CN107460167B - 一种无滋养细胞的nk细胞的扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法：采用共混培养液培养NK细胞，培养7天；然后，改用自体血浆培养基培养，培养过程中每2～3天进行一次补液，维持细胞密度在2.0×10⁶/mL，培养20天以上；所述共混培养液的组成如下：在淋巴细胞培养基的基础上，添加1～10％自体血浆，200～1500IU/mL的IL‑2，10～50ng/mL的IL‑15和10～50ng/mL的IL‑21；所述自体血浆培养基的组成如下：在无血清培养基的基础上，添加1～10％自体血浆，200IU/mL的IL‑2。本发明的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，以脐血或自体外周血为细胞来源，培养过程中无需滋养细胞，扩增效率高，所得NK细胞的纯度高。通过该方法获得的NK细胞，可作为细胞免疫疗法的医药组合物，主要用于治疗和/或预防传染病和/或癌症。

Description

一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法

技术领域

本发明涉及一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法。

背景技术

自然杀伤细胞(nature killer cell，NK cell)属于人体介导固有免疫细胞，与机体抵抗恶性肿瘤、病毒感染和免疫调节密切相关。其免疫表型特征主要为CD3-/CD56+，是一种不表达T细胞受体，也不表达B细胞受体的淋巴细胞亚群。其对肿瘤细胞或受感染细胞的杀伤既不依赖抗体参与，也不需要抗原刺激和致敏；识别靶细胞无主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制，可直接与靶细胞接触释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞；也可释放NK细胞毒因子与靶细胞的NK细胞毒因子(NK cytotoxic factor,NKCF)受体结合，选择性杀伤和裂解靶细胞；或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)对靶细胞造成杀伤。NK细胞在肿瘤免疫中的重要作用，使得NK细胞过继免疫疗法成为一种治疗肿瘤的新策略。

存在于健康人体内的大部分NK细胞通常处于免疫静止状态，一旦被激活，它们将渗透到大多数组织中攻击肿瘤细胞和病毒感染细胞。很多研究人员进行了将NK细胞活化的研究。

NK细胞约占血液中淋巴细胞的5％～10％，而在细胞疗法中充足的细胞数量和细胞纯度是NK杀伤肿瘤细胞作用的重要因素，但NK细胞的增殖很弱，无法提供充足数量的细胞进行给药，这成为将其应用于临床的最大的问题。因此，寻求一种在体外获得足够数量和纯度NK细胞的有效方法，仍然是学者们致力研究的热点课题。

用于肿瘤免疫治疗的NK细胞主要通过体外诱导扩增技术获得，其前体细胞主要来源于自体外周血、异体(异基因)外周血和脐带血的单个核细胞。传统的NK细胞体外扩增方案采用IL-2短期刺激外周血淋巴细胞，但细胞生长倍数有限，细胞增殖10倍左右，因此需要大量的单个核细胞，需要从病人身体中采集大量的外周血才能够初步达到治疗的剂量，这对病人是一个很大的生理负担。

目前，还有关于有些研究人员将肿瘤细胞株用作滋养层细胞(feeder cell)来增殖NK细胞的报道，滋养层细胞的加入虽然能够在无衰老现象的前提下大量扩增NK细胞，但其在临床应用上仍存在许多问题，例如NK细胞在体外持续培养数周后，在输入人体前，需提前移除滋养细胞并确保无任何残留，在失去该最适生长条件后，NK的细胞毒性可能会下降，输注体内后的可持续性也难以保障；而添加异体细胞作为滋养层细胞，尤其是K562癌细胞株，在临床应用上也存在重大风险与伦理问题。

