CN117597358A - 用于治疗her2阳性癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Y·安藤
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Abstract

本公开涉及包含应答靶细胞中杂合性丢失的双受体系统的免疫细胞，以及其制备和使用方法。第一受体包含对HER2抗原具有特异性的活化剂受体，且第二受体包含对癌症中丢失但野生型细胞中未丢失的抗原具有特异性的抑制受体，其抑制所述第一受体对所述免疫细胞的活化。

Description

用于治疗HER2阳性癌症的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年2月16日提交的第63/146,952号美国临时专利申请的优先权和权益，所述申请的内容以全文引用的方式并入。
以引用的方式并入序列表
本申请与电子格式的序列表一同提交。序列表以名称为A2BI_035_01WO_Seq_List_ST25.txt文件提供，其创建于2022年2月16日，且大小为5,413,164字节。序列表的电子格式的信息以全文引用的方式并入。
背景技术
细胞疗法是治疗各种疾病，特别是癌症的有力工具。在常规的过继性细胞疗法中，将免疫细胞工程化以表达特定受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其通过受体与靶细胞表达的配体的相互作用将免疫细胞的活性导向细胞靶。鉴定合适的靶分子仍然具有挑战性，因为许多靶标在正常组织中表达。这类靶标的一个实例为erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2或HER2)，其在许多实体肿瘤以及正常上皮细胞的表面上表达。当移植细胞靶向表达HER2靶分子的正常组织时，这种表达可能会导致毒性。用HER2 CAR的临床试验已显示严重副作用，且目前靶向HER2的唯一抗体治疗仅对具有极高HER2含量的乳腺癌有效。因此，所属领域中需要适用于通过过继性细胞疗法治疗疾病，特别是癌症的组合物和方法。
发明内容
本公开提供应答癌细胞中杂合性丢失的免疫细胞，其包含：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域；和(b)抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，所述非靶抗原为I类HLA等位基因或次要组织相容性抗原(minor histocompatibility antigen；MiHA)。在一些实施例中，I类HLA等位基因包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E。在一些实施例中，I类HLA等位基因为HLA-A*02。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，靶抗原为HER2或与I类主要组织相容性复合物(MHC I)的复合物中的HER2的肽抗原。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，癌细胞表达HER2。在一些实施例中，癌细胞为乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、唾液管癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺癌细胞或结肠癌细胞。在一些实施例中，癌细胞为乳腺癌细胞或胃癌细胞。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，HLA-A*02非靶抗原是由个体的健康细胞表达。在一些实施例中，个体的健康细胞表达靶抗原和HLA-A*02非靶抗原两者。在一些实施例中，活化剂受体和抑制受体在癌细胞存在下一起特异性地活化免疫细胞。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，T细胞为CD8+CD4-T细胞。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，HER2抗原包含与SEQ ID NO:2-29中的任一个的序列或子序列至少95％一致的序列或子序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，活化剂受体为T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，活化剂受体的胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)、或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。在一些实施例中，活化剂受体的胞外配体结合结构域包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。在一些实施例中，VH和VL区包含选自由SEQ ID NO:30-42组成的群组的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：GFNIKDTYIH(SEQ IDNO:36)、ARIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:38)和SRWGGDGFYAMD[Y/V](SEQ ID NO:40)或(SEQ ID NO:41)；且VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLY(SEQ ID NO:32)和QQHYTTPP(SEQ ID NO:34)。在一些实施例中，VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：NYGMN(SEQ ID NO:37)、WINTSTGESTFADDFKG(SEQ ID NO:39)和WEVYHGYVPY(SEQ ID NO:42)；且VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：KASQDVYNAVA(SEQ ID NO:31)、SASSRYT(SEQ ID NO:33)和QQHFRTPFT(SEQ ID NO:35)。在一些实施例中，VH区包含以下的CDR序列：GFNIKDTYIH(SEQ ID NO:36)、ARIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:38)和SRWGGDGFYAMD[Y/V](SEQ ID NO:40)或(SEQ ID NO:41)；且VL区包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLY(SEQ ID NO:32)和QQHYTTPP(SEQ ID NO:34)。在一些实施例中，VH区包含以下的CDR序列：NYGMN(SEQ ID NO:37)、WINTSTGESTFADDFKG(SEQ ID NO:39)和WEVYHGYVPY(SEQ ID NO:42)；且VL区包含以下的CDR序列：KASQDVYNAVA(SEQ ID NO:31)、SASSRYT(SEQ ID NO:33)和QQHFRTPFT(SEQ ID NO:35)。在一些实施例中，VH区包含以下的CDR序列：DTYIH(SEQ ID NO:313)、RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:314)和WGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:315)；且VL区包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLYS(SEQ ID NO:311)、QQHYTTPPT(SEQID NO:312)和DTYIH(SEQ ID NO:313)。在一些实施例中，scFv包含与选自由SEQ ID NO:51、53、55、57、59和61组成的群组的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致性或与其一致的序列。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，CAR包含分离或衍生自CD8、CD28、IgG1或IgG4的铰链序列，或合成铰链。在一些实施例中，CAR包含分离或衍生自CD8或CD28的跨膜结构域。在一些实施例中，CAR包含分离或衍生自CD28、4-1BB或CD3z或其组合的胞内结构域。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，抑制受体包含TCR或CAR。在一些实施例中，抑制受体的胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)、或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。在一些实施例中，抑制受体的胞外配体结合结构域包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。在一些实施例中，VH和VL区包含选自由SEQID NO:87-102组成的群组的CDR。在一些实施例中，VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR：ASGYTFTSYHIH(SEQ ID NO:95)、WIYPGNVNTEYNEKFKGK(SEQ ID NO:98)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)，且VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR：RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFSGVP[D/A]R(SEQ ID NO:90)或(SEQ ID NO:91)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)。在一些实施例中，VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR：SGYTFTSYHMH(SEQ ID NO:97)、WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:100)和EGTYYAMDY(SEQ ID NO:102)；且VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR：RSSQSIVHSNGNTYLD(SEQ ID NO:89)、KVSNRFSGVP[D/A]R(SEQ ID NO:90)或(SEQ ID NO:91)和MQGSHVPRT(SEQ ID NO:94)。在一些实施例中，scFv包含与选自由SEQ ID NO:63-74、207、209和211组成的群组的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致性或与其一致的序列。在一些实施例中，VH区包含VH区包含以下CDR序列：SYHIH(SEQ IDNO:566)、WIYPGNVNTEYNEKFKG(SEQ ID NO:567)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)；且VL区包含以下CDR序列：RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFS(SEQ ID NO:565)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)。
在本公开的免疫细胞的一些实施例中，抑制受体包含LILRB1胞内结构域或其功能变体。在一些实施例中，抑制受体包含LILRB1铰链和跨膜结构域，或其功能变体。在一些实施例中，抑制受体包含与YGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTS TSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH(SEQ ID NO:254)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致性或与其一致的序列。
本公开提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
本公开提供一种药物组合物，其包含本公开的免疫细胞，其用作治疗癌症中的药物。
本公开提供一种多核苷酸系统，其包含一种或多种包含编码以下的多核苷酸序列的多核苷酸：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域；和(b)抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。
本公开提供一种载体，其包含本公开的多核苷酸系统。
本公开提供一种治疗鉴定为在HER2+癌症中的编码非靶抗原的等位基因处具有或疑似具有杂合性丢失的个体的HER2+癌症的方法，其包含向个体施用本公开的免疫细胞或药物组合物。
本公开提供一种制备免疫细胞疗法的方法，其包含用本公开的多核苷酸系统或载体转化免疫细胞。
本公开提供一种试剂盒，其包含本公开的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，试剂盒进一步包含使用说明书。
本公开还提供一种选择性杀伤在HER2阳性癌症中的编码非靶抗原的等位基因处具有杂合性丢失的HER2阳性肿瘤细胞的方法，其包含使HER2阳性肿瘤细胞与组合物或免疫细胞接触，肿瘤细胞是在混合培养物中。在一些实施例中，非靶抗原选自由以下组成的群组：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07和HLA-C*07。
本公开还提供一种免疫细胞，其包含：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中活化剂受体的胞外配体结合结构域包含：(i)VH区包含以下的CDR序列：DTYIH(SEQ ID NO:313)、RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:314)和WGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:315)；和(ii)VL区包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLYS(SEQ ID NO:311)、QQHYTTPPT(SEQ ID NO:312)和DTYIH(SEQ ID NO:313)区和轻链可变(VL)区.；和(b)抑制受体，其包含对由于癌细胞中的杂合性丢失而癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中抑制受体的胞外配体结合结构域包含：(i)重链可变(VH)区，其包含以下的CDR序列：SYHIH(SEQ IDNO:566)、WIYPGNVNTEYNEKFKG(SEQ ID NO:567)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)；和(ii)轻链可变(VL)区，其由RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFS(SEQ ID NO:565)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)构成。
本公开还提供一种免疫细胞，其包含：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中活化剂受体的胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:51的序列的scFv；和(b)抑制受体，其包含对由于癌细胞中的杂合性丢失而癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中抑制受体的胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:209的序列的scFv。
本公开还提供一种治疗鉴定为在编码HLA-A*02的等位基因处具有或疑似具有杂合性丢失的个体的HER2+癌症的方法，其包含向个体施用包含以下的免疫细胞：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中活化剂受体的胞外配体结合结构域包含：VH区，其包含以下的CDR序列：DTYIH(SEQ IDNO:313)、RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:314)和WGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:315)；和(ii)VL区，其包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLYS(SEQ ID NO:311)、QQHYTTPPT(SEQ ID NO:312)和DTYIH(SEQ ID NO:313)区和轻链可变(VL)区；和(b)抑制受体，其包含对由于癌细胞中的杂合性丢失而癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中抑制受体的胞外配体结合结构域包含：(i)重链可变(VH)区，其包含以下的CDR序列：SYHIH(SEQ ID NO:566)、WIYPGNVNTEYNEKFKG(SEQ ID NO:567)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)；和(ii)轻链可变(VL)区，其由RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFS(SEQ ID NO:565)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)构成。
本公开还提供一种治疗鉴定为在编码HLA-A*02的等位基因处具有或疑似具有杂合性丢失的个体的HER2+癌症的方法，其包含向个体施用包含以下的免疫细胞：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中活化剂受体的胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:51的序列的scFv；和(b)抑制受体，其包含对由于癌细胞中的杂合性丢失而癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中抑制受体的胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:209的序列的scFv。
本公开还提供一种选择性杀伤在编码HLA-A*02的等位基因处具有杂合性丢失的HER2阳性肿瘤细胞的方法，其包含使HER2阳性肿瘤细胞与包含以下的免疫细胞接触：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中活化剂受体的胞外配体结合结构域包含：(i)VH区，其包含以下的CDR序列：DTYIH(SEQ ID NO:313)、RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:314)和WGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:315)；和(ii)VL区，其包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLYS(SEQ ID NO:311)、QQHYTTPPT(SEQ ID NO:312)和DTYIH(SEQ ID NO:313)区和轻链可变(VL)区.；和(b)抑制受体，其包含对由于癌细胞中的杂合性丢失而癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中抑制受体的胞外配体结合结构域包含：(i)重链可变(VH)区，其包含以下的CDR序列：SYHIH(SEQ ID NO:566)、WIYPGNVNTEYNEKFKG(SEQ ID NO:567)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)；和(ii)轻链可变(VL)区，其由RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFS(SEQ ID NO:565)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)构成。
本公开还提供一种选择性杀伤在编码HLA-A*02的等位基因处具有杂合性丢失的HER2阳性肿瘤细胞的方法，其包含使HER2阳性肿瘤细胞与包含以下的免疫细胞接触：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中活化剂受体的胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:51的序列的scFv；和(b)抑制受体，其包含对由于癌细胞中的杂合性丢失而癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中抑制受体的胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:209的序列的scFv。
附图说明
通过参考阐述了说明性实施例的以下详细描述，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本发明的原理，并且在附图中：
图1为比较不同嵌合抗原受体与所述靶HER2的活性的表。分别相较于FRP5和4D5，FRP5*和4D5*在VH结构域中各自具有单个氨基酸变化。IgG4(EQ)具有突变CH2区以避免Fc受体结合。连接子序列：GGGSSGGGSG(SEQ ID NO:1)。
图2A为显示Jurkat细胞中的HER2活化剂EC50的曲线，通过在固体底物上的抗原滴定所测量。HER2 CAR2显示无活性。
图2B为显示Jurkat细胞中的HER2活化剂EC50的曲线，通过HCT.116靶细胞数量滴定所测量。HER2 CAR2和HER2 CAR3显示无活性。
图2C为显示Jurkat细胞中的HER2活化剂EC50的曲线和表，通过滴定靶HER2mRNA所测量。HER2 CAR2(C297)在于固体底物上进行抗原滴定(图2A)或靶细胞数量滴定(图2B)的情况下显示无活性，且进一步进行工程化具有不同铰链(CT1094，CT1095)。
图3为显示共表达HLA-A*02特异性抑制受体(HLA-A*02阻断剂)与HER2(CT292)CAR1活化剂的Jurkat细胞的活化被表达活化剂和阻断剂受体两者的配体的靶细胞阻断的一对曲线。靶A：活化剂配体(HER2)；靶B：抑制剂配体(HLA-A*02)；左图显示HCT.116靶细胞；右图：HeLa靶细胞。
图4为显示共表达HLA-A*02特异性抑制受体(HLA-A*02阻断剂)与HER2(CT299)CAR1活化剂的Jurkat细胞的活化被表达活化剂和阻断剂受体两者的配体的HCT.116靶细胞阻断的曲线。靶A：活化剂配体(HER2)；靶B：抑制剂配体(HLA-A*02)。
图5为显示单独的HER2 CAR1或HER2 CAR4或其与HLA-A*02阻断剂组合在Jurkat细胞中的表达的一系列荧光激活细胞分选(FACS)图。
图6为显示单独的HER2 CAR1(CT292)和其与HLA-A*02阻断剂构建体mPA2.1(C1765)、人源化(hu)PA2.1.14(C2162)和人源化PA2.1.18(C2163)组合在原代T细胞中的表达的一系列FACS图。HER2 CAR1和PA2.1 HLA-A*02阻断剂可在原代T细胞中表达且富集。
图7为显示HER2 CAR1(CT292)介导的原代T细胞对HeLa靶细胞的杀伤，在T细胞表达HLA-A*02抑制受体(如所指示)和HeLa靶细胞以1:40比率共表达HER2活化剂配体和HLA-A*02阻断剂靶配体时受到抑制的一系列曲线和图像。靶A：活化剂配体(HER2)；靶B：抑制剂配体(HLA-A*02)；hu：人源化；SW：选择性窗口。图像是在40小时获得，且显示HeLa细胞表达活化剂(各图的左图)或活化剂和抑制剂配体的组合(各图的右图)。效应细胞和靶细胞的比率为1:1。
图8为显示HER2 CAR1(CT292)介导的原代T细胞对HCT.116靶细胞的杀伤，在T细胞表达HLA-A*02抑制受体(如所指示)和HCT.116靶细胞以1:4比率共表达HER2活化剂配体和HLA-A*02阻断剂靶配体时受到抑制的一系列曲线和图像。靶A：活化剂配体(HER2)；靶B：抑制剂配体(HLA-A*02)；hu：人源化；SW：选择性窗口。图像是在40小时获得，且显示HCT.116细胞表达活化剂(各图的左图)或活化剂和抑制剂配体的组合(各图的右图)。效应细胞和靶细胞的比率为1:1。
图9为显示原代T细胞活化被HER2 CAR1(CT292)、HLA-A*02抑制性受体抑制为可逆的一系列曲线。使用HCT.116靶细胞分析原代T细胞的活化。靶AB：表达活化剂(HER2)和抑制剂(HLA-A*02)配体两者的HCT.116细胞；靶A：表达HER2的HCT.116细胞；RD：轮(round)；E:T代表效应:靶。仅表达HER2 CAR而非HLA-A*02抑制受体的原代T细胞在第3轮耗竭，而表达HER2 CAR和HLA-A*02抑制受体两者的原代T细胞则不。
图10为显示实验分析表达HER2 CAR和HLA-A*02抑制受体的原代T细胞在已丢失HLA-A*02表达的HER2阳性癌症的小鼠异种移植模型中杀伤靶细胞的能力的图。
图11为显示表达HER2 CAR和HLA-A*02抑制受体的原代T细胞在已丢失HLA-A*02表达的HER2阳性癌症的小鼠异种移植模型中选择性杀伤肿瘤细胞而非正常细胞的一对曲线。
图12为显示活化剂和抑制剂配体被HeLa、HCT.116和MS751靶细胞表达的一系列FACS图。使用Agilent QIFI试剂盒定量细胞表面抗原。
图13为概述HeLa、HCT.116和MS751靶细胞上的抗原密度和活化剂与阻断剂抗原的比率的表。使用Agilent QIFI试剂盒定量细胞表面抗原。
图14为显示九个受体对的敏感性的一系列曲线，其包含scFv CT292(左列)、CT299(中间列)或CT1094(右列)与无模块(仅CAR)、鼠类阻断剂(C1765)、人源化阻断剂1(C2162)或人源化阻断剂2(C2163)配对。活化剂(顶部行)和阻断剂(底部行)。
图15为显示在1:1E:T比率下，用6种活化剂-阻断剂对候选物转导的原代T细胞对HeLa靶细胞的杀伤的一系列曲线。活化剂-阻断剂对包含CT292(左列)、CT299(中间列)或CT1094(右列)的scFv与鼠类形式(C1765；顶部行)或人源化形式(C2162；底部行)的阻断剂。
图16为显示CT1118或CT1121构建体对肿瘤(实心圆)或正常(空心圆)A375靶细胞的细胞杀伤的一对曲线。在两个HLA-A*02-T细胞供体(左与右)中进行这个分析。
图17为显示在1:1E:T比率下，用HER2 CAR1(CT292)和CAR/人类阻断剂(CT2162)转染的原代T细胞对HeLa靶细胞(左图)或A375靶细胞(右图)的细胞杀伤的一对曲线。
图18为显示在三轮48小时肿瘤再激发中，在1:1E:T比率下，用HER2 CAR1或CT2162转染的原代T细胞对HER2+/HLA-A*02-HeLa靶细胞(左图)或正常HeLa靶细胞(右图)的细胞杀伤的一对曲线。
图19为显示在48小时轮次中，在1:1E:T比率下，HER2 CAR1和CT2162杀伤肿瘤(靶A；HER2+/HLA-A*02-)或正常(靶AB；HER2+/HLA-A*02+)HeLa细胞的能力的可逆性的一系列图。箭头指示暴露的顺序：肿瘤→正常→肿瘤(顶部图)与正常→顶部(top)→正常(底部图)。
图20为显示在1:1E:T比率下，未转导的T细胞(UTD)、HER2 CAR1 T细胞或CT2162细胞杀伤HER2+/HLA-A*02-HeLa细胞(“肿瘤”)或HER2+/HLA-A*02+HeLa细胞(“正常”)的能力的可逆性的一系列图像。显示在t＝48小时各顺序的靶细胞的图像，即左图：肿瘤→正常→肿瘤，与右图：正常→肿瘤→正常。比例尺＝50μm。
图21为显示在三轮48小时内，在1:1比率下，HER2 CAR1和CT2162细胞对肿瘤(靶A；实心圆)和正常(靶AB；空心圆)HeLa靶细胞的选择性杀伤的曲线。
图22为显示在与未转导细胞(UTD；左)、CT292细胞(中间)或CT118细胞(右)共培养20小时之后，对混合培养物中的肿瘤而非正常HeLa靶细胞的选择性杀伤的一系列图像。
图23为显示在与未转导细胞(UTD；左)、CT292细胞(中间)或CT118细胞(右)共培养24小时之后，对混合培养物中再激发(即，第2轮)的肿瘤而非正常HeLa靶细胞的选择性杀伤的一系列图像。
图24显示正常、肿瘤(假设HLA-A2的LOH)和细胞系(星星)中HER2和HLA-A2表达的Quant曲线。CT1118的EC50和IC50通过虚线标记。较浅虚线显示所测量的EC50和IC50的范围。实例12中描述的体内研究中使用的细胞系A375具有分别类似于HER2CT1118的EC50和IC50的HER2和HLA-A2表达。
图25显示在用未转导(“UTD”)细胞、CT292细胞和CT1118细胞治疗之后，携带肿瘤(左图)和正常(右图)A375异种移植的小鼠中的肿瘤体积。
图26A到26C显示在mRNA滴定分析中测量的CT292与HLA-A*03阻断剂、HLA-A*11阻断剂或HLA-B*07阻断剂配对的情况下的Jurkat NFAT荧光素酶(JNL)细胞抑制。
图27显示在mRNA转染后HeLa细胞表面上的已滴定的HLA-A*11:01或HLA-B*07:02蛋白。HeLa细胞用2×连续稀释的mRNA转染，所述mRNA编码加FLAG标签的HLA-A*11:01或加FLAG标签的HLA-B*07:02，最高剂量为2000ng/200,000个HeLa细胞。底部图含有0ng mRNA。
具体实施方式
本公开描述工程化的受体(如嵌合抗原受体(CAR)和工程化的T细胞受体(TCR))、过继性细胞疗法和其使用方法。工程化的受体可靶向HER2抗原且活化遗传变异以表达HER2靶向受体的免疫细胞。表达HER2靶向活化剂受体的免疫细胞可作为例如呈HER2阳性的癌症的治疗中的细胞过继性疗法的一部分用于组合物中。还预期表达HER2靶向活化剂受体的免疫细胞进一步包含第二抑制受体。第二抑制受体可预防或抑制由活化剂受体介导的免疫细胞的活化。举例来说，表达靶向HER2的活化剂受体和特异性结合单独抗原(例如I类MHC抗原)的抑制受体的免疫细胞将在表达HER2的细胞存在下活化，但不会在表达HER2和作为抑制受体靶标的I类HLA抗原两者的细胞存在下活化。表达活化和抑制性受体两者的免疫细胞的选择性活化和抑制适用于降低过继性细胞疗法中的毒性。本发明人已发现，可使用本文所描述的靶向HER2的活化剂受体和抑制性受体来采用这种策略。活化性和抑制性受体可例如为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”可指例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，且涵盖将人工特异性移植到特定免疫效应细胞(如辅助T细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)或NK细胞)上的工程化的受体。CAR可以用于将单克隆抗体的特异性赋予到T细胞上，从而允许生成大量的特异性T细胞，例如用于过继性细胞疗法。在具体实施例中，CAR导引细胞对肿瘤相关抗原(如HER2抗原)的特异性。在一些实施例中，CAR包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含抗原结合区的胞外结构域。在一些实施例中，CAR包含衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)或scFab与跨膜结构域和胞内信号传导结构域融合的融合体。融合体还可包含铰链。可使用重链-轻链(H-L)或轻链-重链(L-H)scFv。CAR设计的特异性可以来源于受体的配体(例如，肽)。取决于胞内结构域的类型，CAR可为活化剂受体或抑制受体。在一些实施例中，例如当CAR为活化剂受体时，CAR包含用于额外共刺激信号传导的结构域，如CD3、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或0X40。在一些实施例中，分子可与CAR一起共表达，包括共刺激分子、用于成像(例如用于正电子发射断层扫描)的报告基因、在添加前药后条件性去除T细胞的基因产物、归巢受体、细胞因子和细胞因子受体。如本文所用，归于嵌合抗原受体的特征可理解为指受体本身或指包含受体的宿主细胞。
如本文所用，“TCR”(有时也称为“TCR复合物”或“TCR/CD3复合物”)是指包含TCRα链、TCRβ链和一种或多种不变CD3链(ζ、γ、δ和ε)(有时称为亚基)的蛋白质复合物。TCRα和β链可以是二硫键连接的，以充当与肽-MHC复合物结合的异二聚体。一旦TCRα/β异二聚体接合肽-MHC，相关不变CD3亚基中TCR复合物的构象变化被诱导，这导致它们磷酸化并与下游蛋白质结合，从而转导初级刺激信号。在示范性TCR复合物中，TCRα和TCRβ多肽形成异二聚体，CD3ε和CD3δ形成异二聚体，CD3ε和CD3γ形成异二聚体，且两个CD3ζ形成同二聚体。
术语“刺激”是指通过刺激结构域或刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合，从而调节信号转导事件(如但不限于通过TCR/CD3复合物进行的信号转导)诱导的初级应答。刺激可介导某些分子的表达改变和/或细胞骨架结构重组等等。
术语“刺激分子”或“刺激结构域”是指当由T细胞天然表达时提供在T细胞信号传导路径的至少一些方面以刺激方式调节TCR复合物的活化的初级胞质信号传导序列的分子或其部分。野生型TCR复合物的TCRα和/或TCRβ链不含刺激结构域且需要与CD3亚基(如CD3ζ)结合以起始信号传导。在一个方面中，初级刺激信号通过例如TCR/CD3复合物与结合肽的主要组织相容性复合物(MHC)结合来起始，且其导致介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等等。如本文所描述的一个或多个刺激结构域可与具有TCR复合物的任何一个或多个亚基的胞内部分融合，所述亚基包括TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3γ和CD3ε。
如本文所用，“能够提供刺激信号的结构域”是指可直接或间接提供增强或增加通过TCR复合物介导的信号传导增强T细胞信号传导的至少一些方面的效用的刺激信号的任何结构域。能够提供刺激信号的结构域可直接提供此信号，例如能够提供刺激信号的结构域为初级刺激结构域或共刺激结构域。或者或另外，能够提供刺激信号的结构域可间接起作用。举例来说，结构域可为将刺激蛋白募集到TCR，或提供通过下游靶标起作用以提供刺激信号的酶活性(如激酶活性)的支架。
如本文所用，“能够提供抑制信号的结构域”是指可直接或间接提供抑制或降低通过TCR复合物介导的信号传导的效用的抑制信号的任何结构域。能够提供抑制信号的结构域可完全或部分地降低或阻断T细胞信号传导或功能的至少一些方面。能够提供抑制信号的结构域可直接提供此信号，例如能够提供抑制信号的结构域提供初级抑制信号。或者或另外，能够提供刺激信号的结构域可间接起作用。举例来说，结构域可将额外抑制蛋白募集到TCR，或可提供通过下游靶标起作用以提供抑制信号的酶活性。
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以范围格式呈现。应理解，采用范围格式的描述仅为了方便和简洁起见，且不应当解释为是对本发明的范围的硬性限制。因此，对范围的描述应当被认为已经明确地公开了所有可能的子范围以及所述范围内的个别数值。举例来说，对例如1到6的范围的描述应当被认为已经明确地公开了例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等的子范围，以及所述范围内的个别数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一实例，范围(如95-99％一致性)包括具有95％、96％、97％、98％或99％一致性的某物，且包括如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％一致性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
通常，“序列一致性”或“序列同源性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应关系。通常，用于确定序列一致性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二个核苷酸或氨基酸序列进行比较。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过测定它们的“一致性百分比”进行比较。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的一致性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并乘以100。举例来说，还可以例如通过使用可从美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)获得的高级BLAST计算机程序(包括2.2.9版)比较序列信息来确定一致性百分比。BLAST程序基于Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:2264-2268(1990)的比对方法并且如Altschul等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410(1990)；Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊》90:5873-5877(1993)；和Altschul等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402(1997)中所论述。简言之，BLAST程序将一致性定义为相同比对符号(通常为核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短序列中符号的总数。所述程序可用于确定在所比较蛋白质全长上的一致性百分比。提供默认参数以优化用短查询序列的搜索，例如在blastp程序的情况下。所需序列一致性程度的范围为大约80％至100％和其间的整数值。通常，公开的序列和要求保护的序列之间的一致性百分比为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
如本文所用，“子序列”是指形成本文所描述的序列的一部分的一段连续氨基酸或核苷酸。当与全长序列比对时，子序列可与全长序列的一部分一致，或与同其比对的全长序列的一部分小于100％一致(例如与50％的全序列90％一致等等)。
术语“外源性”在本文中用于指来源于生物体外部的任何分子，包括核酸、蛋白质或肽、小分子化合物等等。相反，术语“内源性”是指来源于生物体内部(即，由生物体天然产生)的任何分子。
当多核苷酸放于与其它多核苷酸的功能关系中时，其与另一多核苷酸“可操作地连接”。举例来说，如果启动子或增强子影响序列的转录，那么它们与编码序列可操作地连接。当编码肽的多核苷酸可操作地连接时，优选地它们处于相同开放阅读框中，肽与另一肽“可操作地连接”。
“启动子”为DNA中打开或关闭基因所需的序列。启动子紧靠转录起始位点的上游定位和/或与转录起始位点重叠，且长度通常在约一百个到数百个碱基对之间。
本文提到的所有公开案和专利均以全文引用的方式并入，就如同各个别公开案或专利被明确地且单独地指出以引用的方式并入一般。在冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。然而，提到本文引用的任何参考文献、论文、公开案、专利、专利公开案和专利申请不是且不应认为是承认或以任何形式暗示其构成有效现有技术或形成世界上任何国家的公共常识的一部分。
在本说明书中，除非另外指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值并且适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。当紧接在一个数字或数值之前时，术语“约”意指所述数字或数值的范围加或减10％。
抗原
所公开的活化剂受体可与erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原特异性结合。HER2抗原，也称为Neu、ErbB2和其他别名，为在活化后与其他ErbB家族成员形成同或异二聚体以促进胞内信号传导，从而产生存活信号和增殖的受体酪氨酸激酶。HER2被过度表达，或具有有助于驱动各种癌症(如乳腺癌、肺癌和其他癌症)的机制的剪接变体和异构体的差异表达。
在一些实施例中，靶抗原为具有I类主要组织相容性复合物(MHC I)或II类主要组织相容性复合物(MHC II)的复合物中的HER2的肽抗原。在一些实施例中，与MHC I结合的HER2肽包含KIFGSLAFL(SEQ ID NO:309)。在一些实施例中，与MHC II结合的HER2肽包含GSPYVSRLLGICL(SEQ ID NO:310)。在一些实施例中，HER2抗原包含与SEQ ID NO:2-29中的任一个的序列或子序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致或与其一致的序列或子序列。然而，所有HER2异构体以及充当HER2抗原的其序列和子序列均被设想为在本公开的范围内。在一些实施例中，HER2抗原包含含有SEQ ID NO:2-29中的任一个的序列的蛋白质、或SEQ ID NO:2-29中的任一个的肽片段。在一些实施例中，HER2抗原包含具有I类主要组织相容性复合物(MHC-I)的复合物中的SEQ ID NO:2-29中的任一个的肽片段。
包含表达HER2抗原的癌细胞的任何癌症为HER2阳性(HER2+)癌症。在一些实施例中，癌细胞为乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、唾液管癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺癌细胞或结肠癌细胞。在一些实施例中，癌细胞为乳腺癌细胞或胃癌细胞。
