uma modalidade, é fornecida uma linhagem celular modificada compreendendo células de leucemia mieloide K562 que não possuem as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade I que são geneticamente modificadas para expressar interleucina-15 ligada à membrana, ligante 4-1BB ligado à membrana e pelo menos uma membrana adicional interleucina. Em várias modalidades, a pelo menos uma interleucina ligada à membrana adicional é uma ou mais de interleucina-12, interleucina-18 e uma combinação de interleucina-12 e interleucina-18. Em várias modalidades, as células modificadas compreendem ainda um anticorpo anti-CD3 ligado à membrana. Combinações dessas
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19/65 moléculas de sinalização adicionais ligadas à membrana são usadas em várias modalidades. Conforme usados aqui, o termo moléculas de sinalização deve ter seu significado comum e incluir, mas não se limitar a interleucinas, CD3, 4-1BB, etc.
[0031] Em uma modalidade, é fornecida uma linhagem celular modificada compreendendo células de leucemia mieloide K562 que não possuem as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade I que são geneticamente modificadas para expressar interleucina-15, ligante 4-1BB ligado à membrana, anticorpo anti-CD3 ligado à membrana e pelo menos uma interleucina ligada à membrana adicional.
[0032] Também é aqui fornecida uma população de células NK expandidas e/ou ativadas cultivando uma cultura celular mista compreendendo células NK e linfócitos T com qualquer uma das linhagens celulares modificadas aqui divulgadas. Essa população de células NK pode ser usada para o tratamento de câncer ou doença infecciosa e/ou na preparação de um medicamento para esse tratamento. As populações de células modificadas divulgadas neste documento são adequadas para uso na ativação de células NK, tais células NK ativadas para uso no tratamento de câncer ou doença infecciosa.
[0033] Métodos para o tratamento de doenças usando células NK expandidas e/ou ativadas também são fornecidos
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20/65 neste documento. Por exemplo, em várias modalidades, é fornecido um método de tratamento de câncer ou uma doença infecciosa, compreendendo a administração a um indivíduo com câncer (por exemplo, um tumor, seja sólido ou suspensão) ou uma doença infecciosa uma composição compreendendo uma população expandida de células imunes, as células imunes tendo sido expandidas co-cultivando as células imunes com uma população de células modificadas que foi modificada para expressar a interleucina-15 ligada à membrana (mbIL15) e o ligante 4-1BB (4-1BBL) e foi modificada para expressar pelo menos uma interleucina ligada à membrana adicional que estimula a ativação de células imunes. Em várias modalidades, a co-cultura resulta na ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes, e em que pelo menos uma subpopulação de células imunes é administrada ao indivíduo. Em várias modalidades, a população de células modificadas é derivada de uma célula cancerígena, por exemplo, uma linhagem celular imortalizada. Em várias modalidades, a subpopulação administrada de células imunes compreende células NK.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0034] As descrições das figuras abaixo estão relacionadas a experimentos e resultados que representam modalidades não limitativas das invenções aqui divulgadas.
[0035] As Figuras 1A-1G representam exemplos não limitativos de células modificadas para uso na expansão de
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21/65 células imunes de acordo com várias modalidades aqui divulgadas. Construtos são fornecidos em que uma célula K562 (como um exemplo) expressa um ligante para 4-1BB (4-1BBL) e IL15 ligada à membrana (mbIL15) em conjunto com outras citocinas, tal como IL12A/12B ligado à membrana (mbIL12A/12B; Figura IA) , IL18 ligado à membrana (mbIL18; Figura 1B) ou combinações dos mesmos (Figura 1C). Também são fornecidos construtos nos quais as células (usando K562 como exemplo) co-expressam 4-1BBL e mbIL15 em conjunto com combinações de citocinas (tal como mbIL12A/12B e/ou mbIL18, Figuras 1D-1F) e anticorpos (por exemplo, ligados à membrana anti-CD3 (mbantiCD3, Figura 1G)).
[0036] As Figuras 2A-2F representam medições de citometria de fluxo de expressão de vários genes por K562, de acordo com várias modalidades aqui divulgadas. A Figura 2A representa a expressão de mbIL15, a Figura 2B representa a expressão de 4-1BBL, a Figura 2C representa a expressão de mbIL18, a Figura 2D representa a expressão de mbIL12A, a Figura 2E representa a expressão de mbIL12B e a Figura 2F representa a expressão de mb-anti-CD3.
[0037] As Figuras 3A-3B representam dados relacionados à expansão de células NK por vários construtos K562 de acordo com várias modalidades aqui divulgadas. A Figura 3A mostra dados relacionados à porcentagem de células NK recuperadas após 7 dias de cultura (com IL-2) com várias
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22/65 linhagens de células K562, relativas ao número de células mononucleadas do sangue periférico inicialmente semeadas. A Figura 3B mostra dados relacionados à porcentagem de células NK recuperadas após 7 dias de cultura com várias linhagens de células K562, em relação ao número de PBMCs inicialmente semeadas (valor P calculado pelo teste t emparelhado).
[0038] As Figuras 4A-4F representam dados relacionados à expansão e função de longo prazo de células NK estimuladas com várias células K562 geneticamente modificadas. A Figura 4A mostra dados relacionados à expansão das células NK ao longo do tempo quando co-cultivadas com a variante K562 indicada. Os PBMCs foram co-cultivados com células K562 irradiadas que expressam mbIL15 e 4-1BBL (K562mbl5-41BBL) (Figura 4A) ou com células K562-mbl5-41BBL também expressando mbIL12 (+ mbl2) (Figura 4B), mbIL18 (+ mbl8) (Figura 4C) ou mbIL12 e mbIL18 (+ mb12 + mbl8) (Figura 4D) . A Figura 4E representa dados relacionados à citotoxicidade de células NK expandidas contra células K562 nas relações efetor: alvo (E: T) indicadas. A Figura 4F se refere à citotoxicidade de células NK expandidas contra células K562 nas razões E: T indicadas. São mostradas as médias (± DP) das experiências em triplicado. O valor p foi calculado pelo teste t pareado.
DESCRIÇÃO DETALHADA
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23/65 [0039] O surgimento e persistência de células aberrantes (incluindo células malignas e infectadas por vírus) subjacentes a muitas doenças são possibilitadas por uma resposta imune insuficiente às referidas células aberrantes. Um objetivo da imunoterapia é iniciar ou aumentar a resposta do sistema imunológico do paciente, por exemplo, para aumentar a capacidade das células imunes, como as células Exterminadoras Naturais (NK), de danificar, matar ou inibir células danificadas ou doentes. A transferência adotiva de células imunes modificadas para expressar certas moléculas direcionadoras e/ou efetoras que identificam e reagem especificamente às células doentes ou danificadas é uma abordagem de imunoterapia particularmente promissora. Uma variação dessa abordagem envolve a administração de células T modificadas para expressar receptores quiméricos aos pacientes, a fim de obter reconhecimento e destruição direcionados das células aberrantes de interesse. No entanto, uma desvantagem dessa abordagem é que ela pode favorecer o uso de células autólogas (ou células doadoras compatíveis com MHC) para impedir a indução de doença do enxerto contra hospedeiro no paciente. Além disso, a recuperação e o uso de células T autólogas de pacientes com câncer apresentam vários problemas potencialmente adversos. As células NK, no entanto, são vantajosas, pois podem ser empregues células halogênicas autólogas ou derivadas de
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24/65 doadores, de acordo com várias modalidades aqui divulgadas. Um desafio associado à imunoterapia baseada em células NK é obter quantidades suficientemente grandes e suficientemente puras (por exemplo, livres de outros tipos de células) de células NK para manipulação e infusão genética, pois as células NK representam uma pequena fração do total de células em uma população de células imunes.
[0040] Assim, permanece a necessidade de maior expansão das células NK para uso em imunoterapia baseada em células NK. Como tal, em várias modalidades, são fornecidas populações de células NK expandidas e ativadas derivadas da co-cultura das linhagens celulares modificadas aqui divulgadas com uma população inicial de células imunes. Em várias modalidades, a população inicial de células imunes compreende células NK e células T. Em várias modalidades, também é fornecido um método para expandir preferencialmente células NK em uma cultura celular mista compreendendo células NK e células T, que compreende co-cultivar a referida cultura celular mista com as linhagens celulares modificadas aqui divulgadas. Dependendo da modalidade, a expansão preferencial inclui, mas não está limitada a, duas vezes, três vezes, 5 vezes, 10 vezes ou mais, expansão de células NK em comparação com outras células imunes. Em modalidades adicionais, expansão preferencial se refere à expansão de células NK que é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca
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25/65 de 30%, cerca de 50% ou mais do que a expansão de outro tipo de célula imune. Também são fornecidos, em várias modalidades, métodos de utilização de qualquer uma das linhagens celulares modificadas divulgadas aqui para expandir células NK em uma cultura celular mista compreendendo células NK e células T.
Células para uso na expansão de células imunes [0041] Em várias modalidades, as linhagens celulares são usadas em uma co-cultura com uma população de células imunes que devem ser expandidas. Essas linhagens de células são aqui referidas como células estimuladoras, que também podem ser chamadas de células alimentadoras. Em várias modalidades, a população inteira de células imunes deve ser expandida, enquanto em várias modalidades, uma subpopulação de células imunes selecionada é preferencialmente expandida. Por exemplo, em várias modalidades, as células NK são preferencialmente expandidas em relação a outras subpopulações de células imunes. Enquanto em algumas modalidades, as células estimuladoras são células do tipo selvagem, em várias modalidades, as células estimuladoras são geneticamente modificadas para torná-las particularmente adequadas para expandir e/ou ativar células imunes. Como discutido em mais detalhes abaixo, várias linhagens celulares são passíveis de modificação genética que podem resultar na expressão superficial de certas moléculas que
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26/65 estimulam a ativação de NK. Certas linhagens celulares são particularmente favoráveis à expansão de células NK, por exemplo, aquelas que não expressam moléculas de MHC I, as quais têm um efeito inibitório nas células NK. Em algumas modalidades, as células não precisam totalmente da expressão de MHC I, no entanto, podem expressar moléculas de MHC I em um nível mais baixo do que uma célula do tipo selvagem. Por exemplo, em várias modalidades, se uma célula do tipo selvagem expressa um MHC no nível de X, as linhagens celulares usadas podem expressar o MHC em um nível menor que
| 95% de | X, menor que | 90% de | X, | menor | que | 85% de | X, menor | que |
| 8 0% de | X, menor que | 70% de | X, | menor | que | 50% de | X, menor | que |
| 25% de | X e qualquer | nível | de | expressão | entre | (e incluindo) |
os listados. Em várias modalidades, as células estimuladoras são imortalizadas, por exemplo, uma linhagem celular de câncer. No entanto, em várias modalidades, as células estimuladoras são células primárias.
