CN108004210B - 一种大量诱导扩增具有adcc效应的nk细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明设计一种大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，属于生物技术领域，本发明方法包括收集血浆、获得外周血单个核细胞、具有ADCC效应NK细胞的诱导、具有ADCC效应NK细胞的扩增等步骤，该方法操作简单，容易实现，可以获得大量具有ADCC效应的NK细胞，并且细胞纯度高、扩增效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，属于生物技术领域。
背景技术
NK细胞来源于骨髓造血干细胞，主要分布于外周血和脾脏，约占外周血淋巴细胞的5％-30％，是天然免疫的重要组成部分，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解，NK细胞在造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继免疫治疗方面的作用倍受关注。供者异源反应性NK细胞在异基因造血干细胞移植中不仅可以发挥移植物抗白血病(Graft Versus Leukemia，GVL)效应，而且可以减少移植物抗宿主病(Grart Versus Host Diseas，GVHD)的发生。对于实体瘤(如肾细胞癌、黑色素瘤)患者，NK细胞的输注也具有裂解肿瘤细胞的抗实体瘤作用。
NK细胞的杀伤功能主要以下三种机制来实现：①NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤靶细胞；②NK细胞通过膜TNF家族分子与靶细胞膜配体结合诱导靶细胞凋亡；③NK细胞还可以通过其表面CD16分子，与抗体结合，产生抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。有研究表明，具有ADCC效应的NK细胞与单克隆抗体药物联合应用，能够更好的发挥抗肿瘤作用。虽然目前有很多NK细胞扩增培养的方法，但仍存在细胞纯度低、扩增效率不高、不具有ADCC效应等问题。如何才能获得大量、具有ADCC效应的NK细胞仍有待进一步研究。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中无法大量扩增具有ADCC效应的NK细胞的问题，提供一种大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，可以获得大量具有ADCC效应的NK细胞。
本发明所采用的技术方案是：
一种大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，包括如下步骤：
(1)收集血浆：采集10-200mL人外周血，离心分离后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀，将血浆移至新的50mL无菌离心管中，灭活后离心，收集上清，用于后续细胞培养；
(2)获得外周血单个核细胞：用10-200mLPBS悬起步骤(1)中得到的血细胞沉淀，得到细胞悬液，将细胞悬液缓慢注入预先装有15-20mL人淋巴细胞分离液的50mL离心管中，然后室温离心，轻轻吸取分离界面乳白色细胞层，分装到1-4个50mL无菌离心管中，以生理盐水加至40-50mL，混匀后，1800-2500rpm离心8-10min，弃上清，收集细胞沉淀，用PBS洗涤后，即得外周血单个核细胞；
(3)具有ADCC效应NK细胞的诱导：用含有美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2-5×106个细胞/mL，接种于培养瓶中，37℃、5％CO2培养2-3d；
(4)具有ADCC效应NK细胞的扩增：用含有IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2-3×106个细胞/mL，37℃、5％CO2培养10-14d，即得大量具有ADCC效应的NK细胞。
进一步，步骤(1)中，灭活温度为56℃，时间为30min。
进一步，步骤(1)中，两次离心的转速均为2000-3000rpm，离心时间均为8-10min。
进一步，步骤(2)中，室温离心的转速为2000-2500rpm，时间为20min。
进一步，步骤(3)中，所述含有美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基的具体组成为：50-250ng/mL美罗华抗体、0.5-5μg/mL鼠抗人CD161抗体、100-1000U/mL IL-2、1-20ng/mL IL-15、1-10ng/mL IL-18和5-10％自体血浆。