工程化受体
本公开提供一种活化剂受体和抑制受体，其包含胞外区，所述胞外区包含能够特异性结合活化受体或促进受体活化的第一配体的第一配体结合结构域，其促进表达受体的效应细胞的活化。本公开进一步提供一种抑制受体，其包含能够结合第二配体的第二配体结合结构域，其中第二配体与第二配体结合结构域的结合抑制、降低或防止效应细胞即使在与第一配体结合的第一受体存在下的活化。第一配体也可称为活化剂配体。第二配体也可称为抑制剂配体。与这些配体结合的活化剂受体和抑制受体在本文中一般也可称为工程化受体。工程化受体可指本公开中描述的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。工程化受体还可指使用本文所描述的结合结构域、铰链区、跨膜结构域和/或胞质结构域设计的任何受体。工程化受体在本文中有时称为融合蛋白。
活化剂配体
本公开提供第一配体、活化剂和第一工程化受体，其包含与第一活化剂配体结合的第一配体结合结构域。在一些实施例中，第一工程化受体为活化剂受体。在一些实施例中，活化剂受体为T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，第一活化剂配体为HER2抗原。在一些实施例中，HER2抗原包含与SEQ ID NO:2-29中的任一个的序列或子序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致，或与其一致的序列或子序列。说明性HER2序列在表1中示出。
表1：说明性HER2序列
在一些实施例中，活化剂抗原为具有I类主要组织相容性复合物(MHC I)的复合物中的HER2的肽抗原。在一些实施例中，活化剂抗原为不处于具有I类主要组织相容性复合物(MHC I)中的HER2的肽抗原。
如本文所用，“活化剂”或“活化剂配体”是指与本公开的工程化受体(如CAR或TCR)的第一活化剂配体结合结构域(LBD)结合，从而调节表达活化剂受体的T细胞的活化的第一配体。活化剂配体由靶细胞(例如癌细胞)表达，且还可比仅仅靶细胞更广泛地表达。举例来说，活化剂可在一些或所有类型的正常非靶细胞(如上皮细胞)上表达。
在一些实施例中，活化剂配体由靶细胞表达且不由非靶细胞(即，过继性细胞疗法不靶向的正常细胞)表达。在一些实施例中，靶细胞为癌细胞，且非靶细胞为非癌性细胞。
在一些实施例中，活化剂配体在靶细胞上具有高细胞表面表达。这种高细胞表面表达赋予递送较大活化信号的能力。测量细胞表面表达的方法为所属领域的一般技术人员已知，且包括但不限于使用适当的抗活化剂配体的抗体的免疫组织化学，随后显微检查或荧光激活细胞分选(FACS)。
活化剂配体存在于所有靶细胞上。在一些实施例中，靶细胞为例如HER2+乳腺癌中的癌细胞，如HER2+癌细胞。
在一些实施例中，活化剂配体存在于多种靶细胞上。在一些实施例中，靶细胞为癌细胞。在一些实施例中，活化剂配体存在于至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的靶细胞上。在一些实施例中，活化剂配体存在于至少95％靶细胞上。在一些实施例中，活化剂配体存在于至少99％靶细胞上。
在一些实施例中，第一活化剂配体由多种靶细胞和多种非靶细胞表达。在一些实施例中，多种非靶细胞表达第一活化剂配体和第二抑制剂配体。
在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，第一配体与第二配体的比率为约1:100到约100:1。在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，第一配体与第二配体的比率为约1:50到约50:1。在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，第一配体与第二配体的比率为约1:40到约40:1。在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，第一配体与第二配体的比率为约1:30到约30:1。在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，第一配体与第二配体的比率为约1:20到约2:1。在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，第一配体与第二配体的比率为约1:10到约10:1。在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，第一配体与第二配体的比率为约1:5到约5:1。在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，第一配体与第二配体的比率为约1:3到约3:1。在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，第一配体与第二配体的比率为约1:2到约2:1。在一些实施例中，第一活化剂配体和第二抑制剂配体存在于多种非靶靶细胞上，比率为约1:1。
胞外配体结合结构域
本公开提供包含多肽的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，多肽包含配体结合结构域，如抗原结合结构域。合适的抗原结合结构域包括但不限于来自抗体的抗原结合结构域、抗体片段、scFv、衍生自T细胞受体的抗原结合结构域等等。所属领域中已知的抗原结合结构域的所有形式均设想为在本公开的范围内。
如本文所用，“胞外结构域”是指蛋白质的胞外部分。举例来说，TCRα和β链各自包含胞外结构域，其包含涉及肽-MHC识别的恒定区和可变区。“胞外结构域”也可包含例如在能够结合且靶向特定抗原的额外结构域与TCR亚基的内源性胞外结构域之间的融合体的融合结构域。
本文所用，术语“抗体”是指衍生自免疫球蛋白分子、与抗原特异性结合的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白或其片段，并且可以衍生自天然或重组来源。
术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指抗体或其重组变体的至少一个部分，其含有抗原结合结构域，即完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶(如抗原和其定义的表位)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、单链(sc)Fv(“scFv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(缩写为“sdAb”)(VL或VH)、骆驼科VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽连接子连续连接，且能够表达为单个多肽链，且其中scFv保留其来源的完整抗体的特异性。
关于抗体的“重链可变区”或“VH”(或在单结构域抗体的情况下，例如，纳米抗体，则为“VHH”)是指重链的片段，其含有插入在称为构架区的侧接延伸段之间的三个CDR，这些构架区通常比CDR更高度保守且形成支架以支持CDR。
除非说明，否则如本文所用，scFv可以具有例如相对于多肽的N端和C端呈任一顺序的VL和VH可变区，scFv可包含VL-连接子-VH或可包含VH-连接子-VL。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中的较小者。κ(“K”)和λ(“λ”)轻链是指两种主要的抗体轻链同型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。所述术语还应解释为意谓通过合成编码所述抗体的DNA分子而产生的抗体，且所述DNA分子表达抗体蛋白质或指定所述抗体的氨基酸序列，其中所述DNA或氨基酸序列是使用可用且所属领域中众所周知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
在一些实施例中，例如其中受体包含第一和第二多肽的那些实施例，抗原结合结构域分离或衍生自T细胞受体(TCR)胞外结构域或抗体。
在一些实施例中，活化剂受体的胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)、或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。在一些实施例中，活化剂受体的胞外配体结合结构域包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。在一些实施例中，VH和VL区包含选自表2中公开的CDR的群组的互补决定区(CDR；complementdetermining region)。
表2：HER2抗原结合结构域互补决定区(CDR)
在一些实施例中，VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：GFNIKDTYIH(SEQ ID NO:36)、ARIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:38)和SRWGGDGFYAMD[Y/V](SEQ ID NO:40)或(SEQ ID NO:41)；且VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLY(SEQ ID NO:32)和QQHYTTPP(SEQ ID NO:34)。
在一些实施例中，VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：NYGMN(SEQ ID NO:37)、WINTSTGESTFADDFKG(SEQ ID NO:39)和WEVYHGYVPY(SEQ ID NO:42)；且VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：KASQDVYNAVA(SEQ ID NO:31)、SASSRYT(SEQ ID NO:33)和QQHFRTPFT(SEQ ID NO:35)。
在一些实施例中，VH区包含以下的CDR序列：GFNIKDTYIH(SEQ ID NO:36)、ARIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:38)和SRWGGDGFYAMDY(SEQ ID NO:40)或SRWGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:41)；且VL区包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLY(SEQID NO:32)和QQHYTTPP(SEQ ID NO:34)。
在一些实施例中，VH区包含以下的CDR序列：NYGMN(SEQ ID NO:37)、WINTSTGESTFADDFKG(SEQ ID NO:39)和WEVYHGYVPY(SEQ ID NO:42)；且VL区包含以下的CDR序列：KASQDVYNAVA(SEQ ID NO:31)、SASSRYT(SEQ ID NO:33)和QQHFRTPFT(SEQ ID NO:35)。
在一些实施例中，VH区包含以下的CDR序列：DTYIH(SEQ ID NO:313)、RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:314)和WGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:315)；且VL区包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLYS(SEQ ID NO:311)和QQHYTTPPT(SEQ IDNO:312)。
在一些实施例中，全长VH和VL区包含表3中所公开的序列。在一些实施例中，结合结构域包含单一多肽上的全长VH区和VL区。在一些实施例中，多肽从N端到C端包含全长VH区和全长VL区。在一些实施例中，多肽从N端到C端包含全长VL区和全长VH区。在一些实施例中，全长VH和VL包含选自表3的序列。在一些实施例中，结合结构域包含SEQ ID NO:43和SEQID NO:44。在一些实施例中，结合结构域包含SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。在一些实施例中，结合结构域包含SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48。在一些实施例中，结合结构域包含SEQID NO:45和SEQ ID NO:49。在一些实施例中，结合结构域包含SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:49。
表3：HER2 CAR构建体的VH和VL结构域
在一些实施例中，结合结构域为HER2 scFv结构域。在一些实施例中，HER2 scFv结构域选自表4中列举的序列。在一些实施例中，HER2 scFv结构域包含含有SEQ ID NO:51的多肽。在一些实施例中，HER2 scFv结构域由包含SEQ ID NO:52的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，HER2 scFv结构域包含含有SEQ ID NO:53的多肽。在一些实施例中，HER2 scFv结构域由包含SEQ ID NO:54的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，HER2 scFv结构域包含含有SEQ ID NO:55的多肽。在一些实施例中，HER2 scFv结构域由包含SEQ ID NO:56的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，HER2 scFv结构域包含含有SEQ ID NO:57的多肽。在一些实施例中，HER2 scFv结构域由包含SEQ ID NO:58的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，HER2 scFv结构域包含含有SEQ ID NO:59的多肽。在一些实施例中，HER2 scFv结构域由包含SEQ ID NO:60的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，HER2 scFv结构域包含含有SEQ IDNO:61的多肽。在一些实施例中，HER2 scFv结构域由包含SEQ ID NO:62的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，HER2 scFv结构域由包含SEQ ID NO:21803的多核苷酸序列编码。
表4：HER2 CAR构建体的HER2 ScFv结构域
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在一些实施例中，HER2 scFv结构域包含SEQ ID NO:51、53、55、57、59或61中的任一个的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致或与其一致的序列。
抑制受体
本公开提供第二配体、抑制剂和第二抑制受体，其包含与抑制剂配体结合的第二配体结合结构域。在一些实施例中，第二抑制配体为抗原，且第二抑制受体包含特异性识别第二抑制抗原的抗原结合结构域。
本公开提供一种包含胞外区的第二抑制受体，所述胞外区包含能够与抑制表达第一和第二受体的效应细胞的活化的第二配体特异性结合的第二配体结合结构域，其中效应细胞通过第一配体与第一活化剂受体的结合活化。
如本文所用，“抑制剂”或“抑制剂配体”是指与本公开的工程化受体的第二配体结合结构域(抑制剂LBD)结合，但抑制表达工程化受体的免疫细胞的活化的第二配体。抑制剂不由靶细胞表达。抑制剂配体也在多种正常非靶细胞中表达，包括表达活化剂配体的正常非靶细胞，从而保护这些细胞免于过继性细胞疗法的细胞毒性作用。不希望受理论所束缚，抑制剂配体可通过多种机制阻断效应细胞的活化。举例来说，抑制剂配体与抑制剂LBD的结合可阻断在活化剂配体与活化剂LBD结合后发生的信号传输，其在不存在抑制剂的情况下将导致表达本文所描述的工程化受体的免疫细胞活化。
或者或另外，抑制剂配体与第二工程化受体的结合可导致从包含本文所描述的两种受体系统的免疫细胞的表面丢失第一活化剂受体的细胞表面表达。不希望受理论所束缚，认为免疫细胞接合正常细胞上的活化剂和抑制剂配体产生抑制受体以引起从免疫细胞表面去除附近活化剂受体分子。这个过程局部地使免疫细胞失敏，从而可逆地升高其活化阈值。仅接合靶细胞上的活化剂配体的免疫细胞产生不受来自第二抑制受体的信号阻碍的局部活化信号。这种局部活化增加，直到释放细胞毒性颗粒导致靶细胞选择性细胞死亡。然而，表面受体表达水平的调节可能不是抑制受体借以抑制第一活化剂受体对免疫细胞的活化的唯一机制。不希望受理论所束缚，其它机制可开始起作用，包括但不限于活化剂与抑制受体信号传导路径之间的交叉对话。
在一些实施例中，第二配体不由靶细胞表达，且是由非靶细胞表达。在一些实施例中，靶细胞为癌细胞，且非靶细胞为非癌性细胞。
在一些实施例中，第二抑制剂配体为抗原，且第二配体结合结构域包含scFv结构域。
在一些实施例中，第二抑制剂配体结合结构域包含仅Vβ的配体结合结构域。
在一些实施例中，第二抑制剂配体结合结构域包含分离或衍生自T细胞受体(TCR)的抗原结合结构域。举例来说，第二抑制剂配体结合结构域包含TCRα和β链可变结构域。
在一些实施例中，第二抑制剂配体结合结构域为抗原结合结构域。合适的抗原结合结构域包括但不限于来自抗体的抗原结合结构域、抗体片段、scFv、衍生自T细胞受体的抗原结合结构域等等。
抑制剂靶标
本公开提供一种抑制受体。在一些实施例中，抑制受体包含对由于癌细胞中的杂合性丢失而癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。在一些实施例中，非靶抗原为I类HLA等位基因或次要组织相容性抗原(MiHA)。在一些实施例中，I类HLA等位基因包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E。在一些实施例中，I类HLA等位基因为HLA-A*02。在一些实施例中，HLA-A*02非靶抗原由个体的健康细胞表达。
在一些实施例中，抑制受体包含对由于癌细胞中的杂合性丢失而癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外抗原结合结构域。
或者或另外，活化剂和抑制剂靶标的表达可能相关，即所述两种以类似水平在非靶细胞上表达。
在一些实施例中，第二抑制剂配体为肽配体。在一些实施例中，第二抑制剂配体为与I类主要组织相容性(MHC)复合物(肽MHC，或pMHC)复合的肽抗原。包含与包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E中的任一个的pMHC复合的肽抗原的抑制剂配体设想为在本公开的范围内。
在一些实施例中，抑制剂配体由许多肿瘤中不存在或为多态性的基因编码。
区别靶细胞与非靶细胞之间的抑制剂配体的差异表达的方法对于所属领域的人员或一般技术人员将是显而易见的。举例来说，非靶细胞和靶细胞中抑制剂配体的存在与否可通过如下来分析：用与抑制剂配体结合的抗体进行免疫组织化学，随后显微术或FACS，靶细胞和非靶细胞的RNA表达谱，或非靶细胞和靶细胞的DNA测序以确定在靶细胞或非靶细胞中抑制剂配体的基因组基因座是否包含突变。
由于杂合性丢失(Loss of Heterozygosity；LOH)所致的等位基因丢失
原发性肿瘤中的纯合缺失为罕见的且较少，且因此不太可能产生靶B候选物。举例来说，在跨越21种人类癌症类型的2218种原发性肿瘤的分析中，前四个候选物为细胞周期素依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、RB转录辅阻遏物1(RB1)、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)和N3PB2。然而，跨所有癌症中，自仅5％纯合缺失中缺失CDKN2A(P16)。纯合HLA-A缺失发现于小于0.2％的癌症中(Cheng等人,《自然通信(Nature Comm.)》8:1221(2017))。相比之下，由于半合子状态丢失而癌细胞中缺失基因的单一拷贝远远更频繁地发生。
在一些实施例中，第二抑制剂配体包含由于杂合性丢失而靶细胞中丢失的基因的等位基因。在一些实施例中，靶细胞包含癌细胞。癌细胞经历频繁基因组重排，包括重复和缺失。这些缺失可导致癌细胞中缺失一种或多种基因的一个拷贝。
如本文所用，“杂合性丢失(LOH)”是指癌症中高频发生，由此缺失两个等位基因中的一个，留下单个单等位基因(半合子)基因座的遗传变化。
I类HLA等位基因
在一些实施例中，第二抑制剂配体包含I类HLA等位基因。I类主要组织相容性复合物(MHC)为向免疫系统的细胞显示抗原，从而触发免疫应答的蛋白质复合物。对应于I类MHC的人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen；HLA)为HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-E。
在一些实施例中，第二抑制剂配体包含I类HLA等位基因。在一些实施例中，第二抑制剂配体包含通过LOH而靶细胞中丢失的I类HLA的等位基因。HLA-A为一类由HLA-A基因座编码的主要组织相容性复合物(MHC)的人类白细胞抗原(HLA)。HLA-A为人类I类MHC细胞表面受体的三种主要类型之一。受体为包含重链α链和较小β链的异二聚体。α链由HLA-A的变体编码，而β链(β2-微球蛋白)为不变的。存在几千种HLA-A变体，所有这些均落入本公开的范围内。
在一些实施例中，第二抑制剂配体包含HLA-B等位基因。HLA-B基因具有许多可能的变化形式(等位基因)。已知数百种HLA-B基因版本(等位基因)，其各自以特定数字给出(如HLA-B27)。
在一些实施例中，第二抑制剂配体包含HLA-C等位基因。HLA-C属于I类HLA重链旁系同源物。这种I类分子为由重链和轻链(β-2微球蛋白)组成的异二聚体。已描述超过一百个HLA-C等位基因。
在一些实施例中，I类HLA等位基因具有宽广或广泛的RNA表达。
在一些实施例中，I类HLA等位基因具有已知或一般较高的次要等位基因频率。
在一些实施例中，I类HLA等位基因不需要肽-MHC抗原，例如当I类HLA等位基因由pan-HLA配体结合结构域识别时。
在一些实施例中，第二抑制剂配体包含HLA-A等位基因。在一些实施例中，HLA-A等位基因包含HLA-A*02。所属领域中已知或本文公开的结合且识别HLA-A*02的各种单一可变结构域适用于实施例中。这类scFv包括例如但不限于下表5和表6中显示以下以肽非依赖性方式结合HLA-A*02的小鼠和人源化scFv抗体(互补决定区加下划线)：
表5：HLA-A*02ScFv序列和抑制受体构建体
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在一些实施例中，第二抗原结合结构域包含与HLA-A*02抗原结合的scFv结构域。在一些实施例中，scFv结构域包含SEQ ID NO:207、209或211的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致或与其一致的序列。在一些实施例中，scFv结构域包含SEQ ID NO:207、209或211的序列。
表6：其它HLA-A*02scFv结合结构域
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在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B*07。所属领域中已知或本文公开的结合且识别HLA-B*07的各种单一可变结构域适用于实施例中。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11。所属领域中已知或本文公开的结合且识别HLA-A*11的各种单一可变结构域适用于实施例中。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01。所属领域中已知或本文公开的结合且识别HLA-A*01的各种单一可变结构域适用于实施例中。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*03。所属领域中已知或本文公开的结合且识别HLA-A*03的各种单一可变结构域适用于实施例中。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C*07。所属领域中已知或本文公开的结合且识别HLA-C*07的各种单一可变结构域适用于实施例中。
这类scFv包括例如但不限于下表7(其中指示了加下划线的互补决定区)中的以下小鼠和人源化scFv抗体，其以非肽依赖性方式结合非靶抗原(例如HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07)：
表7：示范性HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*07结合结构域
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HLA-A*02抗原结合结构域的示范性重链和轻链CDR(分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)在下表8中显示。
表8：HLA-A*02CDR序列
在一些实施例中，scFv包含SEQ ID NO:87-102中的任一个的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:87-102中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:87-102中的任一个一致的序列。在一些实施例中，抗体的重链包含SEQ ID NO:95-102中的任一个的重链CDR，且其中抗体的轻链包含SEQ ID NO:87-94中的任一个的轻链CDR。在一些实施例中，抗体的重链包含与SEQ ID NO:95-102中的任一个的重链部分至少95％一致的序列，且其中抗体的轻链包含与SEQ ID NO:87-94中的任一个的轻链部分至少95％一致的序列。
HLA-A*03、HLA-B*07、HLA-A*11、HLA-C*07和HLA-A*01配体结合结构域结合结构域的其它示范性重链和轻链CDR(分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)在下表9中显示。
表9：HLA-A*03、HLA-B*07、HLA-A*11、HLA-C*07和HLA-A*01配体结合结构域的CDR
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在一些实施例中，第二抑制配体为HLA-A*02，且抑制配体结合结构域包含HLA-A*02抗原结合结构域。在一些实施例中，第二抗原结合结构域独立于包含HLA-A*02的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*02。在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含SEQ ID NO:63-74、207、209或211中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含与SEQ ID NO:63-74、207、209或211中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B*07，且第二受体的配体结合结构域包含HLA-B*07配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-B*07的pMHC复合物中的肽结合HLA-B*07。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含表7中所指示的B7结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含与表7表9中所指示的HLA-B*07结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-B*07scFv包含表9中所指示的HLA-B*07互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-B*07scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-B*07scFv序列中的任一个一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11，且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*11配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*11的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*11。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含表7中所指示的HLA-A*11结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含与表7中所指示的HLA-A*11结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-A*11scFv包含表9中所指示的HLA-A*11互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*11scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*11scFv序列中的任一个一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01，且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*01配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*01的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*01。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含表7中所指示的HLA-A*01结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含与表7中所指示的HLA-A*01结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-A*01scFv包含表9中所指示的HLA-A*01互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*01scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*01scFv序列中的任一个一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*03，且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*03配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*03的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*03。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含表7中所指示的HLA-A*03结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含与表7中所指示的HLA-A*03结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-A*03scFv包含表9中所指示的HLA-A*03互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*03scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所示的HLA-A*03scFv序列中的任一个一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C*07，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-C*07配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-C*07的pMHC复合物中的肽结合HLA-C*07。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含表7中所指示的HLA-C*07结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含与表7中所指示的HLA-C*07结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-C*07scFv包含表9中所指示的HLA-C*07互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-C*07scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-C*07scFv序列中的任一个一致的序列。
次要组织相容性抗原
在一些实施例中，第二抑制剂配体包含次要组织相容性抗原(MiHA)。在一些实施例中，第二抑制剂配体包含通过LOH而在靶细胞中丢失的MiHA的等位基因。
MiHA为衍生自含有等位基因之间的非同义差异且由共同HLA等位基因呈现的蛋白质的肽。非同义差异可由编码MiHA的基因的编码序列中的SNP、缺失、移码突变或插入引起。示范性MiHA的长度可为约9-12个氨基酸，且可与I类MHC和II类MHC蛋白结合。TCR与呈现MiHA的MHC复合物的结合可活化T细胞。MiHA的遗传和免疫特性对于所属领域的一般技术人员为已知的。候选MiHA为通过已知I类HLA等位基因呈递的已知肽，且已知在临床中引起T细胞应答(例如在移植物抗宿主疾病或移植排斥反应中)，且允许通过简单SNP基因分型进行患者选择。
在一些实施例中，MiHA具有宽广或广泛的RNA表达。
在一些实施例中，MiHA具有较高次要等位基因频率。
在一些实施例中，MiHA包含来源于Y染色体基因的肽。
在一些实施例中，第二抑制剂配体包含选自表10和表11中所公开的MiHA群组的MiHA。
设想为在本发明的范围内的MiHA的示范性但非限制性实例在下表10中公开。表10中的各列从左到右指示MiHA的名称、其来源的基因、可呈现MiHA的I类MHC变体和肽变体的序列[A/B变体在括号中指示)。
表10：I类HLA常染色体MiHA
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设想为在本发明的范围内的MiHA的示范性但非限制性实例在下表11中公开。表11中的各列从左到右指示MiHA的名称、其来源的基因、可呈现MiHA的I类MHC变体和肽变体的序列[A/B变体在括号中指示)。
表11：I类HLA Y连锁的MiHA
在一些实施例中，MiHA包含HA-1。HA-1为具有VL[H/R]DDLLEA(SEQ ID NO:105)的序列的肽抗原，且衍生自Rho GTP酶活化蛋白45(HA-1)基因。
与HA-1变体H肽(VLHDDLLEA(SEQ ID NO:195))选择性结合的示范性配体结合结构域显示于下表12中。TCRα和TCRβ序列被具有N端GSG连接子的序列ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:196)的P2A自我裂解多肽分隔开。
表12：Ftcr HA-1(H)抑制受体序列
在一些实施例中，第二抑制配体包含HA-1(H)。在一些实施例中，第二抑制配体结合分离或衍生自TCR。在一些实施例中，第二抑制配体结合结构域包含TCRα和TCRβ可变结构域。在一些实施例中，TCRα和TCRβ可变结构域被自我裂解多肽序列分隔开。在一些实施例中，被自我裂解多肽序列分隔开的TCRα和TCRβ可变结构域包含SEQ ID NO:197。在一些实施例中，被自我裂解多肽序列分隔开的TCRα和TCRβ可变结构域包含SEQ ID NO:197，或与其具有至少90％、至少95％或至少99％一致性的序列。在一些实施例中，TCRα和TCRβ可变结构域由SEQ ID NO:202的序列、或与其具有至少80％一致性、至少90％、至少95％或至少99％一致性的序列编码。在一些实施例中，TCRα可变结构域包含SEQ ID NO:198或与其具有至少90％、至少95％或至少99％一致性的序列。在一些实施例中，TCRβ可变结构域包含SEQ IDNO:199或与其具有至少90％、至少95％或至少99％一致性的序列。
丢失Y染色体抗原
在一些实施例中，第二抑制剂配体包含Y染色体基因，即由Y染色体上的基因编码的肽。在一些实施例中，第二抑制剂配体包含由通过丢失Y染色体(LoY)而靶细胞丢失的Y染色体基因编码的肽。举例来说，约三分之一的特征MiHA来自Y染色体。Y染色体含有超过200种蛋白质编码基因，其所有均设想为在本公开的范围内。
如本文所用，“丢失Y(loss of Y)”或“LoY”是指肿瘤中高频率发生，由此Y染色体的部分或全部的一个拷贝缺失，从而导致丢失Y染色体编码的基因的遗传变化。
丢失Y染色体已知在某些癌症中存在。举例来说，在肾透明细胞癌中存在报告的40％体细胞丢失Y染色体(Arseneault等人,《科学报告(Sci.Rep.)》7:44876(2017))。类似地，在5/31的男性乳腺癌个体中报告克隆丢失Y染色体(Wong等人,《肿瘤靶点(Oncotarget)》6(42):44927-40(2015))。来自男性患者的肿瘤中Y染色体丢失已描述为头颈癌患者的“一贯特征”(el-Naggar等人,《美国临床病理学杂志(Am J Clin Pathol)》105(1):102-8(1996))。此外，在四/七的男性胃癌患者中，Y染色体丢失与X染色体二体性相关(Saal等人,《菲尔绍文献B细胞病理学(Virchows Arch B Cell Pathol)》(1993))。因此，Y染色体基因在多种癌症中可能会丢失，且可用作抑制剂配体，其中本公开的工程化受体靶向癌细胞。
嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施例中，第一或第二工程化受体为嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，第一和第二工程化受体为嵌合抗原受体。所有CAR架构均设想为在本公开的范围内。
胞外结构域
在一些实施例中，CAR的胞外结构域包含上文描述的抗原结合结构域。
铰链区
在一些实施例中，本公开的CAR包含胞外铰链区。铰链区的并入可能会影响CAR-T细胞的细胞因子产生且改善体内CAR-T细胞扩增。示范性铰链可分离或衍生自IgG、CD28或CD8等，例如IgG1。示范性铰链结构域提供于表13中。
在一些实施例中，铰链分离或衍生自CD8α或CD28。在一些实施例中，CD8α铰链包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:219)。在一些实施例中，CD8α铰链包含SEQ ID NO:219。在一些实施例中，CD8α铰链基本上由SEQ ID NO:219组成。在一些实施例中，CD8α铰链由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT(SEQ ID NO:220)。
在一些实施例中，CD8α铰链由SEQ ID NO:220编码。
在一些实施例中，CD28铰链包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:221)。在一些实施例中，CD28铰链包含SEQ ID NO:221或基本上由其组成。在一些实施例中，CD28铰链由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：TGTACCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC(SEQ ID NO:222)。
在一些实施例中，CD28铰链由SEQ ID NO:222编码。
在一些实施例中，活化剂受体包含分离或衍生自CD8、CD28、IgG1或IgG4的铰链序列，或合成铰链。
表13：HER2 CAR构建体中的铰链结构域序列和其用途
在一些实施例中，例如其中CAR为活化剂受体的那些实施例，铰链包含SEQ ID NO:1、223、225、228或230的序列，或与其至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致或与其一致的序列。在一些实施例中，例如其中CAR为活化剂受体的那些实施例，铰链包含SEQ ID NO:1、223、225、228或230的序列。
跨膜结构域
本公开的CAR可以被设计成包含与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些实施例中，使用与CAR中的结构域之一天然结合的跨膜结构域。举例来说，包含CD28共刺激结构域的CAR也可以使用CD28跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然或合成来源。当来源是天然的时，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区可以分离或衍生自(即至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或免疫球蛋白(如IgG4)。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个端存在。任选地，短的寡肽或多肽连接子，优选地长度为2至10个氨基酸，可以在CAR的跨膜结构域和胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的连接子。
在本公开的CAR的一些实施例中，CAR包含CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:232)。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:232或基本上由其组成。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：TTCTGGGTGCTGGTCGTTGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG(SEQ ID NO:233)。
