CN111465693A

CN111465693A - 用于制备抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的通用平台

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Publication number: CN111465693A
Application number: CN201880076601.7A
Authority: CN
Inventors: G·格罗斯; W·吉布森; D·达哈里; M·贝曼
Original assignee: Impat Biology Co ltd; Gavish-Galilee Bio Applications Ltd
Current assignee: Impat Biology Co ltd; Gavish-Galilee Bio Applications Ltd
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-07-28
Also published as: AU2018338975A1; BR112020006106A2; CA3077174A1; JP2020535814A; PT3688155T; ES2941966T3; IL273598A; FI3688155T3; US11660315B2; US20200261499A1; US20210244759A1; KR20200071740A; EP3688155B1; MX2020003526A; HUE061502T2; WO2019068007A1; DK3688155T3; PL3688155T3; JP2023104959A; US20240139238A1

Abstract

本发明提供了鉴定用于制备能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)或保护性嵌合抗原受体(pCAR)的靶标的方法。还提供了iCAR靶标的列表，以及包括核酸分子的载体和转导的效应免疫细胞，并且进一步提供了包括给药转导的效应免疫细胞的癌症治疗方法。

Description

用于制备抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的通用平台

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年9月28日提交的美国临时申请第62/564,454号以及于2018年3月28日提交的美国临时申请第62/649,429号的优先权，所述两个申请均通过引用并入本文。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且在此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2018年9月27日，命名为120575-5003_ST25.txt。

ASCII表

本申请要求其优先权的临时专利申请含有长的表格部分。该表的副本已在光盘上以ASCII格式提交给美国专利商标局，优先权为2018年3月28日提交的美国临时申请第62/649,429号，并且其通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中使用。所述ASCII表创建于2018年3月28日，为如下：120575-5003-PR allCandExt1167Genes_5003_PR.txt，272,719,870字节。

技术领域

本发明涉及通过过继细胞转移的癌症免疫疗法领域，采用识别在肿瘤细胞表面表达的抗原的活化嵌合抗原受体(aCAR)，针对正常细胞表达但肿瘤不表达(由于杂合性丧失(LOH))的相同或其他细胞表面抗原的等位基因变体的抑制性CAR(iCAR)和保护性CAR(pCAR)。

背景技术

仅由肿瘤细胞表达而不由健康组织表达的可靶向抗原的鉴定无疑是当今癌症免疫疗法的主要挑战。T细胞能够根除肿瘤细胞的临床证据来自众多研究，这些研究评估了利用T细胞治疗癌症的高度多样化的方法(Rosenberg和Restifo，2015)。这些方法采用通过供体淋巴细胞输注的骨髓移植，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继转移、用通过CAR(Gross和Eshhar，2016a)或通过T细胞受体(TCR)基因重定向预选抗原的T细胞进行治疗，使用免疫检查点抑制剂或主动接种。其中，使用基因工程T细胞和不同的主动免疫策略需要在候选抗原上预先存在信息，这些信息可能会产生持久的临床反应，但不良反应最小。然而，正如S.Rosenberg最近的一篇综述的标题所述，“寻找合适的靶标是癌症基因治疗的主要障碍(Finding suitable targets is the major obstacle to cancer gene therapy)”(Rosenberg，2014)。

使用嵌合抗原受体(或CAR)以不依赖于MHC的方式使T细胞(或免疫系统的其他杀伤细胞，诸如自然杀伤(NK)细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞)基因重定向为针对所选抗原的构思最初是由Gross和Eshhar在20世纪80年代后期提出的(Gross等人，1989)。它们是由编码通过柔性铰链和跨膜经典(canonic)基序融合到信号传导成分的细胞外单链抗体可变片段(scFv)的嵌合基因合成产生的，信号传导成分包括能够T细胞活化的CD3-ζ或FcRy链的免疫受体酪氨酸类活化基序。目前，CAR正在数十项临床试验中进行检查，且迄今已显示出对B细胞恶性肿瘤的异常高的功效(Dotti等人，2014；Gill和June，2015；Gross和Eshhar，2016a)。CAR-T细胞疗法的安全性在很大程度上取决于其区分肿瘤和健康组织的能力。在临床和临床前研究中已报道的主要风险和不利的自身免疫反应的直接原因是由目标抗原的肿瘤外表达导致的偏离肿瘤(off-tumor)中靶(on-target)毒性(在我们最近的综述中有详细论述(Gross和Eshhar，2016b)和(Klebanoff等人，2016))。关于这种风险，目前临床或临床前对CAR疗法进行测试的共享的非突变细胞表面抗原，根据其组织分布和表达方式通常可分为许多类别：

-严格的肿瘤特异性抗原。可能该组中唯一已经进行临床实验的成员是表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)，该变体在胶质母细胞瘤中经常过表达，且在非小细胞肺癌和前列腺癌、乳腺癌、头颈癌和卵巢癌中也有发现，但没有在正常组织上发现。

-在肿瘤和非重要健康组织上表达的表面抗原。该组中潜在的CAR抗原是分化相关分子，主要限于B细胞谱系。在它们(以及许多临床试验中的目标抗原)中突出的是CD19，这是一种在B细胞分化中很早就获得的泛B细胞(pan-B cell)标记物，且参与通过B细胞受体(BCR)的信号转导。膜前列腺抗原构成该类别中的另一类抗原。

-典型地由非恶性肿瘤促进细胞表达的抗原。一种这样的抗原是成纤维细胞活化蛋白(FAP)，这是一种细胞表面丝氨酸蛋白酶，在各种原发性和转移性癌症中，几乎总是由肿瘤相关的成纤维细胞表达。另一种抗原是血管内皮生长因子(VEGF)，在肿瘤血管生成过程中高度表达，且通常在许多重要器官的血管和淋巴内皮细胞上表达。

-与重要健康组织共享的肿瘤相关抗原(TAA)。

目前在临床前和临床研究中评估的大多数其他TAA都被肿瘤过度表达，但也通常在基本的正常组织中以较低的水平存在。

旨在解决CAR T细胞疗法中自身免疫问题的广泛策略可分为旨在在损伤已经明显的情况下消除或抑制转移的T细胞的方法(反应性措施)，和旨在起初就防止潜在损伤的方法(前瞻性措施)(Gross和Eshhar，2016a)。反应性方法通常使用自杀基因，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)和iC9，这是一种融合的多肽，包括截短的人胱天蛋白酶(caspase)9和突变的FK506结合蛋白。其他方法利用抗体来选择性去除遭受严重破坏的工程化细胞，或如最近证明的那样，控制CAR识别部分与细胞内信号传导结构域连接的异源二聚化小分子剂(Wu等人，2015)。尽管设计了一些前瞻性措施来限制CAR T细胞的体内持久性或功能(例如，使用mRNA电穿孔进行基因递送)，但其他手段则直接解决了增加治疗性CAR的抗原选择性的关键挑战，从而避免损伤非肿瘤组织。其中两个引起了特别的关注，因为它们可以潜在地扩大可被CAR T细胞安全靶向的肿瘤抗原的范围：

-组合(或“分开的”)抗原识别。尽管真正的肿瘤特异性表面抗原很少，但两种不同抗原的组合却可以定义新的肿瘤特异性标记，而两种不同的抗原不一定归类为由给定肿瘤共表达的肿瘤相关抗原。将CAR T细胞的活性限制于此类抗原对提供了关键的安全性量规，并因此扩展了肿瘤特异性靶标的范围，且可能具有重要的治疗价值。已经设计了第二代和第三代CAR，通过在CAR内域拴接两个或更多个信号传导部分，以在治疗性T细胞接合单个抗原时为其提供活化和共刺激信号。但是，如果活化和共刺激在分别特异于不同抗原的两个CAR之间在同一T细胞中是分开的，那么完全的反应将需要只能在存在两种抗原的情况下才能实现的两个互补信号的共同作用。在一些临床前研究中已经证明了这一原理(Kloss等人，2013；Lantitis等人，2013；Wilkie等人，2012；WO 2016/126608)。

尽管无疑令人着迷，但该方法仍然需要对活化和共刺激信号二者的幅度进行精确确定，以达到最佳平衡，从而仅允许有效的中靶的肿瘤上的T细胞反应性。是否可以在临床环境中常规达到这种平衡仍存在疑问。

最近发布了一种全新的方法，用于限定T细胞仅对表达两种抗原的独特结合的目标细胞反应(Roybal等人，2016a)。它的核心元件起着“基因开关”的作用，它利用了包含Notch在内的几种细胞表面受体的作用方式。在这样的受体与其配体结合后，它经历双重切割，导致其细胞内结构域的释放，该胞内结构域易位至细胞核，在细胞核中它起转录因子的作用。该原理的实施需要将两个基因共同导入效应T细胞。第一个组成性表达并且编码配备有针对第一抗原的识别部分的这种嵌合可切割受体。在目标细胞表面上与该抗原的接合将开启编码针对第二抗原的常规CAR的第二基因的表达。仅当目标细胞也共表达该第二种抗原时，它才会被杀死。

抑制性CAR。当CAR重定向的杀伤细胞的目标抗原被正常组织共享时，存在偏离肿瘤的反应性。如果该正常组织表达了肿瘤上不存在的另一种表面抗原，则在基因修饰的细胞中共表达靶向该非共享抗原的附加CAR可以防止正常组织导致的T细胞活化，该附加CAR具有抑制性信号传导部分。

iCAR具有源自抑制性受体的信号传导结构域，而不是活化结构域(诸如FcRy或CD3-ζ)，该抑制性受体可以拮抗T细胞活化，诸如CTLA-4、PD-1或NK抑制性受体。如果与肿瘤共享候选aCAR抗原的正常组织表达了与肿瘤不共享的另一种表面抗原，则由靶向该非共享抗原的同一T细胞表达的iCAR可以保护正常组织(图1)。

与每个都表达由体细胞重排的基因区段编码的独特的双链TCR的T细胞不同，NK细胞不表达抗原特异性受体。相反，NK细胞表达一系列种系编码的活化和抑制性受体，这些受体分别识别被感染且健康细胞的细胞表面上的多个活化和抑制性配体。已经描述了基于NK抑制性受体(诸如KIR3DL1)的iCAR的保护能力(US 9,745,368)。KIR3DL1和其他NK抑制性受体通过以快速且全面的方式消除免疫突触而发挥作用。有令人信服的证据表明，单个NK细胞可以保留表达抑制性和活化配体两者的抗性细胞，而杀死仅表达活化性配体的它同时接合的易感细胞(Abeyweera等人，2011；Eriksson等人，1999；Treanor等人，2006；Vyas等人，2001)。这种精妙的能力是由在各个免疫突触中形成的信号转导分子的不同空间结构所决定的，从而影响细胞溶解颗粒的胞吐作用(参见(Huse等人，2013)以作参考)。最近，Fedorov等人(Fedorov等人，2013a；WO 2015/142314)成功地将PD-1和CTLA-4的细胞内结构域用于该目的。与NK抑制性受体不同，这些iCAR的调节作用影响了整个细胞。然而，这些作用是暂时的，在随后与仅表达aCAR抗原的目标细胞相遇时，可使T细胞完全活化。

由iCAR和aCAR靶向的抗原的组织分布决定了赋予最大的安全性而不损害临床功效所需的iCAR的最佳作用方式。例如，如果肿瘤和要保护的正常组织(一种或多种)的解剖部位不相交，则短暂抑制(CTLA-4或PD-1样)可能就足够了。但是，如果这些位点确实重叠，则只有突触限制的抑制作用(例如NK作用方式)才将防止治疗性细胞的持续麻痹并允许其有效的杀肿瘤活性。使用iCAR降低中靶偏离肿瘤(on-target off-tumor)反应性的方法受限于非常缺乏在肿瘤细胞中下调的但存在于正常组织上的抗原。

下一代测序(NGS)允许确定给定肿瘤活检中所有蛋白编码基因的DNA序列(整个基因组的～1％)，并允许将癌症“外显子组”与同一患者的健康组织的“外显子组”(通常来自白细胞)进行比较。外显子组测序可以在活检取出后的几天内完成，而且成本相对较低。同时，转录组分析(RNA-seq)可提供有关由同一细胞样本实际表达的基因的互补信息。

越来越清楚的是，每个单独的肿瘤的突变“景观(landscape)”都是独特的(Lawrence等人，2013；Vogelstein等人，2013)。作为非同义突变的结果，肿瘤细胞可能在一个或多个他或她的HLA产物上向患者的免疫系统呈递一组私有的新肽。的确，近年来，在鉴定肿瘤特异性新表位方面付出了巨大的努力，这些新表位可以被患者自己的CD8或CD4T细胞库识别并用作免疫疗法的靶标(参见(Blankenstein等人，2015；Van Buuren等人，2014；Heemskerk等人，2013；Overwijk等人，2013；Schumacher和Schreiber，2015)以供参考)。然而，累积的结果表明，基于新抗原的T细胞免疫疗法在显示较高突变负荷的癌症(诸如黑色素瘤和肺癌)中更可能有效，但在大多数突变较少的癌症中往往无法显示益处(Savage，2014；Schumacher和Schreiber，2015)。此外，相当大的肿瘤内异质性(Burrell等人，2013)需要同时共同靶向几种抗原，以避免出现突变丧失变体，鉴于有用的免疫原性新肽的缺乏，这一任务变得越来越苛刻。

总而言之，鉴定用于通过基因重定向的杀伤细胞的过继转移的癌症免疫疗法的合适靶标的迫切需求仍未得到满足。

发明内容

在一些方面，本发明提供了鉴定用于制备能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)或保护性嵌合抗原受体(pCAR)的靶标的方法，其中该靶标通过包括以下的方法鉴定：

(i)鉴定编码包括细胞外多态性表位的蛋白的具有至少两个表达等位基因的基因；

(ii)确定相对于细胞外多态性表位参考序列，至少一个表达等位基因在细胞外多态性表位序列中表现出氨基酸序列变化；

(iii)确定该基因位于经历肿瘤类型中的杂合性丧失(LOH)的染色体区域中；以及

(iv)确定该基因在发现经历LOH的该染色体区域的该肿瘤类型的起源组织中表达。

在一些实施方式中，LOH位置选自由替换、缺失和插入组成的组。在一些实施方式中，LOH位置是SNP。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA基因。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-K、HLA-L、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA_DQ或HLA-DR基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-A基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-B基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-C基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-G基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-E基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-F基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-K基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-L基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-DM基因。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因是HLA-DO基因。在一些实施方式中，细胞外多态性表位是HLA-DP基因。在一些实施方式中，细胞外多态性表位是HLA_DQ基因。在一些实施方式中，细胞外多态性表位是HLA-DR基因。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体1上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体2上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体3上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体4上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体5上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体6上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体7上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体8上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体9上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体10上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体11上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体12上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体13上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体14上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体15上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体16上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体17上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体18上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体19上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体20上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体21上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体22上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体X上。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方式中，肿瘤选自由以下组成的组：乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、皮肤肿瘤、胰腺肿瘤、结直肠肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、脑肿瘤、淋巴瘤、白血病、肺肿瘤和胶质瘤。

在一些实施方式中，肿瘤选自由以下组成的组：肾上腺肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、DLBC、乳腺肿瘤、肉瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、膀胱肿瘤和肝肿瘤。在一些实施方式中，肾上腺肿瘤是肾上腺皮质癌。在一些实施方式中，肾肿瘤是嫌色性肾细胞癌。在一些实施方式中，黑素瘤是葡萄膜黑色素瘤。

本发明还提供了安全的效应细胞。在一些实施方式中，本发明提供了表达(i)根据权利要求1至46中任一项的iCAR或pCAR和(ii)活化嵌合抗原受体(aCAR)的安全效应免疫细胞。

在一些实施方式中，根据权利要求47的安全效应免疫细胞，其中aCAR针对或特异性结合肿瘤相关抗原或非多态性细胞表面表位。在一些实施方式中，由于iCAR或pCAR的保护作用，aCAR可以针对癌细胞上表达的任何表面蛋白。

在一些实施方式中，aCAR针对或特异性结合肿瘤相关蛋白，如表1所列的CAR靶标，在也表达iCAR的肿瘤组织中表达的任何细胞表面蛋白。

在一些实施方式中，非多态性细胞表面表位选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD10、CD7、CD49f、CD56、CD74、CAIX Igκ、ROR1、ROR2、CD30、LewisY、CD33、CD34、CD38、CD123、CD28、CD44v6、CD44、CD41、CD133、CD138、NKG2D-L、CD139、BCMA、GD2、GD3、hTERT、FBP、EGP-2、EGP-40、FR-α、L1-CAM、ErbB2,3,4、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、间皮素、c-MET、PSMA、CEA、kRas、MAGE-A1、MUC1、MUC16、PDL1、PSCA、EpCAM、FSHR、AFP、AXL、CD80、CD89、CDH17、CLD18、GPC3、TEM8、TGFB1、NY-ESO-1、WT-1和EGFR。

51.权利要求47至50中任一项的安全效应免疫细胞，其中，安全效应免疫细胞是自体或通用(同种异体)效应细胞。

在一些实施方式中，安全效应免疫细胞选自由T细胞、自然杀伤细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞组成的组。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，iCAR或pCAR的表达水平大于或等于aCAR的表达水平。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，iCAR或pCAR由第一载体表达，而aCAR由第二载体表达。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，iCAR或pCAR和aCAR均由同一载体表达。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，编码aCAR的核苷酸序列在编码iCAR或pCAR的核苷酸序列的下游。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，核苷酸序列在编码aCAR的核苷酸序列与编码iCAR或pCAR的核苷酸序列之间包括病毒自切割2A肽。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，病毒自切割2A肽选自由以下组成的组：来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus(TaV))的T2A、来自口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus(FMDV))的F2A、来自马鼻炎病毒A型(Equine rhinitis A virus(ERAV))的E2A以及来自猪捷申病毒1(Porcine teschovirus-1(PTV1))的P2A。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，编码aCAR的核苷酸序列通过柔性接头连接至iCAR或pCAR。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，aCAR包括活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)同源。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)(诸如KIR2DS和KIR3DS)同源。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与衔接分子(诸如DAP12)同源或者是衔接分子(诸如DAP12)。

在安全效应免疫细胞的一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件同源或者是CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件。

本发明还提供了用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的方法，包括向该患者给药如本文所述的表达iCAR的安全效应免疫细胞。

在一些实施方式中，本发明还提供了用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的方法，包括向该患者给药如本文所述的安全效应免疫细胞。

在一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包括编码能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的核苷酸序列，其中iCAR包括与多态性细胞表面表位的单一等位基因变体特异性结合的细胞外结构域以及包括抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域，该多态性细胞表面表位的单一等位基因变体在哺乳动物肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)而不存在，但至少在相关的哺乳动物正常组织的所有细胞上和在重要器官上存在。在一些实施方式中，iCAR或pCAR靶标在所有正常表达aCAR靶标的细胞上表达。在一些实施方式中，iCAR或pCAR靶标在表达aCAR的重要器官细胞上表达。

在另一方面，本发明提供了一种载体，其包括如本文所限定的本发明的核酸分子，以及与该核酸分子可操作地连接的至少一个控制元件，诸如启动子。

在另一方面，本发明提供了制备根据本文所限定的本发明的能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的方法，该方法包括：(i)从至少一个已知变体数据库中检索蛋白编码基因的人类基因组变体列表；(ii)通过以下步骤过滤在(i)中检索到的变体列表：(a)选择与对应的参考等位基因相比，导致相应基因编码的蛋白中的氨基酸序列发生变异的变体，(b)选择其中氨基酸序列变异是在编码的蛋白的细胞外结构域中的基因的变体，(c)选择至少在一种肿瘤中经历杂合性丧失(LOH)的基因的变体，和(d)选择至少在根据(c)的其经历LOH的至少一种肿瘤的起源组织中表达的基因的变体，从而获得在由相应基因编码的蛋白中的细胞外结构域中具有氨基酸序列变异，在至少一种肿瘤中由于LOH而丧失，并且至少在至少一种肿瘤的起源组织中表达的变体的列表；(iii)限定包括来自(ii)中获得的列表中的至少一个单一变体的序列区，亚克隆并表达包括至少一个单一变体的序列区以及包括对应参考等位基因的序列区，从而获得相应的表位肽；(iv)选择iCAR结合结构域，其与(iii)中获得的由克隆的序列区编码的表位肽或者与由对应的参考等位基因编码的表位肽特异性结合；以及(vii)制备如本文所限定的iCAR，每个iCAR包括如(iv)中限定的iCAR结合结构域。

在又一方面，本发明提供了用于制备安全效应免疫细胞的方法，包括：(i)用如本文限定的包括编码iCAR的核苷酸序列的核酸分子转染针对肿瘤相关抗原的TCR工程化效应免疫细胞，或用本文限定的载体转导该细胞；或者(ii)用如本文限定的包括编码iCAR的核苷酸序列的核酸分子和如本文限定的包括编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子转染天然效应免疫细胞；或用如本文限定的载体转导效应免疫细胞。

在又另一方面，本发明提供了通过本文所述的本发明的方法获得的安全效应免疫细胞。该安全效应免疫细胞可以是表达外源性T细胞受体(TCR)和iCAR的重定向T细胞，其中外源性TCR针对抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，其中所述表位是肿瘤相关抗原或至少由相关肿瘤和正常组织的细胞共享，并且iCAR如本文所限定；或者该安全效应免疫细胞是重定向的效应免疫细胞，诸如表达如本文限定的iCAR和aCAR的自然杀伤细胞或T细胞。

在另一方面，本发明提供了为患有以LOH为特征的肿瘤的受试者选择个性化生物标志物的方法，该方法包括(i)从受试者获得肿瘤活检；(ii)从受试者获得正常组织的样本，例如外周血单核细胞(PBMC)；以及(iii)鉴定由于LOH而不由肿瘤细胞表达但由正常组织的细胞表达的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，从而鉴定出受试者的个性化生物标志物。

在另一方面，本发明提供了用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，包括向患者给药如本文所限定的效应免疫细胞，其中该iCAR针对编码多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，该单一等位基因变体在肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)而不存在，但至少存在于患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上。

在还另一方面，本发明涉及本文所限定的安全效应免疫细胞，用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者的用途，其中该iCAR针对编码多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，该单一等位基因变体在肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)而不存在，但至少存在于患者的相关哺乳动物正常组织(包含患者的重要器官)的所有细胞上。在一些实施方式中，iCAR或pCAR在所有正常表达aCAR靶标的细胞上表达。在一些实施方式中，iCAR或pCAR在表达aCAR的重要器官细胞中表达。

在又另一方面，本发明涉及用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的方法，包括：(i)鉴定或接收鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织的细胞表达的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的信息，(ii)鉴定或接收鉴定抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的信息，其中所述表位是所述癌症患者中的肿瘤相关抗原或至少由相关肿瘤和正常组织的细胞共享；(iii)选择或接收限定如本文所限定的iCAR的至少一种核酸分子和包括编码如本文限定的aCAR的核苷酸序列的至少一种核酸分子，或如本文限定的至少一种载体，其中iCAR包括特异性结合(i)的细胞表面表位的细胞外结构域，并且aCAR包括特异性结合(ii)的细胞表面表位的细胞外结构域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接收至少一群体的安全重定向效应免疫细胞；以及(v)向所述癌症患者给药(iv)的至少一群体的安全重定向免疫效应细胞。

在类似方面，本发明提供了用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的至少一群体的安全重定向免疫效应细胞，其中该安全重定向免疫细胞由以下步骤得到：(i)鉴定或接收鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织的细胞表达的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的信息，(ii)鉴定或接收鉴定抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的信息，其中所述表位是所述癌症患者中的肿瘤相关抗原或至少由相关肿瘤和正常组织的细胞共享；(iii)选择或接收限定如本文所限定的iCAR的至少一种核酸分子和包括编码如本文限定的aCAR的核苷酸序列的至少一种核酸分子，或如本文限定的至少一种载体，其中iCAR包括特异性结合(i)的细胞表面表位的细胞外结构域，并且aCAR包括特异性结合(ii)的细胞表面表位的细胞外结构域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接收至少一群体的安全重定向效应免疫细胞。

在另一方面，本发明涉及两种或更多种核酸分子的组合，每一种包括编码受控效应免疫细胞活化系统的不同成员的核苷酸序列，所述核酸分子是单个连续核酸分子的一部分或形成单个连续核酸分子，或包括两个或更多个单独的核酸分子，其中受控效应免疫活化系统指导效应免疫细胞杀伤由于杂合性丧失(LOH)而丧失了一个或多个染色体或其部分的肿瘤细胞，并保留(放过)相关正常组织的细胞，且其中(a)第一成员包括活化嵌合抗原受体(aCAR)多肽，该活化嵌合抗原受体(aCAR)多肽包括与抗原的非多态性细胞表面表位或与不同多态性细胞表面表位的单一等位基因变体特异性结合的第一细胞外结构域，并且所述非多态性或多态性细胞表面表位是肿瘤相关抗原或是被相关不正常和正常哺乳动物组织的细胞共享的；(b)第二成员包括调控多肽，该调控多肽包括与不正常哺乳动物组织由于LOH而不表达的但存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体特异性结合的第二细胞外结构域。

附图说明

图1示出了iCAR的构思(摘自(Fedorov等人，2013a)。

图2示出了aCAR/pCAR分子设计和作用方式。不管是否表达aCAR抗原，pCAR与其在正常细胞上的抗原的结合都预期产生快速RIP，并将多肽分解为3个独立的片段。

图3A-C示出了在编码HLA I类基因座的染色体区域中经历LOH的肿瘤样本的百分比。A.HLA-G，B.HLA-A，C.ZNRD1，来自TCGA数据库的肿瘤类型。肾嫌色细胞癌[KICH]、肾上腺皮质癌[ACC]、胰腺癌[PAAD]、肉瘤[SARC]、肾脏肾乳头状细胞癌[KIRP]、食管癌[ESCA]、肺鳞状细胞癌[LUSC]、肾脏肾透明细胞癌[KIRC]、膀胱尿路上皮癌[BLCA]、卵巢浆液性囊腺癌[OV]、胸腺瘤[THYM]、宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌[CESC]、头颈鳞状细胞癌[HNSC]、乳腺浸润癌[BRCA]、胃腺癌[STAD]、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBC]、多形性成胶质细胞瘤[GBM]、结肠腺癌[COAD]、直肠腺癌[READ]、肺腺癌[LUAD]、睾丸生殖细胞肿瘤[TGCT]、间皮瘤[MESO]、胆管癌[CHOL]、子宫癌肉瘤[UCS]、皮肤黑素瘤[SKCM]、子宫内膜癌[UCEC]、脑低级胶质瘤[LGG]、前列腺腺癌[PRAD]、肝脏肝细胞癌[LIHC]、甲状腺癌[THCA]、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤[PCPG]、急性髓性白血病[LAML]、葡萄膜黑色素瘤[UVM]