进一步，步骤(4)中，所述含有IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基的具体组成为：100-1000U/mL IL-2、1-10ng/mL IL-15、1-10ng/mL IL-18和5-10％自体血浆。
进一步，步骤(4)中，培养期间，每2-3d半量换液，或者补加原体积一半体积的新培养基。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种体外诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，操作简单，容易实现，该方法可以获得大量具有ADCC效应的NK细胞，细胞纯度低、扩增效率高。
附图说明
图1是人外周血淋巴细胞中NK细胞比例的流式细胞术检测结果；
图2是采用实施例1方法诱导扩增后的NK细胞比例的流式细胞术检测结果；
图3是采用实施例1方法诱导扩增后的NK细胞表面CD16分子表达情况的流式细胞术检测结果；
图4是采用实施例1方法获得的NK细胞的ADCC效应的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，包括如下步骤：
(1)收集血浆：用肝素抗凝剂收集20mL人外周血(留取0.5mL用于流式检测CD16分子表达)，经2500rpm离心10min后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀，将血浆移至新的50mL无菌离心管中，56℃灭活30min，然后2500rpm离心10min，收集上清，用于后续细胞培养；
(2)获得外周血单个核细胞：用20mLPBS悬起步骤(1)中得到的血细胞沉淀，得到细胞悬液，将细胞悬液缓慢注入预先装有20mL人淋巴细胞分离液的50mL离心管中，然后2200rpm室温离心20min，轻轻吸取分离界面乳白色细胞层，分装到4个50mL无菌离心管中，以生理盐水加至50mL，混匀后，2000rpm离心10min，弃上清，收集细胞沉淀，用PBS洗涤2遍后，即得外周血单个核细胞；
(3)具有ADCC效应NK细胞的诱导：用含有美罗华抗体(50ng/mL)，鼠抗人CD161抗体(1μg/mL)，IL-2(500U/mL)，IL-15(5ng/mL)，IL-18(5ng/mL)和自体血浆(10％)的培养基调整细胞密度至3×106个细胞/mL，接种于培养瓶中，37℃、5％CO2培养2-3d；
(4)具有ADCC效应NK细胞的扩增：用含有IL-2(200U/mL)，IL-15(5ng/mL)，IL-18(5ng/mL)和自体血浆(5％)的培养基调整细胞密度至2×106个细胞/mL，每3d半量换液，或者补加原体积一半体积的新培养基，37℃、5％CO2培养14d，即得大量具有ADCC效应的NK细胞。
实验测试：
1.细胞计数
取培养的细胞，PBS稀释10倍，取10μl加入到血细胞计数板中，在显微镜下计数，并以“细胞总数÷4×稀释倍数×液体总量”公式计算细胞数。经计算，细胞数为2.35×106个细胞/mL。
2.流式细胞术检测外周血NK细胞CD16分子的表达
取100μl步骤(1)中留取的外周血，加入流式管中，加入不同荧光标记的鼠抗人CD3，CD56和CD16抗体各5μl，室温孵育15min，加入2mL红细胞裂解液，室温孵育5min，1500rpm室温离心5min，去上清，加入2mLPBS洗涤细胞，500rpm室温离心5min，弃上清，加入200μl PBS悬起细胞，流式细胞仪检测。
图1是人外周血淋巴细胞中NK细胞比例的流式细胞术检测结果，图2是采用实施例1方法诱导扩增后的NK细胞比例的流式细胞术检测结果；由图1和图2可以看出，经本方法诱导之前人外周血中NK细胞的比例比较低，仅为8.40％，经本方法诱导培养后，能够获得高纯度的NK细胞，比例高达96.7％。
3.流式细胞术检测扩增后NK细胞表面CD16分子的表达
取200μl扩增培养后的NK细胞，加入流式管中，加入不同荧光标记的鼠抗人CD3，CD56和CD16抗体各5μl，室温孵育15min，加入2mLPBS洗涤细胞，1500rpm室温离心5min，弃上清，加入200μl PBS悬起细胞，流式细胞仪检测。
图3是采用实施例1方法诱导扩增后的NK细胞表面CD16分子表达情况的流式细胞术检测结果；由图3可以看出，本发明方法诱导的NK细胞高表达具有ADCC效应的CD16分子。
4.NK细胞的ADCC效应的检测
试验方法：
a.靶细胞的处理
(1)收集培养的Raji细胞作为靶细胞，1000rpm离心5min，PBS洗1次；
(2)用PBS重悬靶细胞，调整浓度为1×106个/mL；
