CN106164256B - 来自脐带血的汇集的nk细胞和在治疗癌和慢性感染病中的应用 - Google Patents

来自脐带血的汇集的nk细胞和在治疗癌和慢性感染病中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106164256B
CN106164256B CN201580011900.9A CN201580011900A CN106164256B CN 106164256 B CN106164256 B CN 106164256B CN 201580011900 A CN201580011900 A CN 201580011900A CN 106164256 B CN106164256 B CN 106164256B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
hla
ucb
cell
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580011900.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106164256A (zh
Inventor
P·埃诺
M·比利亚尔瓦·冈萨雷斯
陆朝阳
J·F·罗西
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Montpellier I
Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Original Assignee
Emercell Sas
Universite de Montpellier I
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Emercell Sas, Universite de Montpellier I, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM filed Critical Emercell Sas
Publication of CN106164256A publication Critical patent/CN106164256A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106164256B publication Critical patent/CN106164256B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞疗法领域，特别是NK细胞介导的疗法。本发明涉及从至少2个脐带血单位(UCB单位)或者包含所述细胞的组分生产离体细胞群，优选NK细胞群的方法，其通过汇集所述至少2个UCB单位来生产所述细胞群而进行。本发明涉及通过本发明的方法获得或者能够获得的所述细胞，优选NK细胞作为用于治疗用途的组合物，优选作为用于治疗癌和慢性感染病的组合物中的应用。