在一些实施例中，CD28跨膜结构域由SEQ ID NO:233编码。
在本公开的CAR的一些实施例中，CAR包含IL-2Rβ跨膜结构域。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：IPWLGHLLVGLSGAFGFIILV YLLI(SEQ ID NO:234)。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域包含SEQ ID NO:234或基本上由其组成。在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：ATTCCGTGGCTCGGCCACCTCCTCGTGGGCCTCAGCGGGGCTTTTGGCTTCATCATC TTAGTGTACTTGCTGATC(SEQ ID NO:235)。
在一些实施例中，IL-2Rβ跨膜结构域由SEQ ID NO:235编码。
在一些实施例中，CAR包含分离或衍生自CD8或CD28的跨膜结构域。在一些实施例中，CAR包含表14中的跨膜结构域序列。在一些实施例中，CAR包含SEQ ID NO:232或SEQ IDNO:236的跨膜结构域序列，或与其具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的序列。在一些实施例中，CAR包含SEQ ID NO:232或SEQ IDNO:236的跨膜结构域序列。在一些实施例中，CAR包含SEQ ID NO:561的跨膜结构域序列。
表14：HER2 CAR构建体中的跨膜结构域序列和其用途
胞质结构域
本公开提供一种活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。在一些实施例中，活化剂受体为T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，CAR包含分离或衍生自CD28、4-1BB或CD3z或其组合的胞内结构域。
本发明的CAR的胞质结构域或者胞内信号传导结构域负责CAR已置于其中的免疫细胞的至少一种正常效应功能的活化。术语“效应功能”是指细胞的特殊功能。调节T细胞的效应功能例如包括抑制或下调效应T细胞的诱导或增殖。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质中转导效应功能信号且引导细胞执行特殊功能的部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个结构域。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，可以使用这种截短部分代替完整链，只要其转导效应功能信号即可。在一些情况下，可以组合多个胞内结构域以实现本公开的CAR-T细胞的所要功能。因此，术语胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应功能信号的一个或多个胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本公开的CAR中的胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，其在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
因此，本公开的CAR的胞内结构域包含至少一个胞质活化结构域。在一些实施例中，胞内活化结构域确保存在活化CAR T细胞的效应功能所必需的T细胞受体(TCR)信号传导。在一些实施例中，至少一种胞质活化为CD247分子(CD3ζ)活化结构域、刺激性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)KIR2DS2活化结构域，或12kDa的DNAX-活化蛋白(DAP12)活化结构域。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:238)。
在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含SEQ ID NO:238或基本上由其组成。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGCGTAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGACTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:239)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由SEQ ID NO:239编码。
已知通过单独的TCR生成的信号通常不足以完全活化T细胞，且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化据说可以由两类不同的胞质信号传导序列介导的：通过TCR起始抗原依赖性初级活化的序列(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式作用以提供二级或共刺激信号的序列(二级胞质信号传导序列)。
初级胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。在一些实施例中，ITAM含有通过任何两个其它氨基酸与亮氨酸或异亮氨酸分隔开的酪氨酸(YxxL)(SEQ ID NO:240)。
在一些实施例中，胞质结构域含有1、2或3个ITAM。在一些实施例中，胞质结构域含有1个ITAM。在一些实施例中，胞质结构域含有2个ITAM。在一些实施例中，胞质结构域含有3个ITAM。在一些实施例中，胞质结构域含有4个ITAM。在一些实施例中，胞质结构域含有5个ITAM。
在一些实施例中，胞质结构域为CD3ζ活化结构域。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含单个ITAM。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含两个ITAM。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含三个ITAM。
在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(SEQ ID NO:241)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含SEQ ID NO:241。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域包含单个基本上由以下的氨基酸序列组成的ITAM：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(SEQ ID NO:241)。在一些实施例中，包含单个ITAM的CD3ζ活化结构域由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:242)。在一些实施例中，CD3ζ活化结构域由SEQ ID NO:242编码。
可用于本公开的CAR中的含有初级胞质信号传导序列的ITAM的其它实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选的是，本发明的CAR中的胞质信号传导分子包含衍生自CD3ζ的胞质信号传导序列。
共刺激结构域
在一些实施例中，CAR的胞质结构域可以被设计成包含CD3ζ信号传导结构域本身或与在本公开的CAR的上下文中适用的任何其它期望的胞质结构域组合。举例来说，CAR的胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激结构域。共刺激结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。这类分子的实例包括共刺激结构域，其选自由以下组成的群组：IL-2Rβ、Fc受体γ(FcRγ)、Fc受体β(FcRβ)、CD3g分子γ(CD3γ)、CD3δ、CD3ε、CD5分子(CD5)、CD22分子(CD22)、CD79a分子(CD79a)、CD79b分子(CD79b)、癌胚抗原相关细胞粘附分子3(CD66d)、CD27分子(CD27)、CD28分子(CD28)、TNF受体超家族成员9(4-1BB)、TNF受体超家族成员4(OX40)、TNF受体超家族成员8(CD30)、CD40分子(CD40)、程序性细胞死亡1(PD-1)、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2分子(CD2)、CD7分子(CD7)、TNF超家族成员14(LIGHT)、杀伤细胞凝集素样受体C2(NKG2C)和CD276分子(B7-H3)c-刺激结构域，或其功能片段。
本公开的CAR的胞质信号传导部分内的胞质结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽连接子，例如长度在2到10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适连接子的实例。
在一些实施例中，本公开的CAR的胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域分离或衍生自CD28。在一些实施例中，CD28共刺激结构域包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:243)。
在一些实施例中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:243或基本上由其组成。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：AGGAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGA GGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCTCCCAGGGATTTCGCC GCCTACCGGAGC(SEQ ID NO:244)。在一些实施例中，CD28共刺激结构域由SEQID NO:44编码。
在一些实施例中，本公开的CAR的胞内结构域包含白介素-2受体β链(IL-2Rβ或IL-2R-β)胞质结构域。在一些实施例中，IL-2Rβ结构域已截短。在一些实施例中，IL-2Rβ胞质结构域包含一个或多个STAT5募集基序。在一些实施例中，CAR在IL-2Rβ胞质结构域外包含一个或多个STAT5募集基序。
在一些实施例中，IL-2-Rβ胞内结构域包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISP LEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV(SEQ ID NO:245)。在一些实施例中，IL2R-β胞内结构域包含SEQ ID NO:245或基本上由其组成。在一些实施例中，IL-2R-β胞内结构域由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：AACTGCAGGAACACCGGGCCATGGCTGAAGAAGGTCCTGAAGTGTAACACCCCAGACCCCTCGAAGTTCTTTTCCCAGCTGAGCTCAGAGCATGGAGGCGACGTCCAGAAGTGGCTCTCTTCGCCCTTCCCCTCATCGTCCTTCAGCCCTGGCGGCCTGGCACCTGAGATCTCGCCACTAGAAGTGCTGGAGAGGGACAAGGTGACGCAGCTGCTCCCCCTGAACACTGATGCCTACTTGTCTCTCCAAGAACTCCAGGGTCAGGACCCAACTCACTTGGTG(SEQ ID NO:246)。在一些实施例中，IL-2R-β胞内结构域由SEQ ID NO:246编码。
在一实施例中，IL-2R-β胞质结构域包含一个或多个STAT5募集基序。示范性STAT5募集基序由以下提供：Passerini等人(2008)STAT5信号传导细胞因子调节CD4+CD25+调节T细胞和CD4+CD25+效应T细胞中FOXP3的表达(STAT5-signaling cytokines regulate theexpression of FOXP3 in CD4+CD25+regulatory T cells and CD4+CD25+effector Tcells).《国际免疫学(International Immunology)》,第20卷,第3期,第421-431页，和Kagoya等人(2018)含有JAK-STAT信号传导结构域的新颖嵌合抗原受体介导优良的抗肿瘤作用(A novel chimeric antigen receptor containing a JAK-STAT signaling domainmediates superior antitumor effects).《自然·医学(Nature Medicine)》数字对象标识符：10.1038/nm.4478。
在一些实施例中，STAT5募集基序由序列Tyr-Leu-Ser-Leu(SEQ ID NO:247)组成。
在一些实施例中，CAR包含分离或衍生自CD28、4-1BB和/或CD3z或其组合的胞内结构域。衍生自CD28、4-1BB和/或CD3z的示范性结构域显示于下表15中。在一些实施例中，CAR包含含有SEQ ID NO:248、250或252的序列、或与其至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致或与其一致的序列的胞内结构域。在一些实施例中，CAR包含含有SEQ ID NO:248、250或252的序列的胞内结构域。在一些实施例中，CAR胞内结构域由SEQ ID NO:249、251、253或21804中的任一个中所阐述的序列编码。
表15：HER2 CAR构建体中的胞内结构域序列和其用途
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T细胞受体(TCR)
本公开提供第一活化剂受体和包含其的免疫细胞。在一些实施例中，第一受体是T细胞受体(TCR)。用于本公开的包含胞内结构域的示范性TCR描述于2020年9月6日申请的PCT/US2020/045250中，其内容以引用的方式并入本文中。
如本文所用，“TCR”(有时也称为“TCR复合物”或“TCR/CD3复合物”)是指包含TCRα链、TCRβ链和一种或多种不变CD3链(ζ、γ、δ和ε)(有时称为亚基)的蛋白质复合物。TCRα和β链可以是二硫键连接的，以充当与肽-MHC复合物结合的异二聚体。一旦TCRα/β异二聚体接合肽-MHC，相关不变CD3亚基中TCR复合物的构象变化被诱导，这导致它们磷酸化并与下游蛋白质结合，从而转导初级刺激信号。在示范性TCR复合物中，TCRα和TCRβ多肽形成异二聚体，CD3ε和CD3δ形成异二聚体，CD3ε和CD3γ形成异二聚体，且两个CD3ζ形成同二聚体。
任何合适的配体结合结构域可以与本文所描述的TCR的胞外结构域、铰链结构域或跨膜融合。举例来说，配体结合结构域可以是抗体或TCR的抗原结合结构域，或包含抗体片段、仅Vβ结构域、线性抗体、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施例中，配体结合结构域与一个或多个TCR亚基的一个或多个胞外结构域或跨膜结构域融合。TCR亚基可以是TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ或CD3ζ。举例来说，配体结合结构域可以与TCRα或TCRβ融合，或配体结合的部分可以与两个亚基融合，例如配体结合结构域的部分可以与TCRα和TCRβ两者融合。
TCR亚基包括TCRα、TCRβ、CD3ζ、CD3δ、CD3γ和CD3ε。TCRα、TCRβ链、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ或其片段或衍生物中的任一种或多种可以与能够提供本公开的刺激信号的一个或多个结构域融合，从而增强TCR功能和活性。
分离或衍生自任何来源的TCR跨膜结构域均设想为在本公开的范围内。跨膜结构域可以源自天然或重组来源。当来源是天然的时，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。
在一些实施例中，每当TCR复合物已经与靶结合时，跨膜结构域能够向胞内结构域发送信号。本公开中特别适用的跨膜结构域可以至少包括例如TCR的α、β或ζ链、CD3δ、CD3ε或CD3γ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜区。
在一些实施例中，跨膜结构域可以通过铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)与TCR多肽的胞外区连接，例如TCRα或β链的抗原结合结构域。举例来说，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链或CD8a铰链。在一些实施例中，铰链分离或衍生自CD8α或CD28。
在一些实施例中，胞外配体结合结构域与TCR的一个或多个跨膜结构域连接。在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRα跨膜结构域、TCRβ跨膜结构域或两者。在一些实施例中，跨膜包含CD3ζ跨膜结构域。
跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个额外的氨基酸，例如，与衍生跨膜的蛋白质的胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多15个氨基酸)和/或与衍生跨膜蛋白的蛋白质的胞内区相关的一个或多个额外的氨基酸(例如，胞内区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多15个氨基酸)。
在一些实施例中，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如从而最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
当存在时，跨膜结构域可以是天然TCR跨膜结构域、来自异源膜蛋白的天然跨膜结构域或人工跨膜结构域。跨膜结构域可以是膜锚定结构域。在没有限制的情况下，天然或人工跨膜结构域可以包含约20个氨基酸的疏水α-螺旋，通常在跨膜区段侧接带有正电荷。跨膜结构域可以具有一个跨膜区段或超过一个跨膜区段。跨膜结构域/区段的预测可以使用可公开获得的预测工具(例如TMHMM，Krogh等人《分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)》2001；305(3):567-580；或TMpred，Hofmann和Stoffel《霍佩-赛勒生物化学(Biol.Chem.Hoppe-Seyler)》1993；347:166)。膜锚定系统的非限制性实例包括血小板衍生生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚(翻译后添加到信号序列)等。
在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRα跨膜结构域。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少96％一致性、至少97％一致性、至少98％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW(SEQ ID NO:316)。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含SEQID NO:316或基本上由其组成。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域由以下的序列编码：GTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGT TTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGG(SEQ ID NO:317)。
在一些实施例中，跨膜结构域包含TCRβ跨膜结构域。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少96％一致性、至少97％一致性、至少98％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO:318)。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含SEQID NO:318或基本上由其组成。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域由以下序列编码：ACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGC CGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTG(SEQ ID NO:319)。
本公开的TCR可以包含一个或多个胞内结构域。在一些实施例中，胞内结构域包含一个或多个能够向跨膜结构域提供刺激信号的结构域。在一些实施例中，胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一胞内结构域和能够提供刺激信号的第二胞内结构域。在其它实施例中，胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一、第二和第三胞内结构域。能够提供刺激信号的胞内结构域选自由以下组成的群组：CD28分子(CD28)结构域、LCK原癌基因、Src家族酪氨酸激酶(Lck)结构域、TNF受体超家族成员9(4-1BB)结构域、TNF受体超家族成员18(GITR)结构域、CD4分子(CD4)结构域、CD8a分子(CD8a)结构域、FYN原癌基因、Src家族酪氨酸激酶(Fyn)结构域、T细胞受体相关蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)结构域、用于活化T细胞的连接子(LAT)结构域、淋巴细胞胞质蛋白2(SLP76)结构域、(TCR)α、TCRβ、CD3δ、CD3γ和CD3ε胞内结构域。
在一些实施例中，胞内结构域包含至少一个胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域产生促进细胞功能的信号，例如含有TCR的细胞(例如表达TCR的T细胞)的免疫效应功能。在一些实施例中，本公开的第一受体的胞内结构域包括至少一个胞内信号传导结构域。举例来说，CD3γ、δ或ε的胞内结构域包含信号传导结构域。
在一些实施例中，胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域分离或衍生自相同的蛋白质，例如T细胞受体(TCR)α、TCRβ、CD3δ、CD3γ、CD3ε或CD3ζ。
用于本公开的活化剂受体中的胞内结构域的实例包括TCRα、TCRβ、CD3ζ和4-1BB的胞质序列，以及在抗原受体接合后协同作用以起始信号转导的胞内信号传导共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域。示范性初级胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的蛋白质的那些结构域。
在一些实施例中，胞内结构域包含CD3δ胞内结构域、CD3ε胞内结构域、CD3γ胞内结构域、CD3ζ胞内结构域、TCRα胞内结构域或TCRβ胞内结构域。
在一些实施例中，胞内结构域包含TCRα胞内结构域。在一些实施例中，TCRα胞内结构域包含Ser-Ser。在一些实施例中，TCRα胞内结构域由TCCAGC序列编码。
在一些实施例中，胞内结构域包含TCRβ胞内结构域。在一些实施例中，TCRβ胞内结构域包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性或与其一致的氨基酸序列：MAMVKRKDSR(SEQ ID NO:320)。在一些实施例中，TCRβ胞内结构域包含SEQ ID NO:320或基本上由其组成。在一些实施例中，TCRβ胞内结构域由ATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGA(SEQ ID NO:321)序列编码。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含至少一个刺激性胞内结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域(如CD3δ、CD3γ和CD3ε胞内结构域)和一个额外的刺激性胞内结构域(如共刺激结构域)。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(如CD3δ、CD3γ和CD3ε胞内结构域)和两个额外的刺激性胞内结构域。
示范性共刺激细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的蛋白质的那些结构域。共刺激分子包括但不限于I类MHC分子、BTLA、Toll配体受体，以及DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)4-1BB(CD137、TNF受体超家族成员9)和CD28分子(CD28)。共刺激蛋白可以代表以下蛋白质家族：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)以及活化性NK细胞受体。这类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、特异性结合CD83、CD4的配体等。共刺激结构域可以包含其来源的分子的整个胞内部分，或整个天然胞内信号传导结构域，或其功能变体。
在一些实施例中，刺激结构域包含共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域包含CD28或4-1BB共刺激结构域。CD28和4-1BB是完全T细胞活化所需的且已知增强T细胞效应功能的充分表征的共刺激分子。举例来说，CD28和4-1BB已经在嵌合抗原受体(CAR)中用于增强细胞因子释放、细胞溶解功能和持久性，优于仅含有CD3ζ信号传导结构域的第一代CAR。同样地，在TCR中包括共刺激结构域，例如CD28和4-1BB结构域，可以增加T细胞效应功能，且确切地说在不存在共刺激配体的情况下允许共刺激，所述共刺激配体通常在肿瘤细胞表面上下调。在一些实施例中，刺激结构域包含CD28胞内结构域或4-1BB胞内结构域。
抑制受体
本公开提供一种第二受体，其包含对已经在癌细胞中丢失的非靶抗原(如基因的等位基因变体)具有特异性的胞外配体结合结构域。非靶等位基因变体可以通过任何机制在癌细胞中丢失，如但不限于影响非靶等位基因变体表达的表观遗传变化、编码非靶等位基因变体的基因的突变、调节非靶等位基因变体表达的细胞信号传导的破坏、染色体丢失、基因组基因座的部分或完全缺失、通过修饰核酸或异染色质的基因沉默，或通过其它机制的表达丢失。在本文公开的组合物和方法的变化形式中，治疗的细胞或个体可能由于非遗传改变而展现出丢失非靶等位基因变体的表达。因此，本公开提供了用于杀伤细胞和/或治疗因任何原因(包括但不限于杂合性丢失)而缺乏非靶抗原表达的个体的组合物和方法。
示范性抑制受体描述于2020年9月6日申请的PCT/US2020/045228、2020年12月11日申请的PCT/US2020/064607、2021年4月29日申请的PCT/US2021/029907和2020年11月10日申请的PCT/US2020/059856中，其各自的内容以引用的方式并入。
本文所用，术语“抑制性嵌合抗原受体”或“抑制受体”是指与能够转导抑制或阻抑免疫细胞的免疫活性的抑制性信号的胞内信号传导结构域融合的抗原结合结构域。抑制受体具有免疫细胞抑制潜能，且与具有免疫细胞活化潜能的受体CAR不同且可区分。举例来说，CAR为活化受体，因为它们包括胞内刺激和/或共刺激结构域。抑制受体为含有胞内抑制性结构域的抑制受体。
如本文所用，“抑制信号”是指导致免疫应答阻抑(例如，细胞因子产生减少或免疫细胞活化减少)的信号转导或免疫细胞中蛋白质表达的变化。抑制或阻抑免疫细胞可以是选择性的和/或可逆的，或者不是选择性的和/或可逆的。抑制受体对非靶抗原(例如HLA-A*02)有应答。举例来说，当非靶抗原(例如HLA-A*02)结合或接触抑制受体时，抑制受体在非靶抗原与抑制受体的胞外配体结合结构域的结合后具有反应性，且活化表达抑制受体的免疫细胞中的抑制信号。
非靶抗原可为非靶等位基因变体。如本文所用，“非靶等位基因变体”是指等位基因(例如I类MHC基因的等位基因变体)，其由于杂合性丢失或表达丢失的另一机制而在靶细胞(例如癌细胞)中的降低或消除，但在正常或健康细胞中表达或可检测地表达。非靶抗原可为蛋白质或具有I类主要组织相容性复合物(MHC-I)的复合物中的其抗原肽，其中非靶抗原包含多态性。因为非靶抗原为多态性的，所以编码非靶抗原的基因的单个拷贝的丢失(其可能通过癌细胞中的杂合性丢失而发生)产生保留基因的其它多态性变体但已经丢失非靶抗原的癌细胞。举例来说，在HLA基因座具有HLA-A*02和HLA-A*01等位基因的个体可能患有仅丢失HLA-A*02等位基因的癌症。在这类个体中，HLA-A*01蛋白仍，存在但不被遇到癌细胞的免疫细胞的抑制受体识别，因为抑制剂受体被设计成对HLA-A*02(或其它非靶抗原)具有特异性。在正常非恶性细胞中，HLA-A*02(或其它非靶抗原)存在且抑制工程化免疫细胞的活化。在具有杂合性丢失的癌细胞中，HLA-A*02等位基因变体(或其它非靶抗原)丢失。被工程化以表达抑制受体的免疫细胞不接收来自抑制受体的抑制信号，因为抑制性受体仅对癌细胞上不存在的HLA-A*02(或其它非靶抗原)有应答。通过此机制，免疫细胞选择性地活化和选择性地杀死表达HER2但由于杂合性丢失而丢失HLA-A*02(或另一非靶抗原)的癌细胞。这里使用HLA-A作为实例。群体中在其它MHC基因和其它非MHC基因处也发生类似的多态性变异。因此，在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12、APCDD1或CXCL16或HLA-A*02的多态性变体。在一些实施例中，非靶抗原为I类HLA等位基因或次要组织相容性抗原(MiHA)。在一些实施例中，I类HLA等位基因包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E。在一些实施例中，I类HLA等位基因为HLA-A*02。在一些实施例中，HLA-A*02非靶抗原由个体的健康细胞表达。在一些实施例中，非靶抗原为非靶等位基因变体。在一些实施例中，非靶抗原不在个体的癌细胞中表达。在一些实施例中，非靶抗原不在个体的肿瘤中的一部分细胞中表达。在一些实施例中，个体中的癌细胞已经丢失非靶抗原的表达。细胞中非靶抗原表达的丢失或表达的缺乏可以通过任何机制实现，例如但不限于影响非靶基因表达的表观遗传变化、编码非靶抗原的基因的突变，或调节非靶基因表达的细胞信号传导的破坏。
在一些实施例中，第二受体为抑制性嵌合抗原受体(即抑制受体)。在一些实施例中，第二受体为抑制受体。在一些实施例中，第二受体为人源化的。
在一些实施例中，第二受体包含SEQ ID NO:323，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第二受体包含SEQ ID NO:324，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
本公开提供了第二受体，其为抑制受体，包含能够区分非靶抗原的单个氨基酸变体等位基因的胞外配体结合。这种区分非靶抗原的等位基因变体的能力允许第二受体在表达由配体结合结构域识别的等位基因的非靶细胞存在下抑制包含第二受体的免疫细胞的活化。然而，在丢失等位基因的靶细胞(例如通过杂合性丢失而丢失基因的一个等位基因的癌细胞)的存在下，不抑制免疫细胞的活化。
本公开提供了第二受体，其为抑制受体，包含能够区分非靶抗原的不同表达水平的胞外配体结合。这允许第二受体在表达第二受体配体的非靶细胞存在下抑制包含第二受体的免疫细胞的活化，但允许免疫细胞在表达低水平或不表达第二受体配体的癌细胞存在下活化。
抑制剂配体
在一些实施例中，非靶抗原不由靶细胞表达，而由非靶细胞表达。在一些实施例中，非靶抗原由健康细胞，即不是癌细胞的细胞表达。在一些实施例中，靶细胞是通过杂合性丢失(LOH)而丢失非靶抗原表达的多种癌细胞。在一些实施例中，非靶细胞为表达靶抗原和非靶抗原两者的多个健康细胞(即，非癌、正常或健康细胞)。
非靶细胞表达但靶细胞不表达的任何细胞表面分子可以是第二受体胞外配体结合结构域的合适的非靶抗原。举例来说，细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、胞外结构域、涉及趋化性的分子、糖蛋白、G蛋白偶联受体、跨膜、神经递质受体或电压门控离子通道可用作非靶抗原。
在一些实施例中，靶抗原为具有I类主要组织相容性复合物(MHC-I)的复合物中的癌细胞特异性抗原的肽抗原。
在一些实施例中，非靶抗原由于杂合性丢失而在癌细胞中丢失。由于杂合性丢失而在癌细胞中丢失的示范性非靶抗原包括COLEC12、APCDD1、CXCL16和HLA-A*02。在一些实施例中，非靶抗原选自由以下组成的群组：COLEC12、APCDD1和CXCL166的多态性变体、或具有I类主要组织相容性复合物(MHC-I)的复合物中的其肽抗原、或HLA-A*02。在一些实施例中，非靶抗原为包含具有I类主要组织相容性复合物(MHC-I)的复合物中的COLEC12、APCDD1和CXCL16的多态性残基的抗原肽。
包含HLA-A、HLA-B或HLA-C中的任一个的非靶MHC-1(MHC)抗原均设想为在本公开的范围内。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A。在一些实施例中，非靶抗原包含人类白细胞抗原A*02等位基因产物(HLA-A*02)。在一些实施例中，非靶抗原包含人白细胞抗原A*69。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B。在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02。
在一些实施例中，非靶抗原包含C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)或具有MHC-I的复合物中的其抗原肽。人类CXCL16前体描述于NCBI记录号NP_001094282.1中，其内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，CXCL16包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的多态性。举例来说，非靶抗原包含衍生自CXCL16的肽，其包含CXCL16的多态性残基。CXCL16的多态性残基包括SEQ ID NO:325的位置142和200。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其包含SEQ ID NO:325的氨基酸142或200。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:325的氨基酸200处包含A。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:325的氨基酸200处包含V。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:325的氨基酸142处包含I。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:325的氨基酸142处包含T。
在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的多态性。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:325的氨基酸200处包含A，且第二受体包含对于在SEQ ID NO:325的位置200处具有A的CXCL16配体的亲和力比对于在SEQ ID NO:325的位置200处具有V的CXCL16配体的亲和力更高的配体结合结构域。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:325的氨基酸200处包含V，且第二受体包含对于在SEQ ID NO:325的位置200处具有V的CXCL16配体的亲和力比对于在SEQ ID NO:325的位置200处具有A的CXCL16配体的亲和力更高的配体结合结构域。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ ID NO:325的氨基酸142处包含I，且第二受体包含对于在SEQ ID NO:325的位置142处具有I的CXCL16配体的亲和力比对于在SEQ ID NO:325的位置142处具有T的CXCL16配体的亲和力更高的配体结合结构域。在一些实施例中，非靶抗原包含CXCL16的肽，其在SEQ IDNO:325的氨基酸142处包含T，且第二受体包含对于在SEQ ID NO:325的位置142处具有T的CXCL16配体的亲和力比对于在SEQ ID NO:325的位置142处具有I的CXCL16配体的亲和力更高的配体结合结构域。
在一些实施例中，非靶抗原包含胶原凝素亚家族成员12(COLEC12)或具有MHC-I的复合物中的其抗原肽。人类COLEC12描述于NCBI记录号NP_569057.2中，其内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，COLEC12包含以下氨基酸序列：
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在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的多态性。举例来说，非靶抗原包含衍生自COLEC12的肽，其包含COLEC12的多态性残基。COLEC12的多态性残基包括SEQ ID NO:326的位置522。在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的肽，其包含SEQ ID NO:326的氨基酸522。在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的肽，其在SEQ ID NO:326的氨基酸522处包含S。在一些实施例中，非靶抗原包含COLEC12的肽，其在SEQ ID NO:326的氨基酸522处包含P。
在一些实施例中，非靶抗原包含APC下调1(APCDD1)或具有MHC-I的复合物中的其抗原肽。示范性人类APCDD1描述于UniProtKB记录号Q8J025中，其内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，APCDD1包含以下氨基酸序列：
在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的多态性。APCDD1的示范性多态性包括rs3748415，其在SEQ ID NO:327的位置150处可为V、I或L。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其包含SEQ ID NO:327的氨基酸150。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:327的氨基酸150处包含V。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:327的氨基酸150处包含I。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:327的氨基酸150处包含L。
另一示范性人APCDD1描述于UniProtKB记录号V9GY82中，其内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，APCDD1包含以下氨基酸序列：
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APCDD1的示范性多态性包括rs1786683，其在SEQ ID NO:328的位置165处可为Y或S。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其包含SEQ ID NO:328的氨基酸165。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:328的氨基酸165处包含Y。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:328的氨基酸165处包含S。
另一示范性人APCDD1描述于UniProt记录号J3QSE3中，其内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，APCDD1包含以下氨基酸序列：
APCDD1的示范性多态性包括rs9952598，其在SEQ ID NO:329的位置28处可为Q或R。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其包含SEQ ID NO:329的氨基酸28。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:329的氨基酸28处包含Q。在一些实施例中，非靶抗原包含APCDD1的肽，其在SEQ ID NO:329的氨基酸28处包含R。
在一些实施例中，APCDD1包含与SEQ ID NO:327-329中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少94％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的序列。APCDD1的多态性残基在SEQ ID NO:327-329中标记为粗体和加下划线。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*02，且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*02配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*02的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*02。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含SEQ ID NO:63-74中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*02配体结合结构域包含与SEQ ID NO:63-74中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。
