CN114517185B

CN114517185B - 嵌合抗原受体nk细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114517185B
Application number: CN202210049782.2A
Authority: CN
Inventors: 江文正; 高尧鑫
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-01-17
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2042-01-17
Also published as: CN114517185A

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和应用，涉及CAR‑NK细胞治疗技术领域。本发明公开的嵌合抗原受体NK细胞表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体且所述嵌合抗原受体NK细胞的GPR97基因被敲除或其表达受到抑制。本发明还公开了一种细胞药物/药物组合物。本发明公开的嵌合抗原受体NK细胞与原有的效应性CAR‑NK细胞相比能释放更强的细胞效应因子，具有更好的肿瘤细胞杀伤能力，为肿瘤治疗提供了新的方向和思路。

Description

嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于CAR-NK细胞治疗技术领域，具体而言，涉及一种嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和细胞药物。

背景技术

目前，癌症已经成为威胁人类健康的第二大杀手，仅次于心脑血管疾病。并且每年新增约180万人，同时每年有超过160万人死于癌症。人类对于癌症的治疗主要依赖于手术切除和放化疗等，但是这些方法只适用于早期肿瘤，而且达不到彻底根除的效果。此外，手术切除和放化疗等结合的方法，不仅副作用大而且达不到彻底根治的效果。尽管目前有很多小分子抑制剂以及单克隆靶向药物引入该领域，但是适应范围小且个体反应差异大，仍然出现复发转移。癌症之所以难以治愈主要是因为它能够以多种方式逃避机体免疫系统的监视。近年来，随着肿瘤免疫治疗的发展，嵌合抗原受体T细胞治疗(CAR-T)治疗肿瘤逐渐进入临床试验，并且在治疗恶性血液病取得了较好的成果。然而，CAR-T在治疗肿瘤的同时也存在极大的副作用，比如神经毒性、细胞因子风暴以及脱靶效应。CAR-T细胞的制备通常需要数周时间，这使得治疗患有疾病快速发展的患者变得不切实际；CAR-T细胞疗法需要分离自体T细胞然而往往不能够从患者自身收集足够的淋巴细胞以成功生产临床相关剂量的CAR-T细胞；CAR-T细胞疗法伴随着威胁患者生命的副作用等等。针对目前的种种挑战，越来越多的研究学者认为，NK细胞因为独特的杀伤机制以及广泛的细胞来源等优势可以作为T细胞的替代者，与CAR-T细胞相比，嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)能够更安全、更有效地清除肿瘤细胞。

为了降低脱靶效应，研究人员寻找更为有效的靶点。NKG2D及其配体的免疫学特征与肿瘤有着很大的联系。并且发现NKG2D的配体“MICA、MICB、ULBP1-6”在机体大部分正常细胞表面一般不表达或者低表达这些配体，在某些实体肿瘤中，如肝癌细胞、直肠癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞等均有不同程度的NKG2D配体表达。因此，NKG2D可以作为一个理想的靶点用于制备CAR-NK。

G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors，GPCR)是一种七次跨膜结构域受体，能够介导多种细胞外信号的细胞反应。GPCR在机体的多种生理反应中起着非常重要的作用，比如，感光、嗅觉、免疫系统的调节、神经系统的调节等。GPR97是一种孤儿受体，目前还没发现与其结合的内源性配体。现有的研究发现，GPR97可以调节B细胞的发育方向，GPR97缺失以后，CREB和NF-κB通路被激活，进而影响了B细胞的发育。本发明课题组前期的结果发现GPR97缺失后能够增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。此外，现有的CAR-NK细胞在其治疗实体瘤的效果有限，有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的嵌合抗原受体NK细胞、含有嵌合抗原受体NK细胞的细胞药物/药物组合物，以及制备嵌合抗原受体NK细胞的方法。本发明提供的嵌合抗原受体NK细胞与原有的效应性CAR-NK细胞相比能释放更强的细胞效应因子，具有更好的肿瘤细胞杀伤能力。

本发明还提出了在NKG2D-CAR的结构中加入GPR97的干扰序列用于增强NKG2D-CARNK的功能。

本发明提供了一种嵌合抗原受体NK细胞，所述嵌合抗原受体NK细胞表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体且上述嵌合抗原受体NK细胞的GPR97基因被敲除或其表达受到抑制。

