CN102356154A - 从脐带血有效增殖和分化自然杀伤细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从脐带血有效增殖和分化自然杀伤细胞(NK细胞)的方法。更确切地，本发明涉及从脐带血有效增殖和分化自然杀伤细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和2)在用多种细胞因子对其进行处理后，培养所述CD3阴性细胞。本发明的优势在于，与从造血干细胞诱导NK细胞的常规方法相比，通过从CD3阴性细胞诱导NK细胞，可在短时间段内获得高纯度的NK细胞；本发明的优势还在于，通过用不同细胞因子一起处理，例如通过IL-15和IL-21共处理，促进NK细胞的增殖和分化。即，本发明的方法可以诱导具有提高的抗癌细胞毒性的NK细胞，由此该方法可以有效地用于抗癌细胞疗法。
Description
技术领域
本发明涉及从脐带血有效增殖和分化自然杀伤细胞的方法，更确切地，本发明涉及从脐带血有效增殖和分化自然杀伤细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和2)在用多种细胞因子处理后，培养所述CD3阴性细胞。
背景技术
在形成免疫系统的细胞中，已知自然杀伤细胞(下文称“NK细胞”)能够非特异性杀死癌细胞。NK细胞的这种抗肿瘤细胞毒性已被用于通过使用淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来治疗实体瘤，或已被用于细胞疗法的新尝试，所述新尝试借助基于供体淋巴细胞输注的免疫疗法，避免骨髓移植或器官移植后发生的排斥反应(Tilden.A.B.等人，J.Immunol.，136：3910-3915，1986；Bordignon C等人，Hematologia 84：1110-1149，1999)。另已报道，NK细胞分化和活化的缺陷与不同种类的癌症密切相关，所述癌症诸如乳腺癌(Konjevic G等人，Breast Cancer Res.Treat.，66：255-263，2001)、黑素瘤(Ryuke Y等人，Melanoma Res.，13：349-356，2003)和肺癌(Villegas FR等人，Lung Cancer，35：23-28，2002)等。因而，为了治疗所述疾病，使用NK细胞的新型细胞疗法手段引起了我们的注意。
在细胞因子受体γc缺失的小鼠中，仍能发现B细胞和T细胞，但在所述小鼠中未发现NK细胞。因此，认为具有γc的那些受体在NK细胞分化中起重要作用(Singer，B等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，377-381，1995)。受体γc的类型为IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，其中，据报道，IL-2在提高成熟NK细胞的增殖和活化中发挥功能(Shibuya，A.等人，Blood 85，3538-3546，1995)。IL-2缺失的人和小鼠表现出显著减少的NK细胞群(DiSanto，J.P.等人，J.Exp.Med.171，1697-1704，1990)。同时，研究证明，IL-2和IL-2Ra缺失间接影响NK细胞的活性和群。另已知，IL-2R链参与IL-15受体的形成。
IL-15参与NK细胞的分化。在IL-15生成所需的转录因子干扰素(IFN)-调节因子1不足的小鼠中，观察到NK细胞的缺失(Kouetsu等人，Nature 391，700-703，1998)，这已为表明IL-15或IL-15Ra缺失小鼠中未发现NK细胞的研究所支持。已报道，IL-15借助NK细胞中表达的IL-15受体直接增强NK细胞的生长和分化(MrozekE等人，Blood 87，2632-2640，1996)。