[0042] Os tipos de células que não possuem ou reduziram a expressão de MHC I incluem, mas não estão limitados a, células K562, certas linhagens celulares de Tumor de Wilm (por exemplo, linhagem celular de tumor de Wilms HFWT), células de tumor endometrial (por exemplo, HHUA), células de melanoma (por exemplo, HMV-II), células de hepatoblastoma (por exemplo, HuH-6), células de carcinoma de células pequenas do pulmão (por exemplo, Lu-130 e Lu-134-A),
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27/65 células de neuroblastoma (por exemplo, NB19 e NB69), carcinoma células de testículo embrionário (por exemplo, NEC14), células de carcinoma cervical (TCO-2), células de neuroblastoma (por exemplo, TNB1), linhagem de células B 721.221 transformadas por EBV, entre outras. Em várias modalidades, as células estimuladoras também têm expressão reduzida (ou falta) de MHC II, além de terem expressão reduzida (ou inexistente) de MHC I. Em algumas modalidades, outras linhagens celulares que podem inicialmente expressar moléculas de MHC de classe I podem ser usadas, em conjunto com a modificação genética dessas células para reduzir ou eliminar a expressão de MHC I. A modificação genética pode ser realizada através do uso de técnicas de edição de genes (por exemplo, o sistema crispr/cas-9), RNA inibitório (por exemplo, siRNA) ou outros métodos moleculares para interromper e/ou reduzir a expressão de moléculas de MHC I na superfície das células. Adicionalmente, ou alternativamente, outras abordagens para bloquear a ligação ou outras interações com as moléculas do MHC I podem ser usadas (por exemplo, anticorpos bloqueadores, ligantes interferentes, etc.).
[0043] Em várias modalidades, são utilizadas certas proporções de células estimuladoras para células a serem expandidas/estimuladas. Por exemplo, em várias modalidades, é usada uma proporção de célula estimuladora: célula alvo
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28/65 de cerca de 5: 1. Em várias modalidades, as relações 1:1 são usadas, enquanto em modalidades adicionais, pode variar de: 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000, 100.000:1, 50.000:1, 10.000:1, 1.000:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1 e qualquer proporção entre as listadas, incluindo pontos de extremidade. Em algumas modalidades, combinações de tipos de células são usadas (por exemplo, K562 com um ou mais tipos de células adicionais), com a ativação e/ou expansão resultante de células NK sendo maiores do que seria possível com o uso de qualquer tipo de célula isolado (por exemplo, como resultado da sinergia entre os tipos de células). Em algumas dessas modalidades, a expressão do MHC I não precisa necessariamente ser reduzida e/ou ausente em cada uma das linhagens celulares usadas em combinação. Em algumas modalidades, a frequência relativa de um tipo de célula versus as outras em combinação pode ser variada para maximizar a expansão e a ativação da população de células imunes desejada. Por exemplo, se duas populações de células forem usadas, a frequência relativa poderá variar de uma proporção de 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000, 100.000:1, 50.000:1, 10.000:1, 1.000:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1 e qualquer proporção entre as listadas, incluindo pontos de extremidade.
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29/65 [0044] Como discutido em mais detalhes abaixo, certas moléculas estimuladoras (por exemplo, interleucinas, CD3, 4-1BBL, etc.) podem ser expressas nas ou pelas células que promovem a expansão e ativação das células imunes (por exemplo, as células estimuladoras). No entanto, em várias modalidades, em conjunto com ou no lugar de células para promover a expansão da célula imune, é utilizado um suporte sólido. Por exemplo, um suporte sólido é uma superfície capaz de ter uma molécula conectada à superfície, incluindo, entre outros, metal, vidro, plástico, materiais poliméricos, partículas (por exemplo, esferas ou microesferas) e/ou lipídios (natural ou sintético). Em algumas modalidades, são utilizadas composições que podem eluir uma molécula estimuladora, tais como as aqui divulgadas, no meio de cultura, a fim de facilitar a expansão de uma população de células imunes desejada.
Moléculas Estimuladoras [0045] Como discutido brevemente acima, certas moléculas promovem a expansão das células imunológicas. Dependendo da modalidade, a molécula ou moléculas estimuladoras podem ser expressas na superfície das células estimuladoras usadas para expandir a população imune, enquanto em algumas modalidades as células estimuladoras podem ser projetadas para expressar e secretar uma ou mais moléculas estimuladoras no meio de cultura. Em modalidades
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30/65 ainda adicionais, uma ou mais moléculas estimuladoras são usadas para suplementar o meio de cultura de células. Em algumas modalidades, a população de células imunes é expandida de maneira relativamente uniforme (por exemplo, nenhuma subpopulação especifica é preferencialmente expandida). Em algumas dessas modalidades, após a expansão de todas as populações de células imunes, as subpopulações desejadas são separadas seletivamente (por exemplo, as células NK são separadas das células T ou vice-versa) para uso posterior. Em várias modalidades, certas subpopulações de células imunes especificas, como células NK, são preferencialmente expandidas.
[0046] Em várias modalidades, o construto geral para desenvolver uma linhagem celular estimuladora para expressar uma molécula ligada à membrana emprega um peptídeo de sinal que, em última análise, impulsiona a expressão da molécula ligada à membrana, a sequência de ácido nucleico que codifica a molécula ligada à membrana, um ligante opcional e um domínio transmembranar. Este construto geral pode variar com a modalidade com base, pelo menos em parte, na complexidade, tamanho ou capacidade de expressar uma dada molécula ligada à membrana.
[0047] Em algumas modalidades, a interleucina 15 (IL15) é usada para facilitar a expansão das células NK. Em algumas modalidades, a IL15 é ligada à membrana nas células
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31/65 estimuladoras (referidas aqui como mbIL15) . Em algumas modalidades, a IL15 é ligada à membrana em virtude de ser acoplada ou conjugada a uma molécula transmembranar ou proteína de membrana integral. Em várias modalidades, é utilizado um domínio transmembranar de CD8a (SEQ ID NO. 18) . Em várias modalidades, IL15 do tipo selvagem (por exemplo, um comprimento total) é expressa nas células estimuladoras ou por elas. Em algumas modalidades, a IL15 é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% homóloga com a IL15 de comprimento total. Em algumas modalidades, formas truncadas de IL15 são usadas. Em várias modalidades, a mbIL15 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 1. Em várias modalidades, a mbIL15 é codificada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em várias modalidades, a molécula estimuladora pode ter um ou mais mutações adicionais da SEQ ID NO. 1 ou 2, mas retém, ou em algumas modalidades, tem aumentada a atividade estimuladora.
[0048] Em várias modalidades, as células estimuladoras são modificadas para expressar todo ou uma porção do receptor de IL15. Em várias modalidades, a porção do receptor de IL15 é uma porção funcional do receptor de IL15. Por exemplo, em algumas modalidades, as células estimuladoras são modificadas para expressar a subunidade alfa do receptor de IL15. Em várias modalidades, as células
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32/65 produzem ou são modificadas para produzir (por exemplo, secretar) IL15 solúvel. A IL15 solúvel pode assim se ligar ao seu receptor expressado pelas células estimuladoras e subsequentemente ser internalizada (por exemplo, endocitada) e apresentada a outra célula. Em essência, em algumas modalidades, em vez de manipular as células estimuladoras para expressar um mbIL15 manipulado, as células estimuladoras podem ser modificadas para expressar a subunidade alfa do receptor de IL15, que pode se ligar a IL15 (mesmo na ausência das subunidades CD122 e CD132 do receptor de IL15 restantes) e a apresentar na superfície da
| célula, resultando assim | na expressão | de | IL15 | de | maneira |
| alternativa ao mbIL15. | |||||
| [0049] Em algumas | modalidades, | a | interleucina 12A | ||
| (IL12A) e/ou 12B (IL12B) | é usada para | facilitar | a | expansão |
das células NK. Em algumas modalidades, a IL12 é ligada à membrana nas células estimuladoras (referidas aqui como mbIL12). Em algumas modalidades, combinações de IL12A e IL12B são usadas (aqui referidas como IL12A/12B e, quando ligadas à membrana, mbIL12A/12B). Em algumas modalidades, a IL15 é ligada à membrana em virtude de ser acoplada ou conjugada a uma molécula transmembranar ou proteína de membrana integral. Em várias modalidades, um domínio transmembranar de CD8a é usado. Em várias modalidades, IL12A e/ou 12B de tipo selvagem (por exemplo, um comprimento total)
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33/65 é expressa nas células estimuladoras ou por elas. Em algumas modalidades, IL12A e/ou 12B é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% homóloga com IL12A ou 12B de comprimento total, respectivamente. Em algumas modalidades, formas truncadas de IL12A e/ou 12B são usadas. Em várias modalidades, mbIL12A é codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 3. Em várias modalidades, mbIL12A é codificado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em várias modalidades, a molécula estimuladora pode ter uma ou mais mutações adicionais da SEQ ID NO. 3 ou 4, mas retém, ou em algumas modalidades, tem aumentada a atividade estimuladora. Em várias modalidades, o mbIL12B é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5. Em várias modalidades, o mbIL12B é codificado pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. Em várias modalidades, a molécula estimuladora pode ter uma ou mais mutações adicionais da SEQ ID NO. 5 ou 6, mas retém, ou em algumas modalidades, tem aumentada a atividade estimuladora. Em algumas modalidades, uma mistura de IL12A e IL12B é usada. Em várias modalidades, uma proporção específica de expressão de IL12A: IL12B é usada, por exemplo, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, 10.000:1, 1000:1, 100:1, 10:1 e qualquer relação entre, incluindo as extremidades. Em algumas modalidades, IL12A e IL12B são expressados, por exemplo, como uma proteína de fusão. Em
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34/65 algumas modalidades, um fragmento ou fragmentos de IL12A são expressados em conjunto com um fragmento ou fragmentos de IL12B. Em várias modalidades, a expressão de IL12 (A e/ou B) nas células estimuladoras confere às células a capacidade de influenciar o fenótipo e a função das células expandidas. Em outras palavras, a expressão de IL12A e/ou B (isoladamente ou em combinação com as outras moléculas estimuladoras aqui divulgadas), leva a, em várias modalidades, expansão seletiva de uma subpopulação de células NK. Em várias modalidades, essa subpopulação específica pode ser vantajosa em uma aplicação terapêutica específica em que um fenótipo particular de células NK é particularmente eficaz.