本发明首次提出在嵌合抗原受体NK细胞中抑制GPR97蛋白的表达，该嵌合抗原受体NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力得到有效提高。因此，本发明为采用嵌合抗原受体NK细胞治疗肿瘤提供了新的方向和思路。

基于本发明提供的内容，本领域技术人员容易理解到抑制或敲除嵌合抗原受体NK细胞的GPR97基因也能取得相似的抗肿瘤能力提高的技术效果。

在可选的实施方式中，上述GPR97基因的表达通过包括但不限于如下分子中的任意一种或几种的组合被抑制：shRNA、反义RNA、siRNA和antagomir；或者，上述嵌合抗原受体NK细胞的GPR97基因通过包括但不限于如下技术中的任意一种被敲除：CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术。

基于本发明提供的内容，本领域技术人员能够想到采用本领域技术常见的技术对嵌合抗原受体NK细胞进行改造，以使其GPR97基因的表达受到抑制，或敲除GPR97基因，无论通过何种技术得到的嵌合抗原受体NK细胞，只要其GPR97基因被抑制表达或被敲除即属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，上述嵌合抗原受体NK细胞含有shRNA分子，上述GPR97基因的表达通过上述shRNA分子受到抑制。

在可选的实施方式中，上述shRNA分子的靶序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了利用shRNA分子靶向GPR97基因上如SEQ ID NO.1处的靶序列，GPR97基因表现出被抑制的效果，相应的嵌合抗原受体NK细胞均有抗肿瘤能力提高的表现。

在可选的实施方式中，上述shRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示：GGAGAGGUUCAAGUCAGAAGA。

在可选的实施方式中，上述肿瘤相关抗原选自NKG2D配体；上述嵌合抗原受体的抗原结合结构域能够特异性结合上述肿瘤相关抗原。

需要说明的是，基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以选择合适的肿瘤相关抗原，无论选用何种肿瘤相关抗原均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，当上述肿瘤相关抗原为NKG2D配体时，上述嵌合抗原受体的抗原结合结构域为NKG2D蛋白，或者是选自NKG2D蛋白的具有结合活性的片段。

在可选的实施方式中，上述肿瘤相关抗原为NKG2D配体，上述抗原结合结构域为选自NKG2D蛋白的胞外段。

在可选的实施方式中，上述NKG2D蛋白的胞外段的氨基酸序列SEQ ID NO.16所示。

在可选的实施方式中，上述NKG2D配体选自MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP 3、ULBP4、ULBP 5和ULBP 6中的任意一种。

NKG2D及其配体的免疫学特征与肿瘤有着很大的联系。NKG2D的配体包括六个成员：MICA、MICB、ULBP1-6，但是机体大部分正常细胞表面一般不表达或者低表达这些配体，在某些实体肿瘤中，如前列腺癌、肝癌细胞、直肠癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞等均有不同程度的NKG2D配体表达，将NKG2D受体设计到CAR结构中，当其与配体结合时，便会激活T细胞，产生一系列的抗肿瘤反应。

在可选的实施方式中，上述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区；

上述跨膜结构域选自：CD8、CD28、CD33、CD37、CD8α、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4、和CD3ε中的一种或多种的跨膜结构域。

在可选的实施方式中，上述跨膜结构域选自CD8的跨膜结构域。

在可选的实施方式中，上述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，上述共刺激分子选自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3中的一种或多种；

在可选的实施方式中，上述共刺激信号传导区包括4-1BB的细胞内结构域和CD3ζ的细胞内结构域。

本发明还提供了一种制备所述的嵌合抗原受体NK细胞的方法，其包括如下步骤：抑制嵌合抗原受体NK细胞的GPR97基因的表达或敲除上述嵌合抗原受体NK细胞的GPR97基因。

需要说明的是，无论采用何种方法制备出本发明所述的嵌合抗原受体NK细胞，其均是属于本发明的保护范围。

通过本发明实施例的方法能够增强CAR-NK细胞效应因子的释放，有利于增强CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

本发明还提供了一种细胞药物/药物组合物，其含有作为活性成分的如前述的嵌合抗原受体NK细胞以及药学上可接受的辅料。

在可选的实施方式中，上述细胞药物用于预防和/或治疗肿瘤。

在可选的实施方式中，上述肿瘤选自实体瘤或非实体瘤。

需要说明的是，基于本发明的内容，本领域技术人员容易想到将本发明嵌合抗原受体NK细胞应用与治疗各种肿瘤，不仅仅是实体瘤，也适用于非实体瘤，无论哪种肿瘤，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，上述实体瘤为特异性表达NKG2D配体的肿瘤。

