CN110607276A - 高效扩增脐带血nk细胞的无血清培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，包括以下步骤：1)制作第一培养基和第二培养基；2)抗体包被；3)MNCs分离及自体血浆制备；4)NK细胞诱导培养；5)NK细胞扩大培养；6)NK细胞收集。本发明NK细胞扩增倍数高、纯度高、成本低、操作步骤简便，同样适用于外周血；本发明提供的分离培养方法解决了脐带血淋巴细胞难获得的问题，培养初始阶段排除了红细胞的污染，后期收获的NK细胞纯度均可达到70％以上，弥补了肿瘤病人NK细胞培养纯度低及数量不足的缺点，在同种异体NK细胞回输方面具有巨大的优势；本发明添加物和培养基配方单一，不易混淆和差错，培养流程简单，技术人员可以很容易的实施。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法。
背景技术
NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞，这种天然杀伤活性无需抗原致敏，并且无MHC限制性。它能自己识别和攻击外来病毒、癌细胞和异常细胞，一旦被激活，通过释放颗粒酶和穿孔素等杀伤性介质及分泌大量细胞因子直接攻击靶细胞，或通过抗体依赖的细胞毒作用(ADCC效应)杀伤肿瘤细胞，或通过诱导Fas/Fasl和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Trail)分子使靶细胞凋亡。
过继免疫疗法是取对肿瘤有免疫力的供者淋巴细胞，或患者自体淋巴细胞在体外活化、扩增后，再回输入患者体内发挥抗肿瘤作用。NK细胞由于独特的抗肿瘤特点，在肿瘤免疫中的作用越来越受到重视。目前，NK细胞不仅广泛用于肿瘤病人的免疫治疗，还可应用于预防肿瘤发生。
但是NK细胞在外周血中含量很少，尤其肿瘤患者比例更低，活性较差，因此临床上多采用健康供者的血液，通过体外扩增，采用同种异体回输的方式，这就对NK细胞的数量及纯度有较高要求，不能含有过多的T细胞、B细胞等淋巴细胞。而脐带血中所含的幼稚T细胞不易引发移植物抗宿主病(GVHD)，同时脐带血中NK前体细胞多余成人外周血，因此脐带血是制备NK细胞的理想来源。
研究显示，长时间的冷冻保存并不会影响脐带血来源的NK细胞的扩增能力和抗肿瘤活性，且脐带血属于医疗废弃物，取材有保障，因此脐带血成为治疗性NK细胞很有前途的来源。然而现有技术脐带血NK细胞扩增倍数低、效应细胞比例低(纯度低)、操作复杂、需要昂贵的NK细胞培养试剂盒、生产成本高。
发明内容
本发明的目的是针对背景技术中存在的扩增倍数低、效应细胞比例低(纯度低)、操作复杂、生产成本高的问题，提供一种扩增倍数高、纯度高、操作简单、成本低的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法。
一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，包括以下步骤：
1)制作第一培养基和第二培养基；
在基础培养基中添加终浓度为500～1550IU/ml的细胞因子A得到第一培养基。
在第一培养基中添加终浓度为40～80ng/ml的细胞因子B和终浓度为5％～10％的添加物得到第二培养基。
2)抗体包被：用生理盐水稀释Herceptin至1mg/ml～2mg/ml，并加入T-75cm2培养瓶中，置于4℃包被过夜或者室温孵育1h。
3)MNCs分离及自体血浆制备：
a)将脐带血采集至抗凝管，进行离心，吸取上层的血浆灭活得到自体血浆，下层的为脐血MNCs。
b)用羟乙基淀粉共沉淀和密度离心法分离脐血MNCs。
c)收集步骤b)中分离出的白膜层细胞，用生理盐水加2％的自体血浆洗涤二次。
4)NK细胞诱导培养：
d)将洗涤后的白膜层细胞转移至步骤2)中包被好或孵育后的T-75cm2培养瓶中，加入第二培养基重悬细胞，调整细胞密度至大于1.5×106个/ml，进行培养。
e)每隔一天补加第二培养基，调整细胞密度为2.0×106个/ml，继续培养至第六天。
5)NK细胞的扩大培养：再继续培养，并在培养的第八天和第11天补加第一培养基，且调整细胞密度为2.0×106个/ml，然后再继续培养直至收获细胞。
6)NK细胞收集：培养的第14天，离心收集NK细胞，流式细胞术检测NK细胞及NKT细胞的比例。
所述步骤4)、步骤5)和步骤6)中的培养条件：温度37℃，CO2的浓度为5％。
在其中一个实施例中，步骤1)中所述的基础培养基为淋巴细胞无血清培养基。
所述淋巴细胞无血清培养基为AIM-V培养基、或GT551-H3培养基、或Alys-505NK培养基、或X-VIVO15培养基。
步骤1)中所述的细胞因子A为IL-2。
步骤1)中所述的细胞因子B为IL-15和IL-21的混合物，且IL-15与IL-21的质量比为1:1～3:1。