Description

来自脐带血的汇集的NK细胞和在治疗癌和慢性感染病中的 应用
本发明涉及细胞疗法领域，特别是NK细胞介导的疗法。本发明涉及从至少2个脐带血单位(UCB单位)或者包含所述细胞的组分生产离体细胞群，优选NK细胞群的方法，其通过汇集所述至少2个UCB单位来生产所述细胞群而进行。本发明涉及通过本发明的方法获得或者能够获得的所述细胞，优选NK细胞作为用于治疗用途的组合物，优选作为用于治疗癌和慢性感染病的组合物中的应用。
自然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的基础组分。它们能够识别和破坏肿瘤细胞以及被病毒或细菌感染的细胞(Lanier LL，2008；Nat Immunol 9:495-502)。过去二十年来对NK细胞受体和其配体的鉴定和表征已经让人进一步了解NK细胞被肿瘤细胞激活的分子机制。抑制性受体的发现支持了Karre提出的“丧失自我(Missing self)”假说，其先锋性工作指出NK细胞杀死缺乏主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的肿瘤细胞。抑制性受体识别MHC I类分子，而激活受体识别各种配体(P.A.Mathew，J Cell Sci Ther，第3卷，第7期)。
NK细胞负责移植物抗白血病(GvL)效应，具有最小GvH(移植物抗宿主)和HvG(宿主抗移植物)效应，关注涉及NK细胞的免疫疗法的开发。来自数个实验室的数据表明，开发NK细胞同种异体反应性能够具有与NK细胞源无关的很大益处。错配的移植物触发由NK细胞介导的同种异体反应性，其基于“丧失自我识别”。供体抗受体NK细胞同种异体反应性产生在对于HLA-C等位基因组(HLA-Bw4组和/或HLA-A3/11)而言错配的个体之间。KIR配体错配是NK细胞同种异体反应性的前提，因为在移植物抗宿主方向不是KIR配体错配的20个供体-受体对中，未发现供体同种异体反应性NK集落。
NK细胞的另一兴趣点是即使NK也识别主要具有其抑制性受体的自体-身份分子(HLA分子)，它们通过激活信号和抑制信号的复杂平衡而激活，并且需要仅由感染的异常细胞或肿瘤细胞所表达激活信号来杀死所述细胞。然后供体选择更容易，因为单独使用NK细胞，供体和患者不需要十分确切地表达相同的主要HLA等位基因(例如对于全脐带血(UCB)移植而言，HLA匹配>4/6)。与之相反，当接收者不表达相应的HLA(无抑制性信号＝iKIR-HLA错配)时，表达抑制性受体的NK导致更好的肿瘤杀死而不引起GvHD。
即使NK细胞具有天然细胞毒性潜力，其细胞毒性活性可以通过不同的激活机制在体外改善，大多数这些机制也能够扩增(amplify)NK细胞(以各种扩增因子)，产生更具治疗性的细胞，更有效。
发现扩增/激活NK细胞的良好途径对于改善这些细胞的治疗潜力(数量和功效)是重要的。
体外激活程序包括使用细胞因子和生长因子(例如IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、SCF、Flt3-L(...))，例如与辅助细胞或不与辅助细胞一起使用，所述辅助细胞例如外周血单核细胞、肿瘤细胞或细胞系(参见M.Villalba Gonzales等，WO2009/141729)。使用呈现特定iKIR-HLA错配(4个主要iKIR-HLA错配：HLA A3/A11；HLA Bw4；HLA C1；HLA C2和相关iKIR受体)的辅助细胞。
脐带血(UCB)已经显示为NK的良好来源，具有更高的NK细胞百分比和良好的体内扩增/激活(参见M.Villalba Gonzales等，WO2012/146702)。
但是，虽然可能以良好的扩增速率扩增和激活在一个UCB单位中含有的NK细胞，但是期望提供用于临床疗法、可获得的、纯的、具有高扩增速率或激活状态并展示NK细胞的细胞毒性活性的细胞产物，特别是NK细胞产物。
另外，会期望所述方法允许在同一批次(生产批次)中生产预期治疗至少大于1名、优选50名、更优选约100名患者的大量细胞，特别是激活的NK细胞，以及需要显示尽可能低可变性的治疗剂。
为此，会期望提供赋予在通过细胞制造工艺同一生产批次获得大量特定的富集细胞群的能力的方法，所述细胞制造工艺符合药品生产管理规范(cGMP)、商业规模生产以及管理机构的化学、制造以及控制标准。
这是本发明的目标。
申请人首次以令人惊奇的方式成功地从不同供体扩增和富集NK细胞。
根据第一实施方式，本发明涉及生产细胞群的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供至少n个脐带血单位(UCB单位)，或其含有所述细胞的组分，n≥2，优选2<n≤100；和
(b)汇集所述至少n个UCB单位，或其含有所述细胞的组分，以生产所述细胞群。
在更优选的实施方式中，3≤n≤50，最优选3≤n≤25。
在本发明的背景下，“含有所述细胞的UCB单位的组分”是指含有至少期望生产的细胞群或者所述群的一部分的UCB单位的组分。
在优选方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述方法还包括下述步骤：
(c)使步骤(b)中获得的汇集物中含有的T细胞耗尽。
根据另一优选实施方式，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述方法包括下述步骤：在步骤(b)汇集之前使n个UCB单位的每一个中含有的T细胞耗尽。
本发明还提供根据本发明的方法，其中，对于主要HLA I类组的基因型而言在步骤b)中汇集的n个UCB单位呈现相同的模式。
在本说明书中，“对于主要HLA I类组的基因型而言呈现相同模式”是指其HLA分子的组被相同的抑制性KIR识别、并且优选其中存在于汇集的n个UCB中的各HLA组被NK细胞通过相同的主要抑制性KIR识别的UCB单位。
在另一优选实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中存在于汇集的n个UCB中的各UCB属于被相同抑制性KIR识别的HLA组。
如本文所用，术语“KIR”或“抑制性KIR”具有本领域中的通常含义，并且包括但不限于KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2。
主/主要抑制性KIR是KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2。
KIR2DL1识别HLA-C w4以及相关的“组2”等位基因。KIR2DL2和KIR2DL3识别HLA-Cw3以及相关的“组1”等位基因。KIR3DL1是具有Bw4基序的HLA-B同种异型(allotype)的受体。最后，KIR3DL2是HLA-A3/11的受体。
在另一优选实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，所述主要HLA I类组选自由下述组成的组：被KIR3DL2识别的HLA A3/A11，被KIR3DL1识别的HLA Bw4，被KIR2DL2/3识别的HLA C组1，和被KIR2DL1识别的HLA C组2。
UCB单位优选来源是人UCB单位。
在特别优选的实施方式中，所述来源是冷冻人UCB的来源。
在另一方面，本发明还提供从n个UCB单位中含有的细胞生产细胞的扩增群的方法，所述方法包括下述步骤：
(A)通过根据本发明的用于生产细胞群的方法，从至少n个UCB单位或其含有所述细胞的组分生产细胞群，可选的是在步骤A)之前各UCB单位已经对所述细胞进行初步地且分开地扩增；和
(B)在合适的培养基中扩增获自从步骤(A)获得的细胞群中获得的所需细胞，以产生所述的所需细胞的扩增群。
在本发明的从n个UCB单位中含有的细胞生产细胞的扩增群的方法中，在步骤A)中的汇集步骤b)之前各UCB单位已经对所述细胞进行初步地且分开地扩增的情况下，步骤(B)可以是可选步骤。
在另一优选方面，本发明还提供从n个UCB单位中含有的所需细胞生产分化细胞群的方法，所述方法包括下述步骤：
(A)通过根据本发明的用于生产细胞群的方法，从所述n个UCB单位或其含有所述所需细胞的组分生产细胞群，可选的是在步骤A)之前各UCB单位已经对所述细胞进行初步单独地分化；和
(B)在合适的培养基中使获自之前步骤的所需细胞分化，以生产所述的分化细胞群。
在本发明的从n个UCB单位中含有的细胞生产分化细胞群的方法中，在步骤A)中的汇集步骤b)之前各UCB单位已经对所述细胞进行初步单独地分化的情况下，分化步骤(B)可以是可选步骤。
在另一优选方面，本发明还提供一种生产含有激活的自然杀伤(NK)细胞的细胞群的方法，所述方法包括：
(A)通过根据本发明的用于生产细胞群的方法，从至少n个UCB单位或其含有所述NK细胞的组分生产含有激活的NK细胞的细胞群，可选的是在步骤A)之前各UCB单位已经对所述NK细胞进行初步地且分开地扩增；
(B)在合适的培养基中激活从步骤(A)获得的所述NK细胞，以生产含有激活的NK细胞的所述细胞群；
C)可选的是，从所述群回收所述激活的NK细胞。
在另一优选方面，本发明还提供一种生产扩增的激活的NK细胞群的方法，所述方法包括：
(A)通过根据本发明的用于生产细胞群的方法，从至少n个UCB单位或其含有所述NK细胞的组分生产含有NK细胞的细胞群，可选的是在步骤A)之前各个UCB单位已经对所述NK细胞进行初步地且分开地扩增和激活；
(B)在合适的培养基中扩增和激活从步骤(A)获得的所述NK细胞，以生产所述扩增的激活的NK细胞群；和
(C)可选的是，回收所述扩增的激活的NK细胞。
本发明还包括一种从n个UCB单位生产扩增且可选地激活的NK细胞群的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供至少n个UCB单位，或其含有NK细胞的组分，n≥2，优选2<n≤100或3≤n≤50，更优选3≤n≤25，其中所述至少n个UCB单位对于主要HLA I类组的基因型呈现相同模式，优选的是其中在汇集的n个UCB中呈现的各HLA组被NK细胞通过相同的主要抑制性KIR识别；
