CN110684730A - 一种利用滋养细胞高效扩增nk细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程和细胞生物学领域,具体涉及一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,包括1)pHR‑mbIL‑21、pHR‑4‑1BBL和pHR‑MICA质粒载体构建,2)分别用pHR‑mbIL‑21、pHR‑4‑1BBL和pHR‑MICA质粒载体制备重组慢病毒,3)K562‑mbIL‑21‑4‑1BBL‑MICA滋养细胞的制备,4)PBMC细胞的提取,5)NK细胞的体外扩增;本发明提供一种NK细胞的制备方法,采用单独构建表达mbIL‑21、4‑1BBL、MICA三种分子的质粒载体,重组慢病毒感染K562的方法,制备NK细胞,制备方法解决现有技术的缺点,利用IL‑21、4‑1BBL、MICA分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞用于扩增培养NK细胞,其NK细胞扩增倍数高达890倍,制得NK细胞的纯度到达92.2%,并且不同的PBMC细胞间的扩增倍数重复性好。

Description

一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程和细胞生物学领域,具体涉及一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法。
背景技术
目前,全球肿瘤的发生率呈发展迅猛的趋势,然而,传统的治疗手段,如手术,放疗和化疗不能取得良好的效果。肿瘤免疫治疗,是目前医学界公认的第四种肿瘤治疗方法。自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK),是人体固有免疫的主要效应细胞,能无需预先刺激,通过使用穿孔素和颗粒酶以及其他机制,无MHC限制性的杀伤肿瘤细胞。近年来,NK免疫治疗技术由于其无组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)限制性,副作用小,抗肿瘤活性强,正在成为一种广谱的治疗恶性肿瘤的方法。
NK细胞主要分布于外周血中,占外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)的5~10%,淋巴结和骨髓中也有NK活性,但水平较外周血低。而且,NK细胞回输到体内后不会增值,因此在肿瘤免疫治疗中通常需要比较大的细胞数量,才能达到相对较好的治疗效果。因此,如何在体外将NK细胞大量扩增是NK应用于肿瘤免疫治疗的关键之一。
目前NK的扩增主要通过2种方式进行,一种是通过IL-2、IL-15、IL-18和IL-21等细胞因子对NK细胞进行刺激扩增,这种方法能将NK细胞在体外扩增几十到100多倍,且纯度低,不同的PBMC之间的扩增倍数重复性差等缺点。第二种是通过滋养细胞刺激NK细胞扩增的方法。目前最常用的滋养细胞是经过辐照的表达IL-21和4-1BBL的K562细胞,对于NK细胞来说,IL-21能增强IFN-γ的分泌、上调NK细胞穿孔素的分泌和表达、增强细胞毒活性,同时加速NK细胞成熟和NK细胞受体表达。4-1BBL也能调节NK细胞的激活和信号转导。但是这种方法仅仅能将细胞扩增到100多倍,也存在不同的PBMC之间的扩增倍数重复性差等缺点。因此,亟需一种高效的扩增高纯度NK细胞的方式。
目前,已知MICA是NK细胞激活性受体NKG2D的天然配体,NKG2D为NK细胞激活提供主要信号,并能够覆盖别的NK受体接收到的抑制性信号;然而,K562细胞在稳定表达IL-21和4-1BBL分子同时能否进一步表达MICA分子有待研究,利用这三种分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞培养NK,从而提高NK的扩增倍数和纯度是本发明探讨的问题之一。
发明内容
本发明针对背景技术中提出的针对目前NK细胞扩增倍数低、纯度低、重复性差等问题,同时在本发明中利用IL-21、4-1BBL、MICA分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞培养NK细胞,用来提高NK细胞的扩增倍数和纯度也是本发明探讨的问题之一。
因此,本发明提供一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,利用K562细胞在稳定表达mbIL-21和4-1BBL分子的同时进一步表达MICA分子,制得工程细胞株,然后以钴-60辐照灭菌法对该工程细胞株进行灭菌,得到滋养细胞,命名为K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,再以K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞扩增NK细胞,制得NK细胞。
针对上述问题,一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,所述的制备方法包括以下步骤:
