CN111304255A - 一种滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增nk细胞中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用，该制备方法包括S1，pLenti‑mbIL21‑4.1BBL‑CD16A‑OX40L质粒载体的构建；S2，重组慢病毒的包装；S3，K562‑mbIL21‑4.1BBL‑CD16A‑OX40L滋养细胞的制备；S4，脐血或外周血白膜层细胞的制备；S5，NK细胞的体外扩增；本发明通过滋养细胞为NK细胞提供IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L等多个刺激分子来激活NK细胞，从而促使其体外大量增殖；NK细胞经过一个14天的增殖周期，能扩增10000倍以上，制得的NK细胞纯度能达到90％以上，相较于传统的表达IL21和4.1BBL滋养细胞刺激NK培养方法，本发明方法得到的NK细胞纯度，质量以及数量都有明显提高。

Description

一种滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及到一种能激活多个信号通路的滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用。
背景技术
NK细胞是一种先天性免疫细胞，它是病毒感染细胞和肿瘤细胞的天然杀手。与T细胞不同的是，NK细胞能通过其上的抑制受体KIR和NKG2A以及激活受体NKG2D、CD16以及NKp30来识别反常细胞，当靶细胞低水平表达抑制配体并且高水平表达激活配体时，就能导致NK细胞激活，释放穿孔素和颗粒酶来杀死靶细胞。
除了直接的抗肿瘤作用，NK细胞还能参与后天性的抗肿瘤反应，能起到免疫调解功能。
NK细胞主要在外周血中分布，一般成人的NK细胞占外周血单个核细胞的5％到10％，淋巴结和骨髓也有少量的NK细胞，而且大多数是处于静息状态。在NK细胞肿瘤免疫治疗中，往往需要很大数量的NK细胞才有比较好的治疗效果，因而，如何在体外高效扩增NK细胞是治疗癌症的关键所在。
目前，NK细胞的扩增方式主要有两种，一种是通过IL2、IL12、IL15、IL18、IL21等细胞因子来对NK细胞刺激扩增，这种方法的缺陷是成本较高，而且NK细胞增殖的倍数较少。另一种是通过滋养细胞刺激NK细胞增殖。目前最常用的滋养细胞是经过辐射的表达IL21和4.1BBL的K562细胞。对于NK细胞来说，IL21刺激能增强IFN-γ分泌、上调NK细胞穿孔素的分泌和表达、增强NK细胞毒功能，同时加速NK细胞的成熟和提高NK细胞激活受体的表达。4.1BBL也能调节NK细胞的激活信号传导。但这种方法也有扩增倍数不够理想，扩增的NK细胞CD56+CD16+双阳性比例低等缺陷。因而临床细胞免疫治疗急需一种更高效高质的NK细胞体外扩增方法。
人们现在知道治疗性抗体能明显提高
Figure BDA0002389255240000021
NK细胞对肿瘤细胞的毒性，这种抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)是通过结合治疗性抗体的Fc部分到NK细胞的激活受体CD16，从而促使NK细胞激活。最近有人报道，通过OX40受体来激活NK细胞能增加NK细胞的IFN-γ分泌、细胞毒性以及增殖，OX40L是一个很好的提高NK细胞增殖的分子靶标。能否在K562稳定表达IL21和4.1BBL的基础上，同时表达NK细胞激活受体CD16的单链抗体CD16A和OX40的配体OX40L，利用这4种分子同时表达在K562细胞上，然后再作为滋养细胞来培养NK细胞，从而提高扩增的NK细胞的质量和数量是目前本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的培养方法中NK细胞CD56+CD16+双阳性比例低、扩增倍数低等问题，本发明的目的在于提供一种能激活多个信号通路的滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用，利用IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L同时表达在K562细胞，并通过puromycin进行筛选，获得这4种分子同时高表达在细胞膜上的滋养细胞来培养NK细胞，最终获得高质量和高数量的体外扩增NK细胞。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
依据本发明提出的一种pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体，包括如SEQ IDNO:5所示的整个载体连续编码区序列IL21-F2A-4.1BBL-E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体的制备方法，包括以下步骤：
S11，利用基因合成的方法合成E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A-puro基因的全长编码区序列；
S12，将CD16A-P2A-OX40L基因构建到慢病毒质粒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL载体上，形成pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：
S31，将1-2million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1-2毫升含有10％wtFBS的1640培养基；
S32，再将30-35毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养5-6天后，再用1-4μg/ml的Puromycin进行选择性培养；
S33，用流式检测K562-mbIL21-4.1BBL和K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L的各个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上；
S34，再用100Gy的γ射线照射10分钟，-80℃冰箱进行冻存，用于以后的NK细胞培养实验。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞，所述滋养细胞是通过上述的方法制备得到的。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种NK细胞的制备方法，包括以下步骤：