ii)可选地使各UCB单位进行红细胞/红血球耗尽，优选通过密度梯度分离，更优选通过Ficoll-
Figure BDA0001109342210000051
密度梯度分离，通过Hetastarch(羟乙基淀粉；HES)法，通过使用
Figure BDA0001109342210000052
CB装置或者通过冷冻解冻步骤进行；
iii)可选地，将在步骤i)或ii)中获得的细胞群冷冻，保存在液氮中，并在步骤iv)之前解冻；
iv)使各UCB单位中含有的T细胞耗尽；
v)对于在之前步骤中获得的各个UCB单位，分开地扩增并可选的是通过在合适的培养基中使一个UCB单位或其含有NK细胞的组分中含有的NK细胞接触而激活在所述UCB单位中含有的NK细胞，从而生产所述扩增群，可选的是，激活各UCB单位的NK细胞，优选的是在3～28天期间激活各UCB单位的NK细胞；和；
vi)汇集在之前步骤UCB单位或其含有NK细胞的组分中获得的n个UCB单位细胞，以生产汇集的扩增且可选激活的NK细胞群。
本发明还包括一种从n个UCB单位生产扩增且可选地激活的NK细胞群的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供至少n个UCB单位，或其含有NK细胞的组分，n≥2，优选2<n≤100或3≤n≤50，更优选3≤n≤25，其中所述至少n个UCB单位对于主要HLA I类组的基因型呈现相同模式，优选的是其中在汇集的n个UCB中呈现的各HLA组被NK细胞通过相同的主要抑制性KIR识别；
ii)可选地使各UCB单位进行红细胞/红血球耗尽，优选通过密度梯度分离，更优选通过Ficoll-
Figure BDA0001109342210000061
密度梯度分离(Ficoll-Paque
Figure BDA0001109342210000063
型)，通过Hetastarch(羟乙基淀粉；HES)法，通过使用
Figure BDA0001109342210000062
CB装置或者通过冷冻解冻步骤进行；
iii)可选地，将在步骤i)或ii)中获得的细胞群冷冻，保存在液氮中，并在步骤iv)之前解冻；
iv)对于在之前步骤中获得的各个UCB单位，分开地扩增并可选的是通过在合适的培养基中使一个UCB单位或其含有NK细胞的组分中含有的NK细胞接触而激活在所述UCB单位中含有的NK细胞，从而生产所述扩增群，可选的是，激活各UCB单位的NK细胞，优选的是在3～28天期间激活各UCB单位的NK细胞；
v)汇集在之前步骤中从UCB单位或其含有NK细胞的组分中获得的n个UCB单位细胞，以生产汇集的扩增且可选激活的NK细胞群；和
vi)可选地，使在步骤v)后获得的汇集的NK细胞中含有的T细胞耗尽。
在优选实施方式中，使在步骤v)后获得的汇集的NK细胞中含有的T细胞耗尽的步骤vi)不是可选步骤，而是所要求保护方法的一部分。
在另一优选实施方式中，使在步骤v)后获得的汇集的NK细胞中含有的T细胞耗尽的步骤vi)，之后是选择展示CD56+生物标记的NK细胞的步骤，无论在该工序的最后是否仍然需要消除残留的非激活NK细胞。
本发明还包括一种从n个UCB单位生产扩增且可选地激活的NK细胞群的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供至少n个UCB单位，或其含有NK细胞的组分，n≥2，优选2<n≤100或3≤n≤50，更优选3≤n≤25，其中所述至少n个UCB单位对于主要HLA I类组的基因型呈现相同模式，优选的是其中在汇集的n个UCB中呈现的各HLA组被NK细胞通过相同的主要抑制性KIR识别；
ii)可选地使各UCB单位进行红细胞/红血球耗尽，优选通过密度梯度分离，更优选通过Ficoll-
Figure BDA0001109342210000064
密度梯度分离，通过Hetastarch(羟乙基淀粉；HES)法，通过使用
Figure BDA0001109342210000065
CB装置或者通过冷冻解冻步骤进行；
iii)可选地，将在步骤i)或ii)中获得的细胞群冷冻，保存在液氮中，并在步骤iv)之前解冻；
iv)可选地，或优选地，使各UCB单位中含有的T细胞耗尽；
iv)汇集在之前步骤UCB单位或其含有NK细胞的组分中获得的n个UCB单位细胞，以生产汇集的NK细胞群；和
vi)通过在合适的培养基中使所述汇集物中含有的NK细胞或其含有NK细胞的组分接触而扩增并可选地激活在之前步骤中获得的汇集的NK细胞，从而生产所述汇集的扩增且可选地激活的NK细胞群，优选的是在1～5周的持续时间进行所述扩增和激活，优选地是在9～28天的总持续时间里，扩增步骤后NK细胞的扩增因子对于扩增/激活步骤而言为至少100，优选200、300或500。
本发明还包括一种从n个UCB单位生产扩增且可选地激活的NK细胞群的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供至少n个UCB单位，或其含有NK细胞的组分，n≥2，优选2<n≤100或3≤n≤50，更优选3≤n≤25，其中所述至少n个UCB单位对于主要HLA I类组的基因型呈现相同模式，优选的是其中在汇集的n个UCB中呈现的各HLA组被NK细胞通过相同的主要抑制性KIR识别；
ii)可选地使各UCB单位进行红细胞/红血球耗尽，优选通过密度梯度分离，更优选通过Ficoll-
Figure BDA0001109342210000071
密度梯度分离，通过Hetastarch(羟乙基淀粉；HES)法，通过使用
Figure BDA0001109342210000072
CB装置或者通过冷冻解冻步骤进行；
iii)可选地，将在步骤i)或ii)中获得的细胞群冷冻，保存在液氮中，并在步骤iv)之前解冻；
iv)汇集在之前步骤UCB单位或其含有NK细胞的组分中获得的n个UCB单位细胞，以生产汇集的NK细胞群；
v)可选地，或优选地，使在步骤iv后获得的汇集的NK细胞中含有的T细胞耗尽；和
vi)通过在合适的培养基中使所述汇集物中含有的NK细胞或其含有NK细胞的组分接触而扩增并可选地激活在之前步骤中获得的汇集的NK细胞，从而生产所述汇集的扩增且可选地激活的NK细胞群(优选的是，在1～5周的持续时间)，优选地是在9～28天的总持续时间，扩增步骤后NK细胞的扩增因子对于扩增/激活步骤而言为至少100，优选200、300或500。
根据本发明的所有方法和与生产激活/扩增的NK细胞相关的所有方法特别适合用于从汇集的UCB单位制备激活的NK细胞，所述汇集的UCB单位具有以下KIR的错误表达：KIR2DL2和KIR2DL3、KIR2DL1、KIR3DL1和KIR3DL2。因此，在该情况下，根据本发明如上制备的激活/扩增的汇集的NK细胞对来自缺乏相应KIR的其它个体的细胞具有同种异体反应性，相反的是其耐受来自具有相同KIR配体的另一个体的细胞。
因此，通过本发明的方法，可以生产至少2个不同生产批次、优选3个批次，更优选4个批次的通过本发明的用于生产NK细胞的方法能够获得的汇集的激活/扩增的NK细胞的集合体或治疗细胞库，或者所述生产批次的至少2、3或4种组分的集合体，并且其中各个生产批次展示一种主要抑制性KIR的不同错误表达，所述主要抑制性KIR优选选自KIR2DL2和KIR2DL3、KIR2DL1、KIR3DL1和KIR3DL2抑制性KIR的组。
此类至少2个不同生产批次、优选3个批次，更优选4个批次的通过本发明的用于生产汇集/扩增的NK细胞的方法能够获得的汇集的激活/扩增的NK细胞的集合体包含在本发明中。
在优选实施方式中，所述集合体是储存容器的集合体(collection)，其含有至少2、3或4个容器，每个容器含有汇集的激活/扩增的NK细胞，或其组分，其通过本发明的用于生产NK细胞的方法能够获得，并且展现一种主要抑制性KIR的特定错误表达。
根据本发明，所要求保护的集合体的治疗一个患者所需的量的一个生产批次，或其组分可用于移植在有需要的患者中，优选展示不表达特定主要KIR配体的靶细胞的患者，所述配体被将移植的汇集的激活/扩增的NK细胞生产批次识别。
可以通过任何公知的标准方法进行UCB/NK细胞或患者靶细胞的HLA/KIR基因分型/表型分型。
在优选实施方式中，适合扩增和激活所述NK细胞的所述合适的培养基包含辅助细胞和/或至少一种合适的NK激活因子。
在优选实施方式中，所述辅助细胞选自下述组：
-哺乳动物细胞，优选人细胞，更优选来自细胞的HLA型集合体(HLA-typedcollection of cells)的细胞，并且可选的是，经照射的细胞，特别是经γ射线、X射线或紫外线照射的细胞，优选经γ射线照射的细胞；
-转化的哺乳动物细胞，优选人细胞，其中在所述细胞中，编码杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIR)配体的一个基因的表达已经被抑制。
在优选实施方式中，来自细胞的HLA型集合体的细胞来自PLH细胞系，优选选自ECACC N°.88052047，IHW 9047号和HOM-2，ID n°HC107505，IHW 9005号的组。
在优选实施方式中，所述辅助细胞是转化哺乳动物细胞，所述细胞中编码KIR配体的一个基因的表达已经被抑制并且还包括抑制或减少MHC-I表达和/或抑制ERK5基因的表达。制备此类辅助细胞的方法是本领域技术人员公知的(参见WO2012/146702，2012年11月1日公开，此处通过援引并入本文)。
可以通过本领域公知的任何方法进行所述辅助细胞中MHC-I表达的抑制或减少。例如，在国际专利申请公开WO2009141729A2中例举了所述方法。通常而言，通过使用β-2-微球蛋白基因表达的抑制剂进行MHC-I表达的所述抑制或减少。
如上所述，所述辅助细胞会呈现阴性ERK5表型。术语“呈现阴性ERK5表型的细胞”是指在细胞中存在的ERK5蛋白的表达水平或量(特别是线粒体中)与其表达水平相比，减少至少10％，优选25％～90％，例如25％～50％或50％～75％的细胞，
可以通过本领域公知的任何方法进行所述细胞中ERK5基因表达的抑制或减少。例如，在国际专利申请公开WO2009141729A2中例举了所述方法。通常而言，通过使用ER 5基因表达的抑制剂进行基因ER 5表达的所述抑制或减少。
