CN114058589B - 具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、制备方法和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、制备方法和药物，涉及免疫治疗技术领域。本发明公开的免疫细胞的GPR116基因不表达、或其表达受到抑制、或其表达的GPR116蛋白失活。本发明首次发现GPR116基因或蛋白对免疫细胞免疫功能的负调控作用，并且首次将其与嵌合抗原受体修饰的细胞联合，用于增强免疫细胞的抗肿瘤功能，本发明不仅提供了一个提高肿瘤治疗的新方法，也为今后深入GPR116的免疫调节功能以及临床疾病治疗奠定了基础。

Description

具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、制备方法和药物
技术领域
本发明涉及免疫治疗技术领域，具体而言，涉及一种具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、制备方法和药物。
背景技术
近年来，随着医学和生命科学的不断进步，以及人们对生命健康需求的日益提升，肿瘤的免疫疗法成为前沿探索的重要领域，其中使用嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimericantigen receptor T-cell，CAR T)疗法逐渐发展成肿瘤免疫治疗的新趋势。CAR T细胞疗法主要通过对病人自身的T细胞进行基因改造，使得它们特异性地攻击肿瘤细胞，从而达到治愈的目的。其在治疗多种肿瘤，尤其在血液系统肿瘤中疗效显著，但在实体瘤治疗中依然有很多挑战，如肿瘤特异性抗原的匮乏，肿瘤恶劣的微环境，CAR T细胞在体内扩增与存活困难，CAR T细胞杀伤效率低，容易耗竭等等，因此选择更有效的靶点，并且探索新的方法提高CAR T细胞在肿瘤微环境中的积累及存活，进而提高CAR T细胞对实体瘤的疗效是现阶段的一大重要挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、制备方法和药物。本发明提供的免疫细胞，通过对其GPR116基因的调控，使其表达受到限制，例如不表达、表达水平低或蛋白失活等，提高了该免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，有效增强了该免疫细胞的肿瘤治疗效果。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供一种具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述免疫细胞表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体，以及所述免疫细胞的GPR116基因表达下调。
G蛋白偶联受体(GPCR)是一类七次跨膜受体，粘附性GPCR是GPCR中的第二大家族，主要特征是含有一个长的N末端，里面有很多粘附性位点，介导细胞与细胞之间或细胞与基质之间的相互作用。目前为止，大多数aGPCRs没有明确的配体和下游信号通路。aGPCRs以细胞类型和组织特异性的方式表达，并与多种细胞和生理功能相关，如细胞粘附、迁移、免疫反应和肿瘤进展等等。黏附性G蛋白偶联受体116(GPR116)又名ADGRF5、Ig-Hepta，是aGPCRs第六簇中的一员，属于孤儿受体，在其长的细胞外区域中有大约1000个氨基酸残基，且胞外段额外包含两个免疫球蛋白样重复序列和一个自蛋白裂解(SEA)结构域。GPR116受体广泛表达在多种组织和器官中，尤其在肺、心、肝、肾及脾脏中表达较为明显。基于GPR116的表达分布以及功能特性，已有一些研究指出GPR116在调节肺部稳态、血管内皮细胞功能及肿瘤发生发展中发挥着重要作用。但GPR116在免疫系统中调控机理的相关报道很少。
本发明的发明人通过创造性的劳动，首次发现，在嵌合抗原受体修饰的免疫细胞中，下调GPR116基因表达后，在体外，该免疫细胞的活化、杀伤、增殖和存活功能得到增加，在体内，该免疫细胞在肿瘤部位的扩增和积累得到增强，其细胞毒性功能也得到增强，其对肿瘤细胞的杀伤能力得到明显提高。
基于此，本发明提供的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其GPR116基因不表达或表达受到抑制，或其表达的GPR116蛋白失活；该免疫细胞具有更强的细胞毒性功能，其对肿瘤细胞具有更强的杀伤能力，抗肿瘤疗效更高。
本发明首次发现GPR116基因或蛋白对免疫细胞免疫功能的负调控作用，并且首次将其与嵌合抗原受体修饰的细胞联合，用于调控免疫细胞的抗肿瘤功能。本发明不仅提供了一个提高肿瘤治疗的新方法，也为今后深入研究GPR116的免疫调节功能以及临床疾病治疗奠定了基础。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫细胞含有抑制GPR116基因表达的如下分子：shRNA、反义RNA、siRNA和Antagomir。
对于本领域技术人员而言，容易想到采用本领域常规的基因编辑技术实现GPR116基因不表达或抑制其表达，或使其表达的GPR116蛋白失活的效果，例如通过CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术等修饰免疫细胞内源性GPR116基因上游的启动子序列，使其失去驱动表达的功能，是GPR116基因不表达，也可以通过上述技术修饰(例如突变或敲除)GPR116基因序列使其表达的蛋白失去正常的生物学功能，或者利用RNA干扰技术抑制GPR116基因的表达。无论采用何种技术实现GPR116基因不表达或表达受到抑制，或GPR116蛋白失活等类似功能，其均是属于本发明的保护范围的。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫细胞含有抑制GPR116基因表达的shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，优选为SEQ ID NO.3。