IL-21是由活化的CD4+T细胞分泌的细胞因子(Nature，5：688-697，2005)。IL-21R在树突细胞、NK细胞和诸如T细胞和B细胞的淋巴细胞中表达(Rayna Takaki等人，J.Immonol 175：2167-2173，2005)。IL-21的结构与IL-2和IL-15的结构非常相似。IL-21R与IL-2R、IL-15、IL-7R和IL-4R等共享它的链(Asao等人，J.Immunol，167：1-5，2001)。根据在先的报道，IL-21诱导来自骨髓的NK细胞前体的成熟(Parrish-Novak等人，Nature，408：57-63，2000)。特别地，已报道IL-21增强NK细胞的效应子功能(如细胞因子生成和细胞毒性)(M.Strengell等人，J Immunol，170：5464-5469，2003；J.Brady等人，J Immunol，172：2048-2058，2004)。它还增强CD8+T细胞的效应子功能，从而促进适应性免疫系统的抗癌反应(Rayna Takaki等人，J Immunol 175：2167-2173，2005；A.Moroz等人，J Immunol，173：900-909，2004)。此外，它活化分离自人外周血的NK细胞(Parrish-Novak等人，Nature，408：57，2000)，并在诱导来自于从脐带血中分离的造血干细胞的NK细胞的成熟中起重要作用(J.Brady等人，J Immunol，172：2048，2004)。
为将NK细胞有效地用于抗癌免疫细胞疗法，重要的是获得足够数量的NK细胞。然而，NK细胞仅占血液中淋巴细胞的10％-15％，并且癌症患者中NK细胞的群、分化和功能均下降。因此，事实上很难获得足够数量的NK细胞。因而，迫切需要开发借助NK细胞增殖或分化获得大量NK细胞的方法。
NK细胞来源于骨髓的造血干细胞(HSC)。此前的体外诱导NK细胞分化的方法是基于对分离自脐带血并用适当细胞因子预处理的造血干细胞的培养(Galy等人，Immunity 3：459-473，1995；Mrozek E等人，Blood 87：2632-2640，1996；Sivori，S.等人，Eur J Immunol.33：3439-3447，2003；B. Grzywacz等人，Blood 108：3824-3833，2006)。也就是说，将Flt-3L、IL-7、SCF和IL-15添加至CD34+ HSC，随后培养5周以诱导分化为CD3-CD56+ NK细胞。然而，很难获得用于治疗的足够数量的细胞，并且诱导该分化需要长时间和高成本，这使其难以进行临床应用。
迄今已知NK细胞源自CD34+ HSC。然而，它们通过多个前体步骤被分化。尽管尚未鉴定出所有前体，最具代表性的前体是CD122+细胞。尚无CD3-细胞是NK前体的报道。
本发明人等试图开发用于获得NK细胞的更为有效且经济的方法。结果，本发明人等通过确认由如下步骤组成的新方法而完成了本发明，所述新方法能够有效促进NK细胞生长和分化并提高NK细胞的细胞毒性，所述步骤为通过将CD3阳性细胞从分离自脐带血的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞，并培养已用诸如IL-15和IL-21的细胞因子预处理后的CD3阴性细胞。
发明内容
本发明目的在于提供从脐带血有效增殖和分化NK细胞的方法，所述方法由如下步骤组成：1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和2)在用多种细胞因子预处理所述细胞后，培养CD3阴性细胞，并由此优化NK细胞的增殖和分化条件。
本发明另一目的在于提供用于癌症的预防性和治疗性组合物，所述组合物包含由本发明所述方法制备的、具有提高的细胞毒性的NK细胞，本发明另一目的还在于提供用于癌症的预防性和治疗性方法，所述方法使用具有提高的细胞毒性的NK细胞。
为实现上述目的，本发明提供增殖NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和
2)在用细胞因子处理步骤1)的细胞后，培养所述CD3阴性细胞。
本发明还提供分化NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和
2)在用细胞因子处理步骤1)的细胞后，培养所述CD3阴性细胞。
本发明还提供制备具有提高的细胞毒性的NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和
2)在用细胞因子处理步骤1)的细胞后，培养所述CD3阴性细胞。
本发明还提供用于癌症的预防性和治疗性组合物，所述组合物包含由所述方法制备的、具有提高的细胞毒性的NK细胞。
本发明还提供用于治疗癌症的方法，所述方法包括将药学上有效剂量的所述组合物给予患有癌症的受试者的步骤。
本发明还提供预防癌症的方法，所述方法包括将药学上有效剂量的所述组合物给予受试者的步骤。
此外，本发明提供由本发明所述方法制备的、具有提高的细胞毒性的NK细胞在用于癌症的预防性和治疗性组合物的生产中的用途。
