CN105792840A - 细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在细胞表面上共表达第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR的细胞，每个CAR包含：(i)抗原结合域；(ii)间隔区；(iii)跨膜域；和(iv)内域，其中所述第一和第二CAR的抗原结合域结合不同抗原，其中所述第一CAR的间隔区不同于所述第二CAR的间隔区，并且其中第一或第二CAR中的一个是包含活化性内域的活化性CAR，并且另一个CAR是包含连接关闭抑制性内域的抑制性CAR。

Description

细胞
发明领域
本发明涉及包含超过一种嵌合抗原受体(CAR)的细胞。由于靶细胞的两个或更多个抗原的表达(或非表达)的差异模式，所述细胞可以能够特异性识别靶细胞。
发明背景
已经描述了用于癌症治疗的许多免疫治疗剂，包括治疗性单克隆抗体(mAb)，免疫缀合性mAb，放射缀合性mAb和双特异性T细胞结合剂(engager)。
通常，这些免疫治疗剂靶向单一抗原：例如，利妥昔单抗(Rituximab)靶向CD20；Myelotarg靶向CD33；并且阿仑珠单抗(Alemtuzumab)靶向CD52。
然而，单一抗原的存在(或缺乏)有效描述癌症是相对罕见的，这可以导致缺少特异性。
基于单一抗原不能将大多数癌症与正常组织区分。因此，发生相当大的“中靶脱瘤(on-targetoff-tumour)”毒性，由此正常组织被疗法损伤。例如，虽然用利妥昔单抗靶向CD20以治疗B细胞淋巴瘤，但消耗了整个正常B细胞区室，虽然靶向CD52以治疗慢性淋巴细胞性白血病，但消耗整个淋巴样区室，虽然靶向CD33以治疗急性髓样白血病，但损伤了整个髓样区室等。
预测的“中靶脱瘤”毒性的问题已经通过临床试验证实。例如，靶向ERBB2的方法引起具有对肺和肝转移性的结肠癌的患者的死亡。ERBB2在某些患者的结肠癌中过表达，但它也在几种正常组织，包括心脏和正常血管系统上表达。
对于一些癌症，靶向两种癌抗原的存在可以是更具选择性的，因此，比靶向一种有效。例如，B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)是一种常见的白血病，其当前通过靶向CD19治疗。这治疗了淋巴瘤但也消耗了整个B细胞区室，使得治疗具有相当大的毒性效应。B-CLL具有不常见的表型，因为CD5和CD19是共表达的。通过靶向仅表达CD5和CD19的细胞，会有可能大大减少中靶脱瘤毒性。
因此，需要能够更为靶向以反映与许多癌症相关的标志物表达的复杂模式的免疫治疗剂。
嵌合抗原受体(CAR)
嵌合抗原受体是将单克隆抗体(mAb)的特异性嫁接到T细胞的效应子功能的蛋白质。它们通常的形式是I型跨膜域蛋白的形式，具有全部连接到复合内域(胞内域，endodomain)的抗原识别氨基端，间隔区(spacer)，跨膜域，所述内域传送T细胞存活和活化信号(参见图1A)。
这些分子的最常见形式是来源于识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合体，所述单链可变片段通过间隔区和跨膜域融合到信号传导内域。这类分子导致响应scFv对其靶标的识别的T细胞活化。当T细胞表达此种CAR时，它们识别并杀死表达靶抗原的靶细胞。已经开发了针对肿瘤相关抗原的几种CAR，并且使用这样的CAR表达T细胞进行的过继转移方法目前在临床试验中用于各种癌症的治疗中。
然而，CAR表达性T细胞的使用也与中靶脱瘤毒性相关。例如，靶向羧基脱水酶-IX(carboxyanyhydrase-IX)(CAIX)以治疗肾细胞癌的基于CAR的方法导致肝毒性，其被认为是由于特异性攻击胆管上皮细胞引起(Lamersetal(2013)Mol.Ther.21:904-912)。
双重靶向CAR方法
为了解决“中靶脱瘤”毒性的问题，已经开发了具有双重抗原特异性的CART细胞。在“双重靶向”方法中，两个互补CAR共表达在相同的T细胞群中，每个针对远端肿瘤靶标并工程化改造为提供互补信号。
Wlikie等人(2012JClinImmunol32:1059-1070)描述了双重靶向方法，其中ErbB2-和MUC1特异性CAR共表达。ErbB2特异性CAR仅提供CD3ζ信号，并且MUC1特异性CAR仅提供CD28共刺激信号。发现在这两种抗原的存在下出现互补的信号传导，从而导致IL-2产生。然而，当与对照CAR工程化改造的T细胞(其中通过融合的CD28+CD3ζ内域递送信号传导)相比，IL-2的产生是适度的。
Klossetal(2013NatureBiotechnol.31:71-75)描述了类似的方法，其中使用CD-19特异性CAR，其与对PSMA特异性的嵌合共刺激受体组合提供CD3ζ介导的活化信号。使用这种“共同CAR”设计，当CART细胞遇到具有一种抗原的靶细胞时，它接收活化信号，并且当它遇到具有另一种抗原的靶细胞时接收共刺激信号，并且当遇见携带这两种抗原的靶细胞时，它仅接收活化和共刺激信号两者。
这代表将CAR活性限制到仅携带两种抗原的靶细胞的早期尝试。然而这种方法是受限制的：虽然针对表达两种抗原的靶标的CART细胞活性将是最大的，但CART细胞仍然会杀死仅表达由活化性CAR识别的抗原的靶标；此外，共刺激导致对T细胞的延长的效应，其在靶细胞释放后长期持续。因此，例如在以下情况下，针对单个抗原阳性T细胞的活性等于针对双重阳性的活性可以是有可能的：单阳性组织邻近双重阳性肿瘤或在双重阳性肿瘤的迁移路径上。
因此，需要具有降低的中靶脱瘤毒性的改进的基于CAR的治疗方法，其中T细胞活化被完全限制到表达两种抗原的靶细胞上。
附图简述
图1：(a)CAR的一般化结构：结合域识别抗原；间隔区从细胞表面抬高结合域；跨膜域将蛋白质锚定到膜上，并且内域传递信号。(b)至(d)：CAR内域的不同代和排列：(b)起始设计经由FcεR1-γ或CD3ζ内域传递ITAM信号，而后来的设计顺式传递额外的(c)一个或(d)两个共刺激信号。
图2：显示本发明的示意图
本发明涉及工程化T细胞以响应靶细胞抗原表达的逻辑规则。这用设想的FACS散点图最好地例示。靶细胞群表达抗原“A”和“B”中的两种或者一种，或均不表达这两种抗原。不同的靶标群(红色标记)通过用不同门(gate)连接的一对CAR转导的T细胞杀死。用或(OR)门控的受体，将会杀死单阳性和双重阳性细胞两者。用和(AND)门控受体，仅杀死双重阳性靶细胞。用和非(和非)门孔，在单阳性靶标的情况下，双重阳性靶标得到保持。
图3：靶细胞群的产生
SupT1细胞被用作靶细胞。转导这些细胞以表达CD19，CD33或CD19和CD33两者。用适宜的抗体染色靶细胞，并通过流式细胞术分析。
图4：或门的盒设计
单个可读框给这两个CAR提供具有符合读码框的FMD-2A序列，导致两种蛋白质。信号1是来源于IgG1的信号肽(但可以是任何有效的信号肽)。scFv1是识别CD19的单链可变区段(但可以是scFv或肽环或配体或实际上是识别任何期望的任意靶标的任何域)。STK是CD8茎，但可以是任何合适的胞外域。CD28tm是CD28跨膜域，但可以是任何合适的I型蛋白跨膜域，并且CD3Z是CD3Zeta内域，但可以是包含ITAM的任何内域。信号2是来源于CD8的信号肽，但可以是在DNA序列上与信号1不同的任何有效的信号肽。scFv识别CD33，但就scFv1而言是任意的。HC2CH3是人IgG1的铰链-CH2-CH3，但可以是不与第一CAR中使用的隔离区交叉配对的任何胞外域。CD28tm'和CD3Z'与CD28tm和CD3Z编码相同的蛋白质序列但密码子摆动，以防止同源重组。
图5：用于或门的嵌合抗原受体(CAR)的示意图
构建刺激性CAR，其由下列各项组成：N端A)抗CD19scFv域，紧接着是人CD8的胞外铰链区，或B)抗CD33的scFv域，紧接着是人IgG1的胞外铰链区，CH2和CH3区(含有pvaa突变以降低FcR结合)。这两种受体包含人CD28跨膜域和人CD3Zeta(CD247)内域。“S”描述了二硫键的存在。
图6：显示两种CAR在一种T细胞表面上共表达的表达数据。
图7：或门的功能分析
表达或门构建体的效应细胞(5×104细胞)与可变数量的靶细胞共温育，并且在16小时后通过ELISA分析IL-2。图显示来自单独的效应细胞的化学刺激(PMA和离子霉素(lonomycin))的平均最大IL-2分泌和来自三个重复的无任何刺激的效应细胞的平均背景IL-2。
图8：显示用于表达两种和门的盒的两种形式的草图
再一次使用FMD-2A序列共表达活化性和抑制性CAR。信号1是来源于IgG1的信号肽(但可以是任何有效的信号肽)。scFv1是识别CD19的单链可变区段(但可以是scFv或肽环或配体或实际上是识别任何期望的任意靶标的任何域)。STK是CD8茎，但可以是任何不庞大(non-bulky)的胞外域。CD28tm是CD28跨膜域，但可以是任何稳定的I型蛋白跨膜域，并且CD3Z是CD3Zeta内域，但可以是包含ITAM的任何内域。信号2是来源于CD8的信号肽，但可以是DNA序列上与信号1不同的任何有效的信号肽。scFv识别CD33，但就scFv1而言是任意的。HC2CH3是人IgG1的铰链-CH2-CH3，但可以是任意庞大的胞外域。CD45和CD148分别是CD45和CD148的跨膜和内域，但可以来源于任何此类蛋白质。
图9：针对和门的嵌合抗原受体(CAR)的蛋白质结构的示意图。
刺激性CAR由N端抗CD19的scFv域，紧接着是人CD8的胞外茎区，人CD28的跨膜域和人CD3Zeta(CD247)胞内域组成。测试了两种抑制性CAR。这些由以下组成：N端抗CD33的scFv域，紧接着是人IgG1的胞外铰链区，CH2和CH3区(含有pvaa突变以降低FcR结合)，紧接着是人CD148或CD45的跨膜域和胞内域。“S”描述了二硫键的存在。
图10：活化和抑制性CAR的共表达
BW5147细胞被用作效应细胞，并被转导以表达活化抗CD19CAR和抑制性抗CD33CAR之一两者。用CD19-小鼠-Fc和CD33-兔-Fc与合适的二抗染色效应细胞，并通过流式细胞术分析。
图11：和门的功能分析
表达活化抗CD19CAR和具有A)CD148或B)CXD45胞内域的抑制性抗CD33CAR的效应细胞(5×104细胞)与可变数量的靶细胞共温育，并且在16小时后通过ELISA分析IL-2。图显示来自单独的效应细胞的化学刺激(PMA和离子霉素)的最大IL-2分泌和来自三个重复的无任何刺激的效应细胞的背景IL-2。
图12：显示用于产生和非门的三种形式的盒的草图
再一次使用FMD-2A序列共表达活化性和抑制性CAR。信号1是来源于IgG1的信号肽(但可以是任何有效的信号肽)。scFv1是识别CD19的单链可变区段(但可以是scFv或肽环或配体或实际上是识别任何期望的任意靶标的任何域)。STK是人CD8茎，但可以是任何不庞大的胞外域。CD28tm是CD28跨膜域，但可以是任何稳定的I型蛋白跨膜域，并且CD3Z是CD3Zeta内域，但可以是包含ITAM的任何内域。信号2是来源于CD8的信号肽，但可以是DNA序列上与信号1不同的任何有效的信号肽。scFv识别CD33，但就scFv1而言是任意的。muSTK是小鼠CD8茎，但也可以是与活化性CAR的间隔物共定位但不交叉配对的任何间隔区。dPTPN6是PTPN6的磷酸酶域。LAIR1是LAIR1的跨膜域和内域。2Aw是FMD-2A序列的密码子摆动的形式。SH2-CD148是与CD148的磷酸酶域融合的PTPN6的SH2域。
图13：针对非和(NOTAND)门的嵌合抗原受体(CAR)的示意图。
A)刺激性CAR由N端抗CD19的scFv域，紧接着是人CD8的茎区，人CD28的跨膜域和人CD247的胞内域组成。B)抑制性CAR由N端抗CD33的scFv域，紧接着是小鼠CD8的茎区，小鼠CD8的跨膜区和PTPN6的磷酸酶域组成。C)抑制性CAR由N端抗CD33的scFv域，紧接着是小鼠CD8的茎区，和LAIR1的跨膜和胞内区段组成。D)抑制性CAR与前面的CAR相同，只是它与PTPN6SH2域和CD148磷酸酶域的融合蛋白共表达。
图14：非和门的功能分析
表达A)全长SHP-1或B)SHP-1的截短形式的效应细胞(5×104细胞)与可变数量的靶细胞共温育，并且在16小时后通过ELISA分析IL-2。图显示来自单独的效应细胞的化学刺激(PMA和离子霉素)的平均最大的IL-2分泌和来自三个重复的无任何刺激的效应细胞的平均背景IL-2。
图15：或门的氨基酸序列
图16：基于CD148和CD145的和门的氨基酸序列
图17：两种和非(ANDNOT)门的氨基酸序列
图18：和门功能的剖析
A.和门原型显示于右侧，并且其响应于CD19，CD33单阳性靶标和CD19，CD33双重阳性靶标的函数显示于左侧。B.交换scFv，以便活化性内域被CD33触发，并且抑制性内域通过CD19活化。尽管此scFv交换，这种和门仍保持功能性。C.在抑制性CAR的间隔区中，CD8小鼠茎替换了Fc。通过此种修饰，门不能响应CD19单阳性或CD19，CD33双重阳性靶标。
图19：靶抗原在人工靶细胞上的表达
A.显示原始组的来源于SupT1细胞的人工靶细胞的CD19相对于CD33的流式细胞术散点图。从左至右：双阴性SupT1细胞，CD19阳性的SupT1细胞，CD33阳性的SupT1细胞，以及CD19和CD33阳性的SupT1细胞。B.显示产生以测试CD19和GD2门的人工靶细胞的CD19相比于GD2的流式细胞术散点图，从左至右依次为：阴性SupT1细胞，表达CD19的SupT1细胞，用GD2和GM3合酶载体转导从而成为GD2阳性的SupT1细胞，用CD19以及GD2和GM3合酶转导从而成为GD2和CD19阳性的SupT1细胞。C.显示产生以测试CD19和EGFRvIII门的人工靶标的CD19相比于EGFRvIII的流式细胞术散点图。从左至右为：阴性SupT1细胞，表达CD19的SupT1细胞，用EGFRvIII转导的SupT1细胞，和用CD19以及EGFRvIII转导的SupT1细胞。D.显示产生以测试CD19和CD5门的人工靶标的CD19相比于CD5的流式细胞术散点图。从左至右为：阴性293T细胞，用CD19转导的293T细胞，用CD5转导的293T细胞，和用CD5以及CD19载体转导的293T细胞。
图20：和门的一般化(generalizability)
A.和门的草图，其修改为使得第二CAR的特异性从CD33的原始特异性改变以产生3个新的CAR：CD19和GD2,CD19和EGFRvIII,CD19和CD5。B.CD19和GD2AND门：左：显示和门的表达，CD19CAR的重组CD19-Fc染色(x轴)对GD2CAR的抗人Fc染色(Y轴)。右：响应于单阳性和双重阳性靶标的函数。C.CD19和EGFRvIII和门：左：显示了和门的表达，CD19CAR的重组CD19-Fc的染色(x轴)，对针对EGFRvIIICAR的抗人Fc染色(Y轴)。右：响应于单阳性和双重阳性靶标的函数。D.CD19和CD5和门：左：显示了和门的表达，针对CD19CAR的重组CD19-Fc的染色(x轴)对针对CD5CAR的抗人Fc染色(Y轴)。右：响应于单阳性和双重阳性靶标的函数。
图21：和非门的功能
显示了和非门的三种实施方式的功能。经测试的门的草图显示于右侧，并且响应于单阳性和双重阳性靶标的函数显示于左侧。A.基于PTPN6的和非门，其中第一CAR识别CD19，具有人CD8茎间隔区和包含ITAM的活化性内域；与第二CAR共表达，所述第二CAR识别CD33，具有小鼠CD8茎间隔区并具有由PTPN6磷酸酶域构成的内域。B.基于ITIM的和非门与PTPN6门是相同的，只是内域被来自LAIR1的内域取代。C.CD148加强的和非门与基于ITIM的门是相同的，只是表达PTPN6SH2和CD148的内域之间的额外的融合物。所有这三种门如预期地工作，响应CD19而活化，但不响应一起的CD19和CD33。
图22：基于PTPN6的和非门功能的剖析
将原始的基于PTPN6的和非门与几种对照比较来证明该模型。经测试的门的图显示于右侧，响应于单阳性和双重阳性靶标的函数显示于左侧。A.原始的和非门，其中第一CAR识别CD19，具有人CD8茎间隔区和包含ITAM的活化性内域；与第二CAR的共表达，所述第二CAR识别CD33，具有小鼠CD8茎间隔区并具有由PTPN6磷酸酶域构成的内域。B.和非门，其修饰为使得小鼠CD8茎间隔区被替换为Fc间隔区。C.和非门，其修饰为使得PTPN6磷酸酶域被替换为CD148内域。原始的和非门(A.)，功能如预期那样，响应CD19而触发，但不响应CD19和CD33两者。B中的门响应单独的CD19或一起的CD19和CD33而触发。C中的门控不响应一种或两种靶标而触发。
图23：基于LAIR1的和非门的剖析