在优选实施方式中，所述辅助细胞已经永生化，优选通过爱泼斯坦-巴尔(EpsteinBarr)病毒(EBV)转化来永生化。
结果，所述辅助细胞会组成在培养物中无限期地增殖的细胞系。使细胞永生化的方法是本领域公知的，特别是使用用于将人淋巴细胞永生化的“爱泼斯坦-巴尔病毒”(“EBV”)方法。
在优选实施方式中，所述合适的培养基作为合适的NK激活因子包含白介素-2(IL-2)、IL-7和/或IL-12和/或IL-15，或具有α-干扰素或β-干扰素，优选人重组激活因子。
当不使用辅助细胞来激活NK细胞时，可以使用以下可能的含有NK细胞激活因子的培养基进行所述激活：
1/IL-2 5ng/ml+/-抗-CD3 50ng/ml+IL-7 10ng/ml+IL-12 10ng/ml，优选7天后；
2/hIL-15 30ng/ml+hIL-21 30ng/ml(PeproTech)+氢化可的松10-6M>CD34+，培养21天，因此对于成熟/激活NK细胞而言培养21天；
3/IL-2 500U/ml+珠CD335(NKp46)和CD2；
4/细胞因子混合物IL-7、SCF、IL-2、IL-15(高浓度)和GM-CSF、G-CSF、IL-6(低浓度)，用于NK细胞扩增，从D14～D42，在生物反应器中，从CD34+扩增；D0-9＝低分子肝素+细胞因子混合物(高浓度)SCF、Flt3L、TPO、IL-7和(低浓度)GM-CSF，G-CSF、IL-6(CD34+扩增)；J9-14＝低分子肝素+细胞因子混合物(强浓度)SCF、Flt3L、IL-15、IL-7和GM-CSF、G-CSF，IL-6(低浓度，NK分化)。
(也可以使用IL-18和IFNα)。
-在辅助细胞存在下的激活和扩增：
1/IL-2 500U/ml+自体同源/同种异体的经照射喂养PBMC(25Gy)或EBV-LCL(100Gy)，D0时喂养细胞的比率：NK 20：1(或10：1，对于UCB单位放大(scale-up))
2/IL-2 200U/ml+丝裂霉素处理的喂养物(feeder)(PBMC+K562，比例1：1)比例喂养细胞：NK 8:1
3/D0时IL-2 500U/ml+同种异体的经照射喂养物PBMC(5 000rad)，和(abd)在喂养基中或者与喂养细胞预温育的D7比率喂养细胞：总10:1+OKT3(抗-CD3)30ng/ml
4/IL-2 500U/ml+经照射喂养物Jurkat-KLl(300Gy)，在D0
5/IL-2 500U/ml+自体同源的经照射喂养物PBMC(2000rad，+OKT3 10ng/ml，在开始刺激时喂养细胞的T淋巴细胞(未照射组分中(din)耗尽)，比率喂养细胞：NK 5：1 J0
6/IL-2+IL-15+喂养物经照射喂养物K562-mb15-41BBL(100Gy)
在另一优选实施方式中，在本发明的方法中，使T细胞耗尽的步骤通过包含下述步骤的方法进行：
-使细胞与耗尽抗体(depleting antibody)接触；和
-通过所述耗尽抗体检测来除去所述细胞。
耗尽抗体优选至少是选自由抗-CD3、抗-CD 14和抗-CD 20组成的组的抗体，优选抗-CD3抗体。
在获得的耗尽细胞群中，小于0.5％，或甚至小于0.1％或甚至小于0.001％是CD3阳性细胞。
在另一优选实施方式中，在本发明的方法中，各UCB单位或汇集的n个UCB单位是红细胞/红血球耗尽的(red cell-/erythrocytes depleted)，优选通过密度梯度分离，更优选通过Ficoll-
Figure BDA0001109342210000111
密度梯度分离，通过Hetastarch(羟乙基淀粉；HES)法，通过使用
Figure BDA0001109342210000112
CB装置或者通过冷冻解冻步骤进行。
在另一优选实施方式中，在本发明的方法中，各UCB单位或汇集的n个UCB单位通过包括将红细胞裂解的方法，特别是通过包括将在各UCB单位或在n个UCB单位的汇集细胞中的细胞冷冻和解冻的步骤的方法而将红细胞耗尽。
在另一优选实施方式中，在本发明的方法中，用于步骤b)或用于步骤i)的UCB单位是来自冷冻储存的UCB单位的解冻UCB单位。
在另一优选实施方式中，在本发明的方法中，用于步骤b)或用于步骤i)的UCB单位是来自冷冻储存的UCB单位的解冻UCB单位。
将在所述方法最后获得的所述汇集的UCB单位，或含有细胞的其组分优选储存在低于-70℃，优选低于-80℃的温度下，更优选储存于液氮中。
在另一优选实施方式中，本发明涉及本发明的方法，其中：
-在使用前将各UCB单位初步稀释在合适的培养基中，优选稀释在RPMI培养基中；和/或
-在将各UCB单位中或汇集的n个UCB单位中的红细胞/红血球耗尽后，将收集的细胞再悬浮于合适的培养基中，优选再悬浮于RMPI培养基中，或者再悬浮于培养基型X-VIVOTM(Lonza)、AIM-VTM培养基(Invitrogen)或CellGroTM(CellGenix)中，该培养基可选地含有AB阴性胎牛血清(FBS)；和/或
-如果将来自各红细胞耗尽的UCB单位或来自汇集的红细胞耗尽的UCB单位的收集细胞冷冻储存，则将收集细胞再悬浮于包含白细胞冷冻保护剂的合适培养物中。
更优选的是，用于NK细胞扩增/激活的合适培养基中存在的NK细胞和辅助细胞的比例为0.01～2，优选0.05～1.0，更优选0.1～0.5。
更优选的是，用于NK细胞扩增/激活的合适培养基中存在的辅助细胞与待扩增/激活的NK细胞是HLA-KIR错配的。
根据另一优选实施方式，本发明涉及用于生产根据本发明的汇集的、激活的和/或扩增的NK细胞的方法，其中所述方法还包括CD56+NK细胞富集的步骤。
根据另一优选实施方式，本发明涉及用于从UCB单位生产扩增的、可选激活的NK细胞群的至少两种不同汇集物的方法，其中被各汇集的n个UCB的NK细胞识别的主要HLA I类组是不同的，并且来自n个UCB单位的扩增的、可选激活的NK细胞群的各汇集物通过根据本发明的生产汇集的激活的和/或扩增的NK细胞的方法生产。
更具体而言，本发明涉及用于从根据本发明的UCB单位生产扩增的、可选激活的NK细胞群的至少2、3优选4种不同汇集物的方法，其中被各汇集的n个UCB的NK细胞识别的主要HLA I类组是不同的，并且选自由下述组成的组：被KIR3DL2识别的HLA A3/A11，被KIR3DL1识别的HLA Bw4，被KIR2DL2/3识别的HLA C组1，和被KIR2DL2识别的HLA C组2。
根据另一实施方式，本专利申请的发明涉及下述细胞群：
-通过本发明的方法获得的细胞群，或
-通过本发明的方法能够获得的细胞群，并且其中所述“能够获得”的细胞群含有源自至少n个UCB单位的细胞，优选NK细胞，或者其含有NK细胞的组分，n≥2，优选2<n≤100或3≤n≤50，更优选3≤n≤25，并且优选的是，其中对于主要HLAI类组的基因型而言所述n个UCB单位还呈现相同模式，优选其中被各汇集的n个UCB的NK细胞识别的主要HLA I类组是不同的，并且选自由下述组成的组：被KIR3DL2识别的HLA A3/A11，被KIR3DL1识别的HLABw4，被KIR2DL2/3识别的HLA C组1，和被KIR2DL2识别的HLA C组2。
更优选的是，可根据本发明的方法获得的所述细胞群还对于各汇集的n个UCB而言展示KIR之一的错误表达，所述KIR选自KIR2DL2和KIR2DL3、KIR2DL1、KIR3DL1和KIR3DL2的组。
在另一方面，本发明涉及包含通过根据本发明的方法获得，或通过根据本发明的方法能够获得的汇集的和激活的和/或扩增的细胞群，特别是NK细胞群的组合物。
本发明还涉及包含根据本发明的方法获得，或根据本发明的方法能够获得的汇集的和激活的和/或扩增的细胞群，特别是NK细胞群的药物组合物，其用作药物。
本发明还涉及还包含药学上可接受的载体的根据本发明的药物组合物。
在本说明书中，“药学上可接受的载体”是指成为药物组合物的一部分的化合物或者化合物的组合，其不引起二次反应并且例如促进活性化合物的施用、增加其体内寿命和/或功效、增加其在溶液中的稳定性或者改善其保存。所述药学上可接受的载体是本领域公知的，并且会被本领域技术人员根据选择的活性化合物的性质和施用模式来采用。
根据另一方面，本发明涉及一种用于哺乳动物细胞、优选用于人细胞的储存容器的集合体，其中各个所述储存容器含有生产批次的细胞群的组分，所述细胞群通过根据本发明的方法能够获得或者获得。
优选的是，根据本发明的用于哺乳动物细胞的储存容器的集合体含有扩增和/或激活的NK细胞。
优选的是，根据本发明的用于哺乳动物细胞的储存容器的集合体或所述根据本发明的所述组合物含有至少107，优选2～10×107或10～100×107个激活和/或扩增的NK细胞，这取决于待治疗患者的重量。
优选的是，每一个根据本发明的所述储存容器集合体，或所述根据本发明的所述组合物含有NK细胞，并基本上不含CD3+T细胞，优选小于0.1％或小于0.01％。
优选的是，根据本发明的用于哺乳动物细胞的储存容器的集合体或根据本发明的所述组合物含有：
-至少75％，优选大于85％或90％的展示标志物CD56+的NK细胞；和/或
-至少75％，优选大于80％的展示CD45RAdim的NK细胞。
根据另一方面，本发明涉及根据本发明的储存容器的集合体的储存容器，或者根据本发明的所述组合物，其用于抑制肿瘤细胞的增殖，优选用于预防和/或治疗癌或用于治疗感染。
在优选实施方式中，所述肿瘤细胞或待治疗的癌选自下述组：血液病恶性肿瘤细胞，实体瘤细胞或癌细胞、优选白血病细胞，急性T细胞白血病细胞，慢性粒细胞性淋巴瘤(CML)细胞，急性骨髓性白血病细胞，慢性粒细胞性白血病(CML)细胞，多发性骨髓瘤细胞，或肺、结肠、前列腺、成胶质细胞瘤癌症。
根据本发明，根据本发明制备的汇集的激活的和/或扩增的NK细胞，或者根据本发明的所述组合物还可用于治疗感染病或免疫异常/自体免疫疾病。
在优选实施方式中，将根据本发明的储存容器或组合物中含有的细胞根据待治疗的疾病/病理学通过系统性或局部途径施用于至受试对象。优选的是，所述化合物可通过肌内、皮内，腹膜内或皮下途径，或通过口服途径而系统性地施用。还可以以数个剂量、随着时间推移而分散地施用根据本发明的包含抗体的组合物。