与使用常规造血干细胞的方法相比，本发明的增殖和分化NK细胞的方法通过从CD3阴性细胞诱导NK细胞的分化，可以产生具有更高纯度的NK细胞，本发明的增殖和分化NK细胞的方法通过用不同细胞因子IL-15和IL-21共处理细胞而有利于NK细胞的增殖和分化。结果，所述方法可以产生具有提高的细胞毒性的NK细胞，所述NK细胞因而可以有效地用于抗癌治疗。
附图说明
参照以下附图，可以最好地理解对本发明优选实施方式的应用，其中：
图1是示出双色流式细胞术(two-color flow cytometry)结果的一组图。单核细胞(MNC)分离自人脐带血。随后，通过将其中的CD3阳性T细胞清除来获得CD3阴性细胞。进行双色流式细胞术以研究CD3阴性 细胞和单核细胞的纯度。
图2是示出在用细胞因子(IL-2、IL-15和IL-21)处理CD3阴性细胞后，CD3阴性细胞群随时间的变化图，观察所述变化以研究细胞因子对CD3阴性细胞生长的作用。
图3是示出由FACS分析到的NK细胞(CD3-CD56+)比例的一组图，用以研究细胞因子(IL-2、IL-15和IL-21)对NK细胞分化的作用。用不同组合的所述细胞因子处理CD3阴性细胞，随后进行培养。随后，进行FACS以分析NK细胞比例。
图4是示出NK细胞(CD3-CD56+)比例的统计学分析的图，进行该分析是为了研究细胞因子(IL-2、IL-15和IL-21)对NK细胞分化的直接作用。用不同组合的细胞因子处CD3阴性细胞，随后进行培养。随后，研究NK细胞比例。
图5是示出FACS结果的一组图，所述结果显示了以两种组合的细胞因子(IL-15+IL-21，IL-2+IL-15+IL-21)处理的组中所培养的NK细胞比例，所述组合被认为是在诱导分化和增殖中最为有效的组合。
图6是示出NK细胞组的51Cr分泌测定法结果的图，用所述两种在诱导分化和增殖中最为有效的细胞因子(IL-15+IL-21，IL-2+IL-15+IL-21)组合处理所述NK细胞组后再进行培养，所述测定法的进行是为研究细胞因子对NK细胞细胞毒性的直接作用。
图7是示出NK细胞组的LDH活性测定法结果的图，用所述两种在诱导分化和增殖中最为有效的细胞因子(IL-15+IL-21，IL-2+IL-15+IL-21)组合处理所述NK细胞组后再进行培养，所述测定法的进行是为研究细胞因子对NK细胞细胞毒性的直接作用。
具体实施方式
下文描述了本发明中所使用的术语。
本发明所使用的术语“预防”表示通过给予本发明组合物而能抑制癌症发作或转移、或者延缓癌症进程的各种行为。
本发明所使用的术语“治疗”和“改善”表示通过给予本发明所述 组合物能有利地改变癌症症状或转移的各种行为。
本发明所使用的术语“给予”表示根据适当方法向受试者提供所需量的本发明组合物的行为。
本发明所使用的术语“受试者”表示人或包括猴、狗、山羊、猪和大鼠在内的任何动物，在这些动物中，通过给予本发明的组合物可抑制癌症进展或转移。
本发明所使用的术语“药学上有效的剂量”表示为临床治疗合理接受的组合物的量，或足以抑制癌症进展或转移的量。可以根据疾病种类、疾病严重程度、药物活性、敏感性、给予期限和途径、排泄速率、治疗周期、会一起使用的其它药物以及医药领域公知的其它因素来确定所述剂量。
下文详细描述了本发明。
本发明提供增殖NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和
2)在用细胞因子处理步骤1)的细胞后，培养所述CD3阴性细胞。
在上述方法中，可以通过但并非总限于下述方法来完成步骤1)中CD3阴性细胞的制备：利用CD3微珠使CD3阳性细胞具有磁性，从而能够被MACS柱过滤，以分离其中的CD3阴性细胞的方法；或者用荧光标记CD3阴性T细胞的方法，通过使用细胞分选仪分离所述CD3阴性T细胞。
为制备本发明的CD3阴性细胞，首先从脐带血分离单核细胞层(MNC层)。随后，通过从MNC层清除红细胞来获得单核细胞。向其中添加CD3微珠(Miltenyi Biotech)以使CD3+细胞具有磁性，使其通过MACS柱以将CD3-细胞和CD3+细胞分开。结果，从单核细胞中回收到了CD3-细胞(产率：32％)。CD3阴性细胞的平均纯度为88％(参见表1、表2和图1)。
在上述方法中，步骤2)的细胞因子优选为选自于由IL2、IL-15和 IL-21组成的组中的至少2种，并且更优选的是用IL-15和IL-21一起共处理或IL-2、IL-15和IL-21一起共处理，然而并不总限于此。