将上述的质粒载体包装慢病毒颗粒后，再将所述慢病毒颗粒侵染滋养细胞系，获得能够表达目的基因的滋养细胞，再利用滋养细胞在体外大量扩增NK细胞，得到高质量的NK细胞。
优选的，前述的NK细胞的制备方法，所述目的基因包括IL21、4.1BBL、CD16A和OX40L中的至少一种；所述滋养细胞系包括肿瘤细胞。
优选的，前述的NK细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1，pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体的构建；
S2，用pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体包装慢病毒颗粒；
S3，K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞的制备；
S4，脐血或外周血白膜层细胞的制备；
S5，NK细胞的体外扩增。
优选的，前述的NK细胞的制备方法，步骤S2具体包括：
S21，重组慢病毒的包装制备；
S22，重组慢病毒的超速离心浓缩。
优选的，前述的NK细胞的制备方法，步骤S21中，所述重组慢病毒的包装制备方法为：
S21-1)每10cm细胞培养皿中加入4.5-5million的293FT细胞和9-10毫升DMEM完全培养基，混合混匀，在细胞培养箱中进行培养；
S21-2)培养第2天，每个培养皿中加入如下试剂：500-550μL jetPRIME buffer、6-7μg表达pLenti-mbIL21-4.1BBL或者pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L慢病毒载体质粒、3-4μg psPAX2和1.5-2μg pMD2.G，混合均匀，然后再向体系中加入jetPRIME，25μL/10cm培养皿，再次混合均匀，室温静置10min，得到混合液；
S21-3)将用于包装病毒的293FT细胞从培养箱中取出，将混合液平均加到每个培养皿中，混匀，放入培养箱中继续培养。培养4h后，弃去旧培养基，加入PBS清洗细胞，再加入含10wt％FBS的DMEM完全培养基，放入培养箱中进行培养。
优选的，前述的NK细胞的制备方法，步骤S22中，所述重组慢病毒的超速离心浓缩方法为：
S22-1)培养48小时后收取培养上清作为病毒原液，并将收集到的病毒原液过滤到离心管中；
S22-2)4℃，100000g超速离心2小时，弃上清液，向沉淀中加入DMEM完全培养基重选病毒颗粒，得到表达IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L 4个基因的慢病毒颗粒。
优选的，前述的NK细胞的制备方法，步骤S4中，所述获取脐血或外周血白膜层细胞的制备方法为：
S41，在50毫升的离心管中加入15-20毫升的淋巴细胞分离液；
S42，向离心管中缓缓加入30-35毫升的外周血；
S43，室温2000转/分钟快升慢降离心20分钟；
S44，将白膜层细胞转移到一个新的离心管中，用生理盐水补充到50毫升，1800转/分钟快升快降离心8分钟；
S45，弃去上清，用1毫升生理盐水将细胞悬起，再用生理盐水补充到50毫升，1200转/分钟快升快降离心8分钟，即获得白膜层细胞。
优选的，前述的NK细胞的制备方法，步骤S5中，所述NK细胞的体外扩增方法为：
S51，给白膜层细胞计数，用含有200IU/ml IL2的X-VIVO无血清培养基将细胞密度调整为1million/ml，然后加入经过100Gy剂量γ射线照射的K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞在T75或T150培养瓶中进行共培养，K562和T细胞细胞数量的比例为2：1；
S52，共培养第3天和第5天，分别添加1倍体积的含有IL2的X-VIVO无血清培养基；
S53，共培养第7天，给NK细胞计数，再加入经过100Gy剂量γ射线照射的K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞细胞进行第2轮共培养，K562和NK细胞的细胞数量比例为2：1，细胞转入培养袋中进行培养；
S54，期间添加1倍体积的含有IL2的X-VIVO培养基，继续培养7天。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种NK细胞，所述NK细胞的CD56+CD16+双阳性比例在90％以上。
优选的，前述的NK细胞，所述NK细胞是通过上述方法制得的。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：
本发明所提供的滋养细胞，其利用表达IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L 4个基因的K562细胞作为滋养细胞，进行两轮14天的NK刺激培养，从而实现NK细胞的优质大量增殖。
本发明所提供的滋养细胞，其在K562细胞稳定表达IL21和4.1BBL的基础上，同时又表达细胞膜结合的CD16A分子来结合NK细胞激活受体CD16，表达OX40L来结合NK细胞激活受体OX40，从而形成对NK细胞的多个信号通路的激活，实现优质大量增殖NK细胞。
本发明所提供的滋养细胞，其利用慢病毒载体同时表达IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L 4个基因，降低了包装慢病毒的成本，简化了慢病毒的包装过程的工作量。
本发明所提供的滋养细胞，其经过一个14天周期的扩增，NK细胞数量能达到1010级别以上，CD56+CD16+双阳性比例在90％以上。
本发明所提供的滋养细胞，其为获得高质量、高纯度、高扩增倍数的NK细胞奠定了良好的实践基础。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1为本发明的pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L慢病毒质粒载体图谱；
图2为本发明最终得到的K562-mbIL21-4.1BBL滋养细胞对IL21、4.1BBL的表达流式检测结果；
图3为本发明最终得到的K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞对IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L的表达流式检测结果；
图4为本发明的用K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞刺激NK细胞增殖14天后的NK细胞流式检测结果；
图5为本发明的用K562-mbIL21-4.1BBL滋养细胞刺激NK细胞增殖14天后的NK细胞流式检测结果；
