CN116875547A - 一种利用细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增培养方法 - Google Patents

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CN116875547A CN202311127402.3A CN202311127402A CN116875547A CN 116875547 A CN116875547 A CN 116875547A CN 202311127402 A CN202311127402 A CN 202311127402A CN 116875547 A CN116875547 A CN 116875547A
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Abstract

本发明公开了一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，该方法是利用发明专利《一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法》，培养细胞NK细胞获得细胞的外泌体，再进行收集纯化，添加至NK细胞培养中，避免直接K562细胞使用带来的风险，同时也解决纯因子培养NK细胞的增殖能力有限、细胞纯度低等问题。

Description

一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)，是人体固有免疫的主要效应细胞，能无需预先刺激，通过使用穿孔素和颗粒酶以及其他机制，无MHC限制性的杀伤肿瘤细胞。近年来，NK免疫治疗技术由于其无组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性，副作用小，抗肿瘤活性强，正在成为一种广谱的治疗恶性肿瘤的方法。
NK细胞主要分布于外周血中，占外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)的5～10％，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。而且，NK细胞回输到体内后不会增殖，因此在肿瘤免疫治疗中通常需要比较大的细胞数量，才能达到相对较好的治疗效果。因此，如何在体外将NK细胞大量扩增是NK应用于肿瘤免疫治疗的关键之一。
目前NK细胞的体外活化与增殖，主要有饲养层细胞培养和纯因子刺激两大类。饲养层细胞培养方法主要是利用基因修饰饲养层细胞，使细胞的膜表面表达刺激分子和膜绑定的细胞因子，比如常见的IL15和IL21刺激因子，再经辐照灭活后与NK细胞共培养，实现NK细胞的激活与增殖。此种方法的培养效果优于纯细胞因子刺激的培养方法。
其他常规的基因修饰的K562作为饲养层细胞培养NK细胞，流程为：K562细胞经辐照灭活后与单个核细胞按比例混合共培养，在第7天，灭活的K562细胞与NK细胞再次按比例添加培养，二次刺激，实现NK细胞的大量增殖与活化。但此方法制备流程复杂，成本较高，产业化难度较大。
纯因子培养方案主要是借助IL-2(白介素2)、IL-15(白介素15)、IL-21(白介素21)、CD16单抗等细胞因子，在NK细胞培养过程中，按一定浓度比例添加，实现NK细胞的活化与增殖。该纯因子培养方法很难实现真正的NK细胞活化与增殖，即使实现扩增培养，其效果比不上饲养层细胞培养的NK细胞。
因此，研究和开发出一种NK细胞增殖能力高和细胞纯度高的方法仍是目前亟需解决的难题。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷，以及降低成本等，本发明提供一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，该方法是利用中国专利CN110684730A《一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法》，培养细胞NK细胞获得细胞的外泌体，再进行收集纯化，添加至NK细胞培养中，避免直接K562细胞使用带来的风险，同时也解决纯因子培养NK细胞的增殖能力有限、细胞纯度低等问题。
本发明的技术方案是：
一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：
S1.外泌体的获取：利用滋养细胞扩增NK细胞，培养细胞后获得细胞外泌体上清液；
S2.细胞外泌体提取；
S3.NK细胞活化、扩增培养：从外周血或脐血中分离出单个核细胞，接着加入步骤S2制得的细胞外泌体活化培养0～7天，然后扩增培养7～14天，即得。
作为一种优选的技术方案，所述步骤S1利用滋养细胞扩增NK细胞的制备方法包括以下步骤：
a.pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建；
b.分别用pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体制备重组慢病毒；
c.K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备；
d.PBMC细胞的提取；
e.NK细胞的体外扩增。
作为一种优选的技术方案，所述步骤S2的具体步骤为：
a.步骤S1制得的上清液在4℃下，2000g离心10min，收取上清液，弃去沉淀；
b.上清液在4℃下，12000g离心30min，收取上清液，弃去沉淀；
c.上清液在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，用PBS重悬沉定；
d.重悬后转移至新的超速离心管中，在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，采用适当体积PBS重悬沉淀，即得。
作为一种优选的技术方案，所述步骤S3中NK细胞活化、扩增培养的具体步骤为：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，2000转/分钟，离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭活30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭活的血浆降温至4℃，经3500转/分钟，离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液15mL，再加入稀释重悬后的血液25mL，配平后1600转/分钟，升速为6档，降速为4档，离心30min；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再2000转/分钟，离心10min，获得单个核细胞；
B.活化培养：
a.T225培养瓶，加增殖培养基；
b.将步骤A制得的单个核细胞加入增殖培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/mL，体积不大于50mL；