[0050] Em algumas modalidades, a interleucina 18 (IL18) é usada para facilitar a expansão das células NK. Em algumas modalidades, a IL18 é ligada à membrana nas células estimuladoras (referidas aqui como mbIL18). Em algumas modalidades, IL18 é ligada à membrana em virtude de ser acoplada ou conjugada a uma molécula transmembranar ou proteína de membrana integral. Em várias modalidades, um domínio transmembranar de CD8a é usado. Em várias modalidades, IL18 do tipo selvagem (por exemplo, um comprimento total) é expressa nas células estimuladoras ou por elas. Em algumas modalidades, a IL18 é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 95% homóloga à IL18 de
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35/65 comprimento total. Em algumas modalidades, formas truncadas de IL18 são usadas. Em várias modalidades, mbIL18 é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 7. Em várias modalidades, mbIL18 é codificado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em várias modalidades, a molécula estimuladora pode ter uma ou mais mutações adicionais da SEQ ID NO. 7 ou 8, mas retém, ou em algumas modalidades, tem aumentada a atividade estimuladora. Em várias modalidades, a expressão de IL18 nas células estimuladoras confere às células a capacidade de influenciar o fenótipo e a função das células expandidas. Em outras palavras, a expressão de IL18 (isoladamente ou em combinação com outras moléculas estimuladoras aqui divulgadas, leva a, em várias modalidades, expansão seletiva de uma subpopulação de células NK. Em várias modalidades, essa subpopulação especifica pode ser vantajosa em uma determinada aplicação terapêutica em que um fenótipo especifico de células NK é particularmente eficaz.
[0051] Em algumas modalidades, a interleucina 21 (IL21) é usada para facilitar a expansão das células NK. Em algumas modalidades, a IL21 é ligada à membrana nas células estimuladoras (referidas aqui como mbIL21). Em algumas modalidades, IL21 é ligada à membrana em virtude de ser acoplada ou conjugada a uma molécula transmembranar ou proteína de membrana integral. Em várias modalidades, um
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36/65 domínio transmembranar de CD8a é usado. Em várias modalidades, IL21 do tipo selvagem (por exemplo, um comprimento total) é expressa nas células estimuladoras ou por elas. Em algumas modalidades, a IL21 é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% homóloga com a IL21 de comprimento total. Em algumas modalidades, formas truncadas de IL21 são usadas. Em várias modalidades, o mbIL21 usado para estimular células NK é derivado da sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9. Como discutido aqui, em várias modalidades, o domínio transmembranar CD8a é usado para ancorar a IL21 da SEQ ID NO: 9 (ou fragmento da mesma) para a membrana das células estimuladoras. Em várias modalidades, o mbIL21 usado para estimular células NK é derivado da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em várias modalidades, a molécula estimuladora pode ter uma ou mais mutações adicionais da SEQ ID NO. 9 ou 10, mas retém, ou em algumas modalidades, tem aumentada a atividade estimuladora.
[0052] Em algumas modalidades, a interleucina 22 (IL22) é usada para facilitar a expansão das células NK. Em algumas modalidades, a IL22 é ligada à membrana nas células estimuladoras (referidas aqui como mbIL22). Em algumas modalidades, a IL22 é ligada à membrana em virtude de ser acoplada ou conjugada a uma molécula transmembranar ou proteína de membrana integral. Em várias modalidades, um
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37/65 domínio transmembranar de CD8a é usado. Em várias modalidades, IL22 do tipo selvagem (por exemplo, um comprimento total) é expressa nas células estimuladoras ou por elas. Em algumas modalidades, a IL22 é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% homóloga com a IL22 de comprimento total. Em algumas modalidades, formas truncadas de IL22 são usadas. Em várias modalidades, mbIL22 é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 11. Em várias modalidades, mbIL22 é codificado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em várias modalidades, a molécula estimuladora pode ter um ou mais mutações adicionais da SEQ ID NO. 11 ou 12, mas retém, ou em algumas modalidades, tem aumentada a atividade estimuladora.
[0053] Em algumas modalidades, o ligante 4-1BB (41BBL) é usado para facilitar a expansão das células imunes. 4-1BBL tem um domínio extracelular que interage com seu receptor nas células T, 4-1BB, fornecendo assim às células T sinais co-estimuladores para sobrevivência, proliferação e diferenciação. Em algumas modalidades, 4-1BBL é ligado à membrana em virtude de ser acoplado ou conjugado a uma molécula transmembranar ou a uma proteína de membrana integral. Em várias modalidades, 4-1BBL de tipo selvagem (por exemplo, um comprimento total) é expressado nas células estimuladoras ou por elas. Em algumas modalidades, o 4-1BBL
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38/65 é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% homólogo com 4-1BBL de comprimento total. Em algumas modalidades, formas truncadas de IL18 são usadas. Em várias modalidades, mb4-lBBL é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 13. Em várias modalidades, mb4-lBBL é codificado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em várias modalidades, a molécula estimuladora pode tem uma ou mais mutações adicionais da SEQ ID NO. 13 ou 14, mas retém, ou em algumas modalidades, tem aumentada a atividade estimuladora.
[0054] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD3 é usado para facilitar a expansão das células imunes. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 é ligado à membrana nas células estimuladoras (referidas aqui como mbantiCD3 ou mba-CD3). Em várias modalidades, um anticorpo anti-CD3 completo é expressado nas células estimuladoras. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um fragmento de região variável de fragmento de cadeia única (scFv). Dependendo da modalidade, o anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma variedade de fragmentos antigênicos e/ou de fusão selecionados a partir de um Fab', um F(ab')2, um anticorpo de domínio único (por exemplo, um diacorpo, um nanocorpo). Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em muromonab-CD3,
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39/65 otelixizumabe, teplizumabe e visilizumabe. Em algumas modalidades, o anticorpo é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% homólogo de um ou mais de muromonab-CD3, otelixizumabe, teplizumabe e visilizumabe. Em várias modalidades, os anticorpos que se ligam a uma ou mais subunidades da porção CD3 do receptor de célula T são expressados pelas células estimuladoras. Em várias modalidades, os anticorpos expressados são direcionados contra as subunidades CD3 gama, épsilon ou delta. Em várias modalidades, o anticorpo expressado pelas células estimuladoras é direcionado contra um epitopo derivado da sequência de ácidos nucleicos CD3 épsilon da SEQ ID NO: 15. Em várias modalidades, o anticorpo anti-CD3 é uma variável de fragmento de cadeia única (scFv). Em várias modalidades, o mbantiCD3 scFv é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 16. Em algumas dessas modalidades, o anticorpo possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17. Em várias modalidades, a molécula estimuladora pode ter uma ou mais mutações adicionais da SEQ ID NO. 16 ou 17, mas retém, ou em algumas modalidades, aumentou a atividade estimuladora.
[0055] Em várias modalidades, células estimuladoras, tais como células K562, são geneticamente modificadas para expressar combinações de várias moléculas estimuladoras. Dependendo da modalidade, qualquer combinação das moléculas
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40/65 estimuladoras aqui divulgadas pode ser usada. Por exemplo, em várias modalidades, mbIL15, 4-1BBL e mba-CD3 são coexpressados nas células estimuladoras. Em várias modalidades, mbIL15, 4-1BBL e mbIL12A/12B são co-expressados nas células estimuladoras. Em várias modalidades, mbIL15, 41BBL e mbIL18 são co-expressados nas células estimuladoras. Em várias modalidades, mbIL15, 4-1BBL, mbIL18 e mbIL12A/12B são co-expressados nas células estimuladoras. Em várias modalidades, mbIL15, 4-1BBL, mbIL12A/12B e mbantiCD3 são coexpressados nas células estimuladoras. Em várias modalidades, mbIL15, 4-1BBL, mbIL18 e mbantiCD3 são coexpressados nas células estimuladoras. Em várias modalidades, mbIL15, 4-1BBL, mbIL12A/12B, mbIL18 e mbantiCD3 são co-expressados nas células estimuladoras. Em algumas modalidades, mbIL21 e/ou mbIL22 podem ser expressados além de, ou no lugar de, qualquer uma das moléculas estimuladoras listadas acima. Em algumas modalidades, cada uma dessas moléculas é expressa nas células estimuladoras por transfecção com plasmideos individuais. Alternativamente, duas ou mais das moléculas estimuladoras podem ser codificadas em um único plasmideo.
[0056] Dependendo da modalidade, e da molécula estimuladora em questão, as moléculas estimuladoras podem ser expressas em momentos específicos durante o processo de co-cultura com uma população de células imunes. Por exemplo,
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41/65 em vez de serem expressados constitutivamente, um ou mais dos marcadores podem estar sob o controle de um promotor induzivel ou regulável. Como tal, uma molécula ou estímulo desencadeador pode ser adicionado à co-cultura em um tempo desejado, resultando na expressão da molécula estimuladora desejada em um ponto específico durante o protocolo de expansão e ativação. Conforme usado neste documento, os termos promotor induzivel e promotor regulável devem ter seu significado comum e também devem se referir a promotores cuja atividade transcricional é modulada (por exemplo, estimulada ou inibida) pela presença de certos fatores bióticos ou abióticos. Conforme usado aqui, os termos molécula desencadeante ou estímulo desencadeante devem ter seu significado comum e devem se referir a substâncias ou condições químicas ou físicas que atuam em um promotor induzivel ou regulável, incluindo, mas não se limitando a, álcool, tetraciclina, esteroides, metais e outros compostos, bem como temperaturas altas ou baixas de cultura. Além disso, a expressão regulável das moléculas estimuladoras também pode ser usada para reduzir e/ou eliminar a expressão de uma molécula estimuladora específica durante o processo de cultura. Tais modalidades podem facilitar a expansão preferencial de certas subpopulações de células imunes, como células NK, fornecendo, por exemplo, um sinal estimulador específico em um momento no tempo durante o processo de
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42/65 ativação e expansão, quando as células NK são particularmente sensíveis a esse sinal. Em várias modalidades, essa abordagem pode levar a uma ativação e expansão inesperadamente robustas de células NK. Em modalidades ainda adicionais, a duração da proliferação das células NK é estendida, levando finalmente a uma população maior de células NK ativadas para uso em, por exemplo, imunoterapia contra o câncer.