显示了针对CD19阳性，CD33阳性和CD19，CD33双重阳性靶标的功能活性。A.原始的基于ITIM的和非门的结构和活性。此门由两个CAR组成：第一CAR识别CD19，具有人CD8茎间隔区和含有ITAM的内域；第二CAR识别CD33，具有小鼠CD8茎间隔区和含有ITAM的内域。B基于ITIM的对照门的结构和活性，其中小鼠CD8茎间隔区已经替换成Fc域。此门由两个CAR组成：第一个识别CD19，具有人CD8茎间隔区和含有ITAM的内域；第二CAR识别CD33，具有Fc间隔区和含有ITAM的内域。这两种门响应CD19单阳性靶标，而仅原始门在对CD19和CD33双重阳性靶标的响应中是无活性的。
图24：CAR逻辑门的动力学分离模型
和门、非和门和对照的动力学分离和行为模型。CAR识别CD19或CD33。可以设想免疫突触在代表靶细胞膜的蓝线和代表T细胞膜的红线之间。‘45’是存在于T细胞上的天然CD45蛋白质。‘H8’是具有人CD8茎作为间隔区的CAR胞外域。‘Fc’是具有人HCH2CH3作为间隔区的CAR胞外域。‘M8’是具有鼠CD8茎作为间隔区的CAR胞外域。‘19’表示靶细胞表面上的CD19。‘33’表示在靶细胞表面上的CD33。符号‘⊕’表示包含ITAMS的活化性内域。符号代表具有慢动力学的磷酸酶-‘连接开启’内域，诸如由PTPN6的催化域或ITIM构成的内域。符号表示具有快速动力学的磷酸酶-‘连接关闭’内域，如CD45或CD148的内域。在图中这个符号被放大以强调其强大的活性。
(a)显示推测的功能性和门的行为，所述和门由一对CAR构成，其中第一CAR识别CD19，具有人CD8茎间隔区和活化性内域；并且第二CAR识别CD33，具有Fc间隔区和CD148内域。
(b)显示推测的对照和门的行为。此处，第一CAR识别CD19，具有人CD8茎间隔区和活化性内域；并且第二CAR识别CD33，但具有小鼠CD8茎间隔区和CD148内域。
(c)显示功能性和非门的行为，所述和非门由一对CAR构成，其中第一CAR识别CD19，具有人CD8茎间隔区和活化性内域；并且第二CAR识别CD33，具有小鼠CD8茎间隔区和PTPN6内域。
(d)显示推测的对照和非门的行为，所述对照和非门由一对CAR构成，其中第一CAR识别CD19，具有人CD8茎间隔区和活化性内域；并且第二CAR识别CD33，但具有Fc间隔区和PTPN6内域。
在第一列中，靶细胞是CD19和CD33阴性的。在第二列中，靶标是CD19阴性和CD33阳性的。在第三列中，靶细胞是CD19阳性和CD33阴性的。在第四列中，靶细胞是CD19和CD33阳性的。
图25：基于APRIL的CAR的设计。
修饰CAR设计，使得scFv被替换为增殖诱导配体(APRIL)的修饰形式，其与BCMA，TACI和蛋白聚糖相互作用以起抗原结合域作用：APRIL是截短的以使蛋白聚糖结合的氨基端不存在。然后，将信号肽连接至截短的APRIL氨基端，以将蛋白质导向到细胞表面。产生了三种具有这种基于APRIL的结合域的CAR：A.在第一CAR中，人类CD8茎域用作间隔域。B.在第二CAR中，来自IgG1的铰链用作间隔域。C.在第三CAR中，使用修饰为具有由Hombachetal(2010GeneTher.17:1206-1213)描述的pva/a突变以降低Fc受体结合的人IgG1的铰链，CH2和CH3域作为间隔区(因此称作Fc-pvaa)。在全部CAR中，这些间隔区连接至CD28跨膜域，然后连接至含有CD28，OX40和CD3-Zeta内域的融合物的三部分内域(Puleetal,Moleculartherapy,2005:Volume12；Issue5；Pages933-41)。
图26：注释的上述三种APRIL-CAR的氨基酸序列
A:显示注释的CD8茎APRILCAR的氨基酸序列；B：显示注释的基于APRILIgG1铰链的CAR的氨基酸序列；C：显示注释的基于APRILFc-pvaa的CAR的氨基酸序列。
图27：基于APRIL的不同CAR的表达和配体结合
A.在逆转录病毒基因载体中受体与标记基因截短的CD34共表达。标记基因在经转导的细胞上的表达允许转导的确认。B.用具有CD8茎间隔区，IgG1的铰链或Fc间隔区的基于APRIL的CAR转导T细胞。为测试这些受体是否可以在细胞表面上稳定表达，然后用抗APRIL-生物素/链霉亲合素APC和抗CD34染色T细胞。进行流式细胞分析。在细胞表面上在三种CAR中同等地检测到APRIL，提示它们是同等稳定地表达。C.接着，测定了CAR识别TACI和BCMA的能力。用融合至小鼠IgG2aFc融合物的重组BCMA或TACI以及抗小鼠二抗和抗CD34染色经转导的T细胞。所有三种受体形式显示结合BCMA和TACI两者。惊奇的发现是与BCMA的结合看起来强于与TACI的结合。另一个惊奇的发现是，虽然这三种CAR都同等地表达，CD8茎和IgG1铰链CAR显示比具有Fc间隔区的CAR更好地识别BCMA和TACI。
图28：不同CAR构建体的功能
用三种不同的基于APRIL的CAR进行了功能测定。正常供体外周血T细胞未转导(NT)，或经转导以表达不同的CAR。使用相同滴度的上清液进行转导。然后消耗这些T细胞的CD56以除去非特异性NK活性并用作效应物。将未转导的SupT1细胞(NT)或者经转导以表达BCMA或TACI的SupT1细胞用作靶标。显示的数据是来自5个独立实验的平均值和标准偏差。A.使用铬释放测定BCMA和TACI表达T细胞的特异性杀伤。B.也测定了干扰素μ的释放。以1:1的比例共培养靶标和效应物。24小时后，通过ELISA测定在上清液中的干扰素μ。CART细胞的增殖/存活也通过计数再温育6天的相同共培养物中的CAR的T细胞的数量确定。全部3种CAR直接响应表达BCMA和TACI的靶标。对BCMA的响应比对TACI的响应强。
图29：和门在原代细胞中的功能性
从血液中分离PBMC，并使用PHA和IL-2刺激。两天后，在Retronectin包被的板上用含有CD19:CD33和门构建体的逆转录病毒转导细胞。在第5天，通过流式细胞术评估了由和门构建体翻译的两种CAR的表达水平并且对细胞消耗了CD56+细胞(主要是NK细胞)。在第6天，以1:2的效应物比靶细胞的比例使PBMC与靶细胞共培养。在第8天收集上清液并通过ELISA分析IFN-γ的分泌。
图30：显示了大小增加的可能间隔区域的选择/层次。提示CD3-Zeta的胞外域是最短的可能的间隔区，其次是(b)IgG1的铰链。(c)认为鼠或人CD8茎和CD28胞外域是在大小和共分离方面是中等的。(d)IgG1的铰链、CH2和CH3域较大并且较庞大，和(e)IgM的铰链，CH2，CH3和CH4域也较大。考虑靶标分子的性质和在所述靶标分子上的结合域的表位，有可能使用间隔区的这种层次来创建突触形成后共分离或分离的CAR信号转导系统。
图31：用于构建逻辑门控CART细胞的设计规则。
用草图形式显示或、和非及和门控的CAR，其中靶细胞在顶端，T细胞在底部，突触在中间。靶细胞表达任意的靶抗原A和B。
T细胞表达两种CAR，其由抗A和抗B识别域，间隔区和内域构成。或门要求(1)仅间隔区，其允许抗原识别和CAR活化，和(2)两种CAR以具有活化性内域；和非门需要(1)间隔区，其在识别两种抗原后导致两种CAR的共分离和(2)具有活化性内域的一种CAR，和其内域包含或募集弱磷酸酶的另一种CAR；和门需要(1)间隔区，其导致在识别两种抗原后两种CAR分离成免疫突触的不同部分，和(2)具有活化性内域的一种CAR，和其内域包含强的磷酸酶的另一种CAR。
发明概述
本发明人已经开发了一组“逻辑门控”嵌合抗原受体对，它们当通过细胞(如T细胞)表达时能够检测至少两个靶抗原表达的特定模式。如果至少两个靶抗原任意地表示为抗原A和抗原B，三个可能的选项如下：
“或门(ORGATE)”：当抗原A或抗原B存在于靶细胞上时T细胞触发
“和门(ANDGATE)”：只有当两种抗原A和B都存在于靶细胞上时，T细胞触发
“和非门”：如果仅抗原A存在于靶细胞上，T细胞触发，但如果这两种抗原A和B都存在于靶细胞上，T细胞不会触发
可以基于两个或更多个标记物的其特定的表达(或表达缺乏)，调整表达这些CAR组合的工程化改造的T细胞，以对癌细胞敏锐特异性的。
因此，在第一方面，本发明提供细胞，其在细胞表面上共表达第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，每一CAR包含：
(i)抗原结合域；
(ii)间隔区；
(iii)跨膜域；和
(iv)胞内T细胞信号传导域(内域)
其中第一和第二CAR的抗原结合域结合不同抗原，其中第一CAR的间隔区不同于第二CAR的间隔区，使得第一CAR和第二CAR不形成异二聚体，并且其中第一或第二CAR中的一个是包含活化性细胞内T细胞信号传导域的活化性CAR，并且另一个CAR是包含“连接关闭”(如本文定义)抑制性细胞内T细胞信号传导域的抑制性CAR。
细胞可以是免疫效应细胞，如T细胞或天然杀伤(NK)细胞。本文提及的与T细胞相关的特征同样适用于其它免疫效应细胞，如NK细胞。
第一CAR的间隔区可以具有与第二CAR的间隔区不同的长度和/或电荷和/或形状和/或构造和/或糖基化，使得当第一CAR和第二CAR结合它们各自的靶抗原时，第一CAR和第二CAR在T细胞膜上变得空间分离。第一CAR和第二CAR与它们各自抗原的连接导致它们在免疫突触上一起或分开区室化，从而导致活化的控制。当考虑T细胞活化的动力学分离模型时，这是可以理解的(见下文)。
第一间隔区或第二间隔区可以包含CD8茎，并且另一个间隔区可以包含IgG1的铰链，CH2和CH3域。
在涉及“和”门的本发明中，第一CAR或第二CAR中的一个是包含活化性内域的活化性CAR，而另一个CAR是包含抑制性内域的“连接关闭”抑制性CAR。在不存在抑制性CAR连接时，连接关闭抑制性CAR抑制通过活化性CAR的T-细胞活化，当连接抑制性CAR时，抑制性CAR不会通过显著抑制活化性CAR的T-细胞活化。
由于第一CAR的间隔区具有与第二CAR的间隔区不同的长度和/或电荷和/或形状和/或构造和/或糖基化，当两个CAR连接时，它们会分离。这导致抑制性CAR与活化性CAR在空间上分离，以便可以发生T细胞的活化。因此T细胞的活化仅响应具有两种相关抗原的靶细胞而发生。
抑制性内域可以包括来自受体样酪氨酸磷酸酶，如CD148或CD45的内域的全部或一部分。
第一CAR的抗原结合域可以结合CD5，而第二CAR的抗原结合域可以结合CD19。这是利用靶向慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。这种疾病可以通过仅靶向CD19治疗，但存在消耗整个B细胞区室的成本。CLL细胞是少见的，因为它们共表达CD5和CD19。用和门靶向这对抗原将增加特异性和降低毒性。
在第二方面，本发明提供核酸序列，其编码在本发明的第一方面所定义的第一和第二嵌合抗原受体(CAR)两者。
相应的核酸序列可以具有以下结构：AgB1-间隔区1-TM1-endo1-coexpr-AgB2-间隔区2-TM2-endo2
其中，
AgB1是编码第一CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码第一CAR的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码第一CAR的内域的核酸序列；
coexpr是允许两个CAR共表达的核酸序列(例如，切割位点)；
AgB2是编码第二CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码第二CAR的跨膜域的核酸序列；
endo2是编码第二CAR的内域的核酸序列；
其中当在T细胞中表达时，所述核酸序列编码的多肽在切割位点被切割，使得第一和第二CAR共表达在T细胞的表面上。
允许两个CAR共表达的核酸序列可编码自我切割肽或序列(其是允许共表达两个CAR的备选手段)例如内部核糖体进入序列或2nd启动子或其他这样的手段，由此本领域技术人员可以从同一载体表达两种蛋白质。
备选的密码子可以用于编码相同或相似的氨基酸序列的序列区，以避免同源重组。
在第三方面，本发明提供试剂盒，其包含
(i)第一核酸序列，其编码在本发明的第一方面所定义的第一嵌合抗原受体(CAR)，所述核酸序列具有以下结构：
AgB1-间隔区1-TM1-endo1
其中，
AgB1是编码第一CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码第一CAR的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码第一CAR的内域的核酸序列；和
(ii)第二核酸序列，其编码在本发明的第一方面所定义的第二嵌合抗原受体(CAR)，所述核酸序列具有以下结构：
AgB2-间隔区2-TM2-endo2
其中，
AgB2是编码第二CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码第二CAR的跨膜域的核酸序列；
endo2是编码第二CAR的内域的核酸序列。
在第四方面，本发明提供试剂盒，其包含：第一载体，其包含如上定义的第一核酸序列；和第二载体，其包含如上定义的第一核酸序列。
载体可以是质粒载体，逆转录病毒载体或转座子载体。载体可以是慢病毒载体。
在第五方面，本发明提供载体，其包含根据本发明的第二个方面的核酸序列。载体可以是慢病毒载体。
载体可以是质粒载体，逆转录病毒载体或转座子载体。
在第六个方面，本发明涉及以下述方式共表达超过两个(morethantwo)CAR，使得在靶细胞上可以识别超过两种抗原的复杂模式。
在第七方面，本发明提供了制备根据本发明的第一方面的T细胞的方法，其包括将编码第一和第二CAR的一个或多个核酸序列或如上定义的一种或多种载体导入T细胞的步骤。
T细胞可以来自从患者，相关的或不相关的造血移植供体，完全不相关的供体，从脐带血分离的样品，或从胚胎细胞系分化，从诱导的祖细胞系分化，或来源于经转化的T细胞系。
在第八方面，本发明提供了包含根据本发明的第一方面的多个T细胞的药物组合物。
在第九方面，本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据本发明的第八方面的药物组合物施用于受试者的步骤。
该方法可以包括以下步骤：
(i)分离如上列出的T细胞。
(ii)用编码第一和第二CAR的一种或多种核酸序列或包含此种核酸序列的一种或多种载体转导或转染所述T细胞；和
(iii)将来自(ii)的T细胞施用于受试者。
疾病可以是癌症。
在第十个方面，本发明提供根据本发明的第八方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
疾病可以是癌症。
在第十一方面，本发明提供根据本发明第一方面的T细胞的用途，用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物。
疾病可以是癌症。
本发明还提供了核酸序列，其包含：
a)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核苷酸序列；
b)编码第二CAR的第二核苷酸序列；
c)编码位于第一和第二核苷酸序列之间的自我切割肽的序列，从而使得两个CAR被表达为单独的实体。
备选密码子可以用于编码相同或相似氨基酸序列的区域中的第一和第二核苷酸序列中的一个或多个部分。
本发明还提供此类核酸的载体和细胞。
本发明的基于动力学分离的和门提供了相比于先前描述的“共CAR”的显著的技术优势，所述“共CAR”也就是说其中两个抗原通过将活化或共刺激信号提供给T细胞的两个CAR识别的双靶向方法。
使用共CAR方法，尽管可以预期针对具有两种抗原的靶细胞的最大活性，但也可以预期针对仅具有通过活化性CAR识别的抗原的组织的相当大的活性。可以预期这种活性至少是第一代CAR的活性。第一代CAR已经造成了相当大的毒性：例如在识别碳酸酐酶IX的第一代CAR的临床试验中观察到胆毒性，所述碳酸酐酶IX出乎意料地表达在胆上皮上(Rotterdamref)。值得注意的是，终末分化的效应物不需要或响应共刺激信号，所以尽管缺少共刺激CAR信号，但任何终末分化的CART细胞会最大限度地发挥作用。
此外，共刺激信号导致对T细胞群体的长期效应。这些效应长过T细胞/靶突触的相互作用。因此，在肿瘤内完全活化并且迁移的CART细胞可以具有针对具有单抗原的正常组织的最大限度的有力活性。这种“溢出(spill-over)”效应可能是在肿瘤内，肿瘤附近或从肿瘤排出的组织内是最明显的。事实上，已经提出并测试了基于通过共刺激信号增强第一代CAR活性的概念的策略，所述共刺激信号未衔接CAR活化而是通过不同的受体(strategiesbasedontheconceptoftheactivityofafirstgenerationCARbeingenhancedbyco-stimulatorysignalsengagednotCARactivationbutthroughadistinctreceptor,havebeenproposedandtested)(Rossig,Blood.2002Mar15；99(6):2009-16.)。
因此可以预期共CAR的方法最优地会导致针对表达单一抗原的正常组织的毒性的减少但不会消除毒性。本发明使用在T细胞/靶细胞之间形成的免疫突触处的动力学分离以调节T细胞自身触发。因此在不存在第二抗原的情况下，实现了触发的紧密完全控制。因此全部T细胞活化被限制到表达两种抗原的靶细胞上，和门应当发挥作用，这与效应细胞类型或分化状态无关，并且没有“溢出”效应，和门T细胞活化是可能的。
本发明的其它方面
本发明还涉及在下述编号的段落中列出的方面：
1.T细胞，其在细胞表面上共表达第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，每一CAR包含：
(i)抗原结合域；
(ii)间隔区
(iii)跨膜域；和
(iv)内域
其中所述第一和第二CAR的抗原结合域结合不同抗原，其中所述第一CAR的间隔区不同于所述第二CAR的间隔区，并且其中第一或第二CAR中的一个是包含活化内域的活化性CAR，并且另一个CAR是包含活化内域的活化性CAR或包含连接开启或连接关闭的抑制性内域的抑制性CAR。
2.根据段1的T细胞，其中第一CAR的间隔区具有与第二CAR的间隔区不同的长度和/或电荷和/或大小和/或构造和/或糖基化，使得当第一CAR和第二CAR结合它们各自的靶抗原时，第一CAR和第二CAR在T细胞膜上是空间上分离的。
3.根据段2的T细胞，其中第一间隔区或第二间隔区包含CD8茎，并且另一个间隔区包含IgG1的铰链，CH2和CH3域。
4.根据段1的T细胞，其中第一CAR和第二CAR是活化性CAR。
5.根据段4的T细胞,其中一种CAR结合CD19，并且另一种CAR结合CD20。
6.根据段2或3的T细胞，其中第一CAR或第二CAR中的一个是包含活化内域的活化性CAR，和另一个CAR是包含连接关闭的抑制性内域的抑制性CAR，在不存在抑制性CAR连接时，所述抑制性CAR抑制通过活化性CAR的T-细胞活化，当连接抑制性CAR时，抑制性CAR不会显著地抑制通过活化性CAR的T-细胞活化。
7.根据段6的T细胞，其中抑制性内域包含来自CD148或CD45的内域的全部或部分。
8.根据段6或7的T细胞，其中第一CAR的抗原结合域结合CD5和第二CAR的抗原结合域结合CD19。
9.根据段1的T细胞，其中第一和第二间隔区是足够不同的，从而防止第一和第二CAR的交叉配对，但足够相似以导致第一和第二CAR在连接后的共定位。
10.根据段9的T细胞，其中第一CAR或第二CAR中的一个是包含活化内域的活化性CAR，和另一个CAR是包含连接开启的抑制性内域的抑制性CAR，在不存在抑制性CAR连接时，所述抑制性CAR不会显著地抑制通过活化性CAR的T-细胞活化，当连接抑制性CAR时，抑制性CAR抑制通过活化性CAR的T-细胞活化。
11.根据段10的T细胞，其中所述连接开启的抑制性内域包含磷酸酶的至少一部分。
12.根据段11的T细胞，其中所述连接开启的抑制性内域包含PTPN6的全部或部分。
13.根据段10的T细胞，其中所述连接开启的抑制性内域包含至少一种ITIM域。
14.根据段13的T细胞，其中所述连接开启的抑制性内域的活性通过PTPN6-CD45或CD148融合蛋白的共表达而增强。
15.根据段10-14中任一项的T细胞，其中所述包含活化内域的CAR包含结合CD33的抗原结合域，并且包含连接开启的抑制性内域的CAR包含结合CD34的抗原结合域。
16.T细胞，其包含如前述段落中定义的两种以上的CAR，使得所述CAR被具有两种以上抗原的不同模式的细胞，如T细胞特异性刺激。
17.核酸序列，其编码如段1-16中之一所定义的第一和第二嵌合抗原受体(CAR)。
18.根据段7的核酸序列，其具有以下结构：
AgB1-间隔区1-TM1-endo1-coexpr-AgB2-间隔区2-TM2-endo2
其中，
AgB1是编码第一CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码第一CAR的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码第一CAR的内域的核酸序列；
coexpr是使两个CAR共表达的核酸序列；
AgB2是编码第二CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码第二CAR的跨膜域的核酸序列；
endo2是编码第二CAR的内域的核酸序列；
其中当在T细胞中表达时，所述核酸序列编码的多肽在切割位点被切割，使得第一和第二CAR共表达在T细胞的表面上。
19.根据段18的核酸序列，其中所述coexpr编码包含自我切割肽的序列。
20.根据段18或19的核酸序列，其中备选密码子用于编码相同或相似的氨基酸序列的序列区，以避免同源重组。
21.试剂盒，其包含
(i)第一核酸序列，其编码段1-16中之一所定义的第一嵌合抗原受体(CAR)，所述核酸序列具有以下结构：
AgB1-间隔区1-TM1-endo1
其中，
AgB1是编码第一CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码第一CAR的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码第一CAR的内域的核酸序列；和
(ii)第二核酸序列，其编码段1-16中之一所定义的第二嵌合抗原受体(CAR)，所述核酸序列具有以下结构：
AgB2-间隔区2-TM2-endo2
其中，
AgB2是编码第二CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码第二CAR的跨膜域的核酸序列；
endo2是编码第二CAR的内域的核酸序列。
22.试剂盒，其包含：第一载体，其包含如段21定义的第一核酸序列；和第二载体，其包含如段21定义的第一核酸序列。
23.根据段22的试剂盒，其中所述载体是整合型病毒载体或转座子。
24.载体，其包含根据段17-20中任一项所定义的的核酸序列。
25.根据段24的逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。
26.制备根据段1-16中任一项的T细胞的方法，其包括将根据段17-20中任一项的核酸序列，如段21中定义的第一核酸序列和第二核酸序列；和/或如段22中定义的第一载体和第二载体或根据段24或25的载体导入T细胞的步骤。
27.根据段24的方法，其中所述T细胞来自从受试者分离的样品。
28.药物组合物，其包含根据段1-16中任一项的多种T细胞。
29.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据段28的药物组合物施用于受试者的步骤。
30.根据段29的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者分离包含T细胞的样品。
(ii)用根据段17-20中任一项的核酸序列，如段21中定义的第一核酸序列和第二核酸序列；和/或如段22或23中定义的第一载体和第二载体或根据段24或25的载体转导或转染所述T细胞；和
(iii)将来自(ii)的T细胞施用于受试者。
31.根据段29或30的方法，其中所述疾病是癌症。
32.根据段28的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
33.根据段1-16中任一项的T细胞用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物的用途。
发明详述
嵌合抗原受体(CAR)
在图1中示意性显示的CAR是嵌合的I型跨膜蛋白质，其将胞外抗原识别域(结合剂)连接至胞内信号传导域(内域)。结合剂通常为来源于单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但它可以是基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式。为将结合剂与膜分离并允许它具有合适的方向，间隔域通常是必需的。常用的间隔域是IgG1的Fc。取决于抗原，更紧凑的间隔区可以足够，例如来自CD8α的茎和甚至是仅IgG1的铰链。跨膜域将蛋白质锚定在细胞膜中，并将间隔区连接至内域。
早期的CAR设计具有来源于FcεR1或CD3ζ的γ链的细胞内部分的内域。因此，这些第一代受体传输免疫信号1，其足以触发相关靶细胞的T细胞杀死，但未能充分活化T细胞以增殖和存活。为了克服此限制，已构建了复合内域：T细胞共刺激分子的胞内部分与CD3ζ的胞内部分的融合导致了可在抗原识别后同时传输活化和共刺激信号的第二代受体。最常使用的共刺激域是CD28的共刺激域。这提供最有效的共刺激信号-即触发T细胞增殖的免疫信号2。也已经描述了包括TNF受体家族内域的一些受体，例如密切相关的传输存活信号的OX40和41BB。甚至现在已经描述了更强大的第三代CAR，其具有能够传输活化，增殖和存活信号的内域。
使用例如逆转录病毒载体可以将CAR编码核酸转移到T细胞。可使用慢病毒载体。通过这种方式可产生用于过继性细胞转移的大量的癌特异性T细胞。当CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输到表达所述CAR的T细胞上。因此，CAR指导T细胞的针对表达靶抗原的肿瘤细胞的特异性和细胞毒性。
本发明的第一方面涉及共表达第一CAR和第二CAR的T细胞，使得T细胞可以以在真值表(truthtable)(表1，2和3)中详细描述的逻辑门的方式识别靶细胞上表达的所希望的模式。
第一CAR和第二CAR两者(和任选地后来的CAR)包含：
(i)抗原结合域；
(ii)间隔区
(iii)跨膜域；和
(iv)胞内域。
表1：CAR或门的真值表
抗原A 抗原B 响应
不存在 不存在 未活化
不存在 存在 活化
存在 不存在 活化
存在 存在 活化
表2：CAR和门的真值表
抗原A 抗原B 响应
不存在 不存在 未活化
不存在 存在 未活化
存在 不存在 未活化
存在 存在 活化
表3：CAR和非门的真值表
本发明的T细胞的第一和第二CAR可以产生为包含两个CAR和切割位点的多肽。
SEQIDNo.1-5给出了这样的多肽的实例，其中每一个包含两个CAR。因此，CAR可包含对应于单个CAR的以下氨基酸序列中的一个或其它部分。
SEQIDNo1是识别CD19或CD33的CAR或门。
SEQIDNo2是使用CD148磷酸酶识别CD19和CD33的CAR和门。
SEQIDNo3是使用CD45磷酸酶识别CD19和CD33的CAR和门的备选实施方式。
SEQIDNo4是基于PTPN6磷酸酶识别CD19和非CD33的CAR和非门。
SEQIDNo5是识别CD19和非CD33的CAR和非门的备选实施方式并且基于来自LAIR1的含有ITIM的内域。
SEQIDNo6是识别CD19和非CD33的CAR和非门的其他备选实施方式并且募集PTPN6-CD148融合蛋白至含有ITIM的内域。
SEQIDNo.1
MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQIDNo.2
MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA
SEQIDNo.3
MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKALIAFLAFLIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVPLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS
SEQIDNo.4
MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPATTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYWAPLAGICVALLLSLIITLICYHRSRKRVCKSGGGSFWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVPSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQFIETTKKKL
SEQIDNo.5
MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPATTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDILIGVSVVFLFCLLLLVLFCLHRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARH
SEQIDNo.6
MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPATTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDILIGVSVVFLFCLLLLVLFCLHRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARHRAEGRGSLLTCGDVEENPGPWYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYSGGGGSFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIASGS
CAR可以包含如SEQIDNo.1,2,3,4,5或6中所示序列的CAR编码部分的变体，其具有至少80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性，条件是变体序列是具有所需性质的CAR。
序列比对的方法是本领域是公知的，并且使用合适的比对程序来完成。％序列同一性指的是当在最佳比对两个序列时，它们中相同的氨基酸或核苷酸残基的百分比。可使用标准算法诸如BLAST程序(在国家生物技术信息中心基本局部比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchToolattheNationalCenterforBiotechnologyInformation))使用默认参数确定核苷酸和蛋白质序列的同源性或同一性，这在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov是可公开获得的。用于确定序列同一性或同源性的其它算法包括：LALIGN(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/和http://www.ebi.ac.uk/Tools/ psa/lalign/nucleotide.html),AMAS(多比对序列分析(AnalysisofMultiplyAlignedSequences),在http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/Amas/amas.html),FASTA(http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/),ClustalOmega(http://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/),SIM(http://web.expasy.org/sim/),andEMBOSSNeedle(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)。
CAR逻辑或门
在本实施方案中，本发明的第一和第二CAR的抗原结合域结合不同的抗原并且两个CAR均包含活化内域。两个CAR具有不同的间隔区域以防止两个不同受体的交叉配对。因此可以工程化改造T细胞以在识别任一个或两个抗原后活化。如Goldie-Coldman假说所指示的，这在肿瘤学领域是有用的：由于在大多数癌症中所固有的高突变率，单一抗原的单一靶向可以导致通过调制所述抗原进行肿瘤逃逸。通过同时靶向两种抗原，此种逃逸的概率可以成指数地减少。