SEQ ID NO.1-3所示的shRNA均可以抑制GPR116基因的表达，其中，SEQ ID NO.3的抑制效率更高。在其他的实施例中，本领域技术人员也可以根据GPR116基因的序列采用其他的shRNA抑制GPR116基因的表达，其也是属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原选自CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD123、CD138、CD171、BCMA、CD38、NKG2D配体、MUC1、MUC16、LeY、CEA、Mesothelin、CAIX、CD123、ROR1、间皮蛋白、c-Met、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、Claudin18.A2、PLAC1、GD2、PDGFR、MAGE4、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、LMP1、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、IL-13Rα2、EphA2、FAP、EGFRVIII、HER2、IL13R和MAGE-A3中的至少一种。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际所需要治疗的肿瘤类型，选择适合的肿瘤相关抗原包括但不限于上述的肿瘤相关抗原，根据所要治疗的肿瘤类型，确定该肿瘤的特异性肿瘤抗原，对本领域技术人员来说是容易的，基于此，无论选择何种肿瘤相关抗原，其均是属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体具有能够特异性结合所述肿瘤相关抗原的抗原结合结构域。
根据肿瘤相关抗原的类型，本领域技术人员可以选择合适的抗原结合结构域，例如典型的抗肿瘤相关抗原的scFv，也可以基于配体-受体关系，选择适合的配体/受体作为抗原结合结构域，起到靶向作用，无论抗原结合结构域的结构如何变化，只要能够起到特异性结合上述肿瘤相关抗原即属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原为NKG2D配体；所述抗原结合结构域为NKG2D蛋白，优选为NKG2D蛋白的胞外段。
NKG2D活化性受体以及配体在肿瘤治疗方面引起了广泛的关注。NKG2D的配体包括八个成员，在人中有MICA、MICB、ULBP1-6，在鼠中有Rae1α-Rae1ε、H60a-H60c、Mult1。其配体在正常细胞中不表达或者表达很低，但当细胞受到感染或者发生癌变时，这些配体的表达量会大幅度上升，尤其是在很多实体瘤中，如前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌等等。因此，以NKG2D配体为靶向的NKG2D-CAR T细胞是一种治疗肿瘤尤其是实体肿瘤的有效方法。
当本发明的嵌合抗原受体中以NKG2D蛋白胞外段作为抗原结合结构域时，该免疫细胞可以针对表达NKG2D配体的肿瘤例如前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌等发挥抗肿瘤作用。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述NKG2D蛋白的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域。
所述跨膜结构域选自：CD8、CD28、CD33、CD37、CD8α、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4和CD3ε中的一种或多种的跨膜结构域。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述跨膜结构域选自CD8的跨膜结构域。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还具有共刺激信号传导区。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3中的一种或多种。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包括4-1BB的细胞内结构域和CD3ζ的细胞内结构域。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞、记忆性T细胞、双特异性T细胞和CIK细胞中的任意一种。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫细胞源自哺乳动物。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫细胞源自人。
可选地，在本发明的一些实施方案中，当所述免疫细胞源自非人哺乳动物时，所述GPR116基因为人GPR116基因的同源基因。
非人哺乳动物例如可以是鼠、马、牛、猪、猴、羊、兔和狗等，非人哺乳动物存在与人GPR116基因的同源基因，如果免疫细胞源自非人哺乳动物时，通过对其GPR116基因的抑制表达也可以实现抗肿瘤效果增强的效果。
另一方面，本发明提供一种制备如上任一项所述的免疫细胞的方法，其包括：控制所述免疫细胞的GPR116基因不表达、或其表达受到抑制、或其表达的GPR116蛋白失活。