[0057] Em algumas modalidades, também são fornecidas neste documento sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos que possuem homologia de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% (e faixas entre eles) em comparação com as respectivas sequências de ácido nucleico ou aminoácido das moléculas estimuladoras aqui divulgadas, codificadas pela SEQ ID NOS. 1-17 e que também exibem uma ou mais das funções em comparação com as respectivas SEQ ID Nos. 1-17, incluindo mas não se limitando a: (i) ativar as células NK, (ii) sensibilizar as células NK, (iii) proliferação de células NK aprimorada, (iv), afinidade de direcionamento de células NK aumentada, (v) transdução de sinal supra regulada ou de outra forma aumentada, (vi) citotoxicidade de célula NK aumentada, (vii) estimulação de célula T (por exemplo, proliferação, expansão seletiva de subpopulações úteis, etc.), (viii) expansão seletiva de subpopulações de células NK específicas e (ix) combinações das mesmas.
Métodos de co-cultura e expansão de células imunes
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43/65 [0058] Em várias modalidades, as células estimuladoras podem ser transduzidas com múltiplos construtos (cada um codificando uma ou mais das moléculas estimuladoras a serem expressas) ou, alternativamente, construtos únicos podem ser usados. Em várias modalidades, as células estimuladoras são primeiro transduzidas com uma molécula estimuladora acoplada a um marcador identificável, tal como um marcador fluorescente (por exemplo, proteína fluorescente verde, GFP ou outra fração fluorescente). Em modalidades adicionais, outras marcações podem ser usadas. Por exemplo, em várias modalidades, uma marcação FLAG (DYKDDDDK, SEQ ID NO. 19) é usada. Também estão disponíveis outras sequências de marcadores, tal como um marcador de poli-histidina (marcador His) (HHHHHH, SEQ ID NO. 20), marcador HA ou marcador myc. Combinações de tipos de marcadores também podem ser usadas em certas modalidades. Após a transdução, as células estimuladoras podem ser consultadas quanto à presença e grau de expressão do marcador, que se correlaciona com a expressão da molécula estimuladora associada. As células (ou células individuais) com altos níveis de expressão de marcadores (e, portanto, altos níveis de expressão de moléculas estimuladoras) podem ser selecionadas e expandidas (clonalmente se células únicas forem selecionadas). Posteriormente, uma transdução adicional com uma ou mais moléculas estimuladoras adicionais
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44/65 pode ser realizada, seguida de uma consulta e expansão adicionais, até que a expressão desejada de uma combinação de moléculas estimuladoras seja alcançada. Em algumas modalidades, o marcador associado a cada transdução subsequente é diferente daquele das transduções anteriores, de modo que a expressão de cada molécula estimuladora pode ser verificada independentemente.
[0059] Em várias modalidades, as células estimuladoras são inoculadas em frascos de cultura e deixadas para alcançar perto da confluência. As células imunes podem então ser adicionadas à cultura em uma concentração desejada, variando, em várias modalidades, de cerca de 0,5 x 106 células/cm2 a cerca de 5 x 106 células/cm2, incluindo qualquer densidade entre as listadas, incluindo as extremidades. As células imunes podem estar em uma amostra inicial, tal como sangue periférico, uma preparação isolada de células imunes, uma população isolada de células NK etc., dependendo das modalidades. Em várias modalidades, as amostras de sangue são pré-processadas para segregar certas populações a serem expandidas, por exemplo, células NK. Em algumas modalidades, uma amostra de sangue periférico é co-cultivada com as células estimuladoras e uma subpopulação desejada de células imunes expandidas, por exemplo, células NK, é opcionalmente isolada da população mista de células expandidas. Após a
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45/65 expansão, as células podem ser mantidas em um meio adequado, por exemplo, RPMI-1640, 10% de FCS e 10 UI/mL de IL-2.
[0060] Como discutido acima, são fornecidas, em várias modalidades, populações de células modificadas (também aqui referidas como células estimuladoras) adequadas para ativar e/ou expandir uma população de células imunes. Em várias modalidades, a população manipulada é derivada de uma célula cancerígena e é modificada para expressar mbIL15, mb 4-1BBL e pelo menos uma molécula adicional ligada à membrana que estimula a ativação da célula imune, pelo que a co-cultura das células modificadas com uma população de células imunes resulta na ativação e/ou na expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes, tal como células NK. Em várias modalidades, a molécula adicional compreende uma ou mais interleucinas (ou fragmentos das mesmas), tal como IL12A, IL12B, IL18, IL21 e/ou IL22. Em algumas modalidades, a molécula adicional compreende um anticorpo. Em várias modalidades, o anticorpo compreende um anticorpo anti-CD3 ligado à membrana (mba-CD3), anticorpo ou scFv, ou fragmentos dos mesmos. Em várias modalidades, o anticorpo é monoclonal. Em várias modalidades, o anticorpo é coexpressado com a pelo menos uma interleucina, ou fragmento da mesma. Dependendo da modalidade, uma ou mais das moléculas ligadas à membrana são acopladas a um domínio transmembranar da CD8a humana. Também são aqui fornecidos métodos para
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46/65 expandir células NK, em que as células NK são co-expressas com essas células modificadas. Por exemplo, em várias modalidades, é fornecido um método para expandir células NK, compreendendo a obtenção de uma amostra de sangue periférico compreendendo uma população mista de células imunes compreendendo células NK e células T, entrando em contato com a população mista de células com essas populações de células modificadas e co-cultivar a população mista de células com as células modificadas por um período de tempo suficiente para expandir as células NK da população mista. Em várias modalidades, as células T são opcionalmente removidas, resultando em uma população de células NK mais pura.
[0061] Em várias modalidades, a população celular é derivada de uma ou mais das seguintes linhagens celulares: células K562, linhagem celular tumoral de Wilms HFWT, linhagem celular tumoral endometrial HHUA, linhagem celular de melanoma HMV-II, linhagem celular de hepatoblastoma HuH6, linhagens celulares de carcinoma de células pequenas de pulmão Lu-130 ou Lu-134-A, linhagens celulares de neuroblastoma NB19 ou NB69, linhagem celular de carcinoma de testículo embrionário NEC14, linhagem celular de carcinoma cervical TCO-2 e linhagem celular de neuroblastoma TNB1. Em várias modalidades, a população celular não possui expressão de moléculas de MHC I e/ou MHC II.
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47/65 [0062] Em várias modalidades, também são fornecidos kits compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos, para uso na geração de populações de células modificadas para expandir células imunes, o kit compreendendo pelo menos 3 dentre: um ácido nucleico que codifica mbIL15, um ácido nucleico que codifica 4-1BBL , um ácido nucleico que codifica mbIL12A, um ácido nucleico que codifica mbIL12B, um ácido nucleico que codifica mbIL18, um ácido nucleico que codifica mbIL21, um ácido nucleico que codifica mbIL22 e um ácido nucleico que codifica mba-CD3. Em várias modalidades, um ou mais dos ácidos nucleicos podem compreender um marcador, tal
| como GFP, | marcador | FLAG ou | marcador HIS. | ||
| [0063 | ] São | ainda | aqui fornecidos | métodos | de |
| tratamento | de um | indivíduo com câncer ou | uma doença |
infecciosa compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição compreendendo células geneticamente modificadas aqui descritas e/ou composição compreendendo uma população expandida de células imunes co-cultivadas com as células geneticamente modificadas aqui descritas. Conforme usado neste documento, os termos tratar, tratando e tratamento no contexto da administração de uma terapia a um indivíduo devem receber seu significado comum e devem se referir aos efeitos benéficos que um indivíduo obtém de uma terapia. Em certas modalidades, o tratamento de um indivíduo com a administração de uma composição compreendendo células
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48/65 geneticamente modificadas aqui descritas e/ou composição compreendendo uma população expandida de células imunes cocultivadas com as células geneticamente modificadas aqui descritas alcança um, dois, três, quatro, ou mais dos seguintes efeitos, incluindo, por exemplo: (i) redução ou melhoria da gravidade da doença ou sintoma associado a ela;
(ii) redução na duração de um sintoma associado a uma doença;
(iii) proteção contra a progressão de uma doença ou sintoma associado a ela; (iv) regressão de uma doença ou sintoma associado a ela; (v) proteção contra o desenvolvimento ou aparecimento de um sintoma associado a uma doença; (vi) proteção contra a recorrência de um sintoma associado a uma doença; (vii) redução na hospitalização de um indivíduo;
(viii) redução no tempo de internação; (ix) um aumento na sobrevivência de um indivíduo com uma doença; (x) uma redução no número de sintomas associados a uma doença; (xi) uma melhoria, aprimoramento, suplementação, complementação ou aumento do(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia.