c.重悬的单个核细胞转入T225培养瓶，加入步骤S2制得的细胞外泌体和10％的自体灭活血浆；
d.前2天静置培养，第3天，补加50mL增殖培养基和5％自体灭活血浆，后面根据细胞增殖情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加步骤S2制得的细胞外泌体，持续培养；
C.扩增培养：
控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
作为一种优选的技术方案，所述B.活化培养中步骤b的增殖培养基配制为：取1000mL免疫细胞培养基加入500IU/mL的IL-2制得增殖培养基。
作为一种优选的技术方案，所述B.活化培养中步骤c的细胞外泌体的添加量为1～5*108/mL。
作为一种优选的技术方案，所述B.活化培养中步骤c的细胞外泌体的添加量为2～5*108/mL。
作为一种优选的技术方案，所述B.活化培养中步骤d的细胞外泌体的添加量为0.5～2*108/mL。
作为一种优选的技术方案，所述B.活化培养中步骤d的细胞外泌体的添加量为1～2*108/mL。
鉴于目前利用基因修饰的饲养层细胞培养NK细胞容易引入饲养层细胞的生物风险，而纯因子刺激NK细胞培养增殖能力低和纯度低等缺陷。本发明首次提出将细胞外泌体添加替代K562细胞作为饲养层细胞进行NK细胞培养，降低生物风险，同时对比纯因子培养NK细胞，有细胞外泌体的协同刺激，NK细胞在增殖数量和流式结果方面都更优。与现有技术相比，本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法具有以下优点：
(1)本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法对比K562细胞作为饲养层细胞培养NK细胞，在保证NK细胞增殖和活性的基础上，减少了K562细胞系直接使用带来的风险，同时解决制备流程复杂，成本较高，产业化难度较大的问题；
(2)本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法对比纯细胞因子培养NK细胞，有外泌体的协同刺激，在细胞增殖、比例、活性等方面都有更好的效果。
附图说明
图1为组1的细胞流式检测图；
图2为组2的细胞流式检测图；
图3为组3的细胞流式检测图；
图4为组4的细胞流式检测图；
图5为组5的细胞流式检测图。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、技术特征、发明目的与技术效果易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
所述前期获得的外泌体是利用山东德升生物工程有限公司的发明专利CN110684730A 《一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法》，培养获得的NK细胞上清液中提取的外泌体。
实施例1：一种外泌体激活NK细胞的培养方法
S1.细胞外泌体的获得：利用发明专利CN110684730A《一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法》，培养的NK细胞，收集细胞培养上清液；
S2.细胞外泌体提取：将步骤S1获得的外泌体上清液，超速离心处理，得细胞外泌体：
进一步地，所述步骤S2中细胞外泌体提取的具体步骤为：
a.步骤S1制得的上清液在4℃下，2000g离心10min，收取上清液，弃去沉淀。
b.上清液在4℃下，12000g离心30min，收取上清液，弃去沉淀。
c.上清液在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，用PBS重悬沉定。
d.重悬后转移至新的超速离心管中，在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，采用适当体积PBS重悬沉淀，即得。
S3.NK细胞活化、扩增培养：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，2000转/分钟，离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭活30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭活的血浆降温至4℃，经3500转/分钟，离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液15ml，再加入稀释重悬后的血液，加入量不超过淋巴细胞分离液的2倍，配平后，1600转/分钟，升速为6档，降速为4档，离心30min；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再2000转/分钟，离心10min，获得单个核细胞(PBMC)；
B.活化培养：
a.T225培养瓶，加增殖培养基
b.将步骤A制得的单个核细胞加入增殖培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/mL，体积不大于50mL；
d.重悬的单个核细胞转入T225培养瓶，加入步骤S2制得的细胞外泌体1*108/ml和10％的自体灭活血浆；
e.前2天静置培养，第3天，补加50mL增殖培养基和5％自体灭活血浆，后面根据细胞增殖情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加步骤S2制得的细胞外泌体0.5*108/ml，持续培养；
C.扩增培养：
控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
实施例2：一种外泌体激活NK细胞的培养方法
S1.细胞外泌体的获得：利用发明专利CN110684730A《一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法》，培养的NK细胞，收集细胞培养上清液；
S2.细胞外泌体提取：将步骤S1获得的外泌体上清液，超速离心处理，得细胞外泌体：
进一步地，所述步骤S2中细胞外泌体提取的具体步骤为：
a.步骤S1制得的上清液在4℃下，2000g离心10min，收取上清液，弃去沉淀。
b.上清液在4℃下，12000g离心30min，收取上清液，弃去沉淀。
c.上清液在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，用PBS重悬沉定。
d.重悬后转移至新的超速离心管中，在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，采用适当体积PBS重悬沉淀，即得。
S3.NK细胞活化、扩增培养：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，2000转/分钟，离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭活30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭活的血浆降温至4℃，经3500转/分钟，离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液15ml，再加入稀释重悬后的血液，加入量不超过淋巴细胞分离液的2倍，配平后1600转/分钟，升速为6档，降速为4档，离心30min；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再2000转/分钟，离心10min，获得单个核细胞(PBMC)；
B.活化培养：
a.T225培养瓶，加增殖培养基
b.将步骤A制得的单个核细胞加入增殖培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/mL，体积不大于50mL；
d.重悬的单个核细胞转入T225培养瓶，加入步骤S2制得的细胞外泌体3*108/ml和10％的自体灭活血浆；
e.前2天静置培养，第3天，补加50mL增殖培养基和5％自体灭活血浆，后面根据细胞增殖情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加步骤S2制得的细胞外泌体1*108/ml，持续培养；
C.扩增培养：
控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
实施例3：一种外泌体激活NK细胞的培养方法
S1.细胞外泌体的获得：利用发明专利CN110684730A《一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法》，培养的NK细胞，收集细胞培养上清液；
S2.细胞外泌体提取：将步骤S1获得的外泌体上清液，超速离心处理，得细胞外泌体：
进一步地，所述步骤S2中细胞外泌体提取的具体步骤为：
a.步骤S1制得的上清液在4℃下，2000g离心10min，收取上清液，弃去沉淀。
b.上清液在4℃下，12000g离心30min，收取上清液，弃去沉淀。
c.上清液在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，用PBS重悬沉定。
d.重悬后转移至新的超速离心管中，在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，采用适当体积PBS重悬沉淀，即得。
S3.NK细胞活化、扩增培养：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，2000转/分钟，离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭活30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭活的血浆降温至4℃，经3500转/分钟，离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液15ml，再加入稀释重悬后的血液，加入量不超过淋巴细胞分离液的2倍，配平后1600转/分钟，升速为6档，降速为4档，离心30min；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再2000转/分钟，离心10min，获得单个核细胞(PBMC)；
B.活化培养：
a.T225培养瓶，加增殖培养基
b.将步骤A制得的单个核细胞加入增殖培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/mL，体积不大于50mL；
d.重悬的单个核细胞转入T225培养瓶，加入步骤S2制得的细胞外泌体5*108/ml和10％的自体灭活血浆；
e.前2天静置培养，第3天，补加50mL增殖培养基和5％自体灭活血浆，后面根据细胞增殖情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加步骤S2制得的细胞外泌体2*108/ml，持续培养；
C.扩增培养：
控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
试验例1：对比试验
1、试验方法：
参考实施例3的外泌体激活NK细胞的培养方法，以脐血为材料，通过淋巴细胞分离液获得单个核细胞(PBMC)，将获得的PBMC均分5组，细胞量为5*107，分组测试培养，具体分组如下：
组1：利用发明专利CN110684730A《一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法》，培养的NK细胞。
5*107个PBMC，加19ml培养基+1ml滋养层细胞+加10％血浆，接种T75瓶，体积20mL；
②根据细胞增殖情况，补加免疫细胞培养基及1％～5％的血浆；
③持续培养至第7天，取样计数，补加滋养层细胞，继续培养；
④继续根据细胞增殖情况补加免疫细胞培养基，培养至14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测；
组2：纯因子法培养NK细胞
①培养基配制：1000mL康宁的KBM581培养基，加入1000IU/mL的IL-15和IL-2，为培养基1；
康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2，为培养基2；
CD3和CD16单抗按50ng/mL包被T75瓶，体积5mL，放37℃包被2h；
包被后，弃包被液，加PBS清洗一遍，5*107个PBMC，加入18mL培养基1和2mL灭活的血浆混匀细胞，转入培养瓶，再加入1000IU/mL的IL-21，放二氧化碳培养箱培养；
④根据细胞增长情况，先补加完培养基1，再用培养基2，每次补液补加1～5％的血浆；持续培养14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测；
组3：细胞外泌体(1*108/ml）培养NK细胞(本发明实施例1)
①培养基配制：1000mLTaKaRa的GT-551 H3培养基加入500IU/mL的IL-2，为增殖培养基；
②5*107个PBMC，加入18mL增殖培养基和2mL灭活的血浆混匀细胞，转入培养瓶，再加入1*108/mL的细胞外泌体，放二氧化碳培养箱培养；
③根据细胞增长情况，补加增殖培养基，每次补液补加1～5％的血浆；第7天补液，同时补加0.5*108/ml的细胞外泌体，持续培养至14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测；
组4：细胞外泌体(5*108/ml)培养NK细胞(本发明实施例2)
①培养基配制：1000mLTaKaRa的GT-551 H3培养基加入500IU/mL的IL-2，为增殖培养基；
②5*107个PBMC，加入18mL增殖培养基和2mL灭活的血浆混匀细胞，转入培养瓶，再加入3*108/mL的细胞外泌体，放二氧化碳培养箱培养；
③根据细胞增长情况，补加增殖培养基，每次补液补加1～5％的血浆；第7天补液，同时补加1*108/ml的细胞外泌体，持续培养至14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测；
组5：细胞外泌体(2*108/ml)培养NK细胞(本发明实施例3)
①培养基配制：1000mLTaKaRa的GT-551 H3培养基加入500IU/mL的IL-2，为增殖培养基；
②5*107个PBMC，加入18mL增殖培养基和2mL灭活的血浆混匀细胞，转入培养瓶，再加入5*108/mL的细胞外泌体，放二氧化碳培养箱培养；
③根据细胞增长情况，补加增殖培养基，每次补液补加1～5％的血浆；第7天补液，同时补加2*108/ml的细胞外泌体，持续培养至14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测；
其中：
(1)细胞计数：采用细胞计数器进行测定，
(2)流式检测：分别取各组成熟NK细胞2*106个左右，各分成2管；细胞清洗后，1管阴性对照，1管加入流式抗体CD3-FITC、CD16-APC、CD56-PE，孵育20分钟，上流式细胞仪进行流式检测。
2、试验结果：
2.1、细胞计数检测结果如表1所示：
表1细胞计数结果
从表1的细胞增殖情况可以看出，组2的纯细胞因子培养NK在增殖能力上是不及其他组别。
2.2、流式检测结果如表2和图1～图5所示。
2.2.1、细胞流式检测结果如表2所示：
表2细胞流式检测结果
2.2.2、细胞流式图如图1～图5所示，其中，组1的细胞流式图如图1所示，组2的细胞流式图如图2所示，组3的细胞流式图如图3所示，组4的细胞流式图如图4所示，组5的细胞流式图如图5所示。
从细胞流式结果可知，组1饲养层细胞组和组3、4、5，NK效应细胞比例达到90％左右，而组2的纯因子方法，NK效应细胞比例不足80％，说明本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法获得的NK细胞纯度达到甚至超过饲养层细胞培养方案，明显优于纯因子培养方案。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：
S1.外泌体的获取：利用滋养细胞扩增NK细胞，培养细胞后获得细胞外泌体上清液；
S2.细胞外泌体提取；
S3.NK细胞活化、扩增培养：从外周血或脐血中分离出单个核细胞，接着加入步骤S2制得的细胞外泌体活化培养0～7天，然后扩增培养7～14天，即得。
2.如权利要求1所述的一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述步骤S1利用滋养细胞扩增NK细胞的制备方法包括以下步骤：
a.pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建；
b.分别用pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体制备重组慢病毒；
c.K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备；
d.PBMC细胞的提取；
e.NK细胞的体外扩增。
3.如权利要求1所述的一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：所述步骤S2的具体步骤为：
a.步骤S1制得的上清液在4℃下，2000g离心10min，收取上清液，弃去沉淀；
b.上清液在4℃下，12000g离心30min，收取上清液，弃去沉淀；
c.上清液在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，用PBS重悬沉定；
d.重悬后转移至新的超速离心管中，在4℃下，120000g离心70min，弃去上清液，采用适当体积PBS重悬沉淀，即得。
4.如权利要求1所述的一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述步骤S3中NK细胞活化、扩增培养的具体步骤为：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，2000转/分钟，离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭活30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭活的血浆降温至4℃，经3500转/分钟，离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液15mL，再加入稀释重悬后的血液25mL，配平后1600转/分钟，升速为6档，降速为4档，离心30min；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再2000转/分钟，离心10min，获得单个核细胞；
B.活化培养：
a.T225培养瓶，加增殖培养基；
b.将步骤A制得的单个核细胞加入增殖培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/mL，体积不大于50mL；
c.重悬的单个核细胞转入T225培养瓶，加入步骤S2制得的细胞外泌体和10％的自体灭活血浆；
d.前2天静置培养，第3天，补加50mL增殖培养基和5％自体灭活血浆，后面根据细胞增殖情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加步骤S2制得的细胞外泌体，持续培养；
C.扩增培养：
控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
5.如权利要求4所述的一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述B.活化培养中步骤b的增殖培养基配制为：取1000mL免疫细胞培养基加入500IU/mL的IL-2制得增殖培养基。
6.如权利要求4所述的一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述B.活化培养中步骤c的细胞外泌体的添加量为1～5*108/mL。
7.如权利要求4所述的一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述B.活化培养中步骤c的细胞外泌体的添加量为2～5*108/mL。
8.如权利要求4所述的一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述B.活化培养中步骤d的细胞外泌体的添加量为0.5～2*108/mL。
9.如权利要求4所述的一种利用细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述B.活化培养中步骤d的细胞外泌体的添加量为1～2*108/mL。
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