图6为本发明的K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞和传统方法的K562-mbIL21-4.1BBL滋养细胞分别刺激NK细胞增殖14天过程中NK细胞的增殖曲线图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用其具体实施方式、特征及其性能，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
下面以具体的实施例对本发明做进一步说明，但不作为本发明的限定。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的材料或试剂，如无特别说明，均为市购。
实施例1
pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L慢病毒质粒载体的构建
在NCBI等网站查询得到OX40L cDNA(accession number NM_003326)序列(如SEQIDNO:1所示)，将抗体AFM13的CD16抗体重链(重链可变区VH)和轻链(轻链可变区VL)，设计成膜结合的CD16单链抗体序列(CD16A，如SEQ IDNO:2所示)，膜结合部分为CD8A的膜结合区序列；
通过现有的基因合成的方法合成E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A-puro的基因(如SEQIDNO:3所示)，并在其两侧合成上BsmBI和SalI两个酶切位点，编码区避免出现这两个酶切位点；
将上述合成的基因用BsmBI和SalI两个酶进行双酶切，再通过T4 DNA连接酶连接到慢病毒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL(如SEQ IDNO:4所示，中国科学院遗传发育研究所赠送)上，形成的整个载体连续编码区为IL21-F2A-4.1BBL-E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A，此载体命名为pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L(如SEQ IDNO:5所示)，如图1所示。
将上述连接产物转化到E.coli(DH5α)细胞中，通过PCR鉴定出阳性的克隆，然后送到苏州泓迅生物技术公司进行测序验证；
将验证正确的阳性克隆用Qiagen的质粒大提试剂盒进行大提质粒。
实施例2
重组慢病毒的包装制备
1.每10cm细胞培养皿中加入4.5million的293FT细胞和9毫升DMEM完全培养基，混合混匀，在细胞培养箱中进行培养(37℃，5％(v/v)CO2)；
2.培养第2天，每个培养皿中分别加入如下试剂：500μL jetPRIME buffer、6μg表达IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L的慢病毒载体、3μg psPAX2和1.5μg pMD2.G，混合均匀，然后再向体系中加入jetPRIME，25μL/10cm培养皿，再次混合均匀，室温静置10min，得到混合液；
3.将用于包装病毒的293FT细胞从培养箱中取出，将混合液平均加到每个培养皿中，摇匀，放入培养箱中继续培养(37℃，5％(v/v)CO2)。培养4h后，弃去旧培养基，加入PBS清洗细胞，再加入含10wt％FBS的DMEM完全培养基，放入培养箱中进行培养(37℃，5％(v/v)CO2)；
4.培养48小时后收取培养上清作为病毒原液，并将收集到的病毒原液过滤到离心管中；
5. 4℃，100000g超速离心2小时，弃上清液，向沉淀中加入300到500微升的DMEM完全培养基重选病毒颗粒，得到表达IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L这4个基因的慢病毒颗粒。
实施例3
K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞的制备
将1million的生长旺盛的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1毫升含有10wt％FBS的1640；
随后将上述30毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养(37℃，5％(v/v)CO2)5天后，再用3μg/ml的Puromycin进行选择性培养；
用流式检测IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L这4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上(见图2和图3)；
再用100Gy的γ射线进行照射10分钟，照射后-80℃冰箱进行分支冻存，用于以后的γδT细胞培养实验。
实施例4
获取脐血或外周血的白膜层细胞
在50毫升的离心管中加入15毫升的淋巴细胞分离液；
向离心管中缓缓加入30毫升的新鲜血；
室温2000转/分钟快升慢降离心20分钟；
将白膜层细胞转移到一个新的离心管中，用生理盐水补充到50毫升，1800转/分钟快升快降离心8分钟；
5.弃去上清，用1ml生理盐水将细胞悬起，再用生理盐水补充到50毫升，1200转/分钟快升快降离心8分钟，即获得白膜层细胞。
实施例5
NK细胞的体外扩增
给白膜层细胞计数，用含有200IU/ml IL2的X-VIVO无血清培养基将细胞密度调整为1million/ml，然后加入实施例3经过100Gy剂量γ射线照射的K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞在T75或T150培养瓶中进行共培养，K562和T细胞的细胞数量比例为2：1；
共培养第3天和第5天，分别添加原有培养基体积的一倍的含有IL2的X-VIVO无血清培养基；
共培养第7天，给NK细胞计数，再加入实施例3经过100Gy剂量γ射线照射的K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞进行第2轮共培养(37℃，5％(v/v)CO2)，K562和NK细胞的细胞数量比例为2：1，细胞转入培养袋中进行培养(37℃，5％(v/v)CO2)；
期间视细胞生长情况添加含有IL2的X-VIVO培养基(加入量为原有培养基体积的一倍)，继续培养(37℃，5％(v/v)CO2)7天。
检测NK细胞培养14天后的增殖数