[0064] A administração pode ser realizada por uma variedade de vias, incluindo, sem limitação, administração intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intramuscular, intra-hepática, intraperitoneal e/ou local a um tecido afetado. As doses de células geneticamente modificadas e/ou a população expandida de células imunes co-cultivadas com as
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49/65 células geneticamente modificadas descritas aqui, podem ser prontamente determinadas para um determinado indivíduo com base em sua massa corporal, tipo e estado da doença e agressividade desejada do tratamento, mas varia, dependendo das modalidades, de cerca de 105 células por kg a cerca de 1012 células por kg (por exemplo, 105-107, 1O7-1O10, 1010-1012 e faixas sobrepostas). Em uma modalidade, é utilizado um regime de escalonamento de dose. Em várias modalidades, é administrada uma faixa de população expandida de células imunes co-cultivadas com as células geneticamente modificadas aqui descritas, por exemplo, entre cerca de 1 x 106 células/kg a cerca de 1 x 108 células/kg. Dependendo da modalidade, vários tipos de câncer ou doenças infecciosas podem ser tratados. Várias modalidades previstas neste documento incluem tratamento ou prevenção dos seguintes exemplos não limitativos de câncer, incluindo, entre outros, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mielóide aguda (LMA), carcinoma adrenocortical, sarcoma de Kaposi, linfoma, câncer gastrointestinal, câncer de apêndice, câncer do sistema nervoso central, carcinoma basocelular, câncer do dueto biliar, câncer de bexiga, câncer ósseo, tumores cerebrais (incluindo mas não limitado a astrocitomas, tumores da medula espinhal, glioma do tronco cerebral, craniofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma) , câncer de mama, tumores
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50/65 brônquicos, linfoma de Burkitt, câncer cervical, câncer de cólon, leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mielóide crônica (LMC), distúrbios mieloproliferativos crônicos, carcinoma ductal, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer gástrico, linfoma de Hodgkin, Linfoma de não-Hodgkin, leucemia de células ciliares, câncer de células renais, leucemia, câncer de boca, câncer nasofaríngeo, câncer de fígado, câncer de pulmão (incluindo, entre outros, câncer de células não pequenas de pulmão, (NSCLC) e câncer de células pequenas de pulmão), câncer de pâncreas, câncer de intestino, linfoma, melanoma, câncer ocular, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de hipófise, câncer uterino e câncer vaginal.
[0065] Além disso, várias modalidades previstas neste documento incluem tratamento ou prevenção dos seguintes exemplos não limitativos de doenças infecciosas, incluindo, entre outras, infecções de origem bacteriana podem incluir, por exemplo, infecções por bactérias de um ou mais dos seguintes gêneros: Bordetella, Borrelia, Brucella, Campylobacter, Chlamydia e Chlamydophlla, Clostridium, Corynebacterlum, Enterococcus, Escherichia, Franclsella, Haemophilus , Helicobacter, Legionella , Leptospira , Listeria , Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Vibrio, e Yersinia, e mutantes ou
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51/65 combinações dos mesmos. Em várias modalidades, são fornecidos métodos para tratar uma variedade para tratar infecções virais, como aquelas causadas por um ou mais vírus, tal como adenovirus, Coxsackievirus, virus Epstein-Barr, virus da hepatite A, virus da hepatite B, virus da hepatite C, virus do herpes simplex, tipo 1, virus do herpes simplex, tipo 2, citomegalovirus, virus do ebola, virus de herpes humano, tipo 8, HIV, virus da gripe, virus do sarampo, virus da caxumba, papilomavirus humano, virus da parainfluenza, poliovirus, virus da raiva, virus sincicial respiratório, virus da rubéola e virus varicela-zoster.
[0066] Em várias modalidades, as células expandidas e/ou ativadas são administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz (por exemplo, uma quantidade que seja suficiente para tratar um câncer, como por exemplo, melhorando os sintomas associados ao câncer, impedindo ou retardando o aparecimento do câncer, diminuindo também a gravidade ou frequência dos sintomas do câncer e/ou prevenindo, atrasando ou superando as metástases do câncer). A quantidade que será terapeuticamente eficaz no tratamento de um indivíduo em particular dependerá dos sintomas e gravidade da condição (por exemplo, câncer) e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, ensaios in vitro ou in vivo podem opcionalmente ser empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem
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52/65 ideais. A dose exata a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade do câncer e deve ser decidida de acordo com o julgamento de um médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses efetivas podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal. Em várias modalidades, as células imunes expandidas são coadministradas com uma ou mais células estimuladoras, enquanto em algumas modalidades, as células estimuladoras (ou um ou mais fatores produzidos, secretados ou colhidos a partir das células estimuladoras) são administrados para ativar populações endógenas de células imunes.
[0067] Os métodos de administração incluem, mas não estão limitados a intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutâneo, tópico, oral e intranasal. Outros métodos de introdução adequados também podem incluir terapia genética, dispositivos recarregáveis ou biodegradáveis, dispositivos de aceleração de partículas (por exemplo, pistolas de genes) e dispositivos poliméricos de liberação lenta. As composições farmacêuticas desta invenção também podem ser administradas como parte de uma terapia combinatória com outros compostos, em várias modalidades.
EXEMPLOS
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53/65 [0068] A seguir, são apresentadas descrições não limitativas de métodos e materiais experimentais que foram utilizados nos exemplos divulgados abaixo.
Exemplo 1 - Preparação de Derivados K562, Expansão de Células NK [0069] Amostras de sangue periférico foram obtidas de subprodutos anônimos, descartados, de doações de plaquetas de doadores adultos saudáveis no Banco de Sangue do Hospital Universitário Nacional, Cingapura.
[0070] As células mononucleadas foram separadas por centrifugação em uma etapa de densidade de Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Noruega) e lavadas duas vezes em RPMI-1640. Para purificar células NK primárias a partir de células mononucleadas do sangue periférico, foi utilizado um Kit de Isolamento de Células NK da Miltenyi (Bergisch Gladbach, Alemanha).
[0071] A linhagem celular K562-mbl5-41BBL (Figura IA) foi feita como descrito anteriormente (Imai C, Iwamoto S, Campana D.) . A modificação genética de células exterminadoras naturais primárias supera os sinais inibitórios e induz a morte específica de células leucêmicas. Blood. 2005; 106: 376-383; Fujisaki H, Kakuda H, Shimasaki N, et al. Expansão de células exterminadoras naturais humanas altamente citotóxicas para terapia de células cancerígenas. Cancer Res. 2009; 69 (9): 4010-4017.)
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54/65 [0072] As outras variantes do K562 foram geradas pela transdução das células K562-mbl5-41BBL com um vetor retroviral contendo a sequência de cDNA que codifica a interleucina ligada à membrana (IL)-12, IL-18 ou ambas, ou CD3 ScFv anti-humano ligado à membrana. As sequências para os construtos de clonagem são fornecidas nas SEQ ID NO: 21 (mbIL15), SEQ ID NO: 23 (mbIL12A), SEQ ID NO: 24 (mbIL12B), SEQ ID NO: 25 (mbIL18) e SEQ ID NO: 26 (mb-anti-CD3 scFv). Um retrovirus de MSCV pseudotipado com RD144 contendo o cDNA correspondente foi usado para transduzir as células K562mbl5-41BBL. Meio retroviral condicionado ao vetor foi adicionado aos tubos de polipropileno revestidos com RetroNectin (Takara, Otsu, Japão); após centrifugação e remoção do sobrenadante, células K562-mbl5-41BBL foram adicionadas aos tubos e deixadas a 37 °C por 12 horas; foi adicionado sobrenadante viral fresco em outros dois dias sucessivos. As células foram então mantidas em RPMI-1640 com FBS e antibióticos.
[0073] A expressão de superfície de IL-12a, IL12b e IL18 foi analisada por citometria de fluxo, utilizando os anticorpos anti-IL12a conjugados com aloficocianina (ARC; Miltenyi) ou com fitoeritrina (PE; R&D Systems, Minneapolis, MN) , anti-IL12b APC (Biolegend, San Diego, CA) , anti-IL18 (MBL; Woburn, MA) , seguido de PE de IgGl de cabra e camundongo (Southern Biotechnology Associates, Birmingham,
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AL) . 0 anti-CD3 foi detectado usando um anticorpo Fab2 de cabra e anti-camundongo conjugado à biotina, seguido de estreptavidina APC (ambos da Jackson Immunoresearch (West Grove, PA) . Os subclones que expressam altos níveis do transgene foram enriquecidos por citometria de fluxo e usados para estimular a NK expansão celular.
Expansão de células NK humanas [0074] Para expandir as células NK, foram cocultivadas PBMCs e células K562 geneticamente modificadas. Resumidamente, células mononucleadas do sangue periférico (3 χ 106) foram cultivadas em uma placa de cultura de tecidos de 6 cavidades com 2 χ 106 células modificadas por K562 irradiadas (100 Gy) em meio SCGM (CellGenix, Freiburg, Alemanha) contendo 10% de SFB UI/mL de interleucina humana (IL)-2 (Novartis, Basiléia, Suíça) . A cada 2-3 dias, foi adicionado meio de cultura de tecido fresco e IL-2. Após 7 dias de co-cultura, as células T residuais foram removidas usando Dynabeads CD3 (Thermo Fisher), produzindo populações de células contendo > 90% de células CD56 + CD3-NK.
Resultados [0075] Após gerar os construtos e transduzir as células K562-mbl5-41BBL com o respectivo vetor retroviral, as células K562 foram avaliadas usando citometria de fluxo para expressão das várias moléculas ligadas à membrana. A Figura 2A-2F representa os resultados da avaliação. Conforme
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56/65 representado, cada uma das seis moléculas a serem expressas mostrou que quase 100% das linhagens celulares K562 resultantes expressavam a molécula indicada (2A - mbIL15, 2B - 41BBL, 2C - mbIL18, 2D - mbIL12A, 2E - mbIL12B e 2F - mbanti-CD3). Estes dados demonstram que os vários construtos gerados se traduzem com sucesso na expressão da molécula estimuladora desejada pelas células K562 (ou outro tipo de célula estimuladora).
[0076] Tendo confirmado a expressão da molécula estimuladora desejada, foi avaliada a capacidade das várias variantes K562 de expandir as células NK. Como discutido acima, os PBMCs foram co-cultivados com células K562 irradiadas co-expressando mbIL15 e 4-1BBL (K562-mbl5-41BBL). Esse construto K562 foi comparado a um construto que expressa adicionalmente mbIL12 (+ mbl2), mbIL18 (+ mbl8) ou ambos mbIL12 e mbIL18 (+ mbl2 + mbl8). O número de células NK (definidas pela expressão de CD56 e a falta de CD3) recuperadas após 7 dias de cultura em relação àquelas inicialmente semeadas foram calculadas e estão representadas na Figura 3A. Em todas as culturas, foi adicionado IL-2 40 UI/mL (Aldeuskin, Novartis). São mostrados resultados de 5 experiências com células de 4 doadores saudáveis. A barra horizontal corresponde ao valor mediano. Esses dados indicam uma clara tendência à expansão aprimorada de células NK com a adição de mbIL12, mbIL18 e uma combinação de ambos. Isto
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57/65 sugere que a suplementação da natureza estimuladora das células K562 que expressam mbIL15-41BBL é realizada utilizando os construtos de acordo com várias modalidades aqui apresentadas.