最佳的施用模式、给药方案和药物制剂形式可以根据建立适于患者的治疗时通常考虑的标准而确定，例如患者的年龄或重量，患者总体健康的严重性、对治疗的耐受性和关注的副作用。
通过以下附图和实施例而进一步说明本发明。但是，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明：
图1-1～1-3(图1的子图1、2和3)是说明本发明的制造过程的实例的示意图。
图2和3说明在CD3耗尽后或者未经CD3耗尽的情况下获得的NK增殖。
图4说明从汇集的CD3耗尽的UCB单位获得的NK增殖。
图5说明从5个汇集的CD3耗尽的UCB单位获得的NK增殖。
图6说明在从之前未经CD3耗尽的汇集的UCB单位获得的NK增殖。
图7说明在用CD3未耗尽的UCB培养9天后从汇集的UCB单位获得的NK增殖。
图8说明利用2个KIR-HLA匹配的UCB获得并且用PLH辅助细胞扩增的NK增殖扩增因子。
图9说明用2个KIR-HLA错配和匹配的UCB获得并且用PLH辅助细胞扩增的NK增殖扩增因子。
实施例1：材料和方法
A)细胞：
PLH(实施例4)：无HLA-C1，ECACC库n°88052047，IHW 9047号
该细胞系通过来自斯堪的纳维亚妇女的B淋巴细胞的EBV永生化而获得。该细胞是完全HLA基因分型，并且对于表达来自C组2的HLA Class I等位基因(A3/A11和Bw4型)具有特异性，但是对于来自C组1的不具有特异性(完整信息在IMGT/HLA数据库)。
该细胞系用作NK扩增/激活程序的辅助细胞，因为其允许选择辅助细胞和UCB(表达HLA C组1，和潜在的相关抑制性受体KIR2DL2/3)之间的特定HLA错配。由于一些病毒诱导的用于NK激活受体的配体的膜表达，通过EBV感染进行转化增加了其NK激活能力。
HOM-2(实施例4):无HLA-C2，ID n°HC107505，IHW 9005号
该细胞系通过来自加拿大/北美妇女的B淋巴细胞的EBV永生化而获得。该细胞是完全HLA基因分型，并且对于表达来自C组1的HLA Class I位基因(A3/A11和Bw4型)具有特异性，但是对于来自C组2的不具有特异性(完整信息在IMGT/HLA数据库)。
该细胞系用作NK扩增/激活程序的辅助细胞，因为其允许选择辅助细胞和UCB(表达HLA C组2，和潜在的相关抑制性受体KIR2DL1)之间的特定HLA错配。由于一些病毒诱导的用于NK激活受体的配体的膜表达，通过EBV感染进行转化增加了其NK激活能力。
B)培养基、缓冲液和细胞因子：
1/用于淋巴细胞的分离的Ficoll和泛影葡胺钠(sodium diatrizoate)的密度梯度细胞分离培养基：Histopaque-1077，来自Sigma Aldrich，Saint Louis，MO，USA。
2/用于计数细胞和用Muse机观察其活力、用7AAD和荧光DNA探针标记细胞的试剂盒：计数和活力试剂盒，来自Millipore，Darmstadt，德国。
3/细胞培养基：RPMI 1640Glutamax，来自Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，购自France distributor Thermo Fisher Scientific。
4/在细胞培养基中的营养源：胎牛血清，来自Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，购自France distributor Thermo Fisher Scientific。
5/细胞冷冻用有机溶剂：二甲基亚砜，DMSO来自B.Braun，Melsungen，德国。
6/流式细胞仪标记用缓冲液：PBS，来自Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，购自France distributor Thermo Fisher Scientific。
7/NK扩增/激活用细胞因子：重组人rhIL-2，来自ebioscience，San Diego，CA，USA。
8/NK扩增/激活用细胞因子：重组人rh-IL15，来自Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国。
实施例2:制造过程实施例
过程细节：参见图1-1～1-3
-在第一次冷冻前通过ficoll UCB单核细胞分离处理UCB
-用手动磁性耗尽试剂盒完成CD3耗尽。
-汇集的UCB对于主要HLA I类组的基因型而言呈现相同的模式(各HLA组被NK细胞通过主要抑制性KIR识别)：被KIR3DL2识别的HLA A3/A11；被KIR3DL1识别的HLA Bw4；被KIR2DL2/3识别的HLA C组1；和被KIR2DL1识别的HLA C组2。
-用辅助细胞激活汇集的UCB，所述辅助细胞丢失被表达的汇集UCB iKIR识别的HLA中的一种。
-将NK细胞扩增20-24天。
-所用细胞因子是IL-2(100IU/ml)和IL-15(5ng/ml)。这些浓度可以修改以获得类似的结果。
-辅助细胞是具有特异性HLA基因型(一种主要HLA I类组丢失)的EBV用生化细胞系(表达病毒诱导激活配体的细胞)。
-辅助细胞可以用不同方式以不同的照射剂量照射(此处，主要使用20秒的紫外照射，但是最后一次实验还使用105Gy的γ照射，其显示更好的扩增结果)。
-经照射的辅助细胞可以与之前的冷冻保存一起使用或不经冷冻保存使用：新照射的细胞或作为经照射的冷冻保存细胞(在冷冻前立即照射)。
-对于3个最后实验，向UCB细胞添加经照射的辅助细胞，NK：辅助细胞的比例为1：4，各自3-4天(0；4；8；12；+/-15；+/-18天)。使用1：2的比例或者总细胞：辅助细胞为1：1～1：3的比例，获得一些结果(之前和其它未示出的结果)，添加频率为3天～7天。该参数可以变化，仍然获得相似的扩增/激活结果。
-在所示实验中，在所述方法的最后不进行CD56+选择，因为源自汇集的CD3-耗尽的UCB的NK细胞表示在方法的最后已经超过90％的活细胞。CD56选择步骤不是必需的，但是可能会改善NK纯度，对于药物产品而言是优选的(并且可能是完全需要的)。
所述方法的一些步骤可以改变：
-在第一冷冻之前使用符合GMP的方法对UCB进行不同处理，例如HetastarchTM或PrepaCyte CBTM装置(或其它现有的临床接受的方法)。
-即使目前的临床前和临床知识显示iKIR-HLA错配给出比iKIR-HLA匹配更好的结果，仍可能在本发明的情况下iKIR-HLA在临床结果中具有不同的影响。目前，基于文献知识的开发应该伴随着使用NK/辅助细胞错配和NK/患者相同的错配的方法。如果不必要，将来的临床前和临床数据可能改变该参数。
-NK扩增培养持续时间可以优化：14～28天。
-IL-2和IL-15浓度可以优化。
-CD3-耗尽会利用自动的临床可接受装置例如cliniMACS完成。
-CD3-耗尽也可以在红细胞消除和体积减少之后立即完成(在NK回收方面可能结果更好)。
-结果之一证明在一些未定义的情况下，CD3-耗尽对于UCB汇集的NK细胞良好的扩增/激活而言不是必需的。
-为了获得重要量的特征在于独特的药学上定义的批次的激活的由多供体获得的NK细胞，优先的是可以在所述方法的不同时刻汇集CD3-耗尽的UCB单位：扩增培养之前，在扩增培养过程中，或在扩增培养的最后。
实施例3：目标
1.第一实验
由于已知来自不同供体的T淋巴细胞会通过HLA差异识别而相互杀死，并且由于NK细胞需要激活子信号以具有细胞毒性，本发明人试图了解是否可以汇集表达相同的主要HLA组(根据抑制性KIR对其的识别)而非相同HLA等位基因的CD3-耗尽的UCB。汇集来自3个UCB的全部的单核细胞和CD3-耗尽的单核细胞以验证CD3-耗尽是否是必需的。
2.第二实验
由于发明人想要生产4类对于各主要iKIR HLA对而言呈现iKIR-HLA错配的NK细胞，发明人需要调查UCB的成功汇集是否仅归因于之前使用的第一特定HLA基因分型，或者是否能够用UCB的另一HLA基因分型重现。发明人试图了解使用另一iKIR-HLA错配的另一辅助细胞系是否会允许从表达相同HLA组的3个CD3-耗尽UCB的汇集物进行NK扩增/激活。
3.第三实验
由于要治疗约100名患者，发明人需要汇集10个UCB，发明人试图了解表达相同HLA阻的5个UCB(一半)的汇集物是否能进行相同的NK扩增/激活。
实施例4：实验进行
1.第一实验
将通过Ficoll分离获得的UCB单核细胞冷冻保存，然后解冻并使用干细胞试剂盒对一部分进行CD3-耗尽。将3个具有相同的主要HLA类1组A3/A11+、Bw4+、C1+、C2+基因型的CD3-耗尽的UCB或总UCB汇集，并与每4天添加的IL-2、IL-15和经照射的辅助细胞PLH(A3/A11+、Bw4+、C1-、C2+基因型)一起培养21-25天。
2.第二实验
将通过Ficoll分离获得的UCB单核细胞冷冻保存，然后解冻并使用干细胞试剂盒进行CD3-耗尽。将3个具有相同的主要HLA类1组A3/A11-、Bw4+、C1-、C2+基因型的CD3-耗尽的UCB汇集并，与每4天添加的IL-2、IL-15和经照射的辅助细胞HOM-2(A3/A11+、Bw4+、C1+、C2-基因型)一起培养21-25天。
3.第三实验
将通过Ficoll分离获得的UCB单核细胞冷冻保存，然后解冻并使用干细胞试剂盒进行CD3-耗尽。将5个具有相同的主要HLA类1组A3/A11-、Bw4+、C1+、C2-基因型的CD3-耗尽的UCB汇集，并与每4天添加的IL-2、IL-15和经照射的辅助细胞PLH(A3/A11+、Bw4+、C1-、C2+基因型)一起培养21天。
4.评价参数
使用MUSE Millipore系统和培养中细胞组分的流式细胞术表征将活NK细胞常规计数。
NK细胞的激活标志物的表达通过流式细胞术而常规评价(CD16用于单克隆抗体疗法的有效协同效应；CD69作为通用激活受体)。
在培养20天时，对于实验2和3评价对公知的K562靶细胞和肿瘤细胞的细胞毒性，并评价对肿瘤细胞的细胞毒性(NK:K562比例3：1，NK：纯化B淋巴细胞比例3：1，NK：AML细胞(在患者的全PBMC样品中)比例10：1，温育2h)。