在一些实施例中，HLA-A*02scFv包含SEQ ID NO:87-102中的任一个的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:87-102中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:87-102中的任一个一致的序列。在一些实施例中，抗原结合结构域的重链包含SEQ ID NO:87-102中的任一个的重链CDR，且其中抗原结合结构域的轻链包含SEQ ID NO:87-102中的任一个的轻链CDR。在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含重链和轻链，且重链包含选自SEQ ID NO:95-102的CDR，并且轻链包含选自SEQ ID NO:87-94的CDR。在任何配体结合结构域的其它实施例中，各CDR序列可以具有1、2、3或更多个取代、插入或缺失。CDR序列可以容许取代、缺失或插入。使用序列比对工具、常规实验和已知分析，所属领域的技术人员可以生成和测试在CDR序列中具有1、2、3或更多个取代、插入或缺失的变体序列，而无需过度实验。
在一些实施例中，HLA-A*02抗原结合结构域包含重链和轻链，且重链包含与SEQID NO:63-74中的任一个的重链部分至少95％一致的序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:63-74中的任一个的轻链部分至少95％一致的序列。
在一些实施例中，重链包含与SEQ ID NO:63-74中的任一个的重链部分一致的序列，且其中轻链包含与SEQ ID NO:63-74中的任一个的轻链部分一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-B*07，且第二受体的配体结合结构域包含HLA-B*07配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-B*07的pMHC复合物中的肽结合HLA-B*07。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含表7中所指示的B7结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-B*07配体结合结构域包含与表7中所指示的HLA-B*07结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-B*07scFv包含表9中所指示的HLA-B*07互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-B*07scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-B*07scFv序列中的任一个一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*11，且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*11配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*11的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*11。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含表7中所指示的HLA-A*11结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*11配体结合结构域包含与表7中所指示的HLA-A*11结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-A*11scFv包含表9中所指示的HLA-A*11互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*11scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*11scFv序列中的任一个一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*01，且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*01配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*01的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*01。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含表7中所指示的HLA-A*01结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*01配体结合结构域包含与表7中所指示的HLA-A*01结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-A*01scFv包含表9中所指示的HLA-A*01互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*01scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*01scFv序列中的任一个一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-A*03，且第二受体的配体结合结构域包含HLA-A*03配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-A*03的pMHC复合物中的肽结合HLA-A*03。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含表7中所指示的HLA-A*03结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-A*03配体结合结构域包含与表7中所指示的HLA-A*03结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-A*03scFv包含表9中所指示的HLA-A*03互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-A*03scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所示的HLA-A*03scFv序列中的任一个一致的序列。
在一些实施例中，非靶抗原包含HLA-C*07，并且第二受体的配体结合结构域包含HLA-C*07配体结合结构域。在一些实施例中，配体结合结构域独立于包含HLA-C*07的pMHC复合物中的肽结合HLA-C*07。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含scFv结构域。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含表7中所指示的HLA-C*07结合结构域中的任一个的序列。在一些实施例中，HLA-C*07配体结合结构域包含与表7中所指示的HLA-C*07结合结构域中的任一个的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列。在一些实施例中，HLA-C*07scFv包含表9中所指示的HLA-C*07互补决定区(CDR)中的任一个。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-C*07scFv序列中的任一个至少95％一致的序列。在一些实施例中，scFv包含与表7中所指示的HLA-C*07scFv序列中的任一个一致的序列。
本公开的抑制受体可以包含胞外配体结合结构域。可以以配体依赖性方式调节受体活性的任何类型的配体结合结构域均设想为在本公开的范围内。
在一些实施例中，配体结合结构域为抗原结合结构域。示范性抗原结合结构域尤其包括scFv、SdAb、仅Vβ结构域以及衍生自TCRα和β链可变结构域的TCR抗原结合结构域。
任何类型的抗原结合结构域均设想为在本公开的范围内。
在一些实施例中，第二受体的胞外配体结合结构域结合且识别COLEC12、APCDD1、CXCL16的多态性变体或具有I类主要组织相容性复合物(MHC-I)的复合物中的其抗原肽，或HLA-A*02。在一些实施例中，第二受体的胞外配体结合结构域为scFv。
在一些实施例中，第二受体的胞外配体结合结构域与抑制受体的胞外结构域融合。
在一些实施例中，本公开的抑制受体包含胞外铰链区。示范性铰链可以分离或衍生自IgD和CD8结构域，例如IgG1。在一些实施例中，铰链分离或衍生自CD8α或CD28。
本公开的抑制受体可以被设计成包含与抑制受体的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然或合成来源。当来源是天然的时，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区可以分离或衍生自(即至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或免疫球蛋白(如IgG4)。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个端存在。任选地，短的寡肽或多肽连接子，优选地长度为2到10个氨基酸之间，可以在抑制受体的跨膜结构域和胞内结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的连接子。
本公开提供了包含胞内结构域的抑制受体。本公开的抑制受体的胞内结构域负责抑制包含抑制受体的免疫细胞的活化，否则其将响应于第一受体的活化信号而被活化。在一些实施例中，例如在本公开的提供抑制信号的第二抑制受体中，抑制信号通过受体的胞内结构域传输。在一些实施例中，抑制受体包含抑制性胞内结构域。在一些实施例中，抑制性工程化受体为包含抑制性胞内结构域的CAR(抑制性CAR)。
在一些实施例中，抑制性胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif；ITIM)。在一些实施例中，包含ITIM的抑制性胞内结构域可以分离或衍生自免疫检查点抑制剂，如CTLA-4和PD-1。CTLA-4和PD-1为在T细胞表面上表达的免疫抑制受体，且在减弱或终止T细胞应答中起关键作用。
抑制性结构域可分离自人类肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)受体和CD200受体1。在一些实施例中，TRAIL受体包括TR10A、TR10B或TR10D。
在一些实施例中，抑制性结构域包含胞内结构域、跨膜结构域或其组合。在一些实施例中，抑制性胞内结构域分离自具有鞘糖脂微结构域1(PAG1)的磷蛋白膜锚。在一些实施例中，抑制性胞内结构域分离自白细胞免疫球蛋白样受体B1(LILRB1)。在一些实施例中，抑制性结构域分离或衍生自人蛋白，例如人TRAIL受体、CTLA-4、或PD-1、PAG1或LILRB1蛋白。
在一些实施例中，抑制性结构域包含胞内结构域、跨膜结构域、铰链区或其组合。在一些实施例中，抑制性结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。在一些实施例中，包含ITIM的抑制性结构域可以分离或衍生自免疫检查点抑制剂，如CTLA-4和PD-1。本文所描述的抑制受体中可使用的示范性铰链、跨膜和胞内结构域显示于表16中。
抑制性结构域可分离自人类肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)受体和CD200受体1。在一些实施例中，抑制性结构域分离或衍生自人蛋白，例如人TRAIL受体、CTLA-4或PD-1蛋白。在一些实施例中，TRAIL受体包括TR10A、TR10B或TR10D。
内源性TRAIL表达为281-氨基酸的II型反式膜蛋白，其锚定于质膜且存在于细胞表面上。TRAIL由自然杀伤细胞表达，其在建立细胞-细胞接触之后可诱导靶细胞中的TRAIL依赖性细胞凋亡。生理学上，显示TRAIL信号传导系统为免疫监视所必需的，以用于通过调节T辅助细胞1与T辅助细胞2以及“无能(helpless)”CD8+T细胞数塑形免疫系统，以及用于抑制自发性肿瘤形成。
在一些实施例中，抑制性结构域包含分离或衍生自CD200受体的胞内结构域。细胞表面糖蛋白CD200受体1(Uniprot ref：Q8TD46)代表本发明的抑制性胞内结构域的另一实例。CD200/OX2细胞表面糖蛋白的此抑制受体通过响应于所选择刺激抑制促炎性分子(TNF-α、干扰素和诱导性氧化氮合酶(iNOS))的表达限制炎症。
在一些实施例中，工程化受体包含分离或衍生自杀伤细胞免疫球蛋白样受体的抑制性结构域、三个Ig结构域和长胞质尾2(KIR3DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾3(KIR3DL3)、白细胞免疫球蛋白样受体B1(LIR1，也称为LIR-1和LILRB1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、Fcγ受体IIB(FcgRIIB)、杀伤细胞凝集素样受体K1(NKG2D)、CTLA-4、含有合成共有ITIM的结构域、ZAP70 SH2结构域(例如N和C端SH2结构域中的一个或两个)或ZAP70 KI_K369A(激酶非活性ZAP70)。
在一些实施例中，抑制性结构域分离或衍生自人蛋白。在一些实施例中，第二抑制受体包含抑制性结构域。在一些实施例中，第二抑制性受体包含抑制性胞内结构域和/或抑制性结构域和跨膜结构域。在一些实施例中，抑制性胞内结构域与抑制受体的胞内结构域融合。在一些实施例中，抑制性胞内结构域与抑制受体的跨膜结构域融合。
在一些实施例中，第二抑制受体包含分离或衍生自相同蛋白质(例如含有ITIM的蛋白质)的胞质结构域和跨膜结构域。在一些实施例中，第二抑制性受体包含胞质结构域、跨膜结构域和胞外结构域或其分离或衍生自相同蛋白质(例如含有ITIM的蛋白质)的部分。在一些实施例中，第二抑制性受体包含铰链区，其分离或衍生自与胞内结构域和/或跨膜结构域相同的蛋白质，例如含有ITIM的蛋白质。在一些实施例中，第二抑制受体包含抑制性结构域。在一些实施例中，第二抑制受体包含抑制性胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施例中，第二工程化受体为包含抑制性结构域的CAR(抑制性CAR)。在一些实施例中，抑制性胞内结构域与CAR的胞内结构域融合。在一些实施例中，抑制性胞内结构域与CAR的跨膜结构域融合。
LILRB1抑制受体
本公开提供了包含LILRB1抑制性结构域和任选的LILRB1跨膜和/或铰链结构域或其功能变体的第二抑制受体。相较于具有另一跨膜结构域或另一铰链结构域的参考抑制受体，在抑制受体中包括LILRB1跨膜结构域和/或LILRB1铰链结构域可以增加由抑制受体产生的抑制性信号。包含LILRB1抑制性结构域的第二抑制受体可以是CAR或TCR，如本文所描述。如本文中所描述的任何合适的配体结合结构域可与具有一个或多个来自白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LILRB1，或LIR1)的结构域的基于LILRB1的第二抑制受体融合。在一些实施例中，抑制受体包含LILRB1胞内结构域或其功能变体。
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LILRB1)，也称为白细胞免疫球蛋白样受体B1，以及ILT2、LIR1、MIR7、PIRB、CD85J、ILT-2、LIR-1、MIR-7和PIR-B，为白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员。LILRB1蛋白属于LIR受体的亚家族B类。这些受体含有两到四个胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和两到四个基于胞质免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。LILRB1受体在免疫细胞上表达，其中它与抗原呈递细胞上的I类MHC分子结合并转导抑制免疫应答刺激的负信号。认为LILRB1调节炎症反应以及细胞毒性，且在限制自身反应性中发挥作用。存在编码LILRB1的不同异构体的多种转录物变体，所有这些均涵盖在本公开的范围内。
在本文所描述的抑制受体的一些实施例中，抑制受体包含一个或多个分离或衍生自LILRB1的结构域。在具有一个或多个分离或衍生自LILRB1的结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域包含与SEQ ID NO:280的序列或子序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致或与其一致的氨基酸序列。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域包含与SEQ ID NO:280的序列或子序列一致的氨基酸序列。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:280的序列或子序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致或与其一致的氨基酸序列组成。在一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:280的序列或子序列一致的氨基酸序列组成。
在具有一个或多个分离或衍生自LILRB1的结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:556的序列或子序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致或与其一致的多核苷酸序列编码。
在具有一个或多个LILRB1的结构域的受体的一些实施例中，LILRB1的一个或多个结构域由与SEQ ID NO:556的序列或子序列一致的多核苷酸序列编码。在各种实施例中，提供一种包含多肽的嵌合抗原受体，其中多肽包含以下中的一个或多个：LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体；LILRB1跨膜结构域或其功能变体；和LILRB1胞内结构域或胞内结构域，其包含至少一个或至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
胞内结构域
本公开提供抑制受体，所述抑制受体包含多肽。在一些实施例中，多肽包含胞内结构域。在一些实施例中，抑制受体包含LILRB1胞内结构域或其功能变体。
如本文所用，“胞内结构域”是指蛋白质(如受体)中与细胞内部相互作用且进行胞质功能的胞质或胞内结构域。如本文所用，“胞质功能”是指蛋白质或蛋白质复合物在细胞的细胞溶质中进行的功能。举例来说，胞内信号转导级联为胞质功能。
如本文所用，“基于免疫受体酪氨酸的抑制基序”或“ITIM”是指具有S/I/V/LxYxxI/V/L(SEQ ID NO:260)等共有序列的保守氨基酸序列，其存在于免疫系统的许多抑制受体的胞质尾。在具有ITIM的抑制受体与其配体相互作用后，ITIM基序被磷酸化，从而使抑制受体募集其它酶，如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，或称为SHIP的肌醇-磷酸酶。
在一些实施例中，多肽包含胞内结构域，其包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)、至少两个ITIM、至少3个ITIM、至少4个ITIM、至少5个ITIM或至少6个ITIM。在一些实施例中，胞内结构域具有1、2、3、4、5或6个ITIM。
在一些实施例中，多肽包含含有至少一个选自由以下组成的ITIM群组的ITIM的胞内结构域：NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在其它特定实施例中，多肽包含含有至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ IDNO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在一些实施例中，胞内结构域包含ITIM NLYAAV(SEQ ID NO:256)和VTYAEV(SEQID NO:257)两个。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:260至少95％一致的序列。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:281一致的序列或基本上由其组成。
在一些实施例中，胞内结构域包含ITIM VTYAEV(SEQ ID NO:257)和VTYAQL(SEQID NO:258)两个。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:261至少95％一致的序列。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:261一致的序列或基本上由其组成。
在一些实施例中，胞内结构域包含ITIM VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQID NO:259)两个。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:262至少95％一致的序列。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:262一致的序列或基本上由其组成。
在一些实施例中，胞内结构域包含ITIM NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ IDNO:257)和VTYAQL(SEQ ID NO:258)。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:263至少95％一致的序列。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:263一致的序列或基本上由其组成。
在一些实施例中，胞内结构域包含ITIM VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ IDNO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:264至少95％一致的序列。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:264一致的序列或基本上由其组成。
在一些实施例中，胞内结构域包含ITIM NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ IDNO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。在实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:265至少95％一致的序列。在一些实施例中，胞内结构域包含与SEQ ID NO:265一致的序列或基本上由其组成。
在一些实施例中，胞内结构域包含与LILRB1胞内结构域(SEQ ID NO:266)至少95％一致的序列。在一些实施例中，胞内结构域包含与LILRB1细胞内结构域(SEQ ID NO:266)一致的序列或基本上由其组成。
本公开的LILRB1胞内结构域或其功能变体可以具有至少1个、至少2个、至少4个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个ITIM。在一些实施例中，LILRB1胞内结构域或其功能变体具有2、3、4、5或6个ITIM。
在特定实施例中，多肽包含含有二、三、四、五或六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在特定实施例中，多肽包含含有至少三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在特定实施例中，多肽包含含有三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在特定实施例中，多肽包含含有至少四个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在特定实施例中，多肽包含含有至少五个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在特定实施例中，多肽包含含有至少六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在特定实施例中，多肽包含含有至少七个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在一些实施例中，胞内结构域包含TCRα胞内结构域。在一些实施例中，胞内结构域包含TCRα胞内结构域和LILRB1胞内结构域，如本文所描述。在一些实施例中，TCRα胞内结构域包含Ser-Ser。在一些实施例中，TCRα胞内结构域由TCCAGC序列编码。
在一些实施例中，胞内结构域包含TCRβ胞内结构域。在一些实施例中，胞内结构域包含TCRβ胞内结构域和LILRB1胞内结构域，如本文所描述。在一些实施例中，TCRβ胞内结构域包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性或与其一致的氨基酸序列：MAMVKRKDSR(SEQ ID NO:267)。在一些实施例中，TCRβ胞内结构域包含MAMVKRKDSR(SEQ IDNO:267)或基本上由其组成。在一些实施例中，TCRβ胞内结构域由ATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGA(SEQ ID NO:268)序列编码。
LILRB1蛋白具有称为D1、D2、D3和D4的四个免疫球蛋白(Ig)样结构域。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含LILRB1 D3D4结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1D3D4结构域包含与SEQ ID NO:274至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致或与其一致的序列。在一些实施例中，LILRB1 D3D4结构域包含SEQ ID NO:274或基本上由其组成。
跨膜结构域
本公开提供抑制受体，所述受体包含多肽。在一些实施例中，多肽包含跨膜结构域。在一些实施例中，抑制受体包含LILRB1铰链结构域或其功能变体。在一些实施例中，抑制受体包含LILRBI跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，抑制受体包含LILRB1铰链和跨膜结构域，或其功能变体。
如本文所用，“跨膜结构域”是指蛋白质中跨越细胞膜的结构域。跨膜结构域通常主要由非极性氨基酸组成，且可穿过脂质双层一次或若干次。跨膜结构域通常包含α螺旋，一种最大化内部氢键的构型。
分离或衍生自任何来源的跨膜结构域均设想为在本公开的融合蛋白的范围内。
在特定实施例中，多肽包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体。
在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:269至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％的序列。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域或其功能变体包含与SEQ ID NO:269至少95％一致的序列。在一些实施例中，LILRB1跨膜结构域包含与SEQ ID NO:269一致的序列。在实施例中，LILRB1跨膜结构域基本上由与SEQ ID NO:269一致的序列组成。
在本公开的嵌合抗原受体的一些实施例中，跨膜结构域不为LILRB1跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域为与融合蛋白的其它结构域中的一个结合，或分离或衍生自与融合蛋白的其它结构域中的一个的相同蛋白质的结构域。
跨膜结构域可以源自天然或重组来源。当来源是天然的时，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。示范性跨膜结构域可以至少包括例如TCR的α、β或ζ链、CD3δ、CD3ε或CD3γ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜区。
在一些实施例中，跨膜包含TCRα跨膜结构域。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少96％一致性、至少97％一致性、至少98％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW(SEQ ID NO:270)。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW(SEQ ID NO:270)或基本上由其组成。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域由GTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTG AAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGG(SEQ ID NO:271)序列编码。
在一些实施例中，跨膜包含TCRβ跨膜结构域。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少96％一致性、至少97％一致性、至少98％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO:272)。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO:272)或基本上由其组成。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域由以下序列编码：ACCATCCTCTATGAGATC TTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTG(SEQ ID NO:273)。
在一些实施例中，TCRα和/或TCRβ跨膜结构域包含一个或多个减少或消除TCR与TCR CD3亚基的相互作用的突变。在一些实施例中，TCRα跨膜结构域包含R253L突变。在一些实施例中，TCRβ跨膜结构域包含K288L突变。
在一些实施例中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:232)。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:232)或基本上由其组成。在一些实施例中，CD28跨膜结构域由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：TTCTGGGTGCTGGTCGTTGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG(SEQ IDNO:233)。
在一些实施例中，跨膜结构域可通过铰链(例如来自人蛋白的铰链)与胞外区嵌合抗原受体(例如抗原结合结构域或配体结合结构域)连接。举例来说，在一些实施例中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链、CD8a铰链或LILRB1铰链。
铰链结构域
本公开提供抑制受体，所述受体包含多肽。在一些实施例中，多肽包含铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域为LILRB1铰链结构域或其功能变体。
LILRB1蛋白具有称为D1、D2、D3和D4的四个免疫球蛋白(Ig)样结构域。在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含LILRB1 D3D4结构域或其功能变体。在一些实施例中，LILRB1D3D4结构域包含与SEQ ID NO:274至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致或与其一致的序列。在一些实施例中，LILRB1 D3D4结构域包含SEQ ID NO:274或基本上由其组成。
在一些实施例中，多肽包含LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体。在实施例中，LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体包含与SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:274或SEQ IDNO:276至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致或与其一致的序列。在实施例中，LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体包含与SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:274或SEQID NO:276至少95％一致的序列。
在一些实施例中，LILRB1铰链结构域包含与SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:274或SEQID NO:276一致的序列。
在一些实施例中，LILRB1铰链结构域基本上由与SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:274或SEQ ID NO:276一致的序列组成。
在一些实施例中，本公开的嵌合抗原受体、多肽包含不是分离或衍生自LILRB1的铰链。
在一些实施例中，铰链分离或衍生自CD8α或CD28。在一些实施例中，CD8α铰链包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:219)。在一些实施例中，CD8α铰链包含TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:219)。在一些实施例中，CD8α铰链基本上由TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:219)组成。在一些实施例中，CD8α铰链由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccc tgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat(SEQ IDNO:220)。
在一些实施例中，CD28铰链包含与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的氨基酸序列：CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:221)。在一些实施例中，CD28铰链包含CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:221)或基本上由其组成。在一些实施例中，CD28铰链由与以下序列具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性、至少99％一致性或与其一致的核苷酸序列编码：tgtaccattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtc caagtcccctatttcccggaccttctaagccc(SEQ ID NO:222)。
LILRB1结构域的组合
在一些实施例中，本公开的抑制受体包含含有超过一个LILRB1结构域或其功能等效物的多肽。举例来说，在一些实施例中，多肽包含LILRB1跨膜结构域和胞内结构域，或LILRB1铰链结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
在特定实施例中，多肽包含LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体，和LILRB1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:277至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或与其一致的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:277至少95％一致的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ IDNO:277一致的序列。
在其它实施例中，多肽包含：LILRB1跨膜结构域或其功能变体，和LILRB1胞内结构域和/或包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中ITIM选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。在一些实施例中，多肽包含LILRB1跨膜结构域或其功能变体，和LILRB1胞内结构域和/或包含至少两个ITIM的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ IDNO:256)、VTYAEV(SEQ ID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在一些实施例中，多肽包含LILRB1跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:278至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或与其一致的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:278至少95％一致的序列。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:278一致的序列。
在优选实施例中，多肽包含：LILRB1铰链结构域或其功能片段或变体；LILRB1跨膜结构域或其功能变体；和LILRB1胞内结构域和/或包含至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内结构域，其中各ITIM独立地选自NLYAAV(SEQ ID NO:256)、VTYAEV(SEQID NO:257)、VTYAQL(SEQ ID NO:258)和SIYATL(SEQ ID NO:259)。
在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:279至少95％一致，或与SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:279至少99％一致，或与SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:279一致的序列。
在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:277至少99％一致，或与SEQ ID NO:277至少99％一致，或与SEQ ID NO:277一致的序列。
在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:278至少99％一致，或与SEQ ID NO:278至少99％一致，或与SEQ ID NO:278一致的序列。
在一些实施例中，抑制受体包含LIRLRB1铰链、跨膜和胞内结构域。在一些实施例中，LIRLRB1铰链、跨膜和胞内结构域包含SEQ ID NO:254的序列，或与其至少90％、至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或与其一致的序列。
表16：抑制受体铰链、跨膜和胞内结构域
本公开的基于LILRB1的抑制受体的其它序列显示于下表17中。
表17：说明性抑制受体的元件的多肽序列
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分析
本文提供可用于测量本公开的工程化受体的活性的分析。
工程化受体的活性可使用被工程化以表达受体活性的报告子(如荧光素酶报告子)的细胞系来分析。示范性细胞系包含Jurkat T细胞，但可使用所属领域中已知的任何合适的细胞系。举例来说，在NFAT启动子控制下表达荧光素酶报告子的Jurkat细胞可用作效应细胞。通过此细胞系表达荧光素酶反映TCR介导的信号传导。
报告细胞可用各种融合蛋白构建体中的每一个、本文所描述的融合蛋白构建体或对照的组合转染。
报告细胞中融合蛋白的表达可通过使用荧光标记的MHC四聚体(例如AlexaFluor647标记的HER2-MHC四聚体)以检测融合蛋白的表达来确认。
为了分析工程化受体的活性，在暴露于包含报告子和工程化受体的效应细胞之前，靶细胞负载有抗原。举例来说，在暴露于效应细胞之前至少12、14、16、18、20、22或24小时，靶细胞可负载有抗原。示范性靶细胞包括A375细胞，但可使用所属领域中已知的任何合适的细胞。在一些情况下，靶细胞可负载有连续稀释浓度的抗原，如HER2抗原。随后，效应细胞可以与靶细胞一起共培养合适的时间段，例如6小时。随后，通过在共培养之后的发光读数测量荧光素酶。荧光素酶发光可标准化为最大和最小强度，以允许比较各工程化受体构建体的活化肽浓度。