在可选的实施方式中，上述实体瘤选自前列腺癌、胰腺癌、肝癌、直肠癌、胃癌和乳腺癌中的任意一种。

本发明还提供了所述细胞药物/药物组合物在预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

在可选的实施方式中，上述肿瘤选自实体瘤或非实体瘤。

本发明还提供了一种试剂/试剂盒，所述试剂盒包含pLL3.7-NKG2D-shRNA-NC-CAR、pLL3.7-NKG2D-shRNA-A-CAR、pLL3.7-NKG2D-shRNA-B-CAR、pLL3.7-NKG2D-shRNA-C-CAR质粒、PEI以及NK92细胞。

在可选的实施方式中，所述试剂/试剂盒用于诊断肿瘤。

在可选的实施方式中，上述肿瘤选自实体瘤或非实体瘤。

本发明的有益效果在于，本发明首次提出在嵌合抗原受体NK细胞中抑制GPR97蛋白的表达，该嵌合抗原受体NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力得到有效提高，本发明为采用嵌合抗原受体NK细胞治疗肿瘤提供了新的方向和思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为pLL3.7-NKG2D-CAR(NKG2D-CAR)、pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR(NC-NKG2D-CAR)、pLL3.7-shRNA-NKG2D-CAR(KD-NKG2D-CAR)三种质粒的部分表达元件的结构示意图。

图2为重组质粒pLL3.7-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-A-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-B-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-C-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR经EcoR I单酶切鉴定结果。

图3为经pLL3.7-NKG2D-shRNA-NC-CAR、pLL3.7-NKG2D-shRNA-A-CAR、pLL3.7-NKG2D-shRNA-B-CAR、pLL3.7-NKG2D-shRNA-C-CAR感染的NK细胞的GPR97基因转录结果。其中，pLL3.7-NKG2D-shRNA-C-CAR感染的NK细胞的GPR97基因转录明显下调。

图4为经pLL3.7-NKG2D-shRNA-NC-CAR、pLL3.7-NKG2D-shRNA-A-CAR、pLL3.7-NKG2D-shRNA-B-CAR、pLL3.7-NKG2D-shRNA-C-CAR感染的NK细胞其GPR97蛋白表达结果。其中，pLL3.7-NKG2D-shRNA-C-CAR感染的NK细胞其GPR97蛋白表达明显下调。左图为westernblot检测结果，右图为统计学分析结果。

图5为Mock-NK、NKG2D-CAR-NK、NKG2D-shRNA-NC-CAR-NK、NKG2D-shRNA-C-CAR-NK-细胞杀伤前列腺癌效率结果。其中，NKG2D-shRNA-C-CAR-NK细胞杀伤效率更高。左图为靶细胞PC-3的杀伤结果，右图为靶细胞22RV1的杀伤结果。

图6为体内抗肿瘤实验，其中，左图为IVIS成像结果，右图为肿瘤体积统计结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

pLL3.7-shRNA-GPR 97干扰载体的构建

1、RNAi靶序列设计

在NCBI网站中查找到Homo sapiens GPR97(ADGRG3)的基因序号：170776.5。根据基因编号在网站(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)设计GPR97基因RNAi靶序列，结果如表1所示。

表1.GPR97基因RNAi靶序列

靶序列名称	起始位置	RNAi靶序列的核苷酸序列	GC％	SEQ ID NO.
					靶序列C	891	GGAGAGGTTCAAGTCAGAAGA	50.36	1

2、根据靶序列设计干扰序列：

基于筛选出的靶序列，参考如下原则设计和确定干扰序列：5端以G开头，设定G+C含量为30％-50％。根据pLL3.7载体的要求：(1)在正义链5’端加T重建U6启动子l位的T。(2)干扰靶序列后加Loop环“TTCAAGAGA”。(3)加入反转互补序列及终止信号“TTTTTT”。(4)在3’端再加上EcoR I酶切位点GAATTC以方便鉴定。(5)再补平Xho I酶切位点合成一对互补片段。