取培养14天期间的NK细胞，计数制作NK细胞增殖曲线图，见图5，可知，相较于传统的K562-IL21-4.1BBL滋养细胞培养方法，K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞培养方法14天后的细胞数量有明显的提高，最终获得的NK细胞是传统方法的两倍以上，NK细胞增殖了10000倍以上，这说明在滋养细胞上增加CD16A和OX40L这两个NK细胞刺激分子能显著增加NK细胞扩增的数量(见图6)。
检测NK细胞增殖后的阳性率
取培养14天后的NK细胞，稀释细胞密度为1million/ml，其中三管用于CD3-APC、CD16-FITC、CD56-PE单染用于荧光补偿，另外一管用于三色共染，然后经过流式细胞仪检测，结果显示NK细胞CD56+CD16+双阳性比例在90％以上，相较于传统的K562-IL21-4.1BBL滋养细胞培养方法，K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞培养方法14天后的细胞质量有明显的提高，CD56+CD16+双阳性比例由87.3％增加到92.3％(见图4和图5)，这说明在滋养细胞上增加CD16A和OX40L这两个NK细胞刺激分子能显著增加NK细胞的质量。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 秦皇岛中邦干细胞医学科技有限公司
<120> 一种滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用
<130> P2010192
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 549
<212> DNA
<213> Homo sapiens（人类）
<400> 1
atggaaaggg tccaacccct ggaagagaat gtgggaaatg cagccaggcc aagattcgag 60
aggaacaagc tattgctggt ggcctctgta attcagggac tggggctgct cctgtgcttc 120
acctacatct gcctgcactt ctctgctctt caggtatcac atcggtatcc tcgaattcaa 180
agtatcaaag tacaatttac cgaatataag aaggagaaag gtttcatcct cacttcccaa 240
aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac aactcagtca tcatcaactg tgatgggttt 300
tatctcatct ccctgaaggg ctacttctcc caggaagtca acattagcct tcattaccag 360
aaggatgagg agcccctctt ccaactgaag aaggtcaggt ctgtcaactc cttgatggtg 420
gcctctctga cttacaaaga caaagtctac ttgaatgtga ccactgacaa tacctccctg 480
gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg attcttatcc atcaaaatcc tggtgaattc 540
tgtgtcctt 549
<210> 2
<211> 993
<212> DNA
<213> mice（小鼠）
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagctacg tgctgaccca gccttctagc gtgagcgtgg ctccaggaca gacagccaca 120
atctcttgcg gcggccacaa tatcggcagc aagaacgtgc attggtacca gcagcggcca 180
ggacagtctc ccgtgctggt catctaccag gacaacaaga ggcccagcgg catcccagag 240
agattcagcg gcagcaacag cggcaataca gccaccctga ccatcagcgg aacacaggcc 300
atggacgagg ccgactacta ttgccaggtc tgggacaact acagcgtgct gtttggcggc 360
ggaacaaagc tgaccgtgct gggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 420
ggatctcagg tgcagctggt gcagtcagga gcagaagtga agaagcccgg cgagtctctg 480
aaggtgtctt gcaaggccag cggctacacc ttcaccagct actacatgca ttgggtccgg 540
caggctccag gacagggact cgagtggatg ggaatcatca accctagcgg cggcagcaca 600
agctacgctc agaagttcca gggcagggtg accatgacca gagacaccag caccagcacc 660
gtgtacatgg agctgagcag cctgagaagc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgccagg 720
ggaagcgcct actactacga cttcgccgac tattggggcc agggaacact ggtgaccgtg 780
tcttctacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900
gggctggact tcgcctgtga catctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 960
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgc 993
<210> 3
<211> 2364
<212> DNA
<213> Artificial sequence（人工序列）
<220>
<223> misc_feature
<400> 3
caatgtacta actacgcttt gttgaaactc gctggcgatg ttgaaagtaa ccccggtcct 60
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 120
ccgagctacg tgctgaccca gccttctagc gtgagcgtgg ctccaggaca gacagccaca 180