本文提供确定本公开的工程化受体的相对EC50的方法。如本文所用，“EC50”是指反应(或结合)降低一半时抑制剂或试剂的浓度。本公开的工程化受体的EC50是指工程化受体对于抗原的结合降低一半时抗原的浓度。抗原或探针对于工程化受体的结合可通过用标记的肽或标记的肽-MHC复合物，例如与荧光团结合的MHC:HER2 pMHC复合物染色来测量。可以通过用肽滴定对报告子信号进行非线性回归曲线拟合来获得EC50。探针结合和EC50可标准化为无融合蛋白(例如HER2)的基准TCR的水平。
多核苷酸
本公开提供一种多核苷酸系统，其包含一种或多种包含编码以下的多核苷酸序列的多核苷酸：活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域；和抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。
本公开提供包含本文所描述的多核苷酸系统的载体。本公开提供了包含本文所描述的多核苷酸的载体。
本公开提供编码本文所描述的活化剂受体和抑制受体的序列的多核苷酸。在一些实施例中，活化受体和/或抑制受体、或活化剂受体和/或抑制受体的融合蛋白的序列与启动子可操作地连接。在一些实施例中，编码活化剂受体或其多肽的序列与第一启动子可操作地连接，且编码抑制受体或其融合蛋白的序列与第二启动子可操作地连接。
在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:52，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:54，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:56，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:58，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:60，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:62，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:21803，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:75-86中的任一个，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:76，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:77，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:78，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:79，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:80，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:81，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:82，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:83，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:84，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:85，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:86，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:208，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:210，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:212，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:224、226、227、229或231中的任一个，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含SEQ ID NO:292、294、296、298、300、302、304、306或308中的任一个，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
本公开提供编码本文所描述的工程化受体中的任一个的编码序列或序列的载体。在一些实施例中，活化受体和/或抑制受体的序列与启动子可操作地连接。在一些实施例中，编码活化受体的序列与第一启动子可操作地连接，且编码抑制受体的序列与第二启动子可操作地连接。
在一些实施例中，活化受体由第一载体编码，且抑制受体由第二载体编码。在一些实施例中，两种工程化受体由单一载体编码。
在一些实施例中，活化剂受体和抑制受体由单一载体编码。使用单一载体编码多种多肽的方法是所属领域的一般技术人员已知的，且尤其包括在不同启动子控制下编码多种多肽，或者如果使用单个启动子控制多种多肽的转录，那么使用编码内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site；IRES)和/或自我裂解肽的序列。示范性自我裂解肽包括T2A、P2A、E2A和F2A自我裂解肽。在一些实施例中，T2A自我裂解肽包含EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:288)的序列。在一些实施例中，P2A自我裂解肽包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:196)的序列。在一些实施例中，E2A自我裂解肽包含QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:289)的序列。在一些实施例中，F2A自我裂解肽包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:290)的序列。前述中的任一个也可以包括N端GSG连接子。举例来说，T2A自我裂解肽还可包含GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:557)的序列，其可由GGATCCGGAGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACC CTGGCCCC(SEQID NO:558)的序列编码。
在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:52，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:54，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:56，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:58，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ IDNO:60，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:62，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:21803，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:75，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:76，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:77，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:78，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ IDNO:79，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:80，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:81，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:82，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:83，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:84，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:85，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:86，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ IDNO:208，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:210，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:212，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:224、226、227、229或231，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:292、294、296、298、300、302、304、306或308，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:51的多肽序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:53，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:55，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:57，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:59，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:61，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:63，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:64，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:65，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:66，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:67，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:68，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:69，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQID NO:70，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:72，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:73，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:74，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:207、209或211，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，载体编码包含SEQ ID NO:291、293、295、297、299、301、303、305、307、21805，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，本文提供的多核苷酸序列为密码子优化的。密码子优化为将在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下增加由核酸序列编码的蛋白质的产量的沉默核苷酸变化引入核酸序列中的方法。
在一些实施例中，载体为表达载体，即用于在合适的细胞中表达本公开的工程化受体。
衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体为实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子代细胞中繁殖。慢病毒载体比衍生自致癌逆转录病毒(如鼠类白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。其还具有低免疫原性的额外优点。
编码工程化受体的天然或合成核酸的表达通常通过将编码融合蛋白或其部分的核酸与启动子可操作地连接且将构建体并入表达载体中来实现。载体可以适合于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录与翻译终止子、起始序列和适用于调节所需核酸序列的表达的启动子。
可将编码融合蛋白的多核苷酸克隆到多种类型的载体中。举例来说，可以将多核苷酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。备受关注的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞，如免疫细胞。病毒载体技术在所属领域中为众所周知的，且描述于例如Sambrook等人(2001,《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,纽约冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory,New York))中，和其它病毒学和分子生物学手册中。适用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，合适的载体含有在至少一种生物体中有复制功能的起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选标记(例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。举例来说，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。所选择的基因可以插入载体中且使用所属领域中已知的技术将其包装于逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒且在体内或离体递送到个体的细胞。许多逆转录病毒系统是所属领域中已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是所属领域中已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
额外启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，它们位于起始位点上游的30-110碱基对(bp)区域，但最近已显示许多启动子在起始位点下游也含有功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，个别元件似乎可以协同或独立地发挥作用来激活转录。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列为强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一实例为延伸生长因子-1α(EF-1α)。合适的启动子的另一实例为U6启动子。合适的启动子的另一实例为H1启动子。然而，还可使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子，以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也考虑是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，所述分子开关能够在需要这类表达时开启与其可操作连接的多核苷酸序列的表达，或在不需要表达时关闭所述表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。U6启动子的示范性序列阐述于SEQ ID NO:21800中。H1启动子的示范性序列阐述于SEQID NO:21801中。
在某些方面中，载体包含终止序列，例如T6或T7终止序列。
为了评定工程化受体的表达，欲引入细胞中的表达载体也可含有可选标记基因或报导基因或两者以有助于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体鉴定和选择表达细胞。在其它方面中，可选标记可携带在单独的DNA碎片上且用于共转染程序中。可选标记和报告基因均可侧接有适当的调节序列，以使得能够在宿主细胞中表达。适用的可选标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定可能转染或转导的细胞，并用于评估调节序列的功能性。一般来说，报告基因为如下的基因：不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，且编码的多肽的表达通过一些容易检测的特性(例如，酶活性)来体现。在DNA已引入受体细胞之后的合适时间分析报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如Ui-Tei等人,2000《FEBS快报(FEBS Letters)》479:79-82)。合适的表达系统为众所周知的且可使用已知技术制备或商业上获得。通常，具有显示最高水平的报告基因表达的最小5'侧接区的构建体被鉴定为启动子。这类启动子区可以与报告基因连接且用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
将基因引入细胞中且表达的方法为所属领域中已知的。在表达载体的情形下，载体可以通过所属领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。举例来说，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在所属领域中众所周知。参见例如，Sambrook等人(2001,《分子克隆：实验指南》,纽约冷泉港实验室)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。
用于将所关注的多核苷酸引入宿主细胞中的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，且尤其逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物(例如人类细胞)中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。适用作体外和体内递送运载体的示范性胶体系统为脂质体(例如人工膜囊泡)。
不管用于将外源性核酸引入宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种分析。这类分析包括例如所属领域的技术人员熟知的“分子生物学”分析，如DNA和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”分析，如检测特定肽的存在与否，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所描述的分析来鉴定落入本发明范围内的试剂。
免疫细胞
本文提供免疫细胞，其包含本文所描述的多核苷酸、载体、融合蛋白和工程化受体。
本公开提供应答癌细胞中杂合性丢失的免疫细胞，其包含：活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域；和抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。在一些实施例中，非靶抗原为I类HLA等位基因或次要组织相容性抗原(MiHA)。在一些实施例中，I类HLA等位基因包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E。在一些实施例中，非靶抗原选自CXCL16、COLEC12和APCDD1、HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07、HLA-C*07，或其抗原肽。在一些实施例中，I类HLA等位基因为HLA-A*02。在一些实施例中，靶抗原为HER2。在一些实施例中，靶抗原为具有I类主要组织相容性复合物(MHC I)或MHC II的复合物中HER2的肽抗原。在一些实施例中，癌细胞表达HER2。在一些实施例中，癌细胞为乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、唾液管癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺癌细胞或结肠癌细胞。在一些实施例中，癌细胞为乳腺癌细胞或胃癌细胞。
在一些实施例中，HLA-A*02非靶抗原由个体的健康细胞表达。在一些实施例中，个体的健康细胞表达靶抗原和HLA-A*02非靶抗原两者。在一些实施例中，活化剂受体和抑制受体在癌细胞存在下一起特异性地活化免疫细胞。
在一些实施例中，免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，T细胞为CD8+CD4-T细胞。在一些实施例中，免疫细胞为自体的。在一些实施例中，免疫细胞为同种异体的。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与先天或适应性(获得性)免疫系统的细胞。示范性先天免疫细胞包括吞噬细胞(如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)、自然杀伤(NK)细胞、多形核白细胞(如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，以及单核细胞(如单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞)。在获得性免疫中起作用的免疫细胞包括淋巴细胞，如T细胞和B细胞。
如本文所用，“T细胞”是指一种来源于在胸腺中发育的骨髓前体的淋巴细胞类型。存在几种不同类型的在迁移到胸腺时发育的T细胞，其包括辅助CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、记忆T细胞、调节CD4+T细胞和干记忆T细胞。不同类型的T细胞可以由所属领域的一般技术人员基于其标记的表达来区分。区分T细胞类型的方法对于所属领域的一般技术人员来说是显而易见的。
在一些实施例中，工程化免疫细胞表达第一和第二受体，第一受体:第二受体的比率为约100:1到1:100。在一些实施例中，工程化免疫细胞表达第一和第二受体，第一受体:第二受体的比率为约50:1到1:50。在一些实施例中，工程化免疫细胞表达第一和第二受体，第一受体:第二受体的比率为约10:1到1:10。在一些实施例中，工程化免疫细胞表达第一和第二受体，第一受体:第二受体的比率为约5:1到1:5。在一些实施例中，工程化免疫细胞表达第一和第二受体，第一受体:第二受体的比率为约3:1到1:3。在一些实施例中，工程化免疫细胞表达第一和第二受体，第一受体:第二受体的比率为约2:1到1:2。在一些实施例中，工程化免疫细胞表达第一和第二受体，比率为约1:1。
在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:291，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:303，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:291，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:305，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:291，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:307，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:291，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:21805，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:295，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:303，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:295，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:305，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:295，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:307，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:295，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:21805，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:299，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:303，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:299，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:305，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:299，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:307，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。在一些实施例中，第一受体包含SEQ ID NO:299，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列；且第二受体包含SEQ ID NO:21805，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，免疫细胞进一步包含T2A自我裂解肽，其中T2A自我裂解肽包含SEQ ID NO:288或557，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的序列。
在一些实施例中，包含本公开的工程化受体的工程化免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，T细胞为效应T细胞或调节T细胞。如本文所用，“T细胞”是指一种来源于在胸腺中发育的骨髓前体的淋巴细胞类型。存在几种不同类型的在迁移到胸腺时发育的T细胞，其包括辅助CD4+T细胞、细胞毒CD8+T细胞、记忆T细胞、调节CD4+T细胞、NK T细胞、γδT细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞和干记忆T细胞。不同类型的T细胞可以由所属领域的一般技术人员基于其标记的表达来区分。区分T细胞类型的方法对于所属领域的一般技术人员来说是显而易见的。
在一些实施例中，免疫细胞选自由T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞组成的群组。在一些实施例中，免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，免疫细胞为B细胞。在一些实施例中，免疫细胞为自然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，免疫细胞为CD8-。在一些实施例中，免疫细胞为CD8+。在一些实施例中，免疫细胞为CD4+。在一些实施例中，免疫细胞为CD4-。在一些实施例中，免疫细胞为CD8-/CD4+。在一些实施例中，免疫细胞为CD8+CD4-T细胞。
在一些实施例中，免疫细胞为gamma delta(γδ)T细胞。在一些实施例中，免疫细胞为不变T细胞。在一些实施例中，免疫细胞为不变的自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。
在一些实施例中，免疫细胞包含对I类MHC基因或B2M基因的修饰。在一些实施例中，I类MHC基因为HLA-A*02或其等位基因变体。在一些实施例中，修饰降低或消除I类MHC基因或B2M基因的表达。
在一些实施例中，免疫细胞包含本文所描述的多核苷酸或多核苷酸系统。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码本文所描述的第一受体的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码本文所描述的第二受体的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统编码本文所描述的shRNA。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码本文所描述的第一受体和本文所描述的第二受体的序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码本文所描述的第一受体、本文所描述的第二受体和本文所描述的shRNA的序列。
用本公开的载体转化免疫细胞(如T细胞)群体的方法对所属领域的一般技术人员来说是显而易见的。举例来说，CD3+T细胞可以使用CD3+T细胞阴性分离试剂盒(美天旎(Miltenyi))根据制造商的说明书从PBMC中分离。在CD3/28戴诺珠粒(Dynabead)(1:1细胞:珠粒比率)和300单位/mL的IL-2(美天旎)存在下，在补充有5％人A/B血清和1％Pen/strep的X-Vivo 15培养基中以1×10^6个细胞/mL的密度培养T细胞。2天后，可以使用所属领域中已知的方法用病毒载体(如慢病毒载体)转导T细胞。在一些实施例中，病毒载体以5的感染复数(MOI)转导。随后在富集前，可将细胞在IL-2或其它细胞因子(如IL-7/15/21的组合)中再培养5天。分离和培养其它免疫细胞群体(如B细胞，或其它T细胞群体)的方法对所属领域的一般技术人员来说是显而易见的。尽管此方法概述了潜在的方法，但是应当注意，这些方法正在快速发展。举例来说，外周血单核细胞的优异病毒转导可以在生长5天后实现，以产生>99％的CD3+高度转导的细胞群体。
活化和培养包含工程化TCR、CAR、融合蛋白或编码本公开的融合蛋白的载体的T细胞群体的方法对于所属领域的一般技术人员来说是显而易见的。
无论是在对T细胞进行遗传修饰以表达工程化TCR的之前还是之后，T细胞一般可使用如例如以下所描述的方法进行活化和扩增：美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号、第10040846号；和美国专利申请公开案第2006/0121005号。
在一些实施例中，本公开的T细胞在体外扩增和活化。通常，本公开的T细胞通过与表面接触而在体外扩增，表面上附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所描述刺激T细胞群体，如通过与抗CD3抗体接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。举例来说，在适合刺激T细胞增殖的条件下，可以将T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括可以用作所属领域中通常已知的其它方法的9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松市的戴亚克隆(Diaclone,France))(Berg等人,《移植进展(Transplant Proc.)》30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》190(9)；13191328,1999；Garland等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol Meth.)》227(1-2):53-63,1999)。
在一些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。举例来说，提供每个信号的试剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，试剂可以与同一表面(即，以“顺式”形式)或与不同的表面(即，以“反式”形式)偶联。或者，一种试剂可以与表面偶联，另一种试剂在溶液中。在一些实施例中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，且提供初级活化信号的试剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种试剂都可以在溶液中。在另一实施例中，试剂可以呈可溶形式，且随后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或抗体或其它将与试剂结合的结合剂。在这方面，参见例如针对人工抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公开第20040101519号和第20060034810号，所述aAPC被设想为用于活化和扩增本发明中的T细胞。
在一些实施例中，两种试剂固定在珠粒上，或者固定在同一珠粒上，即“顺式”，或者固定在分开的珠粒上，即“反式”。通过举例，提供初级活化信号的试剂为抗CD3抗体或其抗原结合片段，且提供共刺激信号的试剂为抗CD28抗体或其抗原结合片段；且两种试剂以相等的分子量共固定到相同的珠粒上。在一个实施例中，使用与用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长的珠粒结合的1:1比率的每种抗体。在一些实施例中，与珠粒结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1到1:100以及其间的所有整数值。在本发明的一方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于一。在本发明的某些实施例中，与珠粒结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。
可以使用1:500到500:1以及其间的任何整数值的颗粒与细胞的比率来刺激T细胞或其它靶细胞。如所属领域的一般技术人员可以容易理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。举例来说，小尺寸的珠粒仅可以结合几个细胞，而较大珠粒可以结合许多。在某些实施例中，细胞与颗粒的比率范围为1:100到100:1以及其间的任何整数值，且在其它实施例中，所述比率包含1:9到9:1以及其间的任何整数值，也可用于刺激T细胞。在一些实施例中，使用1:1比率的细胞与珠粒。所属领域的技术人员将理解，各种其它比率可以适用于本发明。特别地，比率将根据粒度以及细胞大小和类型而变化。
在本发明的其它实施例中，将细胞(如T细胞)与试剂涂覆的珠粒组合，随后分离珠粒和细胞，且随后培养细胞。在一替代实施例中，在培养之前，不分离试剂涂覆的珠粒和细胞，而是一起培养。在其它实施例中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠粒和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。
通过举例，细胞表面蛋白可以通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁性珠粒与T细胞接触而连接。在一个实施例中，细胞(例如，CD4+T细胞)和珠粒(例如，比率为1:1的戴诺珠粒CD3/CD28 T顺磁性珠粒)合并于缓冲液中。同样，所属领域的一般技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。在某些实施例中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。举例来说，在一个实施例中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在其它实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在其它实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用以1×106个细胞/mL的密度培养的细胞。
在一些实施例中，混合物可以培养数小时(约3小时)到约14天或其间的任何小时整数值。在另一实施例中，珠粒和T细胞一起培养2-3天。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(龙沙(Lonza)))，其可以含有增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或所属领域的技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇的还原剂。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一量额的足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。在一些实施例中，培养基包含补充有5％人A/B血清、1％青霉素/链霉素(pen/strep)和300单位/ml的IL-2(美天旎)的X-VIVO-15培养基。
将T细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
在一些实施例中，包含本公开的工程化TCR、CAR和/或抑制受体的T细胞为自体的。在扩增和遗传修饰之前，从个体获得T细胞源。免疫细胞(如T细胞)可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施例中，可使用任何数量的所属领域中可用的T细胞系。在本发明的某些实施例中，T细胞可获自使用任何数量的所属领域的技术人员已知的技术(如FicollTM分离)自个体收集的血液单位。
在一些实施例中，通过单采血液成分法获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分法产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采血液成分法采集的细胞以去除血浆部分，且将细胞置于适合的缓冲液或培养基中以供后续处理。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代实施例中，洗涤溶液缺少钙且可以缺少镁或者可以缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如所属领域的一般技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过所属领域的技术人员已知的方法来完成，如根据制造商的说明书通过使用半自动化的“直流”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可以将细胞再悬浮于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+、无Mg2+的PBS；PlasmaLyte A；或其它含或不含缓冲液的盐水溶液。或者，可以去除单采血液成分法样本中不合需要的组分，且将细胞直接再悬浮于培养基中。
在一些实施例中，通过溶解红细胞和消耗单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析从外周血淋巴细胞分离免疫细胞，如T细胞。免疫细胞的特定亚群，如T细胞、B细胞或CD4+T细胞，可以通过正或负选择技术进一步分离。举例来说，在一个实施例中，通过与抗CD4-结合的珠粒一起培育一段足以正选择所需的T细胞的时间来分离T细胞。
通过负选择富集免疫细胞群体，如T细胞群体，可以通过针对负向选择细胞特有的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。举例来说，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD 14、CD20、CD11b、CD 16、HLA-DR和CD8的抗体。
为了通过正或负选择分离所需免疫细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠粒)的浓度。在某些实施例中，可能需要显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。
在一些实施例中，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2-10℃或在室温下培育不同长度的时间。