图4示出了HLA-A相对于基因组中所有其他蛋白编码基因的表达。每个基因的值反映了从GTEX(gtexportal.org)获得的组织中位数的平均RPKM值。

图5示出了实施例5中用于分析跨癌症的HLA蛋白杂合性丧失的提议工作流程。

图6示出了使用ABSOLUTE处理的拷贝数数据的pancan12数据集中的LOH频率。线代表频率的95％二项式置信区间。

图7示出了在HLA-A中观察到的LOH的类型。在588例HLA-A LOH中，没有一个涉及HLA-A基因内的断点。

图8示出了涵盖HLA-A的缺失的长度分布(以碱基对计)。这些缺失的很大一部分大于染色体6p的长度。

图9示出了相对的具有HLA-A的LOH的患者分数与阈值为-0.1的绝对(ABSOLUTE)拷贝数数据之间的相关性。

图10A-10C示出了跨32种癌症的HLA-A、HLA-B和HLA-C的LOH率的比较，揭示了LOH的几乎相同的模式。

图11示出了针对染色体6p缺失分选的AML拷贝数概况的IGV屏幕截图。蓝色表示缺失，红色表示扩增。没有HLA-A的缺失。

图12示出了对于所有SNP经历LOH的葡萄膜黑色素瘤肿瘤的比例。

图13提供了TCGA研究缩写(也可在https://gdc.cancer.gov/resources-tcga- users/tcga-code-tables/tcga-study-abbreviations获得)。

图14描绘了在染色体17上编码的，与肿瘤抑制蛋白TP53相邻的染色体区域的丧失。被鉴定为iCAR靶标的染色体17上编码的基因可用于治疗患者RC001。

图15提供了iCAR和aCAR构建体的示意图。

图16提供了关于IL-2分泌的数据，通过ELISA测量。iCAR在与表达iCAR靶标的目标细胞相互作用后特异性抑制IL-2分泌。

图17示出了iCAR在与表达iCAR靶标的目标细胞相互作用后特异性抑制IL-2分泌，通过CBA测量。

图18示出了由表达CD19的目标细胞的CD19 aCAR Jurkat-NFAT的特异性活化。

图19示出了CD19 aCAR/HLA-A2 iCAR Jurkat-NFAT中NFAT活化的特异性抑制。

图20示出了在不同的E/T比下对NFAT活化的特异性抑制。

图21提供了图15的iCAR和aCAR构建体的序列。

图22提供了1167个潜在的iCAR、pCAR和/或aCAR靶标。

图23提供了来自图22中列出的1167个基因的3288个SNP。

具体实施方式

I.介绍

关于A.G.Knudson在1971年提出的肿瘤抑制基因(TSG)的革命性构思(KnudsonJr.,1971)，Devilee、Cleton-Jansen和Cornelisse在其题目为“自Knudson以来”(Devilee等人，2001)的论文的开篇中提到：“许多出版物都记录了多种肿瘤中许多不同染色体上的LOH，暗示了多个TSG的存在。Knudson的二次突变假说预测，这些LOH事件是使TSG的两个等位基因失活中的第二步”。Lengauer、Kinzler和Vogelstein在其关于人类癌症的遗传不稳定性的开创性综述(Lengauer等人，1998)中写道：“核型研究表明，大多数癌症丧失或增加了染色体，且分子研究表明，核型数据实际上低估了这种变化的真实程度。杂合性的丧失，即肿瘤中母本或父本等位基因的丧失，是普遍存在的，且通常伴随着相反等位基因的获得。例如，肿瘤可能会失去母本染色体8，而复制父本染色体8，使细胞具有正常的染色体8核型，但具有不正常的染色体8“等位基因型”。结肠、乳腺、胰腺或前列腺的“平均”癌症可能会丧失25％的其等位基因，而肿瘤丧失了多于一半的其等位基因并不罕见。”。此后，在许多报告中，这些观察结果得到了加强，并扩展到几乎所有人类癌症，包含几乎所有的癌(参见(McGranahan等人，2012)以供参考)。现在已经明确地确定几乎所有的单个肿瘤都表现出全染色体、整个染色体臂或大小不同的亚染色体区域的多种丧失。正在快速开发新算法(例如，Sathirapongsasuti等人，2011)，用于基于外显子组序列数据确定任何给定细胞样本中的LOH概况。尽管目前统计偏差可能会质疑某些解释的有效性(Teo等人，2012)，但这种算法可能会改善和替代大多数在NGS之前的时代为此目的而使用的用于建立LOH概况的其他方法。

可以在同一组织的癌前细胞中检测到早期的LOH事件，而在周围正常细胞中则无法检测到(Barrett等人，1999)。LOH是不可逆的，且事件只能累积，因此肿瘤异质性反映了整个肿瘤进展过程中丧失的累积。尽管可能发展出后期LOH事件不同的肿瘤亚克隆，但在给定患者中存在由癌前细胞、推定的肿瘤干细胞和所有肿瘤亚克隆共享的最小LOH特征预期将成为规则。从这种“树干”LOH模式产生的分支仍然会产生有限的部分重叠的特征集，其一起覆盖了同一患者的所有肿瘤细胞。

总体LOH事件的必然结果是伴随在缺失的染色体物质上的所有其他基因的丧失，且这些基因天然地包含许多编码跨膜蛋白的基因。关于它们的身份，已经编制了3,702种不同的人类细胞表面蛋白(“表面蛋白组”)的目录(Da Cunha等人，2009)。42％的表面蛋白组(surfaceome)基因的表达显示宽的组织分布，同时85个基因由检查的所有组织表达，这是管家基因的标志。这些基因是候选基因，其不同的多态性变体可以用作本发明的iCAR和aCAR的靶标。

最近，Bausch-Fluck等人(Bausch-Fluck等人，2015)应用了他们的化学蛋白质组学细胞表面捕获技术来鉴定41种人类细胞类型中1492个细胞表面糖蛋白的组合集合。预期表面蛋白组的很大一部分将由任何给定肿瘤表达，每种肿瘤都表现出独特的概况。发现与所有其他基因相比，编码细胞表面蛋白的基因在其编码区中稍微更富集单核苷酸多态性(SNP)(Da Cunha等人，2009)。与改变肽序列(非同义)的SNP相比，更罕见的多态性框内插入和缺失进一步促进了变体的数量，并可能对多肽产物产生更稳健的结构作用。典型的基因组总共含有10,000至12,000个具有非同义变体的位点和190-210个框内插入/缺失(Abecasis等人，2010；Auton等人，2015)。这些变体在基因组中不是均匀分布的，因为高度多态的基因诸如HLA基因座(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html)或某些G蛋白偶联受体(GPCR)基因(Lee等人，2003；Rana等人，2001)创建了独特的变体“热点”。LOH相关热点的另一层源于某些染色体或不同癌症中染色体臂的频繁丧失(例如，小细胞肺癌中的3p和17p(Lindblad-Toh等人，2000)，结直肠癌中的17p和18q(Vogelstein等人，1989)，乳腺癌中的17q和19(Li等人，2014；Wang等人，2004)，黑素瘤中的9p(Stark和Hayward，2007)，成胶质细胞瘤中的10q(Ohgaki等人，2004年)以及更多)。

表面蛋白中的等位基因变异的很大一部分会影响相应基因产物的细胞外部分，从而可能产生独特的等位基因限制性表位，其原理上可以通过高度特异性mAb识别并与其他变体区分开。已有充分的文献证明，可以分离出区分同一蛋白的仅在单个氨基酸上有所不同的两个变体的mAb(例如，参见以出色的特异性识别Ras癌基因的点突变产物的mAb的早期实例(Carney等人，1986))。有趣的是，已证明对蛋白表位中单个氨基酸互换具有特异性的两个mAb可以使用结构上与其重链和轻链V基因库不同的可变区(Stark和Caton，1991)。最近，Skora等人(Skora等人，2015)报告了肽特异性scFv的分离，其可区分源自突变的KRAS和EGFR蛋白的HLA-1结合的新肽及其野生型对应物，两种情况下均在一个氨基酸中有所不同。

综上所述，肿瘤细胞出现了独特的抗原性特征，可以使它们与个体患者全身的所有其他细胞明确区分。它包括由等位基因变体编码的所有跨膜蛋白，这些等位基因变体由于LOH而在肿瘤细胞表面不存在，但存在于起源癌组织或表达这些基因的其他组织的正常细胞中。自然地，除真正的管家基因外，每个受LOH影响的基因都将以独特的组织分布模式来表征。这些基因中的大多数预期不会直接参与肿瘤发生或转化表型的维持，且从这个意义上讲，它们的丧失具有“乘客”性质。

上面提出的基本原理认为，对于几乎所有肿瘤，LOH不可避免地会形成独特的分子特性，该特性的特点是不存在在正常细胞上存在的许多多态性表面结构。将个体肿瘤的这种假定特征转变为抗原表位的可靶向集合需要一种实用的免疫学策略，用于将对特定“缺失”的识别转化为能够触发目标细胞杀伤的活化提示。重要的是，纳入安全装置以确保严格避免中靶偏离肿瘤反应性将在该策略的未来临床实施中非常有利。

本发明通过在每个治疗性杀伤细胞中共表达单一对基因来解决这一挑战。该对中的一个伴侣编码活化的CAR(aCAR)，并且另一个编码保护性CAR(pCAR)或抑制性CAR(iCAR)。

II.选择定义

本文所用的术语“核酸分子”是指DNA或RNA分子。

术语“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列(诸如基因、cDNA或mRNA)的固有特性，以用作在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性的其他聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生该蛋白，则该基因编码该蛋白。两条编码链，与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核苷酸序列，以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包含彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可能包含内含子。

术语“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部的或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。

术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入的或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。

本文所用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的顺式作用元件用于表达；其他用于表达的元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包含掺入了重组多核苷酸的本领域中所有已知的载体，诸如粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

本文所用的术语“基因组变体”是指与相同基因组位置处的参考或共有序列相比，测序样本中基因组水平上至少一个核苷酸的变化。

本文所用的关于变体的术语“对应的参考等位基因”是指与变体在相同基因组位置的参考或共有序列或核苷酸。

本文所用的与蛋白有关的术语“细胞外结构域”是指细胞膜外部的蛋白的区域。

本文所用的术语“杂合性丧失”或“LOH”是指在体细胞中两个染色体的一个拷贝中，染色体物质诸如完整染色体或其一部分的丧失。

本文所用的关于变体或参考等位基因的术语“序列区”是指从变体位置的上游开始并在下游终止的序列，其可以被翻译成可以被抗体识别的“表位肽”。

本文所用的术语“CAR”是指与来自例如T细胞或NK细胞的细胞免疫功能受体或衔接分子共享结构和功能特性的嵌合多肽。CAR包含TCAR和NKR-CAR。在结合同源抗原(cognate antigen)后，CAR可以活化或灭活其所处的细胞毒性细胞，或调节细胞的抗肿瘤活性或调节细胞的免疫反应。

本文在细胞外结构域的上下文中使用的术语“特异性结合”，诸如scFv，特异性结合多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，是指scFv与一个等位基因变体的相对结合，并且它不能与相同多态性细胞表面表位的对应的不同等位基因变体结合。由于这取决于亲和性(avidity)(T细胞上CAR拷贝的数量、目标细胞(或待保护的细胞)表面上抗原分子的数量)以及所用的特异性CAR的亲和力(affinity)，所以功能限定应是特异性scFv将在ELISA中针对其特异于的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体提供显著信号，或者在FACS测定中用展示scFv的CAR转染的细胞将清楚地被多态性细胞表面表位的单一等位基因变体标记，而在相同测定中，使用相同多态性细胞表面表位的对应的不同等位基因变体不会产生任何可检测信号。

本文所用的术语“治疗”是指获得期望的生理作用的手段。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的症状而言，该作用可以是治疗性的。该术语是指抑制疾病，例如阻止其发展；或改善疾病，例如导致疾病消退。

本文所用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指希望对其进行诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如，人类。

短语“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”包含本发明描述的表达至少一种如本文所述的iCAR或pCAR的细胞。在一些实施方式中，“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”能够向受试者给药。在一些实施方式中，“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”还表达如本文所述的aCAR。在一些实施方式中，“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”还表达如本文所述的iCAR或pCAR。在一些实施方式中，“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”还表达如本文所述的iCAR或pCAR和如本文所述的aCAR。

可以使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物。载体必须是“可接受的”，意义为与组合物的其他成分相容并且对其接收者无害。

短语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指有效实现特定生物学结果的如本文所述的化合物、制剂、物质或组合物的量。

载体、给药方式、剂型等的下列示例被列为已知的可能性，从中可以选择载体、给药方式、剂型等用于本发明。然而，本领域普通技术人员将理解，应当首先测试所选的任何给定的制剂和给药方式以确定其达到期望的结果。

给药方法包含但不限于肠胃外、例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下、粘膜(例如口服、鼻内、颊、阴道、直肠、眼内)、鞘内、局部和皮内途径。给药可以是系统的或局部的。在一些实施方式中，药物组合物适于口服给药。

术语“载体”是指与活性剂一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。药物组合物中的载体可包括粘合剂，诸如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮或聚维酮)、黄蓍胶、明胶、淀粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解剂，诸如藻酸、玉米淀粉等；润滑剂或表面活性剂，诸如硬脂酸镁或十二烷基硫酸钠；和助流剂，诸如胶体二氧化硅。

本文所用的术语“外周血单核细胞(PBMC)”是指具有圆形核的任何血细胞，诸如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。从血液中分离PBMC的方法对本领域技术人员是显而易见的。一个非限制性实例是使用ficoll(一种分离血液层的亲水性多糖)从全血中提取这些细胞，单核细胞和淋巴细胞在血浆层下形成血沉棕黄层，或通过白细胞去除术，制备白细胞浓缩物，将红细胞和少白细胞的血浆返回给供体。

本文所用的术语“癌症”定义为特征在于异常细胞快速且不受控制地生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包含但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、胶质瘤等。

III.CAR-T系统：iCAR、pCAR和aCAR

应当强调的是，本发明提供了一种新途径，该途径能够特异性靶向肿瘤细胞，同时保持正常细胞安全。本文提出的构思提供了鉴定iCAR(或pCAR或保护性CAR)的新靶标，这些靶标限定为包括多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，由于它们所在的染色体区域的LOH，它们从肿瘤细胞中丧失，但仍在正常组织中表达。由于多态性变异，有可能区分两个等位基因并且仅靶向肿瘤细胞中缺失的等位基因。另外，目标抗原本身不一定是肿瘤抑制基因，或预测与癌症有关的基因，这是因为目标抗原被选择为处于由LOH丧失的区域中，并因此可以简单地与这些基因关联。这在构思上与迄今为止在癌症治疗中采用或建议的靶向肿瘤相关抗原或在肿瘤处下调的抗原而与多态性无关的方法不同。本方法还通过如本文所述通过iCAR和/或pCAR的共表达赋予正常细胞保护，从而扩大了aCAR的选择范围，超过肿瘤相关抗原。

该区别是至关重要的，因为LOH是一种基因组事件，会导致肿瘤中特定变体的完全丧失，极少有机会重新获得丧失的等位基因。如果LOH事件在肿瘤发展的非常早期发生，则它可确保所有源自初始癌前组织(包含转移性肿瘤)的肿瘤细胞均具有统一的目标特征。另外，LOH几乎发生在所有类型的癌症中，并因此可以将这一构思作为开发与所有这些癌症类型相关的标记物的通用工具而依赖。由于LOH事件在某种程度上是随机的，因此本发明还基于在该患者中发生的特定LOH事件为每个个体癌症患者提供个性化肿瘤标志物的选择。执行该构思所依赖的工具aCAR和iCAR是众所周知的，并且可以使用本领域众所周知的方法轻松制备，例如WO 2015/142314和US 9,745,368中所教导的方法，两者均通过引用并入本文，如同在此充分公开一样。

根据一种策略，每个给定对中的两个CAR特异性识别患者中为杂合的同一目标基因的不同等位基因变体的产物。基本原理如下：aCAR靶向选定细胞表面蛋白的等位基因变体，该蛋白由给定的肿瘤细胞表达且不受LOH影响，而pCAR或iCAR靶向由于LOH而从这些肿瘤细胞中丧失的同一基因的等位基因变体所编码的产物。在表达所述基因的个体患者的其他正常组织中，两个等位基因都存在并且已知具有同等功能，也就是说，在所有组织中都是双等位基因表达(与可能表现出随机单等位基因表达的其他基因形成对比(Chess，2012；Savova等人，2016)。在一种情况下，两个CAR靶向位于蛋白产物上相同位置的两个相关表位，它们相差一个或仅几个氨基酸。在另一种情况下，aCAR靶向相同蛋白上的非多态性表位，而pCAR或iCAR是等位基因特异性的。在这种情况下，正常细胞上aCAR表位的密度通常为iCAR或pCAR的密度的两倍高。在一些实施方式中，单个核酸载体编码aCAR和iCAR或pCAR二者。

另一种策略是利用pCAR或iCAR靶向管家基因的蛋白产物。由于根据定义这些基因在身体所有细胞中表达，因此它们是pCAR或iCAR的安全靶标。即，如果pCAR或iCAR靶向给定患者中为杂合的管家基因的膜产物，则除由于LOH而丧失该等位基因的肿瘤细胞外，体内所有细胞都将受到保护。该策略允许aCAR目标基因产物与pCAR或iCAR解偶联。实际上，aCAR靶标则可以是由肿瘤表达的任何非多态性表位。该策略的一种变化是利用靶向非多态性肿瘤相关抗原的已知aCAR(例如在临床使用中的aCAR或在临床试验中处于检查中的aCAR)与iCAR或pCAR相组合，该iCAR或pCAR针对给定患者中为杂合的并且至少在肿瘤起源组织中表达且优选在表达aCAR目标抗原的其他重要正常组织中表达的基因的膜产物。

按照允许将aCAR目标抗原与iCAR/pCAR解偶联的相同原理，后者不必一定是管家基因的产物。在一些实施方式中，iCAR和/或pCAR是其表达模式足够宽的任何基因的产物，以便保护除了肿瘤之外还表达aCAR目标抗原的重要正常组织。按照推论，如关于管家基因所评述的，aCAR抗原可以是由肿瘤表达的任何非多态性表位，而不仅限于已知的“肿瘤相关抗原”，这一考虑因素可以大大扩展候选aCAR靶标的列表。通常，对于管家基因和非管家基因两者，此类正常重要组织鉴定和表达水平将作为此类候选aCAR靶标的优先次序的重要标准。

必须注意确保由iCAR传输的抑制信号相对于aCAR信号严格且永久地占主导地位，并且在iCAR和aCAR之间不会发生交叉识别。iCAR的主导地位确保了与表达两个等位基因的正常细胞相遇时杀伤细胞的活化将被防止。但是，这种默认的制动在与肿瘤细胞接合时不会起作用：在没有目标抗原的情况下，iCAR不会传递抑制信号，因此发动预期的aCAR介导的细胞活化以及随后肿瘤细胞裂解。

iCAR技术可基于免疫检查点。就这一点而言，论证(Fedorov等人，2013b；WO 2015/142314)表明，PD-1和CTLA-4的调控元件当作为iCAR信号传导组分并入时具有强大的T细胞抑制能力，这令人鼓舞，但这些观察的普遍性最近受到质疑(Chicaybam和Bonamino，2014，2015)。此外，尽管尚未完全了解由这些检查点蛋白触发的精确分子途径，但它们的参与会通过近端和远端机制抑制T细胞活化，使T细胞对伴随的活化刺激无反应(Nirschl和Drake，2013)。因此，尽管由PD-1和CTLA-4iCAR确保的失活状态确实是暂时的和可逆的(Fedorov等人，2013b)，但它不允许在表达iCAR靶标和aCAR靶标二者的组织中活化T细胞。相反，NK抑制性受体相对于活化受体的主导地位确保了通过空间而非时间机制使健康细胞免受NK细胞的攻击。(Long等人，2013)。有令人信服的证据表明，单个NK细胞可以保留表达抑制性和活化性配体两者的抗性细胞，却杀死它同时参与的仅表达活化性配体的易感细胞。这种精妙的能力是由在每个相应的免疫突触处形成的信号转导分子的不同空间组织所决定的，其从而影响细胞溶解颗粒的胞吐作用(例如，Abeyweera等人，2011；Eriksson等人，1999；Treanor等人；2006；Vyas等，2001；US9,745,368)。

基于iCAR所主张的控制的策略取决于iCAR活性相对于aCAR活性的主导地位，如上文所解释的。在一些实施方式中，本发明提供了这种类型的iCAR，在本文中称为pCAR(“保护性CAR，参见图2)，其被设计为以突触选择性的方式在CAR T细胞中操作，并保证相对于共表达的aCAR的完全的主导地位。在一些实施方式中，本发明提供的iCAR是这种特定类型的iCAR，在本文中称为保护性CAR(pCAR)。

在一些实施方式中，本发明的pCAR整合两种技术优点。首先，pCAR允许将aCAR的活化部分(FcRγ/CD3-ζ)与识别单元和共刺激元件(例如CD28、4-1BB、CD134(OX40、GITR、IL2Rβ和STAT3-结合基序(YXXQ))解偶联，这是通过将它们在基因上置于两个不同的多肽产物上。这些元件的重新偶联是aCAR功能所必需的，只有通过添加异二聚药物才能发生，该药物可以桥接分别掺入每个多肽上的相应的结合位点(图2B)。Wu等人最近报道了通过异二聚药物桥接相似分开的识别和活化部分来重构全功能CAR。(Wu等人，2015)。为此目的，这些作者使用了FK506结合蛋白结构域(FKBP，104个氨基酸)和FKBP-雷帕霉素结合结构域的T2089L突变体(FRB，89个氨基酸)，它们在雷帕霉素类似物AP21967存在下异二聚化(下文方案I)。这种药物具有的免疫抑制活性比雷帕霉素低1000倍(Bayle等人，2006；Graef等人，1997；Liberles等人，1997)，并且可以商购(ARGENTTM，调节异二聚化试剂盒，ARIAD)。在一些实施方式中，该药物通过口服给药。

方案I.AP21967的结构

其次，将pCAR识别单元和缺失的活化结构域分别移植到RIP控制的受体的跨膜结构域的两个表面上，该受体含有两个膜内切割位点(图2A)。pCAR与其抗原的结合将首先通过细胞外去整合素和金属蛋白酶(ADAM)家族的成员触发编码的多肽的双重切割，其去除细胞外结构域，并然后通过胞内γ-分泌酶释放出pCAR的细胞内结构域。预计该第一次切割事件会破坏截短的aCAR获得其缺失的活化元件的功能性、膜锚定的构型的能力，从而获得一种操作模式(图2C)。最近，在开发新的基因开关时利用了这一原理，该基因开关设计为限制CAR T细胞活性为同时识别肿瘤细胞上的两种不同抗原，应用Notch受体(Morsut等人，2016；Roybal等人，2016b)或上皮细胞粘附分子(EpCAM，Pizem,Y.，发明人指导下的理学硕士论文)，这两个经过充分研究的受体通过RIP起作用。在这些研究中，基于RIP的CAR与一种抗原的结合释放了基因工程化的细胞内结构域，该结构域转位至细胞核，在此它开启了第二种CAR的表达。与之不同，本发明仅利用该过程来在存在保护性抗原的情况下消除任何潜在的aCAR活性。在一些实施方式中，该第一次切割事件破坏截短的aCAR获得其缺失的活化元件的功能性、膜锚定的构型的能力，从而获得一种操作模式。

预计上述提议的作用模式将发挥局部作用，从而仅位于同一突触中的aCAR会受到影响，并且不再能够有效地结合其抗原并形成免疫突触。结果，即使当aCAR与大量非肿瘤细胞可能发生多种相互作用时，也预期它们仅是瞬时的和无功能的，从而使细胞完全能够进行进一步的相互作用。

由于aCAR的功能完全取决于pCAR的存在，因此pCAR相对于aCAR对应物的主导地位是该系统固有的。给定T细胞中pCAR的相对短缺会使aCAR失去功能，这是由于缺少活化结构域。在一些实施方式中，给定T细胞中pCAR的短缺使得aCAR由于缺少活化结构域而失去功能。

至关重要的是识别结构域和活化结构域两者都定位在质膜上(Wu等人，2015)。因此，将活化结构域与质膜分离的第二次切割将使该结构域失去功能并防止不希望的细胞活化。在一些实施方式中，识别结构域和活化结构域位于质膜上。在一些实施方式中，第二次切割使活化结构域与质膜分离，并使该结构域失去功能并防止不希望的细胞活化。

aCAR和pCAR设计为通过互斥机制起作用。pCAR进行切割的能力不取决于抑制性信号传导的强度，因此信号传导结果不会完成。只要将pCAR切割，无论其与相应抗原的相互作用的相对亲和性如何，aCAR都无法起作用，这是确保另一个关键安全水平的方案。

在一些实施方式中，哺乳动物组织是人组织，并且在其他实施方式中，相关的哺乳动物正常组织是发展成肿瘤的正常组织。

在一些实施方式中，效应免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。

在一些实施方式中，至少一种能够抑制效应免疫细胞的信号转导元件与免疫检查点蛋白的信号转导元件同源，诸如选自由以下组成的组的免疫检查点蛋白：PD1；CTLA4；BTLA；2B4；CD160；CEACAM，诸如CEACAM1；KIR，诸如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8和CD94–NKG2A；LAG3；TIM3；T细胞活化的V结构域Ig抑制物(VISTA)；干扰素基因刺激蛋白(STING)；含有免疫受体酪氨酸类抑制性基序(ITIM)的蛋白，T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)，以及腺苷受体(例如A2aR)。在一些实施方式中，免疫检查点蛋白是负免疫调节剂。在一些实施方式中，负免疫调节剂选自由2B4、LAG-3和BTLA-4组成的组。

在一些实施方式中，免疫检查点蛋白是自然杀伤细胞抑制性受体，例如KIR，诸如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3；或白细胞Ig样受体，诸如LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8；以及CD94–NKG2A，一种与CD94形成异源二聚体并含有2个ITIM的C型凝集素受体。

在US 9,745,368中已经描述了在iCAR中制备和使用杀伤细胞受体的方法，其通过引用并入本文，如在本文中充分公开一样。

在一些实施方式中，以上实施方式中任一项的细胞外结构域通过柔性铰链和跨膜经典基序融合至所述细胞内结构域。

i.靶标识别：aCAR、iCAR和pCAR

本发明提供了基于具有细胞外多态性表位的候选基因的鉴定来鉴定aCAR、iCAR和/或pCAR靶标的方法。在一些实施方式中，aCAR可以针对在肿瘤组织上表达的任何细胞外蛋白。在一些实施方式中，aCAR靶标还在非肿瘤组织上表达，并且iCAR靶标也在非肿瘤组织上表达但在肿瘤组织上不表达。

在一些实施方式中，鉴定候选基因的方法包含首先确定该基因编码包括细胞外多态性表位的跨膜蛋白。在一些实施方式中，鉴定候选基因的方法还包含确定该基因具有至少两个表达的等位基因。在一些实施方式中，这些等位基因表现出至少一个等位基因变异。在一些实施方式中，等位基因变异包含，例如，一个或多个SNP的存在，插入和/或缺失。在一些实施方式中，发现的基因的等位基因变异导致相对于蛋白的细胞外区域中的参考序列的氨基酸改变。在一些实施方式中，基因位于经历杂合性丧失(LOH)的染色体区域中。在一些实施方式中，该基因位于在癌症中经历杂合性丧失(LOH)的染色体区域中。在一些实施方式中，基因在肿瘤类型的起源组织中表达，其中发现对应的区域经历了LOH。在一些实施方式中，基因至少在表达aCAR的一种或多种组织中表达。在一些实施方式中，iCAR或pCAR靶标在表达aCAR的重要器官细胞中表达。