本发明还研究了细胞因子对NK细胞增殖的作用。为此，分别培养了未用细胞因子处理的CD3阴性细胞组、IL-2处理的CD3阴性细胞组、IL-2和IL-15共处理的CD3阴性细胞组、IL-15和IL-21共处理的CD3阴性细胞组以及IL-2、IL-15和IL-21共处理的CD3阴性细胞组。随后，利用FACS分析CD3-CD56+ NK细胞的比例。结果，在未用细胞因子处理的组和仅用IL-2处理的组中，NK细胞群略有减少。同时，在余下的组中，细胞群持续增加至第18天。自第18天起，所述细胞群开始减少。在这些组中，用IL-2、IL-15和IL-21三者处理的细胞组和用IL-15及IL-21共处理的组表现出良好的细胞生长速率(见图2)。
因此，已确认，在用IL-15和IL-21共处理时或在用IL-2、IL-15和IL-21三者一起处理时，可以加速CD3阴性细胞生长。
在本发明中，将来自造血干细胞的NK细胞分化与来自CD3阴性细胞的NK细胞的分化进行比较。为此，分别从脐带血来源的造血干细胞和CD3阴性细胞诱导NK细胞分化。随后，通过FACS研究NK细胞群率。结果，在短时间段内，使用CD3阴性细胞而非使用造血干细胞，获得了具有高纯度的增加的NK细胞群。特别地，大规模地获得了原代CD3阴性细胞，所述原代CD3阴性细胞可进一步增殖多达15倍。因而，最终获得大量NK细胞(见表3-表6)。
相比通过使用造血干细胞诱导NK细胞增殖的方法，已证明通过使用CD3阴性细胞诱导NK细胞增殖的方法更有效地在短时间段内获得大量NK细胞。
本发明还提供分化NK细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和
2)在用细胞因子处理步骤1)的细胞后，培养所述CD3阴性细胞。
在上述方法中，可以通过但并不总限于下述方法来完成步骤1)中CD3阴性细胞的制备：利用CD3微珠使CD3阳性细胞具有磁性，从而 能够被MACS柱过滤，以分离其中的CD3阴性细胞的方法；或者用荧光标记CD3阴性T细胞的方法，通过使用细胞分选仪分离所述CD3阴性T细胞。
在上述方法的步骤2)中，优选用两种或更多种细胞因子一起处理，所述细胞因子选自于由IL-2、IL-15和IL-21组成的组。特别地，优选用IL-15和IL-21共处理或更优选用IL-2、IL-15和IL-21三者共处理，但并非总限于此。
为研究细胞因子对NK细胞分化的作用，在本发明中，用不同组合的细胞因子处理CD3阴性细胞，随后通过使用FACS分析NK细胞群率。结果，与仅用IL-2处理或未用任何细胞因子处理的其它组相比，用两种或更多种细胞因子处理的组表现出高分化率。用两种或更多种细胞因子共处理的细胞组表现出高分化率，自第8天起达到至少90％。用两种细胞因子IL-15和IL-21处理以及用IL-2、IL-15和IL-21全部三种处理的那两组表现出相似的高分化率(见图3和图4)。
因此，已确认，在从CD3阴性细胞诱导的NK细胞的分化中，用IL-15和IL-21共处理或用IL-2、IL-15和IL-21共处理更有效。
在本发明中，将来自造血干细胞的NK细胞分化与来自CD3阴性细胞的NK细胞分化进行比较。为此，分别从脐带血来源的造血干细胞和CD3阴性细胞诱导NK细胞分化。随后，通过FACS研究NK细胞群率。结果，在短时间段内，使用CD3阴性细胞而非使用造血干细胞，获得了具有高纯度的增加的NK细胞群。特别地，大规模地获得了原代CD3阴性细胞，所述原代CD3阴性细胞可进一步增殖多达15倍。因而，最终获得大量NK细胞(见表3-表6)。
相比通过使用造血干细胞诱导NK细胞增殖的方法，已证明通过使用CD3阴性细胞诱导NK细胞增殖的方法更有效地在短时间段内获得大量NK细胞。
本发明还提供制备具有提高的细胞毒性的NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备 CD3阴性细胞；和
2)在用细胞因子处理步骤1)的细胞后，培养所述CD3阴性细胞。
在上述方法中，可以通过但并不总限于下述方法来完成步骤1)中CD3阴性细胞的制备：利用CD3微珠使CD3阳性细胞具有磁性，从而能够被MACS柱过滤，以分离其中的CD3阴性细胞的方法；或者用荧光标记CD3阴性T细胞的方法，通过使用细胞分选仪分离所述CD3阴性T细胞。
在上述方法的步骤2)中，优选用两种或更多种细胞因子一起处理，所述细胞因子选自于由IL-2、IL-15和IL-21组成的组。特别地，优选用IL-15和IL-21共处理或更优选用IL-2、IL-15和IL-21三者共处理，但并非总限于此。
为研究细胞因子对NK细胞活性的作用，用不同组合的细胞因子处理CD3阴性细胞，所述CD3阴性细胞将被分化成NK细胞。随后，通过使用γ-计数器研究51Cr的分泌，并使用试剂盒测量乳酸脱氢酶(LDH)的活性。结果，与仅用IL-21处理或未用任何细胞因子处理的组相比，在用至少两种不同细胞因子处理的组中观察到更高的细胞毒性。并且，与用IL-2、IL-15和IL-21这全部三种细胞因子处理的组相比，用IL-15和IL-21一起处理的组表现相对高的细胞毒性(见图5-图7)。
以上结果提示，在从CD3阴性细胞诱导的NK细胞的分化上，使用IL-15和IL-21的共处理更为有效，并且所得NK细胞具有更高的细胞毒性。
本发明还提供用于癌症的预防性和治疗性组合物，所述组合物包含由所述方法制备的、具有提高的细胞毒性的NK细胞。
本文中的癌症优选选自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、结肠癌和肺癌组成的组，但并非总限于此。
本发明的组合物可以包含一种或多种具有与以上NK细胞相同或相似功能的活性成分。
本发明的组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体，所述药 学上可接受的载体选自于由盐水、灭菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体及包含所述组分中的一种或多种的混合物组成的组。如有必要，可以另外添加诸如抗氧化剂和缓冲剂等的普通添加剂。本发明的组合物可以通过与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂混合而制剂成不同的形式，所述不同的形式包括注射用的水性溶液剂、悬浮剂和乳剂；以及丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。还可以按照Remington’s Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company，Easton PA，18th，1990)中提出的如下方法，根据成分将所述组合物制备成合适的形式。
本发明的组合物可以通过肠胃外给予(例如，静脉内注射、皮下注射、腹膜注射或局部注射)。可以根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、排泄和疾病严重程度来确定所述组合物的有效剂量。所述剂量为每日0.0001～500mg/kg，优选为每日0.01～10mg/kg，给药频率为每日一次，或优选地为每日数次。
本发明人等确认，具有提高的细胞毒性的NK细胞可以由CD3阴性细胞诱导而来，因而具有抗癌细胞毒性的NK细胞可以由此分化，暗示本发明的细胞可以有效用于抗癌治疗。
本发明还提供治疗癌症的方法，所述方法包括将药学上有效剂量的所述组合物给予患有癌症的受试者的步骤。
本发明还提供预防癌症的方法，所述方法包括将药学上有效剂量的所述组合物给予受试者的步骤。
本文中的癌症优选选自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、结肠癌和肺癌组成的组，但并非总限于此。
本发明的组合物可以包含一种或多种具有与以上NK细胞相同或相似功能的活性成分。除上述有效成分外，所述组合物还可以包括一种或多种用于给药的药学上可接受的载体。
本发明的组合物可以通过肠胃外给予(例如，静脉内注射、皮下注射、腹膜注射或局部注射)。可以根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、排泄和疾病严重程度来确定所述组合物的有 效剂量。所述剂量为每日0.01～5000mg/kg，优选为每日0.01～10mg/kg，给药频率为每日一次，或优选地为每日数次。
本发明人等确认，具有提高的细胞毒性的NK细胞可以由CD3阴性细胞诱导而来，因而具有抗癌细胞毒性的NK细胞可以由此分化，暗示本发明的细胞可以有效用于抗癌治疗。
此外，本发明提供由本发明方法制备的、具有提高的细胞毒性的NK细胞在用于癌症的预防性和治疗性组合物的生产中的用途。
本文中的癌症优选选自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、结肠癌和肺癌组成的组，但并非总限于此。
本发明人等确认，具有提高的细胞毒性的NK细胞可以由CD3阴性细胞诱导而来，因而具有抗癌细胞毒性的NK细胞可以由此分化，暗示本发明的细胞可以有效用于抗癌治疗。
如以下实施例(实验实施例和制备实施例)所示，本发明的实用的实施方式和当前优选的实施方式是示例性的。
然而，应当理解，本领域技术人员在考虑本公开内容的情况下，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：从脐带血来源的单核细胞制备CD3阴性细胞
用RPMI 1640，以2∶1的比例对用于研究目的而提供的脐带血进行稀释，所述的脐带血来源于医院(韩国建阳大学医院(Konyang University Hospital)产科学和妇科学部和忠南国立大学医院(Chungnam National University Hospital)产科学和妇科学部，各医院都通过了IRB测试)。将所制备的脐带血小心地上样至Ficoll-Paque的上部，随后在20,000rpm下离心30分钟以获得单核细胞层(MNC层)。从由单核细胞层获得的细胞中清除红细胞，以获得单核细胞。将CD3微珠(Miltenyi Biotech)添加至所得单核细胞，随后进行标记。通过使用CS柱和Vario MACS清除CD3阳性细胞，以获得CD3阴性细胞。特别地，CD3微珠(Miltenyi Biotech)识别CD3ε链，从而将磁性提供给来自单核细胞的CD3阳性细胞。随后，使单核细胞中连有微珠的CD3阳性细胞通过与该磁性反应的MACS柱。结果，CD3阳性细胞留在柱中，而CD3阴性细胞通过该柱，借此完成分 离。借助流式细胞术(FACS)研究所得CD3阴性细胞的纯度。结果，如表1和表2所示，来自单核细胞的CD3阴性细胞的产率为32％(表1)，CD3阴性细胞的平均纯度为88％(表2和图1)。
表1
表2
| CD3-CD56+(％) | CD3-(CD3+)(％) | |
| 实验1 | 14.2 | 66.1(33.9) |
| 实验2 | 10.8 | 98.3(1.7) |
| 实验3 | 5.1 | 99.9(0.1) |
| 平均 | 10.03 | 88.1(11.9) |
实施例2：细胞因子对CD3阴性细胞增殖的作用和分化成NK细胞的作用
以1×106个细胞/ml的浓度，将分离自脐带血的CD3阴性细胞接种至12孔板(Falcon，USA)。将细胞分为未用细胞因子处理的组、仅用IL-2处理的组、用IL-2和IL-15一起处理的组、用IL-15和IL-21一起处理的组以及用IL-2、IL-15和IL-21全部三种细胞因子处理的组，随后在Myelocult(Stem cell Technology)完全培养基上，在37℃的5％CO2孵育箱中培养21天。培养过程中，当细胞浓度达到1×106个细胞/ml时，使所述细胞分布于另一培养基上进行传代培养，所述另一培养基具有与最初使用的培养基相同的成分。在第4天、第8天、第14天、第18天和第21天计数细胞数量。在第4天、第8天、第14天和第21天，将CD3抗体和CD56抗体与细胞缀合，随后借助FACS研究CD3-CD56+ NK细胞比例。
结果，在未用细胞因子处理的组和仅用IL-2处理的组中，细胞群没有增加或略有减少。同时，在余下的三组中，细胞群增加，然而，自第18天起，所述群开始下降。只有用IL-2、IL-15和IL-21共处理的组以及 用IL-15和IL-21共处理的组表现出了彼此相似的、相对高的细胞生长(图2)。因此，已证明细胞因子组合的处理、特别是IL-15和IL-21的共处理可以促进CD3阴性细胞的增殖。
根据研究NK细胞比例的结果，已确认，与未处理的组或仅用IL-2处理的组相比，用至少两种不同细胞因子处理的组表现出较高的分化率、特别地自第8天起达到90％或更高。在细胞因子的三种组合中，IL-2、IL-15和IL-21的组合以及IL-15和IL-21的组合表现出相似的、较高的分化率(图3和图4)。总之，混合的细胞因子、特别是包括IL-15和IL-21的组合的处理被证明在从CD3阴性细胞诱导NK细胞的分化中是有效的。
实施例3：细胞因子对CD3阴性细胞中NK细胞活性的作用
如实施例2所示，用不同组合的细胞因子处理CD3阴性细胞，以诱导分化为NK细胞。随后，在用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的组和用IL-15和IL-21的组合处理的组中，研究51Cr的分泌和乳酸脱氢酶(LDH)的活性，这些组表现出较高的增殖率和分化率(图5)。
清洗分化的NK细胞，随后在考虑效应子：靶标的比例的情况下，在用靶细胞上样(104个/孔)的96孔圆底板中培养4小时，所述靶细胞是 51Cr-标记的K562细胞。在培养完成时，获得100μl培养物上清液，随后使用γ-计数器测量放射性。另外，清洗分化的NK细胞，随后在考虑效应子：靶标的比例的情况下，在用靶K562细胞上样的96孔圆底板中培养4小时。获得50μl培养物上清液，随后在室温下与LDH底物反应30分钟。随后测量LDH的活性。
结果，与用IL-2、IL-15和IL-21全部三种细胞因子处理的组相比，在用IL-15和IL-21共处理的组中表现出较高的细胞毒性(图6和图7)。因此，已经确认，在从CD3阴性细胞诱导NK细胞的分化方面，IL-15和IL-21的细胞因子组合的处理更为有效，并且所述分化的NK细胞具有更高的细胞毒性。
实施例4：来自CD3阴性细胞和来自造血干细胞的NK细胞的分化和增殖的比较
<4-1>从脐带血分离造血干细胞并分化为NK细胞
用RPMI 1640，以2∶1的比例对用于研究目的而提供的脐带血进行稀释，所述脐带血由医院提供。将所制备的脐带血小心地上样至Ficoll-Paque的上部，随后在20,000rpm下离心30分钟以获得MNC层。从由MNC层获得的细胞中清除红细胞，以获得单核细胞。向其中添加造血干细胞标志物CD34微珠用于标记，随后通过使用MS/RS柱和MAC分离CD34+细胞。以1×106个细胞/孔的浓度，在12孔板(Falcon，USA)中接种分离的造血干细胞，随后在Myelocult(Stem Cell Technology)完全培养基中，在37℃的5％CO2孵育箱中培养14天，所述完全培养基添加了人SCF(30ng/ml，PeproTech，Rocky Hill，NJ)、人Flt3L(50ng/ml，PeproTech，Rocky Hill，NJ)、人IL-7(5ng/ml，PeproTech)和氢化可的松(10-6M，Stem Cell Tech.)。三天后，用含有细胞因子的相同的新鲜培养基替换一半的培养物上清液。为分化为成熟NK细胞，14天后回收HSC，随后在存在人IL-15(30ng/ml，PeproTech)的情况下进一步再培养14天。在所述培养开始三天后，用含有细胞因子的相同的新鲜培养基替换一半的所述培养基。
<4-2>来自CD3阴性细胞和来自造血干细胞的NK细胞的增殖和分化的比较
为比较来自造血干细胞和来自CD3阴性细胞的NK细胞的分化和增殖，获得脐带血来源的CD3阴性细胞和造血干细胞。从其中诱导NK细胞的分化和增殖，随后进行FACS。
结果，如表3-表5所示，CD34+的比例(脐带血造血干细胞的比例)多至1％(平均为0.88％)(表3)，暗示起始细胞群太小[(1-3)×106/50ml脐带血]而无法诱导增殖(平均细胞数量为1×108个细胞)(表4)。此外，经前体分化为NK细胞花费了5周。所得NK细胞表现出60％-90％(平均为86％)甚至更低的纯度(表5)和很大的个体差异。
表3
| 实验1 | 实验2 | 实验3 | 实验4 | |
| MNC | 2.8×108 | 2.18×108 | 2.8×108 | 2.6×108 |
| HSC(CD34+细胞) | 1.4×106 | 2.02×106 | 3.5×106 | 2.3×106 |
| (CD34+/MNC)×100 | 0.5％ | 0.92％ | 1.25％ | 0.88％ |
[0106] 表4
| 实验1 | 实验2 | 实验3 | 实验4 | |
| mNK(5周) | 1.13×108 | 8.9×108 | 1.38×108 | 1.1×108 |
| 倍数(mNK/HSC) | 80.7 | 44.0 | 39.4 | 54.7 |
表5
| CD56+CD122+(％) | |
| 实验1 | 95.56 |
| 实验2 | 68.02 |
| 实验3 | 95.69 |
| 平均 | 86.42 |
同时，如表6所示，与使用造血干细胞的方法相比，确认了从CD3阴性细胞诱导分化的方法能够在短时间段内大规模产生具有高纯度的NK细胞(表6)。即，可以获得大量的起始CD3阴性细胞[(5-8)×107/50ml脐带血]，所述起始CD3阴性细胞将再增殖多至15倍，由此能获得大规模的(平均1×109个细胞)NK细胞。从培养第8天起，可以获得具有至少95％的高纯度的NK细胞(CD3-CD56+)，暗示与来源自造血干细胞的NK细胞相比，该方法中，分化期短得多但纯度更高。
表6
| 起始细胞数 | 分化期 | NK分化率(％) | 最终NK细胞数 | |
| MNC | 2.6×108 | - | - | - |
| HSC(CD34+细胞) | 2.3×106 | 5周 | 86.4 | 1.1×108 |
| CD3-细胞 | 6.7×107 | 8天 | 95.5 | 1.0×109 |