用于刺激的T细胞或从中分离免疫细胞(如T细胞)的PBMC也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群体中的粒细胞和在一定程度上去除单核细胞而提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是所属领域中已知的且在本文中适用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻培养基，随后将细胞以1℃/分钟的速率冷冻到-80℃且储存在液氮储存罐的汽相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃或液氮中立即进行不受控冷冻。
本公开提供了表达本文所描述的活化剂和/或抑制受体的免疫细胞，其中免疫细胞具有降低的I类主要组织相容性(MHC)复合物的表达和/或功能。
在一些实施例中，免疫细胞为自体的。举例来说，免疫细胞分离或衍生自接受所述细胞作为治疗方案的一部分的同一个体。用对I类MHC抗原具有特异性的抑制受体修饰自体免疫细胞以降低I类MHC的表达和/或功能可能是有利的。不希望受理论束缚，修饰自体免疫细胞以降低I类MHC的表达和/或功能降低了抑制受体与免疫细胞表达的I类MHC的结合，无论是顺式还是反式。
在一些实施例中，免疫细胞全部都是同种异体的。同种异体免疫细胞可以来源于除将施用免疫细胞的个体以外的供体。同种异体免疫细胞在细胞疗法中通常被称为“现成的”或“通用的”，因为同种异体细胞可能被制备和储存用于多种基因型的个体。
降低I类MHC复合物的表达和/或功能的任何合适的方法均设想为在本公开的范围内，且尤其包括敲低一种或多种编码I类MHC组分的RNA的干扰RNA的表达，或编码I类MHC组分的基因的修饰。
主要组织相容性复合物(MHC)为脊椎动物基因组上编码适应性免疫系统所需的一组多肽的基因座。其中有I类MHC多肽，其包括HLA-A、HLA-B和HLA-C和其等位基因。I类MHC等位基因是高度多态性的且在所有有核细胞中均表达。由HLA-A、HLA-B和HLA-C和其等位基因编码的I类MHC多肽与β2微球蛋白(B2M)形成异二聚体，并与细胞表面上的抗原以复合物形式存在。如本文所提及，I类MHC基因或多肽可以指在MHC中发现的任何多肽或编码所述多肽的对应基因。在一些实施例中，本公开的免疫细胞被抑制剂配体灭活，所述抑制剂配体包含I类MHC多肽，例如HLA-A、HLA-B和HLA-C和其等位基因。HLA-A等位基因可以是，例如但不限于，HLA-A*02、HLA-A*02:01、HLA-A*02:01:01、HLA-A*02:01:01:01，和/或编码与HLA-A*02蛋白相同或类似的蛋白的任何基因。因此，为了防止如本文所描述的自分泌信号传导/结合，需要消除或降低由HLA-A、HLA-B和HLA-C和其等位基因编码的多肽在免疫细胞中的表达。
I类MHC多肽表达降低的免疫细胞
在一些实施例中，本文所描述的免疫细胞被修饰以灭活、或降低或消除编码内源性I类MHC多肽的等位基因的内源性基因的表达或功能。在一些实施例中，编码I类MHC多肽的基因为HLA-A、HLA-B和/或HLA-C。HLA-A、HLA-B和HLA-C由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座编码。HLA-A、HLA-B和HLA-C中的每一种均包括许多变异等位基因，所有这些均设想为在本公开的范围内。在一些实施例中，编码I类MHC多肽的基因为HLA-A。在一些实施例中，编码I类MHC多肽的基因为HLA-A*02。在一些实施例中，编码I类MHC多肽的基因为HLA-A*02:01。在一些实施例中，编码I类MHC多肽的基因为HLA-A*02:01:01。在一些实施例中，编码I类MHC多肽的基因为HLA-A*02:01:01:01。
在一些实施例中，修饰本文所描述的基因工程化的免疫细胞以降低或消除B2M基因产物的表达。β-2微球蛋白(B2M)基因编码与I类主要组织相容性复合物(MHC)(即MHC-I复合物)相关的蛋白质。MHC-I复合物是细胞表面上呈递抗原所需的。当B2M缺失时，MHC-I复合物被破坏且不起作用(Wang D等人《干细胞转化医学(Stem Cells Transl Med.)4:1234-1245(2015)》。此外，可以使用所属领域中已知的基因编辑技术高效率破坏B2M基因(Ren等人《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》23:2255-2266(2017))。降低或消除B2M可以降低或消除免疫细胞表面上的功能性MHC I。
本公开提供了用于编辑免疫细胞中的内源性靶基因的基因编辑系统。本公开提供了对靶基因序列具有特异性的干扰RNA。基因编辑系统，如CRISPR/Cas系统、TALEN和锌指，可用于产生双链断裂，其通过基因修复机制(如同源定向修复或非同源末端连接(NHEJ))可用于引入突变。断裂末端切除后的NHEJ或不适当的末端连接可用于引入缺失。在一些实施例中，靶基因包含编码MHC-I复合物的亚基的基因。
靶基因序列包括但不限于启动子、增强子、内含子、外显子、内含子/外显子接合、转录产物(pre-mRNA、mRNA和剪接变体)和/或3'和5'非翻译区(UTR)。为了在本文所描述的免疫细胞中进行遗传编辑的目的，可以靶向任何基因元件或基因元件的组合。对靶基因的修饰可以使用所属领域中已知的任何方法来完成，以编辑靶基因，导致靶基因或基因产物的表达或功能改变或破坏。
在一些实施例中，修饰编码I类MHC多肽的基因包含缺失全部或部分基因。在一些实施例中，修饰编码I类MHC多肽的基因包含在基因中引入突变。在一些实施例中，突变包含缺失、插入、取代或移码突变。在一些实施例中，修饰基因包含使用核酸引导的核酸内切酶。
本文所描述的靶基因的基因序列是所属领域中已知的。这些序列可以在公共数据库中找到，如NCBI基因库或NCBI核苷酸数据库。序列可以使用基因识别符来找到，例如HLA-A基因具有NCBI基因ID：3105，HLA-B基因具有NCBI基因ID：3106，HLA-C基因具有NCBI基因ID：3107，且B2M基因具有NCBI基因ID：567，以及NCBI参考序列：NC_000015.10。也可以通过使用关键词搜索公共数据库来找到基因序列。举例来说，可以通过搜索关键词“HLA-A*02”、“HLA-A*02:01”、“HLA-A*02:01:01”或“HLA-A*02:01:01:01”在NCBI核苷酸数据库中找到HLA-A等位基因。这些序列可用于所属领域中已知的各种基因编辑技术中的靶向。表18提供了靶向用于如本文所描述的修饰的HLA-A等位基因和B2M基因序列的非限制性说明性序列。
表18：示范性靶基因序列
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所属领域的一般技术人员将理解，T可以取代U以将RNA序列转化为DNA序列，反之亦然，且两者都设想为作为本公开的靶基因序列。
在一些实施例中，使用核酸引导的核酸内切酶在本文所描述的免疫细胞中编辑靶基因。示范性核酸引导的核酸内切酶包括II类核酸内切酶，如CRISPR/Cas9。
如本文所用，“CRISPR”或“CRISPR基因编辑”是指一组规律间隔成簇短回文重复序列，或包含这样一组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可用于沉默、敲除或突变靶基因。此系统是一种类型的原核免疫系统，其赋予对如质粒和噬菌体的外来遗传元件的抗性，且提供获得性免疫形式。CRISPR/Cas系统已被修饰用于基因编辑。这是通过向真核细胞中引入一种或多种特别设计的引导核酸(gNA)，通常引导RNA(gRNA)，以及与gNA形成核糖核蛋白复合物的适当的Cas核酸内切酶来实现的。gNA将gNA-核酸内切酶蛋白复合物引导到靶基因组位置，且核酸内切酶在靶基因组位置引入链断裂。这种双链断裂可以通过细胞机制修复，如非同源末端连接(导致缺失)或同源修复(其可以产生插入)，从而将遗传修饰引入宿主细胞基因组中。
CRISPR/Cas系统按类别和按类型分类。2类系统目前代表分类为三种不同类型(II、V和VI型)的单一干扰蛋白。任何适合于基因编辑的2类CRISPR/Cas系统，例如II型、V型或VI型系统，均设想为在本公开的范围内。示范性2类II型CRISPR系统包括Cas9、Csn2和Cas4。示范性2类V型CRISPR系统包括Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i和Cas12k(C2c5)。示范性2类VI型系统包括Cas13、Cas13a(C2c2)Cas13b、Cas13c和Cas13d。
CRISPR序列，有时称为CRISPR基因座，包含交替的重复序列和间隔子。在天然存在的CRISPR中，间隔子通常包含对于细菌来说外源的序列，如质粒或噬菌体序列。如本文所描述，间隔子序列也可以称为“靶向序列”。在用于基因工程的CRISPR/Cas系统中，间隔子衍生自靶基因序列(gNA)。
示范性2类II型CRISPR系统依赖于蛋白质Cas9，其为具有两个活性切割位点的核酸酶，双螺旋的每条链一个。组合Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA可用于基因编辑的系统中。Pennisi(2013)《科学(Science)》341:833-836。在一些实施例中，用于修饰免疫细胞的Cas蛋白为Cas9。
因此，CRISPR/Cas系统可用于编辑靶基因，如通过添加或删除碱基对，或引入过早终止从而降低靶标的表达而靶向用于在本文所描述的免疫细胞中编辑的基因。CRISPR/Cas系统替代地可以像RNA干扰一样使用，以可逆的方式关闭靶基因。举例来说，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导到靶基因启动子，从而空间阻断RNA聚合酶。
Cas蛋白可以衍生自任何细菌或古细菌Cas蛋白。任何合适的CRISPR/Cas系统均设想为在本公开的范围内。在其它方面，Cas蛋白包含以下中的一种或多种：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a(Cpf1)、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY、其同源物或其修饰形式。在一些实施例中，Cas蛋白为Cas9蛋白、Cpf1蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas 5、Cas7、Cas8、Cas10，或这些蛋白的组合或复合物。在一些实施例中，Cas蛋白为Cas9蛋白。
使用所属领域中已知的技术，例如美国公开案第20140068797号和Cong(2013)《科学》339:819-823中描述的，可产生抑制靶基因的人工CRISPR/Cas系统。还可产生抑制靶基因的所属领域中已知的其它人工CRISPR/Cas系统，例如Tsai(2014)《自然·生物技术(Nature Biotechnol.)》,32:6 569-576，美国专利第8,871,445号、第8,865,406号、第8,795,965号、第8,771,945号和第8,697,359号中所描述的。为特定Cas蛋白设计合适gNA的方法是所属领域的一般技术人员已知的。
本公开提供了可以将相关多肽(例如，核酸引导的核酸内切酶)的活性导向靶核酸基因组内的特定靶基因序列的基因靶向引导核酸(gNA)。基因组靶向核酸可以为RNA。基因组靶向RNA在本文中称为“引导RNA”或“gRNA”。引导RNA可以至少包含与所关注的靶核酸序列杂交的靶向序列和CRISPR重复序列。在一些II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA，在本文中也称为“支架”序列。在II型引导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和支架序列彼此杂交以形成双螺旋。在V型引导RNA(gRNA)中，crRNA形成双螺旋。在两种系统中，双螺旋可以结合定点多肽，使得引导RNA和定点多肽形成复合物。基因靶向核酸可以通过其与定点多肽的结合而提供对复合物的靶特异性。因此，基因靶向核酸可以引导定点多肽的活性。
在一些实施例中，本公开提供了包含靶向序列和引导RNA支架序列的引导RNA，其中靶向序列与靶基因的序列互补。
示范性引导RNA包括具有约15-20个碱基的靶向序列。如所属领域的一般技术人员所理解的，每个gRNA可以设计成包括与其基因组靶序列互补的靶向序列。举例来说，可以将每种靶向序列(例如，表19中呈现的DNA序列的RNA版本，减去代表所述PAM位点的三个3'核苷酸)置于单个RNA嵌合体或crRNA中。
基因靶向核酸可为双分子引导RNA。基因靶向核酸可为单分子引导RNA。基因靶向核酸可为所属领域中已知的任何已知构型的引导RNA，例如包括成对的gRNA，或在单个步骤中使用的多个gRNA。尽管从基因组序列中可以清楚地看出编码序列和剪接点在哪里，但基因表达所需的其它特征可能是特异的和不清楚的。
双分子引导RNA可以包含RNA的两条链。第一链包含5'到3'方向的序列、任选的间隔子延伸序列、靶向序列和最小CRISPR重复序列。第二链可以包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
II型系统中的单分子引导RNA(sgRNA)在5'到3'方向上可以包含任选的间隔子延伸序列、靶向序列、最小CRISPR重复序列、单分子引导连接子、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸物可以包含为引导RNA提供额外功能性(例如，稳定性)的元件。单分子引导连接子可以连接最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸物可以包含一个或多个发夹。
在一些实施例中，引导RNA或单分子引导RNA(sgRNA)可以包含靶向序列和支架序列。在一些实施例中，支架序列为Cas9 gRNA序列。在一些实施例中，支架序列由包含与以下序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的序列的DNA序列编码：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT AAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO:575)。在一些实施例中，支架序列由包含GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO:575)的DNA序列编码。
在一些实施例中，例如其中CRISPR/Cas系统为Cas9系统的那些实施例，sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含20个核苷酸的靶向序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含少于20个核苷酸的靶向序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含超过20个核苷酸的靶向序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'端包含具有17-30个核苷酸的可变长度的靶向序列。
合适的支架序列和支架靶向序列的排列将取决于核酸内切酶的选择，且是所属领域的技术人员已知的。
II型系统中的单分子引导RNA(sgRNA)，例如Cas9，在5'至3'方向可包含最小CRISPR重复序列和靶向序列。
借助于说明，在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统中使用的引导RNA，或其它更小的RNA可以通过化学方法容易地合成，如下文所示和在所属领域中描述的。尽管化学合成方法不断扩大，但是当多核苷酸长度显著增加超过一百个左右的核苷酸时，通过如高效液相色谱(HPLC，其避免使用如PAGE的凝胶)的方法纯化这种RNA往往变得更具挑战性。一种用于生成更长RNA的方法是产生两个或多个连接在一起的分子。如编码Cas9或Cpf1核酸内切酶的那些长得多的RNA更容易通过酶促产生。可以在化学合成和/或酶促产生RNA期间或之后引入各种类型的RNA修饰，例如增强稳定性、降低先天性免疫应答的可能性或程度和/或增强其它属性的修饰，如所属领域中所描述。
gRNA的靶向序列与所关注的靶核酸中的序列杂交。基因组靶向核酸的靶向序列可以通过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。靶向序列的核苷酸序列可以根据所关注的靶核酸的序列而变化。
在本文所描述的Cas9系统中，靶向序列可以设计成与位于系统中使用的Cas9酶的PAM的反向互补序列的5'的靶核酸杂交。靶向序列可以完全匹配靶序列或可以具有错配。各CRISPR/Cas系统蛋白可以在其在靶DNA中识别的特定方向和位置上具有特定PAM序列。举例来说，化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9识别靶核酸中包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸且N紧邻靶向序列所靶向的靶核酸序列的3'。选择适当的PAM序列对于所属领域的一般技术人员来说是显而易见的。
靶序列与gRNA的靶向序列互补且与其杂交。靶核酸序列可以包含20个核苷酸。靶核酸可以包含少于20个核苷酸。靶核酸可以包含超过20个核苷酸。靶核酸可包含至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。在一些实施例中，例如其中CRISPR/Cas系统为Cas9系统的那些实施例，靶核酸序列可以包含紧邻PAM序列的反向互补物的第一核苷酸的5'的20个核苷酸。此靶核酸序列通常称为PAM链或靶链，而互补核酸序列通常称为非PAM链或非靶链。所属领域的技术人员将认识到，靶向序列与靶核酸的非PAM链杂交，参见例如US20190185849A1。
在一些实例中，靶向序列与靶核酸之间的互补性百分比为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在一些实例中，靶向序列与靶核酸之间的互补性百分比为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％或100％。在一些实例中，靶向序列与靶核酸之间的互补性百分比在靶核酸的互补链的靶序列的六个连续的最5'核苷酸上是100％。靶向序列与靶核酸之间的互补性百分比在约20个连续核苷酸上可以是至少60％。靶向序列与靶核酸的长度可以相差1到6个核苷酸，其可以被认为是一个或多个凸起。
可以使用所属领域的一般技术人员已知的计算机程序来设计或选择靶向序列。计算机程序可以使用变量，如预测的解链温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列一致性、基因组背景、染色质可及性、GC％、基因组出现的频率(例如，相同或由于错配、插入或缺失而在一个或多个点(spot)上相似但不同的序列)、甲基化状态、SNP的存在等。可用的计算机程序可以将NCBI基因ID、官方基因符号、Ensembl基因ID、基因组坐标或DNA序列作为输入，且创建含有靶向指定为输入的适当基因组区的sgRNA的输出文件。计算机程序还可以提供统计学和分数的概述，指示sgRNA对靶基因的靶向和脱靶结合(Doench等人，《自然·生物技术》34:184-191(2016))。本公开提供包含靶向序列的引导RNA。在一些实施例中，引导RNA进一步包含引导RNA支架序列。在一些实施例中，靶向序列与选自由HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M或其等位基因组成的群组的靶基因的序列互补。在一些实施例中，靶基因为HLA-A基因。在一些实施例中，靶基因为HLA-B基因。在一些实施例中，靶基因为HLA-C基因。在一些实施例中，靶基因为HLA-A、HLA-B、HLA-C或其组合。在一些实施例中，靶向序列包含与表18表19中公开的序列具有约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％一致性或与其一致的序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向内源性HLA-A的序列。在一些实施例中，特异性靶向HLA-A基因座的序列的gNA包含与选自表19中公开的序列的序列具有约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％一致性的序列。在一些实施例中，特异性靶向HLA-A基因座的序列的gNA包含选自表19中公开的序列的序列。在一些实施例中，特异性靶向HLA-A基因座的序列的gNA包含SEQ ID NO:576-8650中的任一个中所阐述的序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02等位基因的序列。举例来说，gRNA特异性靶向并杂交于所有HLA-A*02等位基因共享的序列，但不是HLA-A*02和HLA-A*03共享的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02:01:01:01等位基因的序列。在一些实施例中，gNA特异性靶向HLA-A*02的编码DNA序列。
在一些实施例中，gNA特异性靶向超过1000个HLA-A*02等位基因共享的编码DNA序列。
表19：靶向HLA-A和HLA-等位基因的说明性序列
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表19中公开的序列包括对应基因组序列，包括PAM序列。所属领域的技术人员将理解，gRNA的靶向序列不包括表19中序列的三个3'端核苷酸，其代表gRNA的对应PAM位点。
本公开提供了包含对B2M基因具有特异性的靶向序列的gRNA。在一些实施例中，gRNA特异性靶向B2M基因的编码序列(CDS)序列。在一些实施例中，gRNA包含靶向B2M基因启动子序列的序列。
在一些实施例中，gRNA包含靶向序列和gRNA支架序列。在一些实施例中，靶向序列包含表20中所阐述的序列，或与其具有约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％一致性的序列。
在一些实施例中，靶向序列与B2M基因的序列互补。在一些实施例中，B2M基因包含与表18中所阐述的B2M序列具有约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％一致性的序列。
表20：靶向B2M的说明性序列
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在一些实施例中，使用TALEN基因编辑来编辑本文所描述的免疫细胞。
“TALEN”或“TALEN基因编辑”是指转录活化剂样效应核酸酶，其是一种用于编辑靶基因的人工核酸酶。
通过将TAL效应DNA结合结构域与DNA裂解结构域融合人工产生TALEN。来源于黄单胞菌属细菌的转录活化剂样效应物(TALE)可以被工程化以结合任何所需的DNA序列，包括靶基因的一部分，如TCR亚基、I类MHC复合物组分或CD52。通过将工程化TALE与DNA裂解结构域组合，可以产生对任何所需DNA序列(包括靶基因序列)具有特异性的限制酶。随后可以将它们引入细胞中，在其中它们可用于基因组编辑。
为了产生TALEN，TALE蛋白与核酸酶(N)融合，所述核酸酶为野生型或突变的折叠核酸内切酶。针对FokI在TALEN中的应用，已经进行了几种FokI突变；例如，这些提高了裂解特异性或活性。
FokI结构域作为二聚体起作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于靶基因组中具有适当取向和间隔的位点。TALE DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数量以及两个个别TALEN结合位点之间的碱基数量似乎是实现高水平活性的重要参数。
可以使用所属领域已知的任何方法，包括使用模块化组件的各种方案，构建对靶基因中的序列具有特异性的TALEN。
在一些实施例中，使用ZFN基因编辑在本文所描述的免疫细胞中编辑靶基因。
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“ZFN基因编辑”是指锌指核酸酶，一种可用于编辑靶基因的人工核酸酶。
与TALEN一样，ZFN包含与DNA结合结构域融合的折叠核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。
锌指是由一个或多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可以包含例如Cys2His2，且可以识别大约3-bp的序列。已知特异性的各种锌指可以组合以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于生成识别特异性序列的锌指(和其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。
与TALEN一样，ZFN必须二聚化以裂解DNA。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个个别ZFN必须结合DNA的相对链，它们的核酸酶适当地间隔开。
同样与TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果不恰当地修复，其可以产生移码突变，导致细胞中靶基因或基因产物的表达和数量降低。ZFN也可用于同源重组以在靶基因中突变。
可以使用所属领域已知的任何方法构建对靶基因中的序列具有特异性的ZFN。
在一些实施例中，使用RNA干扰降低一种或多种MCH-I组分的表达和功能。“RNAi”或“RNA干扰”是指由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。双螺旋RNA，如siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)、shRNA(短发夹RNA)、ddRNA(DNA定向RNA)、piRNA(Piwi相互作用RNA)或rasiRNA(重复相关siRNA)及其修饰形式，全部都能够介导RNA干扰。这些dsRNA分子可以是市售的或可以基于已知的序列信息设计和制备。这些分子的反义链可以包括RNA、DNA、PNA或其组合。DNA/RNA嵌合多核苷酸包括但不限于由抑制靶基因的表达的DNA和RNA构成的双链多核苷酸。dsRNA分子还可包含一个或多个如本文所描述的修饰的核苷酸，其可并入在任一条或两条链上。
在RNAi基因沉默或敲低中，将包含与靶基因的一部分互补的第一(反义)链和与第一反义链完全或部分互补的第二(有义)链的dsRNA引入生物体中。在引入生物体后，靶基因特异性dsRNA被加工成相对较小的片段(siRNA)，且随后可分布在整个生物体中，降低靶基因的信使RNA，产生与由靶基因完全或部分缺失产生的表型非常相似的表型。
细胞中的某些dsRNA可以经历Dicer酶(一种核糖核酸酶III酶)的作用。Dicer可以将dsRNA加工成较短的dsRNA碎片，即siRNA。RNAi还涉及被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物。在被Dicer裂解后，siRNA进入RISC复合物并直接裂解具有与siRNA双螺旋的反义链互补的序列的单链RNA靶标。siRNA的另一条链是过客链。靶RNA的裂解发生在与siRNA双螺旋的反义链互补的区域中间。因此，siRNA可通过以序列特异性方式调节RNA干扰下调或敲低基因表达。
如本文关于RNA干扰所用，“靶基因”或“靶序列”是指其对应RNA被靶向以使用如本文所描述的dsRNA或siRNA通过RNAi途径降解的基因或基因序列。示范性靶基因序列显示于表18中。为了靶向基因，例如使用siRNA，siRNA包含与靶基因或序列的至少一部分互补或大体上互补的反义区，以及与反义链互补的有义链。一旦引入细胞中，siRNA引导RISC复合物裂解包含靶序列的RNA，从而降解RNA。本公开提供了干扰RNA。本公开的双链RNA分子可以是所属领域中已知的任何类型的RNA干扰分子的形式。在一些实施例中，双链RNA分子为小干扰RNA(siRNA)。在其它实施例中，双链RNA分子为短发夹RNA(shRNA)分子。在其它实施例中，双链RNA分子为在细胞中加工以产生siRNA的Dicer底物。在其它实施例中，双链RNA分子为微小RNA前体分子的一部分。
在一些实施例中，shRNA具有适合作为Dicer底物的长度，其可以被加工以产生RISC活性siRNA分子。参见例如Rossi等人，US2005/0244858。
Dicer底物双链RNA(例如shRNA)可以具有足以被Dicer加工以产生活性siRNA的长度，且可以进一步包括以下特性中的一种或多种：(i)Dicer底物shRNA可以是不对称的，例如，在反义链上具有3'突出端，(ii)Dicer底物shRNA可以在有义链上具有修饰的3'端，以指导Dicer结合的取向和dsRNA向活性siRNA的加工，例如掺入一个或多个DNA核苷酸，以及(iii)Dicer底物dsRNA的第一链和第二链的长度可以是21-30bp。
在一些实施例中，干扰RNA包含与B2M mRNA的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的B2M mRNA的降解。在一些实施例中，B2M mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，B2M mRNA序列包含非翻译区。
在一些实施例中，干扰RNA包含与HLA-A*02mRNA的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰RNA能够诱导RNAi介导的HLA-A*02mRNA的降解。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含非翻译区。
在一些实施例中，干扰RNA为短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，shRNA包含第一序列，其从5'到3'端具有与B2M mRNA互补的序列；以及第二序列，其从5'到3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shRNA。
在一些实施例中，第一序列为18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，第一序列与选自表21和表22中所阐述的序列的序列互补。在一些实施例中，第一序列具有大于或等于25％且小于60％的GC含量。在一些实施例中，第一序列与选自表21和表22中所阐述的序列的序列互补。在一些实施例中，第一序列不包含相同碱基的四个核苷酸或一连串七个C或G核苷酸碱基。在一些实施例中，第一序列为21个核苷酸。
在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO 8771-13382的序列互补。在一些实施例中，第一序列具有大于或等于25％且小于60％的GC含量。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO:8771-13382的序列互补。在一些实施例中，第一序列不包含相同碱基的四个核苷酸或一连串七个C或G核苷酸碱基。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO:8771-13382的序列互补。在一些实施例中，第一序列为21个核苷酸。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO:8771-9352的序列互补。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ IDNO:8771-9052的序列互补。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO:8771-8908的序列互补。与第一序列互补的说明性靶标B2M序列阐述于SEQ ID NO:8771-8908中。
与第一序列互补的说明性靶标B2M序列显示于表21中。在一些实施例中，靶向B2M的第一序列包含SEQ ID NO:8771-13382中的任一个中所阐述的序列。
在一些情况下，第一序列可以与靶核酸序列具有100％一致性，即完全一致性、同源性、互补性。在其它情况下，在第一序列和靶核酸序列之间可能存在一个或多个错配。举例来说，在有义区和靶核酸序列之间可能存在1、2、3、4、5、6或7个错配。
表21中所阐述的序列以DNA序列形式呈现。在表21中所阐述的所有序列中，胸腺嘧啶(T)可以被尿嘧啶(U)替换以得到靶标mRNA序列的序列。
表21：与第一序列互补的说明性靶标B2M序列。
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编码B2M shRNA的示范性序列包含序列GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC(SEQ ID NO:13383)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的序列。编码B2M shRNA的其它示范性序列包含序列GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC(SEQ ID NO:13384)，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的序列。
在一些实施例中，shRNA包含从5'端到3'端具有与HLA-A*02mRNA互补的序列的第一序列；和从5'端到3'端具有与第一序列互补的序列的第二序列。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含编码序列。在一些实施例中，HLA-A*02mRNA序列包含非翻译区。在一些实施例中，第一序列和第二序列存在于多核苷酸上，其中第一序列和第二序列相隔4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸，其中4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸形成shRNA中的环区。在一些实施例中，shRNA进一步包含5'侧接序列和3'侧接序列，其中5'侧接序列与第一序列的5'端连接，且其中3'侧接序列与第二序列的3'端连接。
在一些实施例中，编码shRNA的多核苷酸从5'端到3'端具有5'侧接序列、第一序列、环序列、第二序列、3'侧接序列。在一些实施例中，编码shRNA的多核苷酸从5'端到3'端具有5'侧接序列、第二序列、环序列、第一序列和3'侧接序列。
在一些实施例中，第一序列为18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO:13385-21779的序列互补。在一些实施例中，第一序列具有大于或等于25％且小于60％的GC含量。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO:13385-16975的序列互补。在一些实施例中，第一序列不包含相同碱基的四个核苷酸或一连串七个C或G核苷酸碱基。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO:13385-16493的序列互补。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO:13385-13663的序列互补。在一些实施例中，第一序列与选自SEQ ID NO:13385-13470的序列互补。
与第一序列互补的说明性靶标HLA序列显示于表22中。
表22：与第一序列互补的说明性靶标HLA序列
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在一些实施例中，第一序列和第二序列被连接子分隔开，连接子有时被称为环。在一些实施例中，第一序列和第二序列两者都由一个单链RNA或DNA载体编码。在一些实施例中，环位于第一序列和第二序列之间。在这些实施例中，第一序列和第二序列杂交形成双螺旋区。第一序列和第二序列通过连接子序列连接，形成“发夹”或“茎-环”结构。shRNA可以在单链分子的相对端具有互补的第一序列和第二序列，使得分子可以与互补序列部分形成双螺旋区，且链在双螺旋区的一端通过连接子(即环序列)连接。连接子或环序列可以可核苷酸或非核苷酸连接子。连接子可以通过共价键或非共价相互作用与第一序列和任选的第二序列相互作用。
任何合适的核苷酸环序列均设想为在本公开的范围内。本公开的shRNA可以包括将shRNA的第一序列与shRNA的第二序列连接的核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸连接子。核苷酸环序列可以是长度为≥2个核苷酸，例如长度为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。说明性环序列公开于表23中。
在一些实施例中，shRNA进一步包含5'侧接序列和3'侧接序列。在一些实施例中，其中5'侧接序列与第一序列的5'端连接，且其中3'侧接序列与第二序列的3'端连接。
不希望受理论束缚，认为具有与在微小RNA中发现的那些序列相似的5'和3'序列的侧接shRNA茎环序列可以靶向用于通过内源性微小RNA加工机制加工的shRNA，从而增加shRNA加工的有效性。或者或另外，侧接序列可以增加shRNA与聚合酶II或聚合酶III启动子的相容性，从而导致对shRNA表达的更有效调节。
在一些实施例中，5'侧接序列选自表23中所阐述的序列。说明性侧接序列显示于表23中。
表23：说明性侧接序列
在一些实施例中，第一序列和第二序列存在于单链多核苷酸上，其中第一序列和第二序列相隔4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸，其中4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸形成shRNA中的环区。在一些实施例中，环区包含选自表24中所阐述的序列。
表24：说明性环区序列
SEQ ID NO 环区序列
21786 CGAA
21787 UUCAAGA
21788 AUAUUCA
21789 UGUGCUGUC
21790 CUCGAG
21791 CUUCCUGUCAGA
21792 CUUCCCUUUGUCAGA
21793 GUGUUAUUCUUG
21794 GUGUCUUAAUUG
21795 GUGUUAGUCUUG
21796 UCAAGAG
21797 GGACAUCCAGGG
21798 GUGAAGCCACAGAUG
21799 GAUUCUAAAA
本公开的shRNA可以通过化学合成、通过体外转录，或通过用Dicer或具有类似活性的另一种适当核酸酶裂解较长的双链RNA而外源地产生。使用常规DNA/RNA合成器，由受保护的核苷氨基亚磷酸酯产生的化学上合成的siRNA可获自商业供应商，如密理博西格马(Millipore Sigma)(德克萨斯州休斯顿(Houston,Tex.)、安必逊公司(Ambion Inc.)(德克萨斯州奥斯汀(Austin,Tex.))、英杰(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,Calif.)或达尔马肯(Dharmacon)(科罗拉多拉斐特(Lafayette,Colo.))。siRNA可例如通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱或其组合来纯化。或者，siRNA可以在很少(如果有的话)纯化的情况下使用，以避免由于样本加工造成的损失。在一些实施例中，本公开的shRNA可以使用其中已经克隆了编码双链RNA的核酸的表达载体来产生，例如在合适的启动子的控制下。
药物组合物
本公开提供药物组合物，其包含表达本公开的工程化受体的免疫细胞，和药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。在一些实施例中，药物组合物用作治疗癌症中的药物。在一些实施例中，癌症为乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、唾液管癌、非小细胞肺癌、胰腺癌或结肠癌。在一些实施例中，癌症为乳腺癌。在一些实施例中，癌症为胃癌。
这类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；和防腐剂。
在一些实施例中，免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。在一些实施例中，至少90％的免疫细胞表达第一受体和第二受体两者。
本公开提供药物组合物，其包含本公开的多种免疫细胞，和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
适于肠胃外施用的药物组合物的调配物通常一般包含与药学上可接受的载剂(如无菌水或无菌等渗盐水)组合的免疫细胞。这类调配物可以适合于快速注射施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射调配物可以单位剂型制备、包装或销售，如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的调配物包括但不限于悬浮液、溶液、在油性或水性媒剂中的乳液、糊剂等。这类调配物可进一步包含一种或多种其它成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。肠胃外调配物还包括水溶液，其可以含有赋形剂，如盐、碳水化合物和缓冲剂。示范性肠胃外施用形式包括在无菌水溶液，例如丙二醇水溶液或右旋糖溶液中的溶液或悬浮液。如果需要，这类剂型可以适当地缓冲。用于肠胃外施用的调配物可以调配为立即释放和/或调节释放。调节释放调配物包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程控释放。
在一些实施例中，包含免疫细胞的调配的组合物适合于通过注射施用。在一些实施例中，包含免疫细胞的调配的组合物适合于通过输注施用。
可宜以单位剂型存在的本公开的药物组合物可以根据制药业中熟知的常规技术制备。这类技术包括使免疫细胞与药物载剂或赋形剂(如液体载剂)结合的步骤。
水性悬浮液可以进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。
本公开的组合物可以另外含有药物组合物中常规存在的其它辅助组分。因此，举例来说，组合物可以含有额外的相容的药物活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎剂，或可含有可用于物理调配本公开的组合物的各种剂型的额外物质，如染料、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加这类物质时，这类物质不应过度干扰本公开的组合物的免疫细胞的生物活性。