1)pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建;
2)分别用pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体制备重组慢病毒;
3)K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备;
4)PBMC细胞的提取;
5)NK细胞的体外扩增;
进一步,所述制备方法具体包括:
1)pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建:
(1)利用基因合成方法,获得mbIL-21、4-1BBL、MICA基因的全长编码区序列;
(2)分别构建质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA;
2)分别用质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA制备重组慢病毒:
(1)重组慢病毒的制备;
(2)重组慢病毒的浓缩;
(3)重组慢病毒的滴度检测
3)K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备;
4)PBMC细胞的提取;
5)NK细胞的体外扩增。
进一步,所述步骤2)重组慢病毒的制备方法为:
293FT细胞的制备:
1)取对数生长期的293FT细胞传入6孔板中,每孔含有0.6x106个细胞和2ml的DMEM完全培养液,混合均匀,置于37℃培养箱中培养过夜,同时准备20mlDMEM完全培养液置于同样条件培养过夜,备用。
2)当在显微镜下观察293FT细胞的汇合度达到50%-60%时,弃掉6孔板中的培养液,然后在6孔板上加入DMEM完全培养液,加入量为2ml/孔,备用;
重组慢病毒的制备:
以制备pHR-mbIL-21重组慢病毒为例:按质粒载体质量比计,分别取3ug步骤1)中构建得到的pHR-mbIL-21质粒载体、2.66ugpCMV载体和0.34ugpMD.2G载体,将pHR-mbIL-21质粒载体、pCMV载体和pMD.2G载体混合均匀,室温放置10-15min,形成混合液Ⅰ,将混合液Ⅰ滴加到含有293FT细胞的6孔板中,然后将含有混合液Ⅰ的6孔板置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,转染6~8小时,再弃掉含有混合液Ⅰ的6孔板中的培养液,按2ml/孔的加入量在6孔板上加入DMEM完全培养液,培养48小时,收集病毒上清,转速为3000转/分钟,离心5分钟,收集上清液Ⅰ,将上清Ⅰ液通过0.45μm滤膜过滤,得到滤液,即得到pHR-mbIL-21重组慢病毒;
根据制备pHR-mbIL-21重组慢病毒的方法依次制备pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒。
进一步,所述步骤2)中重组慢病毒的滴度检测,利用流式检测感染法对K562细胞进行1)在24孔板中的每个孔内加入细胞个数为1x105的k562细胞,然后在每个孔内加入500ul的1640完全培养液;
2)分别取1ul、3ul、10ul、30ul的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液,依次将各体积的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液加入到步骤1)中含有k562细胞的24孔板内,每个体积的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液重复6个对照,置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,培养48小时,然后分别收集细胞,以转速为500转/分钟,离心3分钟,弃上清,后用200ul的PBS缓冲液重悬,继续加入200ul的抗体,温度为4℃孵育1小时,再以转速为500转/分钟,离心3分钟,弃上清,用200ul的PBS缓冲液重悬,最后经过流式细胞仪,检测K562细胞的感染效率。
进一步,检测K562细胞的感染效率小于10%时认为被感染的阳性的K562细胞数等于病毒的颗粒数。
进一步,所述步骤步骤3)K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法为:
(1)根据复合重组慢病毒的终MOI值为5,依次加入pHR-mbIL-21重组慢病毒、pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒,混合均匀,形成复合重组慢病毒;
(2)利用复合重组慢病毒对K562细胞进行感染,感染72小时,克隆,得到K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株;