在一些实施方式中，基于具有至少一个细胞外多态性表位的基因的鉴定来选择用于iCAR和/或pCAR的靶标，并且其中所述基因具有至少两个表达的等位基因。在一些实施方式中，基于位于经历杂合性丧失的染色体区域中的基因的鉴定来选择用于iCAR和/或pCAR的靶标。在一些实施方式中，基于位于癌症中经历杂合性丧失的染色体区域中的基因的鉴定，来选择用于iCAR和/或pCAR的靶标。在一些实施方式中，计算理论SNP的得分并确定阈值极限。例如，如果仅32％的SNP在染色体上具有肿瘤抑制基因，则具有其的百分等级将为0.68。此外，例如，如果等位基因的次要等位基因分数为0.49(其中0.5是最高可能值)，则百分等级将为0.99。如果LOH率为0.10，并且75％的SNP具有比这更高的LOH，则百分等级将为0.25。如果跨组织表达值的标准偏差与带有该SNP的基因的中值之比为1.3，且这优于90％的其他基因，则百分等级为0.9。那么，此SNP的总得分将为0.68*0.99*0.25*0.9＝0.15。在一些实施方式中，该LOH候选得分可以用作确定候选基因是否是合适的iCAR或pCAR靶标的一种方法。在一些实施方式中，可以基于该LOH得分来选择靶标。在一些实施方式中，确定候选基因为适合作为iCAR或pCAR靶标。LOH候选基于大于0.4的LOH候选得分。

在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自具有至少一个细胞外多态性表位的基因。在一些实施方式中，靶标是位于染色体1、染色体2、染色体3、染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、染色体11、染色体12、染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染色体19、染色体20、染色体21、染色体22或染色体X的基因。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体1上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体2上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体3上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体4上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体5上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体6上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体6上并且包括HLA靶标。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标是HLA-A2。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体7上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体8上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体9上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体10上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体11上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体12上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体13上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体14上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体15上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体16上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体17上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体18上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体19上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体20上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体21上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体22上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方式中，包括细胞外多态性表位的基因位于染色体X上。在一些实施方式中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方式中，用于治疗癌症的aCAR针对或特异性结合在肿瘤组织上表达的任何膜蛋白，只要iCAR在其中表达目标蛋白的每个正常组织上表达即可。在一些实施方式中，aCAR可以特异性结合或针对肿瘤相关蛋白、肿瘤相关抗原和/或临床试验中的抗原，表1中所列的CAR靶标，以及根据本申请中列出的标准，在靶标结合方面iCAR可以与之匹配或配对的在肿瘤组织中表达的任何细胞表面蛋白。在一些实施方式中，只要iCAR在与aCAR相同的组织中或在任何重要组织中表达但在肿瘤细胞中丧失，则aCAR可以是具有细胞外结构域的任何表达的蛋白。在一些实施方式中，用于治疗癌症(诸如以上所述的任何一种癌症类型)的aCAR针对或特异性结合选自表1所列抗原(诸如CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方式中，aCAR、iCAR和/或pCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。在一些实施方式中，用于治疗癌症的aCAR针对或特异性结合选自但不限于以下抗原列表的非多态性细胞表面表位：CD19、CD20、CD22、CD10、CD7、CD49f、CD56、CD74、CAIX Igκ、ROR1、ROR2、CD30、LewisY、CD33、CD34、CD38、CD123、CD28、CD44v6、CD44、CD41、CD133、CD138、NKG2D-L、CD139、BCMA、GD2、GD3、hTERT、FBP、EGP-2、EGP-40、FR-α、L1-CAM、ErbB2,3,4、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、间皮素、c-MET、PSMA、CEA、kRas、MAGE-A1、MUC1、MUC16、PDL1、PSCA、EpCAM、FSHR、AFP、AXL、CD80、CD89、CDH17、CLD18、GPC3、TEM8、TGFB1、NY-ESO-1、WT-1和EGFR。在一些实施方式中，aCAR、iCAR和/或pCAR靶标是表1中列出的抗原。

表1.CAR目标抗原，包含在ClinicalTrials.gov中注册的试验中评估的一些抗原

表2：其他CAR目标抗原

ii.识别部分：aCAR、iCAR和pCAR

本发明还提供了被设计为提供与靶标的特异性结合的识别部分。该识别部分允许引导aCAR、iCAR和/或pCAR的特异性和靶向结合。在一些实施方式中，被设计为提供与靶标的特异性结合的识别部分提供与细胞外多态性表位的特异性结合。在一些实施方式中，识别部分是aCAR、iCAR和/或pCAR的细胞外结构域的一部分。在一些实施方式中，细胞外结构域包括抗体、其衍生物或片段，诸如人源化抗体；人抗体；抗体的功能片段；单域抗体，诸如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)。在一些实施方式中，细胞外结构域包括抗体模拟物，诸如affibody分子；affilin；affimer；affitin；alphabody；anticalin；avimer；DARPin；fynomer；Kunitz结构域肽；和monobody。在一些实施方式中，细胞外结构域包括适体(aptamer)。

通常，可以使用任何相关技术来设计赋予aCAR和pCAR或iCAR特异性结合其靶标的识别部分。例如，包括此iCAR-aCAR库的识别部分可以源自理想地选自组合展示库的主识别部分库，从而：

-共同地，所选择的识别部分靶向位于所有22个人类常染色体的两个臂的每个上的一系列基因的细胞表面产物。相邻基因之间的距离越短，覆盖范围就越大，因此使用的通用性就越大。

-对于每个选择的基因，分离出一组等位基因特异性识别部分，每个都允许在人类群体中普遍存在的不同等位基因变体之间进行严格区分。靶向的变体的数量越多，可以提供给患者的治疗基因对的数量就越多。

给定的等位基因产物可以在一个患者中成为潜在的pCAR或iCAR靶标，而在具有相同等位基因的另一名患者中成为有用的aCAR靶标，这取决于每种情况下的特定LOH模式。因此，当鉴定出合适的识别部分基因时，每个基因将被移植到pCAR或iCAR和aCAR基因支架上。因此，期望针对同一基因的等位基因变体的所有识别部分都具有相似范围的结合亲和力。在这样一组给定的识别部分中，可以将pCAR-aCAR或iCAR-aCAR对的所有可能组合预组装，以便确保在整个群体中该基因的潜在等位基因组成的最大覆盖范围。

在一些实施方式中，患者对于主要等位基因和次要等位基因是杂合的，其产物由于非同义SNP或更不常见的插入缺失而在沿编码的多肽的单个位置中不同。在一些其他实施方式中，患者对于两个次要等位基因是杂合的，这两个次要等位基因在两个分开的位置中与主要等位基因不同。取决于个体患者中涉及所述基因的特定LOH事件，给定的变体表位可以在一个患者中用作iCAR靶标，而在另一个患者中用作aCAR靶标。在一些实施方式中，可以用作iCAR靶标的变体表位不是主要等位基因变体。在一些实施方式中，可以用作iCAR靶标的变体表位是次要等位基因。

变体特异性mAb的鉴定(如，对由次要等位基因'a'编码的表位具有特异性的mAb)在本领域中是众所周知的，并且原理上类似于针对任何常规抗原决定簇的mAb的鉴定，且可通常最好通过高通量筛选重组抗体scFv文库来完成，例如利用噬菌体(Barbas等人，2004)、核糖体(Hanes等人，1997)或酵母(Chao等人，2006)展示技术。用于文库筛选的抗原可以是跨越两个等位基因之间的变异位置的合成肽(长度典型地为15-20个氨基酸或更多)，可商购的或由在该领域经营的许多公司之一定制合成的重组全长多肽，或者甚至是凭借在不表达该等位基因的相同细胞上进行差减步骤后基因转染而以高水平表达所述等位基因变体的整个细胞(例如，对编码作为模板克隆的全长cDNA的mRNA进行电穿孔，用于在pGEM4Z/A64载体中进行体外mRNA转录(Boczkowski等人，2000))。这些方法是众所周知的，并描述于例如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第四版)Green和Sambrook，冷泉港实验室出版社；《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》(第二版)，由Edward A.Greenfield编辑，2012CSH实验室出版社；《使用抗体，实验室手册(Using Antibodies,A laboratory manual)》，由Ed Harlow和David Lane编辑，1999CSH实验室出版社。

根据定义，由主要等位基因('A')编码的对应表位(在相同位置)会产生独特的抗原决定簇，该抗原决定簇在单个氨基酸的同一性(SNP)或长度(插入缺失；例如，插入或缺失)方面与由'a'产生的抗原决定簇不同。原理上，该决定簇可以由通过相同或其他抗体展示筛选技术鉴定的一组不同mAb来识别。两组已鉴定的mAb的每组中不同成员区分两个表位或变体的能力(例如，第一组的抗体结合等位基因“a”而不是“A”的产物以及第二组的Ab相反地结合“A”而不是“a”)可以使用常规结合测定法(诸如ELISA或流式细胞术(Skora等人，2015))或其他细胞染色技术来确定。替代地，一旦鉴定出结合“a”不结合“A”的Ab并确定了其蛋白序列，就可以可能地使用计算方法来预测结合“A”但不结合“a”的“互补”抗体scFv的序列。对于这样的计算方法，参见例如(Sela-Culang等人，2015a,b)。

在一些实施方式中，例如关于HLA-I类基因座基因HLA-A、HLA-B和HLA-C作为目标基因，存在许多可用的等位基因特异性单克隆抗体，例如但不限于，实施例3中列出的抗体。

在一些实施方式中，用于产生识别部分的靶标包括至少一种细胞外多态性表位。在一些实施方式中，靶标是位于染色体1、染色体2、染色体3、染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、染色体11、染色体12、染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染色体19、染色体20、染色体21、染色体22号或染色体X的基因的产物。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体1的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体1的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体2的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体2的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体3的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体3的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体4的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体4的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体5的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体5的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体6的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体6的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体7的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体7的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体8的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体8的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体9的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体9的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体10的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体10的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体11的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体11的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体12的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体12的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体13的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体13的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体14的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体14的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体15的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体15的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体16的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体16的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体17的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体17的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体18的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体18的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体19的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体19的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体20的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体20的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体21的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体21的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体22的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体22的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自染色体X的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于aCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自染色体X的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方式中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

可以容易地从相关杂交瘤中克隆编码这些抗体的可变区的序列，并用于构建编码针对任何所需靶标的scFv的基因，包含例如针对特定HLA I类等位基因表位变体的scFv，并且适用于使用广泛可用的工具将其掺入CAR构建体，如在例如以下中所公开的：《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第四版)Green和Sambrook，冷泉港实验室出版社；《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》(第二版)，由Edward A.Greenfield编辑，2012CSH实验室出版社；《使用抗体，实验室手册(UsingAntibodies,A laboratory manual)》，由Ed Harlow和David Lane编辑，1999CSH实验室出版社。

本发明提供了一种数据库，包括在肿瘤细胞中由于LOH而丧失的多态性变体的DNA序列，并且这些DNA序列编码细胞表面产物，其中该DNA序列上的变异导致了编码的蛋白的细胞外结构域中氨基酸序列的变异。信息是从多个向公众开放的数据库中检索得到的，诸如TCGA，可在公共国家卫生研究院TCGA数据门户(https://gdc.cancer.gov/)上获得，其尤其提供了可以用于推断在多种肿瘤类型中的基因的相对拷贝数的数据，以及可在用于TCGA数据的cbio门户http://www.cbioportal.org上获得(Cerami等人，2012，Gao等人，2013)；外显子集成联合(Exome Aggregation Consortium，ExAC)数据库(exac.broadinstitute.org，Lek等人，2016)，尤其提供了各种人群中SNP变体的等位基因频率；基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression，GTEX)数据库v6p(dbGaPAccession phs000424.v6.p1)(https://gtexportal.org/home,Consortium GT.人类基因组学，2015)，其包含基因的组织表达数据；以及提供蛋白的结构信息的数据库，诸如人类蛋白图谱(Uhlen等人，2015)；细胞表面蛋白图谱(Bausch-Fluck等人，2015)，N-糖基化细胞表面蛋白的基于质谱的数据库，以及UniProt数据库(www.uniprot.org/downloads)。

本发明进一步提供了用于对经历LOH的编码表达的细胞表面蛋白的基因进行全基因组鉴定的方法。鉴定的基因必须满足以下标准：1)该基因编码跨膜蛋白——因此具有在细胞表面上表达的部分以允许iCAR或pCAR结合；2)该基因具有至少两个表达的等位基因(在至少一个检查的种族人群中)；3)该基因存在等位基因变异导致了在蛋白的细胞外区域中相对于参考序列的氨基酸改变；4)该基因位于在癌症中经历LOH的染色体区域；5)该基因在其中对应区域被发现经历LOH的肿瘤类型的起源组织中表达。

原理上，如上所述的适合编码iCAR或pCAR结合的靶标的基因可以通过本领域已知的任何方法来鉴定，而不仅是通过数据库挖掘来鉴定。例如，LOH的构思不是新的，且有关特定肿瘤中的特定基因、染色体或基因组/染色体区域的LOH信息已在文献中发表，并因此候选基因可从现有出版物中获得。替代地，可以通过与染色体标记物(诸如微卫星探针)的全基因组杂交(Medintz等人,2000,Genome Res.2000年8月；10(8):1211-1218)或通过任何其他合适的方法(Ramos和Amorim,2015,J.Bras.Patol.Med.Lab.51(3):198-196)来发现这样的信息。

类似地，关于等位基因变体的信息可在各种数据库中公开获取，并且也可通过对可疑区域进行基因组测序来针对个性化案例轻松获得。而且，如上所述，关于蛋白结构和表达模式的信息是可公开获取且容易访问的。

因此，由于关于许多基因和SNP的各种标准的信息是可公开获取的，并且用于检索它的技术是众所周知的，因此本申请的主要新颖之处在于使用LOH作为用于选择iCAR或pCAR识别的靶标的标准，以及基于在特定患者中丧失的特定等位基因进行个性化治疗的构思。

作为非限制性实例，根据本发明发现HLA基因，包含非经典的HLA-I和HLA-II基因(例如，HLA-A、HLA-B HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DRHLA-K和或HLA-L)的LOH在变化频率上在许多肿瘤类型中都是相对频繁的事件(参见图10A-C)，这将使这些基因成为出于本发明的目的用作iCAR/pCAR识别的靶标的良好候选。

在缺少pCAR或iCAR靶标的情况下，任何健康基本组织中正常细胞上aCAR靶标的识别都是有害的，并被严格禁止。在这方面，此处提出的pCAR-aCAR或iCAR-aCAR对的构思构成了故障安全活化开关，如：i)不表达所选基因的细胞(在aCAR和pCAR或iCAR靶向相同基因的不同产物的情况下)由于不存在aCAR目标抗原而将不会被靶向；ii)表达该相同基因的正常细胞将共表达两个等位基因，并且由于pCAR或iCAR的主导地位而将不会被靶向；iii)在pCAR或iCAR靶向多态性管家基因的产物的情况下，则将保护体内的所有细胞；以及iv)仅表达aCAR靶标但不表达pCAR或iCAR靶标的肿瘤细胞将被攻击。在一些实施方式中，在不存在pCAR或iCAR靶标的情况下，对在任何健康基本组织中正常细胞上aCAR靶标的识别将是有害的。在一些实施方式中，不表达所选基因的细胞(在aCAR和pCAR或iCAR靶向同一基因的不同产物的情况下)由于不存在aCAR目标抗原而将不会被靶向。在一些实施方式中，表达该相同基因的正常细胞将共表达两个等位基因，并且由于pCAR或iCAR的主导地位而将不会被靶向。在一些实施方式中，当pCAR或iCAR靶向多态性管家基因的产物时，将保护体内的所有细胞。在一些实施方式中，仅表达aCAR靶标但不表达pCAR或iCAR靶标的肿瘤细胞将被攻击。在一些实施方式中，表达aCAR/iCAR对靶标两者或aCAR/pCAR对靶标两者的细胞将被保护。

如上所强调的，根据本发明，抑制性信号相对于活化信号必须具有永久的主导地位。因此，有必要确保在没有iCAR伴侣的情况下，任何时候在给定的杀伤细胞中均不表达aCAR基因。这可以通过将这些iCAR-aCAR基因对串联组装成单链产物或通过基于例如内部核糖体进入位点或几种病毒自切割2A肽之一的合适双顺反子形态来实现。正如报道的有关双顺反子表达的大量数据所表明的那样，iCAR基因将始终位于其aCAR伴侣的上游，以保证有利的化学计量。另一个选项是通过用两个独立的构建体转染或转导杀伤细胞来工程化杀伤细胞以表达aCAR和iCAR或pCAR两者，每个构建体编码aCAR或iCAR/pCAR。当然，当使用pCAR-aCAR基因对时这不是问题。在一些实施方式中，抑制性信号相对于活化信号占主导地位。在一些实施方式中，aCAR和iCAR或pCAR在同一细胞中同时表达。

确保iCAR主导地位的另一种吸引人的选项是将aCAR识别部分与其活化/共刺激部分分离，使得两个实体只能在异二聚化小分子存在下组装成一个功能受体。最近在抗肿瘤CAR的背景下证明了通过精确的时间、剂量和位置来严格控制这种分开的受体的操作状态的能力(Wu等人，2015)。

另外，预期的主导优势也可能是并入所选iCAR设计的细胞内部分的iCAR信号传导元件的特定组成所固有的，其应该与所选aCAR平台的信号传导强度“竞争”。该能力还将受到两个识别部分对它们相应的目标表位的相对亲和力(如上处理)以及它们相互作用的总体亲合性的影响。关于后者，所提出的策略既保证了良好的iCAR/aCAR化学计量，又保证了它们对应的目标表位在正常细胞上的平衡分布。同样，当使用pCAR-aCAR基因对时这不是问题。

为了进一步确保安全性，可以采用目前在CAR和TCR免疫疗法领域中实施的其他常规手段，诸如使用自杀基因或使用mRNA电穿孔进行瞬时表达。

尽管LOH经常导致细胞仅具有给定基因的一个等位基因，但它经常伴随着其余染色体或染色体部分的重复，从而导致“拷贝数中性”-LOH(Lo等人，2008；O'Keefe等人，2010；Sathirapongsasuti等人，2011)。在这些情况下，表位丧失变体的出现需要两个独立的事件，并因此可能性较小。即使在其中仅保留目标等位基因的单一拷贝的“拷贝数丧失”LOH情况中，在基因修饰细胞的不同部分中表达数个pCAR-aCAR或iCAR-aCAR对仍将防止突变逃逸的出现。但是，由于单拷贝基因可能变得至关重要，因此其功能丧失的可能性将大大降低。

鉴于以上所述，在一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包括编码能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的核苷酸序列，其中iCAR包括与多态性细胞表面表位的单一等位基因变体特异性结合的细胞外结构域以及包括抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域，该多态性细胞表面表位的单一等位基因变体在哺乳动物肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)而不存在，但至少在相关的哺乳动物正常组织的所有细胞上或在表达aCAR的重要器官上存在。

在一些实施方式中，多态性细胞表面表位是由肿瘤抑制基因或与肿瘤抑制基因遗传连锁的基因编码的抗原的一部分，因为这样的基因很可能在肿瘤中由于LOH而丧失。另外，多态性细胞表面表位可以是由通常位于在癌细胞中经常经历LOH的染色体或染色体臂上的基因编码的抗原的一部分，在癌细胞中经常经历LOH的染色体或染色体臂诸如但不限于染色体臂3p、6p、9p、10q、17p、17q或18q或染色体19。这些表位可以容易地在本文所述的相关数据库中鉴定。

在一些实施方式中，多态性细胞表面表位是管家基因产物的，诸如未分类的AP2S1、CD81、GPAA1、LGALS9、MGAT2、MGAT4B、VAMP3；细胞粘附蛋白CTNNA1NM_001903、CTNNB1、CTNNBIP1NM_020248、CTNNBL1NM_030877、CTNND1NM_001085458δ连环蛋白；通道和转运蛋白ABCB10NM_012089、ABCB7NM_004299、ABCD3NM_002857、ABCE1NM_002939、ABCF1NM_001090、ABCF2NM_005692、ABCF3NM_018358、CALM1[1][7]钙调蛋白捕捉钙离子、MFSD11NM_024311，与MSFD10又名TETRAN或四环素转运蛋白样蛋白类似[1]、MFSD12NM_174983、MFSD3NM_138431、MFSD5NM_032889、SLC15A4NM_145648、SLC20A1NM_005415、SLC25A11[1]线粒体酮戊二酸/苹果酸载体蛋白、SLC25A26NM_173471、SLC25A28NM_031212、SLC25A3NM_002635、SLC25A32NM_030780、SLC25A38NM_017875、SLC25A39NM_016016、SLC25A44NM_014655、SLC25A46NM_138773、SLC25A5NM_001152、SLC27A4NM_005094、SLC30A1NM_021194、SLC30A5NM_022902、SLC30A9NM_006345、SLC35A2NM_005660、SLC35A4NM_080670、SLC35B1NM_005827、SLC35B2NM_178148、SLC35C2NM_015945、SLC35E1NM_024881、SLC35E3NM_018656、SLC35F5NM_025181、SLC38A2NM_018976、SLC39A1NM_014437、SLC39A3NM_144564、SLC39A7NM_006979、SLC41A3NM_017836、SLC46A3NM_181785、SLC48A1NM_017842、受体ACVR1NM_001105，类似于ACVRL1TGFβ受体家族朗-奥-韦综合征(Rendu-Osler-Weber syndrome)、ACVR1B NM_004302、CD23[1]FCER2低亲和力IgE受体(凝集素)；以及参与RNA剪接的HLA/免疫球蛋白/细胞识别组BAT1又名DDX39B、BSG Basigin免疫球蛋白超家族、细胞外金属蛋白酶、MIF巨噬细胞迁移抑制因子和/或TAPBP[维基百科]。在一些实施方式中，管家基因是I型HLA、G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道或受体酪氨酸激酶，优选为HLA-A、HLA-B、HLA-C。在一些实施方式中，管家基因是HLA-A。在一些实施方式中，管家基因是HLA-B。在一些实施方式中，管家基因是HLA-C。

可以使用任何相关技术来设计赋予aCAR和pCAR或iCAR特异性结合其靶标的识别部分。在一些实施方式中，细胞外结构域包括(i)抗体、其衍生物或片段，诸如人源化抗体；人抗体；抗体的功能片段；单域抗体，诸如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)；(ii)抗体模拟物，诸如affibody分子；affilin；affimer；affitin；alphabody；anticalin；avimer；DARPin；fynomer；Kunitz结构域肽；和monobody；或(iii)适体。优选地，细胞外结构域包括ScFv。

在一些实施方式中，aCAR包括特异性结合抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的细胞外结构域。在一些实施方式中，aCAR细胞外结构域结合至为肿瘤相关抗原表位的表位。在一些实施方式中，aCAR细胞外结构域结合至为至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享的肿瘤相关抗原的表位，以及细胞内结构域包括活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。在一些实施方式中，用于治疗癌症的aCAR针对或特异性结合在肿瘤组织上表达的任何膜蛋白，只要在表达目标aCAR蛋白的每个正常组织上表达iCAR靶标即可。在一些实施方式中，aCAR针对或特异性结合选自但不限于以下抗原列表的非多态性细胞表面表位：CD19、CD20、CD22、CD10、CD7、CD49f、CD56、CD74、CAIX Igκ、ROR1、ROR2、CD30、LewisY、CD33、CD34、CD38、CD123、CD28、CD44v6、CD44、CD41、CD133、CD138、NKG2D-L、CD139、BCMA、GD2、GD3、hTERT、FBP、EGP-2、EGP-40、FR-α、L1-CAM、ErbB2,3,4、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、间皮素、c-MET、PSMA、CEA、kRas、MAGE-A1、MUC1、MUC16、PDL1、PSCA、EpCAM、FSHR、AFP、AXL、CD80、CD89、CDH17、CLD18、GPC3、TEM8、TGFB1、NY-ESO-1、WT-1和EGFR。在一些实施方式中，aCAR结合CD19。在一些实施方式中，aCAR针对或特异性结合CD19的非多态性细胞表面表位。

在一些实施方式中，iCAR针对或特异性结合不包含肝配蛋白受体(例如，EPHA 7)和紧密连接蛋白(claudins)的抗原的单一等位基因变体。在一些实施方式中，iCAR针对或特异性结合由HLA基因(HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因)的单一等位基因变体编码的表位。

iii.细胞内结构域：aCAR、iCAR和pCAR

本发明还提供了作为aCAR、iCAR和/或pCAR的一部分的细胞内结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括至少一个信号转导元件。在一些实施方式中，细胞内结构域包括抑制效应免疫细胞的至少一个信号转导元件。

通常，可以使用任何相关技术来工程化赋予aCAR和pCAR或iCAR诱导细胞功能的能力(包含例如抑制效应免疫细胞或活化或共刺激效应免疫细胞的能力)的信号转导元件。

在一些实施方式中，至少一个信号转导元件能够抑制效应免疫细胞。在一些实施方式中，能够抑制效应免疫细胞的至少一个信号转导元件与免疫检查点蛋白的信号转导元件同源。在一些实施方式中，免疫检查点蛋白选自由以下组成的组：PD1、CTLA4、BTLA、2B4、CD160、CEACAM(包含例如CEACAM1)、KIR(包含例如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8和CD94)、NKG2A；LAG3；TIM3；T细胞活化的V结构域Ig抑制物(VISTA)；干扰素基因刺激蛋白(STING)；含有免疫受体酪氨酸类抑制性基序(ITIM)的蛋白，T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)，以及腺苷受体(例如A2aR)。在一些实施方式中，免疫检查点蛋白是负免疫调节剂。在一些实施方式中，负免疫调节剂选自由2B4、LAG-3和BTLA-4组成的组。

在一些实施方式中，信号转导元件能够活化或共刺激效应免疫细胞。在一些实施方式中，信号转导元件是活化结构域。在一些实施方式中，信号转导元件是共刺激结构域。在一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)、活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体或衔接分子和/或共刺激信号转导元件同源。在一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)同源。在一些实施方式中，ITAM来自包含但不限于CD3ζ或FcRγ链的蛋白。在一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)同源。在一些实施方式中，KIR包含例如但不限于KIR2DS和KIR3DS。在一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与衔接分子同源。在一些实施方式中，衔接分子包含例如但不限于DAP12。在一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与共刺激信号转导元件同源。在一些实施方式中，共刺激信号转导元件来自包含但不限于CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)和/或GITR的蛋白。在一些实施方式中，aCAR包括信号转导元件。

在一些实施方式中，细胞外结构域通过柔性铰链和跨膜经典基序融合至所述细胞内结构域。

在一些实施方式中，pCAR的使用允许将aCAR的活化部分(FcRγ/CD3-ζ)与识别单元和共刺激元件(例如，CD28、4-1BB)解偶联。在一些实施方式中，将这些元件在基因上置于两个不同的多肽产物上。在一些实施方式中，这些元件的重新偶联是aCAR功能所必需的，只有通过添加异二聚药物才能发生，该药物可以桥接分别掺入每个多肽上的相应的结合位点。

iCAR具有源自可以拮抗T细胞活化的抑制性受体的信号传导结构域，而不是活化结构域(诸如FcRy或CD3-ζ)。在一些实施方式中，iCAR具有源自可以拮抗T细胞活化的抑制性受体的信号传导结构域。在一些实施方式中，iCAR信号传导结构域源自抑制性受体，包含例如但不限于CTLA-4、PD-1或NK抑制性受体。

iv.CAR-T载体构建(aCAR；iCAR；pCAR)