如下表4中所示，各种肿瘤相关抗原是已知的。对于给定的疾病，第一CAR和第二CAR可以结合到与该疾病相关的两个不同的TAA。以这种方式，由于第二抗原也被靶向，防止了通过调控单一抗原进行的肿瘤逃逸。例如，当靶向B细胞恶性肿瘤时，可同时靶向CD19和CD20两者。在本实施方案中，这两个CAR不异二聚体化是重要的。
表4
癌症类型 TAA
弥漫性大B细胞淋巴瘤 CD19,CD20
乳腺癌 ErbB2,MUC1
AML CD13,CD33
神经母细胞瘤 GD2,NCAM
B-CLL CD19,CD52
大肠癌 叶酸结合蛋白,CA-125
动力学分离模型
产生和门及和非门的CAR的随后配对是基于T细胞活化的动力学分离模型(KS)。这是由实验数据支持的功能性模型，其解释了如何将通过T细胞受体进行的抗原识别转换成下游活化信号。简要地：在基态下，在T细胞膜上的信号传导组分处于动态平衡，由此相比于磷酸化ITAM，有利于脱磷酸化ITAM。这是由于跨膜CD45/CD148磷酸酶比膜栓系(membrane-tethered)激酶例如lck更大的活性。当T细胞通过相关抗原的T细胞受体(或CAR)识别而衔接靶细胞时，形成了紧密的免疫突触。T细胞和靶标膜的这种紧密并置排除了CD45/CD148，这是因为它们的不能装配到突触中的较大胞外域。在无磷酸酶的存在下，高浓度的T细胞受体相关ITAM和激酶在突触中的分离导致了有利于磷酸化ITAM的状态。ZAP70识别磷酸化ITAM的阈值并且传播T细胞活化信号。本发明利用了T细胞活化的这种先进的见解。具体而言，本发明是基于这样的见解：不同长度和/或体积和/或电荷和/或构造和/或糖基化的胞外域如何在突触形成后导致差别分离。
CAR逻辑和门
在本实施方案中，一个CAR包含活化性内域，并且一个CAR包含抑制性内域，其中抑制性CAR组成性抑制第一活化性CAR，但在识别其相关抗原后解除其对活化性CAR的抑制。以这种方式，可以工程化改造T细胞，从而仅当靶细胞表达两种相关抗原时触发。此行为是由包含含有ITAM域的活化性内域(例如CD3Zeta内域)的活化性CAR和包含来自能够使ITAM脱磷酸的磷酸酶的内域(例如CD45或CD148)的抑制性CAR实现的。关键的是，两个CAR的间隔区域在大小和/或形状和/或电荷等方面显著地不同。当仅连接活化性CAR时，抑制性CAR在T细胞表面上在溶液中(insolution)，并可以在抑制活化性CAR的突触中扩散并且扩散出抑制活化性CAR的突触。当连接这两个CAR时，由于间隔区性质的差异，活化和抑制性CAR被差异地分开，从而允许活化性CAR触发T细胞活化而不会受抑制性CAR的阻碍。
这是在癌症治疗领域相当有用的。目前，免疫疗法一般靶向单一抗原。大多数癌症基于单一抗原不能与正常组织区分。因此，发生大量的“中靶脱瘤”毒性，由此使正常组织被治疗损伤。例如，虽然用利妥昔单抗靶向CD20以治疗B细胞淋巴瘤，但消耗了整个正常B细胞区室。例如，虽然靶向CD52以治疗慢性淋巴细胞性白血病，但消耗整个淋巴样区室。例如，虽然靶向CD33以治疗急性髓样白血病，但损伤了整个髓样区室等。通过将活性限制到一对抗原上，可以开发精细多得多的靶向和因此毒性较低的治疗。实际的实例是靶向同时表达CD5和CD19的CLL。仅正常B细胞的一小部分表达这两种抗原，因此用逻辑和门靶向这两种抗原的脱靶毒性实质性小于单独靶向每种抗原。
本发明的设计相对于Wilkieetal.((2012).J.Clin.Immunol.32,1059–1070)描述和之后在体内测试的(Klossetal(2013)Nat.Biotechnol.31,71–75)的先前的实施方式是相当大的改进。在本实施方式中，第一CAR包含(comprisesof)活化性内域，并且第二CAR包含共刺激域。以此方式，当两种抗原都存在时，T细胞只接收活化和共刺激信号。然而，在仅存在第一抗原的情况下，T细胞将仍然活化，这导致潜在的脱靶毒性。另外，本发明的实施方式允许多个复合连接门(compoundlinkedgate)，由此细胞可以解读抗原的复杂模式。
表5
CAR逻辑和非门
在本实施方案中，一个CAR包含活化性内域，并且一个CAR包含抑制性内域，使得此抑制性CAR仅在它识别其相关抗原时活化。因此，以这种方式工程化改造的T细胞响应第一抗原的单独存在而活化，但在两种抗原均存在时不被活化。本发明是通过具有与第一CAR共定位的间隔区的抑制性CAR实施的，但抑制性CAR的磷酸酶活性应当不是如此有力的，以致于它在溶液中抑制，或仅当抑制性CAR识别其相关靶标时，抑制内域实际上募集磷酸。这种内域在本文被称为“连接开启”或半抑制。
当通过肿瘤相关抗原的存在和在正常组织表达的抗原的丢失可以区分肿瘤和正常组织时，本发明在改善靶向中是有用的。和非门在肿瘤学领域中是相当有用的，因为它允许靶向由正常细胞表达的抗原，所述正常细胞也表达包含活化性内域的CAR识别的抗原。这种抗原的实例是CD33，其是由正常干细胞和急性髓样白血病(AML)细胞表达。CD34在干细胞上表达，但通常不在AML细胞上表达。识别CD33和非CD34的T细胞将导致白血病细胞的破坏，但节约了(spareof)正常干细胞。
用于与和非门一起使用的潜在抗原对显示于表6。
表6
复合门(compoundgate)
具有上述组份的动力学分离模型允许制备复合门，例如响应超过两个靶抗原的模式而触发的T细胞。例如，有可能制备仅当3种抗原存在(A和B和C)时触发的T细胞。此处，细胞表达3个CAR，各自识别抗原A，B和C。一个CAR是兴奋性的(excitatory)，并且两个是抑制性的，其中的每个CAR具有导致差别分离的间隔区域。只有当连接所有三个时，T细胞会活化。另一个实例：(A或B)和C：此处，识别抗原A和B的CAR在活化，并具有共定位的间隔区，而识别抗原C的CAR是抑制性的并且具有导致差别共分离的间隔区。另一个实例(A和非B)和C：此处，针对抗原A的CAR具有活化性内域并且与针对抗原B的具有条件性抑制性内域的CAR共定位。针对抗原C的CAR具有与A或B差别分离的间隔区并且是抑制性的。事实上，甚至更复杂的布尔(boolean)逻辑可以用本发明的这些简单的组分与具有任何数量的CAR和间隔区一起进行编程。
信号肽
本发明的T细胞的CAR可以包含信号肽使得当CAR在细胞，如T细胞内表达时，初生蛋白被引导至内质网并随后引导至其表达的细胞表面上。
信号肽的核心可含有一段长的疏水性氨基酸，其具有形成单个α-螺旋的倾向。信号肽可以起始于短的带正电的一段氨基酸，这有助于在移位期间实施多肽的合适的拓扑学。在信号肽的末端通常有被信号肽酶识别和切割的一段氨基酸。信号肽酶可以在移位期间或完成移位之后切割以产生游离的信号肽和成熟蛋白。然后游离的信号肽被特定的蛋白酶消化。
信号肽可以是在分子的氨基末端。
信号肽可包含SEQIDNo.7,8或9或其变体，所述变体具有5，4，3，2或1个氨基酸突变(插入，取代或添加)，条件是信号肽仍然行使导致CAR的细胞表面表达的功能。
SEQIDNo.7:MGTSLLCWMALCLLGADHADG
SEQIDNo.7的信号肽是紧凑和高效的。预测通过信号肽酶在末端甘氨酸后产生约95％的切割，产生有效的移除。
SEQIDNo.8:MSLPVTALLLPLALLLHAARP
SEQIDNo.8的信号肽来源于IgG1。
SEQIDNo.9:MAVPTQVLGLLLLWLTDARC
SEQIDNo.9的信号肽来源于CD8。
第一CAR的信号肽可以具有与第二CAR(和第三CAR和第四CAR等)的信号肽不同的序列。
抗原结合域
抗原结合域是CAR的识别抗原的部分。众多的抗原结合域是本领域公知的，包括基于抗体，抗体模拟物和T细胞受体的抗原结合位点的那些抗原结合域。例如，抗原结合域可以包含：由单克隆抗体衍生的单链可变片段(scFv)；靶抗原的天然配体；具有针对靶标的足够亲和性的肽；单域抗体；人工单结合剂诸如Darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)；或T细胞受体衍生的单链。
抗原结合域可包含不基于抗体的抗原结合位点的域。例如，抗原结合域可包含基于蛋白质/肽的域，所述蛋白质/肽为肿瘤细胞表面受体的可溶性配体(例如可溶性肽，如细胞因子或趋化因子)；或膜锚定配体或者受体的胞外域，对于所述配体或者受体，结合对对应物表达在肿瘤细胞上。
实施例11-13涉及结合BCMA的CAR，在其中抗原结合域包含包括APRIL，即BCMA的配体。
抗原结合域可基于抗原的天然配体。
抗原结合域可包含来自组合文库的亲和肽或从头设计的亲和蛋白质/肽。
间隔区域
CAR包含间隔区序列以连接抗原结合域与跨膜域并且在空间上分离来自内域的抗原结合域。柔性间隔区允许抗原结合域在不同方向上定向以促进结合。
在本发明的T细胞中，第一和第二CAR包含不同的间隔区分子。例如，间隔区序列可以例如包含IgG1Fc区，IgG1铰链或人CD8茎或小鼠CD8茎。间隔区可以备选地包含备选的接头序列，其具有与IgG1Fc区，IgG1铰链或CD8茎相似的长度和/或域间距性质。可以改变人IgG1间隔区以除去Fc结合基序。
这些间隔区的氨基酸序列的实例如下：
SEQIDNo.10(人IgG1的铰链CH2CH3)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD
SEQIDNo.11(人CD8茎):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
SEQIDNo.12(人IgG1的铰链):
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
SEQIDNo.13(CD2胞外域)
KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD
SEQIDno.14(CD34胞外域)
SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKT
因为CAR通常是同二聚体(见图1a)，所以交叉配对可能导致异二聚体嵌合抗原受体。基于各种原因，这是不希望的，例如：(1)表位可能不是处在靶细胞的相同“水平”上，使得交叉配对的CAR可能只能够结合一种抗原；(2)来自两个不同的scFv的VH和VL可以交换并且不能识别靶标或者更坏识别意外的和不可预测的抗原。对于“或”门和“和非”门，第一CAR的间隔区与第二CAR的间隔区是足够地不同的，以避免交叉配对。第一间隔区的氨基酸序列可以与第二间隔区在氨基酸水平上共享小于50％，40％，30％或20％的同一性。
在本发明的其他方面(例如和门)，重要的是，第一CAR的间隔区具有不同的长度和/或电荷和/或形状和/或构造和/或糖基化，使得当第一CAR和第二CAR两者结合它们的靶抗原时，间隔区电荷或尺寸的不同导致两种类型的CAR的空间分离至膜的不同部分，从而导致活化，如通过动力学分离模型所预测的。在这些方面，牢记大小和靶抗原上的结合表位，仔细地选择间隔区的不同长度和/或形状和/或构造，以允许在相关靶标识别后的差别分离。例如，预期IgG1铰链，CD8茎，IgG1Fc，CD34的胞外域，CD45胞外域差别分离。
差别分离并且因此适用于与和门一起使用的间隔区对的实例在下表中显示：
在本发明的其他方面(例如和非门)，重要的是间隔区足够不同以防止交叉配对，但要足够相似以共定位。可采用直系同源间隔区序列对。实例是鼠和人CD8茎，或备选地单体的间隔区域-例如CD2的胞外域。
共定位并因此适用于与和非门一起使用的间隔区对的实例在下表中显示：
上述提到的所有间隔区域形成同二聚体。然而，该机制不限于使用同二聚体受体，并且应该与单体受体一起使用，只要间隔区具有足够的刚性。这样的间隔区的实例是CD2或截短的CD22。
跨膜域
跨膜域是CAR的跨越膜的序列。
跨膜域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是由几个疏水性残基构成的α-螺旋。可以将任何跨膜蛋白质的跨膜域用于提供本发明的跨膜部分。蛋白质的跨膜域的存在和跨度可以通过本领域的技术人员使用TMHMM算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)来确定。此外，考虑到蛋白质的跨膜域是相对简单的结构，即预测形成足够长的疏水α螺旋以跨越膜的多肽序列，也可以使用人工设计的TM域(US7052906B1描述了合成的跨膜组分)。
跨膜域可以来源于CD28，其提供了良好的受体稳定性。
活化性内域
内域是CAR的信号传输部分。在抗原识别后，受体聚簇，天然CD45和CD148被排除在突触外，并且将信号传输到细胞。最常用的内域组分是含有3个ITAM的CD3-zeta的内域。这在结合抗原后将活化信号传输到T细胞。CD3-zeta可能不能提供完全有能力(competent)的活化信号，并且可能需要额外的共刺激信号。例如，可以将嵌合CD28和OX40与CD3-zeta一起用于传输增殖/存活信号，或全部三种可以一起使用。
在本发明的T细胞包含具有活化性内域的CAR的情况中，它可以仅包含CD3-Zeta内域，CD3-Zeta内域与CD28或OX40的内域，或CD28内域和OX40和CD3-Zeta内域。
包含ITAM基序的任何内域可以作为本发明的活化性内域起作用。已知几种蛋白质含有内域，所述内域具有一个或更多个ITAM基序。这种蛋白质的实例包括CD3ε链、CD3γ链和CD3δ链等等。考虑标签YxxL/l，任意两个其他氨基酸可以容易地将ITAM基序识别为与亮氨酸或异亮氨酸分开的酪氨酸。通常但不总是，这些基序中的两个是由分子尾部的6-8个氨基酸分隔(YxxL/IX(6-8)YxxL/I)。因此，本领域技术人员可以容易地找到含有一个或更多ITAM的现存蛋白质以传输活化信号。此外，考虑到基序是简单的，并且不需要复杂的二级结构，本领域的技术人员可以设计含有人工ITAM的多肽以传输活化信号(参见WO2000063372，其涉及合成的信号分子)。
具有活化性内域的CAR的跨膜和胞内T细胞传递域(内域)可以包含如SEQIDNo.15,16中显示的序列或其变体，所述变体具有至少80％序列同一性。
SEQIDNo.15，包含CD28跨膜域和CD3Z内域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQIDNo.16，包含CD28跨膜域，CD28和CD3Zeta内域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQIDNo.17，包含CD28跨膜域，CD28，OX40和CD3Zeta内域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
变体序列可具有与SEQIDNo.15,16或17至少80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性，条件是该序列提供了有效的跨膜域和有效的细胞内T细胞信号传导域。
“连接关闭”抑制性内域
在上面称为和门的实施方案中，CAR中的一个包含抑制性内域，使得在不存在抑制性CAR连接的情况下，抑制性CAR抑制通过活化性CAR导致的T细胞活化，当连接抑制性CAR时，不显著抑制通过活化性CAR导致的T细胞活化。这被称为“连接关闭”抑制性内域。
在这种情况下，抑制性CAR的间隔区具有与活化性CAR不同的长度，电荷，形状和/或构造和/或糖基化，使得当连接两个受体时，间隔区尺寸的差异导致抑制性CAR和活化性CAR在免疫突触的不同膜区室中分离，使得活化性内域从由抑制性内域导致的抑制中解除出来。
因此，用于连接关闭抑制性CAR的抑制性内域可以包含任何序列，当其在相同膜区室中时(在不存在抑制性CAR的抗原的情况中)其抑制通过活化性CAR的T细胞信号传导，但当它与抑制性CAR在膜的不同部分中分离时不显著抑制T细胞传递。
连接关闭抑制性内域可以是或包含酪氨酸磷酸酶，例如受体样酪氨酸磷酸酶。抑制性内域可以是或包含任何酪氨酸磷酸酶，当仅连接刺激性受体时，所述酪氨酸磷酸酶能够抑制TCR信号传导。抑制性内域可以是或包含具有针对磷酸化的ITAM的足够快的催化速率的任何酪氨酸磷酸酶，当仅连接刺激性受体时，所述酪氨酸磷酸酶能够抑制TCR信号传导。
例如，和门的抑制性内域可以包含CD148或CD45的内域。CD148和CD45已显示天然地作用于TCR信号传导的磷酸化的酪氨酸上游。
CD148是受体样蛋白质酪氨酸磷酸酶，其通过干扰PLCγ1和LAT的磷酸化和功能负调节TCR信号传导。
CD45存在于所有造血细胞中，是一种蛋白酪氨酸磷酸酶，它能够再次通过磷酸化PLCγ1调节信号转导和功能性响应。
抑制性内域可包含受体样酪氨酸磷酸酶的全部或一部分。磷酸酶可以干扰参与T细胞信号传导的元件如PLCγ1和/或LAT的磷酸化和/或功能。