将序列打乱设计成NC(Negative Control)序列，各序列如下表2所示。

表2.针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸序列

3、构建靶向质粒pLL3.7-shRNA-NKG2D-CAR

通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/和https://www.uniprot.org/网站查到NKG2D蛋白的胞外段基因序列然后加入CD8a信号肽的序列。经过RT-PCR的方式扩增得到Sig-NKG2D胞外段序列如下SEQ ID NO.6：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGATGTTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTG；

氨基酸序列如下(SEQ ID NO.16)：

MALPVTALLLPLALLLHAARPMLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV。

将得到的sigNKG2DEX序列通过重叠PCR的方式连接到二代CAR CD8-CD3-4-1BB)。通过测序鉴定后确定构建成功，获得pLL3.7-NKG2D-CAR载体。将步骤2合成好的干扰片段连接到pLL3.7-NKG2D-CAR载体上，获得pLL3.7-shRNA-NKG2D-CAR。

实施例2

pLL3.7-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-NKG2D-CAR和pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR质粒的扩增与病毒包装。

1、质粒转染

1)分别将pLL3.7-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-NKG2D-CAR和pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR质粒与Opti-MEM，PEI与Opti-MEM培养基混合并在室温孵育5min；

2)将配好的PEI-Opti-MEM溶液加入含质粒的Opti-MEM中，室温静置20min；

3)将DNA/PEI混合物缓慢均匀地加入到铺有293T培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育，6-8h后更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育。

2、病毒收集和浓缩

1)收集转染48h和72h后的293T细胞上清；

2)4℃，4000g离心10min，除去293T细胞碎片；

3)以0.45μm滤器过滤得到的上清；

4)将过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000转离心2h，用1/100上清体积的PBS进行稀释，反复吹打后转入密闭的离心管中4℃过夜；

5)将病毒浓缩液进行分装，然后置于-80℃中保存。

3、病毒滴度测定

1)将293T细胞按照密度为2×10⁵/ml接种到24孔培养板；

2)向24孔板中分别加入0.1、0.5、1ul病毒浓缩液；

3)16h后弃去感染上清，添加0.5ml新鲜全培养基；

4)48h后流式检测被感染细胞的目的基因表达；

5)计算滴度。

实施例3

本发明实施例1构建的pLL3.7-shRNA-NKG2D-CAR载体干扰验证试验

将NK92细胞从液氮中取出置于37℃水浴锅中快速融化，800rpm/min离心3分钟后用α-MEM完全培养基(12.5％胎牛血清、12.5％马血清、2％青霉素链霉素混合液和73％的α-MEM基础培养基组成，还需额外补充100-200U/ml重组IL-2、0.2mM肌醇、0.1mM巯基乙醇以及0.02mM叶酸)重悬并接种于24孔板中培养。待细胞状态稳定后将其分为4组：无病毒感染阴性对照组、LV-NKG2D-CAR组，LV-NKG2D-shRNA-C-CAR慢病毒干扰组和LV-NKG2D-shRNA-NC-CAR阴性干扰组，每组各2孔。两个实验组分别按照MOI＝10:1加入相应体积的病毒，并加入10μg/ml polybrene促进感染。24h后将细胞进行收集，1000g离心10min，弃去培养基，加入新鲜培养基。

慢病毒感染48h后收取细胞，流式检测NKG2D表达效率，即病毒感染阳性率。结果LV-NKG2D-CAR、LV-NKG2D-shRNA-C-CAR和LV-NKG2D-shRNA-NC-CAR三种病毒在NK细胞上的感染效率接近100％。

将上述中的四种细胞用Trizol裂解细胞，抽提总RNA，进行逆转录。q-PCR分析重组质粒的干扰效果。结果如图3所示pLL3.7-NKG2D-shRNA-C-CAR慢病毒感染细胞后能显著抑制GPR97 mRNA的转录。与此同时，GPR97在蛋白水平也有明显下降，结果如图4所示。

实施例4

靶细胞的选择及CAR-NK杀伤功能研究

1、实验室前期的研究发现NKG2DL高表达的前列腺癌细胞株为PC3。

2、构建带有luciferase前列腺癌细胞株PC3

将前列腺癌细胞株PC3单细胞悬液与luciferase病毒混合后接种到6孔板中，24h后更换新鲜的DMEM培养基。48h后加入1μg/mL的puromycin进行筛选。

