具体实施方式
为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识,用以较佳的实施例对本发明进行详细的说明。
本发明中所使用的试验材料,无特殊说明,均可从商业途径得到;本发明中的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用主要材料的来源为:
pCDH载体:购自addgene公司;
xbaⅠ限制性内切酶:购自NEB公司,产品货号为R0145;
NotⅠ限制性内切酶:购自NEB公司,产品货号为R0189;
BamH1-F限制性内切酶:购自NEB公司;
T4连接酶:购自NEB公司,产品货号为M0202;
pCDH-EF1α-MCS空载体:购自SBI公司,产品货号为CD502A-1;
琼脂糖:购自生工生物工程(上海)股份有限公司,产品货号为A600434;
DH5α大肠杆菌:购自中国食品药品检定研究院;
293T细胞:购于美国菌种保藏中心ATCC,产品目录号为CRL-11268。
实施例1
敲减人IL-15的siRNA的序列的设计:
从NCBI官方网站上获取到IL-15不同异构体的mRNA,进行比对,得到它的共同序列,以这段序列为靶向序列进行siRNA的设计。
利用设计网站https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/seq/search,获得三对特异性较好的序列,其中选择特异性较好的a序列进行试验:
a.正义链序列如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列,反义链序列如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列;
b.正义链序列如SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列,反义链序列如SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列;
c.正义链序列如SEQ ID NO.5所述的核苷酸序列,反义链序列如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列。
敲减人IL-15的siRNA的序列的设计与合成:
转录siRNA的基因将使用human U6启动子来启动,并在siRNA的转录序列后端连接polyA序列,所述polyA序列如SEQ ID NO.7所示。
在U6启动子的前端加入BamHI酶切位点末端和保护性碱基,在polyA序列末端后加入NotI酶切位点末端和保护性碱基,具体序列如SEQ ID NO.8所示,直接进行U6启动子+siRNA+polyA整个siRNA转录基因序列的成,所述DNA的合成由南京金斯瑞生物科技有限公司进行。
实施例2
敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒载体的构建
(1)CD19 CAR的pCDH载体的构建:
CD19 CAR基因是采用二代CAR的组成方式,整个CD19 CAR由识别CD19分子的scFv片段,CD8跨膜区,4-1BB片段,CD3ζ片段组成;
scFv是Anti-CD19的抗体分子轻链与重链组成单链分子,具体序列来源于专利号为PCTUS2011064191的专利文献,所述序列如SEQ ID NO.9所示;CD8α hinge region/Transmembrane(CD8α hinge/TM),CD8α铰链区和跨膜区,CD8α铰链区是一段柔性区域,含有大量脯氨酸,CD8α跨膜区主要将胞外区和胞内区锚定在细胞膜上。Genebank数据库中查得CD8α铰链区和跨膜区序列NM_001768(1301..1507);
4-1BB属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,表达于活化的T细胞上,是T细胞协同刺激因子,配体为4-1BBL,两者结合后可刺激T细胞的活化和增殖;
CD3ζ胞内区是将胞外接收的信号传递至胞内,并将活化信号传递到核内,激活T细胞的增殖。CD3ζ含有3个免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif,ITAM)具体序列来源于专利号为PCTUS2011064191的专利文献,所述序列如SEQ ID NO.10所示。
CD19 CAR序列由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成,并在CD19 CAR序列两端加入xbaⅠ限制性内切酶和NotⅠ限制性内切酶的酶切位点粘性末端以及保护性碱基,CD19 CAR序列具体构成如图1所示,其序列如SEQ ID NO.11所示。
①用xbaⅠ限制性内切酶和NotⅠ限制性内切酶分别酶切合成的anti-CD19 scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3ζ基因片段和pCDH-EF1α-MCS空载体,于37℃酶切30min,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果,分离纯化anti-CD19scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3ζ基因片段1461bp产物、和pCDH-EF1α-MCS空载体6418bp产物;
②分别使用T4连接酶连接酶切后的pCDH-EF1α-MCS空载体与anti-CD19scFV-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ,16℃过夜连接,取2μl连接产物分别转化DH5a大肠杆菌,第二天,挑取单克隆培养获得质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序,获得pCDH-anti-CD19scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3z质粒载体,得到的载体图谱如图2所示。