(3)取1mL靶细胞(1×106个/mL)，加入1μl 1mM的CalceinAM(终浓度为1μM)，37℃，5％CO2避光孵育30min。
(4)孵育好的靶细胞，PBS洗2次(1000rpm，5min)，5％FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整浓度为5×104个/mL，备用。
b.效应细胞的处理
(效应细胞：靶细胞＝20:1、10:1和5:1)
诱导后的NK细胞，1000rpm离心5min，收集细胞，并用含有5％FBS的培养基将细胞密度调整至1×106个/mL(20:1)、5×105个/mL(10:1)和2.5×105个/mL(5:1)。
c.铺板(各设四复孔，取平均值)
自发释放对照孔：90μl靶细胞+90μl 5％FBS·培养基+20μl PBS；
最大释放孔：90μl靶细胞+90μl 5％FBS·培养基+10μl 4.2％Triton100+10μlPBS；
实验孔：
NoAntibody Group：90μl靶细胞+90μl效应细胞+20μl PBS
Antibody Group：90μl靶细胞+90μl效应细胞+20μl Rituximab(50-200mg/mL)
d.检测
37℃，5％CO2避光孵育4h后，2500rpm离心5min，每孔吸取上清100μl于新96孔平板中，酶标仪检测上清荧光值(激发光波长485nm，发射光波长528nm)，根据下面公式计算细胞毒性，结果见表1：
表1
图4是采用实施例1方法获得的NK细胞的ADCC效应的检测结果,由图4可以看出，经本方法诱导的NK细胞具有ADCC效应，而且随着效靶比的增高，ADCC效应明显增强。
Claims (5)
1.一种大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)收集血浆：采集10-200mL人外周血，离心分离后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀，将血浆移至新的50mL无菌离心管中，灭活后离心，收集上清，用于后续细胞培养；
(2)获得外周血单个核细胞：用10-200mLPBS悬起步骤(1)中得到的血细胞沉淀，得到细胞悬液，将细胞悬液缓慢注入预先装有15-20mL人淋巴细胞分离液的50mL离心管中，然后室温离心，轻轻吸取分离界面乳白色细胞层，分装到1-4个50mL无菌离心管中，以生理盐水加至40-50mL，混匀后，1800-2500rpm离心8-10min，弃上清，收集细胞沉淀，用PBS洗涤后，即得外周血单个核细胞；
(3)具有ADCC效应NK细胞的诱导：用含有美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2-5×106个细胞/mL，接种于培养瓶中，37℃、5％CO2培养2-3d；
(4)具有ADCC效应NK细胞的扩增：用含有IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2-3×106个细胞/mL，37℃、5％CO2培养10-14d，即得大量具有ADCC效应的NK细胞；
步骤(3)中，所述含有美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基的具体组成为：50-250ng/mL美罗华抗体、0.5-5μg/mL鼠抗人CD161抗体、100-1000U/mL IL-2、1-20ng/mL IL-15、1-10ng/mL IL-18和5-10％自体血浆；
步骤(4)中，所述含有IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基的具体组成为：100-1000U/mL IL-2、1-10ng/mL IL-15、1-10ng/mL IL-18和5-10％自体血浆。
2.如权利要求1所述的大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，灭活温度为56℃，时间为30min。
3.如权利要求1所述的大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，两次离心的转速均为2000-3000rpm，离心时间均为8-10min。
4.如权利要求1所述的大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中，室温离心的转速为2000-2500rpm，时间为20min。
5.如权利要求1至4任一项所述的大量诱导扩增具有ADCC效应的NK细胞的方法，其特征在于，步骤(4)中，培养期间，每2-3d半量换液，或者补加原体积一半体积的新培养基。
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