在一些实施方式中，aCAR由第一核酸载体编码，而iCAR或pCAR由第二核酸载体编码。在一些实施方式中，aCAR由第一核酸载体编码，而iCAR或pCAR由第二核酸载体编码。在一些实施方式中，aCAR由第一核酸载体编码，而iCAR或pCAR由第二核酸载体编码。在一些实施方式中，编码iCAR或pCAR的核苷酸序列在第二载体上。

在一些实施方式中，本发明提供了一种载体，其包括如以上实施方式中任一项所限定的本发明的核酸分子，以及与该核酸分子可操作地连接的至少一个控制元件，诸如启动子。

在一些实施方式中，载体是慢病毒(LV)载体。在一些实施方式中，LV载体是可商购的LV载体。在一些实施方式中，LV载体包含但不限于pLVX-Puro、pLVX-IRES-Puro/Neo/Hygro、pLVx-EF1a-IRES(TAKARA)和/或pcLV-EF1a(Sirion)。在一些实施方式中，LV载体是pLVX-Puro。在一些实施方式中，LV载体是pLVX-IRES-Puro/Neo/Hygro。在一些实施方式中，LV载体是pLVx-EF1a-IRES(TAKARA)。在一些实施方式中，LV载体是pcLV-EF1a(Sirion)。

在一些实施方式中，载体包括EF1启动子。在一些实施方式中，载体包括CMV启动子。在一些实施方式中，载体包括PGK启动子。在一些实施方式中，载体包括CD8铰链。在一些实施方式中，载体包括CD28TM和41BB共刺激结构域。

在一些实施方式中，载体还包括含有编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子，该aCAR包括特异性结合抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的细胞外结构域，其中所述表位是肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享，以及包括活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域。

在一些实施方式中，由载体中包括的核酸编码的aCAR的细胞外结构域特异性结合抗原的非多态性细胞表面表位，而iCAR的细胞外结构域特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体。

在一些实施方式中，由载体中包括的核酸编码的iCAR的细胞外结构域针对或特异性结合包含例如HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的HLA基因的单一等位基因变体；或针对表8中所列基因的单一等位基因变体。

在一些实施方式中，由载体中包括的核酸编码的aCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自表1中所列抗原(诸如CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方式中，aCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。

在一些实施方式中，由载体中包括的核酸编码的iCAR的细胞外结构域针对或特异性结合包含例如HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的HLA基因的单一等位基因变体或针对表8中所列基因的单一等位基因变体；并且由载体中包括的核酸编码的aCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自表1中所列抗原(诸如CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方式中，aCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。

在一些实施方式中，活化或共刺激效应免疫细胞的aCAR的至少一种信号转导元件与以下同源：例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)；活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的跨膜结构域，包括带正电荷的氨基酸残基或带正电的侧链，或例如KIR2DS和KIR3DS的活化KIR跨膜结构域，或诸如DAP12的衔接分子；或例如CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)或CD134(OX40)的共刺激信号转导元件。

在一些实施方式中，iCAR或pCAR由第一载体表达，而aCAR由第二载体表达。在一些实施方式中，iCAR或pCAR和aCAR都由相同的载体表达。

在一些实施方式中，载体的核苷酸序列在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列之间包括内部核糖体进入位点(IRES)。通常，编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列可以是任何先后顺序，但是在特定实施方式中，编码aCAR的核苷酸序列在编码iCAR的核苷酸序列的下游。

在一些实施方式中，编码aCAR和iCAR的核苷酸序列被编码在单个载体上。在一些实施方式中，载体在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列之间包括内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方式中，编码aCAR的核苷酸序列在编码iCAR的核苷酸序列的下游。在一些实施方式中，核苷酸序列包括位于编码aCAR的核苷酸序列与编码iCAR的核苷酸序列之间的病毒自切割2A肽。在一些实施方式中，载体的核苷酸序列包括在编码aCAR的核苷酸序列与编码iCAR的核苷酸序列之间的病毒自切割2A肽。在一些实施方式中，病毒自切割2A肽包含但不限于：来自明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A、来自马鼻炎病毒A型(ERAV)的E2A和/或来自猪捷申病毒1(PTV1)的P2A。在一些实施方式中，病毒自切割2A肽是来自明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)的T2A。在一些实施方式中，病毒自切割2A肽是来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A。在一些实施方式中，病毒自切割的2A肽是来自马鼻炎病毒A型(ERAV)的E2A。在一些实施方式中，病毒自切割2A肽是来自猪捷申病毒1(PTV1)的P2A。

在一些实施方式中，载体包括编码通过柔性接头连接至所述iCAR的组成性aCAR的核苷酸序列。

可通过例如RNA转染或通过掺入适合在真核细胞或病毒载体中复制和/或转录的质粒中，用本文所述的合适核酸分子转染免疫细胞。在一些实施方式中，载体选自逆转录病毒或慢病毒载体。

也可以使用逆转录病毒载体和合适的包装线的组合，其中衣壳蛋白将具有感染人类细胞的功能。已知几种产生双嗜性病毒的细胞系，包含PA12(Miller等人(1985)《分子和细胞生物学(Mol.Cell.BioI.)》5:431-437)；PA317(Miller等人(1986)《分子和细胞生物学(Mol.Cell.BioI.)》6:2895-2902；和CRIP(Danos等人(1988)《美国科学院院报(Proc.Nati.Acad.Sci.USA)》85:6460-6464)。替代地，可以使用非双嗜性颗粒，诸如用VSVG、RD 114或GAL V包膜假型化的颗粒。还可以通过与生产细胞直接共培养来转导细胞，例如通过Bregni等人(1992)《血液(Blood)》80:1418-1422的方法，或与单独的病毒上清液或浓缩的载体原种一起培养，例如通过Xu等人(1994)《实验血液学(Exp.Hemat.)》22:223-230；和Hughes等人(1992)《临床研究杂志(J Clin.Invest.)》89:1817的方法。

在另一方面，本发明提供了制备根据上文所限定的本发明的能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的方法，该方法包括：(i)从至少一个已知变体数据库中检索蛋白编码基因的人类基因组变体列表；(ii)通过以下步骤过滤在(i)中检索到的变体列表：(a)选择与对应的参考等位基因相比，导致相应基因编码的蛋白中的氨基酸序列发生变异的变体，(b)选择其中氨基酸序列变异是在编码的蛋白的细胞外结构域中的基因的变体，(c)选择至少在一种肿瘤中经历杂合性丧失(LOH)的基因的变体，和(d)选择至少在根据(c)的其经历LOH的至少一种肿瘤的起源组织中表达的基因的变体，从而获得在由相应基因编码的蛋白中的细胞外结构域中具有氨基酸序列变异，在至少一种肿瘤中由于LOH而丧失，并且至少在至少一种肿瘤的起源组织中表达的变体的列表；(iii)限定包括来自(ii)中获得的列表中的至少一个单一变体的序列区，亚克隆并表达包括至少一个单一变体的序列区以及包括对应参考等位基因的序列区，从而获得相应的表位肽；(iv)选择iCAR结合结构域，其与(iii)中获得的由克隆的序列区编码的表位肽或者与由对应的参考等位基因编码的表位肽特异性结合；以及(vii)制备如上文所限定的iCAR，每个iCAR包括如(iv)中限定的iCAR结合结构域。

在一些实施方式中，所选择的基因的候选变体在某种肿瘤类型中经历至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的LOH。

在一些实施方式中，在至少一个群体中，每个选择的变体的次要等位基因频率等于或超过1、2、3、4或5％。

在一些实施方式中，第一成员选自：(a)组成性aCAR，其还包括含有活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域；以及(b)条件性aCAR，其还包括含有用于异二聚化小分子的结合位点的第一成员和任选的至少一种共刺激信号转导元件但是缺少活化信号转导元件的细胞内结构域；以及第二成员是：(c)抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其还包括含有抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域；或(d)保护性嵌合抗原受体(pCAR)，其还包括含有用于脱落酶(sheddase)的底物的细胞外调节区；包括用于膜内切割蛋白酶的底物的跨膜经典基序；以及细胞内结构域，所述细胞内结构域包括活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件和用于异二聚化小分子的结合位点的第二成员。

在一些实施方式中(i)iCAR或pCAR的细胞外结构域特异性结合与aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体；(ii)所述pCAR或iCAR的细胞外结构域特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同抗原的不同多态性细胞表面表位的单一等位基因变体；或(iii)所述pCAR或iCAR的细胞外结构域特异性结合所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同多态性细胞表面表位的不同的单一等位基因变体。

在一些pCAR实施方式中，用于脱落酶的底物是用于去整合素和金属蛋白酶(ADAM)或β-分泌酶1(BACE1)的底物。在一些实施方式中，底物形成细胞外结构域的一部分，并包括Lin 12/Notch重复序列和ADAM蛋白酶切割位点。

人们普遍认为，没有预测ADAM切割的一致的序列基序，但是Caescu等人(Caescu等人，2009)在表3中公开了大量ADAM10和/或ADAM17底物序列，其通过引用并入本文，如同在此充分公开一样，并且可以用作在本发明的pCAR中的ADAM的底物。在一些实施方式中，ADAM底物序列是淀粉样前体蛋白、BTC、CD23、胶原蛋白、DII-1、埃博拉糖蛋白、E-钙粘着蛋白、EGF、上皮调节蛋白、Fas配体、生长激素受体、HB-EGF、II型白介素-1受体、IL-6受体、L-选择素、N-钙粘着蛋白、Notch、p55TNF受体、p75TNF受体、Pmel17、朊病毒蛋白、受体型蛋白酪氨酸磷酸酶Z、TGF-α、TNF或TR的那些(Caescu等人，2009)。

在本发明的pCAR中使用ADAM10切割序列可能是有利的，因为ADAM10以相当高的水平组成性地存在于例如淋巴细胞上。与ADAM10形成对比，在未刺激的细胞上仅以低水平检测到了近缘的TACE/ADAM17。通过刺激迅速诱导T细胞原始细胞上的ADAM17表面表达(Ebsen等人，2013)。

Hemming等人(Hemming等人，2009)报道了在底物与非底物中未鉴定出预测BACE1切割的一致性序列基序，但是在表1中公开了具有BAC1切割序列的大量BACE1底物，其通过引用并入本文，如同在此充分公开一样，且其可以用作本发明的pCAR中BACE1的底物。

在一些pCAR实施方式中，用于膜内切割蛋白酶的底物是用于SP2、γ-分泌酶、信号肽肽酶(spp)、spp样蛋白酶或菱形蛋白酶的底物。

Rawson等人(Rawson，2013)公开了SP2底物具有至少一个2型跨膜螺旋，并且在SP2底物中包含螺旋去稳定基序，诸如Asp-Pro基序。该论文在表1中公开了许多具有SP2切割序列的SP2底物，其通过引用并入本文，如同在此充分公开一样，并且可以用作本发明的pCAR中SP2的底物。

Haapasalo和Kovacs(Haapasalo和Kovacs，2011)教导了淀粉样β蛋白前体(AβPP)是早老素(PS)依赖γ-分泌酶(PS/γ-分泌酶)的底物，并且已经发现了至少90种其他蛋白被该酶复合物类似地蛋白水解。γ-分泌酶底物具有一些共同特征：大多数底物蛋白是I型跨膜蛋白；PS/γ-分泌酶介导的γ样切割(对应于AβPP中的&切割，其释放AICD)发生在跨膜和胞质结构域的边界处或边界附近。&样切割位点位于富含赖氨酸和/或精氨酸残基的一段疏水性氨基酸序列的侧翼。似乎PS/γ-分泌酶切割不依赖于切割位点处或附近的特定氨基酸目标序列，而是可能取决于跨膜结构域的构象状态。Haapasalo和Kovacs在表1中公开了γ-分泌酶底物的列表，其切割序列通过引用并入本文，如同在此充分公开一样，并且可以在本发明的pCAR中用作γ-分泌酶的底物。

Voss等人(Voss等人，2013)教导了迄今为止，对于GxGD天冬氨酰蛋白酶类(spps)尚未描述基于底物内的一级序列元件的共有切割位点。膜蛋白的跨膜结构域优先采用α螺旋构象，其中其肽键很难被蛋白酶接触。为了使跨膜结构域对膜内蛋白水解敏感，因此假定需要通过螺旋去稳定氨基酸来降低其α-螺旋含量。与该假定一致，各种信号肽已显示在其h区域内含有螺旋去稳定氨基酸，这严重影响了它们通过SPP的蛋白水解过程。另外，信号肽的h区域内的极性残基可能影响通过SPP的切割，例如，各种HCV株的信号肽内的丝氨酸和半胱氨酸残基对于SPP切割至关重要。这些极性残基是否也仅影响信号肽的螺旋含量，或者特别地羟基或巯基是否是触发被SPP切割所需的，还尚不完全清楚。类似地，当减少Bri2跨膜结构域的α-螺旋含量时，SPPL2b对Bri2跨膜结构域的切割显著增加。有趣的是，具有推定的螺旋去稳定能力的四个残基中只有一个氨基酸残基在基于磷脂的环境中显著降低了Bri2跨膜结构域的α-螺旋含量。这表明α-螺旋跨膜结构域的去稳定不仅是由某些氨基酸残基引起的，而是这些氨基酸的背景和位置决定了其螺旋去稳定的可能性，并因此决定了跨膜结构域对通过SPP/SPPL的膜内蛋白水解的可及性。Voss等人在表1中还公开了spp和spp样底物的列表，其切割序列通过引用并入本文，如同在此充分公开一样，并且可以在本发明的pCAR中用作spp的底物。

Bergbold等人(Bergbold和Lemberg，2013)教导了对于菱形蛋白酶，已经提出了两种不同的底物识别模型。在第一个模型中，底物肽骨架的构象柔性与将膜浸入菱形活性位点附近相结合足以提供特异性。对于特征明确的果蝇属(Drosophila)底物Spitz，已证明甘氨酸-丙氨酸基序可用作螺旋断裂，其使跨膜结构域展开到菱形活性位点中。第二种模型表明，菱形蛋白酶主要识别围绕切割位点的特定序列，而跨膜螺旋去稳定残基仅是一些底物所需要的次要特征。尚未鉴定具体序列。Bergbold等人在表3中公开了菱形蛋白酶底物的列表，其切割序列通过引用并入本文，如同在此充分公开一样，并且其可以在本发明的pCAR中用作菱形蛋白酶的底物。

鉴于以上所述，由于在大多数情况下尚未为膜内切割蛋白酶建立共有基序，并且由于鉴定膜内切割蛋白酶底物的测定方法是本领域众所周知的，如上文引用的文献所述，因此pCAR可以包括这样鉴定的氨基酸序列，并且还可以包括跨膜螺旋去稳定残基。

在一些实施方式中，底物形成跨膜经典基序的一部分，并且与Notch、ErbB4、E-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白、肝配蛋白B2、淀粉样蛋白前体蛋白或CD44的跨膜结构域同源/由其衍生。

在一些实施方式中，包括编码所述条件性aCAR的作为分开的蛋白的细胞外结构域和细胞内结构域的核苷酸序列，其中每个结构域独立地融合至跨膜经典基序，并且包括异二聚化小分子的结合位点的不同成员。

在一些实施方式中，异二聚化小分子的结合位点的第一和第二成员中的每一种均衍生自选自以下的蛋白：(i)他克莫司(Tacrolimus)(FK506)结合蛋白(FKBP)和FKBP；(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶催化亚基A(CnA)；(iii)FKBP和亲环蛋白；(iv)FKBP和FKBP-雷帕霉素相关蛋白(FRB)；(v)促旋酶B(GyrB)和GyrB；(vi)二氢叶酸还原酶(DHFR)和DHFR；(vii)DmrB均二聚结构域(DmrB)和DmrB；(viii)PYL蛋白(又称脱落酸受体，和RCAR)和ABI；以及(ix)GAI拟南芥(Arabidopsis thaliana)蛋白(又名赤霉酸不敏感和DELLA蛋白GAI；GAI)和GID1拟南芥蛋白(也称为赤霉素受体GID1；GID1)。

v.效应细胞的构建

在另一方面，本发明提供了用于制备安全效应免疫细胞的方法，包括：(i)用包括编码如上文限定的iCAR或pCAR的核苷酸序列的核酸分子转染针对肿瘤相关抗原的TCR工程化效应免疫细胞，或用载体转导该细胞；或者(ii)用包括编码如上文限定的iCAR或pCAR的核苷酸序列的核酸分子和包括编码如上文限定的aCAR的核苷酸序列的核酸分子转染天然效应免疫细胞；或用上文限定的载体转导效应免疫细胞。

在一些实施方式中，用于工程化的免疫细胞包含但不限于T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。在一些实施方式中，用于工程化的免疫细胞包含但不限于Jurkat T细胞、Jurkat-NFAT T细胞和/或外周血单核细胞(PBMC)。

在又另一方面，本发明提供了通过上文所述的本发明的方法获得的安全效应免疫细胞。安全效应免疫细胞可以是表达外源性T细胞受体(TCR)和iCAR或pCAR的重定向T细胞，其中外源性TCR针对抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，其中所述表位是肿瘤相关抗原或至少由相关肿瘤和正常组织的细胞共享，并且iCAR或pCAR如上文所限定；或安全效应免疫细胞是重定向的效应免疫细胞，诸如表达如上文限定的iCAR或pCAR和aCAR的自然杀伤细胞或T细胞。

在一些实施方式中，安全效应免疫细胞在其表面上表达包括特异性结合抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域的aCAR和包括特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的不同抗原的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的细胞外结构域的iCAR或pCAR。在一些实施方式中，iCAR或pCAR的细胞外结构域特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同抗原的不同多态性细胞表面表位的单一等位基因变体；或iCAR或pCAR的细胞外结构域特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同的多态性细胞表面表位区域的不同的单一等位基因变体。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的aCAR的细胞外结构域特异性结合选自表1中列出的抗原(诸如CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方式中，靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-K、HLA-L、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA_DQ或HLA-DR基因的单一等位基因变体或针对表8中所列基因的单一等位基因变体。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单一等位基因变体或针对表8中所列基因的单一等位基因变体；并且在细胞表面上表达的aCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自表1所列抗原(诸如例如但不限于CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方式中，aCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。

在一些实施方式中，aCAR和iCAR作为分离的蛋白存在于细胞表面上。

在一些实施方式中，编码iCAR的核苷酸序列在细胞表面上的表达水平大于或等于编码aCAR的核苷酸序列的表达水平。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合至少一个细胞外多态性表位的单一等位基因变体。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方式中，用于aCAR、iCAR和/或pCAR的识别部分提供对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态表位的特异性：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自由以下组成的组的基因的单一等位基因变体：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合HLA-A2的单一等位基因变体。在一些实施方式中，在细胞表面表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合CD20的单一等位基因变体。在一些实施方式中，iCAR将针对HLA-A2。在一些实施方式中，iCAR将针对CD20。在一些实施方式中，aCAR将针对CD19。在一些实施方式中，iCAR/aCAR组将分别是HLA-A2和CD19。在一些实施方式中，iCAR/aCAR组将分别包含CD20和CD19。

vi.目标细胞的制备

在一些实施方式中，在体外系统中制备并测试目标细胞。在一些实施方式中，将建立体外重组系统以测试iCAR和/或pCAR构建体在抑制aCAR针对偏离目标(off-target)细胞的活性中的功能。在一些实施方式中，将产生表达aCAR表位、iCAR表位或两者的目标细胞。在一些实施方式中，将产生表达aCAR表位、pCAR表位或两者的目标细胞。在一些实施方式中，表达aCAR表位的重组细胞将代表中靶“肿瘤上”细胞，而表达aCAR表位和iCAR表位两者的细胞将代表中靶“偏离肿瘤”健康细胞。

在一些实施方式中，iCAR/aCAR组将分别是HLA-A2和CD19，表达HLA-A2、CD19或两者的重组细胞将通过用编码这些基因的表达载体转染细胞系(例如Hela、Hela-荧光素酶或Raji)而产生。为了检测重组CD19和HLA-A2表达，两个基因都将融合至蛋白标签(例如HA或Flag或Myc等)。在一些实施方式中，iCAR/aCAR靶标组将是CD20/CD19，并且重组细胞将表达CD19、CD20或两者。

在一些实施方式中，将包括iCAR/aCAR靶标组的表达载体转染到细胞中。在一些实施方式中，将表达载体转染到细胞中以产生靶向和偏离肿瘤效应。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2AD2A。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方式中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方式中，如上所限定的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞在其表面上表达包括特异性结合肿瘤相关抗原或抗原的细胞表面表位的细胞外结构域的aCAR，以及包括特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的，至少在肿瘤起源组织中表达的抗原(诸如上文所列出的那些中的任一种)的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的细胞外结构域的iCAR。在一些实施方式中，在与表达aCAR的组织相同的组织中表达iCAR。在一些实施方式中，aCAR和iCAR是相同基因的不同等位基因。在一些实施方式中，aCAR和iCAR是不同的蛋白，因此是不同的等位基因。

A.体外测定

在一些实施方式中，将使用多种测定来测试iCAR和/或pCAR的作用活性，包含有效性和抑制能力。在一些实施方式中，将在体外和/或体内测试iCAR和/或pCAR的抑制作用。在一些实施方式中，将在体外测试iCAR和/或pCAR的抑制作用。在一些实施方式中，将在体内测试iCAR和/或pCAR的抑制作用。在一些实施方式中，体外测定测量细胞因子分泌和/或细胞毒性效应。在一些实施方式中，体内测定将评估iCAR和/或pCAR对中靶偏离肿瘤异种移植物的抑制和保护。在一些实施方式中，体内测定将评估iCAR和/或pCAR对中靶偏离肿瘤组织和/或重要器官的抑制和保护。

i.荧光素酶细胞毒性测定

在一些实施方式中，使用荧光素酶细胞毒性测定来评估iCAR和/或pCAR。通常，对于荧光素酶细胞毒性测定，重组目标细胞(可以称为“T”)被工程化以表达萤火虫荧光素酶。在一些实施方式中，可以用编码目标蛋白的DNA转染商业Hela-Luc细胞。可以根据Bright-Glo荧光素酶测定(可从Promega或BPS Biosciences或其他商业供应商购得)进行体外荧光素酶测定。转导的效应(E)T细胞(已被iCAR或pCAR和aCAR或aCAR或模拟CAR二者转导)可与表达HLA-A2、CD19、或CD19和HLA-A2二者、或CD20、或CD20和CD19二者的重组目标细胞温育24-48小时，以不同的效应物与靶标比率进行测试。在一些实施方式中，iCAR/aCAR或pCAR/aCAR对包括具有上述组分的aCAR、pCAR和/或iCAR中的任何一种。在一些实施方式中，iCAR/aCAR对包括靶向HLA-A2的iCAR和靶向CD19的aCAR。在一些实施方式中，iCAR/aCAR对包括靶向CD20的iCAR和靶向CD19的aCAR。通过使用Bright-Glo荧光素酶系统估算活细胞的数量，可以间接量化细胞杀伤。

在一些实施方式中，可以通过根据iCAR/aCAR表达水平对转导的T细胞群体进行分选或通过根据重组目标细胞的靶标表达(包含例如编码至少一种细胞外多态性表位的基因产物的表达)选择重组目标细胞的亚群体来优化“偏离肿瘤”细胞毒性。在一些实施方式中，aCAR、iCAR和/或pCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。在一些实施方式中，分选基于CD19或HLA-A2表达水平。

在一些实施方式中，检查iCAR和/或pCAR以确定iCAR转导的T细胞是否可以体外区分“肿瘤上”细胞(例如，肿瘤细胞)和“偏离肿瘤”细胞(例如，非肿瘤细胞)。通常，通过检查与比例为1:1的“肿瘤上”和“偏离肿瘤”细胞的混合物一起温育的转导的T细胞的杀伤作用来测试这一点。在一些实施方式中，比率为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7或1:8。在仅一个细胞群体被工程化以一次表达荧光素酶基因的实施方式中，可以通过荧光素酶表达将肿瘤上重组细胞与“偏离肿瘤”重组细胞区分开。可以使用Bright-Glo荧光素酶测定(Promega)在共温育24-48小时后定量杀伤。

在一些实施方式中，iCAR/aCAR和/或pCAR/aCAR转导的T细胞表现出与用aCAR转导但未用iCAR和/或pCAR转导的T细胞相比低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％和/或约95％的偏离肿瘤细胞杀伤。在一些实施方式中，iCAR/aCAR和/或pCAR/aCAR转导的T细胞表现出与用aCAR转导但未用iCAR和/或pCAR转导的T细胞相比低约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约10倍的偏离肿瘤细胞杀伤。

ii.胱天蛋白酶3

在一些实施方式中，采用胱天蛋白酶3检测测定来体外检查iCAR和/或pCAR以确定“肿瘤上”细胞(例如肿瘤细胞)和“偏离肿瘤”细胞(例如非肿瘤细胞)的凋亡水平。在一些实施方式中，通过活化的切割的胱天蛋白酶3的抗体来对细胞毒性淋巴细胞(CTL)诱导的凋亡进行胱天蛋白酶3检测。

通常，CTL杀伤目标细胞的途径之一是通过经由Fas配体诱导凋亡。CASP3蛋白是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(胱天蛋白酶)家族的成员。典型地，胱天蛋白酶的顺序活化在细胞凋亡的执行阶段中起着重要作用，并因此，前原胱天蛋白酶(pro-caspase)3切割成胱天蛋白酶3导致构象变化和催化活性的表达。胱天蛋白酶3的切割的活化形式可以被单克隆抗体特异性识别。

在一些实施方式中，可以将转导的T细胞与“肿瘤上”(例如模拟肿瘤)和“偏离肿瘤”细胞(例如模拟非肿瘤)重组细胞一起温育。在一些实施方式中，“肿瘤上”(例如肿瘤)和“偏离肿瘤”细胞(例如非肿瘤)重组细胞先前已经用CFSE((5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯))或其他细胞示踪染料(例如CellTrace Violet)标记。在一些实施方式中，目标细胞与效应细胞的共温育发生约1小时至6小时、约2小时至约5小时或约2小时至约4小时。在一些实施方式中，通过流式细胞术定量目标细胞凋亡。可以通过内部染色试剂盒(Miltenyi或BD bioscience)对细胞进行透化和固定，并用活化的胱天蛋白酶3的抗体(BDbioscience)进行染色。

在一些实施方式中，iCAR/aCAR和/或pCAR/aCAR转导的T细胞诱导与用aCAR转导但未用iCAR和/或pCAR转导的T细胞相比低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％和/或约95％的偏离肿瘤细胞凋亡。在一些实施方式中，aCAR/iCAR和/或aCAR/pCAR转导的T细胞诱导与用aCAR转导但未用iCAR和/或pCAR转导的T细胞相比低约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约10倍的偏离肿瘤细胞凋亡。

iii.时间间隔显微镜检查

时间间隔显微CTL-

为了识别靶标结合，可以进行iCAR和/或pCAR转导的T细胞的时间间隔显微镜检查。在一些实施方式中，目标细胞将用报道基因(例如但不限于荧光蛋白，诸如mCherry)标记。在一些实施方式中，将转导的T细胞与“肿瘤上”或“偏离肿瘤”细胞温育长达5天。在一些实施方式中，时间间隔显微镜检查可以用于可视化杀伤。在一些实施方式中，将进行使用活细胞数染色和CountBright珠(Invitrogen)的流式细胞术分析，以在终点时间确定目标细胞数。