atctcttgcg gcggccacaa tatcggcagc aagaacgtgc attggtacca gcagcggcca 240
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gggctggact tcgcctgtga catctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 1020
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcgcaacaa acttctcact actcaaacaa 1080
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gtgggaaatg cagccaggcc aagattcgag aggaacaagc tattgctggt ggcctctgta 1200
attcagggac tggggctgct cctgtgcttc acctacatct gcctgcactt ctctgctctt 1260
caggtatcac atcggtatcc tcgaattcaa agtatcaaag tacaatttac cgaatataag 1320
aaggagaaag gtttcatcct cacttcccaa aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac 1380
aactcagtca tcatcaactg tgatgggttt tatctcatct ccctgaaggg ctacttctcc 1440
caggaagtca acattagcct tcattaccag aaggatgagg agcccctctt ccaactgaag 1500
aaggtcaggt ctgtcaactc cttgatggtg gcctctctga cttacaaaga caaagtctac 1560
ttgaatgtga ccactgacaa tacctccctg gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg 1620
attcttatcc atcaaaatcc tggtgaattc tgtgtccttg agggcagagg aagtcttcta 1680
acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc cctgagggca gaggaagtct tctaacatgc 1740
ggtgacgtgg aggagaatcc cggccctatg actgaataca aaccaactgt tcgcctggca 1800
actcgtgatg atgttccacg tgcagttcgc actctggctg ctgcatttgc tgactaccct 1860
gcaacccgtc acactgtgga cccagaccgc cacattgaac gtgtgactga actgcaggag 1920
ctgttcctga cccgtgtggg cctggacatt ggcaaagtgt gggtggcaga tgatggtgct 1980
gctgtggcag tgtggaccac ccctgaatct gttgaagctg gtgcagtgtt tgctgagatt 2040
ggcccacgca tggcagaact gtctggcagc cgcctggcag cacaacagca gatggaaggt 2100
ctgctggcac cacaccgccc aaaagaacct gcttggttcc tggcaactgt gggtgtgagc 2160
cctgaccacc agggtaaggg cctgggctct gcagtggtgc tgcctggtgt ggaagcagct 2220
gaacgtgcag gtgtgcctgc tttcctggag acctcagctc cacgcaacct gcctttctat 2280
gaacgcctgg gcttcactgt gactgctgat gtggaagtgc cagaaggccc acgcacttgg 2340
tgcatgactc gcaaaccagg tgct 2364
<210> 4
<211> 1521
<212> DNA
<213> Homo sapiens（人类）
<400> 4
atgagatcca gtcctggcaa catggagagg attgtcatct gtctgatggt catcttcttg 60
gggacactgg tccacaaatc aagctcccaa ggtcaagatc gccacatgat tagaatgcgt 120
caacttatag atattgttga tcagctgaaa aattatgtga atgacttggt ccctgaattt 180
ctgccagctc cagaagatgt agagacaaac tgtgagtggt cagctttttc ctgctttcag 240
aaggcccaac taaagtcagc aaatacagga aacaatgaaa ggataatcaa tgtatcaatt 300
aaaaagctga agaggaaacc accttccaca aatgcaggga gaagacagaa acacagacta 360
acatgccctt catgtgattc ttatgagaaa aaaccaccca aagaattcct agaaagattc 420
aaatcacttc tccaaaagat gattcatcag catctgtcct ctagaacaca cggaagtgaa 480
gattccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 540
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 600
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 660
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ctcaagttgg cgggagacgt ggagtccaac ccagggccca tggaatacgc ctctgacgct 780
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cggcagggca tgtttgcgca gctggtggcc caaaatgttc tgctgatcga tgggcccctg 1080