因此，已确认，与从造血干细胞诱导NK细胞的方法相比，从CD3阴性细胞诱导NK细胞分化的方法有利于在短时间段内大规模制备NK细胞。
工业实用性
如上文所解释的，本发明提供更为有效和经济的增殖和分化NK细胞的方法，由此能够被有效用于使用NK细胞的抗癌免疫细胞疗法，该疗法通常需要大量NK细胞。
Claims (20)
1.增殖NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和
2)在用细胞因子处理步骤1)的细胞后，培养所述CD3阴性细胞。
2.如权利要求1所述的增殖NK细胞的方法，其中，通过如下工艺进行步骤1)的制备：
通过使用CD3微珠，使CD3阳性细胞具有磁性；和
通过使用MACS柱分离CD3阴性细胞；或者在用荧光标记CD3阴性T细胞后，通过使用细胞分选仪分离CD3阴性细胞。
3.如权利要求1所述的增殖NK细胞的方法，其中，使用选自于由IL-2、IL-15和IL-21组成的组中的至少两种细胞因子一起进行步骤2)的细胞因子的处理。
4.如权利要求1所述的增殖NK细胞的方法，其中，步骤2)的细胞因子的处理是IL-15和IL-21的共处理。
5.分化NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和
2)在用细胞因子处理步骤1)的细胞后，培养所述CD3阴性细胞。
6.如权利要求5所述的分化NK细胞的方法，其中，通过如下工艺进行步骤1)的制备：
通过使用CD3微珠，使CD3阳性细胞具有磁性；和
通过使用MACS柱分离CD3阴性细胞；或者在用荧光标记CD3阴性T细胞后，通过使用细胞分选仪分离CD3阴性细胞。
7.如权利要求5所述的分化NK细胞的方法，其中，使用选自于由IL-2、IL-15和IL-21组成的组中的至少两种细胞因子一起进行步骤2)的细胞因子的处理。
8.如权利要求5所述的分化NK细胞的方法，其中，步骤2)的细胞因子的处理是IL-15和IL-21的共处理。
9.制备具有提高的细胞毒性的NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过将CD3阳性T细胞从脐带血源的单核细胞中清除，来制备CD3阴性细胞；和
2)在用细胞因子处理步骤1)的细胞后，培养所述CD3阴性细胞。
10.如权利要求9所述的制备具有提高的细胞毒性的NK细胞的方法，其中，通过如下工艺进行步骤1)的制备：
通过使用CD3微珠，使CD3阳性细胞具有磁性；和
通过使用MACS柱分离CD3阴性细胞；或者在用荧光标记CD3阴性T细胞后，通过使用细胞分选仪分离CD3阴性细胞。
11.如权利要求9所述的制备具有提高的细胞毒性的NK细胞的方法，其中，使用选自于由IL-2、IL-15和IL-21组成的组中的至少两种细胞因子一起进行步骤2)的细胞因子的处理。
12.如权利要求9所述的制备具有提高的细胞毒性的NK细胞的方法，其中，步骤2)的细胞因子的处理是IL-15和IL-21的共处理。
13.用于癌症的预防性和治疗性组合物，所述组合物包含由权利要求9所述方法制备的、具有提高的细胞毒性的NK细胞。
14.如权利要求13所述的用于癌症的预防性和治疗性组合物，其中，所述癌症选自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、结肠癌和肺癌组成的组。
15.治疗癌症的方法，所述方法包括将药学上有效剂量的权利要求13所述的组合物给予患有癌症的受试者的步骤。
16.如权利要求15所述的治疗癌症的方法，其中，所述癌症选自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、结肠癌和肺癌组成的组。
17.预防癌症的方法，所述方法包括将药学上有效剂量的权利要求13所述的组合物给予受试者的步骤。
18.如权利要求17所述的预防癌症的方法，其中，所述癌症选自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、结肠癌和肺癌组成的组。
19.由权利要求9所述的方法制备的具有提高的细胞毒性的NK细胞在用于癌症的预防性和治疗性组合物的制备中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中，所述癌症选自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、结肠癌和肺癌组成的组。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120215 |