在一些实施方式中，为了确定aCAR/iCAR或aCAR/pCAR转导的T细胞是否可以在体外识别靶标，将每个重组目标细胞(“肿瘤上”或“偏离肿瘤”)用不同的报道蛋白(例如GFP和mCherry)标记。在一些实施方式中，任何报道蛋白对都将起作用，只要报道物对含有两个易于区分的报道物即可。在一些实施方式中，转导的T细胞(效应细胞)将与重组细胞(目标细胞)以1:1的E/T比例共温育。在一些实施方式中，效应物与靶标的比率(E/T)包含但不限于16:1、12:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1或1:1。在一些实施方式中，然后通过显微镜成像检查细胞命运。

iv.细胞因子释放

可以检查细胞因子释放以确定T细胞活化。在一些实施方式中，将iCAR/aCAR和/或pCAR/aCAR转导的T细胞与重组目标细胞一起温育，并例如通过根据BioLegend的ELISAMAXTM Deluxe Set试剂盒测量细胞培养上清液中的细胞因子分泌或通过对产生细胞因子的T细胞的百分数进行流式细胞术分析来定量一种或多种细胞因子的细胞因子产生。对于流式细胞术分析，通常采用Golgi Stop来阻止细胞因子的分泌。在一些实施方式中，在将转导的T细胞与目标细胞温育6小时和18小时至24小时之后，将通过内部染色试剂盒(Miltenyi)透化并固定T细胞，并用针对T细胞标志物(CD3和CD8)的抗体以及针对一种或多种细胞因子的抗体进行染色。在一些实施方式中，细胞因子包含但不限于IL-2、INFγ和/或TNFα。

v.CD107a染色

还可以检查CD107a的染色，以便确定转导的T细胞的细胞溶解活性。通常，可以通过CD107a(一种溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1))的表面表达来鉴定T细胞的脱颗粒，并且已证明LAMP-1的表面表达与CD8T细胞的细胞毒性有关。此外，该分子位于溶酶体的腔侧。典型地，在活化后，CD107a被转移到活化淋巴细胞的细胞膜表面。此外，CD107a在细胞表面瞬时表达，并通过内吞途径迅速重新内化。因此，不受理论的束缚，通过在细胞刺激过程中进行抗体染色和通过添加莫能菌素(monensin)(例如，以防止内吞的CD107a抗体复合物的酸化和随后降解)，使得CD107a检测最大化。

在一些实施方式中，将aCAR/iCAR和/或aCAR/pCAR转导的T细胞与目标细胞一起温育约6小时至约24小时，并检查CD8T细胞上的CD107a表达。在一些实施方式中，目标细胞仅表达一种被aCAR(如在肿瘤细胞中)识别的目标蛋白或目标细胞表达被aCAR和iCAR(如在正常细胞中)识别的两种目标蛋白。在一些实施方式中，在存在莫能菌素的情况下，将iCAR和/或pCAR转导的T细胞与目标细胞温育约6小时至约24小时，并且在CD8T细胞上表达CD107a，随后使用针对T细胞表面标志物(例如CD3和CD8)的缀合抗体和CD107a的缀合抗体进行流式细胞术。

vi.通过ELISA定量分泌的细胞因子

在一些实施方式中，在将表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR两者的转导的T细胞(Jurkat或原代T细胞)与在其细胞表面表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR两者抗原的修饰的目标细胞共培养后，收集条件培养基，并通过细胞因子ELISA测量细胞因子的浓度。在一些实施方式中，细胞因子选自由IL-2、INFγ和/或TNFα组成的组。在一些实施方式中，细胞因子选自由IL-2组成的组。在一些实施方式中，细胞因子选自由INFγ组成的组。在一些实施方式中，细胞因子选自由TNFα组成的组。在一些实施方式中，证明在双CAR(aCAR/iCAR)转导的细胞的情况下，降低了约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。

vii.通过流式微珠阵列(CBA)测定测量的细胞因子分泌

流式微珠阵列(CBA)用于测量各种可溶性和细胞内蛋白，包含细胞因子、趋化因子和生长因子。在一些实施方式中，用在其细胞表面上表达iCAR和aCAR二者或aCAR或iCAR目标抗原的修饰的目标细胞刺激经aCAR或aCAR和iCAR两者构建体(效应细胞)转导的T细胞(原代T细胞或Jurkat细胞)。在一些实施方式中，效应物与靶标的比率范围为20:1至1:1。在一些实施方式中，效应物与靶标的比率范围为20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1。在一些实施方式中，在共同温育数小时后，效应细胞产生并分泌细胞因子，这指示了其效应状态。在一些实施方式中，收集反应的上清液，并通过多重CBA测定来测量和定量分泌的IL-2。

在一些实施方式中，证明了在双CAR(aCAR/iCAR)转导的细胞与表达两个目标抗原的目标细胞共温育的情况下，与相同效应细胞与仅表达一个靶标的目标细胞共温育的情况下产生的IL-2分泌相比，降低了约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方式中，证明了在双CAR(aCAR/iCAR)转导的细胞与表达两个目标抗原的目标细胞共温育的情况下，与相同效应细胞与仅表达一个靶标的目标细胞共温育的情况下产生的IL-2分泌相比，在IL-2分泌方面降低了约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方式中，降低了86％。在一些实施方式中，aCAR是CD19aCAR。在一些实施方式中，iCAR是HLA-A2iCAR。在一些实施方式中，iCAR是CD20iCAR。在一些实施方式中，aCAR/iCAR对是CD19aCAR和HLA-A2iCAR。在一些实施方式中，aCAR/iCAR对是CD19aCAR和CD20iCAR。

viii.通过CD107a染色测量的T细胞脱颗粒测定

在一些实施方式中，可以通过CD107a(一种溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1))的表面表达来鉴定T细胞的脱颗粒。在一些实施方式中，已证明LAMP-1的表面表达与CD8T细胞的细胞毒性有关。在一些实施方式中，颗粒形成(CD107a)是杀伤潜力的标志物。

B.体内测定

在一些实施方式中，对iCAR/aCAR和/或iCAR/pCAR对进行体内有效性测试。在一些实施方式中，用肿瘤细胞静脉内接种NOD/SCID/γc-或类似小鼠。在一些实施方式中，肿瘤细胞是经工程化表达萤火虫荧光素酶的CD19阳性NALM 6(ATCC，人B-ALL细胞系)细胞。在一些实施方式中，为了建立和/或区分“中靶”细胞和“偏离肿瘤”细胞之间的差异，可以将NALM6工程化以表达iCAR和/或pCAR表位，从而代表健康细胞。在一些实施方式中，iCAR和/或pCAR表位包括至少一种细胞外多态性表位。在一些实施方式中，iCAR和/或pCAR表位来自HLA-A2或CD20。可用于这些测定的其他细胞包含但不限于Raji或任何其他重组细胞系。在一些实施方式中，此类测定可以在PDX(患者来源的异种移植)模型中进行。

为了进行测定，将小鼠分为研究组；一组将注射NALM 6细胞，而另一组将注射表达iCAR表位的NALM-6。几天后，向小鼠静脉内输注经aCAR、aCAR/iCAR转导的T细胞，以及未转导的T细胞或无T细胞的对照组。处死小鼠，并将根据总通量来量化肿瘤负荷。

根据该测定的一种实施方式，为了测试表达iCAR和/或pCAR构建体的T细胞是否可以在相同生物体内在体内区分目标细胞和偏离目标细胞，向小鼠注射“肿瘤上”/“偏离肿瘤”NALM-6细胞的1:1混合物，然后注射表达单独的aCAR或表达aCAR和iCAR二者的转导的T细胞。在该实施方式中，在处死小鼠后，将通过流式细胞术分析两种标志物CD19和iCAR表位在脾和骨髓中“肿瘤上”和“偏离肿瘤”细胞中的存在。

i.人异种移植小鼠模型中的体内CTL测定

在一些实施方式中，为了测试表达aCAR和iCAR两者构建体的T细胞是否在相同生物体内区分目标细胞和“偏离目标”细胞，并有效杀死目标细胞同时保留“偏离目标”细胞，将通过体内CTL测定来评估。

在一些实施方式中，将用iCAR或aCAR或iCAR和aCAR二者转导的T细胞静脉注射到天然NOD/SCID/γc-或类似小鼠中，并在长达几个小时后，注射表达iCAR、aCAR或两者的目标细胞。在一些实施方式中，这些靶标将用不同浓度(高、中和低)的CFSE/CPDE或类似的细胞示踪染料标记，这将允许它们之间的进一步区分。在一些实施方式中，如实施例5中所述，将计算特异性杀伤的百分比。

ii.人异种移植小鼠模型中的肿瘤生长动力学

在一些实施方式中，肿瘤细胞表达iCAR靶标、aCAR靶标或两者。在一些实施方式中，aCAR肿瘤细胞系可以是CD19阳性NALM 6(ATCC，人BALL细胞系)。在一些实施方式中，表达aCAR和iCAR二者的肿瘤细胞(即“偏离肿瘤”细胞)是工程化为表达iCAR表位(例如HLA-A2)的NALM 6，从而代表健康细胞。在一些实施方式中，NALM 6和NALM 6-HLA-A2也可工程化以表达报道基因(例如萤火虫荧光素酶)，用于容易地检测。

在一些实施方式中，将通过机械手段(卡尺)以及还通过使用体内成像系统(IVIS)测量肿瘤体积来进行监测。在一些实施方式中，可以定量肿瘤负荷，并且可以通过FACS分析浸润的T细胞群体。

iii.转基因小鼠模型中的毒性和肿瘤生长动力学

在一些实施方式中，表达人aCAR和iCAR靶标的转基因小鼠也将用于确定转导的T细胞的功效。在一些实施方式中，系统将允许我们监视功效和毒性问题。

C.体内用途：治疗、生物标志物

在又另一方面，本发明提供了为患有以LOH为特征的肿瘤的受试者选择个性化生物标志物的方法，该方法包括(i)从该受试者获得肿瘤活检；(ii)从受试者获得正常组织的样本，例如PBMC；以及(iii)鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织的细胞表达的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，从而鉴定出受试者的个性化生物标志物。

在一些实施方式中，生物标志物用于定制受试者的治疗，因此该方法还包括治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的步骤，包括向该患者给药如上限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对(iii)中鉴定的单一等位基因变体。在一些实施方式中，本发明提供了为患有以LOH为特征的肿瘤的受试者选择个性化生物标志物的方法，该方法包括(i)从该受试者获得肿瘤活检；(ii)从该受试者获得正常组织的样本，例如PBMC；(iii)基于LOH候选得分，鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织的细胞表达的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，其中等位基因变体被鉴定为受试者的个性化生物标志物。

在另一方面，本发明提供了用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，包括向该患者给药如上所限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，该单一等位基因变体在肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)而不存在，但至少存在于患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上。

在类似方面，本发明提供了用于减少患有以LOH为特征的肿瘤的受试者中的肿瘤负荷的方法，包括向该患者给药如上所限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，该单一等位基因变体在肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)而不存在，但至少存在于患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上，或至少存在于表达aCAR的重要组织上。

在另一类似方面，本发明提供了用于提高患有以LOH为特征的肿瘤的受试者的存活率的方法，包括向该患者给药如上所限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，该单一等位基因变体在肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)而不存在，但至少存在于患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上。

在还另一方面，本发明涉及如上文所限定的安全效应免疫细胞，用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者、减少患有以LOH为特征的肿瘤的患者的肿瘤负荷或提高患有以LOH为特征的肿瘤的患者的存活率的用途，其中iCAR针对编码多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，该单一等位基因变体在肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)而不存在，但至少存在于患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上。

在又另一方面，本发明涉及用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的方法，包括：(i)鉴定或接收鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织的细胞表达的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的信息，(ii)鉴定或接收鉴定抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的信息，其中所述表位是所述癌症患者中的肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享；(iii)选择或接收限定如上文所限定的iCAR的至少一种核酸分子和包括编码如上文所限定的aCAR的核苷酸序列的至少一种核酸分子，或如上文所限定的至少一种载体，其中iCAR包括特异性结合(i)的细胞表面表位的细胞外结构域，并且aCAR包括特异性结合(ii)的细胞表面表位的细胞外结构域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接收至少一群体的安全重定向效应免疫细胞；以及(v)向所述癌症患者给药(iv)的至少一群体的安全重定向免疫效应细胞。

在类似方面，本发明提供了用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的至少一群体的安全重定向免疫效应细胞，其中该安全重定向免疫细胞通过以下步骤得到：(i)鉴定或接收鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织的细胞表达的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的信息，(ii)鉴定或接收鉴定抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的信息，其中所述表位是所述癌症患者中的肿瘤相关抗原或至少由相关肿瘤和正常组织的细胞共享；(iii)选择或接收限定如上文所限定的iCAR的至少一种核酸分子和包括编码如上文限定的aCAR的核苷酸序列的至少一种核酸分子，或如上文限定的至少一种载体，其中iCAR包括特异性结合(i)的细胞表面表位的细胞外结构域，并且aCAR包括特异性结合(ii)的细胞表面表位的细胞外结构域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接收至少一群体的安全重定向效应免疫细胞。

在引用涉及治疗癌症或安全免疫效应细胞用于治疗癌症的用途的上述实施方式中的任一项的一些实施方式中，(i)iCAR的细胞外结构域特异性结合与aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体；(ii)所述iCAR的细胞外结构域特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同抗原的不同多态性细胞表面表位的单一等位基因变体；或(iii)所述iCAR的细胞外结构域特异性结合所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同多态性细胞表面表位的不同的单一等位基因变体。

在一些实施方式中，与包括向癌症患者给药至少一群体的表达(iii)的aCAR但缺乏和(iii)的iCAR的免疫效应细胞的治疗相比，该治疗导致降低的中靶偏离肿瘤反应性。

在一些实施方式中，如上所限定的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞在其表面上表达包括特异性结合肿瘤相关抗原或抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域的aCAR，以及包括特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的，至少在肿瘤起源组织中表达的抗原的或管家蛋白的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的细胞外结构域的iCAR。

在一些实施方式中，如上所限定的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞在其表面上表达包括特异性结合肿瘤相关抗原或抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域的aCAR，以及包括特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的，至少在肿瘤起源组织中表达的抗原的或管家蛋白的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体(诸如HLA基因(包含例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-K、HLA-L、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR))的细胞外结构域的iCAR。

在一些实施方式中，如上所限定的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞在其表面上表达包括特异性结合肿瘤相关抗原或抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域的aCAR，以及包括特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的，至少在肿瘤起源组织中表达的抗原的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体(诸如HLA-A)的细胞外结构域的iCAR。

在一些实施方式中，给药多于一群体的免疫效应细胞，并且不同的群体表达特异性结合不同基因产物的细胞表面表位的aCAR和iCAR的不同对。

在一些实施方式中，用于治疗癌症的方法中使用的安全效应免疫细胞选自T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。在一些实施方式中，安全效应免疫细胞是自体或通用(同种异体)效应细胞。在一些实施方式中，在上文限定的任何一种治疗癌症的方法中使用的iCAR针对其上存在aCAR的目标抗原的患者的所有组织，其中aCAR的目标抗原是抗原的非多态性细胞表面表位或存在的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，并且所述表位是肿瘤相关抗原或至少由相关肿瘤和正常组织的细胞共享。

在一些实施方式中，癌症选自急性髓性白血病[LAML]、肾上腺皮质癌[ACC]、膀胱尿路上皮癌[BLCA]、脑低级胶质瘤[LGG]、乳腺浸润癌[BRCA]、宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌[CESC]、胆管癌[CHOL]、结肠腺癌[COAD]、食道癌[ESCA]、多形性成胶质细胞瘤[GBM]、头颈鳞状细胞癌[HNSC]、肾嫌色细胞癌[KICH]、肾脏肾透明细胞癌[KIRC]、肾脏肾乳头状细胞癌[KIRP]、肝脏肝细胞癌[LIHC]、肺腺癌[LUAD]、肺鳞状细胞癌[LUSC]、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBC]、间皮瘤[MESO]、卵巢浆液性囊腺癌[OV]、胰腺癌[PAAD]、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤[PCPG]、前列腺腺癌[PRAD]、直肠腺癌[READ]、肉瘤[SARC]、皮肤黑素瘤[SKCM]、胃腺癌[STAD]、睾丸生殖细胞肿瘤[TGCT]、胸腺瘤[THYM]、甲状腺癌[THCA]、子宫癌肉瘤[UCS]、子宫内膜癌[UCEC]、葡萄膜黑色素瘤[UVM]。

在一些实施方式中，用于治疗癌症用途的iCAR和/或pCAR是本文所述的任何iCAR和/或pCAR。在一些实施方式中，用于治疗癌症(诸如上述任何一种癌症类型)的iCAR和/或pCAR针对或特异性结合HLA基因的单一等位基因变体(包含例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-K、HLA-L、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR、HLA-B基因或HLA-C基因，或针对表8中列出的基因的单一等位基因变体。在一些实施方式中，用于治疗癌症(诸如上述任何一种癌症类型)的iCAR针对或特异性结合HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单一等位基因变体或针对表8中列出的基因的单一等位基因变体；以及用于治疗癌症(诸如上述任何一种癌症类型)的aCAR针对或特异性结合选自表1中列出的抗原(诸如CD19)的非多态性细胞表面表位。

对于口服给药，药物制剂可以呈液体形式，例如溶液、糖浆剂或混悬剂，或者可以作为在使用前用水或其他合适的媒介物重构的药物产品存在。这样的液体制剂可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂来制备，添加剂为诸如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如杏仁油、油性酯或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。药物组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，其通过常规手段用药学上可接受的赋形剂来制备，诸如粘合剂(例如，预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。可以通过本领域公知的方法将片剂包衣。

用于口服给药的制剂可以适当地配制成提供活性化合物的控释。

对于口含(颊)给药，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。

可以将组合物配制成用于通过注射，例如通过推注或连续输注进行肠胃外给药。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可以采取如混悬剂、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代地，活性成分可以是粉末形式，以便在使用前与合适的媒介物(例如无菌无热原水)一起构制。

组合物也可以配制成直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质，诸如可可脂或其他甘油酯。

对于通过吸入给药，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾剂形式方便地递送根据本发明的用途的组合物。在加压气溶胶的情况下，可通过提供阀门以递送计量的量来确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，其含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

为了清楚起见，并且绝不限制本教导的范围，除非另外指出，否则表示数量、百分比或比例以及本文引用的其他数值的所有数字在所有情况下均应解释为被术语“约”修饰。因此，本说明书中记载的数字参数是近似值，其可以根据期望的结果而变化。例如，可以根据所报告的有效数字的个数并通过应用普通的舍入技术来解释每个数值参数。

如本文所用，术语“约”是指还包含高于或低于指示值的10％或更少的值。

示例性实施方式

在一些实施方式中，本发明的方法提供了以下示例性实施方式。

1.一种核酸分子，其包括编码能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)或保护性嵌合抗原受体(pCAR)的核苷酸序列，其中iCAR或pCAR包括与多态性细胞表面表位的单一等位基因变体特异性结合的细胞外结构域以及包括抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域，该多态性细胞表面表位的单一等位基因变体在哺乳动物肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)而不存在，但至少在相关的哺乳动物正常组织的所有细胞上存在。

2.权利要求1的核酸分子，其中，多态性细胞表面表位是管家基因产物的，诸如HLA基因，G蛋白偶联受体(GPCR)，离子通道或受体酪氨酸激酶，优选为HLA-A、HLA-B或HLA-C；或是选自表8的基因的多态性细胞表面表位。

3.权利要求1的核酸分子，其中，所述细胞外结构域包括(i)抗体、其衍生物或片段，诸如人源化抗体；人抗体；抗体的功能片段；单域抗体，诸如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)；(ii)抗体模拟物，诸如affibody分子；affilin；affimer；affitin；alphabody；anticalin；avimer；DARPin；fynomer；Kunitz结构域肽；和monobody；或(iii)适体。

4.权利要求1的核酸分子，其中，所述哺乳动物组织是人组织，并且所述相关的哺乳动物正常组织是发展成肿瘤的正常组织。

5.权利要求1的核酸分子，其中，所述效应免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。

6.权利要求1的核酸分子，其中，所述能够抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与免疫检查点蛋白的信号转导元件同源。

7.权利要求6的核酸分子，其中，所述免疫检查点蛋白选自由以下组成的组：PD1；CTLA4；BTLA；2B4；CD160；CEACAM，诸如CEACAM1；KIR，诸如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8和CD94–NKG2A；LAG3；TIM3；T细胞活化的V结构域Ig抑制物(VISTA)；干扰素基因刺激蛋白(STING)；含有免疫受体酪氨酸类抑制性基序(ITIM)的蛋白，T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)，以及腺苷受体(例如A2aR)。

8.权利要求1的核酸分子，其中，所述细胞外结构域通过柔性铰链和跨膜经典基序融合至所述细胞内结构域。

9.一种载体，包括权利要求1至8中任一项的核酸分子，以及与该核酸分子可操作地连接的至少一个控制元件，诸如启动子。

10.权利要求9的载体，还包括含有编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子，该aCAR包括特异性结合抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的细胞外结构域，其中所述表位是肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享，以及包括活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域。

11.权利要求10的载体，其中，aCAR的细胞外结构域特异性结合抗原的非多态性细胞表面表位，而iCAR的细胞外结构域特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体。

12.权利要求10或11的载体，其中，aCAR的细胞外结构域特异性结合选自表1中列出的抗原(诸如CD19)的非多态性细胞表面表位。

13.权利要求10的载体，其中，活化或共刺激效应免疫细胞的所述至少一种信号转导元件与以下同源：例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)；活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，诸如KIR2DS和KIR3DS，或衔接分子诸如DAP12；或例如CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)或CD134(OX40)的共刺激信号转导元件。

14.权利要求10的载体，其中，核苷酸序列在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列之间包括内部核糖体进入位点(IRES)。

15.权利要求14的载体，其中，编码aCAR的核苷酸序列在编码iCAR的核苷酸序列的下游。

16.权利要求10的载体，其中，核苷酸序列包括在编码aCAR的核苷酸序列与编码iCAR的核苷酸序列之间的病毒自切割2A肽。

17.权利要求16的载体，其中，病毒自切割2A肽选自由以下组成的组：来自明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A、来自马鼻炎病毒A型(ERAV)的E2A以及来自猪捷申病毒1(PTV1)的P2A。

18.权利要求10的载体，包括编码通过柔性接头连接至所述iCAR的所述组成性aCAR的核苷酸序列。

19.一种制备如权利要求1至8中限定的能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的方法，该方法包括：

(i)从至少一个已知变体数据库中检索蛋白编码基因的人类基因组变体列表；

(ii)通过以下步骤过滤在(i)中检索到的变体列表：

(a)选择与其对应的参考等位基因相比，导致由相应基因编码的蛋白中氨基酸序列变异的变体，

(b)选择其中氨基酸序列变异是在编码的蛋白的细胞外结构域中的基因的变体，

(c)选择至少在一种肿瘤中经历杂合性丧失(LOH)的基因的变体，以及

(d)选择至少在根据(c)的其经历LOH的至少一种肿瘤的起源组织中表达的基因的变体，从而获得在由相应基因编码的蛋白中的细胞外结构域中具有氨基酸序列变异，在至少一种肿瘤中由于LOH而丧失，并且至少在至少一种肿瘤的起源组织中表达的变体的列表；

(iii)限定包括来自(ii)中获得的列表中的至少一个单一变体的序列区，亚克隆并表达包括至少一个单一变体的序列区以及包括对应参考等位基因的序列区，从而获得相应的表位肽；

(iv)选择iCAR结合结构域，其与(iii)中获得的由克隆的序列区编码的表位肽或者与由对应的参考等位基因编码的表位肽特异性结合；以及

(vii)制备如权利要求1至8中任一项限定的iCAR，每个都包括如(iv)中限定的iCAR结合结构域。

20.权利要求19的方法，其中每个变体的次要等位基因频率等于或超过1、2、3、4或5％。

21.一种用于制备安全效应免疫细胞的方法，包括：(i)用权利要求1至8中任一项的包括编码iCAR的核苷酸序列的核酸分子转染针对肿瘤相关抗原的TCR工程化效应免疫细胞，或用权利要求9的载体转导该细胞；或者(ii)用权利要求1至8中任一项的包括编码iCAR的核苷酸序列的核酸分子和权利要求10至13中任一项限定的包括编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子转染天然效应免疫细胞；或用权利要求10至18中任一项的载体转导效应免疫细胞。

22.由权利要求21的方法获得的安全效应免疫细胞。

23.权利要求22的安全效应免疫细胞，在其表面上表达包括特异性结合抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域的aCAR和包括特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的不同的抗原的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体的细胞外结构域的iCAR。

24.权利要求22或23的安全效应免疫细胞，其中，aCAR的细胞外结构域特异性结合选自表1中列出的抗原(诸如CD19)的非多态性细胞表面表位。

25.权利要求22的安全效应免疫细胞，其中，aCAR和iCAR作为分离的蛋白存在于细胞表面上。

26.权利要求22的安全效应免疫细胞，其中，所述编码iCAR的核苷酸序列的表达水平大于或等于编码aCAR的核苷酸序列的表达水平。

27.一种为患有以LOH为特征的肿瘤的受试者选择个性化生物标志物的方法，该方法包括

(i)从该受试者获得肿瘤活检；

(ii)从该受试者获得正常组织的样本，例如PBMC；

(iii)鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织的细胞表达的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，

从而鉴定出该受试者的个性化生物标志物。

28.一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，包括向该患者给药权利要求22的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，该单一等位基因变体在肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)不存在，但至少存在于患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上。

29.权利要求22的安全效应免疫细胞，用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者的用途，其中iCAR针对编码多态性细胞表面表位的单一等位基因变体，该单一等位基因变体在肿瘤细胞中由于杂合性丧失(LOH)不存在，但至少存在于患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上。

30.权利要求29的用途的安全效应免疫细胞，其中，与包括向癌症患者给药至少一群体的表达(iii)的aCAR但缺乏和(iii)的iCAR的免疫效应细胞的治疗相比，该治疗导致降低的中靶偏离肿瘤反应性。

31.权利要求29的用途的安全效应免疫细胞，在其表面上表达包括特异性结合肿瘤相关抗原或抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域的aCAR，以及包括特异性结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的，至少在肿瘤起源组织中表达的抗原的或管家蛋白的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体(诸如HLA-A)的细胞外结构域的iCAR。

32.权利要求28的用途的安全效应免疫细胞，其是自体或通用(同种异体)效应细胞。

33.权利要求28至32中任一项的用途的安全效应免疫细胞，选自T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。

34.两种或更多种核酸分子的组合，每一种包括编码受控效应免疫细胞活化系统的不同成员的核苷酸序列，所述核酸分子形成单个连续核酸分子或包括两个或更多个单独的核酸分子，其中受控效应免疫活化系统指导效应免疫细胞杀灭由于杂合性丧失(LOH)而丧失了一个或多个染色体或其部分的肿瘤细胞，并留下相关正常组织的细胞，以及其中

(a)第一成员包括活化嵌合抗原受体(aCAR)多肽，该活化嵌合抗原受体(aCAR)多肽包括与抗原的非多态性细胞表面表位或与不同多态性细胞表面表位的单一等位基因变体特异性结合的第一细胞外结构域，并且所述非多态性或多态性细胞表面表位是肿瘤相关抗原或是被相关不正常和正常哺乳动物组织的细胞共享的；以及