(2)将敲减IL-15的siRNA序列克隆进入CD19 CAR的pCDH质粒载体中:
采用CD19 CAR载体构建的方法,使用NotI与BamH1-F两种限制性内切酶进行酶切,于37℃酶切30min,将敲减IL-15的siRNA序列克隆进入CD19 CAR的pCDH载体中。随后转染DH5α大肠杆菌,进行载体扩增以及测序鉴定,获得pCDH-anti-CD19 scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3z-IL15KD质粒载体。最终敲减IL15 CD19 CAR载体如图3所示。
(3)pCDH-anti-CD19scFV-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ和pCDH-anti-CD19scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3ζ-IL15KD慢病毒的包装和收获:
①293T细胞的准备:转染前24小时,铺6孔板,8×105细胞/孔,2mL/孔;待细胞密度达90%时即可用于转染;
②病毒包装:表达质粒和辅助质粒的加入量如下:
③向一灭菌EP管中按照上述表格的量加入所制备的各DNA溶液,辅助质粒和表达质粒,与200μL的DMEM(不加FBS)混合均匀,在室温下温育5分钟。将293Fection试剂轻柔摇匀,取10μL的293Fection试剂在另一管中与200μL的DMEM(不加FBS)混合,在室温下温育5min。把稀释后的DNA与稀释后的293Fection进行混合,轻轻地颠倒混匀,不要振荡。必须在5min之内混合。混合后,在室温下温育20min,以便形成DNA与293Fection稀释液的转染复合物。将DNA与293Fection混合液转移至293T细胞的培养液中,混匀,于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。感染4-6h后,更换新的加血清的DMEM培养基;
④感染后72h收集上清,将病毒上清于400g离心10min,除去细胞碎片,以0.45μm滤器过滤上清液于1.5mL离心管中(分装,1mL/管),于-80℃长期保存。
(4)pCDH-anti-CD19 scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3ζ和pCDH-anti-CD19 scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3ζ-T2A-IL15KD慢病毒浓缩和滴度检测:
①感染后72h收集上清,将病毒上清于400g离心10min,除去细胞碎片;
②以0.45μm滤器过滤上清液于40mL超速离心管中;
③将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内,25000×g,4℃离心2h;
④离心结束后,除去上清,加入病毒保存液,轻轻反复吹打重悬;
⑤样品滴度的检测,将pCDH-anti-CD19scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3ζ和pCDH-anti-CD19scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3ζ-IL15KD慢病毒稀释至107TU/mL,-80℃保存。
实施例3
敲减人IL-15的CD19 CAR-T细胞:
T细胞的培养和pCDH-anti-CD19 scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3ζ和pCDH-anti-CD19scFV-CD8α hinge/TM-CD137-CD3ζ-IL15KD慢病毒转染T细胞
(1)T细胞的复苏:液氮中取出PBMC细胞一支,迅速放入37℃水浴锅中迅速溶解,待细胞冰块只有黄豆大小时,将PBMC细胞转入已预热的RPMI1640培养基中,300g离心5min,去除上清液,KBM581无血清培养基将PBMC细胞重悬,加入至1μg/mL anti-CD3、2μg/mL anti-CD28预包被的培养瓶中,37℃5%CO2培养;
(2)第四天,将T细胞转入Retronectin预包被的慢病毒中,MOI值为10,即慢病毒:T细胞=10:1,37℃5%CO2培养。即可获得CD19 CAR-T细胞和敲减IL15的CD19 CAR-T细胞。
实施例4
CAR-T细胞体外增殖及维持能力:
在使用敲减IL-15的CD19 CAR慢病毒感染T细胞后,分别在第2、4、6、8、10、12天的时间点进行CAR-T细胞数目分析,分析采用流式细胞术,以CD3分子作为门控,使用特异性识别anti-CD19scFv的抗体耦联荧光分子进行流式标记来计算CAR-T细胞数目。CD19 CAR病毒与敲减IL-15的CD19 CAR慢病毒制备的CAR-T细胞扩增增殖曲线如图4所示,图4中IL15 KDCD19 CAR-T为敲减IL-15的CD19 CAR慢病毒制备的CAR-T细胞,CD19 CAR-T表示CD19 CAR病毒制备的CAR-T细胞,从图4可以看出,IL-15 siRNA的表达序列对CD19 CAR分子的表达以及CAR-T细胞的扩增无显著影响。
实施例5
细胞杀伤实验效果评估:
(1)分别培养CD19+K562细胞和PBMC细胞;
(2)实验开始前4天,MOI=10的CD19 CAR和敲减IL15的CD19 CAR的病毒感染PBMC细胞,培养72-96h后可安排开始实验;
(3)收集靶细胞(CD19+K562)5×105cells和效应细胞(CART细胞)3×106cells,800g,6min离心,弃上清;
(4)用1mL 1×PBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞,800g,6min离心,弃上清;
(5)重复步骤(3)一次;
(6)用700μL培养基(1640培养基+10%FBS)重悬效应细胞,用2mL培养基(1640培养基+10%FBS)重悬靶细胞;