3、靶细胞与效应细胞共孵育

将PC3/22RV1细胞株按照4×10⁴/孔的数量接种至超低吸附细胞培养96孔板中；将NKG2D-CAR-NK、NKG2D-shRNA-C-CAR-NK和NKG2D-shRNA-NC-CAR-NK细胞和感染对照病毒的NK细胞(Mock-NK)分别按照效靶比1:1、2.5:1、5:1接种至靶细胞中，每组设两个重复，每孔补液至200μl；

将细胞混合后的培养板放至37℃培养箱中培养；4h后经流式检测其杀伤效率。

4、杀伤效率分析

如图5所示，与Mock-NK组相比，NKG2D-CAR-NK、NKG2D-shRNA-C-CAR-NK和NKG2D-shRNA-NC-CAR-NK均具有很强的杀伤前列腺癌的效果。并且与NKG2D-CAR-NK和NKG2D-shRNA-NC-CAR-NK相比，NKG2D-shRNA-C-CAR-NK具有更强的杀伤效率，此实验表明，NKG2D可以很好的靶向前列腺癌细胞株发挥功能，并且干扰GPR97能增强NKG2D-CAR-NK的杀伤效率。

实施例5

体内肿瘤治疗实验方法

准备6-8周龄的雌性NSG小鼠，然后在小鼠背部皮下注射200μL肿瘤细胞悬液。当肿瘤体积长到约100mm³时，经尾静脉注射CAR-NK细胞；每隔3天测量肿瘤大小和IVIS成像。当肿瘤负荷达到1500-2000mm³时，将小鼠进行安乐死。

体内抗肿瘤实验结果：

如图6所示，与Mock-NK治疗组相比，NKG2D-CAR-NK组和NKG2D-shRNA-C-CAR-NK组均能有效地抑制肿瘤的生长；相比于NKG2D-CAR-NK组，NKG2D-shRNA-C-CAR-NK组抑制肿瘤生长的效果更为明显。此实验表明，NKG2D可以很好的靶向前列腺癌，并且干扰GPR97能增强NKG2D-CAR-NK的抗肿瘤效果。

对比例C1-2

针对多个不同靶序列设计了不同的对照干扰序列，并进行了相关实验。实验方法与前述方法相同。

各对比例的靶序列见表3，各靶序列对应的干扰序列的上下游片段如表4所示，其中shRNA-C为本发明实施例1的原有序列。

表3.GPR97基因的RNAi靶序列

实施例	靶序列名称	起始位置	RNAi靶序列的核苷酸序列	GC％	SEQ ID NO.
						实施例1	靶序列C	891	GGAGAGGTTCAAGTCAGAAGA	50.36	1
对比例C1	靶序列A	104	GCAACAACATGTACGACATCT	50.1	7
						对比例C2	靶序列B	451	GCCGTCACCATTCTGGACATT	46.9	8

表4.针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸序列

靶向靶序列C的shRNA的RNA序列为：GGAGAGGUUCAAGUCAGAAGA(SEQ ID NO.13)。

靶向靶序列A的shRNA的RNA序列为：GCAACAACAUGUACGACAUCU(SEQ ID NO.14)。

靶向靶序列B的shRNA的RNA序列为：GCCGUCACCAUUCUGGACAUU(SEQ ID NO.15)。

利用与本发明实施例1载体构建相同的方法，设计干扰shRNA后由公司合成干扰序列DNA双链并连接到pLL3.7载体上，进行EcoR I单酶切鉴定，结果如图2所示。

利用与本发明实施例2相同的方法，进行慢病毒包装。

图3结果显示，从GPR97 mRNA表达来看，在众多干扰RNA中，shRNA-C具有最好的效果，shRNA-A和shRNA-B的干扰组mRNA的表达量均高于shRNA-C组，因此shRNA-C片段具有最优的干扰效果。

图4所示为经不同片段shRNA干扰后，western blot检测GPR97的蛋白水平，shRNA-C的条带最淡，也显示出其干扰效果最强。上述实验的结果是本领域技术人员无法预料的。

作为肿瘤治疗的重要方法之一，免疫细胞疗法逐渐给癌症患者带来了新的希望。CAR-T细胞疗法在血液瘤的治疗过程中取得了很大的成果，但是也反映出一些潜在的问题，比如抗宿主移植、治疗成本较高等。随着研究的不断深入，NK细胞逐渐成为更具有潜力的种子细胞。NK细胞具有独特的杀伤机制并且不受宿主的影响。因此，本发明通过以NK细胞为种子细胞，对其进行体外修饰。本发明通过构建靶向实体肿瘤的NKG2D-CAR-NK细胞，并且共表达能够提高CAR-NK细胞抗肿瘤能力干扰基因GPR97，结果发现干扰GPR97后能够有效地提高NKG2D-CAR-NK细胞的抗肿瘤能力，这些研究为治疗实体瘤提供了新的方向和思路。

总之，本发明是首次靶向前列腺癌细胞的NKG2D-CAR-NK的细胞治疗，也是首次将shRNA-GPR97就用于CAR-NK治疗中。本发明通过体外实验不仅证明了NKG2D-CAR-NK能够有效地靶向治疗前列腺癌，同时证明了干扰GPR97后能够有效地增加NKG2D-CAR-NK细胞的抗肿瘤功能，为CAR-NK应用于实体瘤治疗提供了新的方向。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggagaggttc aagtcagaag a 21

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggagaggtt caagtcagaa gattcaagat cttctgactt gaacctctcc ttttttgaat 60

tcc 63

<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgaggaatt caaaaaagga gaggttcaag tcagaagatc tcttgaatct tctgacttga 60

acctctcca 69

<210> 4

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgaacccacc tccagtaaat ggttcaagag accatttact ggaggtgggt tcttttttga 60

attcc 65

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcgaggaatt caaaaaagaa cccacctcca gtaaatggtc tcttgaacca tttactggag 60

gtgggttca 69

<210> 6

<211> 471

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgatgttat tcaaccaaga agttcaaatt cccttgaccg aaagttactg tggcccatgt 120

cctaaaaact ggatatgtta caaaaataac tgctaccaat tttttgatga gagtaaaaac 180

tggtatgaga gccaggcttc ttgtatgtct caaaatgcca gccttctgaa agtatacagc 240

aaagaggacc aggatttact taaactggtg aagtcatatc attggatggg actagtacac 300

attccaacaa atggatcttg gcagtgggaa gatggctcca ttctctcacc caacctacta 360

acaataattg aaatgcagaa gggagactgt gcactctatg cctcgagctt taaaggctat 420

atagaaaact gttcaactcc aaatacatac atctgcatgc aaaggactgt g 471

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcaacaacat gtacgacatc t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gccgtcacca ttctggacat t 21

<210> 9

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgcaacaaca tgtacgacat ctttcaagag aagatgtcgt acatgttgtt gcttttttga 60

attcc 65

<210> 10

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcgaggaatt caaaaaagca acaacatgta cgacatcttc tcttgaaaga tgtcgtacat 60

gttgttgca 69

<210> 11

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgccgtcacc attctggaca ttttcaagag aaatgtccag aatggtgacg gcttttttga 60

attcc 65

<210> 12

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgaggaatt caaaaaagcc gtcaccattc tggacatttc tcttgaaaat gtccagaatg 60

gtgacggca 69

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggagagguuc aagucagaag a 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcaacaacau guacgacauc u 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccgucacca uucuggacau u 21

<210> 16

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Met Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu

20 25 30

Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys

35 40 45

Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser

50 55 60

Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met

85 90 95

Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly

100 105 110

Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly

115 120 125

Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys

130 135 140

Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

145 150 155

Claims

1.一种嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体NK细胞表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体且所述嵌合抗原受体NK细胞的GPR97基因表达受到抑制；所述嵌合抗原受体NK细胞含有shRNA分子，所述GPR97基因的表达通过所述shRNA分子受到抑制，所述shRNA分子的靶序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述肿瘤相关抗原选自NKG2D配体；

所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域能够特异性结合所述肿瘤相关抗原。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述肿瘤相关抗原为NKG2D配体，所述抗原结合结构域为选自NKG2D蛋白的胞外段。

4.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，

所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区；

所述跨膜结构域选自：CD8、CD28、CD33、CD37、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4、和CD3ε中的一种或多种的跨膜结构域；

所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD28、CD30、CD40、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3中的多种。

5.一种细胞药物/药物组合物，其特征在于，其含有作为活性成分的根据权利要求1-4之任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞以及药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的细胞药物/药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自实体瘤或非实体瘤；其中，所述实体瘤为特异性表达NKG2D配体的肿瘤；所述实体瘤选自前列腺癌、胰腺癌、肝癌、直肠癌、胃癌和乳腺癌中的任意一种。