(b)第二成员包括调控多肽，该调控多肽包括与不正常的哺乳动物组织由于LOH而不表达的但存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体特异性结合的第二细胞外结构域。

35.权利要求34的组合，其中，第一成员选自：

(a)组成性aCAR，其还包括含有活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域；以及

(b)条件性aCAR，其还包括含有用于异二聚化小分子的结合位点的第一成员和任选地至少一种共刺激信号转导元件，但缺少活化信号转导元件的细胞内结构域；以及第二成员是：

(c)抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其还包括含有抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域；或

(d)保护性嵌合抗原受体(pCAR)，其还包括含有用于脱落酶的底物的细胞外调节区；包括用于膜内切割蛋白酶的底物的跨膜经典基序；以及细胞内结构域，所述细胞内结构域包括活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件和用于异二聚化小分子的结合位点的第二成员。

36.权利要求34或35的组合，其中：

(i)iCAR或pCAR的细胞外结构域特异性结合与aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单一等位基因变体。

(ii)所述pCAR或iCAR的细胞外结构域特异性结合所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同抗原的不同多态性细胞表面表位的单一等位基因变体；或

(iii)所述pCAR或iCAR的细胞外结构域特异性结合所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同多态性细胞表面表位的不同单一等位基因变体。

37.权利要求34的组合，其中，所述用于脱落酶的底物是用于去整合素和金属蛋白酶(ADAM)或β-分泌酶1(BACE1)的底物。

38.权利要求37的组合，其中，所述底物形成细胞外结构域的一部分，并包括Lin12/Notch重复序列和ADAM蛋白酶切割位点。

39.权利要求34的组合，其中，所述用于膜内切割蛋白酶的底物是用于SP2、y-分泌酶、信号肽肽酶(spp)、spp样蛋白酶或菱形蛋白酶的底物。

40.权利要求39的组合，其中，所述底物形成跨膜经典基序的一部分，并且与Notch、ErbB4、E-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白、肝配蛋白B2、淀粉样蛋白前体蛋白或CD44的跨膜结构域同源/由其衍生。

41.权利要求34的组合，包括编码所述条件性aCAR的作为分开的蛋白的细胞外结构域和细胞内结构域的核苷酸序列，其中每个结构域独立地融合至跨膜经典基序，并且包括异二聚化小分子的结合位点的不同成员。

42.权利要求34的组合，其中，所述用于异二聚化小分子的结合位点的所述第一和第二成员中的每一个衍生自选自以下的蛋白：

(i)他克莫司(FK506)结合蛋白(FKBP)和FKBP；

(ii)FKBP和钙调磷酸酶催化亚基A(CnA)；

(iii)FKBP和亲环蛋白；

(iv)FKBP和FKBP-雷帕霉素相关蛋白(FRB)；

(v)促旋酶B(GyrB)和GyrB；

(vi)二氢叶酸还原酶(DHFR)和DHFR；

(vii)DmrB均二聚结构域(DmrB)和DmrB；

(viii)PYL蛋白(又称脱落酸受体，以及RCAR)和ABI；

(ix)GAI拟南芥蛋白(又名赤霉酸不敏感和DELLA蛋白GAI；GAI)和GID1拟南芥蛋白(也称为赤霉素受体GID1；GID1)。

长表格

该专利申请含有长表格部分。表格的副本通过随附的CD-ROM同时提交。

实施例

关于实施例，采用以下术语。

当使用术语染色体时，通常指SNP所在的染色体。对于SNP分析，位置是指SNP的基因组位置(组装GRCh37.p13)。snp_id在使用时指的是dbSNP rs ID(在存在的情况下)。

术语“ref”是指参考核苷酸等位基因。术语“alt”是指替代核苷酸等位基因。

术语“品质”是指来自外显子集成联合(ExAC)的品质得分。术语“过滤器_状态”是指来自ExAC的过滤器信息。

术语“等位基因_频率”是指来自ExAC的总体等位基因频率。术语“最大_等位基因_频率”是指最常见的替代等位基因的总体等位基因频率(通常，仅当SNP在相同位点具有多于两个替代等位基因时才有意义，且这通常都意味着测序错误)。

术语“het_等位基因_计数”是指ExAC中杂合子的参与者数。术语“AFR_AF”是指来自非洲基因组的次要等位基因频率。术语“AMR_AF”是指拉丁裔基因组中次要等位基因频率。术语“EAS_AF”是指东亚基因组中次要等位基因频率。术语“FIN_AF”是指芬兰基因组中次要等位基因频率。术语“NFE_AF”是指非芬兰-欧洲基因组中次要等位基因频率。术语“OTH_AF”是指其他基因组中次要等位基因频率。术语“SAS_AF”是指南亚基因组中次要等位基因频率。

术语“最大_AF”是指在ExAC中分类的群体中的最大次要等位基因频率(0.5是允许的最大等位基因频率)。

术语“基因”是指SNP落入其中的基因的HUGO符号。

术语“hgnc_ID”是指SNP落入其中的基因的HUGO基因命名委员会数字ID。

术语“后果”是指SNP对翻译的蛋白产物的影响。可以是以下之一，包含：错义_变体，移码_变体，框内_缺失，停止_获得。

术语“蛋白_后果”报告了氨基酸替换及其在参考蛋白转录物上的位置(例如p.Arg482Gln)。

术语“aa_受影响”是指受影响的氨基酸在共有蛋白转录物上的数字位置。

术语“等位基因_1”是指由参考等位基因编码的氨基酸。

术语“等位基因_2”是指由替代等位基因编码的氨基酸。

术语“sift_得分”是指通过SIFT算法对氨基酸替换的预测功能作用的得分和解释。使用版本sift5.2.2。得分范围为0-1。低分意味着氨基酸替换更可能被容忍。

术语“polyphen_得分”是指通过polyphen算法对氨基酸替换的预测功能作用的得分和解释。使用PolyPhen(v2.2.2)。得分范围为0-1。低分意味着氨基酸替换更可能是有害的。

术语“polyphen_数字”是指从polyphen算法中提取的仅数字得分。

术语“蛋白_结构域_受影响”是指基于以下算法的预测蛋白结构域：Gene3D、hmmpanther、Prosite。

术语“BLOSUM_得分”是指基于来自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ToolBox/C_DOC/lxr/source/data/BLOSUM62的BLOSUM62矩阵的氨基酸替换的得分。负得分表示在进化中随着时间的推移发生频率较低的氨基酸替换(更可能影响蛋白功能)。

术语“等位基因_1_一_字母”是指参考氨基酸等位基因的一个字母氨基酸代码。

术语“等位基因_2_一_字母”是指替代氨基酸等位基因的一个字母氨基酸代码。

术语“单_等位基因_表达”是指SNP落入的基因在人中是否经历单等位基因表达。由Savova等人建立的数据库用于此标注⁷。此列中的1表示基因显示单等位基因表达。此列中的0表示基因在Savova等人数据库中未显示单等位基因表达。此列中的NA表示基因未在Savova等人文章中进行标注。

术语“细胞外”是指SNP是否落在受影响蛋白的细胞外结构域中。此列中的1表示SNP在细胞外结构域中，而0则表示不在细胞外结构域中。Uniprot用于标注蛋白结构域。

术语“Pdb_id”是指受影响的蛋白的蛋白数据库ID(如果存在)。在一个蛋白存在许多蛋白数据库条目的情况下，则仅包含第一个ID。

术语“aa_背景_21aa_等位基因_1”是指在共有蛋白序列上围绕SNP氨基酸的21个氨基酸的窗口。该序列由共有蛋白序列前面部分中的10个氨基酸组成。进行检查以确保参考氨基酸在受影响的位置处与共有蛋白序列匹配。如果这两个氨基酸不相同，则该条目显示为“基于共有同种型的与uniprot fasta的差异”。

术语“aa_背景_21aa_等位基因_2：与上面相同的氨基酸窗口，但是将氨基酸等位基因2插入中间。

术语“gtex_平均：跨组织的平均基因表达(以RPKM)。这由来自GTEX的跨组织的RPKM中值的平均值组成。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么此条目中报告的值将是3.33。

术语“gtex_最小：跨所有组织的组织的最低基因表达。该值源自跨所有组织中基因表达的中值列表。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么此条目中报告的值将是2。

术语“gtex_最大：跨所有组织的组织的最高基因表达。该值源自跨所有组织中基因表达的中值列表。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么此条目中报告的值将是5。

术语“gtex_std_dev：给定基因的跨组织的基因表达值的标准偏差。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么此条目中报告的值将是1.5。

术语“细胞_表面_蛋白_图谱：用于是否将该蛋白标注为细胞表面蛋白图谱中的膜蛋白的二进制标记(wlab.ethz.ch/cspa/)。1表示该基因在该数据库中标注为膜蛋白。

术语“人_蛋白_图谱_膜_蛋白：用于是否将该蛋白标注为在人蛋白图谱中的膜蛋白的二进制标记(https://www.proteinatlas.org/)。1表示该基因在该数据库中标注为膜蛋白。

术语“亚细胞_谱图_蛋白质组_膜_蛋白：用于是否将该蛋白标注为蛋白组的亚细胞谱图中的膜蛋白的二进制标记(http://science.sciencemag.org/content/early/2017/05/10/science.aal3321/)。1表示该基因在该数据库中标注为膜蛋白。

术语“n_膜_数据库_w_基因：具有标注为该基因在细胞膜上表达的基因的数据库总数。最大值＝3，最小值＝0。

术语“膜_蛋白_判定：对包含该基因的膜数据库数量的文本解释。如果该基因包含在一个数据库中，则判定为“低置信度”膜蛋白。如果该基因包含在两个数据库中，则判定为“中等置信度”膜蛋白。如果该基因包含在三个数据库中，则判定为“高置信度”膜蛋白。

术语“比率_gtex_std_dev_与_平均：跨组织基因表达的标准偏差与跨组织平均基因表达的比率。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么此条目中报告的值将是1.5/3.33＝0.45。这意为是对跨组织表达的均匀性的度量。低的值表示该基因均匀表达。高的值表明该基因倾向于在某些组织而不是其他组织中表达。

术语“普遍_表达：基因是否似乎被普遍表达的二进制标记。如果gtex_平均>10,gtex_最小，则表示该基因普遍表达。术语“>1”，且比率_gtex_std_dev_与_平均<1。此列中的1表示所讨论的基因符合这些标准。

术语“疾病：在电子表格这一行中，分析的疾病的LOH数据的TCGA条形码。

术语“平均_表达_在_组织”：分析的组织中的平均基因表达。几种组织分类可以映射到单个TCGA肿瘤类型。文件“tcga_疾病_组织_查找.txt”中给出了从GTEX中的组织到TCGA肿瘤类型的映射。下面给出了代表性样本：

术语“平均_表达_在_其他_组织：除所分析的组织外，在所有其他组织中的平均基因表达。例如，如果所分析的基因是PSMA(前列腺特异性基因)，那么当所分析的肿瘤类型是PRAD(前列腺腺癌)时，该值将非常低。

术语“科恩氏_d：科恩氏d(Cohen’s d)是在所分析的组织相对于所有其他组织中的表达的分离的度量。这意为是对该基因在所分析的组织中独特表达的程度的度量。高科恩氏d表明该基因在所分析的组织中独特表达，并因此可能是好的aCAR靶标。

术语“比例_w_LOH_相对：所分析的肿瘤类型中显示出LOH证据的肿瘤比例。判定暗示LOH的基因组区段的阈值为-0.1(以相对拷贝数单位)。区段的相对拷贝数是肿瘤中的拷贝数信号除以匹配正常中的拷贝数信号的对数。这些数据是从cbio门户获得的，并且该技术已在第1部分中进行了验证。

术语“CI_95_低_相对：在该基因座处经历LOH的肿瘤比例上的95％置信区间的下边界。R的prop.test函数用于此计算。此函数使用Yates的连续性校正来计算二项式置信区间。

术语“CI_95_高_相对：在该基因座处经历LOH的肿瘤比例上的95％置信区间的上边界。R的prop.test函数用于此计算。此函数使用Yates的连续性校正来计算二项式置信区间。

术语“mutsig_命中_在_chr：通过统计学显著性(q-值<0.25)的与SNP在相同染色体上的基因作为癌症驱动。使用Mutsig 2.0算法。格式为“基因符号，q＝q-值；基因符号2，……”

术语“tsg_在_chr_突变_在_疾病：用于通过mutsig的统计学意义的基因之一是否是肿瘤抑制基因的二进制指示变量。用于该标注的肿瘤抑制基因的清单是由Vogelstein等人⁹发表的表格中的清单。此列中的1表示该基因被标注为肿瘤抑制基因。

术语“标志性_tsg_在_chr_突变的_在_疾病：用于在所分析的肿瘤类型中鉴定为显著突变以及与SNP在相同染色体上的基因中的任何一个是否是“标志性”肿瘤抑制基因的二进制指标变量。“标志性”肿瘤抑制基因是少数经过充分验证的更有可能在肿瘤发展的早期发生突变的肿瘤抑制基因。这些基因是：TP53、PTEN、APC、MLL3、MLL2、VHL、CDKN2A和RB1。此列中的1表示这些标志性TSG之一与所讨论的SNP存在于同一条染色体上，并且在所分析的肿瘤类型中发生显著突变。

术语“gistic_缺失_n_峰”：SNP所落在的染色体上的GISTIC峰的数量。较高的数字表明(松散地)存在更多的选择性力驱动该染色体上遗传物质的丧失。

术语“gistic_缺失_最佳_q_值：SNP所落在的染色体上基因组丧失的最低GISTICq-值。极低的q-值表明存在显著的选择压力，使染色体上某处的基因组物质丧失。

术语“比例_的_患者_符合的：在肿瘤中具有i)SNP的种系杂合性和ii)SNP的LOH的患者的估计比例。具有SNP的种系杂合性的患者比例的估计假设符合Hardy-Weinberg平衡，使用等式杂合体比例＝2pq。其中p是SNP的总体等位基因分数，以及q＝1-p。

术语“比例_的_患者_符合_最大_种族_目标：在肿瘤中具有i)SNP的种系杂合性和ii)SNP的LOH的患者的估计比例。具有SNP的种系杂合性的患者比例的估计假设符合Hardy-Weinberg平衡，使用等式杂合体比例＝2pq。其中p是SNP的最大群体限制性等位基因分数，以及q＝1-p。例如，在一些情况下，使用的群体可能是非洲人，而在一些情况下可能是南亚人。

术语“累积_得分：量化SNP是iCAR靶标的良好候选者的程度的得分。得分范围从0到理论1。有关此得分的计算的更多信息，请参见标题为“对候选SNP进行排名的累积得分”的部分。

实施例1.跨癌症的HLA基因的LOH率评估

简介：

提出了一种治疗策略来解决由癌细胞中基因组丧失引起的缺陷。所提出的策略使用活化CAR T细胞(aCAR)和抑制性CAR T细胞(iCAR)的组合，以更安全地靶向已经丧失编码细胞膜蛋白的母本和父本等位基因杂合的基因组区段(即，多态性蛋白编码改变)的肿瘤。

如果iCAR的靶标仅由非肿瘤组织表达，则iCAR可以降低CAR-T治疗的偏离肿瘤毒性，而不会降低抗肿瘤功效。当iCAR抗原由已在肿瘤细胞中缺失的基因组的一部分编码时，就会发生其中iCAR靶标仅由非肿瘤细胞表达的这种情况。高度多态性并已知在所有细胞上表达的一个基因家族是HLA。

HLA蛋白几乎被哺乳动物细胞普遍表达，可以将非自身抗原呈递给免疫系统的细胞。HLA基因还倾向于在定量上高度表达，使其更适合治疗性靶向。HLA基因的RNA表达高于基因组中99.3％的其他蛋白编码基因(图4)。HLA基因的平均组织表达及其基因组位置包含在表3以及CD-ROM上随附的长表格中。

本部分的目的是鉴定其中HLA基因经历频繁缺失的癌症类型。次要分析包含尝试鉴定HLA基因座处基因组丧失的驱动。

我们执行了一项详细计划，以鉴定具有驱动HLA基因的频繁拷贝丧失的选择性压力的癌症(图5)。

跨肿瘤类型的HLA丧失的频率，使用ABSOLUTE数据：

我们使用了经ABSOLUTE算法处理过的TCGA的拷贝数概况，以评估HLA-A的等位基因丧失率的真实(ground-truth)估计。可公开获得的ABSOLUTE分段拷贝数数据是从(https://www.synapse.org/#！Synapse:syn1710464.2)¹下载的。ABSOLUTE算法输出单个癌症基因组内每个等位基因区段的整数拷贝水平。在丧失染色体6的单拷贝(携带HLA基因座)的情况下，则等位基因拷贝数将是：保留的区段为1，且丧失的区段为0。在拷贝中性丧失杂合性的情况下，则保留的区段将具有拷贝数2，而丧失的区段将具有拷贝数0。由ABSOLUTE处理的可公开可获得的拷贝数数据可用于12种肿瘤类型(表4)。与其他肿瘤类型相比，肺鳞状细胞癌(LUSC)具有最高的HLA-A LOH频率(图6)。子宫/子宫内膜癌(UCEC)在所有可评估的肿瘤中具有最低的HLA-A LOH频率(由于无法获得ABSOLUTE数据，因此不包含AML样本)。在HLA-A基因的588个缺失中，没有一个具有基因内断点(图7)。HLA-A基因的大多数缺失涵盖了染色体的大部分(图8)。虽然无法获得AML样本的ABSOLUTE拷贝数数据，但手动检查这些样本中的相对拷贝数数据并未发现缺失(图11)。

相比于ABSOLUTE拷贝数数据的相对拷贝数数据的验证：

我们试图得到可公开获得的尽可能多的肿瘤类型的LOH频率。但是，这些数据尚未由ABSOLUTE处理，并且待由ABSOLUTE处理的原始数据也无法公开获得。取而代之，我们使用了来自TCGA的32种肿瘤类型的相对拷贝数数据(图13)。这些数据是从cbio门户(cbioportal.org/data_sets.jsp)下载的。相对拷贝数数据获自肿瘤样本的AffymetrixSNP 6.0阵列。

为了确定是否可以从相对拷贝数数据中获得LOH的准确估计，我们针对已经具有来自ABSOLUTE的LOH数据的肿瘤用相对数据计算了LOH的比率。这些数据由分段的拷贝数文件组成。每个区段都分配有相对的拷贝-率。拷贝率定义为肿瘤相比于匹配的正常中信号密度的比的对数(在Affymetrix阵列中)。对匹配的对照(通常来自外周血)进行标准化有助于移出任何种系拷贝数变体，避免被误认为是体细胞的。如果该基因组区段的相对拷贝数低于给定的阈值，则认为该区段经历了基因组丧失。例如，如果区段321的相对拷贝数为-0.4，并且拷贝-丧失的阈值为-0.3，则可以说区段321经历了拷贝丧失，并且由于我们缺少直接等位基因信息，因此可以说也已经经历LOH。

我们首先尝试确定用于将相对拷贝数区段标记为已经历LOH的最佳拷贝数截止值。在相对拷贝数的截止值为-0.1的情况下，LOH的ABSOLUTE和相对拷贝数估计的一致性最高(表5和图9)。此阈值也恰好是在TCGA Tumorscape门户(http://portals.broadinstitute.org/tcga/home)中，TCGA拷贝数组限定拷贝-丧失所使用的阈值。相对数据与ABOSLUTE数据中具有HLA-A LOH的个体分数之间的相关性为0.55。这种合理的高度相关性使我们能够推进利用可用的相对拷贝数数据对所有肿瘤类型进行分析。

使用相对拷贝数数据在跨32种肿瘤类型中具有HLA-LOH的患者分数

针对可从TCGA获得的所有32种肿瘤计算具有HLA-A的LOH的患者比例(图10A；COAD和READ一起分析)。具有最高的HLA-A LOH比率的肿瘤是肾嫌色性癌。具有最低的HLA-A LOH比率的肿瘤是葡萄膜黑色素瘤(表6)。为确保我们在这些分析中得出的LOH比率对基因组位置的微小扰动具有鲁棒性，我们分析了HLA-A上游和下游基因的LOH比率，以查看它们的HLA-LOH比率是否与HLA-A类似。不出所料，上游和下游基因HLA-G和ZNRD1的LOH比率分别与HLA-A的完全相同。(图3A-C)。这些数据表明，HLA-A LOH判定对基因组位置的微小偏差具有鲁棒性。接下来，我们试图确定与HLA-A相比，其他HLA基因(A、B、C)是否具有相似的LOH比率。这些基因都落入染色体6p的1.3Mb区域内。在基因组距离上，这是一个很小的区域。我们对HLA-B和HLA-C重复了HLA-A分析。在所分析的32个肿瘤中，所有三个HLA基因之间的LOH模式几乎相同(图10A-C)。

向HLA-A LOH比率增加选择压力

瘤内基因组异质性是最近认识到的至今被分析的几乎所有人类癌症的特征^2,3。靶向仅存在于一部分肿瘤细胞中的基因改变的疗法可能仅影响具有所述改变的肿瘤细胞。如果抗原没有被克隆删除，则靶向肿瘤细胞上不存在的抗原的iCAR策略可能会保护某些肿瘤细胞免受aCAR攻击。因此，我们寻求鉴定其中HLA基因可能会经历克隆性LOH的肿瘤。发生在进化早期的LOH很可能是由肿瘤起始和/或维持中的选择性力驱动的。因此，我们以三种方式寻找了在染色体6(具有HLA基因座)上的肿瘤抑制因子。首先，我们在评估的每种肿瘤类型中寻找在染色体6上显著突变的基因⁴。电子表格在“chr6_mutsig_sig_基因”列下报告了染色体6上显著突变的基因。

其次，我们寻找显著缺失的基因的区域，预示了可能缺失的肿瘤抑制因子。我们使用在这些数据上运行的GISTIC2.0的结果。电子表格报告了在染色体6上GISTIC缺失峰的数量(q<0.25)，以及这些缺失峰的最低q-值。通常，GISTIC缺失峰越多并且q-值越低，则选择压力越强。但是，也有可能出现这样一种情况：其中一个非常强的GISTIC峰占主导地位，并且峰的数量将很小，但是驱动的显著性是肯定的。通常，最低的q值应与给定染色体上存在肿瘤抑制因子驱动具有最强相关性。

第三，我们将在每种肿瘤中显著突变的一组基因与一系列已知的肿瘤抑制基因重叠，以确定是否有任何突变的基因可能驱动染色体6的丧失⁵。我们能够鉴定出具有可能的突变驱动的两种肿瘤类型。在肾上腺皮质癌中，DAXX基因显著突变(q＝.0571)，以及在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，TNFAIP3基因显著突变(q＝0.00278)。DAXX编码组蛋白伴侣，其突变与肾上腺皮质癌中较长的端粒有关⁶。TNFAIP3编码NF-κB信号传导的负调节因子。该基因在DLBCL中发生的突变已证明因而升高了NF-κB信号传导⁷。

表3.分析基因组基因座的LOH。基因组坐标在hg19人类基因组组装中。

表4.有ABSOLUTE数据的肿瘤类型

表5.通过相对拷贝数数据与ABSOLUTE拷贝数数据的LOH比率的相关性(皮尔逊)。阈值为-0.1的相关峰。

表6.TCGA数据集中所有32种癌症的LOH的数量和比率。

基于上文，我们得出结论，HLA区LOH是许多肿瘤中的常见事件，但是LOH的百分比随肿瘤类型的不同而不同。因此，HLA基因是iCAR靶标的良好候选者。

实施例1的参考文献：

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2.Gibson WJ,Hoivik EA,Halle MK,Taylor-Weiner A,Cherniack AD,Berg A,Holst F,Zack TI,Werner HM,Staby KM,Rosenberg M,Stefansson IM,Kusonmano K,Chevalier A,Mauland KK,Trovik J,Krakstad C,Giannakis M,Hodis E,Woie K,BjorgeL,Vintermyr OK,Wala JA,Lawrence MS,Getz G,Carter SL,Beroukhim R,Salvesen HB.子宫内膜癌进展和腹部盆腔转移的基因组景观和演变(The genomic landscape andevolution of endometrial carcinoma progression and abdominopelvicmetastasis).《自然遗传学(Nature genetics)》.2016；48:848-855

3.Gerlinger M,Rowan AJ,Horswell S,Math M,Larkin J,Endesfelder D,Gronroos E,Martinez P,Matthews N,Stewart A,Tarpey P,Varela I,Phillimore B,Begum S,McDonald NQ,Butler A,Jones D,Raine K,Latimer C,Santos CR,Nohadani M,Eklund AC,Spencer-Dene B,Clark G,Pickering L,Stamp G,Gore M,Szallasi Z,Downward J,Futreal PA,Swanton C.多区域测序揭示的肿瘤内异质性和分支进化(Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregionsequencing).《新英格兰医学杂志(The New England journal of medicine)》.2012；366:883-892

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实施例2.经历杂合性丧失的编码表达的细胞表面蛋白的种系等位基因的全基因组鉴定

简介：

如果iCAR的靶标仅由非肿瘤组织表达，则抑制性CAR-T细胞可以降低CAR-T治疗的偏离肿瘤毒性，而不会降低抗肿瘤功效。其中iCAR靶标将仅由非肿瘤细胞表达的一种这样的情况是其中iCAR抗原由已在肿瘤细胞中缺失的基因组的一部分编码。工作流程这一部分的目标是鉴定这样的等位基因。

等位基因鉴定：

我们使用外显子集成联合(ExAC)数据库作为分析的输入(exac.broadinstitute.org)。ExAC数据库是来自各种人群水平测序研究的外显子组的汇总，总计60,706个外显子组¹。ExAC含有关于每个变体的信息，包含与替代等位基因相比的参考等位基因计数的数目(等位基因频率)。等位基因频率信息扩展到数据库中的亚群，如表7中详细说明的。

表7.ExAC数据库中的亚群。注意：并非基因组中的所有位置都在外显子组中具有足够的覆盖范围使得该表中的所有个体都可以被代表。来源：

http://exac.broadinstitute.org/faq。

群体血统	群体缩写	个体的数量
			非洲	AFR	5,203
拉丁美洲	AMR	5,789
			东亚	EAS	4,327
芬兰	FIN	3,307
			非芬兰欧洲	NFE	33,370
南亚	SAS	8,256
			其他	OTH	454

以下过滤器应用于ExAC数据库中的变体：i)变体必须影响编码的蛋白的氨基酸组成；ii)变体必须在表6中的至少一个群体中具有大于0.05(5％)的次要等位基因频率。该分析纠正了次要等位基因的等位基因分数大于0.5(50％)的情况。如果在一个位点观察到多于三个等位基因，则使用最普遍的替换(这些位点通常是测序错误的位点，并应谨慎解释)。

如果任何SNP产生以下任何变体类别，则将SNP视为对蛋白组成有影响：“错义_变体”、“框内_缺失”、“开始_丧失”、“停止_得到”、“框内_插入”、“停止_保持_变体”、“移码_变体”、“停止_丧失”、“编码_序列_变体”、“蛋白_改变_变体”。