步骤1)中所述的添加物为自体血浆或血清替代物。
在其中一个实施例中，步骤3)中的a)步骤中，灭活方法为56℃水浴30min。
在其中一个实施例中，步骤3)的b)步骤中，密度离心法的离心条件为800g,时间为20min。
在其中一个实施例中，步骤1)中，细胞因子A的添加浓度为1000IU/ml。
在其中一个实施例中，步骤1)中细胞因子B的添加浓度为60ng/ml。
在其中一个实施例中，步骤1)中添加物的浓度为5％。
在其中一个实施例中，步骤2)中的T-75cm2培养瓶为悬浮细胞专用培养瓶。
在其中一个实施例中，步骤3)中采集脐带血用肝素钠抗凝。
在其中一个实施例中，步骤4)中洗涤后的白膜层细胞的细胞浓度为2.0×106个/ml。
本发明的优点及有益效果：
1、本发明克服了现有技术在脐带血NK培养中细胞数量不足、纯度低的问题，同时降低了成本，简化了操作步骤，本方法同样适用于外周血。
2、本发明的NK细胞培养方法不需要昂贵复杂的NK细胞培养试剂盒套装，只需要在诱导阶段添加IL-15和IL-21，扩增阶段只需要IL-2维持，极大的降低了成本。
3、本发明的细胞因子配方，可实现NK细胞的高效活化及扩增，最终收获的NK细胞比市售NK细胞培养试剂盒有更多的数量和更高的纯度，提高了培养效率。
4、本发明提供的分离培养方法解决了脐带血淋巴细胞难获得的问题，培养初始阶段排除了红细胞的污染，后期收获的NK细胞纯度均可达到70％以上，弥补了肿瘤病人NK细胞培养纯度低的不足，在同种异体NK细胞应用方面具有巨大的优势。
5、本发明添加物和培养基配方单一，不易混淆和差错，培养流程简单，技术人员可以很容易的实施。
附图说明
图1为本发明培养时间的工艺流程图。
图2为本发明培养的第七天对照组(现有技术即市售NK细胞培养试剂盒培养的)的NK细胞比例图。
图3为本发明培养的第七天实验组(本发明方法培养的)的NK细胞比例图。
图4为本发明培养的第14天对照组(现有技术即市售NK细胞培养试剂盒培养的)的NK细胞比例图。
图5为本发明培养的第14天实验组(本发明方法培养的)的NK细胞比例图。
图6为对照组(现有技术培养的)和实验组(本发明培养的)的NK细胞数量生长曲线对比图。
图7为对照组(现有技术培养的)和实验组(本发明培养的)的NK细胞数量条形对比图。
具体实施方式
实施例1
请参阅图1，一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，包括以下步骤：
1)制作第一培养基和第二培养基；
在基础培养基中添加终浓度为1000IU/ml的细胞因子A得到第一培养基。
在第一培养基中添加终浓度为60ng/ml的细胞因子B和终浓度为5％的添加物得到第二培养基。
2)抗体包被：用生理盐水稀释Herceptin至1.2mg/ml，并加入T-75cm2培养瓶中，置于
4℃包被过夜或者室温孵育1h。
3)MNCs分离及自体血浆制备：
a)将脐带血采集至抗凝管，进行离心，吸取上层的血浆灭活得到自体血浆，下层的为脐血MNCs。
b)用羟乙基淀粉共沉淀和密度离心法分离脐血MNCs。
c)收集步骤b)中分离出的白膜层细胞，用生理盐水加2％的自体血浆洗涤二次。
4)NK细胞诱导培养：
d)将洗涤后的白膜层细胞转移至步骤2)中包被好或孵育后的T-75cm2培养瓶中，加入第二培养基重悬细胞，调整细胞密度至大于1.5×106个/ml，进行培养。
e)每隔一天补加第二培养基，调整细胞密度为2.0×106个/ml，继续培养至第六天。
5)NK细胞的扩大培养：再继续培养，并在培养的第八天和第11天补加第一培养基，且调整细胞密度为2.0×106个/ml，然后再继续培养直至收获细胞。
6)NK细胞收集：培养的第14天，离心收集NK细胞，流式细胞术检测NK细胞及NKT细胞的比例。
其中，步骤4)、步骤5)和步骤6)中的培养条件：温度37℃，CO2的浓度为5％。
其中，步骤1)中所述的基础培养基为淋巴细胞无血清培养基。
具体的，淋巴细胞无血清培养基为AIM-V培养基、或GT551-H3培养基、或Alys-505NK培养基、或X-VIVO15培养基。
具体的，步骤1)中的细胞因子A为IL-2。步骤1)中的细胞因子B为IL-15和IL-21的混合物，且IL-15与IL-21的质量比为1:1～3:1。步骤1)中的添加物为自体血浆。
具体的，步骤3)中的a)步骤中，灭活方法为56℃水浴30min。步骤3)的b)步骤中，密度离心法的离心条件为800g,时间为20min。
其中，步骤2)中的T-75cm2培养瓶为悬浮细胞专用培养瓶。
具体的，步骤3)中采集脐带血用肝素钠抗凝。
步骤4)中洗涤后的白膜层细胞的细胞浓度为2.0×106个/ml。
由图2至图7可知：本发明方法培养的(图6和图7中的实验组)与市场上的现有技术培养的(图6和图7中的对照组)对比，本发明NK细胞的扩增数量远远高于现有技术，数量将近是现有技术的2倍。
本发明的优点及有益效果：