调配物或组合物还可以含有超过一种适用于用免疫细胞治疗的特定适应症、疾病或病状的活性成分，其中相应的活性不会彼此产生不利影响。这类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施例中，药物组合物进一步包括其它药物活性剂或药物，如化疗剂。
在一些方面，药物组合物可以采用延时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得组合物的递送发生在欲治疗部位致敏之前并且以足够的时间引起所述部位致敏。许多类型的释放递送系统是可用的且已知的。这类系统可以避免组合物的重复施用，从而增加个体和医生的便利性。
施用可以在整个治疗过程中连续或间歇地以一个剂量进行。可以用治疗医生选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。
在一些实施例中，药物组合物含有治疗或预防癌症有效量的免疫细胞，如治疗有效量或预防有效量。在一些实施例中，治疗或预防功效通过定期评定治疗的个体来监测。对于在数天、数周或数月内的重复施用，取决于病状，可以重复治疗直到出现期望的癌症体征或症状的抑制。然而，其它给药方案可能适用且可以确定。所需剂量可以通过组合物的单次快速注射施用或输注或通过组合物的多次快速注射施用或输注来递送。
使用方法
本文提供用于选择性杀伤在编码HER2阳性癌症中的非靶抗原的等位基因处具有杂合性丢失的HER2阳性肿瘤细胞的方法，其包含使HER2阳性肿瘤细胞与包含本公开的工程化受体的免疫细胞接触。细胞可为例如在组织(例如体内)中或在混合培养物中。在一些实施例中，非靶抗原为I类HLA等位基因或次要组织相容性抗原(MiHA)。在一些实施例中，I类HLA等位基因包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E。在一些实施例中，I类HLA等位基因为HLA-A*02。在一些实施例中，非靶抗原选自由以下组成的群组：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07和HLA-C*07。
本文提供治疗有需要的个体的方法，其包含向个体施用治疗有效量的包含含有本公开的工程化受体的免疫细胞的组合物。
在一些实施例中，所述方法包含治疗鉴定为在HER2+癌症中的编码非靶抗原的等位基因处具有或疑似具有杂合性丢失的个体的HER2+癌症，其包含向个体施用本文所描述的免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞为自体的。在一些实施例中，免疫细胞为同种异体的。在一些实施例中，非靶抗原为I类HLA等位基因或次要组织相容性抗原(MiHA)。在一些实施例中，I类HLA等位基因包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E。在一些实施例中，I类HLA等位基因为HLA-A*02。在一些实施例中，非靶抗原选自由以下组成的群组：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07和HLA-C*07。
本公开提供制备免疫细胞疗法的方法。在一些实施例中，所述方法包含用本文所描述的多核苷酸系统转化免疫细胞。在一些实施例中，多核苷酸系统包含一种或多种包含编码以下的多核苷酸序列的多核苷酸：活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域；和抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。
在一些实施例中，治疗个体的方法包含提供来自罹患HER2阳性(HER2+)癌症或处于其风险下的个体的免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包含用本文所描述的多核苷酸系统转导免疫细胞。
当前使用自体细胞的过继性细胞疗法的方法包括从患者血液分离免疫细胞，对于分离的细胞进行一系列修饰，和向患者施用细胞(Papathanasiou等人《癌症基因疗法(Cancer Gene Therapy.)》27:799-809(2020))。提供来自罹患癌症或血液恶性肿瘤或处于其风险下的个体的免疫细胞需要从患者血液中分离免疫细胞，且可以通过所属领域中已知的方法实现，例如通过白细胞分离术。在白细胞分离术期间，从个体抽取血液，且分离外周血单核细胞(PBMC)，并将剩余的血液返回到个体的循环中。将PBMC作为免疫细胞样本冷冻或冷冻保存储存，并提供进一步加工步骤，例如本文所描述的修饰。
在一些实施例中，本文所描述的治疗个体的方法包含对来自个体的免疫细胞的修饰，修饰包含一系列修饰，包含富集、活化、遗传修饰、扩增、调配和冷冻保存。
本公开提供了富集步骤，其可以是例如所属领域中已知的洗涤和分级分离方法，用于制备用于下游程序(例如本文所描述的修饰)的个体PBMC。例如但不限于，方法可以包括去除总红细胞和血小板污染物的装置、用于消耗单核细胞和分离淋巴细胞的基于大小的细胞分级分离的系统，和/或允许富集特定T细胞亚群(例如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞)的系统。富集步骤后，将从个体的PMBC中分离出靶免疫细胞亚群用于进一步处理。所属领域的技术人员将理解，如本文提供的富集步骤也可以涵盖任何新发现的方法、装置、试剂或其组合。
本公开提供了活化步骤，其可以是所属领域中已知的诱导免疫细胞(例如T细胞)的活化的任何方法，所述活化是其离体扩增所需的。免疫细胞活化可以例如通过在树突状细胞存在下培养个体免疫细胞，在人工抗原呈递细胞(AAPC)存在下培养个体免疫细胞，或在照射的K562源性AAPC存在下培养免疫细胞来实现。用于活化个体免疫细胞的其它方法可以是，例如，在分离的活化因子和组合物(例如用活化因子官能化的珠粒、表面或颗粒)存在下培养免疫细胞。活化因子可以包括例如抗体，例如抗CD3和/或抗CD28抗体。活化因子还可以是例如细胞因子，例如白介素(IL)-2或IL-21。活化因子还可以是共刺激分子，例如CD40、CD40L、CD70、CD80、CD83、CD86、CD137L、ICOSL、GITRL和CD134L。所属领域的技术人员将理解，如本文所提供的活化因子也可以涵盖任何新发现的可以活化免疫细胞的活化因子、试剂、组合物或其组合。
本公开提供了用于修饰个体免疫细胞的遗传修饰步骤。在一些实施例中，遗传修饰包含用工程化受体转导免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包含用包含编码活化剂受体的序列的第一载体和包含编码抑制受体的序列的第二载体转导免疫细胞，从而产生表达活化剂受体和抑制受体的免疫细胞。
本公开提供了遗传修饰的个体免疫细胞的扩增步骤。遗传修饰的个体免疫细胞可以在所属领域中已知的任何免疫细胞扩增系统中扩增，以产生治疗剂量的施用用免疫细胞。举例来说，用于包含控制器泵的系统中的生物反应器袋和允许自动进料和废物去除的探针可用于免疫细胞扩增。在底部具有气体渗透膜的细胞培养瓶可用于免疫细胞扩增。本文提供的扩增步骤涵盖所属领域中已知的能够扩增用于临床用途的免疫细胞的任何这类系统。免疫细胞在培养系统中在专门调配用于扩增的培养基中扩增。也可以通过在如本文所描述的活化因子的存在下培养本公开的免疫细胞来促进扩增。所属领域的技术人员将理解，本文提供的扩增步骤也可以涵盖任何新发现的可用于扩增免疫细胞的培养系统、培养基或活化因子。
本公开提供了用于扩增的遗传修饰的个体免疫细胞的调配和冷冻保存步骤。提供的调配步骤包括，例如，洗去用于本文所描述的治疗方法的免疫细胞的制备和扩增的过量组分。所属领域中已知的与免疫细胞相容的任何药学上可接受的调配介质或洗涤缓冲液可用于洗涤、稀释/浓缩免疫细胞，和制备用于施用的剂量。调配介质对于免疫细胞的施用可以是可接受的，例如用于静脉内输注的晶体溶液。冷冻保存可以任选地用于长期储存免疫细胞。可以使用所属领域中已知的方法实现冷冻保存，包括例如在含有冷冻保存组分的冷冻保存培养基中保存细胞。冷冻保存组分可以包括例如二甲亚砜或甘油。储存在冷冻保存培养基中的免疫细胞可以通过将储存温度降低到-80℃到-180℃进行冷冻保存。
在一些实施例中，方法包含施用本文所描述的免疫细胞。在一些实施例中，方法包含在施用本文所描述免疫细胞之前施用预处理方案(conditioning regimen)。在一些实施例中，预处理方案为淋巴细胞耗竭。淋巴细胞耗竭方案可包括例如施用阿仑单抗(alemtuzumab)、环磷酰胺、苯杜阿莫司汀(benduamustin)、利妥昔单抗(rituximab)、喷司他汀(pentostatin)和/或氟达拉滨(fludarabine)。淋巴细胞耗竭方案可以在一个或多个周期中施用，直到循环免疫细胞减少达到预期结果。
在一些实施例中，预处理方案包含施用特异性靶向且降低或消除个体体内CD52+细胞的试剂，且修饰免疫细胞以降低或消除CD52表达。
在一些实施例中，治疗方法包含确定个体的HLA种系类型。在一些实施例中，确定HLA种系类型包含确定HLA-A*02:01杂合子的存在。在一些实施例中，确定骨髓中的HLA种系类型。
在一些实施例中，治疗方法包含确定活化剂配体(例如HER2抗原)的表达水平。在一些实施例中，确定来自个体的肿瘤组织样本中活化剂配体的表达水平。在一些实施例中，使用下一代测序确定活化剂配体的表达水平。在一些实施例中，使用RNA测序确定活化剂配体的表达水平。在一些实施例中，使用免疫组织化学确定活化剂配体的水平。
在一些实施例中，治疗方法包含在有需要的个体中施用治疗有效剂量的免疫细胞，其中确定个体为HLA种系HLA-A*02:01杂合的且具有携带活化剂表达并丢失HLA-A*02:01的肿瘤组织。
在一些实施例中，施用治疗有效剂量的本文所描述的免疫细胞。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过静脉内注射施用。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过腹膜内注射施用。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞、约1×106个细胞、约2×106个细胞、约3×106个细胞、4×106个细胞、约5×106个细胞、约6×106个细胞、约7×106个细胞、约8×106个细胞、约9×106个细胞、约1×107、约2×107、约3×107、约4×107、约5×107、约6×107、约7×107、约8×107、约9×107、1×108个细胞、约2×108个细胞、约3×108个细胞、约4×108个细胞、约5×108个细胞、或约6×108个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞到约6×108个细胞、约1×106个细胞到约5×108个细胞、约2×106个细胞到约5×108个细胞、约3×106个细胞到约4×108个细胞、约4×106个细胞到约3×108个细胞、约5×106个细胞到约2×108个细胞、约6×106个细胞到约1×108个细胞、约7×106个细胞到约9×107个细胞、约8×106个细胞到约8×107个细胞、约9×106个细胞到约7×107个细胞、约1×107个细胞到约6×107个细胞、或约2×107个细胞到约5×107个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞到约6×108个细胞。在治疗剂量中提到的术语“约”可以是例如±0.5×106个细胞、±0.5×107个细胞、或±0.5×108个细胞。
在一些实施例中，有需要的个体患有癌症。在一些实施例中，癌症为HER2阳性(HER2+)癌症。癌症是一种异常细胞不受控制地分裂且扩散到附近组织的疾病。在一些实施例中，癌症包含液体肿瘤或实体肿瘤。示范性液体肿瘤包括白血病和淋巴瘤。示范性实体肿瘤包括肉瘤和癌瘤。癌症可以几乎在体内器官中产生，包括血液、骨髓、肺、乳房、结肠、骨骼、中枢神经系统、胰腺、前列腺和卵巢。呈实体肿瘤的其它癌症包括例如前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、结肠癌、甲状腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、肾癌、头颈癌、喉癌、鼻子的湿润粘膜衬里(lining)上形成的鳞状癌瘤、口腔癌、咽喉癌、膀胱癌、骨肉瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、肝癌和肾癌。在一些实施例中，通过本文所描述的方法治疗的病状为以下各种的转移：黑色素瘤细胞、前列腺癌细胞、睾丸癌细胞、乳腺癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、甲状腺癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、卡波西氏肉瘤细胞、皮肤癌细胞、肾癌细胞、头部或颈部癌细胞、喉癌细胞、鳞状癌细胞、膀胱癌细胞、骨肉瘤细胞、宫颈癌细胞、子宫内膜癌细胞、食道癌细胞、肝癌细胞或肾癌细胞。
其中多种癌细胞表达第一活化剂配体而不表达第二抑制剂配体的任何癌症均设想为在本公开的范围内。举例来说，可使用本文描述的方法治疗的HER2阳性癌症包括乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、唾液管癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺癌细胞或结肠癌细胞。
在一些实施例中，多种癌细胞不表达COLEC12、APCDD1或CXCL16的多态性等位基因。在一些实施例中，多种癌细胞不表达非靶抗原。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*02。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*02的等位基因变体。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*01。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*03。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-A*11。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-B*07。在一些实施例中，多种癌细胞不表达HLA-C*07。举例来说，癌细胞通过在所述基因座的杂合性丢失而丢失了COLEC12、APCDD1或CXCL16或HLA-A*02的等位基因。
治疗癌症可能导致肿瘤大小减小。肿瘤大小的减小也可以被称为“肿瘤消退”。优选地，治疗后，肿瘤大小相对于其治疗前的大小减小5％或更多；更优选地，肿瘤大小减小10％或更多；更优选地，减小20％或更多；更优选地，减小30％或更多；更优选地，减小40％或更多；甚至更优选地，减小50％或更多；且最优选地，减小大于75％或更多。肿瘤的大小可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤的大小可以测量为肿瘤的直径。
治疗癌症可能导致肿瘤体积减小。优选地，治疗后，肿瘤体积相对于其治疗前的大小减少5％或更多；更优选地，肿瘤体积减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；且最优选地，减少大于75％或更多。肿瘤体积可以通过任何可再现的测量手段来测量。
治疗癌症导致肿瘤数量减少。优选地，治疗后，肿瘤数量相对于治疗前的数量减少5％或更多；更优选地，肿瘤数量减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；且最优选地，减少大于75％。肿瘤的数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤数量可以通过计数肉眼或在指定放大倍数下可见的肿瘤来测量。优选地，指定的放大倍数为2×、3×、4×、5×、10×或50×。
治疗癌症可能导致远离原发性肿瘤部位的其它组织或器官中转移病灶的数量减少。优选地，治疗后，转移病灶的数量相对于治疗前的数量减少5％或更多；更优选地，转移病灶的数目减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；且最优选地，减少大于75％。转移病灶的数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。转移病灶的数量可以通过计数肉眼或在指定放大倍数下可见的转移病灶来测量。优选地，指定的放大倍数为2×、3×、4×、5×、10×或50×。
相较于仅接受载剂的群体，治疗癌症可能导致受治疗的个体群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了超过30天；更优选地，增加了超过60天；更优选地，增加了超过90天；且最优选地，增加了超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的手段来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加还可以例如通过计算在用活性化合物完成第一轮治疗之后群体的平均存活长度来测量。
相较于未治疗的个体群体，治疗癌症可以导致受治疗的个体群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了超过30天；更优选地，增加了超过60天；更优选地，增加了超过90天；且最优选地，增加了超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的手段来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加还可以例如通过计算在用活性化合物完成第一轮治疗之后群体的平均存活长度来测量。
相较于接受不是本发明化合物、或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的药物的单一疗法的群体，治疗癌症可导致受治疗的个体群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了超过30天；更优选地，增加了超过60天；更优选地，增加了超过90天；且最优选地，增加了超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的手段来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加还可以例如通过计算在用活性化合物完成第一轮治疗之后群体的平均存活长度来测量。
相较于仅接受载剂的群体，治疗癌症可能导致受治疗的个体群体的死亡率降低。相较于未治疗的群体，治疗癌症可能导致受治疗的个体群体的死亡率降低。相较于接受不是本发明化合物、或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的药物的单一疗法的群体，治疗癌症可导致受治疗的个体群体的死亡率降低。优选地，死亡率降低了超过2％；更优选地，降低了超过5％；更优选地，降低了超过10％；且最优选地，降低了超过25％。受治疗的个体群体的死亡率降低量可以通过任何可再现的手段来测量。群体的死亡率的降低可以例如通过计算在开始用活性化合物治疗之后，群体的每单位时间疾病相关死亡的平均数来测量。群体的死亡率的降低还可以例如通过计算在用活性化合物完成第一轮治疗之后，群体的每单位时间疾病相关死亡的平均数来测量。
治疗癌症可能导致肿瘤生长速率降低。优选地，治疗后，肿瘤生长速率相对于治疗前的在之前降低至少5％；更优选地，肿瘤生长速率降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；且最优选地，降低至少75％。肿瘤生长速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。可以根据每单位时间肿瘤直径的变化测量肿瘤生长速率。
治疗癌症可能导致肿瘤再生长减少。优选地，治疗后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于10％；更优选地，小于20％；更优选地，小于30％；更优选地，小于40％；更优选地，小于50％；甚至更优选地，小于50％；且最优选地，小于75％。肿瘤再生长可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤再生长例如通过在治疗后的先前肿瘤收缩之后，测量肿瘤直径的增加来测量。停止治疗后肿瘤不再复发指示肿瘤再生长减少。
治疗或预防细胞增殖病症可导致细胞增殖速率降低。优选地，治疗后，细胞增殖速率降低至少5％；更优选地，降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；且最优选地，降低至少75％。细胞增殖速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。细胞增殖速率例如通过测量每单位时间组织样本中正在分裂的细胞的数量来测量。
治疗或预防细胞增殖病症可导致增殖细胞的比例降低。优选地，治疗后，增殖细胞的比例降低至少5％；更优选地，降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；且最优选地，降低至少75％。增殖细胞的比例可以通过任何可再现的测量手段来测量。优选地，增殖细胞的比例例如通过对组织样本中的分裂细胞的数量相对于非分裂细胞的数量进行定量来测量。增殖细胞的比例可以等于有丝分裂指数。
治疗或预防细胞增殖病症可导致细胞增殖的区域或区段的大小减小。优选地，在治疗之后，细胞增殖区域或区段的大小相对于其在治疗之前的大小减小了至少5％；更优选地，减小了至少10％；更优选地，减小了至少20％；更优选地，减小了至少30％；更优选地，减小了至少40％；更优选地，减小了至少50％；甚至更优选地，减小了至少50％；且最优选地，减小了至少75％。细胞增殖的区域或区段的大小可以通过任何可再现的测量手段来测量。细胞增殖的区域或区段的大小可以测量为细胞增殖的区域或区段的直径或宽度。
治疗或预防细胞增殖病症可导致具有异常外观或形态的细胞的数量或比例降低。优选地，治疗后，具有异常形态的细胞的数量相对于其在治疗之前的大小降低至少5％；更优选地，降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；且最优选地，降低至少75％。异常的细胞外观或形态可以通过任何可再现的测量手段来测量。异常细胞形态可以通过显微术来测量，例如使用倒置组织培养显微镜。异常细胞形态可以表现为核多形性(pleiomorphism)。
本公开提供治疗个体的癌症的方法，其包含：(a)确定个体的正常细胞和多个癌细胞在选自由以下组成的群组的多态基因座处的基因型：COLEC12的多态基因座、APCDD1的多态基因座和CXCL16的多态基因座、或HLA-A*02基因座；(b)确定多个癌细胞中HER2的表达；和(c)如果正常细胞的多态基因座为杂合的且多个癌细胞的多态基因座为半合子的或已丢失HLA-A*02，且多个癌细胞为HER2阳性，那么向个体施用多个免疫细胞，其中所述多个免疫细胞包含：(i)第一受体、任选地嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含对HER2或具有I类主要组织相容性复合物(MHC-I)的复合物中的其肽抗原具有特异性的胞外配体结合结构域；和(ii)第二受体、任选地抑制性嵌合抗原受体(即，抑制受体)，其包含对选自COLEC12、APCDD1和CXCL16的非靶抗原、或具有I类主要组织相容性复合物(MHC-I)的复合物中的其抗原肽、或HLA-A*02具有特异性的胞外配体结合，其中非靶抗原包含多态性。
对个体的癌细胞和正常细胞进行SNP存在与否的基因分型的方法对于所属领域的一般技术人员来说是显而易见的。SNP基因分型方法尤其包括基于PCR的方法，如双探针TaqMan分析、基于阵列的杂交方法和测序。
测量个体的癌症或正常细胞中靶抗原表达的方法对于所属领域的一般技术人员来说是显而易见的。这些方法尤其包括测量RNA表达的方法，如RNA测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及测量蛋白质表达的方法，如基于免疫组织化学的方法。测量多种癌细胞中杂合性丢失的方法尤其包括使用所属领域中已知的方法对从癌细胞提取的基因组DNA进行高通量测序。
测量个体的癌症或正常细胞中靶抗原表达的方法对于所属领域的一般技术人员来说是显而易见的。这些方法尤其包括测量RNA表达的方法，如RNA测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及测量蛋白质表达的方法，如基于免疫组织化学的方法。
在一些实施例中，免疫细胞为T细胞。
在一些实施例中，免疫细胞为同种异体或自体的。
在一些实施例中，相较于表达第一受体但不表达第二受体的免疫细胞，第二受体增加了免疫细胞对HER2阳性癌细胞的特异性。在一些实施例中，相较于表达第一受体但不表达第二受体的免疫细胞，所述免疫细胞具有降低的副作用。
剂量和施用
取决于需要局部治疗还是全身治疗，本公开的免疫细胞和可以以多种方式施用。
通常，施用可以是肠胃外的。
用于过继性细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，且可以与所提供的方法和组合物结合使用。举例来说，过继性T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开案第2003/0170238号和Rosenberg的美国专利第4,690,915号中。
本公开的组合物适合于肠胃外施用。如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括以物理破坏个体的组织，以及通过组织中的破坏施用药物组合物，因此通常导致直接施用到血流中、肌肉中或内部器官中为特征的任何施用途径。因此，肠胃外施用包括但不限于借助于注射组合物来施用药物组合物、借助于通过外科手术切口应用组合物、借助于通过穿透组织的非外科手术伤口应用组合物等。特别地，肠胃外施用预期包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、瘤内、滑膜内注射或输注；以及肾透析输注技术。在一些实施例中，本公开的组合物的肠胃外施用包含静脉内或动脉内施用。
细胞或细胞群体可以以一个或多个剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以在一段时间内以多于一个剂量施用。施用时机在主治医师的判断范围内，并取决于患者的临床病状。
细胞或细胞群体可以从任何来源获得，如血库或供体，或患者本身。
有效量是指提供治疗或预防益处的量。所施用的剂量将取决于受体的年龄、健康状况和体重、同时进行的治疗(如果存在)的种类、治疗频率和所需作用的性质。在一些实施例中，肠胃外施用有效量的细胞或包含那些细胞的组合物。在一些实施例中，施用可以是静脉内施用。在一些实施例中，施用可以通过肿瘤内注射直接进行。
为了本公开的目的，可以使用一种分析来确定欲施用于哺乳动物的起始剂量，所述分析包含例如在将给定剂量的这类免疫细胞施用于哺乳动物后，比较靶细胞溶解或表达受体的免疫细胞分泌一种或多种细胞因子的程度，在一组哺乳动物中，每个哺乳动物被给予不同剂量的免疫细胞。
在一些实施例中，细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗干预(如抗体或工程化细胞或受体或试剂，如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序依序施用。在一些实施例中，本公开的免疫细胞与一种或多种额外的治疗剂共同施用或与另一种治疗干预联合施用，同时或以任何顺序依序施用。在一些情况下，免疫细胞与另一种疗法在足够接近的时间内共同施用，使得免疫细胞群体增强一种或多种额外治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施例中，免疫细胞在一种或多种额外治疗剂之前施用。在一些实施例中，免疫细胞在一种或多种额外治疗剂之后施用。
在实施例中，在施用(例如，输注)过继性免疫细胞之前、同时或之后向个体施用淋巴细胞耗竭化疗。在实例中，在施用免疫细胞之前对个体施用淋巴细胞耗竭化疗。举例来说，淋巴细胞耗竭化疗在过继性细胞输注前1-4天(例如，1、2、3或4天)结束。在实施例中，施用多剂量的过继性细胞，例如如本文所描述。在实施例中，在施用(例如，输注)本文所描述的免疫细胞之前、同时或之后向个体施用淋巴细胞耗竭化疗。淋巴细胞耗竭的实例包括但不限于非清髓性淋巴细胞耗竭化疗、清髓性淋巴细胞耗竭化疗、全身照射等。淋巴细胞耗竭剂的实例包括但不限于抗胸腺细胞球蛋白、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD52抗体、抗CD2抗体、TCRαβ阻断剂、抗CD20抗体、抗CD19抗体、硼替佐米(Bortezomib)、利妥昔单抗(rituximab)、抗CD 154抗体、雷帕霉素(rapamycin)、CD3免疫毒素、氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、美法仑(melphalan)、玛瑟拉(Mabthera)、他克莫司(Tacrolimus)、阿法赛特(alefacept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、OKT3、OKT4、OKT8、OKT11、芬戈莫德(fingolimod)、抗CD40抗体、抗BR3抗体、坎帕斯(Campath)-1H、抗CD25抗体、钙调磷酸酶抑制剂、霉酚酸酯(mycophenolate)和类固醇(steroids)，其可以单独或组合使用。作为另一实例，淋巴细胞耗竭方案可以包括施用阿仑单抗、环磷酰胺、苯杜阿莫司汀(benduamustin)、利妥昔单抗、喷司他汀(pentostatin)和/或氟达拉滨。淋巴细胞耗竭方案可以在一个或多个周期中施用，直到循环免疫细胞减少达到预期结果。在一些实施例中，淋巴细胞耗竭包含施用特异性靶向且降低或消除个体体内CD52+细胞的试剂，且修饰免疫细胞以降低或消除CD52表达。
在一些实施例中，在施用(例如输注)过继性免疫细胞之前、同时或之后向个体施用免疫刺激疗法。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含稳态细胞因子。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含免疫刺激分子。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-9或其功能片段。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-9或其组合。在一些实施例中，免疫刺激疗法包含IL-2或其功能片段。
使用自体细胞进行过继性细胞疗法的方法包括从患者血液中分离免疫细胞，对分离的细胞进行一系列修饰，包括用一种或多种编码本文所描述的双受体系统的载体转导细胞，并将细胞施用于患者。提供来自罹患癌症或血液恶性肿瘤或处于其风险下的个体的免疫细胞需要从患者血液中分离免疫细胞，且可以通过所属领域中已知的方法实现，例如通过白细胞分离术。在白细胞分离术期间，从个体抽取血液，且分离外周血单核细胞(PBMC)，并将剩余的血液返回到个体的循环中。将PBMC作为免疫细胞样本冷冻或冷冻保存储存，并提供进一步加工步骤，例如本文所描述的修饰。
在一些实施例中，本文所描述的治疗个体的方法包含对来自个体的免疫细胞的修饰，修饰包括一系列修饰，包括富集和/或耗乏、活化、遗传修饰、扩增、调配和冷冻保存。
本公开提供了富集和/或耗竭步骤，其可以是例如所属领域中已知的洗涤和分级分离方法，用于制备用于下游程序(例如本文所描述的调节)的个体PBMC。例如但不限于，方法可以包括去除总红细胞和血小板污染物的装置、用于消耗单核细胞和分离淋巴细胞的基于大小的细胞分级分离的系统，和/或允许富集或耗竭特定T细胞亚群(例如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞)的系统。富集步骤后，将从个体的PMBC中分离出靶免疫细胞亚群用于进一步处理。所属领域的技术人员将理解，如本文提供的富集步骤也可以涵盖任何新发现的方法、装置、试剂或其组合。
本公开提供了活化步骤，其可以是所属领域中已知的诱导免疫细胞(例如T细胞)的活化的任何方法，所述活化是其离体扩增所需的。免疫细胞活化可以例如通过在树突状细胞存在下培养个体免疫细胞，在人工抗原呈递细胞(AAPC)存在下培养个体免疫细胞，或在照射的K562源性AAPC存在下培养免疫细胞来实现。用于活化个体免疫细胞的其它方法可以是，例如，在分离的活化因子和组合物(例如用活化因子官能化的珠粒、表面或颗粒)存在下培养免疫细胞。活化因子可以包括例如抗体，例如抗CD3和/或抗CD28抗体。活化因子还可以是例如细胞因子，例如白介素(IL)-2或IL-21。活化因子还可以是共刺激分子，例如CD40、CD40L、CD70、CD80、CD83、CD86、CD137L、ICOSL、GITRL和CD134L。所属领域的技术人员将理解，如本文所提供的活化因子也可以涵盖任何新发现的可以活化免疫细胞的活化因子、试剂、组合物或其组合。
本公开提供了用于修饰个体免疫细胞的遗传修饰步骤。在一些实施例中，遗传修饰包含用包含与B2M或HLA-A互补的本文所描述的shRNA的载体转导免疫细胞。在一些实施例中，遗传修饰包含使用CRISPR/Cas介导的基因组工程化修饰免疫细胞的基因组以诱导B2M或HLA-A中的突变。在一些实施例中，所述方法包含用一种或多种编码活化剂受体和抑制受体的载体转导免疫细胞，从而产生表达活化剂受体和抑制受体的免疫细胞。
本公开提供了遗传修饰的个体免疫细胞的扩增步骤。遗传修饰的个体免疫细胞可以在所属领域中已知的任何免疫细胞扩增系统中扩增，以产生治疗剂量的施用用免疫细胞。举例来说，用于包含控制器泵的系统中的生物反应器袋和允许自动进料和废物去除的探针可用于免疫细胞扩增。在底部具有气体渗透膜的细胞培养瓶可用于免疫细胞扩增。本文提供的扩增步骤涵盖所属领域中已知的能够扩增用于临床用途的免疫细胞的任何这类系统。免疫细胞在培养系统中在专门调配用于扩增的培养基中扩增。也可以通过在如本文所描述的活化因子的存在下培养本公开的免疫细胞来促进扩增。所属领域的技术人员将理解，本文提供的扩增步骤也可以涵盖任何新发现的可用于扩增免疫细胞的培养系统、培养基或活化因子。
本公开提供了用于扩增的遗传修饰的个体免疫细胞的调配和冷冻保存步骤。提供的调配步骤包括，例如，洗去用于本文所描述的治疗方法的免疫细胞的制备和扩增的过量组分。所属领域中已知的与免疫细胞相容的任何药学上可接受的调配介质或洗涤缓冲液可用于洗涤、稀释/浓缩免疫细胞，和制备用于施用的剂量。调配介质对于免疫细胞的施用可以是可接受的，例如用于静脉内输注的晶体溶液。
冷冻保存可以任选地用于长期储存免疫细胞。可以使用所属领域中已知的方法实现冷冻保存，包括例如在含有冷冻保存组分的冷冻保存培养基中保存细胞。冷冻保存组分可以包括例如二甲亚砜或甘油。储存在冷冻保存培养基中的免疫细胞可以通过将储存温度降低到-80℃到-196℃进行冷冻保存。
在一些实施例中，治疗方法包含确定个体的HLA种系类型。在一些实施例中，确定骨髓中的HLA种系类型。
在一些实施例中，治疗方法包含确定HER2的表达水平。在一些实施例中，在来自个体的肿瘤组织样本中确定HER2的表达水平。在一些实施例中，使用下一代测序确定HER2的表达水平。在一些实施例中，使用RNA测序确定HER2的表达水平。在一些实施例中，使用免疫组织化学确定HER2的水平。
在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的个体施用治疗有效剂量的包含HLA-A*02抑制受体的免疫细胞，其中个体被确定为HLA种系HLA-A*02杂合型且具有丢失HLA-A*02的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的个体施用治疗有效剂量的包含HLA-A*01抑制受体的免疫细胞，其中个体被确定为HLA种系HLA-A*01杂合型且具有丢失HLA-A*01的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的个体施用治疗有效剂量的包含HLA-A*03的免疫细胞，其中个体被确定为HLA种系HLA-A*03杂合型且具有丢失HLA-A*03的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的个体施用治疗有效剂量的包含HLA-A*07抑制受体的免疫细胞，其中个体被确定为HLA种系HLA-A*07杂合型且具有丢失HLA-A*07的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含向有需要的个体施用治疗有效剂量的包含HLA-C*07抑制受体的免疫细胞，其中个体被确定为HLA种系HLA-C*07杂合型且具有丢失HLA-C*07的癌细胞。在一些实施例中，治疗方法包含在有需要的个体中施用治疗有效剂量的包含HLA-B*07抑制受体的免疫细胞，其中个体被确定为HLA种系HLA-B*07杂合型且具有丢失HLA-B*07的癌细胞。
在各种实施例中，本公开提供了治疗患有表达HER2且已经丢失HLA-A*02表达的恶性肿瘤的杂合HLA-A*02患者的方法；和/或治疗患有表达HER2且丢失HLA-A*02表达的复发性不可切除或转移性实体肿瘤的杂合HLA-A*02成年患者。
在一些实施例中，施用治疗有效剂量的本文所描述的免疫细胞。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过静脉内注射施用。在一些实施例中，本公开的免疫细胞通过腹膜内注射施用。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞、约1×106个细胞、约2×106个细胞、约3×106个细胞、4×106个细胞、约5×106个细胞、约6×106个细胞、约7×106个细胞、约8×106个细胞、约9×106个细胞、约1×107、约2×107、约3×107、约4×107、约5×107、约6×107、约7×107、约8×107、约9×107、约1×108个细胞、约2×108个细胞、约3×108个细胞、约4×108个细胞、约5×108个细胞、约6×108个细胞、约7×108个细胞、约8×108个细胞、约9×108个细胞、约1×109个细胞、约2×109个细胞、约3×109个细胞、约3×109个细胞、约4×109个细胞、约5×109个细胞、约5×109个细胞、约6×109个细胞、约7×109个细胞、约8×109个细胞、约9×109个细胞、约1×1010个细胞、约2×1010个细胞、约3×1010个细胞、约4×1010个细胞、约5×1010个细胞、约6×1010个细胞、约7×1010个细胞、约8×1010个细胞、或约9×1010个细胞。
在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞到约9×1010个细胞、约1×106个细胞到约5×1010个细胞、约2×106个细胞到约5×109个细胞、约3×106个细胞到约5×109个细胞、约4×106个细胞到约3×109个细胞、约5×106个细胞到约2×109个细胞、约6×106个细胞到约1×109个细胞、0.5×106个细胞到约6×109个细胞、约1×106个细胞到约5×109个细胞、约2×106个细胞到约5×109个细胞、约3×106个细胞到约4×109个细胞、约4×106个细胞到约3×109个细胞、约5×106个细胞到约2×109个细胞、约6×106个细胞到约1×109个细胞、0.5×106个细胞到约6×108个细胞、约1×106个细胞到约5×108个细胞、约2×106个细胞到约5×108个细胞、约3×106个细胞到约4×108个细胞、约4×106个细胞到约3×108个细胞、约5×106个细胞到约2×108个细胞、约6×106个细胞到约1×108个细胞、约7×106个细胞到约9×108个细胞、约8×106个细胞到约8×108个细胞、约9×106个细胞到约7×108个细胞、约1×107个细胞到约6×108个细胞、约2×107个细胞到约5×108个细胞、约7×106个细胞到约9×107个细胞、约8×106个细胞到约8×107个细胞、约9×106个细胞到约7×107个细胞、约1×107个细胞到约6×107个细胞、或约2×107个细胞到约5×107个细胞。
在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×105个细胞到约9×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞到约1×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞到约5×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞到约1×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞到约6×108个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×106个细胞到约9×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞到约1×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞到约5×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞到约1×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×107个细胞到约6×108个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞到约9×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞到约1×1010个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞到约5×109个细胞。在一些实施例中，治疗有效剂量包含约0.5×108个细胞到约1×109个细胞。在治疗剂量中提到的术语“约”可以是例如±0.5×106个细胞、±0.5×107个细胞、或±0.5×108个细胞。
试剂盒和制品
本公开提供试剂盒和制品，其包含编码本文所描述的工程化受体的多核苷酸和载体，以及使用本文所描述的基因编辑系统编辑且包含本文所描述的工程化受体的免疫细胞。在一些实施例中，试剂盒包含制品，如小瓶、注射器和使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含含有编码一种或多种本公开的工程化受体的序列的多核苷酸或载体。