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gcctcctccg aggctcggaa ctcggccttc ggtttccagg gccgcttgct gcacctgagt 1380
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<210> 5
<211> 3885
<212> DNA
<213> Artificial sequence（人工序列）
<220>
<221> misc_feature
<223> 质粒载体
<400> 5
atgagatcca gtcctggcaa catggagagg attgtcatct gtctgatggt catcttcttg 60
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gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 660
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcgtgaaac agactttgaa ttttgacctt 720
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ttgctgctcc acgccgccag gccgagctac gtgctgaccc agccttctag cgtgagcgtg 1680
gctccaggac agacagccac aatctcttgc ggcggccaca atatcggcag caagaacgtg 1740
cattggtacc agcagcggcc aggacagtct cccgtgctgg tcatctacca ggacaacaag 1800
aggcccagcg gcatcccaga gagattcagc ggcagcaaca gcggcaatac agccaccctg 1860
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tactacatgc attgggtccg gcaggctcca ggacagggac tcgagtggat gggaatcatc 2160
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gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 2460
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg acatctacat ctgggcgccc 2520
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcgcaaca 2580
aacttctcac tactcaaaca agcaggtgat gtggaggaga atcccggccc tatggaaagg 2640
gtccaacccc tggaagagaa tgtgggaaat gcagccaggc caagattcga gaggaacaag 2700
ctattgctgg tggcctctgt aattcaggga ctggggctgc tcctgtgctt cacctacatc 2760
tgcctgcact tctctgctct tcaggtatca catcggtatc ctcgaattca aagtatcaaa 2820
gtacaattta ccgaatataa gaaggagaaa ggtttcatcc tcacttccca aaaggaggat 2880
gaaatcatga aggtgcagaa caactcagtc atcatcaact gtgatgggtt ttatctcatc 2940
tccctgaagg gctacttctc ccaggaagtc aacattagcc ttcattacca gaaggatgag 3000
gagcccctct tccaactgaa gaaggtcagg tctgtcaact ccttgatggt ggcctctctg 3060
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catgtgaatg gcggagaact gattcttatc catcaaaatc ctggtgaatt ctgtgtcctt 3180
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccctgagggc 3240
agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccggccctat gactgaatac 3300
aaaccaactg ttcgcctggc aactcgtgat gatgttccac gtgcagttcg cactctggct 3360
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cgtgtgactg aactgcagga gctgttcctg acccgtgtgg gcctggacat tggcaaagtg 3480
tgggtggcag atgatggtgc tgctgtggca gtgtggacca cccctgaatc tgttgaagct 3540
ggtgcagtgt ttgctgagat tggcccacgc atggcagaac tgtctggcag ccgcctggca 3600
gcacaacagc agatggaagg tctgctggca ccacaccgcc caaaagaacc tgcttggttc 3660
ctggcaactg tgggtgtgag ccctgaccac cagggtaagg gcctgggctc tgcagtggtg 3720
ctgcctggtg tggaagcagc tgaacgtgca ggtgtgcctg ctttcctgga gacctcagct 3780
ccacgcaacc tgcctttcta tgaacgcctg ggcttcactg tgactgctga tgtggaagtg 3840
ccagaaggcc cacgcacttg gtgcatgact cgcaaaccag gtgct 3885

Claims (11)

1.一种pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体，其特征在于，包括如SEQ IDNO:5所示的整个载体连续编码区序列IL21-F2A-4.1BBL-E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A。