1、本发明克服了现有技术在脐带血NK培养中细胞数量不足、纯度低的问题，同时降低了成本，简化了操作步骤，本方法同样适用于外周血。
2、本发明的NK细胞培养方法不需要昂贵复杂的NK细胞培养试剂盒套装，只需要在诱导阶段添加IL-15和IL-21，扩增阶段只需要IL-2维持，极大的降低了成本。
3、本发明的细胞因子配方，可实现NK细胞的高效活化及扩增，最终收获的NK细胞比市售NK细胞培养试剂盒有更多的数量和更高的纯度，提高了培养效率。
4、本发明提供的分离培养方法解决了脐带血淋巴细胞难获得的问题，培养初始阶段排除了红细胞的污染，后期收获的NK细胞纯度均可达到70％以上，弥补了肿瘤病人NK细胞培养纯度低的不足，在同种异体NK细胞应用方面具有巨大的优势。
5、本发明添加物和培养基配方单一，不易混淆和差错，培养流程简单，技术人员可以很容易的实施。
本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案作出各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。
Claims (10)
1.一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制作第一培养基和第二培养基；
在基础培养基中添加终浓度为500～1550IU/ml的细胞因子A得到第一培养基；
在第一培养基中添加终浓度为40～80ng/ml的细胞因子B和终浓度为5％～10％的添加
物得到第二培养基；
2)抗体包被：用生理盐水稀释Herceptin至1mg/ml～2mg/ml，并加入T-75cm2培养瓶
中，置于4℃包被过夜或者室温孵育1h；
3)MNCs分离及自体血浆制备：
a)将脐带血采集至抗凝管，进行离心，吸取上层的血浆灭活得到自体血浆，下层的为脐血MNCs；
b)用羟乙基淀粉共沉淀和密度离心法分离脐血MNCs；
c)收集步骤b)中分离出的白膜层细胞，用生理盐水加2％的自体血浆洗涤二次；
4)NK细胞诱导培养：
d)将洗涤后的白膜层细胞转移至步骤2)中包被好或孵育后的T-75cm2培养瓶中，
加入第二培养基重悬细胞，调整细胞密度至大于1.5×106个/ml，进行培养；
e)每隔一天补加第二培养基，调整细胞密度为2.0×106个/ml，继续培养至第六天；
5)NK细胞的扩大培养：再继续培养，并在培养的第八天和第11天补加第一培养基，
且调整细胞密度为2.0×106个/ml，然后再继续培养直至收获细胞；
6)NK细胞收集：培养的第14天，离心收集NK细胞，流式细胞术检测NK细胞及NKT细
胞的比例；所述步骤4)、步骤5)和步骤6)中的培养条件：温度37℃，CO2的浓度为5％。
2.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤1)中所述的基础培养基为淋巴细胞无血清培养基；
所述淋巴细胞无血清培养基为AIM-V培养基、或GT551-H3培养基、或Alys-505NK培养基、或X-VIVO15培养基；
步骤1)中所述的细胞因子A为IL-2；
步骤1)中所述的细胞因子B为IL-15和IL-21的混合物，且IL-15与IL-21的质量比为1:1～3:1；
步骤1)中所述的添加物为自体血浆或血清替代物。
3.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤3)中的a)步骤中，灭活方法为56℃水浴30min。
4.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤3)的b)步骤中，密度离心法的离心条件为800g,时间为20min。
5.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤1)中，细胞因子A的添加浓度为1000IU/ml。
6.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤1)中细胞因子B的添加浓度为60ng/ml。
7.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤1)中添加物的浓度为5％。
8.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤2)中的T-75cm2培养瓶为悬浮细胞专用培养瓶。
9.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤3)中采集脐带血用肝素钠抗凝。
10.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤4)中洗涤后的白膜层细胞的细胞浓度为2.0×106个/ml。
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