CD45和CD148的跨膜和内域分别显示为SEQIDNo.18和No.19。
SEQID18-CD45跨膜和内域序列
ALIAFLAFLIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVPLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS
SEQID19-CD148跨膜和内域序列
AVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA
抑制性CAR可以包含SEQIDNo18或19的全部或部分(例如，它可以包含内域的磷酸酶功能)。它可以包含该序列或其部分的具有至少80％的序列同一性的变体，只要所述变体保留了基本上抑制由活化性CAR导致的T细胞信号传导的能力。
其他间隔区和内域可以例如使用本文列举的模型系统来进行测试。可以通过单独或双重转导合适的细胞系诸如SupT1细胞系产生靶细胞群以建立针对两种抗原呈阴性的细胞(野生型)，针对任一种抗原呈阳性的细胞和针对两种抗原呈阳性的细胞(如CD19-CD33-，CD19+CD33-，CD19，CD33+和CD19+CD33+)。可以用一对CAR转导T细胞如在活化后释放IL-2的小鼠T细胞系BW5147，并且通过测量IL-2的释放(例如通过ELISA)测量它们在逻辑门中发挥作用的能力。例如，在实施例4中显示CD148和CD45内域两者可以作为抑制性CAR与含有CD3Zeta内域的活化性CAR组合行使功能。这些CAR依靠一个CAR上的短/不庞大的CD8茎间隔区和另一个CAR上庞大的Fc区实现和门控。当连接了两个受体时，间隔区尺寸的差异导致不同受体在不同膜区室中的分离，从而将CD3Zeta受体从由CD148或CD45内域导致的抑制中解除出来。以这种方式，仅当两种受体被活化时才发生活化。可以容易地看出，这种模块系统可用于测试备选的间隔区对和抑制性内域。如果在两种受体的连接之后，间隔区没有实现分离，那么抑制将不会被释放，所以不会发生活化。如果所测试的抑制性内域是无效的，那么在活化性CAR的连接的存在下将预期活化，与抑制性CAR的连接状态无关。
“连接开启”内域
在上述称为和非门的实施方案中，CAR中的一个包含”连接开启”抑制性内域，使得在缺乏抑制性CAR连接的情况下，抑制性CAR不显著抑制由活化性CAR导致的T细胞活化，当连接抑制性CAR时，其抑制由由活化性CAR导致的T细胞活化。
“连接开启”抑制性内域可以是或包含酪氨酸磷酸酶，当仅连接刺激性受体时，所述酪氨酸磷酸酶不能抑制TCR信号传导。
“连接开启”抑制性内域可以是或包含具有针对磷酸化的ITAM的足够慢的催化速率的酪氨酸磷酸酶，当仅连接刺激性受体时，所述酪氨酸磷酸酶不能够抑制TCR信号传导，但当在突触处集中时，能抑制TCR信号传导响应。通过抑制性受体连接实现了突触处的富集。
如果酪氨酸磷酸酶具有针对”连接开启”抑制性内域太快的催化速率，则有可能通过修饰如点突变和短接头(其导致位阻)来下调(tune-down)磷酸酶的催化速率，以使其适合于“连接开启”抑制性内域。
在第一实施方案中，内域可以是或包含具有比CD45或CD148具有少得相当多的活性的磷酸酶，使得ITAMS的显著脱磷酸化仅在活化和抑制性内域共定位时发生。许多合适的序列是本领域已知的。例如，非和门的抑制性内域可包含蛋白质-酪氨酸磷酸酶如PTPN6的全部或部分。
蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)是调节多种细胞过程，包括细胞生长，分化，有丝分裂周期和致癌性转化的信号传导分子。此PTP的N末端部分含有两个串联的Src同源(SH2)域，它作为蛋白质磷酸酪氨酸结合域起作用，并介导此PTP与其底物的相互作用。此PTP主要在造血细胞中表达，并在造血细胞中作为多种信号传导途径的重要调节剂发挥作用。
抑制剂域可包含整个PTPN6(SEQIDNo.20)或仅磷酸酶域(SEQIDNo.21)。
SEQIDNo.20–PTPN6序列
MVRWFHRDLSGLDAETLLKGRGVHGSFLARPSRKNQGDFSLSVRVGDQVTHIRIQNSGDFYDLYGGEKFATLTELVEYYTQQQGVLQDRDGTIIHLKYPLNCSDPTSERWYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYYATRVNAADIENRVLELNKKQESEDTAKAGFWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVPSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQFIETTKKKLEVLQSQKGQESEYGNITYPPAMKNAHAKASRTSSKHKEDVYENLHTKNKREEKVKKQRSADKEKSKGSLKRK
SEQIDNo.21–PTPN6磷酸酶域序列
FWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVPSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQF
连接开启抑制性内域的第二种实施方案是含有ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)的内域，如来自CD22，LAIR-1，杀手(killer)抑制性受体家族(KIR)，LILRB1，CTLA4，PD-1，BTLA等的内域。当被磷酸化时，ITIM通过其SH2域募集内源PTPN6。如果与含ITAM的内域共定位，那么发生脱磷酸化，并且抑制了活化性CAR。
ITIM是在免疫系统的许多抑制性受体的胞质尾部中发现的氨基酸的保守序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)。本领域技术人员可以很容易地发现含ITIM的蛋白质域。已经通过蛋白质组全扫描(Staub,etal(2004)Cell.Signal.16,435–456)产生含ITIM的人类候选蛋白质的列表。此外，由于共有序列是公知的并且小的二级结构似乎是需要的，本领域技术人员可以产生人工ITIM。
来自PDCD1,BTLA4,LILRB1,LAIR1,CTLA4,KIR2DL1,KIR2DL4,KIR2DL5,KIR3DL1和KIR3DL3的ITIM内域分别显示于SEQID22至31中。
SEQID22PDCD1内域
CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL
SEQID23BTLA4
KLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH
SEQID24LILRB1
LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH
SEQID25LAIR1
HRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARH
SEQID26CTLA4
FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
SEQID27KIR2DL1
GNSRHLHVLIGTSVVIIPFAILLFFLLHRWCANKKNAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP
SEQID28KIR2DL4
GIARHLHAVIRYSVAIILFTILPFFLLHRWCSKKKENAAVMNQEPAGHRTVNREDSDEQDPQEVTYAQLDHCIFTQRKITGPSQRSKRPSTDTSVCIELPNAEPRALSPAHEHHSQALMGSSRETTALSQTQLASSNVPAAGI
SEQID29KIR2DL5
TGIRRHLHILIGTSVAIILFIILFFFLLHCCCSNKKNAAVMDQEPAGDRTVNREDSDDQDPQEVTYAQLDHCVFTQTKITSPSQRPKTPPTDTTMYMELPNAKPRSLSPAHKHHSQALRGSSRETTALSQNRVASSHVPAAGI
SEQID30KIR3DL1
KDPRHLHILIGTSVVIILFILLLFFLLHLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP
SEQID31KIR3DL3
KDPGNSRHLHVLIGTSVVIIPFAILLFFLLHRWCANKKNAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYAQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTSV
连接开启抑制性内域的第三个实施方案是含有ITIM的与融合蛋白共表达的内域。融合蛋白可以包含蛋白质-酪氨酸磷酸酶的至少一部分和受体样酪氨酸磷酸酶的至少一部分。该融合物可以包含来自蛋白质-酪氨酸磷酸酶的一个或多个SH2域。例如，融合可以是在PTPN6SH2域和CD45内域之间或PTPN6SH2域和CD148内域之间进行。当被磷酸化时，ITIM域募集融合蛋白，使高度有力的CD45或CD148磷酸酶接近活化性内域以阻断活化。
融合蛋白的序列列在32和33
SEQID32PTPN6-CD45融合蛋白
WYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFMIQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS
SEQID33PTPN6-CD148融合蛋白
ETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA
连接开启抑制性CAR可以包含SEQIDNo20或21的全部或部分。它可以包含SEQIDNo20至31的全部或部分。它可以包含与SEQID32或33共表达的SEQID22至31的全部或部分。它可以包含具有至少80％序列同一性的序列或其部分的变体，只要所述变体保留了在抑制性CAR连接后抑制由活化性CAR导致的T细胞信号传导的能力。
如上述，可以例如使用本文列举的模型系统测试备选的间隔区和内域。在实施例5中显示，PTPN6内域可以作为半抑制性CAR与含有CD3Zeta内域的活化性CAR组合发挥功能。这些CAR依靠一个CAR上的人CD8茎间隔区和另一CAR上的小鼠CD8茎间隔区。直系同源序列防止交叉配对。然而，当连接两种受体时，间隔区的相似性导致在相同的膜区室中的不同受体的共分离。这导致了PTPN6内域抑制CD3Zeta受体。如果只是活化性CAR连接，那么PTPN6内域不是足够有活性以防止T细胞的活化。以这种方式，仅当活化性CAR连接并且抑制性CAR不连接时(和非门)时发生活化。可以容易地看出，这种模块系统可用于测试备选的间隔区对和抑制性域。如果在两种受体连接后，间隔区没有实现共分离，那么抑制不会是有效的，并且因此不会发生活化。如果所测试的半抑制性内域是无效的，将预期在活化性CAR连接的存在下活化，与半抑制性CAR的连接状态无关。
共表达位点
本发明的第二方面涉及编码第一CAR和第二CAR的核酸。
核酸可以产生多肽，其包含通过切割位点连接的两个CAR分子。切割位点可以自我切割，使得当多肽产生时，它立即被切割成第一CAR和第二CAR而不需要任何外部切割活性。
多种自我切割位点是已知的，包括口蹄疫病毒(FMDV)2a自我切割肽，其具有如SEQIDNo.34中所示的序列：
SEQIDNo.34
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
共表达序列可以是内部核糖体进入序列(IRES)。共表达序列可以是一个内部启动子。
细胞
本发明的第一方面涉及在细胞表面共表达第一CAR和第二CAR的细胞。
细胞可以是能够在细胞表面表达CAR的任何真核细胞如免疫细胞。
具体地，细胞可以是免疫效应细胞，如T细胞或天然杀伤(NK)细胞。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中起中心作用的一类淋巴细胞。可以通过细胞表面上存在的T细胞受体(TCR)将它们与其他的淋巴细胞，如B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)区分开来。有多种类型的T细胞的，总结如下。
辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫学过程中协助其他的白细胞，所述免疫学过程包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。TH细胞在其表面表达CD4。TH细胞当它们通过在抗原呈递细胞(APC)表面上的MHCII类分子而呈递有肽抗原时被活化。这些细胞能够分化成几种亚型之一，包括TH1，TH2，TH3，TH17，TH9，或TFH，其分泌不同细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞毒性T细胞(TC细胞，或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。CTL在其表面表达CD8。这些细胞通过结合与存在于所有有核细胞的表面上的MHCI类结合的抗原识别它们的靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10，腺苷和其它分子，可以使CD8+细胞失活至无反应性状态，这防止自身免疫疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
记忆T细胞是感染已经结束后长期存在的抗原特异性T细胞的亚组。在重新暴露于它们的相关抗原后，它们很快扩展成大量的效应T细胞，从而给免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三个亚型：中枢记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应子记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
调节性T细胞(Treg细胞)，以前称作抑制性T细胞，对于维持免疫耐受是关键的。它们的主要作用是朝向免疫反应结束关闭T细胞介导的的免疫并抑制逃脱了胸腺中的负选择过程的自身反应性T细胞。
已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞-天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。
天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)在胸腺中出现并且已经与发展中的T细胞与用TSLP活化的两种髓样(CD11c+)以及浆细胞样(CD123+)树突细胞之间的相互作用相关。通过称为FoxP3的胞内分子的存在，可以将天然存在的Treg细胞与其他T细胞区分开来。FOXP3基因突变可以阻止调节性T细胞发育，导致致命的自身免疫性疾病IPEX。
适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3的细胞)可以在正常免疫应答过程中起源。
本发明的T细胞可以是上文提到的任何T细胞类型，特别是CTL。
自然杀伤(NK)细胞是一类形成先天性免疫系统的一部分的细胞溶解性细胞。NK细胞以独立于MHC的方式，提供对来自病毒感染细胞的先天信号的快速应答。
NK细胞(属于先天淋巴样细胞组)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成了区分于通常的产生B和T淋巴细胞的淋巴样前体的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结，脾，扁桃体和胸腺中分化和成熟，在那里它们进入中循环。
本发明的CAR细胞可以是上文提到的任何细胞类型。
CAR表达细胞，如CAR表达T或NK细胞可以从患者自身的外周血(第一方)，或在来自供体外周血(第二方)的造血干细胞移植物的背景中，或者从无关供体(第三方)的外周血离体产生。
本发明还提供细胞组合物，其包含根据本发明的CAR表达性T细胞和/或CAR表达性NK细胞。细胞组合物可以通过用根据本发明的核酸离体转导或转染血液样品来制备。