另一方面，本发明提供一种治疗肿瘤的药物，其含有作为活性成分的如上任一项所述的免疫细胞。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述药物含有药学上可接受的辅料。
另一方面，本发明提供一种增强免疫细胞功能的方法，控制所述免疫细胞的GPR116基因不表达、或其表达受到抑制、或其表达的GPR116蛋白失活。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节T细胞、记忆性T细胞、双特异性T细胞和CIK细胞中的任意一种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为质粒载体的酶切验证结果，图中：1.pLL3.7空载，2.pLL3.7-GPR116-shRNA-NC，3.pLL3.7-GPR116-shRNA-1，4.pLL3.7-GPR116-shRNA-2，5.pLL3.7-GPR116-shRNA-3。
图2为质粒载体上的嵌合抗原受体表达部分的结构示意图。
图3为不同shRNA的干扰效率检测结果。
图4为不同CAR T细胞的NKG2D-CAR阳性率检测结果。
图5为不同CAR T细胞以不同效靶比对靶细胞的杀伤效率检测结果。
图6为经不同CAR T细胞治疗后小鼠体内的肿瘤体积大小变化检测结果。
图7为pLL3.7载体图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1shRNA的设计
根据GPR116基因，设计3条siRNA序列(SEQ ID NO.1-3)和1条NC序列，按照如下原则设计和确定干扰序列：5端以G开头，设定G+C含量为30％～50％。根据pLL3.7载体(见图7)的要求，(1)在正义链5’端加T重建U6启动子l位的T。(2)干扰靶序列后加Loop环“TTCAAGAGA”。(3)加入反转互补序列及终止信号“TTTTTT”。(4)在3’端再加上EcoR I酶切位点GAATTC以方便鉴定。(5)再补平Xho I酶切位点合成一对互补片段。shRNA的序列如下表1所示。
表1 GPR116-shRNA碱基序列
Figure BDA0002611027500000051
2重组干扰载体pLL3.7-GPR116-shRNA构建
将设计好的干扰序列送至公司合成，将合成的正义链和反义链DNA进行退火，获得shRNA双链片段。与Hpa I和Xho I双酶切处理的线性化载体pLL3.7片段进行连接，提取质粒后通过酶切鉴定筛选出阳性的质粒。由于设计干扰序列时人为加入了EcoR I酶切位点，且pLL3.7-U6-EF1α-EGFP载体上含有一个EcoR I酶切位点，若连接成功，则载体上会有两个EcoR I酶切位点，因此使用EcoR I进行酶切鉴定时，会有两个条带，大小约为6215bp和1427bp。若连接失败，则质粒上只有一个EcoR I酶切位点，EcoR I酶切后只有一个条带。可根据条带数量和大小区分阳性和阴性质粒，EcoR I酶切鉴定结果如图1所示，与空载相比，GPR116-shRNA-1/2/3和GPR116-shRNA-NC均有两条带，表明载体构建成功。阳性质粒送至公司测序来进一步确认，所有质粒测序结果均正确。
3重组靶向干扰载体pLL3.7-GPR116-shRNA-NKG2D-CAR构建
通过网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/查到NKG2D基因全长的CDS区，并且在https://www.uniprot.org/网站找到NKG2D蛋白的胞外段区域，在NKG2D全长基因序列中找到对应的胞外段基因序列。NKG2D蛋白为二型跨膜蛋白，其胞外段序列位于C端，将CD8a信号肽的序列加入NKG2D胞外段序列前端。用SnapGene软件设计并在公司合成引物(引物中包含信号肽序列)，以人的T细胞cDNA为模板，通过RT-PCR的方式扩增NKG2D的胞外段，将RT-PCR产物测序得到Sig-NKG2D胞外段的核苷酸编码序列如下(SEQ ID NO.5)：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgatgttattcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacatacatctgcatgcaaaggactgtg。
Sig-NKG2D胞外段氨基酸序列如下(SEQ ID NO.4)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPMLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV。
将上述得到的Sig-NKG2D胞外段核苷酸序列与已经构建好的二代CAR序列CD8-CD3-4-1BB通过重叠PCR的方式连接到一起。通过RT-PCR以及测序鉴定后确定构建成功，获得pLL3.7-NKG2D-CAR载体。将已经构建好的pLL3.7-GPR116-shRNA载体经Xba I和Nhe I双酶切胶回收小片段，pLL3.7-NKG2D-CAR载体经Xba I和Nhe I双酶切胶回收大片段，T4 DNA连接酶连接过夜，得到重组载体pLL3.7-GPR116-shRNA-NKG2D-CAR，重组质粒经EcoR I单酶切鉴定结果。pLL3.7-NKG2D-CAR载体和pLL3.7-GPR116-shRNA-NKG2D-CAR载体上的CAR表达盒结构部分的示意图见图2。
4shRNA功能验证
将构建成功的pLL3.7-GPR116-shRNA1/2/3/NC-NKG2D-CAR四种质粒进行慢病毒包装，收集病毒后，检测其病毒原液滴度均很高。使用病毒原液感染293T细胞，收集细胞提取mRNA并反转成cDNA，Q-PCR检测GPR116的表达，结果如图3所示，与对照组NC相比，三种干扰序列均可以发挥干扰作用，其干扰效果近60-80％。三种干扰序列根据干扰效率可排序为：GPR116-shRNA-3>GPR116-shRNA-2>GPR116-shRNA-1，在后续实施例中，选择pLL3.7-GPR116-shRNA3-NKG2D-CAR作为后续功能验证的干扰载体。
实施例2
1 CAR T细胞制备及阳性率检测
将从医院采取的人的外周血裂解红细胞后，通过磁珠分选获得CD3+T细胞，用CD3和CD28抗体激活2天后，离心换液，将T细胞接种于24孔板中，每孔1×106个细胞。pLL3.7-NKG2D-CAR和pLL3.7-GPR116-shRNA-3-NKG2D-CAR两种载体质粒进行慢病毒包装及浓缩，以MOI＝10感染T细胞，分别获得两种CAR T细胞(NKG2D-CAR T和116shRNA-G2DCAR T)，通过流式检测两种CAR T细胞的NKG2D-CAR阳性率，感染效率均达95％以上(图4)。
2 CAR T细胞杀伤功能检测
选用NKG2D配体表达较高的人的前列腺癌细胞系PC-3作为靶细胞，进行CFSE标记后，与效应细胞按效靶比1:9、1:3、1:1在96孔超低吸附培养板中共培养8h，收集细胞，FACS洗两遍后用1×Annexin V binding buffer重悬细胞，加入Annexin V染色15min，流式上机检测靶细胞的凋亡，统计两种CAR T细胞的杀伤效率，结果如图5所示，GPR116敲低的116shRNA-G2DCAR T细胞杀伤效果高于对照NKG2D-CAR T细胞，且效靶比越高，差异越明显。
3 CAR T细胞体内杀伤功能检测
选取6-8周的雌性NOD/SCID/γ链-/-(NSG)免疫缺陷小鼠，每只小鼠背部右侧皮下注射2.5×106个细胞的PC-3肿瘤细胞，每隔三天测量肿瘤体积，当肿瘤体积长到100mm3左右时，分为三个组，每组5只小鼠，分别对每组小鼠尾静脉注射NT、NKG2D-CAR T和116shRNA-G2DCAR T细胞，每只小鼠1×107个细胞，期间定期观察小鼠，在NT组肿瘤大小达到1500mm3左右时判定为安乐死。在NT组所有肿瘤达到安乐死标准时，剥离小鼠肿瘤进行拍照。结果如图6所示，与对照NT组相比，两组CAR T细胞的治疗效果都很明显，肿瘤大小明显减小，而相比于NKG2D-CAR T组，116shRNA-G2DCAR T组的治疗效果更明显，其肿瘤明显更小，表明下调GPR116的表达能够提高NKG2D-CAR T细胞体内的抗肿瘤功能。
综上，与血液系统恶性肿瘤相比，CAR T细胞治疗实体瘤的临床试验很少，因为不同于血液瘤较单一的肿瘤环境，实体肿瘤具有形成耐受性微环境的能力，并且可以激活强大的免疫抑制机制，协同作用来抵消免疫细胞有效的抗肿瘤效应，因此CAR T细胞靶向实体瘤治疗时会遇到更多的问题和阻碍。实体肿瘤的免疫抑制微环境会削弱CAR T细胞的细胞毒性，抑制CAR T细胞的扩增，使其无法发挥持久的抗肿瘤功能。所以在选择有效的靶点治疗实体瘤的同时，也需寻求更多的策略来增强CAR T细胞的功能，协同增强实体瘤的治疗效果。
另外，前列腺癌是一种发病率极高的恶性肿瘤，局部性的肿瘤可通过手术切除进行治疗，但存在较大的复发风险，对于肿瘤复发或者发生转移的患者，目前依然缺乏有效的治疗手段。鉴于CAR T细胞疗法的有效性和可行性，研究者们也在尝试使用CAR T细胞治疗转移性前列腺癌。本实验室前期发现前列腺癌高表达NKG2D的多种配体，且NKG2D-CAR T细胞能够有效识别并杀伤前列腺癌细胞。但与大多数实体肿瘤一样，前列腺中肿瘤的免疫抑制微环境会削弱CAR T细胞的细胞毒性，抑制CAR T细胞的扩增，使其无法发挥持久的抗肿瘤功能。因此，寻求更多的策略来增强CAR T细胞的功能，协同增强前列腺癌的治疗效果尤为重要。
本发明首次发现G蛋白偶联受体GPR116下调后能够增强NKG2D-CAR T细胞的细胞毒性功能，进而增强NKG2D-CAR T细胞体内的抗肿瘤功效。本发明首次发现GPR116受体对T细胞免疫功能的负调控作用，并且首次将其与CAR T细胞联合，用于调控CAR T细胞的抗肿瘤功能。本发明不仅提供了一个提高肿瘤治疗的新方法，也为今后深入探究GPR116的免疫调节功能以及临床疾病治疗奠定了基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东师范大学
上海邦耀生物科技有限公司
<120> 具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、制备方法和药物
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcagucaggg uaauguuaau u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcccaucuau gaagcugaau c 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcagucggau ucgucuauug u 21
<210> 4
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Met Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu
            20                  25                  30
Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys
        35                  40                  45
Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser
    50                  55                  60
Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met
                85                  90                  95
Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly
            100                 105                 110
Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly
        115                 120                 125
Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys
    130                 135                 140
Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
145                 150                 155
<210> 5
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgatgttat tcaaccaaga agttcaaatt cccttgaccg aaagttactg tggcccatgt 120
cctaaaaact ggatatgtta caaaaataac tgctaccaat tttttgatga gagtaaaaac 180
tggtatgaga gccaggcttc ttgtatgtct caaaatgcca gccttctgaa agtatacagc 240
aaagaggacc aggatttact taaactggtg aagtcatatc attggatggg actagtacac 300
attccaacaa atggatcttg gcagtgggaa gatggctcca ttctctcacc caacctacta 360
acaataattg aaatgcagaa gggagactgt gcactctatg cctcgagctt taaaggctat 420
atagaaaact gttcaactcc aaatacatac atctgcatgc aaaggactgt g 471

Claims (9)

1.一种具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体，以及所述免疫细胞的GPR116基因不表达、或其表达受到抑制、或其表达的GPR116蛋白失活；
所述嵌合抗原受体具有能够特异性结合所述肿瘤相关抗原的抗原结合结构域；
所述免疫细胞为T细胞；
所述免疫细胞含有抑制GPR116基因表达的shRNA，所述shRNA的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.根据权利要求1所述的具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述肿瘤相关抗原选自CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD123、CD138、CD171、BCMA、CD38、NKG2D配体、MUC-1、MUC16、LeY、CEA、Mesothelin、CAIX、ROR1、c-Met、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、Claudin18A2、PLAC1、GD2、PDGFR、MAGE4、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、LMP1、EGFRvIII、NY-ESO-1、IL-13Rα2、EphA2、FAP、和MAGE-A3中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述肿瘤相关抗原为NKG2D配体；所述抗原结合结构域为NKG2D蛋白的胞外段；
所述NKG2D蛋白的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域；
所述跨膜结构域选自：CD8、CD28、CD33、CD37、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4和CD3ε中的一种或多种的跨膜结构域。
5.根据权利要求4所述的具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述跨膜结构域选自CD8的跨膜结构域。
6.根据权利要求5所述的具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有共刺激信号传导区。
7.根据权利要求6所述的具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述共刺激信号传导区包括4-1BB的细胞内结构域和CD3ζ的细胞内结构域。
8.一种制备如权利要求1-7任一项所述的免疫细胞的方法，其特征在于，其包括：控制所述免疫细胞的GPR116基因不表达、或其表达受到抑制、或其表达的GPR116蛋白失活。
9.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，其含有作为活性成分的如权利要求1-7任一项所述的免疫细胞。
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