[0077] A Figura 3B mostra uma experiência adicional comparando células NK por co-cultura de PBMCs com células K562-mbl5-41BBL ou com células K562-mbl5-41BBL expressando mbl2 e mbl8 por 7 dias de cultura. Estes dados são de 12 experiências com células mononucleadas de sangue periférico de 8 doadores. O valor p foi calculado pelo teste t pareado. Esses dados demonstram que um aumento significativo no grau de células NK (em comparação com a população inicial). Assim, os construtos de acordo com várias modalidades divulgadas neste documento resultam em uma expansão significativa das populações de células NK. Essa expansão é particularmente vantajosa em várias modalidades, porque as células K562 expressam várias moléculas estimuladoras resultam em uma expansão inesperadamente robusta das células NK, levando a uma população considerável que pode ser usada em aplicações terapêuticas.
Exemplo 2 - Expansão e função de longo prazo de células NK estimuladas com variantes K562
Expansão a longo prazo [0078] A capacidade das células NK para continuar a se expandir foi avaliada. Os PBMCs foram co-cultivados com
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58/65 células K562 irradiadas que expressam mbIL15 e 4-1BBL (K562mbl5-41BBL) (Figura 4A) ou com células K562-mbl5-41BBL também expressando mbIL12 (+ mbl2) (Figura 4B) , mbIL18 ( + mbl8) (Figura 4C) ou mbIL12 e mbIL18 (+ mb12 + mbl8) (Figura 4D) . 0 número de células NK (definidas pela expressão de CD56 e a falta de CD3) recuperadas após diferentes intervalos de tempo em cada cultura em relação àquelas originalmente semeadas foi calculado para calcular a duplicação da população celular. Para renovar a potencial expansão das células NK, células K562 geneticamente modificadas foram adicionadas a cada 2 semanas, na proporção K562: NK de 5:1, e a concentração de IL-2 foi mantida em 40 UI/mL durante a primeira semana e a 400 UI/mL subsequentemente, após a depleção de células T. As setas indicam o ponto no tempo em que as células NK deixaram de se expandir, apesar da adição de células K562, indicando senescência.
[0079] Como com os dados de expansão discutidos acima, esses dados indicam que a expressão de mbIL15-41BBL resulta em um nível limiar de expansão, enquanto a expressão de moléculas estimuladoras adicionais resulta em aprimoramentos significativos de expansão, em várias modalidades. Em particular, a expressão de mbIL12 por si só não pareceu alterar a capacidade das células NK de continuarem a se expandir além daquelas realizadas usando as células que expressam mbIL15-41BBL. No entanto, as células
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K562 que expressam mbIL18 e mbIL12-mbILl8 combinadas resultaram em durações significativamente maiores de expansões de células NK, com cada construto estimulando a expansão de células NK por quase 20 semanas (~ 3 vezes maior que as células K562 que expressam mbIL15-41BBL). Isso demonstra que, de acordo com várias modalidades divulgadas neste documento, a expressão de certas moléculas estimuladoras pode aumentar inesperadamente a expansão das células NK. Além disso, de acordo com várias modalidades, a co-expressão de múltiplas moléculas estimuladoras pode resultar em efeitos estimuladores sinérgicos.
Ensaios de citotoxicidade [0080] Além da expansão das células NK, a citotoxicidade das células expandidas foi avaliada para determinar se certas variantes modificadas de células estimuladoras transmitiam um maior grau de citotoxicidade às células NK expandidas.
[0081] As células alvo foram suspensas em RPMI-1640 com 10% de FBS, marcadas com calceina AM (Sigma) e plaqueadas em placas de fundo plano de 96 cavidades (Costar, Corning, NY) . As células NK expandidas, suspensas em RPMI-1640 com 10% de FBS, foram então adicionadas a várias proporções E: T, conforme indicado, e co-cultivadas com células alvo por 4 horas. As células foram então coradas com iodeto de propridio e a citotoxicidade foi medida por citometria de
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60/65 fluxo usando um citômetro de fluxo Accuri (BD Bioscience), enumerando o número de células-alvo viáveis (propriedades positivas para calceina AM, negativas para iodeto de propidio e propriedades de espalhamento de luz de células viáveis).
[0082] A Figura 4E mostra dados de medições de citotoxicidade de células NK contra células K562 em ensaios de 4 horas nas relações efetor: alvo (E:T) mostradas após 8 e 15 dias de cultura. No período inicial de 8 dias, nas duas razões E:T, as células NK estimuladas com diferentes construtos exibiram citotoxicidade diferencial. Como mostrado, essas células NK se expandiram por 8 dias com o construto mbIL15-41BBL + mbIL18 e o mbIL15-41BBL mostrou a maior citotoxicidade. Curiosamente, naqueles grupos cultivados por mais 7 dias em cultura (15 dias no total, com IL-2 a 4400 UI/mL na segunda semana), as diferenças na citotoxicidade foram reduzidas, com todos os grupos exibindo efeitos citotóxicos perto de 100 %.
[0083] A Figura 4F ilustra dados relacionados à citotoxicidade das células NK após 64 dias em cultura (9 semanas em cultura), usando as razões E:T mostradas. Esses dados demonstram que, mesmo após uma quantidade substancial de tempo em cultura, a citotoxicidade ainda é exibida. Em 1:1 E:T, as células NK expandidas usando células K562 que expressam mbIL15-41BBL + mbIL18 demonstraram aproximadamente 30% de citotoxicidade, enquanto as células NK expandidas
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61/65 usando células K562 que expressam mbIL15-41BBL + mbIL12 + mbIL18 demonstraram quase 80% de citotoxicidade. Quando superadas em número pelas células alvo (E:T de 1:2), as respectivas células NK ainda exibem citotoxicidade, embora tenham sido reduzidas em comparação à proporção de 1:1. Por outro lado, quando presentes em quantidades maiores que as células alvo (E:T de 2:1), as células NK exibiram maior citotoxicidade. Esses dados sugerem que, quando cultivadas por longos períodos de tempo, pode haver uma redução na potência das células NK (embora com um aumento no número). Assim, de acordo com algumas modalidades, um aumento da duração da co-cultura não apenas aumenta o número bruto de células NK, mas também leva a um aumento nos efeitos citotóxicos de cada célula NK. Por conseguinte, algumas modalidades resultam não apenas em números de células NK maiores, mas a potência de cada membro da população de células NK expandida é aprimorada, resultando em maior eficácia clínica geral. De acordo com várias modalidades, a duração da cultura versus potência é balanceada para atingir um equilíbrio ideal entre o número de células e os efeitos citotóxicos resultantes.
[0084] Em várias modalidades, um ácido nucleico que codifica 4-1BBL compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO. 22 mostrada abaixo
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| gaattcgccc | ttccaccatg | gaatacgcct | ctgacgcttc | actggacccc | gaagccccgt |
| ggcctcccgc | gccccgcgct | cgcgcctgcc | gcgtactgcc | ttgggccctg | gtcgcggggc |
| tgctgctgct | gctgctgctc | gctgccgcct | gcgccgtctt | cctcgcctgc | ccctgggccg |
| tgtccggggc | tcgcgcctcg | cccggctccg | cggccagccc | gagactccgc | gagggtcccg |
| agctttcgcc | cgacgatccc | gccggcctct | tggacctgcg | gcagggcatg | tttgcgcagc |
| tggtggccca | aaatgttctg | ctgatcgatg | ggcccctgag | ctggtacagt | gacccaggcc |
| tggcaggcgt | gtccctgacg | gggggcctga | gctacaaaga | ggacacgaag | gagctggtgg |
| tggccaaggc | tggagtctac | tatgtcttct | ttcaactaga | gctgcggcgc | gtggtggccg |
| gcgagggctc | aggctccgtt | tcacttgcgc | tgcacctgca | gccactgcgc | tctgctgctg |
| gggccgccgc | cctggctttg | accgtggacc | tgccacccgc | ctcctccgag | gctcggaact |
| cggccttcgg | tttccagggc | cgcttgctgc | acctgagtgc | cggccagcgc | ctgggcgtcc |
| atcttcacac | tgaggccagg | gcacgccatg | cctggcagct | tacccagggc | gccacagtct |
| tgggactctt | ccgggtgacc | cccgaaatcc | cagccggact | cccttcaccg | aggtcggaat |
| aactcgag | (SEQ | ID NO. 22 | ) . |
[0085] É contemplado que várias combinações ou sub combinações das características e aspectos específicos das modalidades divulgadas acima possam ser feitas e ainda se enquadrem em uma ou mais das invenções. Além disso, a divulgação aqui de qualquer característica, aspecto, método, propriedade, característica, qualidade, atributo, elemento ou similar em particular com relação a uma modalidade pode ser usada em todas as outras modalidades aqui estabelecidas. Por conseguinte, deve ser entendido que várias características e aspectos das modalidades divulgadas podem ser combinadas ou substituídas umas pelas outras, a fim de formar modos variados das invenções divulgadas. Assim, pretende-se que o escopo das presentes invenções aqui
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63/65 divulgadas não seja limitado pelas modalidades divulgadas particulares descritas acima. Além disso, embora a invenção seja suscetível a várias modificações e formas alternativas, exemplos específicos da mesma foram mostrados nos desenhos e são aqui descritos em detalhes. Deve ser entendido, no entanto, que a invenção não deve se limitar às formas ou métodos particulares divulgados, mas, pelo contrário, a invenção deve abranger todas as modificações, equivalentes e alternativas que se enquadram no espírito e no escopo das várias modalidades descritas e as reivindicações anexas. Quaisquer métodos aqui divulgados não precisam ser executados na ordem recitada. Os métodos aqui divulgados incluem certas ações tomadas por um profissional; no entanto, eles também podem incluir qualquer instrução de terceiros dessas ações, expressamente ou por implicação. Por exemplo, ações como administrar uma população de células NK expandidas inclui instruir a administração de uma população de células NK expandidas. Além disso, onde os recursos ou aspectos da divulgação são descritos em termos de grupos Markush, os especialistas na técnica reconhecerão que a divulgação também é assim descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.