分析开始时有9,362,319个变体，且29,904个变体通过了这两个过滤器。这些变体落入10,302个基因。分析中包含与这两个过滤器匹配的所有等位基因。

鉴定表达的基因：

我们使用基因型-组织表达(GTEX)数据库v6p(dbGaP编号phs000424.v6.p1)来鉴定在各种组织类型中表达的基因(https://gtexportal.org/home/)²。GTEX数据库由来自多种健康组织类型的8,555个人类样本的RNA测序组成。从该数据库获得了几个标注。首先，我们确定了每个基因跨所有组织的平均表达。通过取每个组织的中值表达数据并计算跨组织的这些值的平均值来计算每个基因的平均表达。这些数据是从文件GTEx_Analysis_v6p_RNA-seq_RNA-SeQCv1.1.8_gene_median_rpkm.gct中获得的，可在https://gtexportal.org/home/datasets获取。

还包含对应于每种肿瘤类型的每个基因的平均表达。为了获得这些数据，我们创建了肿瘤类型到对应正常组织的映射。例如，胰腺癌TCGA数据将用来自GTEX的胰腺组织标注。在一些情况下，映射更为近似。例如，成胶质细胞瘤表达数据由在GTEX中标注为脑的所有组织映射。附有一张带有这些映射的表格(标题为tcga_disease_tissue_lookup.txt)。计算了几种测量值来评估每种组织/肿瘤类型中每个基因的同质性或过表达。对于每种肿瘤类型，计算科恩氏D得分以建立该基因可能的过表达。在特定组织中过表达的基因可能是良好的aCAR靶标。相反，我们测量了跨组织的基因表达的标准偏差，并将其与跨所有组织的平均表达进行比较。当该比率低时，该基因在所有组织中均匀表达。在所有组织中均匀表达的基因可能是更好的iCAR靶标。

如果一个基因满足以下标准，则判定该基因为“普遍表达”：(i)跨组织的平均表达大于10RPKM。(ii)最少表达的组织的RPKM大于1。(iii)跨组织中值RPKM相比于平均RPKM的标准偏差之比小于1。只有1,092个基因被标注为普遍表达。

仅基于UniProt标注选择候选物。对于跨膜蛋白，通常可以明确预测在细胞外的蛋白区段。

表8给出了通过上述方法鉴定的具有细胞外多态性表位的1167个良好候选基因的列表，其根据染色体位置分选。

等位基因标注

等位基因对蛋白功能的影响：

对于仅有效识别丧失了膜蛋白的一个等位基因的癌细胞的iCAR，该蛋白的结构要根据所编码的等位基因而充分不同。采取了几种措施来量化每种SNP对所得蛋白的影响。首先，在“后果”列中报告了报告的SNP变体类别(例如，错义、无义)。对共有蛋白翻译的影响包含在“蛋白_后果”栏中(例如p.Arg482Gln)。SIFT算法试图预测蛋白变体是否会对蛋白结构产生影响，并从而发挥作用⁶。得分的范围可以从0(有害)到1(良性)。每个可获得得分的SNP均包含SIFT得分(版本sift5.2.2)。例如，对于移码突变无法获得得分。PolyPhen(v2.2.2)还用于预测变体可能影响蛋白结构和功能的可能性。Polyphen算法以与SIFT相反的方式报告得分，得分0对应于良性，且得分1对应于有害。

引起结构改变的氨基酸替换概率的一种经典度量是使用BLOSUM62替换矩阵。我们从

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ToolBox/C_DOC/lxr/source/data/BLOSUM62下载了BLOSUM62矩阵。每个SNP都用与其替换相对应的BLOSUM62得分进行标注。

将等位基因分类为落入蛋白的细胞外部分：

对于识别等位基因的iCAR，等位基因必须落在蛋白的细胞外部分。对于每个SNP，我们提取了在共有翻译中受影响的氨基酸的位置，并将其与Uniprot数据库中标注为细胞外的结构域进行比较。Uniprot数据库是从www.uniprot.org/downloads下载的。由于缺乏所有蛋白结构域的表征，可能会导致许多假阴性。1167个基因中共有3288个SNP标注为细胞外(表8)。

SNP的肽背景的标注：

当尝试生成识别这些序列的抗体时，所分析的等位基因的肽背景可能很重要。作为参考，我们包含由SNP编码的氨基酸之前和侧翼的10个氨基酸(总共21个氨基酸序列)。uniprot数据库用于共有氨基酸序列。我们标注了其中uniprot数据库序列与由预测位置上任一SNP编码的氨基酸不匹配的任何冲突，以便不包含任何错误序列。这21个氨基酸序列可以用作B细胞表位预测程序(诸如Beppred)的输入。

癌症特异性标注：

经历LOH的肿瘤比例

寻找其肿瘤可从所提出的治疗中受益的患者将需要iCAR靶标是在大部分肿瘤中经历杂合性丧失(LOH)的SNP。区段拷贝数文件从cbio癌症基因组学门户http://www.cbioportal.org/⁸下载。作为实例，对于所有SNP，经历LOH的葡萄膜黑色素瘤肿瘤的比例在图12中示出。

具有候选SNP的染色体上的潜在驱动改变

抗性基因组靶向治疗的一种可能机制是预期的基因组改变中的一种仅存在于一部分癌细胞中。试图鉴定可能在肿瘤发展的最早阶段出现的靶标的一种机制是鉴定每种肿瘤的驱动事件。肿瘤抑制基因失活的最常见机制是突变和随后的未突变染色体的LOH。我们试图找到驱动基因，特别是在每种肿瘤类型中可能经历此过程的肿瘤抑制基因(TSG)。我们在此分析中使用了在所有肿瘤上运行的MUTSIG 2.0的结果，以鉴定在每种肿瘤类型中均发生显著突变的基因。我们标注了显著突变的基因之一是否包含在“标志性”肿瘤抑制基因列表中，“标志性”肿瘤抑制基因列表包含TP53、PTEN、APC、MLL3、MLL2、VHL、CDKN2A、RB1。最后，如果驱动基因、TSG和“标志性”TSG的列表与SNP位于同一染色体上，则将其标注到SNP上。

虽然随后经历LOH的驱动基因的突变是可以标记可能在肿瘤进化早期发生的事件的一种机制，但另一种是含有肿瘤抑制基因的基因组区段的局部缺失。我们使用GISTIC算法来鉴定以高于平均的比率经历基因组缺失的DNA区域。GISTIC算法鉴定沿染色体臂的统计显著性的“峰”，这表明在这些区域上存在负选择性压力。对于每个SNP，我们记录了SNP落在的染色体上的缺失峰的数量。我们还记录了所有这些峰中最低的q-值。较低的q-值表明较强的选择性压力。

对候选SNP进行排名的累积得分：

为了为候选SNP提供连续性“得分”，我们结合了应该与更好的SNP候选物相关联的几种不同指标。得分由以下各项的百分等级的乘积组成：

1.具有在该SNP的LOH的肿瘤比例(越高越好)，2.等位基因的流行率(越高越好)3.跨组织的表达值的标准偏差与中值的比率(越低越好，代表更一致)4.染色体上是否有肿瘤抑制基因(有比没有好)。

为了说明这一点，我们将计算理论SNP的得分。如果仅32％的SNP在染色体上具有肿瘤抑制基因，则具有其的百分等级将为0.68。如果等位基因的次要等位基因分数为0.49(其中0.5是最高可能值)，则百分等级将为0.99。如果LOH率为0.10，并且75％的SNP具有比这更高的LOH，则百分等级将为0.25。如果跨组织表达值的标准偏差与带有该SNP的基因的中值之比为1.3，且这优于90％的其他基因，则百分等级为0.9。那么，此SNP的总得分将为0.68*0.99*0.25*0.9＝0.15。

任何得分大于0.4的SNP都被认为是“热门”。

表8.示例性iCAR靶标

实施例2的参考文献：

1.Lek M,Karczewski KJ,Minikel EV,Samocha KE,Banks E,Fennell T,O'Donnell-Luria AH,Ware JS,Hill AJ,Cummings BB,Tukiainen T,Birnbaum DP,KosmickiJA,Duncan LE,Estrada K,Zhao F,Zou J,Pierce-Hoffman E,Berghout J,Cooper DN,Deflaux N,DePristo M,Do R,Flannick J,Fromer M,Gauthier L,Goldstein J,Gupta N,Howrigan D,Kiezun A,Kurki MI,Moonshine AL,Natarajan P,Orozco L,Peloso GM,Poplin R,Rivas MA,Ruano-Rubio V,Rose SA,Ruderfer DM,Shakir K,Stenson PD,Stevens C,Thomas BP,Tiao G,Tusie-Luna MT,Weisburd B,Won HH,Yu D,Altshuler DM,Ardissino D,Boehnke M,Danesh J,Donnelly S,Elosua R,Florez JC,Gabriel SB,GetzG,Glatt SJ,Hultman CM,Kathiresan S,Laakso M,McCarroll S,McCarthy MI,McGovernD,McPherson R,Neale BM,Palotie A,Purcell SM,Saleheen D,Scharf JM,Sklar P,Sullivan PF,Tuomilehto J,Tsuang MT,Watkins HC,Wilson JG,Daly MJ,MacArthur DG,外显子集成联合(Exome Aggregation C).60,706人中蛋白质编码遗传变异的分析(Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706humans).《自然(Nature)》.2016；536:285-291

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3.

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7.

8.Cerami E,Gao J,Dogrusoz U,Gross BE,Sumer SO,Aksoy BA,Jacobsen A,Byrne CJ,Heuer ML,Larsson E,Antipin Y,Reva B,Goldberg AP,Sander C,SchultzN.cbio癌症基因组学门户：探索多维癌症基因组学数据的开放平台(The cbio cancergenomics portal:An open platform for exploring multidimensional cancergenomics data).《癌症发现(Cancer discovery)》.2012；2:401-404

实施例3.用于验证KICH样本中HLA LOH的DNA测序分析

文库制备和测序

目的——根据计算机模拟分析，选择KICH癌症作为第一种肿瘤类型对HLA LOH预测进行湿验证。目的是基于源自正常组织的DNA鉴定每个患者的HLA基因型，并然后分析癌症组织中的HLA同种异型，以试图鉴定HLA等位基因之一的丧失。

为此，确定了源自6个冷冻匹配KICH样本(正常和癌症)RC-001-RC003、TNEABA11、TNEABNWE、2rDFRAUB、2RDFRNQG、IOWT5AVJ、IOWT5N74的DNA的HLA同种异型。另外，还分析了两个DNA匹配的样本OG-001-OG-002(正常和癌症)。制备DNA文库进行序列分析以鉴定样本的HLA分型。从6个冷冻匹配的KICH样本(正常和肿瘤)中提取DNA，并按如下所述制备文库。

TruSight HLA测序文库是使用

HLA v2测序面板(依诺米那(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)在印度班加罗尔基因型技术私人有限公司(Genotypic Technology Pvt.Ltd.)制备的。

简而言之，使用TruSight HLA测序试剂盒中提供的引物生成HLA扩增子。在琼脂糖凝胶上确认扩增子，然后使用试剂盒中提供的Aample纯化珠清理(cleanup)扩增子。通过Tagmentation反应将扩增子标准化并片段化。Tagmentation后，合并各个样本的不同扩增子，并进行富集PCR。使用Nextera XT Index试剂盒v2(Illumina)在富集PCR期间对样本进行条形码编码。使用样本纯化珠纯化最终的PCR产物，然后对文库进行质量控制检查。通过Qubit荧光计(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，MA，美国)对文库进行定量，并在Agilent生物分析仪上分析其片段大小分布。

Illumina接头序列：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTC

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG

[i5，i7]——唯一的双指标序列，以鉴定样本特异性的测序数据

下表描绘了上述样本的HLA基因型。

如下所示，我们可以从分析中推断丧失的等位基因，例如，患者#RC001在肿瘤样本中表现出HLA-A30等位基因的丧失，并成为HLA-32的半合子；患者#RC003在肿瘤样本中丧失了HLA-1，并成为HLA-30的半合子。鉴定出的丧失等位基因将确定每位患者的相关iCAR。在肿瘤样本被正常细胞污染的情况下，在此方法中可能会显示明显的HLA等位基因缺失。

表9：匹配的KICH样本的HLA基因型

x-无变体读段

外显子组测序

除了HLA测序外，我们还进行了外显子组测序以确认HLA-LOH并鉴定跨基因组的额外LOH事件。

使用FastQC对Illumina配对末端原始读段(150X2，HiSeq)进行质量检查。通过Trim Galore软件处理Illumina原始读取，以使用最小读取长度50bp和最低基本质量30的参数进行接头剪切和低质量碱基修剪。使用Bowtie2将经过处理的读段与参考人类基因组(hg19)进行比对。然后处理每个样本的比对.bam文件，以获取最终的PCR重复删除的.bam文件，并使用Qualimap检查比对质量。

使用SAMtools和BCFtools鉴定变体。在这种情况下，进行联合基因分型以鉴定每对样本中的变体(每个正常和肿瘤对)。因此，为每对生成一个合并的.vcf。使用>20的读段深度阈值和>30的映射质量，从这些合并的.vcf文件中的每个文件中鉴定出潜在的变体。从每对过滤的合并的.vcf中，生成按样本的.vcf文件。使用Variant Studio，对已过滤的变体进行了基因、蛋白变化和变体影响的标注。

下表描述了上述样本的染色体丧失程度。RC001、RC002和RC003表现出广泛的染色体丧失，包含编码HLA基因的染色体6，因此，对于这些样本，HLA可以用作iCAR靶标，此外还有许多在染色体1、2、3、4(RC002)、5、6、8(RC003)、9(RC001，RC002)、10(RC001，RC003)、11(RC003)、13(RC001，RC003)、14(RC002)、17(RC001，RC003)、19(RC001)、21(RC001，RC003)、22(RC001，RC002)上编码的其他靶标。

表10.染色体丧失

+约50％的细胞的LOH(染色体丧失)

++几乎100％的细胞的LOH(染色体丧失)

对于RC001，图14描绘了与在染色体17上编码的肿瘤抑制蛋白TP53相邻的染色体区域的丧失。被鉴定为iCAR靶标的染色体17上编码的基因可用于治疗患者RC001。

缩写：ADP，二磷酸腺苷；ALL，急性淋巴细胞白血病；AML，急性髓性白血病；APRIL，增殖诱导配体；BAFF，TNF家族的B细胞活化因子；BCMA，B细胞成熟抗原；BCR，B细胞受体；BM，骨髓；CAIX，碳酸酐酶IX；CAR，嵌合抗原受体；CEA，癌胚抗原；CLL，慢性淋巴细胞性白血病；CNS，中枢神经系统；CSPG4，硫酸软骨素蛋白聚糖4；DC，树突状细胞；ECM，细胞外基质；EGFR，表皮生长因子受体；EGFRvIII，EGFR的变体III；EphA2，产生促红细胞生成素的肝细胞癌A2；FAP，成纤维细胞活化蛋白；FR-α，叶酸受体-α；GBM，多形性成胶质细胞瘤；GPI，糖磷脂酰肌醇；H&N，头和颈；HL，霍奇金淋巴瘤；Ig，免疫球蛋白；L1-CAM，L1细胞粘附分子；MM，多发性骨髓瘤；NB，神经母细胞瘤；NF-KB，核因子-KB；NHL，非霍奇金淋巴瘤；NK，自然杀伤细胞；NKG2D-L，NKG2D配体；PBMC，外周血单核细胞；PC，浆细胞；PLL，前淋巴细胞性白血病；PSCA，前列腺干细胞抗原；PSMA，前列腺特异性膜抗原；RCC，肾细胞癌；ROR1，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1；TCL，T细胞白血病/淋巴瘤；Th2，辅助性T细胞2；TNBC，三阴性乳腺癌；TNFR，肿瘤坏死因子受体；VEGFR-2，血管内皮生长因子2。

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实施例4.在蛋白水平的LOH验证

通过使用等位基因特异性抗体对正常与肿瘤细胞样本进行差异染色，可以在蛋白水平上检测LOH。例如，可以使用对患者的HLA同种异型有特异性的市售HLA抗体对癌症样本中的HLA-LOH进行验证。下表11详述了可以使用的可获得的等位基因特异性抗体的实例。

样本将按照以下IHC方案中所描述的进行免疫组织化学(IHC)染色。

表11：等位基因特异性抗HLA抗体

IHC方案：

冷冻的组织样本——

冷冻的组织通常固定在基于福尔马林的溶液中，并包埋在OCT(最佳切割温度化合物)中，从而可以对样本进行冷冻切片。OCT中的组织保持在-80℃下冷冻。切片前，将冷冻的块从-80℃中取出，在低温恒温室中平衡，然后切成薄片(通常5-15μm厚)。将切片安装在组织学载玻片上。载玻片可以存储在-20℃至-80℃下。

IHC染色之前，将载玻片在室温(RT)下解冻10-20min。

石蜡包埋的组织——

组织被包埋在甲醛固定液中。在添加石蜡之前，通过在RT下逐步浸入浓度越来越高的乙醇(70％、90％、100％)和二甲苯中特定次数和持续时间来使组织脱水。然后，将组织包埋在石蜡中。

将石蜡包埋的组织在切片机中切成5-15μm厚的切片，漂浮在56℃水浴中，并安装在组织载玻片。载玻片可以保存在RT下。

在IHC染色之前，石蜡包埋的切片需要复水步骤。复水——通过浸入二甲苯中(2X10min)，然后降低乙醇浓度–100％X2，每次10min 95％乙醇–5min70％乙醇–5min 50％乙醇–5min在dH2O中冲洗，从而将切片复水。

免疫荧光检测：

方案：

1.在洗涤缓冲液(PBSX1)中将载玻片复水10min。沥干洗涤缓冲液。

2.进行抗原修复——如果需要(热诱导抗原修复或酶促修复)。

3.对于细胞内抗原，进行透化——将载玻片在PBSX1中的0.1％triton X-100中于RT下温育10min。

4.封闭——将组织在封闭缓冲液中在RT下封闭30min。封闭缓冲液取决于检测方法，通常为在PBSX1中的5％动物血清，或在PBSX1中的1％BSA。

5.第一抗体——根据抗体制造商的指示，在温育缓冲液(例如，1％BSA，在PBS中1％的驴血清，其他温育缓冲液也可以使用)中稀释第一抗体。将组织在稀释的第一抗体中于4℃下温育过夜。第一抗体可以是如上文所详述的单克隆抗HLA-A、抗HLA-B或抗HLA-C等位基因特异性抗体。

·如果使用了缀合的第一抗体，则避光，然后继续执行步骤8。

·作为阴性对照，仅用温育缓冲液温育组织，不使用第一抗体。

·另外，对实验中使用的单克隆抗体进行同种型匹配的对照。

·

6.6.洗涤——在洗涤缓冲液中洗涤载玻片–3X 5-15min。

7.7.第二抗体——根据抗体制造商的指示在温育缓冲液中稀释第二抗体。将组织在稀释的第二抗体中于RT下温育30-60min。避光。

8.8.洗涤——在洗涤缓冲液中洗涤载玻片–3X 5-15min。

9.9.DAPI染色——稀释DAPI温育缓冲液(～300nM-3μM)。向每个切片中加入300μl的DAPI溶液。在RT下温育5-10min。

10.10.洗涤——用X1PBS洗涤载玻片一次。

11.11.用防褪色安装介质进行安装。

12.12.保持载玻片避光。

13.13.使用荧光显微镜可视化载玻片。

显色检测：

方案：

1.1.在洗涤缓冲液(PBSX1)中将载玻片复水10min。沥干洗涤缓冲液。

2.2.进行抗原修复——如果需要——参见上文。

3.3.对于HRP试剂，用甲醇中的3.0％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性至少15min。

4.4.通过将切片浸入dH2O中5min以对其进行洗涤。

5.5.对于细胞内抗原，进行透化——将载玻片在PBSX1中的0.1％triton X-100中于RT下温育10min。

6.6.封闭——将组织在封闭缓冲液中在RT下封闭30min。封闭缓冲液取决于检测方法，通常是PBSX1中的5％动物血清或PBSX1中的1％BSA。

7.7.第一抗体——根据抗体制造商的指示，在温育缓冲液(例如，1％BSA，在PBS中1％的驴血清，其他温育缓冲液也可以使用)中稀释第一抗体。将组织在稀释的第一抗体中在4℃下温育过夜。

8.8.洗涤——在洗涤缓冲液中洗涤载玻片–3X 5-15min。

9.9.第二抗体——将组织在HRP缀合的第二抗体中于RT下温育30-60min。

10.10.洗涤——在洗涤缓冲液中洗涤载玻片3X 5-15min。

11.11.根据制造商指南添加ABC-HRP试剂。在RT下温育60min。

12.12.根据制造商指南准备DAB溶液(或其他色原)，并应用于组织切片。显色反应使表位位点变成褐色(通常几秒钟-10分钟)。当信号强度适合成像时，继续下一步骤。

13.13.洗涤——在洗涤缓冲液中洗涤载玻片–3X 5-15min。

14.14.在dH2O中洗涤载玻片–2X 5-15min。

15.15.核染色——加入苏木精溶液。在RT下温育5min。

16.16.使组织切片脱水——95％乙醇-2X 2min。100％乙醇–2X 2min。二甲苯–2X2min。

17.17.用防褪色安装介质进行安装。

18.18.使用亮视场照明可视化载玻片。

实施例5.CAR-T设计与构建

研究目的是创建一个合成受体，其将抑制CAR-T疗法的中靶“偏离肿瘤”效应。在此程度上，建立了由活化和抑制性CAR组成的CAR构建体文库。

第一组构建体包含针对HLA I型序列(HLA-A2)的抑制性CAR和针对肿瘤抗原(CD19)的活化CAR。为了验证构思的目的而使用的下一组构建体，其包含针对CD19的活化CAR序列和针对CD20的抑制性CAR序列。将构建针对通过未来生物信息学分析鉴定的目标抗原的其他构建体。将根据提出的标准(示例性标准包含但不限于靶标表达模式、靶标表达水平、抗原性等)对靶标候选物进行优先排序。已经构建了CD19aCAR、CD20iCAR和HLA-A2iCAR，如在图15和21中所描述的。

使用商业DNA合成技术设计和合成iCAR构建体。跨膜结构域和细胞内结构域直至PD-1的第一个标注的细胞外结构域(氨基酸145-288)融合到HLA-A2scFv(编码HLA-A2的DNA序列，从杂交瘤BB7.2中检索到(ATCC cat#:HB-82)，产生抗HLA-A2)下游。

将设计具有CTLA4(氨基酸161-223)或具有源自其他负免疫调节物的其他序列(例如2B4、LAG-3和BTLA-4)的相似构建体，并将其信号传导序列融合至HLA-A2scFv下游。

对于iCAR检测和分选，通过IRES序列将报道基因(例如eGFP)整合至iCAR序列下游，并随后是抗生素抗性基因(即潮霉素)，由P2A序列分开，如图15所示。

对于aCAR构建体，将CD19scFV与第二代CAR构建体融合，该第二代CAR构建体由CD8铰链序列、随后的CD28跨膜和41BB共刺激1和CD3ζ组成。也将设计和构建由其他信号传导或结构元件组成的其他aCAR构建体(例如CD28铰链、CD28信号传导结构域或CD28和41BB信号传导结构域二者)。对于aCAR检测和分选，通过IRES序列将报告基因RFP整合到aCAR序列下游，然后是抗生素抗性基因(嘌呤霉素抗性)，由P2A序列分开(图15)。

将aCAR和iCAR序列二者克隆到慢病毒转移载体中，然后使用HEK-293T包装细胞将其用于病毒颗粒生产。

实施例6.效应细胞的产生

为了研究iCAR构建体对调节CD19CAR活化的影响，构建了重组Jurkat效应细胞，如下表12中详细说明的。使用retronectin包被的(Takara)慢病毒载体结合板或在存在凝聚胺(polybrene)的情况下转导Jurkat(ATCC TIB152)、CD4+T-细胞系和Jurkat-NFAT(Jurkat细胞系购自BPS Biosciences，工程化为表达萤火虫荧光素酶蛋白，受控于NFAT反应元件)。对转导的细胞进一步进行抗生素选择，以产生表12中所述的细胞系。选择后，对细胞进行流式细胞术分析以验证在每个构建体上编码的报道蛋白的表达。

表12-重组效应细胞系

此外，将源自从健康供体获得的外周血的活化T细胞用编码aCAR、iCAR或两者的病毒颗粒以不同的感染复数(MOI)转导。基于报道基因表达的FACS选择将用于分选和选择表达不同水平的aCAR、iCAR或两者的细胞群。

实施例7.目标细胞的制备

建立了体外重组系统，用于测试iCAR构建体在抑制aCAR对偏离目标细胞的活性方面的功能。为此目的，产生了表达aCAR表位、iCAR表位或两者的目标细胞。表达aCAR表位的重组细胞代表“中靶”“肿瘤上”细胞，而同时表达aCAR和iCAR表位的细胞代表“中靶”“偏离肿瘤”健康细胞。

因为我们的第一iCAR/aCAR组分别基于HLA-A2和CD19，因此表达HLA-A2或CD19或二者的重组细胞通过用编码这些的基因的表达载体转染细胞系(例如Hela，ATCC CRM-CCL-2，Hela-荧光素酶-GenTarget SCO32-Bsd或Raji-ATCC CCL-86)来产生。

为了检测重组HLA A-2表达，插入Myc标签。对于由CD20iCAR/CD19 aCAR组成的第二个iCAR/aCAR组，构建了表达CD20或CD19或两者的重组细胞(表15中详细列出了目标细胞)。

表13-目标细胞系

测定-

iCAR的抑制作用将在体外和体内都进行测试。

在体外测定中，我们将专注于测量细胞因子分泌和细胞毒性作用，而在体内，我们将评估iCAR对“中靶偏离肿瘤”异种移植物的抑制和保护作用。通过使用报告基因将T细胞分选为iCAR/aCAR双阳性，我们将限制缺乏iCAR的T细胞污染结果。作为iCAR阻断活性的阴性对照，我们可以使用由缺乏scFv结构域的CAR转导的T细胞(即模拟转导)。

实施例8.体外测定

荧光素酶细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定

将使用工程化为表达萤火虫荧光素酶和一种或两种CAR目标抗原的上述Hela-Luc重组目标细胞进行测定。体外荧光素酶测定将根据Bright-Glo荧光素酶测定制造商的方案(Promega)进行，并以生物发光作为读数。

T细胞(用iCAR和pCAR两者或iCAR和aCAR或aCAR或模拟CAR转导)将与表达HLA-A2或CD19或HLA-A2和CD19两者或CD20或CD20和CD19二者的重组目标细胞以不同的效应物与靶标比率一起温育24-48小时。细胞杀伤将通过Bright-Glo荧光素酶系统进行定量。

通过根据iCAR/aCAR表达水平对转导的T细胞群体进行分选，或通过根据其CD19、HLA-A2或CD20表达水平选择重组目标细胞的亚群体，从而优化“偏离肿瘤”细胞毒性。为了测试iCAR转导的T细胞能否在体外区分“肿瘤上”和“偏离肿瘤”细胞，我们将测试与以1:1或更高的比率的“肿瘤上”和“偏离肿瘤”细胞的混合物一起温育的转导的T细胞的杀伤作用。通过荧光素酶表达将“肿瘤上”重组细胞与“偏离肿瘤”重组细胞区分开(在给定的时间，仅一个细胞群将被工程化为表达荧光素酶基因)。在共温育24-48小时后，杀伤将被定量化。