(3)将K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株进行钴-60照射灭菌,制得K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,-20℃,冻存。
进一步,所述步骤4)PBMC细胞的提取,
(1)在50ml离心管Ⅰ加入45ml样本血样,转速为2000转/分钟,离心10分钟,将血浆移至50ml离心管Ⅱ,灭活,得到灭活血浆、血细胞,备用;
(2)按体积比,生理盐水:血细胞的比例为1:1,将血细胞移至含有生理盐水的50ml离心管Ⅲ内,稀释,制得稀释血细胞,备用;
(3)在50ml离心管Ⅳ内加入15ml人淋巴细胞分离液,然后加入30ml稀释血细胞,转速为1600转/分钟,离心20分钟,弃掉上清液,得到白膜层细胞;
(4)将白膜层细胞移至50ml离心管Ⅴ中,加入生理盐水直至50ml离心管Ⅴ中的溶液体积为45ml时止,混合均匀,转速为1500转/分钟,离心10分钟,弃掉上清液,得到沉淀物A;
(5)在含有沉淀物A的50ml离心管Ⅴ中再次加入生理盐水直至50ml离心管Ⅳ中溶液的含量为45ml时止,混合均匀,转速为1500转/分钟,离心10分钟,弃掉上清液,得到沉淀物B、即PBMC细胞,4℃,存贮。
进一步,所述步骤5)NK细胞的体外扩增,
K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞在37℃条件下水浴复苏;
(1)取PBS缓冲液将复苏后的K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞清洗一次,转速为1500转/分钟,离心5分钟,弃上清,形成洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,备用;
(2)按体积份数计,在含有1份NK细胞完全培养基的培养瓶中加入1份PBMC细胞,重悬,然后加入1份洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,混合均匀,形成培养细胞液Ⅰ,将培养细胞Ⅰ液置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,进行培养,在培养至第3天时,将培养细胞液Ⅰ在转速为2000转/分钟,离心5分钟,弃掉上清液,再加入与上清液相同体积的NK细胞完全培养基,混合均匀,形成形成培养细胞液Ⅱ,将培养细胞Ⅱ液置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,继续培养;
(3)将培养细胞液Ⅱ培养至第7天时,在含有培养细胞液Ⅱ的培养瓶内加入NK细胞完全培养基使培养细胞液Ⅱ中PBMC细胞的细胞密度为2x106个/ml,按细胞密度比,PBMC细胞:K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的比例=1:1,在培养细胞液Ⅱ中加入步骤①中洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,混合均匀,形成培养细胞液Ⅲ,将培养细胞液Ⅲ置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,再次培养7天,制得NK细胞。
进一步,所述K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法中,钴-60照射灭菌中钴的剂量为100Gy。
进一步,所述NK细胞的体外扩增中,所使用的NK细胞完全培养基,包括以下组分,灭活自体血浆、庆大霉素、GTT551H3培养液,IL-2白介素;
其中IL-2白介素的加入量,按每毫升GTT551H3培养液中含有200-300IU的IL-2白介素;
庆大霉素的加入量,按每毫升GTT551H3培养液中含有50-100IU的庆大霉素;
NK细胞完全培养基的制备方法:按体积百分比,在95%的GTT551H3培养液中加入5%的灭活自体血浆,混合均匀,然后加入IL-2白介素、庆大霉素,混合均匀,形成NK细胞完全培养基。
进一步,所述的NK细胞的阳性率大于92.2%。
本发明的有益效果为:
1.本发明提供的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,与现有制备NK细胞技术相比,在本发明中,在K562细胞滋养细胞表面稳定表达mbIL-21和4-1BBL分子的同时又可以表达MICA分子,MICA分子作为NK细胞激活性受体NKG2D的天然配体,能够促进NK细胞的激活,其中NKG2D为NK细胞激活提供主要信号,并能够覆盖别的NK受体接收到的抑制性信号。
2.本发明提供的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,采用单独构建表达mbIL-21、4-1BBL、MICA三种分子的质粒载体,然后重新组建为三种慢病毒,用三种慢病毒同时感染K562的方法,避免了将mbIL-21、4-1BBL、MICA三种分子构建在同一质粒载体上时目的片段过大,三种分子的表达量不一致等问题缺陷。可以有效提高K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞的构建成功率,降低了构建难度。
3.本发明提供的一种NK细胞,利用IL-21、4-1BBL、MICA分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞用于扩增培养NK细胞,其NK细胞扩增倍数高达890倍,制得NK细胞的纯度到达92.2%,并且不同的PBMC间的扩增倍数重复性好。
4.本发明中制备方法可以为获得高纯度、高扩增倍数的NK细胞奠定实践基础。
附图说明
图1为pHR-mbIL-21的质粒载体图谱;
图2为pHR-4-1BBL的质粒载体图谱;
图3为pHR-MICA的质粒载体图谱;
图4为K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞对mbIL-21、4-1BBL、MICA的表达检测;
图5为NK细胞增值曲线图;
图6为NK细胞表型检测流式图;
具体实施方式:
为了更好地理解本发明,下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案,但是本发明并不局限于此。
DMEM完全培养液购自TAKARA公司;
所述的Lenti-XTMConcentrator试剂盒购自TAKARA公司;
质粒纯化试剂盒购自Qiagen公司;
Fluorescein(FITC)-AffiniPureGoatAnti-MouseIgG,F(ab')2FragmentSpecific抗体购自JacksonImmunoResearch公司;
酶切试剂盒购自NEB公司;
GTT551H3培养液购自TAKARA公司;
本发明中所用限制性内切酶均为常用选择;
NK细胞完全培养基包括,灭活自体血浆、庆大霉素、GTT551H3培养液,IL-2白介素,IL-2白介素的加入量,按每毫升GTT551H3培养液中含有200-300IU的IL-2白介素,庆大霉素的加入量,按每毫升GTT551H3培养液中含有50-100IU的庆大霉素;
NK细胞完全培养基的制备方法:按体积百分比,在95%的GTT551H3培养液中加入5%的灭活自体血浆,混合均匀,然后加入IL-2白介素、庆大霉素,混合均匀,形成NK细胞完全培养基;
实施例1
pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建
1、获得mbIL-21、4-1BBL、MICA的全基因编码区序列
1)分别在NCBI网站查询人mbIL-21基因序列、人4-1BBL基因序列、人MICA基因序列;
2)利用PCR扩增法将mbIL-21基因序列中的信号肽区序列、人IL-21序列、铰链区序列、人Fc片段序列、人CD8跨膜区序列进行连接,然后在mbIL-21基因序列中首部引入限制性内切酶BamHI、尾部位引入限制性内切酶NotI,制得mbIL21全基因编码区序列,备用;
3)利用PCR扩增法将4-1BBL基因序列中的信号肽区序列、人IL-21序列、铰链区序列、人Fc片段序列、人CD8跨膜区序列进行连接,然后在4-1BBL基因序列中首部引入限制性内切酶BamHI、位部位引入限制性内切酶NotI,制得4-1BBL全基因编码区序列,备用;
4)利用PCR扩增法将MICA基因序列中的信号肽区序列、人IL-21序列、铰链区序列、人Fc片段序列、人CD8跨膜区序列进行连接,然后在MICA基因序列中首部引入限制性内切酶BamHI、位部位引入限制性内切酶NotI,制得MICA全基因编码区序列,备用;
2、分别构建质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA;
1)通过酶切试剂盒将mbIL21全基因编码区序列进行BamHI、NotI双酶切;
2)将酶切后的mbIL21全基因编码区序列通过T4DNA连接酶连接到慢病毒pHR载体上,然后将其转化到感受态E.coli(DH5α)细胞上,制得质粒,将质粒送至金唯智测序公司进行测序,经过测序得到需要的的质粒,然后用质粒纯化试剂盒对质粒进行纯化,制得质粒载体pHR-mbIL-21;
3)依照质粒载体pHR-mbIL-21的制备方法,依次制备质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA。
实施例2
制备pHR-mbIL-21重组慢病毒、pHR-4-1BBL重组慢病毒和pHR-MICA重组慢病毒
1、293FT细胞的制备:
1)取对数生长期的293FT细胞传入6孔板中,每孔含有0.6x106个细胞和2ml的DMEM完全培养液,混合均匀,置于37℃培养箱中培养过夜,同时准备20mlDMEM完全培养液置于同样条件培养过夜,备用。
2)当在显微镜下观察293FT细胞的汇合度达到50%-60%时,弃掉6孔板中的培养液,然后在6孔板上加入预热的DMEM完全培养液,加入量为2ml/孔,用以除去未贴壁的细胞,备用;
2、重组慢病毒的制备
pHR-mbIL-21重组慢病毒的制备:
1)按质量比取3ug的pHR-mbIL-21质粒载体、2.66ug的pCMV载体和0.34ug的pMD.2G载体,混合均匀,形成混合DNA载体;
2)在0.5ml离心管内Ⅰ加入步骤1)中的混合DNA载体,再加入90ul去离子水、10ulCaCl2,混合均匀,然后以速度为15s/100ul将其加入到含有100ul的2XHBS(HEPES-buffersaline)的0.5ml离心管Ⅱ内,反复吹打8-10次,室温放置10-15min,混合液Ⅰ;
3)将混合液Ⅰ缓慢滴加到含有293FT细胞的6孔板中,避免将293FT细胞吹起,混匀,静置后可见细小颗粒沉淀,然后将含有混合液Ⅰ的6孔板置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,转染6~8小时,再弃掉含有混合液Ⅰ的6孔板中的培养液,按2ml/孔的加入量在6孔板上加入预热的DMEM完全培养液,培养48小时,收集病毒上清,转速为3000转/分钟,离心5分钟,收集上清液Ⅰ,将上清Ⅰ液通过0.45μm滤膜过滤,得到滤液,即得到pHR-mbIL-21重组慢病毒;
重组慢病毒的制备:
pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒
根据制备pHR-mbIL-21重组慢病毒的方法依次制备pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒;
3、pHR-mbIL-21重组慢病毒的浓缩
1)利用Lenti-XTMConcentrator试剂盒对pHR-mbIL-21重组慢病毒
①按体积份数计,在3份pHR-mbIL-21重组慢病毒中加入1份Lenti-XTMConcentrator,混合均匀,形成混合液Ⅱ,4℃条件下静置0.5-24小时,然后将混合液Ⅱ取出,在温度为4℃、转速为1500转/分钟条件下,离心45分钟,得到沉淀物;
②按稀释倍数为10-100倍进行稀释,在沉淀物中加入GT-T551H3培养液,重悬,得到浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒。
2)根据pHR-mbIL-21重组慢病毒的浓缩方法依次对pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒进行浓缩,制得浓缩后的pHR-4-1BBL重组慢病毒、浓缩后的pHR-MICA重组慢病毒;
4、重组慢病毒的滴度检测
分别用浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒、浓缩后的pHR-4-1BBL重组慢病毒、浓缩后的pHR-MICA重组慢病毒感染K562细胞,采用流式细胞仪检测法,检测重组慢病毒的滴度,即病毒的颗粒数,以此判定重组慢病毒的滴度,以浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒为例,具体步骤为:
1)在CountStar计数仪上的计数孔内加入k562细胞,k562细胞的加入量为1x105,备用;
2)用1640完全培养液将pHR-mbIL-21重组慢病毒按10倍-100倍进行稀释,形成稀释病毒液,然后分别将稀释病毒液分别加入到步骤1)含有k562细胞的CountStar计数仪的计数孔内,稀释病毒液的加入量分别为1ul、3ul、10ul、30ul,最后将CountStar计数仪置于5%二氧化钛培养箱中,37℃,培养48小时;
3)在1ml离心管中加入20ul(即含有1x106个细胞)步骤2)中经过培养的细胞,200ul的PBS缓冲液,重悬,在0℃条件下,在加入Fluorescein(FITC)AffiniPureGoatAnti-MouseIgG,F(ab')2fragmentspecific抗体1ul,孵育15分钟,然后以转速为1000转/分钟,离心5分钟,在加入200ul的PBS缓冲液,重悬,进行流式细胞仪检测,浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒感染K562细胞,其K562细胞的感染效率小于10%时认为被感染的阳性的K562细胞数等于病毒的颗粒数;
依照浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒感染K562细胞的方法,依次对浓缩后的pHR-4-1BBL重组慢病毒、浓缩后的pHR-MICA重组慢病毒进行感染K562细胞,同样,感染K562细胞的感染效率均小于10%时认为被感染的阳性的K562细胞数等于病毒的颗粒数。
实施例3
K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备
1、K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法包括:
1)根据复合重组慢病毒的终MOI值为5依次加入pHR-mbIL-21重组慢病毒、pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒,混合均匀,形成复合重组慢病毒;
2)利用复合重组慢病毒对K562细胞进行感染,感染72小时,通过流式细胞术和有限稀释法进行克隆,得到K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株;
3)将K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株进行钴-60照射灭菌,将K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株进行钴-60照射灭菌,钴-60照射灭菌中钴的剂量为100Gy,制得K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,其K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的细胞密度为1x107个/ml,-20℃条件下冻存;
实施例4
PBMC细胞的提取
1)在50ml离心管Ⅰ加入45ml样本血样,转速为2000转/分钟,离心10分钟,将血浆移至50ml离心管Ⅱ,灭活,得到灭活血浆、血细胞,备用;
2)按体积比,生理盐水:血细胞的比例为1:1,将血细胞移至含有生理盐水的50ml离心管Ⅲ内,稀释,制得稀释血细胞,备用;
3)在50ml离心管Ⅳ内加入15ml人淋巴细胞分离液,然后加入30ml稀释血细胞,转速为1600转/分钟,离心20分钟,弃掉上清液,得到白膜层细胞;
4)将白膜层细胞移至50ml离心管Ⅴ中,加入生理盐水直至50ml离心管Ⅴ中的溶液体积为45ml时止,混合均匀,转速为1500转/分钟,离心10分钟,弃掉上清液,得到沉淀物A;
5)在含有沉淀物A的50ml离心管Ⅴ中再次加入生理盐水直至50ml离心管Ⅳ中溶液的含量为45ml时止,混合均匀,转速为1500转/分钟,离心10分钟,弃掉上清液,得到沉淀物B、即外周血单个核细胞(PBMC细胞),4℃,存贮。
实施例5
NK细胞的体外扩增
1)取PBS缓冲液将复苏后的K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞清洗一次,转速为1500转/分钟,离心5分钟,弃上清,形成洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,备用;
2)按体积份数计,在含有1份NK细胞完全培养基的培养瓶中加入1份PBMC细胞,重悬,然后加入1份洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,混合均匀,形成培养细胞液Ⅰ,将培养细胞Ⅰ液置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,进行培养,在培养至第3天时,将培养细胞液Ⅰ在转速为2000转/分钟,离心5分钟,弃掉上清液,再加入与上清液相同体积的NK细胞完全培养基,混合均匀,形成形成培养细胞液Ⅱ,将培养细胞Ⅱ液置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,继续培养;
3)将培养细胞液Ⅱ培养至第7天时,在含有培养细胞液Ⅱ的培养瓶内加入NK细胞完全培养基使培养细胞液Ⅱ中PBMC细胞的细胞密度为2x106个/ml,按细胞密度比,PBMC细胞:K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的比例=1:1,在培养细胞液Ⅱ中加入步骤①中洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,混合均匀,形成培养细胞液Ⅲ,将培养细胞液Ⅲ置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,再次培养7天,制得NK细胞。
检测NK细胞培养14天时的增值数
取培养14天时的NK细胞,计数制作NK细胞增值曲线图,见图3,可知,NK细胞增值了890倍。
检测NK细胞增值的阳性率
取培养14天时的NK细胞,稀释细胞密度为1.0×106个/ml,用CD3-FITC、CD56CD16-PE抗体染色,然后经过流式细胞仪检测,结果显示,NK细胞的阳性率为92.2%;本发明中采用K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞培养NK细胞,大大提高了NK细胞的阳性率。
以上为本领域技术人员提供的实施例,以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案,而不是用于限制本文公开的范围。

Claims (10)

1.一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述的制备方法包括以下步骤:
1)pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建;
2)分别用pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体制备重组慢病毒;
3)K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备;
4)PBMC细胞的提取;
5)NK细胞的体外扩增。
2.根据权利要求1所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述制备方法具体包括:
1)pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建:
(1)利用基因合成方法,获得mbIL-21、4-1BBL、MICA基因的全长编码区序列;
(2)分别构建质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA;
2)分别用质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA制备重组慢病毒:
(1)重组慢病毒的制备;
(2)重组慢病毒的浓缩;
(3)重组慢病毒的滴度检测
3)K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备;
4)PBMC细胞的提取;
5)NK细胞的体外扩增。
3.根据权利要求2所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述步骤2)重组慢病毒的制备方法为:
293FT细胞的制备:
1)取对数生长期的293FT细胞传入6孔板中,每孔含有0.6x106个细胞和2ml的DMEM完全培养液,混合均匀,置于37℃培养箱中培养过夜,同时准备20mlDMEM完全培养液置于同样条件培养过夜,备用。
2)当在显微镜下观察293FT细胞的汇合度达到50%-60%时,弃掉6孔板中的培养液,然后在6孔板上加入DMEM完全培养液,加入量为2ml/孔,备用;
重组慢病毒的制备:
以制备pHR-mbIL-21重组慢病毒为例:按质粒载体质量比计,分别取3ug步骤1)中构建得到的pHR-mbIL-21质粒载体、2.66ugpCMV载体和0.34ugpMD.2G载体,将pHR-mbIL-21质粒载体、pCMV载体和pMD.2G载体混合均匀,室温放置10-15min,形成混合液Ⅰ,将混合液Ⅰ滴加到含有293FT细胞的6孔板中,然后将含有混合液Ⅰ的6孔板置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,转染6~8小时,再弃掉含有混合液Ⅰ的6孔板中的培养液,按2ml/孔的加入量在6孔板上加入DMEM完全培养液,培养48小时,收集病毒上清,转速为3000转/分钟,离心5分钟,收集上清液Ⅰ,将上清Ⅰ液通过0.45μm滤膜过滤,得到滤液,即得到pHR-mbIL-21重组慢病毒;
根据制备pHR-mbIL-21重组慢病毒的方法依次制备pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒。
4.根据权利要求2所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述步骤2)中重组慢病毒的滴度检测,利用流式检测感染法对K562细胞进行感染,测定效率,以此判定重组慢病毒的滴度,具体步骤为:
1)在24孔板中的每个孔内加入细胞个数为1x105的k562细胞,然后在每个孔内加入500ul的1640完全培养液;
2)分别取1ul、3ul、10ul、30ul的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液,依次将各体积的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液加入到步骤1)中含有k562细胞的24孔板内,每个体积的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液重复6个对照,置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,培养48小时,然后分别收集细胞,以转速为500转/分钟,离心3分钟,弃上清,后用200ul的PBS缓冲液重悬,继续加入200ul的抗体,温度为4℃孵育1小时,再以转速为500转/分钟,离心3分钟,弃上清,用200ul的PBS缓冲液重悬,最后经过流式细胞仪,检测K562细胞的感染效率;
其中,检测K562细胞的感染效率小于10%时认为被感染的阳性的K562细胞数等于病毒的颗粒数。
5.根据权利要求1或2所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述步骤步骤3)K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法为:
(1)根据复合重组慢病毒的终MOI值为5,依次加入pHR-mbIL-21重组慢病毒、pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒,混合均匀,形成复合重组慢病毒;
(2)利用复合重组慢病毒对K562细胞进行感染,感染72小时,克隆,得到K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株;
(3)将K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株进行钴-60照射灭菌,制得K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,-20℃,冻存。
6.根据权利要求1或2所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述步骤4)PBMC细胞的提取,
(1)在50ml离心管Ⅰ加入45ml样本血样,转速为2000转/分钟,离心10分钟,将血浆移至50ml离心管Ⅱ,灭活,得到灭活血浆、血细胞,备用;
(2)按体积比,生理盐水:血细胞的比例为1:1,将血细胞移至含有生理盐水的50ml离心管Ⅲ内,稀释,制得稀释血细胞,备用;
(3)在50ml离心管Ⅳ内加入15ml人淋巴细胞分离液,然后加入30ml稀释血细胞,转速为1600转/分钟,离心20分钟,弃掉上清液,得到白膜层细胞;
(4)将白膜层细胞移至50ml离心管Ⅴ中,加入生理盐水直至50ml离心管Ⅴ中的溶液体积为45ml时止,混合均匀,转速为1500转/分钟,离心10分钟,弃掉上清液,得到沉淀物A;
(5)在含有沉淀物A的50ml离心管Ⅴ中再次加入生理盐水直至50ml离心管Ⅳ中溶液的含量为45ml时止,混合均匀,转速为1500转/分钟,离心10分钟,弃掉上清液,得到沉淀物B、即PBMC细胞,4℃,存贮。
7.根据权利要求1或2所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述步骤5)NK细胞的体外扩增,
K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞在37℃条件下水浴复苏;
(1)取PBS缓冲液将复苏后的K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞清洗一次,转速为1500转/分钟,离心5分钟,弃上清,形成洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,备用;
(2)按体积份数计,在含有1份NK细胞完全培养基的培养瓶中加入1份PBMC细胞,重悬,然后加入1份洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,混合均匀,形成培养细胞液Ⅰ,将培养细胞Ⅰ液置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,进行培养,在培养至第3天时,将培养细胞液Ⅰ在转速为2000转/分钟,离心5分钟,弃掉上清液,再加入与上清液相同体积的NK细胞完全培养基,混合均匀,形成形成培养细胞液Ⅱ,将培养细胞Ⅱ液置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,继续培养;
(3)将培养细胞液Ⅱ培养至第7天时,在含有培养细胞液Ⅱ的培养瓶内加入NK细胞完全培养基使培养细胞液Ⅱ中PBMC细胞的细胞密度为2x106个/ml,按细胞密度比,PBMC细胞:K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的比例=1:1,在培养细胞液Ⅱ中加入步骤①中洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞,混合均匀,形成培养细胞液Ⅲ,将培养细胞液Ⅲ置于5%二氧化碳培养箱中,温度为37℃,再次培养7天,制得NK细胞。
8.根据权利要求5所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法中,钴-60照射灭菌中钴的剂量为100Gy。
9.根据权利要求7所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述NK细胞的体外扩增中,所使用的NK细胞完全培养基,包括以下组分,灭活自体血浆、庆大霉素、GTT551H3培养液,IL-2白介素;
其中IL-2白介素的加入量,按每毫升GTT551H3培养液中含有200-300IU的IL-2白介素;
庆大霉素的加入量,按每毫升GTT551H3培养液中含有50-100IU的庆大霉素;
NK细胞完全培养基的制备方法:按体积百分比,在95%的GTT551H3培养液中加入5%的灭活自体血浆,混合均匀,然后加入IL-2白介素、庆大霉素,混合均匀,形成NK细胞完全培养基。
10.根据权利要求7所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法,其特征在于:所述的NK细胞的阳性率大于92.2%。
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