[0086] Os intervalos divulgados neste documento também abrangem toda e qualquer sobreposição, subintervalos
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64/65 e combinações dos mesmos. Idiomas como até, pelo menos, maior que, menor que, entre e similares incluem o número recitado. Os números precedidos por um termo como sobre ou aproximadamente incluem os números recitados. Por exemplo, 90% inclui 90%. Em algumas modalidades, pelo menos 95% de homologia inclui 96%, 97%, 98%, 99% e 100% de homologia da sequência de referência. Além disso, quando uma sequência é divulgada como compreendendo uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos, essa referência também deve incluir, salvo indicação em contrário, que a sequência compreende, consiste em ou consiste essencialmente em a sequência recitada.
[0087] Artigos como um, um, o/a e similares, podem significar um ou mais de um, a menos que indicado em contrário ou evidente do contexto. A frase e/ou, conforme usada aqui na especificação e nas reivindicações, deve ser entendida como significando um ou ambos dos elementos assim combinados. Vários elementos listados com e/ou devem ser interpretados da mesma maneira, isto é, um ou mais dos elementos combinados. Outros elementos podem opcionalmente estar presentes, além dos elementos especificamente identificados pela cláusula e/ou. Conforme usado aqui na especificação e nas reivindicações, ou deve ser entendido como tendo o mesmo significado que e/ou como definido acima. Por exemplo, quando usado em uma lista de elementos,
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65/65 ou ou e/ou deve ser interpretado como inclusive, ou seja, a inclusão de pelo menos um, mas opcionalmente mais de um, da lista de elementos e, opcionalmente, elementos adicionais não listados. Somente termos claramente indicativos do contrário, como apenas um de ou exatamente um de se referirão à inclusão de exatamente um elemento de um número ou lista de elementos. Assim, as reivindicações que incluem ou entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais de um ou todos os membros do grupo estiverem presentes, empregados ou relevantes para um determinado produto ou processo, a menos que indicado ao contrário. Modalidades são fornecidas nas quais exatamente um membro do grupo está presente, empregado ou relevante para um determinado produto ou processo. Modalidades são fornecidas nas quais mais de um ou todos os membros do grupo estão presentes, empregados ou são relevantes para um determinado produto ou processo. Qualquer uma ou mais reivindicações pode ser alterada para excluir explicitamente qualquer modalidade, aspecto, característica, elemento ou característica ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer uma ou mais reivindicações pode ser alterada para excluir qualquer agente, composição, quantidade, dose, via de administração, tipo de célula, alvo, marcador celular, antígeno, unidade de direcionamento ou combinação dos mesmos.
Claims (23)
- REIVINDICAÇÕES1. População de células geneticamente modificadas que não expressa moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) I, caracterizada pelo fato de
que a referida população de células modificadas é derivada de uma célula imortaliz ada, que a referida população de células modificadas é modificada para expressar a interleucina· -15 ligada à membrana (mbIL15), que a referida população de células modificadas é modificada para expressar o ligante 4-1BB ligado à membrana (4-1BBL), que a referida população de células modificadas é modificada para expressar pelo menos uma interleucina ligada à membrana adicional que estimula a ativação de células imunes, que a referida população de células modificadas não expressa moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) I, e que a co-cultura da referida população de células modificadas com uma população de células imunes resulta na ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes. - 2. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mbIL15 éPetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 95/1252/23 codificada por uma sequência de ácido nucleico que compreende a SEQ ID NO. 1.
- 3. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o 4-1BBL é codificado por uma sequência de ácido nucleico que compreende a SEQ ID NO. 13.
- 4. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada uma das moléculas ligadas à membrana é acoplada a um domínio transmembranar da CD8a humana.
- 5. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembranar da CD8a humana compreende a sequência da SEQ ID NO. 18.
- 6. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas é derivada de uma linhagem celular selecionada do grupo que consiste em células K562, linhagem celular de tumor Wilms HFWT, linhagem celular de tumor endometrial HHUA, linhagem celular de melanoma HMV-II, linhagem celular de hepatoblastoma HuH-6, linhagens celulares de carcinoma de células pequenas do pulmão Lu-130 ou Lu-134-A, linhagens celulares de neuroblastoma NB19 ou NB69, linhagem celular de carcinoma embrionário testicularPetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 96/1253/23NEC14, linhagem celular de carcinoma cervical TCO-2 e linhagem celular de neuroblastoma TNB1.
- 7. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas não possui expressão de moléculas de MHC II.
- 8. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas é derivada de células K562.
- 9. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a interleucina compreende IL12A, ou um fragmento da mesma.
- 10. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a IL12A compreende a sequência da SEQ ID NO. 4.
- 11. População celular modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a interleucina compreende IL12B, ou um fragmento da mesma.
- 12. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a IL12B compreende a sequência da SEQ ID NO. 6.
- 13. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada peloPetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 97/1254/23 fato de que a interleucina compreende IL12A e IL12B, ou fragmentos das mesmas.
- 14. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas expressa ainda IL18 ligado à membrana (mbIL18), ou fragmento da mesma.
- 15. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a IL18 compreende a sequência da SEQ ID NO. 8.
- 16. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas expressa ainda IL21 ligada à membrana (mbIL21), ou fragmento da mesma.
- 17. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a IL21 compreende a sequência da SEQ ID NO. 10, ou um fragmento da mesma.
- 18. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células
expressam IL22 ligada à membrana (mbIL22) ou fragmento da mesma. 19. População de células modificadas, de acordo coir l a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a IL22 compreende a sequência da SEQ ID NO. 12, ou um fragmento da mesma.Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 98/1255/2320. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que as células compreendem ainda um anticorpo antiCD3 ligado à membrana (mba-CD3), um fragmento de anticorpo do mesmo, ou scFv.21. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o mba-CD3 é um anticorpo monoclonal.22. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o mba-CD3 tem como alvo um epítopo dentro da sequência de ácido nucleico de CD3 épsilon da SEQ ID NO. 15.23. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o mba-CD3 é um s c Fv.24. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende a sequência da SEQ ID NO. 17.25. Método para expandir células imunes caracterizado pelo fato de que compreende co-cultivar uma amostra de sangue compreendendo células imunes com a população de células modificadas conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 99/1256/2326. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células Exterminadoras Naturais (NK) .27. População de células geneticamente modificadas que não expressa moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) I, caracterizada pelo fato deque a referida população de células modificadas é derivada de uma célula cancerígena, que a referida população de células modificadas é modificada para expressar a interleucina· -15 ligada à membrana (mbIL15), que a referida população de células modificadas é modificada para expressar o ligante 4-1BB ligado à membrana (4-1BBL), que a referida população de células modificadas é modificada para expressar pelo menos uma interleucina ligada à membrana adicional que estimula a ativação de células imunes, e que a co-cultura da referida população de células modificadas com uma população de células imunes resulta na ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes.28. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a interleucina compreende IL12A, ou um fragmento da mesma.Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 100/1257/2329. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a IL12A compreende a sequência da SEQ ID NO. 4.30. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a interleucina compreende IL12B, ou um fragmento da mesma.31. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a IL12B compreende a sequência da SEQ ID NO. 6.32. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a interleucina compreende IL12A e IL12B, ou fragmentos das mesmas.33. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 32, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas expressa ainda IL18 ligado à membrana (mbIL18), ou fragmento da mesma.34. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a IL18 compreende a sequência da SEQ ID NO. 8.35. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 34, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas expressa IL21 ligado à membrana (mbIL21), ou fragmento da mesma.Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 101/1258/2336. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a IL21 compreende a sequência da SEQ ID NO. 10, ou um fragmento da mesma.37. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 36, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas expressa IL22 ligada à membrana (mbIL22), ou fragmento da mesma.38. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a IL22 compreende a sequência da SEQ ID NO. 12, ou um fragmento da mesma.39. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 38, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas compreende ainda um anticorpo anti-CD3 ligado à membrana (mba-CD3), um fragmento de anticorpo do mesmo, ou scFv.40. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o mba-CD3 é um anticorpo monoclonal.41. População de células modificadas, de acordo com as reivindicações 39 ou 40, caracterizada pelo fato de que o mba-CD3 tem como alvo um epitopo dentro da sequência de ácidos nucleicos do CD3 épsilon da SEQ ID NO. 15.Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 102/1259/2342. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o mba-CD3 é um s c Fv.43. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende a sequência da SEQ ID NO. 17.44. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 43, caracterizada pelo fato de que a população de células modificadas é derivada de uma linhagem celular selecionada do grupo que consiste em células K562, linhagem celular de tumor Wilms HFWT, linhagem celular de tumor endometrial HHUA, linhagem celular de melanoma HMV-II, linhagem celular de hepatoblastoma HuH-6, linhagem celular de carcinoma de células pequenas de pulmão Lu-130 ou Lu-134-A, linhagens celulares de neuroblastoma NB19 ou NB69, linhagem celular de carcinoma embrionário testicular NEC14, linhagem celular de carcinoma cervical TCO-2, e linhagem celular de neuroblastoma TNB1.45. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 44, caracterizada pelo fato de que as células modificadas não têm expressão de moléculas de MHC II.Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 103/12510/2346. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que as células modificadas são derivadas de células K562.47. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 46, caracterizada pelo fato de que cada uma das moléculas ligadas à membrana é acoplada a um domínio transmembranar da CD8a humana.48. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembranar da CD8a humana compreende a sequência da SEQ ID NO. 18.49. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 48, caracterizada pelo fato de que a mbIL15 é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende a SEQ ID NO. 1.50. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 49, caracterizada pelo fato de que o mb4-lBBL é codificado por uma sequência de ácido nucleico que compreende a SEQ ID NO. 13.51. População de células geneticamente modificadas que não expressa moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) I caracterizada pelo fato de que a referida população de células modificadas é derivada de uma célula cancerígena,Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 104/12511/23 que a referida população de células modificadas é modificada para expressar a interleucina-15 ligada à membrana (mbIL15), que a referida população de células modificadas é modificada para o ligante 4-1BB expressado ligado à membrana (4-1BBL), que a referida população de células modificadas é modificada para expressar um anticorpo anti-CD3 ligado à membrana (mba-CD3) que estimula a ativação de células imunes, e que a co-cultura da referida população de células modificadas com uma população de células imunes resulta na ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes.52. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o mba-CD3 é um anticorpo monoclonal.53. População de células modificadas, de acordo com as reivindicações 51 ou 52, caracterizada pelo fato de que o mba-CD3 tem como alvo um epitopo dentro da sequência de ácido nucleico do CD3 épsilon da SEQ ID NO. 15.54. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o mba-CD3 é um s c Fv.Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 105/12512/2355. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende a sequência da SEQ ID NO. 17.56. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 51 a 55, caracterizada pelo fato de que as células expressam ainda pelo menos uma interleucina ligada à membrana ou um fragmento da mesma.57. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que a interleucina compreende IL12A, ou um fragmento da mesma.58. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que a IL12A compreende a sequência da SEQ ID NO. 4.59. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 56 a 58, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma interleucina ligada à membrana ou um fragmento da mesma compreende IL12B, ou um fragmento da mesma.60. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que a IL12B pelo menos uma interleucina ligada à membrana ou um fragmento da mesma a sequência da SEQ ID NO. 6.61. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 56 a 60, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma interleucina ligada àPetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 106/12513/23 membrana, ou um fragmento da mesma compreende IL12A e IL12B, ou fragmentos das mesmas.62. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 56 a 67, caracterizada pelo fato de que as células expressam ainda IL18 ligada à membrana (mbIL18), ou um fragmento da mesma.63. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que a IL18 compreende a sequência da SEQ ID NO. 8.64. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 56 a 63, caracterizada pelo fato de que as células expressam IL21 ligada à membrana (mbIL21), ou um fragmento da mesma.65. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a IL21 compreende a sequência da SEQ ID NO. 10, ou um fragmento da mesma.66. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 56 a 65, caracterizada pelo fato de que as células expressam IL22 ligada à membrana (mbIL22) ou um fragmento da mesma.67. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 66, caracterizada pelo fato de que a IL22 compreende a sequência da SEQ ID NO. 12, ou um fragmento da mesma.Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 107/12514/2368. População de células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 67, caracterizada pelo fato de que as células modificadas são adequadas para a expansão de células imunes.69. População de células modificadas, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que as células imunes expandidas são células NK.70. Método para expandir células NK caracterizado pelo fato de compreender co-cultivar uma amostra compreendendo células NK com a população de células modificadas conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 25 a 69.71. Método para preparar a população de células modificadas conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 25 a 69 caracterizado pelo fato de que compreende:transduzir as células com um primeiro construto que codifica mbIL15, gerando, assim, uma primeira população de células transduzidas, expandir a primeira população transduzida de células, transduzir a primeira população de células transduzidas com um segundo construto que codifica 4-1BBL, gerando assim uma segunda população de células transduzidas, transduzir a segunda população de células transduzidas com um terceiro construto que codifica pelo menos uma molécula adicional capaz de estimular células imunes,Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 108/12515/23 gerando assim uma terceira população de células transduzidas, e expandir a terceira população de células transduzidas.72. Pluralidade de ácidos nucleicos para uso na preparação da população de células modificadas conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 25 a 69 caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 3 de:um ácido nucleico que codifica mb IL15, um ácido nucleico que codifica 4-1BBL, um ácido nucleico que codifica mbIL12A, um ácido nucleico que codifica mbIL12B, um ácido nucleico que codifica mbIL18, um ácido nucleico que codifica mbIL21, um ácido nucleico que codifica mbIL22, e um ácido nucleico que codifica mba-CD3. 73. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de ácidos nucleicos é configurada como um único construto.74. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que mbIL15 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO. 1.75. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que 4-1BBL éPetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 109/12516/23 codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO. 13.76. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que mbIL12A é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO. 3.77. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que mbIL12B é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO. 5.78. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que mbIL18 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO. 7.79. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que mbIL21 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO. 9, ou um fragmento da mesma.80. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que mbIL22 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO. 11, ou um fragmento da mesma.81. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que mba-CD3 éPetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 110/12517/23 codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO. 16.82. Pluralidade de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que cada uma da pluralidade de nucleicos compreende ainda uma marcação GFP.83. Método para expandir células NK caracterizado pelo fato de que compreende:a) obter uma amostra de sangue periférico compreendendo uma população mista de células imunes compreendendo células NK e células T,b) colocar em contato a população mista de células com uma população de células modificadas que exibe expressão reduzida de MHC I e foi modificada para expressar:i) interleucina-15 ligada à membrana (mbIL15), ii) ligante 4-1BB (4-1BBL), e iii) pelo menos uma molécula adicional que estimula a ativação de células imunes, ec) co-cultivar a população mista de células com as células modificadas por um período de tempo suficiente para expandir as células NK da população mista de células imunes, expandindo assim as células NK.84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que compreende opcionalmente a remoção de células T da população mista antes ou após a cocultura .Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 111/12518/2385. Linhagem celular modificada caracterizada pelo fato de compreender células de leucemia mieloide K562 que não possuem as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade I, em que as referidas células de leucemia mieloide K562 são geneticamente modificadas para expressar interleucina 15 ligada à membrana, ligante 4-1BB e anticorpo anti-CD3 ligado à membrana.86. Linhagem celular modificada caracterizada pelo fato de que compreende células de leucemia mieloide K562 que não possuem as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade I, em que as referidas células de leucemia mieloide K562 são geneticamente modificadas para expressar interleucina-15 ligada à membrana, ligante 4-1BB ligado à membrana e pelo menos uma interleucina ligada à membrana adicional.87. Linhagem de células modificada, de acordo com a reivindicação 8 6, caracterizada pelo fato de que a interleucina ligada à membrana expressada adicional é interleucina-12.88. Linhagem de células modificada, de acordo com a reivindicação 8 6, caracterizada pelo fato de que a interleucina ligada à membrana expressada adicional é interleucina-18.89. Linhagem de células modificada, de acordo com a reivindicação 86, caracterizada pelo fato de que asPetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 112/125 - 19/23 interleucinas ligadas à membrana expressas adicionais são interleucina-12 e interleucina-18.90. Linhagem de células modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 86 a 89, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um anticorpo anti-CD3 ligado à membrana.91. Linhagem de células modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 86 a 90, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais mbIL12A, mbIL12B, mbIL18, mbIL21, mbIL22 e mba-CD3.92. Linhagem celular modificada caracterizada pelo fato de compreender células de leucemia mielóide K562 que não possuem as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade I, em que as referidas células de leucemia mielóide K562 são geneticamente modificadas para expressar interleucina-15 ligada à membrana, ligante 4-1BB ligado à membrana, anti-CD3 ligado à membrana anticorpo e pelo menos uma interleucina ligada à membrana adicional.93. Linhagem celular modificada, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que a interleucina ligada à membrana expressada adicional é interleucina-12.94. Linhagem de células modificada, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que aPetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 113/125
- 20/23 interleucina ligada à membrana expressada adicional é interleucina-18.95. Linhagem de células modificada, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que as interleucinas ligadas à membrana expressas adicionais são interleucina-12 e interleucina-18.96. Linhagem de células modificada, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma interleucina adicional compreende um ou mais mbIL12A, mbIL12B, mbIL18, mbIL21 e mbIL22.97. População de células NK expandida cultivando uma cultura celular mista caracterizada pelo fato de que compreende células NK e linfócitos T com a linhagem celular modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 85 a 86.98. Uso da população de células NK conforme definida na reivindicação 97 caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de câncer ou doença infecciosa.99. Uso da população de células modificadas conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 25 a 69 caracterizado pelo fato de ser para uso na expansão de uma população de células imunes, em que a população de células imunes é adequada para uso no tratamento de câncer ou doença infecciosa, e em que a população de células imunes compreende células NK.Petição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 114/125
- 21/23100. Método para tratamento de câncer ou de uma doença infecciosa caracterizado pelo fato de que compreende:administrar a um indivíduo com câncer ou uma doença infecciosa uma composição compreendendo uma população expandida de células imunes, em que as referidas células imunes foram expandidas cocultivando as células imunes com uma população de células modificadas, em que a referida população de células modificadas é derivada de uma célula cancerígena, em que a referida população de células modificadas é modificada para expressar a interleucina-15 ligada à membrana (mbIL15), em que a referida população de células modificadas é modificada para expressar o ligante 4-1BB ligado à membrana (4-1BBL), em que a referida população de células modificadas é modificada para expressar pelo menos uma interleucina ligada à membrana adicional que estimula a ativação de células imunes, em que a co-cultura da referida população de células modificadas com uma população de células imunes resulta na ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes, ePetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 115/125
- 22/23 em que a referida pelo menos uma subpopulação de células imunes é administrada ao referido indivíduo.101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que a subpopulação de células administrada compreende células NK.102. Método para tratamento de câncer ou de uma doença infecciosa caracterizado pelo fato de que compreende:administrar a um indivíduo com câncer ou uma doença infecciosa uma composição compreendendo uma população expandida de células imunes, em que as referidas células imunes foram expandidas cocultivando as células imunes com uma população de células modificadas, em que a referida população de células modificadas é derivada de uma célula cancerígena, em que a referida população de células modificadas é modificada para expressar a interleucina-15 ligada à membrana (mbIL15), em que a referida população de células modificadas é modificada para expressar o ligante 4-1BB ligado à membrana (4-1BBL), em que a referida população de células modificadas é modificada para expressar um anticorpo anti CD-3, em que a co-cultura da referida população de células modificadas com uma população de células imunes resulta naPetição 870190095719, de 25/09/2019, pág. 116/125
- 23/23 ativação e expansão de pelo menos uma subpopulação de células imunes, e em que a referida pelo menos uma subpopulação de células imunes é administrada ao referido indivíduo.
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