2.一种权利要求1所述的pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11，利用基因合成的方法合成E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A-puro基因的全长编码区序列；
S12，将CD16A-P2A-OX40L基因构建到慢病毒质粒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL载体上，形成pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体。
3.一种K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S31，将1-2million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1-2毫升含有10％wtFBS的1640培养基；
S32，再将30-35毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养5-6天后，再用1-4μg/ml的Puromycin进行选择性培养；
S33，用流式检测K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L的4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上；
S34，再用100Gy的γ射线照射10分钟，-80℃冰箱进行冻存。
4.一种K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞，其特征在于，所述滋养细胞是通过权利要求3所述的方法制备得到的。
5.一种NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的质粒载体包装慢病毒颗粒后，再将所述慢病毒颗粒侵染滋养细胞系，获得能够表达目的基因的滋养细胞，再利用滋养细胞在体外大量扩增NK细胞，得到高质量的NK细胞。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述目的基因包括IL21、4.1BBL、CD16A和OX40L中的至少一种；所述滋养细胞系包括肿瘤细胞。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体的构建；
S2，用pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体包装慢病毒颗粒；
S3，K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞的制备；
S4，脐血或外周血白膜层细胞的制备；
S5，NK细胞的体外扩增。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括：
S21，重组慢病毒的包装制备；
S22，重组慢病毒的超速离心浓缩。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，
步骤S21中，所述重组慢病毒的包装制备方法为：
S21-1)每10cm细胞培养皿中加入4.5-5million的293FT细胞和9-10毫升DMEM完全培养基，混合混匀，在细胞培养箱中进行培养；
S21-2)培养第2天，每个培养皿中加入如下试剂：500-550μL jetPRIME buffer、6-7μg的pLenti-mbIL21-4.1BBL或者pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L慢病毒载体质粒、3-4μg psPAX2和1.5-2μg pMD2.G，混合均匀，然后再向体系中加入jetPRIME，25-30μL/10cm培养皿，再次混合均匀，室温静置10-15min，得到混合液；
S21-3)将用于包装病毒的293FT细胞从培养箱中取出，将混合液平均加到每个培养皿中，混匀，放入培养箱中继续培养；培养4-5h后，弃去旧培养基，加入PBS清洗细胞，再加入含10wt％FBS的DMEM完全培养基，放入培养箱中进行培养；
步骤S22中，所述重组慢病毒的超速离心浓缩方法为：
S22-1)培养48小时后收取培养上清作为病毒原液，并将收集到的病毒原液过滤到离心管中；
S22-2)4℃，100000-150000g超速离心2-3小时，弃上清液，向沉淀中加入DMEM完全培养基重选病毒颗粒，得到表达IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L 4个基因的慢病毒颗粒。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
步骤S4中，所述获取脐血或外周血白膜层细胞的制备方法为：
S41，在50毫升的离心管中加入15-20毫升的淋巴细胞分离液；
S42，向离心管中加入30毫升的外周血；
S43，室温2000转/分钟快升慢降离心20分钟；
S44，将白膜层细胞转移到一个新的离心管中，用生理盐水补充到50毫升，1800转/分钟快升快降离心8分钟；
S45，弃去上清，用1毫升生理盐水将细胞悬起，再用生理盐水补充到50毫升，1200转/分钟快升快降离心8分钟，即获得白膜层细胞；
步骤S5中，所述NK细胞的体外扩增方法为：
S51，给白膜层细胞计数，用含有200IU/ml IL2的X-VIVO无血清培养基将细胞密度调整为1-1.5million/ml，然后加入经过100Gy剂量γ射线照射的K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞在T75或T150培养瓶中进行共培养，K562和T细胞细胞数量的比例为2：1；
S52，共培养第3天和第5天，分别添加1倍体积的含有IL2的X-VIVO无血清培养基；
S53，共培养第7天，给NK细胞计数，再加入经过100Gy剂量γ射线照射的K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞细胞进行第2轮共培养，K562和NK细胞的细胞数量比例为2：1，细胞转入培养袋中进行培养；
S54，期间添加1倍体积的含有IL2的X-VIVO培养基，继续培养7天。
11.一种权利要求5-10任一项所述的方法制备的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞的CD56+CD16+双阳性比例在90％以上。
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