备选地，CAR表达细胞可以来源于诱导祖细胞或胚胎祖细胞到相关的细胞类型，如T细胞的离体分化。备选地，可以使用永生化细胞系，如保留其裂解功能并能用作治疗剂的T细胞系。
在所有这些实施方案中，通过许多方式之一，包括用病毒载体转导，用DNA或RNA转染导入编码CAR的DNA或RNA来产生CAR细胞。
本发明的CART细胞可以是来自受试者的离体T细胞。T细胞可以来自外周血单核细胞(PBMC)样品。在用CAR编码核酸转导之前，可以例如通过用抗CD3单克隆抗体处理来活化和/或扩增T细胞。
本发明的CART细胞可以通过以下制备：
(i)从受试者或上面列出的其它来源分离含T细胞的样品；和
(ii)用编码第一和第二CAR的一种或多种核酸序列转导或转染T细胞。
然后可以纯化T细胞，例如基于第一和第二CAR的共表达来选择。
核酸序列
本发明的第二方面涉及编码如在本发明的第一方面所定义的第一CAR和第二CAR的一个或多个核酸序列。
核酸序列可包含以下序列之一或其变体：
SEQID35或门
使用CD45的SEQID36和门
使用CD148的SEQID37和门
使用PTPN6作为内域的SEQID38和非门
使用LAIR1内域的SEQID39和非门
使用具有CD148磷酸酶的LAIR1和PTPN6SH2融合物的SEQID40和非门
SEQIDNo.35:
>MP13974.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3pvaa-CD28tmZw
ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGCCGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGTTGCTACTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACACAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGATCGCGTCACCATCACCTGTCGAGCAAGTGAGGACATTTATTTTAATTTAGTGTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATACAAATCGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCTCTGGATCTGGCACACAGTATACTCTAACCATAAGTAGCCTGCAACCCGAAGATTTCGCAACCTATTATTGTCAACACTATAAGAATTATCCGCTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAAGATCTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGCGGAGGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGAGGCGGAGGCTCGAGATCTGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTCTCAGTAATTATGGCATGCACTGGATCAGGCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCGTCTATTAGTCTTAATGGTGGTAGCACTTACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGGGACAATGCAAAAAGCACCCTCTACCTTCAAATGAATAGTCTGAGGGCCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCAGCACAGGACGCTTATACGGGAGGTTACTTTGATTACTGGGGCCAAGGAACGCTGGTCACAGTCTCGTCTATGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGTTCTGGGTCCTGGTGGTGGTGGGAGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTCCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCTCCCGGGTGAAGTTTTCTCGCTCTGCCGATGCCCCAGCCTATCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAATGAACTGAACCTGGGCAGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCACGGCGCAAAAATCCCCAGGAGGGACTCTATAACGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAGGCCTATTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGAAGACGCGGAAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGATTGTCCACCGCTACAAAAGATACATATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCACCCAGATGA
SEQIDNo.36
>MP14802.SFG.aCD19fmc63_clean-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3pvaa-dCD45
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SEQIDNo.37:
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SEQIDno.40
>MP16092.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-muCD8STK-LAIR1tm-endo-2A-PTPN6_SH2-dCD148
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核酸序列编码的氨基酸序列可以与SEQIDNo.35,36,37,38,39或40编码的氨基酸序列相同，但由于遗传密码的简并性可以具有不同的核酸序列。核酸序列可具有与SEQIDNo.35,36,37,38,39或40中显示的序列至少80％，85，90，95，98或99％的同一性，条件是它编码如在本发明的第一方面限定的第一CAR和第二CAR。
载体
本发明还提供包含一个或多个CAR编码核酸序列的载体或载体试剂盒。这样的载体可用于将核酸序列导入宿主细胞中，使得其表达第一和第二CAR。
载体可以是例如质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mRNA。
载体可以能够转染或转导的T细胞。
药物组合物
本发明还涉及含有根据本发明的第一方面的多个CAR表达细胞，例如T细胞或NK细胞的药物组合物。药物组合物可另外包含可药用的载体，稀释剂或赋形剂。药物组合物可任选包含一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。这样的制剂可以例如是适合于静脉内输注的形式。
治疗方法
本发明的T细胞可以能够杀死靶细胞，例如癌细胞。靶细胞可以通过限定的抗原表达模式识别，例如抗原A和抗原B的表达；抗原A或抗原B的表达；或抗原A和非抗原B的表达或这些门的复杂迭代。
本发明的T细胞可用于感染如病毒感染的治疗。
本发明的T细胞也可以用于控制病原性免疫应答，例如，自身免疫性疾病，变态反应和移植抗宿主排斥。
本发明的T细胞可以用于治疗癌性疾病，如膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，肾癌(肾细胞)，白血病，肺癌，黑素瘤，非霍奇金淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌和甲状腺癌。
它特别适合于治疗实体瘤，其中良好选择性的单一靶标的利用度是有限的。
本发明的T细胞可用于治疗：口腔和咽的癌症，包括舌癌，口腔癌和咽癌；消化系统的癌症，其包括食管癌，胃癌和结肠直肠癌；肝脏和胆道系统的癌症，其包括肝细胞癌和胆管上皮癌(cholangiocarcinoma)；呼吸系统的癌症，其包括支气管癌和喉癌；骨和关节的癌症，包括骨肉瘤；皮肤癌，其包括黑素瘤；乳腺癌；生殖道的癌症，其包括在女性中的子宫癌，卵巢癌和宫颈癌，以及在男性中的前列腺癌和睾丸癌；肾道的癌症，其包括肾细胞癌，尿道或膀胱的移行细胞癌；脑癌，其包括胶质瘤，多行性胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤(medullobastomas)；内分泌系统的癌症，包括甲状腺癌，肾上腺癌和与多发性内分泌腺新生物综合征相关的癌症；淋巴瘤，其包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；多发性骨髓瘤和浆细胞瘤；急性和慢性白血病，髓样或淋巴性白血病；以及其他的未指明位点的癌症，包括神经母细胞瘤。
用本发明的T细胞进行的治疗可以帮助防止在标准方法中经常发生的肿瘤细胞的逃逸或释放。
本发明现在将通过实施例进一步描述，所述实施例意在用于协助本领域普通技术人员中实施本发明，并且不是意在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：靶细胞群的产生
为了证明本发明的原理的目的，任意地选择了基于抗CD19和抗CD33的受体。使用逆转录病毒载体，克隆了CD19和CD33。将这些蛋白质截短，以便它们不能发信号并且可以长时段稳定地表达。接着，单一或双重使用这些载体来转导SupT1细胞系以建立针对两种抗原呈阴性(野生型)，对任一种抗原呈阳性和对两种抗原呈阳性的细胞。表达数据显示于图3。
实施例2：或门的设计和功能
为了构建或门，共表达识别CD19和CD33的一对受体。将不同的间隔区用于防止交叉配对。这两种受体具有来源于CD28的用于改善表面稳定性的跨膜域和来源于CD3Zeta的内域的用于提供简单的活化信号的内域。以这种方式，共表达了一对独立的第1代CAR。用于共表达序列的逆转录病毒载体盒利用口蹄疫病毒2A自我切割肽，以允许共表达1:1的两种受体。盒设计显示于图4，并且蛋白质结构显示于图5中。同源区的核苷酸序列是密码子摆动的，以防止在逆转录病毒载体逆转录过程中的重组。
实施例3：测试或门
通过用融合至Fc的相关抗原染色在T细胞表面上测试两种CAR的表达。通过使用不同种类的Fc域(对于CD19为小鼠并且对于CD33为兔)，通过用缀合有不同荧光团的不同二抗染色在细胞表面上确定两种CAR的共表达。这显示于图6。
然后使用小鼠T细胞系BW5147进行功能测试。这种细胞系在活化后释放IL2，以允许简单的定量读数。这些T细胞与增加量的上述人工靶细胞共培养。如通过ELISA测量的IL2释放显示的，T细胞响应表达任一抗原的靶细胞。显示两种CAR在细胞表面上表达，并且显示T细胞响应任一种或两种抗原。这些数据显示在图7中。
实施例4：和门的设计和功能
和门组合简单活化受体与基本上抑制活性但其活性在连接受体后被关闭的受体。这通过组合标准的第一代CAR与第二受体实现，所述第一代CAR具有短/非庞大的CD8茎间隔区和CD3Zeta内域，所述第二受体具有庞大的Fc间隔区，它的内域包含CD148或CD45内域。当连接两个受体时，间隔区尺寸的差异导致不同受体在不同膜区室中的分离，从而使CD3Zeta受体从由CD148或CD45内域导致的抑制中解除出来。以这种方式，仅在两种受体被活化时发生活化。对此选择了CD148和CD45，因为它们天然地在这种方式发挥功能：例如，非常庞大的CD45胞外域将整个受体排除在免疫突触外。表达盒描述在图8中并且在图9中描述了后续蛋白质。
针对不同的特异性的表面染色显示，两种受体对可以在图10中显示的细胞表面上有效地表达。在BW5147中的功能显示T细胞仅在两种抗原的存在下才被活化(图11)。
实施例5：和门的一般化的证明
为了确保观察结果不是CD19/CD33和已经使用的其结合剂的一些特定特征的表现，交换了两个靶向性scFv，使得现在活化(ITAM)信号在识别CD33，而不是CD19后传输；并且抑制信号(CD148)在识别CD19而不是CD33后传输。因为认为CD45和CD148内域在功能上类似，所以将实验限制到具有CD148内域的和门。这应当仍然导致功能性和门。用具有单独的CD19或CD33或两者的靶标攻击表达新逻辑门的T细胞。T细胞响应同时表达CD19和CD33的靶标，但不响应只表达这些抗原中的一种或不表达这些抗原的靶标。这表明，和门在此形式中仍是有功能的(图18B)。
以同样的思路，试图确立如何一般化我们的和门：和门应当在不同的靶标间一般化。虽然门给出的相对抗原密度，相关scFv结合动力学和scFv结合表位的精确距离可能具有更低或更高的保真度，但将预期用一大批靶物和结合剂看到一些和门的表现。为了测试这点，产生了三种另外的和门。再一次，将实验限制到CD148形式的和门。将来自原始的CD148和门的第二scFv替换成抗GD2scFvhuK666(SEQID41和SEQID42)，或抗CD5scFv(SEQID43和SEQID44)，或抗EGFRvIIIscFvMR1.1(SEQID45和SEQID46)，以产生以下CAR和门：CD19和GD2；CD19和CD5；CD19和EGFRvIII。也产生了下面的人工抗原表达细胞系：通过用GM3和GD2合酶转导SupT1和我们的SupT1.CD19，产生了SupT1.GD2和SupT1.CD19.GD2。通过用编码EGFRvIII的逆转录病毒载体转导SupT1和SupT1.CD19产生了SupT1.EGFRvIII和SupT1.CD19.EGFRvIII。因为CD5在SupT1细胞上表达，所以将不同的细胞系用于产生靶细胞：产生了表达单独的CD19，单独的CD5和CD5和CD19两者的293T细胞。表达通过流式细胞术确认(图19)。用SupT1.CD19和各自的相关双重阳性和单阳性靶细胞攻击表达三种新CAR和门的T细胞。所有三种和门显示与单阳性靶标相比通过双重阳性细胞系导致的活化降低(图20)。这显示了和门设计至任意靶标和相关结合剂的一般化。
实施例6：CAR和门的动力学分离模型的实验证据
目的是要证明下述模型，即通过不同间隔区引起的差别分离是产生这些逻辑CAR门的能力背后的中心机制。该模型是，如果仅连接活化性CAR，那么有力的的抑制性“连接关闭”型CAR在膜中在溶液中，并且可以抑制活化性CAR。一旦两个CAR均连接，若两个CDR间隔区充分不同，那么它们将在突触内分离并且不会共定位。因此，关键的需求是间隔区是充分不同的。如果模型是正确的，如果这两个间隔物充分相似，从而当连接两个受体时它们共定位，那么门将不能发挥功能。为了验证这一点，我们用鼠CD8间隔区替换了原始CAR中的庞大Fc间隔区。预测这具有与人CD8类似的长度，体积和电荷，但因此不应与它交叉配对。因此，新的门具有识别CD19的第一CAR，人CD8茎间隔区和活化性内域；而第二CAR识别CD33，具有小鼠CD8茎间隔区和CD148内域(图18C)。转导T细胞以表达这种新的CAR门。然后用表达单独的CD19，单独的CD33或一起的CD19和CD33的SupT1细胞攻击这些T细胞。按照原始的和门，T细胞不响应单独表达任一种抗原的SupT1细胞。然而，CART细胞不能响应表达两种抗原的SupT1细胞，从而证实了模型(图18C)。功能性和门需要两种CAR具有充分不同的间隔区，使得它们不在免疫突触内共定位(图23A和B)。
实施例7：和非门的设计和功能
磷酸酶如CD45和CD148是如此有力的，以致少量进入了免疫突触的磷酸酶能抑制ITAM活化。这是逻辑和门抑制的基础。其他类别的磷酸酶不是如此有力，例如PTPN6及相关磷酸酶。据预测，通过扩散进入突触的少量PTPN6不会抑制活化。此外，据预测，如果抑制性CAR与活化性CAR具有充分相似的间隔区，那么若连接这两个CAR，则它可以在突触内共定位。在这种情况下，当两种抗原均存在时，大量的抑制性内域将足以停止ITAMS活化。以这种方式，可以创建和非门。