实施例5：结果
1.第一实验(参见图2和3)
UCB 1:HLA A11:01/A29:02,B35:01/B44:02,C04:01/C16/01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+
UCB2:HLA A11:01/A23:01,B35:02/B49:01,C04:01/07:01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+
UCB3:HLA A2/A3,B18/B51,C5/C14>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+
在CD3-耗尽后从分离的UCB进行NK增殖显示更好的结果，因为T淋巴细胞与NK细胞就利用所用的细胞因子增殖而竞争(并且针对EBV抗原的CD8-T淋巴细胞也被辅助细胞刺激)。
来自汇集的CD3-耗尽UCB的NK与来自分离的UCB的NK类似地增殖，但是如果UCB未CD3-耗尽，则来自不同供体的T淋巴细胞相互具有细胞毒性，并且NK细胞不能增殖。
表1:
Figure BDA0001109342210000191
NK扩增因子在该实验中由于技术问题而相对低。
激活受体良好地表达，并且针对所培养的NK细胞的通用靶标K562的细胞毒性与未激活的NK细胞相比更好。
该实验显示，对于NK扩增而言具有相同的主要HLA组基因分型的汇集的UCB是可行的，但是需要预先CD3-耗尽。扩增的NK细胞被良好地激活。
2.第二实验(参见图4)
UCB1:HLA A01/02,B27:05/B40:02/C02:02/C15:02>HLA A3/A11-,Bw4+,C1-,C2+
UCB2:HLA A2/A31,B50/B51,C06:02/15:02>HLA A3/A11-,Bw4+,C1-,C2+
UCB3:HLA A23/A24,B44/B44,C4/C5>HLA A3/A11-,Bw4+,C1-,C2+
从汇集的具有该新基因型的CD3-耗尽UCB进行NK增殖与用分离的CD3-耗尽UCB进行的NK增殖相似。
表2:
Figure BDA0001109342210000201
在该实验中NK扩增因子较高(无技术问题)，但是仍然能够通过特异性针对新的辅助细胞系对程序优化而改善。
激活受体非常良好地表达。针对所培养的NK细胞的通用靶标K562的细胞毒性与未激活的NK细胞相比更好，进行2小时温育，发明人观察到针对B淋巴瘤肿瘤细胞的显著细胞毒性。
汇集具有另一主要HLA组基因型的CD3-耗尽UCB，并且扩增具有另一iKIR-HLA错配的NK细胞和另一辅助细胞系是可行的。扩增的NK细胞被良好地激活。
3.第三实验(参见图5)
UCB:HLA A3/A11-,Bw4+,C1+,C2-
表3:
Figure BDA0001109342210000202
从5个汇集的CD3-耗尽的UCB进行NK增殖是良好的。
在该实验中NK扩增因子较高。
激活受体非常良好地表达。针对所培养的NK细胞的通用靶标K562的细胞毒性与未激活的NK细胞相比更好，进行2小时温育，发明人观察到针对AML肿瘤细胞的小特异性细胞毒性(但是在20小时后发明人不能观察到细胞毒性，因为此时患者细胞由于解冻而死亡)。
汇集5个CD3-耗尽的UCB，并且用发明人的制造方法以重要的扩增因子扩增NK细胞是可行的。扩增的NK细胞被良好地激活。
4.互补结果
实验显示从不进行预先CD3–耗尽的UCB汇集的NK细胞的良好扩增(无重现性检验)：(参见图6)
3用PLH扩增的iKIR-HLA错配UCB
UCB 1:HLA A2:01/A68:01；B38:01/B57:01；C6:02/C12:03>C1+,C2+,A3/A11-,Bw4+
UCB 2:HLA A1:01/A2:01；B52:01/B57:01；C6:02/C12:02>C1+,C2+,A3/A11-,Bw4+
UCB 3:HLA A02/02；B15:09/B50:02；C06/C07>C1+,C2+,A3/A11-,Bw4-
在不进行预先CD3–耗尽的情况下NK扩增在分离的或者汇集的UCB中是相似的。
-显示9天培养后(用CD3-未耗尽的UCB)汇集的可行性的实验
1/相同的之前的实验(参见图7)
表4：
Figure BDA0001109342210000211
可以汇集9天激活的NK细胞(此处不进行预先CD3-耗尽)，保持显著但较低的NK扩增。
2/利用以PLH扩增的2个iKIR-HLA错配UCB的实验：(参见图8)
UCB 1:HLA A11:01/A29:02,B35:01/B44:02,C04:01/C16/01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+
UCB2:HLA A11:01/A23:01,B35:02/B49:01,C04:01/07:01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+
当9天扩增后NK在CD3-未耗尽的汇集UCB中不适当地扩增(增加NK％和NK激活状态，但仍然具有高度T淋巴细胞％)时，似乎克服了该问题。它们显示针对B淋巴瘤肿瘤细胞的体外相似的良好细胞毒性(过夜，比例E:T 1：1)。
3/利用以PLH扩增的2个iKIR-HLA错配UCB的实验：(参见图9)
UCB1:HLA A02:02/30:01,B42:01/B53:01,C04:01/17:01>HLA A3/A11-,Bw4+,C1-,C2+
UCB2:HLA A11:01/A23:01,B35:02/B49:01,C04:01/07:01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+
表5:
Figure BDA0001109342210000221
来自CD3-未耗尽iKIR-HLA错配的汇集的UCB的NK细胞显示较低的扩增因子，并且9天扩增后汇集这些UCB提供更好的NK扩增。它们显示针对B淋巴瘤肿瘤细胞的体外相似的良好细胞毒性(过夜，比例E:T 1：1)。
实施例6：展望
1.方法优化
优选的是，根据本发明的汇集的激活/扩增的NK细胞的制造方法适应药物管理义务，并且所述方法的每一步适于最佳品质保证。
-首先，例如，必须设定UCB单位的接受标准，如大于1.4或1.6×106总有核细胞(目前1.85×106个总有核细胞，对于我们的局部UCB库而言)，对于NK百分比而言具有潜在最小的阈值，例如7％(在UCB总有核细胞中通常观察到的3-15％NK)。
-在以上实施例中用于UCB单核细胞(UCBMC)分离的“Ficoll”法可以容易地被适应性良好的标准和用于临床应用的公知方法和药物条件代替，例如使用具有袋的密封灭菌的单应用系统，使用合适的步骤例如HES 6％和离心红细胞消除和体积减少，或Prepacyte CB分离系统。这些系统必然提高第一步中的总有核细胞回收。
-优选的是，UCBMC的CD3-耗尽可以更好地适合合规性和/或用于药物应用的GMP方法，例如利用合适的临床上可升级的材料如CliniMACSTM，和通过确定对于最佳细胞回收和最佳CD3–耗尽品质而言，首先在冷冻保存之前或之后是否需要CD3-耗尽的最佳步骤时间。
-优选的是，用于UCBMC的冰冷、冷冻保存和解冻步骤可以在制造方法的验证后使用临床应用用授权步骤改善。可以使用用于袋密封系统的合适材料，并且冷冻保存条件(培养基，细胞浓度)可以由本领域技术人员针对本发明的方法而容易地优化。在解冻后仅这些优化步骤应该必然地提高总细胞回收。同时，应该设定用于各解冻的UCBMC进一步进入根据药物指南的制造方法的接受标准。
-优选的是，HLA-基因分型和抑制性KIR表达评价方法应该经验证以选择允许针对扩增/激活步骤汇集的不同UCB单位：选择标准应该针对各个批次设定。
-优选的是，符合GMP的可升级的辅助细胞(无论它们是否会包括在本发明的方法中)，关于NK扩增：激活进行最终筛选以用于集落选择。最终的辅助细胞必须被良好地表征以用于治疗剂生产方法。该优化步骤也可以改善NK扩增/激活结果。
-优选的是，照射步骤会经优化和验证以用于具有临床适应性品质参数的最佳扩增/激活结果，并且会设定冷冻保存的经照射辅助细胞的接受标准，包括不增殖评价、细胞活力、EBV失活等等。
-会对经照射的辅助细胞提取物添加步骤进行优化以用于在包含辅助细胞的工序中使用的最终集落。
-优选的是，使用生物反应器中的动力学培养密封系统以用于具有至少5个，优选10个汇集的UCB单位的扩增/激活步骤，例如已经针对NK培养物测试的Wave systemTM(GEHealthcare)。
-优选的是，可以使用用于扩增/激活步骤的培养基，其使用无动物血清培养基，如来自Lonza的X-VIVOTM培养基、来自Cellgenix的CellGro SCGMTM，或来自nvitrogen的AIMVTM(如已经针对NK培养物进行了测试)。
-优选的是，使用利用合适的临床上可升级的材料(例如CliniMACSTM)扩增/激活的NK细胞的CD56阳性选择。
2.药物开发：最终产品表征和接受标准
优选的是，接受最终经扩增/激活产品的标准必须包括在所述工序中，包括产品鉴定步骤(遗传稳定性、嵌合性、表型)和标准效力评价步骤。
-优选的是，可以检查本发明工序前后NK细胞的遗传稳定性，观察其核型(例如通过本领域技术人员公知的G带核型分型或cytoscanHD显微阵列方法)，并且必须定义来自不同供体的最终汇集NK细胞的嵌合性(例如通过标准多重PCR STR法)。
-优选的是，为了更好地鉴定和表征最终产物和定义接受标准，评价更多NK表型标志物(NKG2D、NKG2C、CD94、NKp44、NKp30、NKp46、CD158...)的表达(例如通过流式细胞术)。
-优选的是，用针对通常使用的公知靶细胞的验证细胞毒性检验测试各产品批次。
-优选的是，在最终工序步骤期间或之后必须验证不存在污染物，例如细菌、真菌、支原体和病毒(特别是EBV)，以及不存在内毒素和制造过程中使用的细胞因子。