胱天蛋白酶3活性测定——通过抗活化的胱天蛋白酶3(CASP3)检测CTL诱导的凋亡。

细胞毒性T细胞杀伤目标细胞的途径之一是通过经由Fas配体诱导凋亡。胱天蛋白酶的顺序活化在细胞凋亡的执行阶段中起重要作用。前原胱天蛋白酶3切割成胱天蛋白酶3导致构象变化和催化活性的表达。胱天蛋白酶3的切割活化形式可以被单克隆抗体特异性识别。

转导的T细胞将与预先用CFSE或其他细胞示踪染料(例如CellTrace Violet)标记的“肿瘤上”或“偏离肿瘤”重组细胞共培养2-4小时。通过内部染色试剂盒(例如Miltenyi或BD bioscience)将细胞透化并固定后，将通过特异性抗体染色(BD bioscience)来检测活化的CASP3，然后通过流式细胞术检测并定量凋亡的目标细胞。

时间间隔显微镜检查CTL

转导的T细胞将与“肿瘤上”或“偏离肿瘤”细胞一起温育长达5天。时间间隔显微镜检查将用于可视化杀伤。替代地，将进行使用活细胞数染色和CountBright珠(Invitrogen)的流式细胞术分析，以在终点时间确定目标细胞数。

为了证明aCAR/iCAR转导的T细胞在体外识别靶标的有效性，将每个重组目标细胞(“肿瘤上”或“偏离肿瘤”)用不同的报道蛋白(例如GFP和mCherry)标记。转导的T细胞(效应细胞)将与表达一种或两种目标抗原的重组细胞(目标细胞)的混合物以不同的E/T比率共同温育。将通过显微镜成像跟踪每个细胞系的命运。

细胞因子释放

在T细胞活化后，细胞分泌细胞因子，细胞因子可以被量化并用于评价T细胞活化和抑制。可以通过流式细胞术或通过经由ELISA或流式微珠阵列(CBA)测量培养基中分泌的蛋白来在细胞内检测细胞因子。

通过ELISA定量分泌的细胞因子

在将表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR两者的转导的T细胞(Jurkat或原代T细胞)与在其细胞表面表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR两者抗原的修饰的目标细胞共培养后，收集条件培养基，并通过细胞因子ELISA(IL-2、INFγ和或TNFα)，根据制造商指示(例如BioLegened或类似的)，以及通过流式微珠阵列(Miltenyi或类似的)测量细胞因子的浓度。

通过IL-2ELISA测量的iCAR特异性抑制

将Jurkat CD19aCAR和Jurkat CD19aCAR/HLA-A2iCAR效应细胞与Raji、Raji-HLA-A2和Thp1目标细胞共培养，并收集对应的上清液，用于通过ELISA进行IL-2测量，如图16A中所示。Jurkat CD19-aCAR/HLA-A2-iCAR与表达CD19的Raji目标细胞(“肿瘤”)一起温育显示IL-2分泌，但是这些效应细胞与表达CD19和HLA-A2二者的Raji-HLA-A2目标细胞(“偏离肿瘤”)一起温育导致抑制超过80％的IL-2分泌。与之不同，当将CD19aCAR Jurkat细胞与Raji或Raji-HLA-A2目标细胞一起温育时，IL-2分泌不会受到影响(图16B)。该结果与下文所述的NFAT活化测定一起指向iCAR构建体特异性保护表达在肿瘤细胞上未表达的抗原的正常细胞的效力。

通过流式细胞术定量细胞因子释放

与在其细胞表面表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR二者的目标抗原的重组目标细胞共培养6-24小时的表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR二者的转导的T细胞(Jurkat或原代T细胞)将经受高尔基(Golgi)转运阻断剂(例如布雷菲德菌素A(Brefeldin A)、莫能菌素)，以使细胞因子在细胞内积累。然后将T细胞通过内部染色试剂盒(例如Miltenyi)进行透化和固定，并用抗CD3和CD8以及IL-2和或INFγ和或TNF进行染色α。

通过流式微珠阵列(CBA)测定测量的细胞因子分泌

流式微珠阵列(CBA)用于测量各种可溶性和细胞内蛋白，包含细胞因子、趋化因子和生长因子。

用在其细胞表面上表达iCAR和aCAR二者或aCAR或iCAR目标抗原的修饰的目标细胞刺激经aCAR或aCAR和iCAR两者构建体(效应细胞)转导的T细胞(原代T细胞或Jurkat细胞)(图17A)。在共同温育数小时后，效应细胞产生并分泌细胞因子，这指示了其效应状态。收集反应的上清液，并通过多重CBA测定来测量和定量分泌的IL-2。

如图17B中所示，证明了与表达两种目标抗原的目标细胞共培养的aCAR/iCAR转导的Jurkat T细胞对IL-2分泌的特异性抑制。证明了在双CAR(aCAR/iCAR)转导的细胞与表达两个目标抗原的目标细胞共温育的情况下，与相同效应细胞与仅表达一个靶标的目标细胞共温育的情况下产生的IL-2分泌相比，在IL-2分泌方面降低了86％。

NFAT活化测定

为了确定通过NFAT活化所测量的T细胞活化，用aCAR和iCAR的不同组合转导Jurkat-NFAT细胞，如表12中详细说明的。将表达CD19aCAR、HLA-A2iCAR或两者的效应Jurkat-NFAT细胞系与表达CD19(Raji细胞“中靶”)、CD19和HLA-A2二者(Raji-HLA-A2“偏离肿瘤”)或HLA-A2(Thp1“偏离肿瘤”)的目标细胞共培养，如表13中所述。作为阳性对照，在PMA和离子霉素(Ionomycin)的存在下刺激效应细胞，从而触发NFAT信号传导所需的钙释放。在37℃下温育16小时之后，根据制造商的指示使用BPS Biosciences试剂盒“一步荧光素酶测定系统”定量荧光素酶。如所预期的，表达CD19-CAR构建体的Jurkat NFAT细胞系在存在表达CD19的Raji细胞系的情况下被特异性活化，而当这些细胞与不表达CD19的Thp1细胞系共培养时，未显示活化(图18)。

HLA-A2iCAR对CD19aCAR诱导的NFAT活化的抑制作用可见于图21中。与由仅表达CD19的Raji细胞诱导的活化相比，当与表达CD19和HLA-A2的Raji-HLA-A2共温育时，表达CD19aCAR和HLA-A2iCAR二者的Jurkat-NFAT细胞系被特异性抑制。相比之下，仅表达CD19-CAR的Jurkat-NFAT细胞系被Raji和Raji-A2细胞系二者类似地活化。在这些条件下，NFAT活化的抑制被计算为～30％(图19)。

测试了不同E/T比率的效果。以10:1、5:1、1:1的E/T比率重复测定几次。图20中给出的结果表明，更高的E/T比率可以获得增加的抑制效果。结果表示为来自每个效应细胞系和“偏离肿瘤”目标细胞共培养的平均发光值与来自和“中靶”呈递细胞共培养的平均值之比。如所示，当与表达CD19和HLA-A2蛋白的Raji-HLA-A2共温育时，表达CD19aCAR和HLA-A2iCAR二者的Jurkat-NFAT细胞系受到特异性抑制，但是，当该细胞系与仅表达CD19的Raji细胞系共培养时，未检测到抑制作用。相反，表达CD19aCAR的Jurkat-NFAT细胞系被同等活化，而不论与其共培养的表达CD19的目标细胞系(Raji或Raji-HLA-A2)。

通过CD107a染色测量的T细胞脱颗粒测定

可以通过CD107a(一种溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1))的表面表达来鉴定T细胞的脱颗粒。已证明LAMP-1的表面表达与CD8T细胞的细胞毒性有关。该分子位于溶酶体的腔侧。在活化后，CD107a被转移到活化淋巴细胞的细胞膜表面。CD107a在细胞表面瞬时表达，并通过内吞途径迅速重新内化。因此，通过在细胞刺激过程中进行抗体染色和添加莫能菌素(防止内吞的CD107a抗体复合物的酸化和随后降解)，CD107a的检测得以最大化。

在存在莫能菌素的情况下，将转导的T细胞与目标细胞温育6-24小时，并且在CD8T细胞上表达CD107a之后，使用针对T细胞表面标志物(CD3、CD8)的缀合抗体和CD107a的缀合抗体进行流式细胞术。

颗粒形成(CD107a)作为杀伤潜力的标志物。溶细胞性T细胞最关键的功能是杀伤目标细胞的能力。细胞毒性CD8+T淋巴细胞通过两个主要途径介导目标细胞的杀伤：穿孔素-粒酶介导的凋亡活化和fas-fas配体介导的凋亡诱导。这些途径的诱导取决于从响应的CD8+T细胞释放溶细胞性颗粒。脱颗粒是穿孔素-粒酶介导的杀伤的先决条件，并且是由响应抗原特异性CD8+T细胞介导的即时裂解功能所需的。细胞毒性不需要由效应CD8+T细胞从头合成蛋白；而是，位于细胞质内的预先形成的裂解颗粒以极化方式向目标细胞释放。裂解颗粒是膜结合的分泌型溶酶体，其含有由各种蛋白(包含穿孔素和粒酶)组成的致密核心。颗粒核心被含有许多溶酶体相关的膜糖蛋白(LAMP)的脂质双层包围，这些膜糖蛋白包含CD107a(LAMP-1)、CD107b(LAMP-2)和CD63(LAMP-3)。在脱颗粒过程中，裂解颗粒膜与活化的CD8+T细胞的质膜合并，然后将颗粒的内容物释放到CD8+T细胞与目标细胞之间的免疫突触中。作为该过程的结果，其中包含CD107a、CD107b和CD63糖蛋白的颗粒膜被掺入到了响应CD8+T细胞的质膜中。CD107a和b在活化T细胞的细胞表面上的高水平表达需要脱颗粒，因为脱颗粒抑制剂(诸如秋水仙碱)会大大降低CD107a和b的细胞表面表达。重要的是，这些蛋白很少存在于静息T淋巴细胞表面上。因此，用针对CD107a和b的抗体标记响应细胞并通过流式细胞术测量其表达可以直接鉴定脱颗粒的CD8+T细胞(Betts和Koup，2004)。

实验设置：

用PMA+离子霉素(阳性对照)或在其细胞表面表达iCAR+aCAR/aCAR/iCAR抗原的修饰的目标细胞刺激用iCAR+aCAR/aCAR构建体转导的PBMC(效应细胞)。在共温育的几个小时中，效应细胞脱颗粒，可以在细胞表面检测到CD107a。该表达是瞬时的，并且CD107a通过内吞途径被迅速重新内化。因此，通过在细胞刺激过程中进行抗体染色和添加莫能菌素(防止内吞的CD107a抗体复合物的酸化和随后降解)，CD107a的检测得以最大化。BFA是最佳细胞因子表达所需的。

实施例9.体内模型

人异种移植小鼠模型中的体内CTL测定

为了测试表达aCAR和iCAR两者构建体的T细胞是否可在相同生物体内区分目标细胞和“偏离目标”细胞并有效杀死目标细胞，同时保留“偏离目标”细胞，将通过体内CTL测定来评估。

用iCAR或aCAR或iCAR和aCAR二者转导的T细胞将被静脉注射到天然NOD/SCID/γc-或类似小鼠。几个小时后，将注射表达iCAR、aCAR或两者的目标细胞。这些靶标将用不同浓度(高、中和低)的CFSE/CPDE或类似的细胞示踪染料标记，这将允许它们之间的进一步区分。注射靶标后18小时，将处死小鼠，收集脾脏，并通过FACS评估特定靶标的消除。具体杀伤百分数将根据以下公式计算：

人异种移植小鼠模型中的肿瘤生长动力学

将用肿瘤细胞接种NOD/SCID/γc-或类似小鼠。接种可以是i.p/i.v.或s.c.。肿瘤细胞将表达iCAR靶标、aCAR靶标或两者。一种可能的aCAR肿瘤细胞系的实例可以是CD19阳性NALM 6(ATCC，人BALL细胞系)。表达aCAR和iCAR二者的肿瘤细胞(即“偏离肿瘤”细胞)的实例是工程化为表达iCAR表位(例如HLA-A2)的NALM 6，从而代表健康细胞。NALM 6和NALM6-HLA-A2也可工程化以表达报道基因(例如萤火虫荧光素酶)，用于容易地检测。将小鼠分为几个研究组，接种所有可能的目标细胞的组合。例如，一组将注射NALM 6细胞，而另一组将注射表达iCAR表位的NALM-6。几天后，当已经建立了肿瘤时，将向小鼠静脉内输注用aCAR或aCAR/iCAR或iCAR转导的T细胞。另外，还将包含未转导的T细胞、没有T细胞或没有信号传导结构域的情况下转导的T细胞的对照组。将监测小鼠直到肿瘤达到实验终点，即最大允许的肿瘤体积。将通过机械手段(卡尺)以及还通过使用体内成像系统(IVIS)测量肿瘤体积来进行监测。在最后一天，将处死小鼠，定量肿瘤负荷，并通过FACS分析浸润的T细胞群体。为了测试表达iCAR构建体的T细胞是否可以区分同一生物体内的目标细胞和“偏离目标”细胞，我们将向小鼠注射以几种不同比例的“肿瘤上”/“偏离肿瘤”NALM-6细胞的几种可能的混合物，然后注射表达单独的aCAR或表达aCAR和iCAR二者的转导的T细胞。在处死小鼠后，将通过流式细胞术分析两种标志物CD19和iCAR表位在脾和骨髓中“肿瘤上”和“偏离肿瘤”细胞中的存在。

转基因小鼠模型中的毒性和肿瘤生长动力学

表达人aCAR和iCAR靶标的转基因小鼠也将用于确定转导的T细胞的功效。在这些设置下，小鼠具有完整的免疫系统，并且可以评估iCAR/aCAR转导的T细胞的潜在毒性。CAR构建体将含有与人抗原相匹配的scFv，而信号传导结构域将被修饰以活化或抑制鼠T细胞。这种模型的一个实例是仅表达人HLA-A2分子同时所有其他蛋白仅是鼠类的HHD-HLA-A2小鼠。在这种情况下，CD19aCAR的scFv将针对鼠CD19同源物。将使用缺少HLA分子的人目标细胞(例如，LCL 721.221细胞或

CRL-2369^TM或类似的细胞)。靶标将被修饰以表达鼠CD19。该系统将允许监测功效和毒性问题。

mAb产生

选择在不同肿瘤中鉴定的几对保存的和丧失的等位基因变体，并且它们的多肽产物将用于使用mAb产生技术来产生变体特异性mAb。候选mAb的区分能力将通过双重染色和流式细胞术实验或免疫组织化学进行测定，如通过结合表达所选等位基因的重组细胞系来确定。

使用所有标题和章节命名仅仅是出于清楚和参考的目的，并且不应当被视为以任何方式进行限制。例如，本领域技术人员将认识到根据本文所描述的本发明的精神和范围，适当地组合来自不同标题和章节的各个方面的有用性。

本文中所引用的所有参考文献在此通过引用以其整体并入本文，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请具体地且单独地被指示出于所有目的以其整体通过引用并入。

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序列表

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Gavish-Galilee Bio Applications, Ltd.

Gross, Gideon

Gibson, Will

Dahary, Dvir

Beiman, Merav

<120> 用于制备抑制性嵌合抗原受体（iCAR）的通用平台

<130> 120575-5003-WO

<150> 62/564,454

<151> 2017-09-28

<150> 62/649,429

<151> 2018-03-28

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3432

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 aCAR_IRES_RFP_P2A_Puro 合成DNA

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

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cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840

cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900

cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960

gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020

tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080

tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140

agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200

ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260

gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320

atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380

gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440

caggccctgc cgcctcggtg agcggccgca aattccgccc ctctccctcc ccccccccta 1500

acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt 1560

ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 1620

cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 1680

tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 1740

gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 1800

aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 1860

aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 1920

taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 1980

cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa 2040

cacgataata ccatggtgtc taagggcgaa gagctgatta aggagaacat gcacatgaag 2100

ctgtacatgg agggcaccgt gaacaaccac cacttcaagt gcacatccga gggcgaaggc 2160

aagccctacg agggcaccca gaccatgaga atcaaggtgg tcgagggcgg ccctctcccc 2220

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acccagggca tccccgactt ctttaagcag tccttccctg agggcttcac atgggagaga 2340

gtcaccacat acgaagacgg gggcgtgctg accgctaccc aggacaccag cctccaggac 2400

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atgcagaaga aaacactcgg ctgggaggcc aacaccgaga tgctgtaccc cgctgacggc 2520

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aacttcaaga ccacatacag atccaagaaa cccgctaaga acctcaagat gcccggcgtc 2640

tactatgtgg accacagact ggaaagaatc aaggaggccg acaaagagac ctacgtcgag 2700

cagcacgagg tggctgtggc cagatactgc gacctcccta gcaaactggg gcacaaactt 2760

aatggatccg gcgcgacaaa ctttagcttg ctgaagcaag ctggtgacgt ggaggagaat 2820

cccggcccta tggccaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc 2880

ccccgggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc 2940

gtcgatccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc 3000

gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg 3060

accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc 3120

gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac 3180

cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc 3240

aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg 3300

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accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag 3420

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 aCAR 合成蛋白

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Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

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50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

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Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

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Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

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385 390 395 400

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RFP 合成蛋白

<400> 3

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Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr

50 55 60

Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile

65 70 75 80

Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg

85 90 95

Val Thr Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr

100 105 110

Ser Leu Gln Asp Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val

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165 170 175

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180 185 190

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<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嘌呤霉素抗性合成蛋白

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1 5 10 15

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35 40 45

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Leu Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr

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130 135 140

Val Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe

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Leu Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly

165 170 175

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180 185 190

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<211> 3669

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20 iCAR_IRES_GFP_P2A_Hygro 合成DNA

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aatggccaca agtttagcgt gtccggagag ggagagggcg acgcaaccta cggcaagctg 1980

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gacgcaatcg ccgccgccga cctgtctcag acaagcggct tcggcccttt tggcccacag 3060

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gagctgatgc tgtgggccga ggattgtcca gaggtgcgcc acctggtgca cgcagacttt 3240

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gcctgcatgg agcagcagac ccgctatttt gagaggcgcc accctgagct ggccggctct 3420

ccacggctga gagcatacat gctgcgcatc ggcctggacc agctgtatca gagcctggtg 3480

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<211> 411

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20 iCAR 合成蛋白

<400> 6

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

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His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu

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Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GFP 合成蛋白

<400> 7

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

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Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

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Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 8

<211> 344

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 潮霉素抗性合成蛋白

<400> 8

Met Asp Arg Ser Gly Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys

1 5 10 15

Phe Leu Ile Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser

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Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly

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Gly Gln Tyr Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro

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His Val Tyr His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser

165 170 175

Val Ala Gln Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro

180 185 190

Glu Val Arg His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu

195 200 205

Thr Asp Asn Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met

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225 230 235 240

Trp Leu Ala Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His

245 250 255

Pro Glu Leu Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile

260 265 270

Gly Leu Asp Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp

275 280 285

Ala Ala Trp Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala

290 295 300

Gly Thr Val Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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cagtggcggg agaaaacccc agagccacct gtgccctgcg tgcctgagca gaccgagtat 1140

gccacaatcg tgtttccatc cggaatgggc acaagctccc ctgcaaggag aggcagcgcc 1200

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tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga 1740

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tatcccgacc acatgaagca gcacgatttc tttaagagcg ccatgcctga gggctacgtg 2160

caggagcgga ccatcttctt taaggacgat ggcaactata agaccagagc cgaggtgaag 2220

ttcgagggcg acacactggt gaacaggatc gagctgaagg gcatcgactt taaggaggat 2280

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gccgataagc agaagaacgg catcaaggtc aatttcaaga tcagacacaa tatcgaggac 2400

ggctctgtgc agctggccga tcactaccag cagaacaccc caatcggcga cggacccgtg 2460

ctgctgcctg ataatcacta tctgtctaca cagagcgccc tgtccaagga ccccaacgag 2520

aagagggatc acatggtgct gctggagttt gtgaccgcag caggaatcac actgggaatg 2580

gacgagctgt ataagggcag cggcgccacc aacttctccc tgctgaagca ggcaggcgac 2640

gtggaggaga atccaggacc tatggataga agcggcaagc cagagctgac cgccacatcc 2700

gtggagaagt tcctgatcga gaagtttgac tctgtgagcg atctgatgca gctgtccgag 2760

ggagaggagt ccagggcctt ctcttttgat gtgggcggca ggggatacgt gctgagggtg 2820

aatagctgcg ccgacggctt ctataaggat agatacgtgt atagacactt tgcctccgcc 2880

gccctgccaa tcccagaggt gctggacatc ggcgagtttt ccgagtctct gacctactgt 2940

atcagccgga gagcccaggg agtgaccctg caggatctgc ctgagacaga gctgccagcc 3000

gtgctgcagc cagtggcaga ggctatggac gcaatcgccg ccgccgacct gtctcagaca 3060

agcggcttcg gcccttttgg cccacagggc atcggccagt acaccacatg gagggacttc 3120

atctgcgcca tcgccgatcc tcacgtgtat cactggcaga ccgtgatgga cgatacagtg 3180

agcgcctccg tggcacaggc cctggacgag ctgatgctgt gggccgagga ttgtccagag 3240

gtgcgccacc tggtgcacgc agactttggc agcaacaatg tgctgaccga taatggccgg 3300

atcacagccg tgatcgactg gtccgaggcc atgttcggcg attctcagta cgaggtggcc 3360

aacatcttct tttggaggcc ttggctggcc tgcatggagc agcagacccg ctattttgag 3420

aggcgccacc ctgagctggc cggctctcca cggctgagag catacatgct gcgcatcggc 3480

ctggaccagc tgtatcagag cctggtggat ggcaatttcg acgatgcagc atgggcacag 3540

ggccggtgcg acgcaatcgt gagatccggc gccggcaccg tgggccggac acagatcgca 3600

cggcggagcg ccgccgtgtg gaccgacgga tgcgtggagg tgctggccga ttctggcaac 3660

aggcgcccaa gcacaaggcc ccgcgccaag gagtga 3696

<210> 10

<211> 420

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HLA-A2 iCAR 合成蛋白

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln

20 25 30

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

35 40 45

Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His

50 55 60

Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

65 70 75 80

Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

85 90 95

Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

100 105 110

Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala

115 120 125

Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

130 135 140

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

145 150 155 160

Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro

165 170 175

Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser

180 185 190

Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys

195 200 205

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

225 230 235 240

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr

245 250 255

Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

260 265 270

Leu Glu Ile Lys Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro

275 280 285

Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly

290 295 300

Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu

305 310 315 320

Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg

325 330 335

Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser

340 345 350

Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu

355 360 365

Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val

370 375 380

Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala

385 390 395 400

Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys

405 410 415

Ser Trp Pro Leu

420

Claims

1.一种鉴定用于制备能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)或保护性嵌合抗原受体(pCAR)的靶标的方法，其中所述靶标通过包括以下步骤的方法鉴定：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述LOH位置选自由替换、缺失和插入组成的组。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述LOH位置是SNP。

4.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-K、HLA-L、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA_DQ或HLA-DR基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-A基因。

7.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-B基因。

8.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-C基因。

9.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-G基因。

10.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-E基因。

11.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-F基因。

12.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-K基因。

13.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-L基因。

14.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-DM基因。

15.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-DO基因。

16.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-DP基因。

17.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA_DQ基因。

18.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因是HLA-DR基因。

19.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

20.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

21.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

22.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

23.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

24.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

25.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

26.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

27.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

28.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

29.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

30.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

31.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

32.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

33.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

34.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

35.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

36.根据权利要求5所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

37.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

38.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

39.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

40.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

41.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述细胞外多态性表位的所述基因选自由以下组成的组：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、皮肤肿瘤、胰腺肿瘤、结直肠肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、脑肿瘤、淋巴瘤、白血病、肺肿瘤和胶质瘤。

43.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：肾上腺肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、DLBC、乳腺肿瘤、肉瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、膀胱肿瘤和肝肿瘤。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述肾上腺肿瘤是肾上腺皮质癌。

45.根据权利要求43所述的方法，其中所述肾肿瘤是嫌色性肾细胞癌。

46.根据权利要求43所述的方法，其中所述黑素瘤是葡萄膜黑色素瘤。

47.一种表达(i)根据权利要求1至46中任一项所述的iCAR或pCAR和(ii)活化嵌合抗原受体(aCAR)的安全效应免疫细胞。

48.根据权利要求47所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR针对或特异性结合肿瘤相关抗原或非多态性细胞表面表位。

49.根据权利要求47所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR针对或特异性结合肿瘤相关蛋白，如表1所列的CAR靶标，在也表达iCAR的肿瘤组织中表达的任何细胞表面蛋白。

50.根据权利要求49所述的安全效应免疫细胞，其中所述非多态性细胞表面表位选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD10、CD7、CD49f、CD56、CD74、CAIX Igκ、ROR1、ROR2、CD30、LewisY、CD33、CD34、CD38、CD123、CD28、CD44v6、CD44、CD41、CD133、CD138、NKG2D-L、CD139、BCMA、GD2、GD3、hTERT、FBP、EGP-2、EGP-40、FR-α、L1-CAM、ErbB2,3,4、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、间皮素、c-MET、PSMA、CEA、kRas、MAGE-A1、MUC1 MUC16、PDL1、PSCA、EpCAM、FSHR、AFP、AXL、CD80、CD89、CDH17、CLD18、GPC3、TEM8、TGFB1、NY-ESO-1、WT-1和EGFR。

52.根据权利要求47至51中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞选自由T细胞、自然杀伤细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞组成的组。

53.根据权利要求47至52中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR的表达水平大于或等于所述aCAR的表达水平。

54.根据权利要求47至53中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR由第一载体表达，而所述aCAR由第二载体表达。

55.根据权利要求47至53中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR和所述aCAR都由同一载体表达。

56.根据权利要求55所述的安全效应免疫细胞，其中编码所述aCAR的核苷酸序列在编码所述iCAR或pCAR的核苷酸序列的下游。

57.根据权利要求55所述的安全效应免疫细胞，其中所述核苷酸序列在编码所述aCAR的核苷酸序列与编码所述iCAR或pCAR的核苷酸序列之间包括病毒自切割2A肽。

58.根据权利要求57所述的安全效应免疫细胞，其中所述病毒自切割2A肽选自由以下组成的组：来自明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A、来自马鼻炎病毒A型(ERAV)的E2A以及来自猪捷申病毒1(PTV1)的P2A。

59.根据权利要求55所述的安全效应免疫细胞，其中编码所述aCAR的核苷酸序列通过柔性接头连接至所述iCAR或pCAR。

60.根据权利要求47至59中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR包括活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。

61.根据权利要求60所述的安全效应免疫细胞，其中所述活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)同源。

62.根据权利要求60所述的安全效应免疫细胞，其中所述活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与诸如KIR2DS和KIR3DS的活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)同源。

63.根据权利要求60所述的安全效应免疫细胞，其中所述活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与诸如DAP12的衔接分子同源或者是诸如DAP12的衔接分子。

64.根据权利要求60所述的安全效应免疫细胞，其中所述活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件同源或者是CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件。

65.一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的方法，包括向所述患者给药表达根据权利要求1至64中任一项所述的iCAR的安全效应免疫细胞。

66.一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的方法，包括向所述患者给药根据权利要求47至64中任一项所述的安全效应免疫细胞。