综上所述，开发一种无滋养层细胞的NK细胞扩增方法，以获得高纯度和大数量的NK细胞，具有极大的应用前景。

CN104789527A公开了一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法，在重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A共同作用下激活自然杀伤细胞增殖，CD56+/CD16+表型均大于80％。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，可显著提高NK细胞的数量和纯度。本发明以脐血或自体外周血为细胞来源，仅在培养前7天添加自体血浆、重组人白介素15、重组人白介素21和重组人白介素2，7天后仅添加血浆和重组人白介素2，培养至20天，NK细胞比率达85％以上，增殖1500倍以上，NK细胞纯度高于现有技术(比如CN104789527A公开的方法)，而且大大节省了细胞扩增的成本。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法：采用共混培养液培养NK细胞(初始单个核细胞的细胞密度为1.5×10⁶cells/ml)，培养条件为37℃，5％CO₂，饱和水蒸气，培养过程中每三天进行一次半量换液，培养7天；然后，改用自体血浆培养基培养(初始细胞密度为2.0×10⁶cells/ml)，培养条件为37℃，5％CO₂，饱和水蒸气，培养过程中每2～3天进行一次补液，维持细胞密度在2.0×10⁶/mL，培养20天以上，即可获得大量高纯度NK细胞(NK细胞比率达85％以上，增殖1500倍以上)；

所述共混培养液的组成如下：在淋巴细胞培养基的基础上，添加1～10％自体血浆(体积比)；200～1500IU/mL的IL-2，10～50ng/mL的IL-15和10～50ng/mL的IL-21；

所述自体血浆培养基的组成如下：在无血清培养基(优选GT-T551H3培养液)的基础上，添加1～10％自体血浆(体积比)；200IU/mL的IL-2。

优选的，所述共混培养液的组成如下：在GT-T551H3培养液的基础上，添加5％自体血浆(体积比)；200IU/mL的IL-2，50ng/mL的IL-15和25ng/mL的IL-21。

所述NK细胞，以脐血或外周血为细胞来源，通过常规方法即可得到，比如以下方法：

1)在生物安全柜内，将血液(脐血或外周血)分装到50ml离心管中，每管血液30ml，经500g离心10min；

2)离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中，56℃水浴灭活30min，2000g离心10min，留上清备用；

3)用生理盐水按照1:1的比例稀释血细胞，以2:1的比例将混匀的血细胞缓慢加到装有淋巴细胞分离液的离心管中，使其呈清晰的界面，400g离心20min；

4)离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、淋巴分离液层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中；

5)将白膜层细胞加生理盐水洗涤两次，300g离心10min；用培养基重悬，即为单个核细胞，细胞计数，活率及表型检测。

所述淋巴细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，为现有技术中已有的常规产品，比如：GT-T551-H3(Takara Bio)，RPMI-1640培养液(Thermo)，X-VIVO(Lonza)。

所述自体血浆为灭活的自体血浆(灭活的方式为：56℃水浴30min，2000g离心10min，上清即为所需血浆)。

本发明的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，以脐血或自体外周血为细胞来源，培养过程中无需滋养细胞，扩增效率高，所得NK细胞的纯度高。通过该方法获得的NK细胞，可作为细胞免疫疗法的医药组合物，主要用于治疗和/或预防传染病和/或癌症，所述疾病包括但不限于例如口腔癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、肝癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌、白血病、或者由病毒、细菌等引起的传染病。

本发明中一些常用的术语说明如下：

IL-2：白细胞介素-2。

IL-15：白细胞介素-15。

IL-21：白细胞介素-21。

附图说明

图1：对单个核细胞进行CD3-FITC及CD56-PE抗体双重染色并通过流式细胞法鉴定的结果图。

图2：3种培养体系中，细胞培养至20天CD3-/CD56+表型NK细胞比率的比较。

图3：3种培养体系培养过程中NK增殖倍数的比较。

图4：扩增培养第20天，使用倒置显微镜观察NK细胞的生长形态。

图5：使用本发明的方法培养20天，细胞增殖曲线图。

图6：使用本发明的方法培养20天，CD3及CD56的抗体进行双重染色并通过流式细胞法进行鉴定的结果图。

图7：CD3-/CD56+表型NK细胞比率随培养时间的变化曲线。

图8：CD3-/CD56+表型NK细胞增殖曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

下述实施例中试剂来源：GT-T551H3培养液(Takara Bio，宝日医生物技术(北京)有限公司)，淋巴细胞分离液(TBD，天津灏洋华科生物科技有限公司)，IL-2(PeproTech,USA)，IL-15(PeproTech,USA，USA)，IL-21(PeproTech,USA)，CD3-FITC(eBioscience，USA)，CD56-PE(eBioscience，USA)。

实施例1从外周血或脐带血中分离单个核细胞

1)在生物安全柜内，将30mL血液分装到50ml离心管中，经500g离心10min；

2)离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中，56℃水浴灭活30min，2000g离心10min，留上清备用。

3)用15mL生理盐水按照1∶1的比例稀释血细胞，取15mL淋巴细胞分离液，以2:1的比例将混匀的血细胞缓慢加到装有淋巴细胞分离液的离心管中，使其呈清晰的界面，400g离心20min；

4)离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、淋巴分离液层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中；

5)将白膜层细胞加生理盐水至45mL，洗涤两次，300g离心10min；离心后弃上清，即为单个核细胞。单个核细胞计数，台盼蓝拒染法检测细胞活率，CD3-FITC及CD56-PE的抗体进行双重染色，细胞流式法检测细胞表型。

台盼蓝拒染法测得单个核细胞活率大于98％。对单个核细胞进行CD3-FITC及CD56-PE的抗体双重染色，细胞流式法检测细胞表型。CD3-/CD56+比率为2.0％～7.0％。图1为对单个核细胞进行CD3-FITC及CD56-PE抗体双重染色并通过流式细胞法鉴定的结果图，CD3-/CD56+比率为5.06％。

实施例2细胞因子组合优化实验

细胞因子组合分为3组：(1)自体血浆培养基组(在GT-T551H3培养液的基础上，添加1～10％自体血浆，200IU/mL的IL-2)；(2)共混培养液组(在GT-T551H3培养液的基础上，添加1～10％自体血浆，200IU/mL的IL-2，50ng/mL的IL-15和25ng/mL的IL-21)；(3)共混培养液培养7天后撤换为自体血浆培养基组。

培养第0天，将实施例1种获得的单个核细胞分别悬浮于相应培养液中，调整细胞密度为1.5×10⁶/mL，接种于6孔板中，每孔液体终体积为2ml,自体血浆浓度均为5％，在37℃、5％CO₂及饱和水蒸气培养箱培养。

培养第3天，分别补加相应培养液1ml，自体血浆浓度均为5％，37℃、5％CO₂及饱和水蒸气培养箱培养。

连续培养至第7天，将6孔板的细胞移至T25培养瓶，自体血浆培养基组和共混培养液组分别补加4ml相应的培养液(其中自体血浆浓度均为1％)；第三组补加4ml自体血浆培养基(自体血浆浓度为1％)。37℃、5％CO₂及饱和水蒸气培养箱培养培养2天，之后每2～3天补液，维持细胞密度为2.0×10⁶/mL，继续培养至20天。第7天、10天、14天、18天和20天显微镜下观察细胞形态，进行细胞计数，活率，CD3-FITC及CD56-PE的抗体进行双重染色，细胞流式法检测细胞表型，计算NK增殖倍数。NK增殖倍数计算公式如下：

NK细胞增殖倍数＝培养天数细胞总数×NK细胞％/0d细胞总数×NK细胞％

图2显示不同培养组细胞培养第20天NK阳性比率。第0天单个核细胞CD3-/CD56+阳性比率为5.2±2.28％；自体血浆培养基组CD3-/CD56+阳性比率为36.33±4.5％；共混培养液组CD3-/CD56+阳性比率为88.5±8.33％，共混培养液培养7天后撤换为自体血浆培养基组CD3-/CD56+阳性比率为85±5.57％。

图3显示不同细胞因子组合对NK细胞增殖的影响。培养前7天，3组培养体系的细胞均增殖缓慢，自体血浆培养基组NK细胞增殖5.7±0.55倍，共混培养液组增殖和共混培养液培养7天后撤换为自体血浆培养基组增殖32±4.23倍。培养7天以后3组培养体系的细胞均开始快速增殖，但自体血浆培养基组增殖明显低于其他两组，培养至第20天，自体血浆培养基组增殖约124±5.0倍，共混培养液组增殖1971.88±73.1倍，共混培养液培养7天后撤换为自体血浆培养基组NK细胞增殖2059.8±124.0倍。共混培养液组增殖和共混培养液培养7天后撤换为自体血浆培养基组培养第20天NK细胞增殖倍数无明显差异。

图2和图3中，自体血浆培养基组NK阳性比率和细胞增殖倍数都明显小于其他两组；共混培养液组和共混培养液培养7天后撤换为自体血浆培养基组NK阳性比率和细胞增殖倍数无明显差异，但成本上有明显差异，因此，从经济上考虑，本发明选择使用第3组培养体系。

实施例3NK细胞的大量扩增培养

1)激活刺激NK细胞：将单个核细胞用共混培养液(在GT-T551H3培养液的基础上，含有5％自体血浆，200IU/mL IL-2，50ng/mL IL-15，25ng/mL IL-21)重悬，调整细胞密度为1.5×10⁶/mL，混匀后取4mL加入到T25培养瓶中，在37℃、5％CO₂及饱和水蒸气培养箱培养，第3天添加2mL共混培养液，继续至培养7天，显微镜下观察细胞形态。

2)NK细胞扩增培养：激活培养7天后，将自然杀伤细胞用10mL移液管吹打后，吸取至T75细胞培养瓶中，添加8mL新鲜培养基(在GT-T551H3培养液的基础上，含有1％自体血浆,200IU/mL IL-2)，37℃、5％CO₂及饱和水蒸气培养箱培养培养2天，之后每2～3天补液，维持细胞密度为2.0×10⁶/mL，继续培养至20天。第7天、10天、14天、18天和20天显微镜下观察细胞形态，进行细胞计数，活率及流式表型检测。

初始培养时，单个核细胞体积较小，在激活诱导过程中，细胞体积逐渐变大，细胞浆越来越丰富，细胞拉长并呈现突触样结构。第2天部分细胞聚集，成簇状克隆样生长，此后细胞增殖更加明显。

图4为扩增培养至第20天，使用倒置显微镜观察NK细胞的生长形态。图5为使用本发明的方法培养20天，细胞增殖曲线图。培养至20天，细胞由初始培养的6×10⁶个扩增至576×10⁶个，细胞扩增96倍。图6为使用本发明的方法培养20天，CD3及CD56的抗体进行双重染色并通过流式细胞法进行鉴定的结果图。图7为CD3-/CD56+表型NK细胞比率随培养时间的变化曲线。图8为CD3-/CD56+表型NK细胞增殖曲线。

实施例3中，培养至20天细胞活率达98％以上，NK细胞比率达90.4％，增殖1735倍。随着培养时间的延长，CD3-/CD56+表型NK细胞比率升高，NK细胞纯度升高。NK细胞纯度高于现有技术(比如CN104789527A公开的方法)，而且大大节省了细胞扩增的成本。

Claims (7)

1.一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：采用共混培养液培养NK细胞，培养7天；然后，改用自体血浆培养基培养，培养过程中每2～3天进行一次补液，维持细胞密度在2 .0×10⁶/mL，培养20天以上；

所述共混培养液的组成如下：在GT-T551H3培养液的基础上，添加5％自体血浆，200IU/mL的IL-2，50ng/mL的IL-15和25ng/mL的IL-21；

所述自体血浆培养基的组成如下：在GT-T551H3培养液的基础上，添加1～10％自体血浆，200IU/mL的IL-2。

2.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述采用共混培养液培养NK细胞时，初始单个核细胞的细胞密度为1 .5×10⁶cells/ml。

3.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述采用共混培养液培养NK细胞时，培养条件为：37℃，5％CO₂，饱和水蒸气，培养过程中每三天进行一次补液。

4.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述用自体血浆培养基培养时，初始细胞密度为2.0×10⁶cells/ml。

5.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述用自体血浆培养基培养时，培养条件为：37℃，5％CO₂，饱和水蒸气。

6.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述自体血浆为灭活的自体血浆，灭活的方式为：56℃水浴30min，2000g离心10min。

7.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述NK细胞，以脐血或外周血为细胞来源，通过以下方法得到：

1)在生物安全柜内，将血液分装到50ml离心管中，每管血液30ml，经500g离心10min；

2)离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中，56℃水浴灭活30min，2000g离心10min，留上清备用；

3)用生理盐水按照1:1的比例稀释血细胞，以2:1的比例将混匀的血细胞缓慢加到装有淋巴细胞分离液的离心管中，使其呈清晰的界面，400g离心20min；

4)离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、淋巴分离液层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中；

5)将白膜层细胞加生理盐水洗涤两次，300g离心10min；用培养基重悬，即为单个核细胞。

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