Claims (9)

1.一种生产扩增且激活的NK细胞群的方法，所述方法包括：
(A)通过包括步骤(a)、(b)和(c)的方法，从至少n个UCB单位或其含有NK细胞的组分生产含有NK细胞的细胞群，
(a)提供至少n个脐带血单位(UCB单位)，或其含有NK细胞的组分，n≥2，其中当汇集时所述n个UCB单位对于主要HLA I类组的基因型呈现相同模式；
(b)汇集所述至少n个UCB单位，或其含有NK细胞的组分，以生产含有NK细胞的细胞群，和
(c)使步骤(b)中获得的汇集物中含有的T细胞耗尽，或在步骤(b)汇集之前使所述n个UCB单位的每一个中含有的T细胞耗尽，
(B)在合适的培养基中扩增和激活从步骤(A)获得的细胞群中含有的所述NK细胞，以生产所述扩增且激活的NK细胞群，其中适合于扩增和激活NK细胞的所述合适的培养基包含辅助细胞；和
C)可选的是，回收所述扩增且激活的NK细胞，
其中，在步骤(a)中，所述主要HLAI类组选自由下述组成的组：被KIR3DL2识别的HLAA3/A11，被KIR3DL1识别的HLA Bw4，被KIR2DL2/3识别的HLA C组1，和被KIR2DL1识别的HLAC组2；并且
其中，在步骤(B)中，用于NK细胞扩增和激活的合适培养基中存在的辅助细胞与待扩增和激活的所述NK细胞是HLA-KIR错配的。
2.一种从n个UCB单位生产扩增且激活的NK细胞群的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供至少n个UCB单位，或其含有NK细胞的组分，n≥2，其中所述至少n个UCB单位对于主要HLA I类组的基因型呈现相同的模式；
ii)对各UCB单位进行红细胞/红血球耗尽；
iii)将在步骤i)或ii)中获得的细胞群冷冻，保存在液氮中，并在步骤iv)之前解冻；
iv)使各UCB单位中含有的T细胞耗尽；
v)汇集在之前步骤中获得的n个UCB单位细胞或其含有NK细胞的组分，以生产汇集的NK细胞群；和
vi)通过在合适的培养基中使汇集物中含有的NK细胞或其含有NK细胞的组分接触而扩增和激活在之前步骤中获得的汇集的NK细胞，从而生产汇集的扩增且激活的所述NK细胞群，其中适合于扩增和激活NK细胞的所述合适的培养基包含辅助细胞，
其中，在步骤i)中，所述主要HLA I类组选自由下述组成的组：被KIR3DL2识别的HLAA3/A11，被KIR3DL1识别的HLA Bw4，被KIR2DL2/3识别的HLAC组1，和被KIR2DL1识别的HLA C组2；并且
其中，在步骤vi)中，用于NK细胞扩增和激活的合适培养基中存在的辅助细胞与待扩增和激活的所述NK细胞是HLA-KIR错配的。
3.一种从n个UCB单位生产扩增的且激活的NK细胞群的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供至少n个UCB单位，或其含有NK细胞的组分，n≥2，其中所述至少n个UCB单位对于主要HLA I类组的基因型呈现相同的模式；
ii)对各UCB单位进行红细胞/红血球耗尽；
iii)将在步骤i)或ii)中获得的细胞群冷冻，保存在液氮中，并在步骤iv)之前解冻；
iv)汇集在之前步骤中获得的n个UCB单位细胞或其含有NK细胞的组分，以生产汇集的NK细胞群；
v)使在步骤iv)后获得的汇集的NK细胞中含有的T细胞耗尽；和
vi)通过在合适的培养基中使汇集物中含有的NK细胞或其含有NK细胞的组分接触而扩增和激活在之前步骤中获得的汇集的NK细胞，从而生产汇集的扩增且激活的所述NK细胞群，其中适合于扩增和激活NK细胞的所述合适的培养基包含辅助细胞，
其中，在步骤i)中，所述主要HLA I类组选自由下述组成的组：被KIR3DL2识别的HLAA3/A11，被KIR3DL1识别的HLA Bw4，被KIR2DL2/3识别的HLA C组1，和被KIR2DL1识别的HLAC组2；并且
其中，在步骤vi)中，用于NK细胞扩增和激活的合适培养基中存在的辅助细胞与待扩增和激活的所述NK细胞是HLA-KIR错配的。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，适合于扩增和激活NK细胞的所述合适的培养基包含至少一种合适的NK激活因子。
5.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在9～28天的总持续时间，扩增步骤后NK细胞的扩增倍数对于扩增/激活步骤而言为至少100或300。
6.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，3≤n≤50。
7.如权利要求3所述的方法，其中，在ii)中所述对各UCB单位进行红细胞/红血球耗尽通过密度梯度分离或者通过冷冻解冻步骤进行。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述密度梯度分离是
Figure FDA0003055474230000031
密度梯度分离。
9.一种用于从UCB单位生产扩增的且激活的NK细胞群的至少两种不同的汇集物的方法，其中，对于各汇集的n个UCB，由NK细胞识别的主要HLA I类组是不同的，并且来自n个UCB单位的扩增的且激活的NK细胞群的各个汇集物通过权利要求1至8中任一项所述的方法生产。
CN201580011900.9A 2014-03-07 2015-03-09 来自脐带血的汇集的nk细胞和在治疗癌和慢性感染病中的应用 Active CN106164256B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14305332 2014-03-07
EP14305332.0 2014-03-07
PCT/EP2015/054837 WO2015132415A1 (en) 2014-03-07 2015-03-09 Pooled nk cells from ombilical cord blood and their uses for the treatment of cancer and chronic infectious disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106164256A CN106164256A (zh) 2016-11-23
CN106164256B true CN106164256B (zh) 2021-08-10