(7)设置效靶比为10:1的实验孔,并设置对照组,每组3个复孔;
(8)250×g,5min平板离心;
(9)37℃5%CO2培养箱中培养4h;
(10)250×g,5min平板离心;
(11)取每个孔的50μL上清到新96孔板中,并且每孔加入50μL底物溶液(避光操作);
(12)避光孵育25min;
(13)每孔加入50μL终止液;
(14)酶标仪检测490nm吸光度;
(15)将3个复孔取平均值;将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值;将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值;
(16)将步骤15中获得的经过校正的值带入下面公式,计算每个效靶比所产生的细
(17)胞毒性百分比,其中杀伤效率=(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)×100%。
结果如图5所示,单个核细胞(PBMC)为对照组,CD19 CAR-T细胞与敲减IL-15的CD19 CAR-T细胞(图中表示为IL 15KD CD19 CAR-T)对靶细胞的杀伤效果相似,说明敲减IL-15并没有显著影响效应细胞的杀伤能力。
实施例6
IL-15敲减效果评估及评估其他细胞因子释放:
先单独培养CD19+K562细胞、CD19 CAR-T细胞、敲减IL-15的CD19 CAR-T细胞(图中表示为IL 15 KD CD19 CAR-T),再分别收集各种细胞进行共培养,具体方法同上述杀伤功能检测。设置效靶比为10:1的实验孔,并设置对照组,在37℃5%CO2培养箱中共培养10h,收集200μL共培养上清液,进行ELISA检测,检测项目包括IL-15,IL-2,IFNγ。从图6中可以看出,IL-15在敲减IL-15效应细胞组以及与靶细胞共培养组都比对照组的IL-15水平显著减少,如图7、图8所示,其他的细胞因子,包括IL-2、IFNγ都没有显著变化。
以上仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅限于上述实施例,与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽古一生物科技有限公司
<120> 敲减人 IL-15 的 siRNA、CD19 CAR 表达载体、CAR-T 细胞及构建方法和应用
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccaactgggt gaatgtaata actcgagtta ttacattcac ccagttgg 48
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttgaccca cttacattat tgagctcaat aatgtaagtg ggtcaacc 48
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcatattgat gctactttat actcgagtat aaagtagcat caatatgc 48
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgtataacta cgatgaaata tgagctcata tttcatcgta gttatacg 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcttggagtt acaagttatt tctcgagaaa taacttgtaa ctccaaga 48
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agaacctcaa tgttcaataa agagctcttt attgaacatt gaggttct 48
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cacacaaaaa accaacacac agatgtaatg aaaataaaga tattttatt 49
<210> 8
<211> 374
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
caccggatcc gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 60
tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 120
gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 180
ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 240
gtggaaagga cgaaacaccg gtccaactgg gtgaatgtaa taactcgagt tattacattc 300
acccagttgg cacacaaaaa accaacacac agatgtaatg aaaataaaga tattttattg 360
aagcggccgc ccac 374
<210> 9
<211> 745
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatg 745
<210> 10
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag 60
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct 340
<210> 11
<211> 1459
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140
agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440
caggccctgc cccctcgct 1459