在一些实施例中，试剂盒包含多种包含如本文所描述的工程化受体的免疫细胞。在一些实施例中，多种免疫细胞包含多种T细胞。
实例
实例1：分析Jurkat和原代T细胞中的HER2 CAR活性的方法
细胞培养
编码NFAT荧光素酶报告子的Jurkat细胞获自BPS生命科学(BPS Bioscience)。在培养中，将Jurkat细胞维持在补充有10％FBS、1％Pen/Strep和0.4mg/mL G418/遗传霉素的RPMI培养基中。HCT.116和HeLa细胞如ATCC上所建议进行维持。
Jurkat细胞转染
Jurkat细胞根据制造商的方案用100μL或20μl格式4D Nucleofactor(龙沙)瞬时转染。每1e6细胞用1-3μg活化剂受体构建体和1-3μg抑制受体构建体或空载体进行共转染，且在补充有20％热灭活FBS和0.1％Pen/Strep的RPMI培养基中回收。为了确认抑制受体表面表达，在转染后18-24小时，Jurkat细胞在4℃下在具有1％BSA的PBS中用10μg/mL链霉亲和素-PE-HLA-A*02-pMHC四聚体染色60分钟，且通过流式细胞术(BD FACS Canto II)表征。
Jurkat-NFAT-荧光素酶活化研究
简单来说，Jurkat NFAT-萤火虫-荧光素酶细胞使用龙沙4D NucleofectorTM(AAF-1002B)或NeonTM转染系统(赛默飞世尔(ThermoFisher)，MPK5000)，用活化剂受体构建体和抑制(阻断剂)受体构建体转染。将mRNA转染的靶细胞(10,000个细胞/孔)、不同密度的表达仅活化剂或活化剂/阻断剂的靶细胞添加到384孔平板(康宁(Corning)3570)中的转染的Jurkat-NFAT-萤火虫-荧光素酶细胞(12,000个细胞/孔)中，到20mL的最终体积。在37℃下6小时培育之后，使用One-StepTM荧光素酶萤火虫分析系统(BPS生命科学，60690)来确定TecanM1000上的发光强度。/>
固体底物抗原滴定
将生物素化pMHC添加到具有和不具有浓度与最高pMHC摩尔浓度等摩尔的生物素化重组CD28激动剂、生物素化重组PD-L1或两者的链霉亲和素涂覆的平板中。小鼠IgG1用作对照以确保不超过孔的结合能力。洗涤掉未结合分子，且添加转导的T细胞。一半的T细胞被回收，且在24小时时用抗CD69染色，且其余部分在48小时时用抗CD25染色。
活化剂mRNA滴定
HER2或HLA-A2 mRNA如下文所描述合成，且进行两倍稀释12次。将mRNA的每种稀释液与两百万个Her2敲除HeLa细胞(Her2-/HLA-A2-)混合，且使用4D Nucleofactor电穿孔。随后，在如上文所描述测量活化程度之前，将mRNA转染的靶细胞与用HER2 CAR或阻断剂受体转染的Jurkat细胞一起共培养6小时。
mRNA的体外转录
通过金斯瑞(Genscript)，用5'端的T7启动子以及5'和3'合成UTR序列合成HER2序列。在具有T7 RNA聚合酶(NEB，M0251S)、无机焦磷酸酶(NEB，M2403S)和鼠类RNA酶抑制剂(NEB，M0314S)的1×IVT缓冲液(40mM Tris，10mM DTT，2mM亚精胺，0.002％Triton X-100，和27mM MgCl2)中进行体外转录。另外，添加500ng PCR纯化的模板，5mM CleanCap Cap1 AG三聚体，各5mM ATP、CTP、GTP和假尿苷三磷酸(假UTP)，且在37℃下培育转录反应物2小时，随后添加DNA酶I(NEB，M0303S)，在37℃下再培育15分钟。
通过添加用聚A酶(NEB，M0276S)加尾的聚A和在37℃下培育30分钟来完成体外转录反应。随后，使用NEB Monarch试剂盒清洗mRNA。纯化的mRNA用Antarctic磷酸酶(NEB，M0289S)在37℃下于1×Antarctic磷酸酶缓冲液(NEB)中处理1小时。随后，mRNA使用NEBMonarch试剂盒再次纯化。通过Nanodrop测量mRNA浓度。通过凝胶电泳获取mRNA的品质。将最终体外转录的mRNA等分且存储在-80℃下，直到在使用前不久。
原代T细胞转导、扩增和富集
根据先前描述的方法，从购自的Leukopaks纯化出人类PBMC(Garcia等人,2014)。收集方案和供体知情同意书在/>由机构审查委员会(InstitutionalReview Board；IRB)批准。/>还遵循HIPAA顺应性和经过严格监督的批准方案(https://www.allcells.com/cell-tissue-procurement/donor-facilities/)。除非另外规定，否则所有LymphoONE培养基(宝生物(Takara)WK552)均补充有1％人AB血清(吉米尼生物(GeminiBio)100-512)。在用编码活化剂(CAR)和/或阻断剂的慢病毒转导之前，使人类PBMC在LymphoONE加TransActTM(美天旎130-111-160)中按照制造商指南(1:100稀释液)生长24小时。在转导后24小时，将额外LymphoONE加IL-2(300IU/ml)添加到转导的细胞中，在转移到24孔G-Rex平板(威尔逊伍尔夫(Wilson Wolf)80192M)之前生长3天。当在G-Rex平板中扩增细胞时，每48小时添加新鲜IL-2(300IU/ml)，其中每7天进行培养基更换。通过流式细胞术，使用蛋白L(对于活化剂)和HLA-A2pMHC或LIL-RB1抗体(对于阻断剂)确认原代T细胞中转导的活化剂或活化剂与阻断剂的表达和抗原结合。如果需要，那么表达CAR或阻断剂的细胞根据制造商的说明书用蛋白质L-生物素/链霉亲和素-PE或pMHC/链霉亲和素-PE标记，随后用抗PE微珠(美天旎130-048-801)标记，且随后使用/>Pro分离器(美天旎)富集。使富集的细胞在G-Rex平板中生长直到使用。
原代T细胞体外细胞毒性研究
对于细胞毒性研究，将富集的原代T细胞与表达海肾荧光素酶(生物塞蒂亚(Biosettia))的HeLa和HCT.116细胞一起培育。使用海肾荧光素酶报告子分析系统(普洛麦格(Promega))定量表达荧光素酶的活靶细胞。使用IncuCyte活细胞成像器，对稳定表达GFP和海肾荧光素酶(生物塞蒂亚)或稳定表达RFP和萤火虫荧光素酶(生物塞蒂亚)的靶细胞，以及未标记的原代T细胞成像。在40小时之后，使用IncuCyte成像软件定量活靶细胞随着时间推移的荧光强度。对于可逆性研究，将富集的原代T细胞与“正常”或“肿瘤”靶细胞一起类似地共培养3天且成像。3天后，通过移液、FACS或磁珠将T细胞与剩余靶细胞分离。在分开的孔中，在72小时时，使用双重荧光素酶报告子分析系统(普洛麦格)定量表达荧光素酶的活靶细胞。
小鼠异种移植研究
如上文所描述产生表达活化剂和阻断剂的T细胞。
五到六周龄雌性NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)、JAX储备号005557小鼠购自杰克逊实验室(The Jackson Labs)。在起始研究之前，使动物适应圈养环境至少3天。对动物注射5e6HER2+HCT.116细胞，在一个侧腹中为HLA-A*02阳性细胞，且在另一侧腹中为HLA-A*02阴性细胞。当两侧腹中的肿瘤总体积达到平均100mm3(V＝L×W×W/2)时，将动物随机分组到各组，且通过尾静脉施用2e6、5e6或10e6总T细胞。在T细胞注射后，对两个侧腹上进行肿瘤测量，每周3次，持续4周。
统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计分析。除非另外指出，否则所有肽和细胞滴定研究均显示为平均值±标准差(SD)，而使用原代T细胞的体外和体内研究均显示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用四参数非线性回归分析拟合肽和细胞滴定曲线。直接根据曲线计算EC50值。除非另外指出，否则使用普通双向ANOVA，随后杜凯氏(Tukey's)多比较测试分析所有其它数据群组。
实例2：Jurkat细胞中HER2嵌合抗原受体的活性
测定Jurkat细胞中不同HER2嵌合抗原受体(CAR)的敏感性且进行排序。所分析的不同HER2 CAR的格式，和这些CAR的HER2抗原结合结构域显示于图1中。所分析的HER2 CAR的序列显示于下表25中。
使用固体底物上HER2抗原的滴定(图2A)，和通过滴定HCT.116HER2阳性靶细胞的数量(图2B)，来分析表达HER2 CAR 1-4(分别为CT292、CT297、CT298和CT299)的Jurkat细胞的活性。在两种情况下，具有FRP5抗原结合结构域的HER2 CAR2显示很少乃至无活性。分析使用IgG1铰链结构域(CT1094和CT1095)的不同CAR格式的FRP5抗原结合结构域和FRP5的变体。如图2C中所示，FRP5抗原结合结构域与IgG1铰链组合显示可检测的活性。
表25
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实例3：HLA-A*02抑制受体可抑制HER2 CAR介导的Jurkat细胞的活化
分析基于HLA-A*-02LIR1的抑制受体抑制HER2介导的表达HER2 CAR和基于的抑制受体两个的Jurkat细胞的活化。
使表达单独的HER2 CAR1(图3)或HER2 CAR4(图4)或与CT1765 HLA-A*02LIR1抑制受体组合的Jurkat细胞，与HCT.116或HeLa细胞一起共培养。HCT.116HeLa细胞表达HER2(靶A)、或HER2和HLA-A*02(靶AB)。如从图3可看出，活化表达HLA-A*02抑制受体和HER2 CAR1的Jurkat细胞受到表达HER2和HLA-A*02两个的HCT.116或HeLa靶细胞抑制。相比之下，活化仅表达HER2 CAR1的Jurkat细胞在表达HER2和HLA-A*02两个的靶细胞存在下未受到抑制。对于HER2 CAR4观测到类似结果，如图4中所示。
Jurkat细胞对HER2 CAR和HLA-A*02抑制受体两个的表面表达，通过使用蛋白L(对于活化剂受体)和pMHC或抗LILRB1抗体(对于阻断剂受体)染色Jurkat细胞来验证，如图5中所示。
实例4：HLA-A*02抑制受体可抑制HER2 CAR介导的原代T细胞的活化
在原代T细胞中证明HER2 CAR1(CT292)与HLA-A*02LIR1抑制受体组合的功效、选择性和可逆性。分析HLA-A*02LIR1抑制受体(C1765)的鼠类型式以及两种人源化型式(C2162和C2163)与HER2 CAR的组合。HLA-A*02抑制受体的序列提供于下表26中。
如图6中可看出，在慢病毒转导和富集之后，所有HER2 CAR1以及三种抑制受体构建体均被原代T细胞表达。在1:40(HER:HLA-A*-02)的比率下，使用表达活化剂配体与抑制剂配体的HeLa靶细胞，来分析表达三种抑制受体中的各者与HER2 CAR1组合的原代T细胞的活性。如图7中所示，所有抑制受体均能够抑制HER2介导的原代T细胞活化。在约1:4的比率下，使用表达活化剂与阻断剂抗原的HCT.116靶细胞得到类似结果(图8)。HeLa和HCT.116靶细胞的抗原表达和抗原密度显示于图12和13中。
表26：HLA-A*02抑制受体
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实例5：HLA-A*02抑制受体对HER CAR介导的原代T细胞活化的抑制是可逆的
HLA-A*02LIR1抑制受体抑制HER2介导的表达HER2 CAR的原代T细胞的活化的能力是可逆的。以1:1的比率,将表达单独HER2 CAR1(CT292)或与CT1765 HLA-A*02抑制受体组合的原代T细胞与表达HER2和HLA-A*02(图9，RD1，或第1轮)的HCT.116细胞一起共培养。随后去除HCT.116靶细胞，且以1:1的比率将原代T细胞与仅表达HER2的HCT.116靶细胞一起共培养(图9，RD2，或第2轮)。最后，在1:1的比率下，将原代T细胞与表达HER2和HLA-A*02两个、或仅HER2作为对照的HCT.116细胞一起再次共培养(图9，RD3，或第3轮)。如图9中可看出，T细胞的活化和失活是可逆的。另外，仅表达HER2 CAR的T细胞在第3轮共培养耗竭，而表达HER2 CAR和HLA-A*02LIR1抑制受体两个的T细胞则不。
实例6：小鼠异种移植模型中表达HER2 CAR和HLA-A*02抑制受体的原代T细胞的活性
使用小鼠异种移植模型分析待用于体内治疗和研究的T细胞的最优剂量。对小鼠的各侧腹中植入5e6靶细胞。靶细胞为呈HER2+和HLA-A*02阳性的HCT.116野生型细胞(“正常”细胞)，或已敲除HLA-A*02的HCT.116(“肿瘤”细胞)。在一个侧腹中移植正常靶细胞，且在另一侧腹中移植肿瘤细胞。小鼠用来自未转导或用HER2 CAR1活化剂受体(CT292)与C2162 HLA-A*02LIR1抑制受体的组合转导的HLA-A*02阴性供体的T细胞处理。对异种移植模型小鼠注射2e6、5e6或10e6总T细胞，且在T细胞注射后的日子中监测肿瘤体积。实验的示意图在图10中示出。如图11中所见，在异种移植体内模型中，表达HER2 CAR和HLA-A*02LIR抑制受体的组合的T细胞显示细胞毒性和阻断效果，且每小鼠1e7总T细胞的剂量。
实例7：Jurkat细胞中表达的HER2 CAR和HLA-A*02抑制受体的活性
测试九种受体对候选物。scFv CT292、CT299或CT1094与无模块(仅CAR)、鼠类阻断剂(C1765)、人源化阻断剂1(C2162)或人源化阻断剂2(C2163)配对。阻断剂和抑制剂的各种组合显示于表27中。
使用mRNA滴定分析测量活化剂和阻断剂敏感性。滴定mRNA，且其用于转染HER2-HeLa靶细胞，随后其与表达适当的HER2构建体和NFAT荧光素酶的Jurkat细胞一起共培养。在共培养6小时后，通过发光强度测量Jurkat细胞活化。结果显示于图14中且概述于表27中。阻断剂C2163显示与具有较低活化水平的C2162类似的阻断活性，且未进一步研究。
表27：筛选的HER2 CAR和抑制受体
实例8：表达HER2 CAR和HLA-A*02抑制受体的原代T细胞的选择性细胞杀伤
原代T细胞用六种活化剂-阻断剂受体对转导，且测量在1:1E:T比率下其对于HeLa靶细胞的急性细胞毒性功能。细胞用仅HER2 CAR(CT292、CT299或CT1094)或用HER2 CAR和鼠类形式(C1765)或人源化形式(C2162)的阻断剂转染。结果显示于图15中。用测试的任一受体对转染的细胞选择性杀伤肿瘤细胞但略过正常细胞，而仅用CAR转染的细胞杀伤两种细胞类型。
原代T细胞用HER2 CAR CT292和人类阻断剂1(CT1118细胞)、或用HER2 CARCT1094和人类阻断剂1(CT1121细胞)转导，且在广泛范围的E:T比率内与A375正常(HLA-A*02-熟练)或肿瘤(HLA-A*02-缺陷型)靶细胞一起共培养48小时，且记录各E:T比率下的最大特异性杀伤。使用非线性回归拟合数据，得到产生50％最大细胞毒性的E:T比率(EC50)。结果显示于图16中，其中从肿瘤到正常靶细胞的EC50的倍数变化指示为选择性比率。此分析在两个个别HLA-A*02-T细胞供体(左与右)中进行。总的来说，CT1211受体组合比CT1118更强效。两种构建体均具有选择性，但CT1118受体组合似乎在所测试的E:T比率范围内更能保护正常A375靶细胞。
实例9：CT1118受体组合的进一步表征
相对于单独的CT292 CAR衡量CT1118受体组合(CT292 CAR和人类阻断剂CT2162)。原代T细胞用单独的CT292或其与CT2162组合转导，且评估在1:1E:T比率下对于HeLa靶细胞或A375靶细胞的急性细胞毒性。结果显示于图17中。相对于CT1118细胞，CT292细胞杀伤肿瘤和正常细胞两者。CT1118细胞以与CT292细胞类似的效率杀伤肿瘤细胞同时略过正常细胞，因此证明受体组合比单独CAR的选择性提高。
接下来，在再激发之后评估CT1118细胞的活性和选择性。结果显示于图18中。在1:1E:T比率下，原代CT292 T细胞和CT1118 T细胞对于HER2+/HLA-A*02-HeLa靶细胞维持类似的效能至多三个48小时肿瘤再激发轮次。然而，CT1118细胞持续略过HER2+/HLA-A*02+HeLa靶细胞，而CT292细胞则不。
实例10：CT1118功能的可逆性
通过在1:1E:T比率下，将CT292细胞和CT1118细胞与肿瘤(靶A；HER2+/HLA-A*02-)或正常(靶AB；HER2+/HLA-A*02+)的HeLa同型一起共培养，每轮48小时，来评估CT292和CT1118细胞的功能的可逆性。结果显示于图19中。CT292T细胞杀伤两种细胞类型，而CT1118细胞显示可逆的活化。此外，CT1118细胞显示细胞毒性失活，这取决于HLA-A*02状态。不管暴露顺序如何，均观测到功能的此可逆性，肿瘤→正常→肿瘤或正常→顶部→正常。图20显示在t＝48小时各顺序的靶细胞的图像(左图：肿瘤→正常→肿瘤；右图：正常→肿瘤→正常)。不管顺序如何，CT1118细胞均呈现可逆的功能。UTD治疗引起健康的粘附靶细胞，不管HLA-A*02表达如何，而CT292细胞杀伤肿瘤和正常靶细胞两个。CT1118细胞选择性杀伤肿瘤细胞但略过正常细胞
实例11：混合培养物中CT1118的选择性毒性
通过将CT292细胞或CT1118细胞与在1:1比率下混合的肿瘤和正常HeLa靶细胞一起共培养三个48小时轮次评定选择性细胞毒性。结果显示于图21中。CT1118细胞显示对肿瘤细胞的持续选择性杀伤，而CT292细胞杀伤两种细胞类型。图22显示在与未转导的T细胞、CT292细胞或CT1118细胞一起共培养20小时后，混合培养物中肿瘤和正常HeLa靶细胞的图像。CT292细胞杀伤正常和肿瘤细胞两个，而CT1118细胞选择性杀伤肿瘤细胞。图23显示CT1118的选择性在再激发后维持24小时。
实例12：CT292在体内的作用
在第0天，将1E6 A375A2+(正常)和A2-(肿瘤)移植于NSG小鼠的各侧腹上。A375细胞的HER2和HLA-A2表达分别类似于CT1118的EC50和IC50(图24)。在第8天，以每小鼠2000万个细胞注射未转导的(“UTD”)、CT292细胞和CT1118细胞。在注射后每2-3天通过卡尺测量肿瘤体积。
结果显示于图25中。CT292细胞减少肿瘤和正常异种移植物两个，而CT1118细胞选择性减少肿瘤异种移植物而非正常异种移植物。
实例13：CT292与HLA-A03、HLA-A*11或HLA-B807阻断剂配对的体外功效
在mRNA滴定分析中测量在以下情况下的Jurkat NFAT荧光素酶(JNL)细胞抑制：CT292与HLA-A*03:01阻断剂26(包含SEQ ID NO:405的scFv)、HLA-A*11:01阻断剂4(包含SEQ ID NO:345的scFv)或HLA-B*07:02阻断剂BB7.1(包含SEQ ID NO:21806的scFv)配对。
在mRNA滴定分析中，使用用mRNA转染的HeLa细胞，测量JNL细胞活化。HeLa细胞用连续稀释的编码A*03:01、A*11:01或B*07:02阻断剂的mRNA转染。JNL细胞用CT292和阴性对照载体(空心圆)、或CT292和HLA-A*03:01、HLA-A*11:01或HLA-B*07:02阻断剂中的任一者(实心圆)瞬时转染。在5,000个JNL细胞和5,000个HeLa细胞共培养6小时后，评定功能性反应。数据显示于图26A到26C中。结果显示，所有阻断剂在所滴定的对应HLA mRNA存在下均阻断HER2 CAR的活化。
通过流式细胞仪评定在mRNA转染后HeLa细胞表面上的HLA-A*11:01或HLA-B*07:02蛋白。HeLa细胞用2×连续稀释的mRNA转染，所述mRNA编码加FLAG标签的HLA-A*11:01或加FLAG标签的HLA-B*07:02，最高剂量为2000ng/200,000个HeLa细胞。根据制造商说明书，以20μL格式，使用4D nucleofector X-单位(龙沙)转染细胞。将转染的细胞转移到含有10％FBS和0.1％青霉素和链霉素的MEM培养基中，且在37℃、5％CO2下培育16-24小时。在第二天，机械地剥离细胞，且其用100μL FACS缓冲液(PBS+1％BSA)洗涤两次，随后在冰上用抗HLA*A11:01(1λ0284HA)或抗B*07:02mRNA(BB7.1)抗体染色30分钟。在用100μL FACS缓冲液2×洗涤之后，细胞在冰上用抗小鼠IgG FITC或APC二级抗体染色30分钟。随后，细胞用FACS缓冲液洗涤两次，且测量荧光。结果显示于图27中，其中底部图含有0ng mRNA。

Claims (60)

1.一种应答癌细胞中杂合性丢失的免疫细胞，其包含：
a.活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域；和
b.抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述非靶抗原为I类HLA等位基因或次要组织相容性抗原(minor histocompatibility antigen；MiHA)。
3.根据权利要求2所述的免疫细胞，其中所述I类HLA等位基因包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E。
4.根据权利要求2所述的免疫细胞，其中所述I类HLA等位基因为HLA-A*02。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原为HER2或与I类主要组织相容性复合物(MHC I)的复合物中HER2的肽抗原。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞，其中所述癌细胞表达HER2。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞为乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、唾液管癌细胞、非小细胞肺癌细胞、胰腺癌细胞或结肠癌细胞。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述癌细胞为乳腺癌细胞或胃癌细胞。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的免疫细胞，其中所述HLA-A*02非靶抗原是由个体的健康细胞表达。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的免疫细胞，其中所述个体的健康细胞表达所述靶抗原和所述HLA-A*02非靶抗原两者。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫细胞，其中所述活化剂受体和所述抑制受体在所述癌细胞存在下一起特异性活化所述免疫细胞。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞为T细胞。
13.根据权利要求12所述的免疫细胞，其中所述T细胞为CD8+CD4-T细胞。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫细胞，其中所述HER2抗原包含与SEQ IDNO:2-29中的任一个的序列或子序列至少95％一致的序列或子序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的免疫细胞，其中所述活化剂受体为T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
16.根据权利要求15所述的免疫细胞，其中所述活化剂受体的所述胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)、或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
17.根据权利要求15或16所述的免疫细胞，其中所述活化剂受体的所述胞外配体结合结构域包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。
18.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述VH区和所述VL区包含选自由SEQ IDNO:30-42组成的群组的互补决定区(CDR)。
19.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：GFNIKDTYIH(SEQ ID NO:36)、ARIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:38)和SRWGGDGFYAMD[Y/V](SEQ ID NO:40)或(SEQ ID NO:41)；且所述VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLY(SEQ ID NO:32)和QQHYTTPP(SEQ ID NO:34)。
20.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：NYGMN(SEQ ID NO:37)、WINTSTGESTFADDFKG(SEQ ID NO:39)和WEVYHGYVPY(SEQ ID NO:42)；且所述VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR序列：KASQDVYNAVA(SEQ ID NO:31)、SASSRYT(SEQ ID NO:33)和QQHFRTPFT(SEQ ID NO:35)。
21.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述VH区包含以下CDR序列：GFNIKDTYIH(SEQ ID NO:36)、ARIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:38)和SRWGGDGFYAMD[Y/V](SEQ ID NO:40)或(SEQ ID NO:41)；且所述VL区包含以下CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLY(SEQ ID NO:32)和QQHYTTPP(SEQ ID NO:34)。
22.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述VH区包含以下CDR序列：NYGMN(SEQ IDNO:37)、WINTSTGESTFADDFKG(SEQ ID NO:39)和WEVYHGYVPY(SEQ ID NO:42)；且所述VL区包含以下CDR序列：KASQDVYNAVA(SEQ ID NO:31)、SASSRYT(SEQ ID NO:33)和QQHFRTPFT(SEQID NO:35)。
23.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述VH区包含以下CDR序列：DTYIH(SEQ IDNO:313)、RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:314)和WGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:315)；且所述VL区包含以下CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLYS(SEQ ID NO:311)、QQHYTTPPT(SEQ ID NO:312)和DTYIH(SEQ ID NO:313)。
24.根据权利要求16或17所述的免疫细胞，其中所述scFv包含与选自由SEQ ID NO:51、53、55、57、59和61组成的群组的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致性或与其一致的序列。
25.根据权利要求15至24中任一项所述的免疫细胞，其中所述CAR包含分离或衍生自CD8、CD28、IgG1或IgG4的铰链序列、或合成铰链。
26.根据权利要求15至25中任一项所述的免疫细胞，其中所述CAR包含分离或衍生自CD8或CD28的跨膜结构域。
27.根据权利要求15至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述CAR包含分离或衍生自CD28、4-1BB或CD3z或其组合的胞内结构域。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的免疫细胞，其中所述抑制受体包含TCR或CAR。
29.根据权利要求28所述的免疫细胞，其中所述抑制受体的所述胞外配体结合结构域包含抗体片段、单链Fv抗体片段(scFv)、β链可变结构域(Vβ)、或TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。
30.根据权利要求28或29所述的免疫细胞，其中所述抑制受体的所述胞外配体结合结构域包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。
31.根据权利要求30所述的免疫细胞，其中所述VH区和所述VL区包含选自由SEQ IDNO:87-102组成的群组的CDR。
32.根据权利要求29或30所述的免疫细胞，其中所述VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR：ASGYTFTSYHIH(SEQ ID NO:95)、WIYPGNVNTEYNEKFKGK(SEQ ID NO:98)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)，且所述VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR：RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFSGVP[D/A]R(SEQ ID NO:90)或(SEQ ID NO:91)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)。
33.根据权利要求29或30所述的免疫细胞，其中所述VH区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR：SGYTFTSYHMH(SEQ ID NO:97)、WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:100)和EGTYYAMDY(SEQ ID NO:102)；且所述VL区包含一个或多个选自由以下组成的群组的CDR：RSSQSIVHSNGNTYLD(SEQ ID NO:89)、KVSNRFSGVP[D/A]R(SEQ ID NO:90)或(SEQ ID NO:91)和MQGSHVPRT(SEQ ID NO:94)。
34.根据权利要求29或30所述的免疫细胞，其中所述VH区包含以下CDR序列：SYHIH(SEQID NO:566)、WIYPGNVNTEYNEKFKG(SEQ ID NO:567)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)；且所述VL区包含以下CDR序列：RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFS(SEQ ID NO:565)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)。
35.根据权利要求29至32中任一项所述的免疫细胞，其中所述scFv包含与选自由SEQID NO:63-74、207、209和211组成的群组的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致性或与其一致的序列。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的免疫细胞，其中所述抑制受体包含LILRB1胞内结构域或其功能变体。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的免疫细胞，其中所述抑制受体包含LILRB1铰链和跨膜结构域，或其功能变体。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的免疫细胞，其中所述抑制受体包含与YGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH(SEQ ID NO:254)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％一致性或与其一致的序列。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞被修饰以灭活、或降低或消除编码内源性I类MHC多肽的等位基因的内源性基因的表达或功能。
40.根据权利要求39所述的免疫细胞，其中编码所述I类MHC多肽的所述基因为HLA-A*02。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞被修饰以降低或消除B2M基因产物的表达。
42.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至41中任一项所述的免疫细胞。
43.根据权利要求42所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
44.根据权利要求42或43所述的药物组合物，其用作治疗癌症中的药物。
45.一种多核苷酸系统，其包含一种或多种包含编码以下的多核苷酸序列的多核苷酸：
a.活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域；和
b.抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。
46.一种载体，其包含根据权利要求45所述的多核苷酸系统。
47.一种治疗鉴定为在HER2阳性癌症中的编码非靶抗原的等位基因处具有或疑似具有杂合性丢失的个体的HER2+癌症的方法，其包含向所述个体施用根据权利要求1至41中任一项所述的免疫细胞。
48.一种制备免疫细胞疗法的方法，其包含用根据权利要求45所述的多核苷酸系统或根据权利要求46所述的载体转化免疫细胞。
49.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至41中任一项所述的免疫细胞或根据权利要求42至44中任一项所述的药物组合物。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，以进一步包含使用说明书。
51.一种选择性地杀伤在HER2阳性癌症中的编码非靶抗原的等位基因处具有杂合性丢失的HER2阳性肿瘤细胞的方法，其包含使所述HER2阳性肿瘤细胞与根据权利要求1至41中任一项所述的免疫细胞接触。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述肿瘤细胞是在组织中。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述肿瘤细胞是在混合培养物中。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述非靶抗原选自由以下组成的群组：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-B*07及HLA-C*07。
55.一种免疫细胞，其包含：
(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述活化剂受体的所述胞外配体结合结构域包含(i)VH区，其包含以下的CDR序列：DTYIH(SEQ ID NO:313)、RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:314)和WGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:315)；和(ii)VL区，其包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLYS(SEQ ID NO:311)、QQHYTTPPT(SEQ ID NO:312)和DTYIH(SEQ ID NO:313)区以及轻链可变(VL)区.；和
(b)抑制受体，其包含对由于所述癌细胞杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述抑制受体的所述胞外配体结合结构域包含(i)重链可变(VH)区，其包含以下的CDR序列：SYHIH(SEQ ID NO:566)、WIYPGNVNTEYNEKFKG(SEQ ID NO:567)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)；
和(ii)轻链可变(VL)区，其由RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFS(SEQ IDNO:565)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)构成。
56.一种免疫细胞，其包含：
(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述活化剂受体的所述胞外配体结合结构域为包含SEQID NO:51的序列的scFv；和
(b)抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述抑制受体的所述胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:209的序列的scFv。
57.一种治疗鉴定为在编码HLA-A*02的等位基因处具有或疑似具有杂合性丢失的个体的HER2+癌症的方法，其包含向所述个体施用包含以下的免疫细胞：
(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述活化剂受体的所述胞外配体结合结构域包含(i)VH区，其包含以下的CDR序列：DTYIH(SEQ ID NO:313)、RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:314)和WGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:315)；和(ii)VL区，其包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLYS(SEQ ID NO:311)、QQHYTTPPT(SEQ ID NO:312)和DTYIH(SEQ ID NO:313)区以及轻链可变(VL)区.；和
(b)抑制受体，其包含对由于所述癌细胞杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述抑制受体的所述胞外配体结合结构域包含(i)重链可变(VH)区，其包含以下的CDR序列：SYHIH(SEQ ID NO:566)、WIYPGNVNTEYNEKFKG(SEQ ID NO:567)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)；
和(ii)轻链可变(VL)区，其由RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFS(SEQ IDNO:565)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)构成。
58.一种治疗鉴定为在编码HLA-A*02的等位基因处具有或疑似具有杂合性丢失的个体的HER2+癌症的方法，其包含向所述个体施用包含以下的免疫细胞：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述活化剂受体的所述胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:51的序列的scFv；和(b)抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述抑制受体的所述胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:209的序列的scFv。
59.一种选择性杀伤在编码HLA-A*02的等位基因处具有杂合性丢失的HER2阳性肿瘤细胞的方法，其包含使所述HER2阳性肿瘤细胞与包含以下的免疫细胞接触：
(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述活化剂受体的所述胞外配体结合结构域包含(i)VH区，其包含以下的CDR序列：DTYIH(SEQ ID NO:313)、RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:314)和WGGDGFYAMDV(SEQ ID NO:315)；和(ii)VL区，其包含以下的CDR序列：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:30)、SASFLYS(SEQ ID NO:311)、QQHYTTPPT(SEQ ID NO:312)和DTYIH(SEQ ID NO:313)区以及轻链可变(VL)区.；和
(b)抑制受体，其包含对由于所述癌细胞杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述抑制受体的所述胞外配体结合结构域包含(i)重链可变(VH)区，其包含以下的CDR序列：SYHIH(SEQ ID NO:566)、WIYPGNVNTEYNEKFKG(SEQ ID NO:567)和EEITYAMDY(SEQ ID NO:101)；
和(ii)轻链可变(VL)区，其由RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:87)、KVSNRFS(SEQ IDNO:565)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO:92)构成。
60.一种选择性杀伤在编码HLA-A*02的等位基因处具有杂合性丢失的HER2阳性肿瘤细胞的方法，其包含使所述HER2阳性肿瘤细胞与包含以下的免疫细胞接触：(a)活化剂受体，其包含对erb-b2受体酪氨酸激酶2(HER2)抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述活化剂受体的所述胞外配体结合结构域为包含SEQ ID NO:51的序列的scFv；和(b)抑制受体，其包含对由于所述癌细胞中的杂合性丢失而所述癌细胞不表达的非靶抗原具有特异性的胞外配体结合结构域，其中所述抑制受体的所述胞外配体结合结构域为包含SEQ IDNO:209的序列的scFv。
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