对于非和门，第二信号需要“否决(veto)”活化。这是通过使抑制性信号进入免疫突触中完成的，例如通过引入酶的磷酸酶，如PTPN6完成。我们因此产生如下的和非门：两个CAR共表达，其中第一个识别CD19，具有人CD8茎间隔区和活化性内域；与抗CD33CAR共表达，所述抗CD33CAR具有小鼠CD8茎间隔区和由PTPN6的催化域构成的内域(SEQID38,图13A和B)。合适的盒显示于图12，并且初步功能数据显示于图14。
此外，发展了一种用于产生和非门的备选策略。免疫酪氨酸酶抑制基序(ITIM)以与ITAMS类似的方式活化，因为它们在聚簇和磷酸酶排斥后通过lck磷酸化。代替通过结合ZAP70触发活化，磷酸化的ITIM通过它们的相关SH2域募集磷酸酶，如PTPN6。ITIM可以作为抑制性内域发挥功能，只要活化和抑制性CAR上的间隔区可以共定位。为了产生这种构建体，如下产生了和非门：两个CAR共表达，其中第一个识别CD19，具有人CD8茎间隔区和活化内域；与抗CD33CAR共表达，所述抗CD33CAR具有小鼠CD8茎间隔区和来源于LAIR1的内源的含有ITIM的内域(SEQID39,图13A和C)。
也开发了另外的更复杂的和非门，其中ITIM通过额外的嵌合蛋白质的存在而增强：PTPN6的SH2域和CD148的内域的胞内融合物。在这种设计中表达三种蛋白质-第一种识别CD19，具有人CD8茎间隔区和活化内域；与抗CD33CAR共表达，所述抗CD33CAR具有鼠CD8茎间隔区和来源于LAIR1的内域的含有ITIM的内域。另外的2A肽允许PTPN6-CD148融合物的共表达(SEQID40，图13A和D)。预测这些和非门将具有不同程度的抑制：PTPN6-CD148>PTPN6>>ITIM。
用这些门转导T细胞并用表达单独的任一种CD19或CD33或一起的CD19和CD33两者的靶标攻击T细胞。所有三个门响应仅表达CD19的靶标，但不响应表达一起的CD19和CD33两者的靶标(图21)，证实全部三种和非门均是有功能的。
实施例8：基于PTPN6的和非门的动力学分离模型的实验证据
和非门的模型集中于这样的事实，即在两个CAR中使用的间隔区的性质对于门的正确功能是关键的。在具有PTPN6的功能性和非门中，两个CAR间隔区充分相似，使得当两个CAR连接时，这两者在突触内以如此高的浓度共定位，即使弱PTPN6足以抑制活化。如果间隔区是不同的，那么在突触中的分离会使PTPN6与ITAM分离，从而允许扰乱和非门的活化。为了测试这一点，产生用Fc间隔区替换鼠CD8茎间隔区的对照。在这种情况下，测试门由两个CAR组成：第一识别CD19，具有人CD8茎间隔区和ITAM内域；而第二CAR识别CD33，具有Fc间隔区和由来自PTPN6的磷酸酶构成的内域。这种门响应CD19而活化，但也响应一起的CD19和CD33而活化(图22B，其中这种门的功能与原始和非，和在实施例6中描述的对照和门变体比较)。这种实验数据证明了以下模型：对于具有PTPN6的功能性和非门，需要共定位的间隔区。
实施例9：基于ITIM的和非门的动力学分离模型的实验证据
与基于PTPN6的和非门相似，基于ITIM的门也需要在免疫突触中共定位以作为和非门发挥功能。为了证明这一假设，如下产生了基于ITIM的对照门：两个CAR共表达-第一种识别CD19，具有人CD8茎间隔区和活化性内域；与抗CD33CAR共表达，所述抗CD33CAR具有Fc间隔区和来源于LAIR1的内域的含有ITIM的内域。将这种门的活性与原始的基于ITTM的和非门的活性相比较。在这种情况下，经修饰的门响应于表达CD19的靶标而活化，但也响应于表达CD19和CD33两者的细胞而活化。这些数据表明，基于ITIM的和非门遵循基于动力学分离的模型，并且必须选择正确的间隔区以创建功能性门(图23B)。
实施例10：通过动力学分离产生的CAR逻辑门的模型的总结
基于动力学分离模型和本文所描述的实验数据的正确理解，在图24中呈现了两个CAR门模型的总结。此图显示表达两种CAR的细胞，每种CAR识别不同抗原。当任一或两个CAR识别细胞上的靶抗原时，形成了突触，并且天然CD45和CD148由于其庞大的胞外域而被排除在突触之外。这设置T细胞活化阶段。在靶细胞仅具有一种相关抗原的情况下，相关CAR连接，并且相关CAR分离到突触中。未连接的CAR仍然保留在T细胞膜上的溶液中，并且可以扩散进出突触，使得形成了连接的CAR的高局部浓度区域与未连接的CAR的低浓度的区域。在这种情况下，如果连接的CAR具有ITAM，并且未连接的CAR具有“连接关闭”类型的抑制性内域如CD148的内域，那么未连接的CAR的量足以抑制活化并且门是关闭的。与此相反，在此情况下，如果连接的CAR具有ITAM，并且未连接的CAR具有“连接开启”类型的抑制内域如PTPN6，那么未连接的CAR的量不足以抑制活化并且门是开启的。当受到具有两种相关抗原的靶细胞攻击时，连接了这两个相关的CAR并且形成免疫突触的一部分。重要的是，如果CAR间隔区足够相似，那么CAR在突触内共定位，但如果CAR间隔区足够不同，CAR在突触内分离。在后一种情况下，形成了膜区域，其中存在高浓度的一种CAR，但是另一种CAR是不存在的。在这种情况下，由于分离完成，即使抑制性内域是“连接关闭”类型，门仍是开启的。在前者的情况下，形成了高浓度的两种CAR混合在一起的膜区域。在这种情况下，由于两个内域都被浓缩，即使抑制内域是“连接开启”类型，门仍关闭。通过选择间隔区和内域的正确组合，可将逻辑编程到CART细胞中。
基于我们的以上工作，我们已经建立了一系列的设计规则，以允许产生逻辑门控的CAR(如图31所示)。为产生“抗原A或抗原B”门控的CART细胞，必须产生抗A和抗BCAR，使得(1)每一CAR具有仅允许抗原访问和突触形成的间隔区，使得CAR发挥功能，和(2)每一CAR具有活化性内域；为了产生“抗原A和非B”门控的CART细胞，必须产生抗A和抗BCAR，使得(1)这两个CAR具有间隔区，所述间隔物不交叉配对，但会允许CAR在识别靶细胞上的两个相关抗原后共分离，(2)并且一个CAR具有活化性内域，而另一个CAR具有包含或募集弱磷酸酶(例如PTPN6)的内域；(3)为了产生“抗原A和抗原B”门控的CART细胞，必须产生抗A和抗BCAR，使得(1)一个CAR具有与另一个CAR足够不同的间隔区，使得在识别靶细胞上的两个相关抗原后，两个CAR不会共分离，(2)一个CAR具有活化性内域，而另一个CAR具有由有力的磷酸酶构成的内域(例如，CD45或CD148的内域)。实现期望的效应的正确的间隔区可以从一组具有已知尺寸/形状等的间隔区选择，同时考虑靶抗原的尺寸/形状等(例如参见图30)和靶抗原上相关表位的位置。
SEQIDNo41:
SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aGD2-HCH2CH3pvaa-dCD148
MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQESGPGLVKPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNQVFLKMSSLTAADTAVYYCAKRSDDYSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGKAPKVWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGYPITFGQGTKVEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA
SEQIDNo.42:
SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aGD2-HCH2CH3pvaa-dCD148
ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCCAGCCAGACCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGGCCAGCTACAACATCCACTGGGTGCGGCAGCCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGCTGGCGGCAGCACCAACTACAACAGCGCCCTGATGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAACCAGGTGTTCCTGAAGATGAGCAGCCTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGCGGAGCGACGACTACAGCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGAACCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCTTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGGGTGACCATGACCTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCAAGGCCCCAAAGGTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCGGCTACCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCTTCATCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCTAAAAAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTGTGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAACTGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTTTCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAAAGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGAAAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTATTGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCCGGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGTGAGAGTCACCCTCTGAGACAGTTCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTACCTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGTCGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGGATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTATGTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTACCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATGGTTACATCGCCTAA
SEQIDNo.43:
SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD5-HCH2CH3pvaa-dCD148
MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDVYYNPSLKNQLTISKDASRDQVFLKITNLDTADTATYYCVRRRATGTGFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSNIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIACKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCHQYNSYNTFGSGTRLELKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA
SEQIDNo.44:
SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD5-HCH2CH3pvaa-dCD148
ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGCCAGGTGACCCTGAAGGAGAGCGGTCCCGGCATCCTGAAGCCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCAGCTTCAGCGGCTTCAGCCTGAGCACCAGCGGCATGGGCGTGGGCTGGATTCGGCAGCCCAGCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACGTGTACTACAACCCCAGCCTGAAGAACCAGCTGACCATCAGCAAGGACGCCAGCCGGGACCAGGTGTTCCTGAAGATCACCAACCTGGACACCGCCGACACCGCCACCTACTACTGCGTGCGGCGCCGGGCCACCGGCACCGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGTGGCAGCAACATCGTGATGACCCAGAGCCACAAGTTCATGAGCACCAGCGTGGGCGACCGGGTGAGCATCGCCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGGGCACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGACCAGCACCCGGCACACCGGCGTGCCCGACCGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCACCAACGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGCCACCAGTACAACAGCTACAACACCTTCGGCAGCGGCACCCGGCTGGAGCTGAAGCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCTTCATCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCTAAAAAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTGTGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAACTGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTTTCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAAAGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGAAAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTATTGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCCGGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGTGAGAGTCACCCTCTGAGACAGTTCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTACCTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGTCGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGGATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTATGTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTACCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATGGTTACATCGCCTAA
SEQIDNo.45:
SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aEGFRvIII-HCH2CH3pvaa-dCD148
MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGQVKLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA
SEQIDNo.46:
SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aEGFRvIII-HCH2CH3pvaa-dCD148
ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGCCAGGTGAAGCTGCAGCAGAGCGGCGGAGGCCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCCTGAAGCTGAGCTGCGTGACCAGCGGCTTCACCTTCCGGAAGTTCGGCATGAGCTGGGTGCGGCAGACCAGCGACAAGCGGCTGGAGTGGGTGGCCAGCATCAGCACCGGCGGCTACAACACCTACTACAGCGACAACGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGAGAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAAGAGCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCACCCGGGGCTACAGCAGCACCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGAGCAGCGGCGGAGGAGGCAGTGGTGGGGGTGGATCTGGCGGAGGTGGCAGCGACATCGAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGAGCGTGGCCACCGGCGAGAAGGTGACCATCCGGTGCATGACCAGCACCGACATCGACGACGACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCGAGCCCCCAAAGTTCCTGATCAGCGAGGGCAACACCCTGCGGCCCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCAGCAGCGGCACCGGCACCGACTTCGTGTTCACCATCGAGAACACCCTGAGCGAGGACGTGGGCGACTACTACTGCCTGCAGAGCTTCAACGTGCCCCTGACCTTCGGCGACGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCTTCATCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCTAAAAAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTGTGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAACTGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTTTCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAAAGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGAAAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTATTGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCCGGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGTGAGAGTCACCCTCTGAGACAGTTCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTACCTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGTCGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGGATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTATGTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTACCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATGGTTACATCGCCTAA
实施例11：基于APRIL的CAR的设计和构建
天然形式的APRIL是一种分泌性II型蛋白。将APRIL用作CAR的BCMA结合域需要将这种II型分泌蛋白转化成I型膜结合蛋白，并且对于这种蛋白质是稳定的，并在这种形式中保留对BCMA的结合。为了产生候选分子，将APRIL的最终氨基末端删除以除去与蛋白聚糖的结合。接着，加入信号肽以将新生蛋白质引导至内质网，从而引导至细胞表面。此外，由于使用的间隔区的性质可以改变CAR的功能，测试了三种不同的间隔区域：产生了基于APRIL的CAR，其包含(i)经改变以除去Fc结合基序的人IgG1间隔区；(ii)CD8茎；和(iii)仅IgG1铰链(草图25中的图和图26中的氨基酸序列)。这些CAR在双顺反子逆转录病毒载体中表达(图27A)，使得标记蛋白—截短的CD34可共表达为一种方便的标记基因。
实施例12：基于APRIL的CAR的表达和功能
本研究的目的是测试已经构建的基于APRIL的CAR是否在细胞表面上表达和APRIL是否已经折叠以形成天然蛋白。用这些不同的CAR构建体转导T细胞，并使用市售的抗APRILmAb染色以及对标记基因染色，并通过流式细胞术分析。实验结果显示于图27B，其中将APRIL结合对标记基因荧光作图。这些数据显示，在这种形式中，基于APRIL的CAR是细胞表面上表达，并且APRIL充分折叠从而通过抗APRILmAb识别。
接着，确定这种形式中的APRIL是否可识别BCMA和TACI。以与小鼠IgG2a-Fc的融合物产生了重组BCMA和TACI。将这些重组蛋白与经转导的T细胞一起温育。在此之后，洗涤细胞并用抗小鼠荧光团缀合的抗体和检测缀合到不同荧光团的标记基因的抗体对细胞染色。通过流式细胞术分析细胞，结果在图27C中呈现。不同的CAR能够同时结合BCMA和TACI。出人意料地，相比于TACI，CAR能够更好地结合BCMA。此外，出人意料地，相比于具有Fc间隔区的CAR，具有CD8茎或IgG1铰链间隔区的CAR能够更好地结合BCMA和TACI。
实施例13：基于APRIL的嵌合抗原受体针对BCMA表达性细胞是有活性的
用不同APRILCAR转导来自正常供体的T细胞，并且针对野生型或经工程化改造表达BCMA和TACI的SupT1细胞进行测试。使用几种不同的测定法来确定功能。进行了经典的铬释放测定法。这里，用51Cr标记靶细胞(SupT1细胞)并以不同比例与效应物(经转导的T细胞)混合。靶细胞的裂解通过计数共培养物上清液中的51Cr确定(图28A显示了累积数据)。
此外，通过ELISA测定了来自以1:1与SupT1细胞一起培养的T细胞的上清液中的γ干扰素(图28B显示出了累积数据)。也进行了与SupT1细胞共培养一周后的T细胞扩增的测量(图28C)。通过用计数珠校准的流式细胞术对T细胞计数。这些实验数据显示，基于APRIL的CAR可以杀死表达BCMA的靶标。此外，这些数据显示，基于CD8茎或IgG1铰链的CAR比基于Fc-pvaa的CAR表现得更好。
实施例14：和门在原代细胞中的功能分析
从血液中分离PBMC，并使用PHA和IL-2刺激。两天后，在Retronectin包被的板上用含有CD19:CD33和门构建体的逆转录病毒转导细胞。在第5天，通过流式细胞术评估了通过和门构建体翻译的两种CAR的表达水平并且细胞消耗了CD56+的细胞(主要是NK细胞)。在第6天，以1:2的效应物比靶细胞的比例使PBMC与靶细胞共培养。在第8天收集上清液并通过ELISA分析IFN-γ的分泌(图29)。
这些数据证明和门在原代细胞中发挥功能。
将上述说明书中提及的所有出版物并入本文作为参考。对描述的本发明的方法和系统的多种修改和变化在不背离本发明的范围和精神的情况下对于本领域技术人员是显而易见的。尽管已经结合具体优选的实施方案描述了本发明，但应当理解，要求保护的本发明不应当不适当地受限于这些具体实施方案。实际上，对描述的用于实施本发明的模式的多种修改对于分子生物学，细胞生物学或相关领域的技术人员是显而易见的，预期落在所附权利要求书的范围之内。

Claims (26)

1.T细胞，其在细胞表面上共表达第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，每个CAR包含：
(i)抗原结合域；
(ii)间隔区；
(iii)跨膜域；和
(iv)内域；
其中所述第一和第二CAR的抗原结合域结合不同抗原，其中所述第一CAR的间隔区不同于所述第二CAR的间隔区，并且其中第一或第二CAR中的一个是包含活化性内域的活化性CAR，并且另一个CAR是包含连接关闭抑制性内域的抑制性CAR。
2.根据权利要求1的T细胞，其中所述第一CAR的间隔区具有与所述第二CAR的间隔区不同的长度和/或电荷和/或大小和/或构造和/或糖基化，使得当所述第一CAR和所述第二CAR结合它们各自的靶抗原时，所述第一CAR和第二CAR在T细胞膜上在空间上被分开。
3.根据权利要求2的T细胞，其中第一间隔区或第二间隔区包含CD8茎，并且另一个间隔区包含IgG1的铰链，CH2和CH3域。
4.根据权利要求2或3的T细胞，其中所述第一CAR或第二CAR中的一个是包含活化性内域的活化性CAR，而另一个CAR是包含连接关闭抑制性内域的抑制性CAR，所述抑制性CAR在不存在抑制性CAR连接的情况下抑制通过活化性CAR的T-细胞活化，并且当连接所述抑制性CAR时不显著抑制通过所述活化性CAR的T-细胞活化。
5.根据权利要求4的T细胞，其中所述抑制性内域包含来自CD148或CD45的内域的全部或部分。
6.根据权利要求4或5的T细胞，其中所述第一CAR的抗原结合域结合CD5，而所述第二CAR的抗原结合域结合CD19。
7.T细胞，其包含超过两个如前述权利要求中定义的CAR，使得它被携带超过两种抗原的独特模式的细胞，如T细胞特异性刺激。
8.核酸序列，其编码如权利要求1-7中任一项所定义的第一和第二嵌合抗原受体(CAR)。
9.根据权利要求8的核酸序列，其具有以下结构：
AgB1-间隔区1-TM1-endo1-coexpr-AgB2-间隔区2-TM2-endo2
其中，
AgB1是编码所述第一CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区1是编码所述第一CAR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码所述第一CAR的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码所述第一CAR的内域的核酸序列；
coexpr是使这两个CAR能够共表达的核酸序列；
AgB2是编码所述第二CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区2是编码所述第二CAR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码所述第二CAR的跨膜域的核酸序列；
endo2是编码所述第二CAR的内域的核酸序列；
其中当在T细胞中表达时，所述核酸序列编码多肽，所述多肽在切割位点处切割，使得所述第一和第二CAR共表达在T细胞表面上。
10.根据权利要求9的核酸序列，其中coexpr编码包含自我切割肽的序列。
11.根据权利要求9或10的核酸序列，其中备选密码子用于编码相同或相似氨基酸序列的序列区，以避免同源重组。
12.试剂盒，其包含
(i)第一核酸序列，其编码如权利要求1-7中任一项所定义的第一嵌合抗原受体(CAR)，所述核酸序列具有以下结构：
AgB1-间隔区1-TM1-endo1
其中，
AgB1是编码所述第一CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区1是编码所述第一CAR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码所述第一CAR的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码所述第一CAR的内域的核酸序列；和
(ii)第二核酸序列，其编码如权利要求1-7中任一项所定义的第二嵌合抗原受体(CAR)，所述核酸序列具有以下结构：
AgB2-间隔区2-TM2-endo2
AgB2是编码所述第二CAR的抗原结合域的核酸序列；
间隔区2是编码所述第二CAR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码所述第二CAR的跨膜域的核酸序列；
endo2是编码所述第二CAR的内域的核酸序列。
13.试剂盒，其包含：第一载体，其包含如权利要求12中定义的第一核酸序列；和第二载体，其包含如权利要求12中定义的第一核酸序列。
14.根据权利要求13的试剂盒，其中所述载体是整合型病毒载体或转座子。
15.载体，其包含根据权利要求8-11中任一项的核酸序列。
16.根据权利要求15的逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。
17.用于制备根据权利要求1-7中任一项的T细胞的方法，其包括将根据权利要求8-11中任一项的核酸序列；如权利要求12中定义的第一核酸序列和第二核酸序列；和/或如权利要求13中定义的第一载体和第二载体或根据权利要求15或16的载体导入T细胞中的步骤。
18.根据权利要求17的方法，其中所述T细胞来自从受试者分离的样品。
19.药物组合物，其包含多个根据权利要求1-7中任一项的T细胞。
20.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据权利要求19的药物组合物施用于受试者的步骤。
21.根据权利要求20的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者分离包含T细胞的样品；
(ii)用根据权利要求8-11中任一项的核酸序列；如权利要求12中定义的第一核酸序列和第二核酸序列；如权利要求13或14中定义的第一载体和第二载体或根据权利要求15或16的载体转导或转染所述T细胞；并
(iii)将来自(ii)的T细胞施用于所述受试者。
22.根据权利要求20或21的方法，其中所述疾病是癌症。
23.根据权利要求19的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
24.根据权利要求1-7中任一项的T细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
25.天然杀伤(NK)细胞，其在细胞表面上共表达第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，每个CAR包含：
(i)抗原结合域；
(ii)间隔区；
(iii)跨膜域；和
(iv)内域；
其中所述第一和第二CAR的抗原结合域结合不同抗原，其中所述第一CAR的间隔区不同于所述第二CAR的间隔区，并且其中所述第一或第二CAR中的一个是包含活化性内域的活化性CAR，并且另一个CAR是包含连接关闭抑制性内域的抑制性CAR。
26.包含根据权利要求1的CAR表达性T细胞和/或根据权利要求25的CAR表达性NK细胞的细胞组合物，其通过用编码所述第一和第二CAR的核酸转导离体血液样品制备。
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