Family

ID=50277168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580011900.9A Active CN106164256B (zh) 2014-03-07 2015-03-09 来自脐带血的汇集的nk细胞和在治疗癌和慢性感染病中的应用

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20170073637A1 (zh)
EP (1) EP3114215B1 (zh)
JP (2) JP6775426B2 (zh)
CN (1) CN106164256B (zh)
CA (1) CA2941519C (zh)
DK (1) DK3114215T3 (zh)
ES (1) ES2880718T3 (zh)
WO (1) WO2015132415A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017042393A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 Emercell Sas Pooled nk cells from umbilical cord blood associated with antibodies and their uses for the treatment of disease
KR20180086204A (ko) * 2015-11-05 2018-07-30 글리코스템 떼라퓨틱스 비.브이. 면역치료법에 사용하기 위한 조성물
KR20180117116A (ko) * 2016-02-05 2018-10-26 워싱턴 유니버시티 표적화된 사이토카인 전달을 위한 조성물 및 방법들
IL276365B2 (en) 2018-02-01 2023-10-01 Nkmax Co Ltd A method for the production of natural killer cells and a preparation for cancer treatment
MX2020008801A (es) * 2018-02-21 2021-01-08 Univ Texas Células presentadoras de antígeno universal y usos de las mismas.
MX2021002332A (es) 2018-08-27 2021-08-11 Affimed Gmbh Células nk crioreservadas precargadas con una construcción de anticuerpo.
WO2020152661A1 (ja) * 2019-01-21 2020-07-30 株式会社ガイアバイオメディシン Ｎｋ細胞を含む細胞集団の製造方法
JP6838750B2 (ja) * 2019-01-21 2021-03-03 株式会社ガイアバイオメディシン Ｎｋ細胞を含む細胞集団の製造方法
JP6977969B2 (ja) * 2019-03-22 2021-12-08 株式会社ガイアバイオメディシン 免疫細胞提供システム
JP2021035400A (ja) * 2020-12-07 2021-03-04 株式会社ガイアバイオメディシン Ｎｋ細胞を含む細胞集団の製造方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2703428A1 (en) * 2010-05-11 2011-11-11 Mcgill University Health Center Pooled cord blood units
CN102356154A (zh) * 2008-10-24 2012-02-15 株式会社美迪赛 从脐带血有效增殖和分化自然杀伤细胞的方法
WO2012118349A2 (ko) * 2011-03-03 2012-09-07 한국생명공학연구원 제대혈 ｃｄ14 양성 단핵세포로부터 자연살해세포 분화 및 증식 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220053695A (ko) * 2010-07-13 2022-04-29 셀룰래리티 인코포레이티드 천연 킬러 세포의 생성 방법
EP2702145A1 (en) * 2011-04-28 2014-03-05 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Methods for preparing accessory cells and uses thereof for preparing activated nk cells
JP5572863B2 (ja) * 2011-06-24 2014-08-20 国立大学法人九州大学 Ｎｋ細胞の増幅方法
JP5840876B2 (ja) * 2011-06-24 2016-01-06 テラ株式会社 Ｎｋ細胞を増幅するための組成物及び方法
AU2014215458A1 (en) * 2013-02-05 2015-08-13 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells from placenta

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102356154A (zh) * 2008-10-24 2012-02-15 株式会社美迪赛 从脐带血有效增殖和分化自然杀伤细胞的方法
CA2703428A1 (en) * 2010-05-11 2011-11-11 Mcgill University Health Center Pooled cord blood units
WO2011140654A1 (en) * 2010-05-11 2011-11-17 Mcgill University Health Center Pooled cord blood units
WO2012118349A2 (ko) * 2011-03-03 2012-09-07 한국생명공학연구원 제대혈 ｃｄ14 양성 단핵세포로부터 자연살해세포 분화 및 증식 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
High-resolution HLA matching in double-umbilical-cord-blood reduced-intensity transplantation in adults;Meghan Delaney et al.,;《TRANSFUSION》;20090531;第49卷;995-1002 *
Influence of infused cell dose and HLA match on engraftment after double-unit cord blood allografts;Sharon Avery et al.,;《BLOOD》;20110324;第117卷(第12期);3277-3285 *
Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood utilizing double-unit grafts for five teenagers with transfusion-dependent thalassemia;T-H Jaing et al.,;《Bone Marrow Transplantation》;20071231;第40卷;307-311 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020114248A (ja) 2020-07-30
JP6775426B2 (ja) 2020-10-28
WO2015132415A1 (en) 2015-09-11
EP3114215B1 (en) 2021-04-14
US20170073637A1 (en) 2017-03-16
JP2017508479A (ja) 2017-03-30
CN106164256A (zh) 2016-11-23
CA2941519A1 (en) 2015-09-11
ES2880718T3 (es) 2021-11-25
CA2941519C (en) 2022-09-06
DK3114215T3 (da) 2021-06-21
EP3114215A1 (en) 2017-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106164256B (zh) 来自脐带血的汇集的nk细胞和在治疗癌和慢性感染病中的应用
EP2725100B1 (en) Method for amplifying nk cells
US20230355676A1 (en) Highly active nk cell and use thereof
Shin et al. Ex vivo expansion of canine cytotoxic large granular lymphocytes exhibiting characteristics of natural killer cells
JP6073417B2 (ja) 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物
EP3000876A1 (en) Method for preparing nk cells
JP5989016B2 (ja) Ｎｋ細胞の増幅方法
TWI757709B (zh) 含有nk細胞之細胞集團之製造方法
CN114402065A (zh) 低密度细胞培养
Jin et al. The CD56bright CD62L+ NKG2A+ immature cell subset is dominantly expanded in human cytokine-induced memory-like NK cells
Hasmim et al. Expression of CD94 by ex vivo-differentiated NK cells correlates with the in vitro and in vivo acquisition of cytotoxic features
JP2019137696A (ja) 高活性ｎｋ細胞、およびその利用
WO2011021503A1 (ja) 一過性生着ｃｔｌを含む医薬品組成物
JP2023153286A (ja) Ｎｋ細胞を含む細胞集団の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20181122

Address after: Saint Matieu de Trevier, France

Applicant after: AI, Mel.

Applicant after: National Medical and Health Research Institute

Applicant after: CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE DE MONTPELLIER

Applicant after: Universite De Montpellier

Address before: Saint Matieu de Trevier, France

Applicant before: AI, Mel.

Applicant before: National Medical and Health Research Institute

TA01 Transfer of patent application right
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: P.Aino

Inventor after: M*Gonzales Villalba

Inventor after: Lu Chaoyang

Inventor after: J.F.Rossi

Inventor before: P.Aino

Inventor before: M*Gonzales Villalba

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant