ES2880718T3

ES2880718T3 - Células NK de sangre del cordón umbilical combinadas y sus usos para el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas crónicas

Info

Publication number: ES2880718T3
Application number: ES15709149T
Authority: ES
Inventors: Patrick Henno; Gonzalez Martin Villalba; Zhao Yang Lu; Jean-François Rossi
Original assignee: EMERCELL Sas; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM; Universite de Montpellier
Current assignee: EMERCELL Sas; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM; Universite de Montpellier
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2015-03-09
Publication date: 2021-11-25
Anticipated expiration: 2035-03-09
Also published as: CA2941519A1; CA2941519C; JP2017508479A; JP6775426B2; CN106164256B; DK3114215T3; EP3114215B1; US20170073637A1; EP3114215A1; JP2020114248A; WO2015132415A1; CN106164256A

Abstract

Un método para la producción de una población de células NK activadas expandidas, que comprende: (A) producir una población de células que contienen células NK a partir de al menos n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene dichas células NK, mediante un método que comprende las etapas de: (a) proporcionar al menos n unidades de sangre de cordón umbilical (unidades de SCU), o una fracción de las mismas que contiene dichas células, con n >= 2, y (b) combinar dichas al menos n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene dichas células, para producir la población de células (B) expandir y activar dichas células NK obtenidas de la etapa (A) en un medio adecuado para producir dicha población de células NK activadas expandidas; y (C) recuperar dichas células NK activadas expandidas, en donde dicho método comprende en la etapa (A), - una etapa (c) de empobrecimiento de las células T de dicha población de células obtenidas en (b), o - una etapa de empobrecimiento de las células T contenidas en cada una de dichas n unidades de SCU antes de la etapa (b) de combinación de dichas unidades de SCU, en donde dichas n unidades de SCU cuando se combinan presentan el mismo patrón para los genotipos de los grupos principales de HLA de clase I y en donde dicho grupo principal de HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA A3/A11 que es reconocido por KIR3DL2, HLA Bw4 que es reconocido por KIR3DL1, HLA C grupo 1 que es reconocido por KIR2DL2/3 y HLA C grupo 2 que es reconocido por KIR2DL; y en donde el medio adecuado para expandir y activar las células NK en la etapa (B) comprende células accesorias, dichas células accesorias y las células NK a expandir y activar no son compatibles para HLA-KIR.

Description

DESCRIPCIÓN

Células NK de sangre del cordón umbilical combinadas y sus usos para el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas crónicas

La invención se refiere al campo de la terapia celular, particularmente a la terapia mediada por células NK. La presente invención se refiere a un método para producir ex vivo una población de células, preferentemente células NK, a partir de al menos dos unidades de sangre de cordón umbilical (unidades de SCU), o una fracción de las mismas que contiene dichas células, mediante la combinación de al menos dos unidades de SCU de estas para producir dicha población de células. La presente invención se refiere al uso de dichas células, preferentemente células NK, obtenibles u obtenidas mediante el proceso de acuerdo con la invención, como una composición para uso terapéutico, preferentemente para el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas crónicas.

Las células asesinas naturales (NK) son un componente fundamental del sistema inmune innato. Son capaces de reconocer y destruir células tumorales, así como también células que han sido infectadas por virus o bacterias (Lanier LL, 2008; Nat Immunol 9: 495-502) La identificación y caracterización de los receptores de las células NK y sus ligandos durante las dos últimas décadas ha arrojado luz sobre los mecanismos moleculares de la activación de las células NK por las células tumorales. El hallazgo de receptores inhibidores apoyó la hipótesis del "pérdida de lo propio" propuesta por Karre, cuyo trabajo pionero demostró que las células NK mataban las células tumorales que carecían de la molécula de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los receptores inhibidores reconocen moléculas MHC de clase I, mientras que los receptores activadores reconocen una amplia variedad de ligandos (PA Mathew, J Cell Sci Ther, Volumen 3, Número 7).

Las células NK son responsables del efecto de injerto versus leucemia (GvL) con efectos mínimos de GvH (injerto versus huésped) y HvG (huésped versus injerto), lo que señala el desarrollo de inmunoterapias que involucran células NK. Los datos de varios laboratorios sugieren que la explotación de la alorreactividad de las células NK podría tener un gran beneficio independientemente de la fuente de las células NK. El trasplante no compatible desencadena una alorreactividad mediada por células NK, que se basa en la "falta de reconocimiento de lo propio". Las alorreacciones de células NK de donante versus receptor se generan entre individuos no compatibles para los grupos de alelos HLA-C, el grupo HLA-Bw4 y/o HLA-A3/11. La incompatibilidad de ligando KIR es un requisito previo para la alorreactividad de las células NK porque en 20 pares de donante-receptor que no eran compatibles para ligando KIR en la dirección injerto versus huésped, no se encontraron clones NK alorreactivos del donante.

Otro punto interesante con las células NK es que incluso si las células NK también reconocen las moléculas de identidad propia (moléculas HLA) principalmente con sus receptores inhibidores, se activan a través de un equilibrio complejo de señal de activación y señal de inhibición y necesitan la señal de activación expresada solo por células infectadas, anormales o tumorales para matar las células. Entonces, la selección del donante es más fácil porque con las células NK solas, el donante y el paciente no necesitan expresar exactamente los mismos alelos principales de HLA (coincidencia de HLA> 4/6 para el injerto de sangre total del cordón umbilical (SCU), por ejemplo). Por el contrario, las NK que expresan receptores inhibidores cuando el receptor no expresa e1HLA correspondiente (ausencia de señal inhibitoria = incompatibilidad de iKIR-HLA) conduce a una mejor destrucción del tumor sin conducir a GvHD

Incluso si las células NK tienen un potencial citotóxico natural, su actividad citotóxica puede mejorarse in vitro mediante diferentes mecanismos de activación, y la mayoría de estos mecanismos también son capaces de amplificar las células NK (con factores de amplificación variables) dando lugar a células más terapéuticas, más eficientes.

Encontrar una buena forma de amplificar/activar las células NK es importante para mejorar el potencial terapéutico de estas células (cantidad y potencia).

Los protocolos de activación in vitro incluyen el uso de citosinas y factores de crecimiento, como IL-2, IL-15, IL-18, IL-21, SCF, Flt3-L (...) con o sin células accesorias como células mononucleares de sangre periférica, células tumorales o líneas celulares (ver M. Villalba Gonzales y otros, WO2009/141729). Usando células accesorias que presentan una incompatibilidad de iKIR-HLA particular (incompatibilidad de 4 iKIR-HLA principales: HLA A3/A11; HLA Bw4; HLA CI; HLA C2 y receptores iKIR asociados).

Se ha demostrado que la sangre del cordón umbilical (SCU) es una buena fuente de células NK, con porcentajes más altos de células NK y una buena expansión/activación in vivo (ver M. Villalba Gonzales y otros, WO2012/146702).

No obstante, y a pesar de la posibilidad de amplificar y activar las células NK contenidas en una unidad de SCU con una buena tasa de amplificación, es deseable proporcionar un producto celular, particularmente un producto de células NK, para terapias clínicas, disponible, puro, con tasas de expansión y estado de activación altos y que exhibe actividad citotóxica para las células NK. Además, sería deseable que el método permita la producción de una gran cantidad de células, particularmente células NK activadas, en un mismo lote (lote de producción), que se espera que trate al menos más de 1, preferentemente 50, con mayor preferencia alrededor 100 pacientes, agentes terapéuticos que necesitan mostrar la menor variabilidad posible.

Para ello, sería deseable proporcionar un método que ofrezca la capacidad de obtener en un mismo lote de producción, una gran cantidad de poblaciones específicas de células enriquecidas, con un proceso de fabricación de células que cumpla con las buenas prácticas de fabricación (cGMP), producción y química a escala comercial, fabricación y normas de control de las agencias reguladoras.

Este es el objeto de la presente invención.

Por primera vez, y de manera sorprendente, el solicitante logró amplificar y combinar células NK de diferentes donantes.

Según una primera modalidad, la presente invención se refiere a un método para la producción de una población de células NK activadas expandidas, que comprende:

(A) producir una población de células que contienen células NK a partir de al menos n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene dichas células NK, mediante un método que comprende las etapas de:

(a) proporcionar al menos n unidades de sangre de cordón umbilical (unidades de SCU), o una fracción de las mismas que contiene dichas células, con n > 2, y

(b) combinar al menos dichas n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene dichas células, para producir la población de células

(B) expandir y activar dichas células NK obtenidas de la etapa (A) en un medio adecuado para producir dicha población de células NK activadas expandidas; y

(C) recuperar dichas células NK activadas expandidas,

en donde dicho método comprende en la etapa (A),

- una etapa (c) de empobrecimiento de las células T de dicha población de células obtenidas en (b), o - una etapa de empobrecimiento de las células T contenidas en cada una de dichas n unidades de SCU antes de la etapa (b) de combinar dichas unidades de SCU,

en donde dichas n unidades de SCU cuando se combinan presentan el mismo patrón para el genotipo de los grupos principales de HLA de clase I y en donde dicho grupo principal de HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA A3/A11 que es reconocido por KIR3DL2, HLA Bw4 que es reconocido por KIR3DL1, HLA C grupo 1 que es reconocido por KIR2DL2/3, y HLA C grupo 2 que es reconocido por KIR2DL; y

en donde el medio adecuado para expandir y activar las células NK en la etapa (B) comprende células accesorias, dichas células accesorias y las células NK a expandir y activar no son compatibles para ^hL^a-KIR.

En una modalidad preferida, en el método de la presente invención en la etapa a), 3 < n < 50.

En otra modalidad preferida, en el método de acuerdo con la presente invención, se irradian dichas células accesorias.

En otra modalidad preferida, en el método de acuerdo con la presente invención, dichas células accesorias se inmortalizan.

En otra modalidad preferida, en el método de acuerdo con la presente invención, cada una de dichas n unidades de SCU o la combinación de unidades de SCU está empobrecida en glóbulos rojos.

Finalmente, la presente invención se refiere al método de acuerdo con la presente invención en donde las unidades de SCU usadas en la etapa (A) son unidades de SCU descongeladas a partir de unidades de SCU congeladas almacenadas.

En la presente solicitud, también se describe un método para producir una población de células, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar al menos n unidades de sangre de cordón umbilical (unidades de SCU), o una fracción de las mismas que contiene dichas células, con n > 2, preferentemente 2 <n < 100; y

(b) combinar al menos n de dichas unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene dichas células, para producir la población de células.

En una modalidad, se describe que 3 < n < 50, siendo 3 < n < 25 el d mayor preferencia.

En el contexto de la presente invención, por "fracción de unidad de SCU que contiene dichas células", se pretende designar una fracción de la unidad de SCU que contiene al menos la población de células o parte de dicha población que se desea producir.

En la presente solicitud, también se describe un método, en donde dicho método comprende además la etapa de: (c) empobrecer las células T contenidas en la combinación obtenida en la etapa (b), o

una etapa de empobrecimiento de las células T contenidas en cada una de las n unidades de SCU antes de la etapa (b) de combinación.

La solicitud describe además el método para la producción de una población de células NK activadas expandidas, en donde las n unidades de SCU que se combinan en la etapa b) presentan el mismo patrón para el genotipo de los grupos principales de HLA de clase I.

En la presente descripción, por "presentar el mismo patrón para el genotipo de los principales grupos HLA de clase I", se pretende designar unidades de SCU cuyo grupo de moléculas HLA es reconocido por el mismo KIR inhibidor o preferentemente en donde cada grupo HLA presente en las n SCU combinadas es reconocido por el mismo KIR inhibidor principal por las células NK.

La solicitud describe además el método, en donde cada SCU presente en las n SCU combinadas pertenece a un grupo HLA que es reconocido por el mismo KIR inhibidor.

Como se usa en la presente descripción, el término "KIR" o "KIR inhibidor" tiene su significado general en la técnica e incluye, pero no se limita a, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1 y KIR3DL2.

Los KIR inhibidores principales/importantes son KIR2DL 1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL 1 y KIR3DL2.

KIR2DL1 reconoce HLA-C w4 y alelos relacionados del 'grupo2'. KIR2DL2 y KIR2DL3 reconocen HLA-Cw3 y alelos relacionados del 'grupo 1'. KIR3DL1 es el receptor de los alotipos HLA-B con motivos Bw4. Finalmente, KIR3DL2 es el receptor de HLA-A3/11.

La solicitud describe además un método para la producción de una población de células NK activadas expandidas, en donde dicho grupo principal de HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA A3/ A11 que es reconocido por KIR3DL2, HLA Bw4, que es reconocido por KIR3DL1, HLA C grupo 1 que es reconocido por KIR2DL2/3 y HLA C grupo 2 que es reconocido por KIR2DL 1.

La fuente de las unidades de SCU son las unidades de SCU humanas, particularmente las SCU humanas congeladas.

Se describe además un método para producir una población expandida de células a partir de células contenidas en n unidades de SCU, que comprende la etapa de:

(A) producir una población de células a partir de al menos n unidades de SCU, o fracción de las mismas que contiene dichas células, mediante el método para producir una población de células de acuerdo con la presente invención, opcionalmente cada unidad de SCU se ha expandido preliminarmente y por separado para dichas células antes de la etapa A); y

(B) expandir las células deseadas obtenidas de la población de células obtenida en la etapa (A) en un medio adecuado para producir dicha población expandida de células deseadas.

En el método para producir una población expandida de células a partir de células contenidas en n unidades de SCU de la presente invención, la etapa (B) puede ser una etapa opcional en caso de que cada unidad de SCU haya sido expandida de forma preliminar por separado para dichas células antes de la etapa b) de combinación en la etapa A). Se describe además un método para producir una población de células diferenciadas a partir de células deseadas contenidas en n unidades de SCU, que comprende la etapa de:

(A) producir una población de células a partir de dichas n unidades de SCU, o fracción de las mismas que contiene dichas células deseadas, mediante el método para producir una población de células de acuerdo con la presente invención, opcionalmente cada unidad de SCU se ha diferenciado preliminarmente y por separado para dichas células antes de la etapa A); y

(B) diferenciar las células deseadas obtenidas de la etapa anterior en un medio adecuado para producir dicha población de células diferenciadas.

Se describe además un método para producir una población de células diferenciadas a partir de células contenidas en n unidades de SCU, la etapa (B) de diferenciación puede ser una etapa opcional en caso de que cada unidad de SCU haya sido diferenciada por separado de manera preliminar para dichas células antes de la etapa b) de combinación en la etapa A).

Se describe además un método para producir una población de células que contienen células asesinas naturales (NK) activadas, que comprende:

(A) producir una población de células que contienen células NK activadas a partir de al menos n unidades de SCU, o fracción de las mismas que contiene dichas células NK, mediante el método para producir una población de células de acuerdo con la presente invención, opcionalmente cada unidad de SCU se ha expandido preliminarmente y por separado para dichas células n K antes de la etapa A);

(B) activar dichas células NK obtenidas de la etapa (A) en un medio adecuado para producir dicha población de células que contienen células NK activadas;

(C) opcionalmente, recuperar dichas células NK activadas de dicha población.

Se describe además un método para producir una población de células NK activadas expandidas, que comprende:

(A) producir una población de células que contienen células NK a partir de al menos n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene dichas células NK, mediante el método para producir una población de células de acuerdo con la presente invención, opcionalmente cada unidad de SCU se ha expandido y activado de forma preliminar y por separado para dichas células NK antes de la etapa A);

(C) opcionalmente, recuperar dichas células NK activadas expandidas.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas, opcionalmente activadas a partir de n unidades de SCU, comprendiendo dicho método la etapa de:

i) proporcionar al menos n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene células NK, con n> 2, preferentemente 2 <n <100 o 3 <n <50, con mayor preferencia 3 <n <25, y en donde dichas al menos n unidades de SCU presentan el mismo patrón para el genotipo de los grupos principales HLA de clase I, preferentemente en donde cada grupo HLA presente en las n SCU combinadas es reconocido por el mismo KIR inhibidor principal de las células NK;

ii) opcionalmente, empobrecer cada unidad de SCU en glóbulos rojos/eritrocitos, preferentemente por separación en gradiente de densidad, con mayor preferencia por separación en gradiente de densidad Ficoll-Paque®, por el método Hetastarch (hidroxietil almidón; HES), mediante el uso del dispositivo PrepaCyte® CB o por una etapa de congelación y descongelación;

iii) opcionalmente, la población de células obtenida en la etapa i) o ii) se congela, se mantiene en nitrógeno líquido y se descongela antes de la etapa iv);

iv) empobrecer las células T contenidas en cada unidad de SCU;

v) para cada una de las unidades de SCU obtenidas en la etapa anterior, expandida por separado y, opcionalmente, activar las células NK contenidas en una unidad de SCU contactando las células NK contenidas en la unidad de SCU, o fracción de las mismas que contiene células NK, en un medio adecuado para producir dicha población expandida y, opcionalmente, células NK activadas para cada unidad de SCU, preferentemente durante 3 a 28 días;

vi) combinar las células n unidades de SCU obtenidas en la etapa anterior de unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene células NK, para producir una población combinada de células NK expandidas y, opcionalmente, activadas.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y, opcionalmente, activadas a partir de n unidades de SCU, que comprende dicho método la etapa de:

i) proporcionar al menos n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene células NK, con n > 2, preferentemente 2 <n < 100 o 3 < n < 50, con mayor preferencia 3 < n < 25, y en donde dichas al menos n unidades de SCU presentan el mismo patrón para el genotipo de los grupos principales HLA de clase I, preferentemente en donde cada grupo HLA presente en las n SCU combinadas es reconocido por el mismo KIR inhibidor principal de las células NK;

ii) opcionalmente, empobrecimiento de cada unidad de SCU en glóbulos rojos/eritrocitos, preferentemente por separación en gradiente de densidad, con mayor preferencia por separación en gradiente de densidad Ficoll-Paque® (tipo Ficoll-Paque PREMIUM®), por el método Hetastarch (hidroxietil almidón; HES), mediante el uso del dispositivo PrepaCyte® CB o mediante una etapa de congelación y descongelación;

ii) opcionalmente, la población de células obtenida en la etapa i) o ii) se congela, se mantiene en nitrógeno líquido y se descongela antes de la etapa iv);

iv) para cada una de las unidades de SCU obtenidas en la etapa anterior, expandir por separado y, opcionalmente, activar las células NK contenidas en una unidad de SCU contactando las células NK contenidas en la unidad de SCU, o fracción de las mismas que contiene células NK, en un medio adecuado para producir dicha población expandida y, opcionalmente, células NK activadas para cada unidad de SCU, preferentemente durante 3 a 28 días;

v) combinar las células de n unidades de SCU obtenidas en la etapa anterior, o una fracción de las mismas que contiene células NK, para producir una población de células NK combinadas expandidas y, opcionalmente, activadas; y

vi) opcionalmente, empobrecer las células T contenidas en las células NK combinadas obtenidas después de la etapa v).

Se describe que el empobrecimiento de las células T contenidas en las células NK combinadas obtenidas después de la etapa v) no es una etapa opcional y es parte del método.

Se describe que en la etapa vi) de empobrecimiento de las células T contenidas en las células NK combinadas obtenidas después de la etapa v) le sigue una etapa de selección de las células NK que exhiben el biomarcador CD56 , si aún es deseable eliminar el resto que no son células NK activadas en este final del proceso.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y, opcionalmente, activadas a partir de n unidades de SCU, comprendiendo dicho método la etapa de:

ii) opcionalmente, empobrecimiento de cada unidad SCU en glóbulos rojos/eritrocitos, preferiblemente por separación en gradiente de densidad, más preferiblemente por separación en gradiente de densidad Ficoll-Paque®, por el método Hetastarch (hidroxietil almidón; HES), usando el dispositivo PrepaCyte® CB o por una etapa de congelación y descongelación;

iv) opcionalmente, o preferentemente empobrecer las células T contenidas en cada unidad de SCU;

v) combinar las células de n unidades de SCU obtenidas en la etapa anterior, o una fracción de las mismas que contiene células NK, para producir una población de células NK combinadas; y

vi) expandir y, opcionalmente, activar las células NK combinadas obtenidas en la etapa anterior al poner en contacto las células NK contenidas en la combinación, o una fracción de las mismas que contiene células NK, en un medio adecuado para producir dicha población de células NK combinadas expandidas y, opcionalmente, activadas, preferentemente durante 1 a 5 semanas, preferentemente el factor de amplificación para las células NK después de la (s) etapa (s) de expansión es al menos 100, preferentemente, 200, 300 o 500 para una duración total de la (s) etapa (s) de expansión/activación comprendida entre 9 y 28 días.

i) proporcionar al menos n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene células NK, con n > 2, preferentemente 2 <n < 100 o 3 < n < 50, con mayor preferencia 3 < n < 25, y en donde dichas al menos n unidades de SCU presentan el mismo patrón para el genotipo de los grupos principales HLA de clase I, preferentemente en donde cada grupo HLA presente en las n UCB combinadas es reconocido por el mismo KIR inhibidor principal de las células NK;

ii) opcionalmente, empobrecimiento de cada unidad de SCU en glóbulos rojos/eritrocitos, preferentemente por separación en gradiente de densidad, con mayor preferencia por separación en gradiente de densidad Ficoll-Paque®, por el método Hetastarch (hidroxietil almidón; HES), mediante el uso del dispositivo PrepaCyte® CB o por una etapa de congelación y descongelación;

iv) combinar las células de n unidades de SCU obtenidas en la etapa anterior, o una fracción de las mismas que contiene células NK, para producir una población de células NK combinadas;

v) opcionalmente, o preferentemente, empobrecer las células T contenidas en las células NK combinadas obtenidas después de la etapa iv; y

vi) expandir y, opcionalmente, activar las células NK combinadas obtenidas en la etapa anterior al poner en contacto las células NK contenidas en la combinación, o una fracción de las mismas que contiene células NK, en un medio adecuado para producir dicha población de células NK expandidas y, opcionalmente, activadas combinadas, preferentemente durante 1 a 5 semanas, preferentemente el factor de amplificación para las células NK después de la (s) etapa (s) de expansión es al menos 100, preferentemente, 200, 300 o 500 para una duración total de la (s) etapa (s) de expansión/activación comprendida entre 9 y 28 días

Todos los métodos de acuerdo con la presente invención y relacionados con la producción de células NK activadas/expandidas son particularmente adecuados para preparar células NK activadas, a partir de unidades de SCU combinadas, con expresión incorrecta de uno de los siguientes KIR: KIR2DL2 y KIR2DL3, KIR2DL1, KIR3DL1 y KIR3DL2. En consecuencia, en este caso, las células NK combinadas activadas/expandidas preparadas anteriormente de acuerdo con la presente invención serán alorreactivas contra células que carecen del ligando KIR correspondiente y, a la inversa, serán tolerantes a células de otro individuo que tenga los mismos ligandos de KIR. Por lo tanto, mediante el método de la presente invención, se puede producir una colección, o un banco de células terapéuticas, de al menos 2 lotes de producción diferentes, preferentemente 3, con mayor preferencia 4, de células NK activadas/expandidas combinadas que se pueden obtener mediante un método para producir células NK de la invención, o una colección de al menos 2, 3 o 4 fracciones de dichos lotes de producción, y en donde cada lote de producción exhibe una expresión errónea diferente de uno de los principales KIR inhibidores, preferentemente seleccionado del grupo de KIR2DL2 y KIR inhibidores KIR2DL3, KIR2DL1, KIR3DL1 y KIR3DL2.

Se describe además una colección de este tipo de al menos 2 lotes de producción diferentes, preferentemente 3, con mayor preferencia 4, de células NK activadas/expandidas combinadas que se pueden obtener mediante un método para producir células NK activadas/expandidas combinadas. Las células NK de la invención están comprendidas en la presente invención.

Se describe además una colección de contenedores de almacenamiento que comprende al menos 2, 3 o 4 contenedores que cada uno contiene células NK activadas/expandidas combinadas, o una fracción de las mismas, obtenible mediante un método para producir células NK de la invención y exhibiendo una falta de expresión particular de uno de los principales KIR inhibidores.

Se describe además que un lote de producción, o una fracción del mismo que se necesita en cantidad para tratar a un paciente, de la colección reivindicada se puede usar para trasplante en un paciente que lo necesite, preferentemente un paciente que exhibe células diana que no expresan el principal ligando KIR que es reconocido por el lote de producción de células NK activadas/amplificadas combinadas que se trasplantará.

La genotipificación/fenotipificación de HLA/KIR de células SCU/ NK o células diana del paciente se puede realizar mediante cualquier método estándar bien conocido.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde dicho medio adecuado para expandir y activar las células NK comprende células accesorias y/o al menos un factor activador de NK adecuado.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde dichas células accesorias se seleccionan del grupo de:

- células de mamíferos, preferentemente células humanas, con mayor preferencia de una colección de células del tipo HLA y, opcionalmente, células irradiadas, particularmente células irradiadas con rayos gamma, X o UV, prefiriéndose las células irradiadas con rayos gamma;

- células de mamíferos transformadas, preferentemente células humanas, en donde en dicha célula, se ha inhibido la expresión de un gen que codifica un ligando de receptor (es) de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR).

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde dichas células de la colección de células tipo HLA son de la línea celular PLH, preferentemente seleccionadas del grupo de ECACC N°. 88052047, IHW número 9047 y HOM-2, ID n° HC107505, IHW número 9005.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde dicha célula accesoria es una célula de mamífero transformada en donde se ha inhibido la expresión de un gen que codifica un ligando KIR y que además comprende la inhibición o la reducción de la expresión de MHC-I y/o la inhibición de la expresión del gen ERK5. El método para preparar tales células accesorias es bien conocido por el experto en la técnica (ver WO 2012/146702 publicado el 1 de noviembre de 2012.

La inhibición o reducción de la expresión de MHC-I en dicha célula accesoria se puede realizar mediante cualquier método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, dichos métodos se ejemplifican en la publicación de la solicitud de patente internacional WO2009141729A2. Típicamente, dicha inhibición o reducción de la expresión de MHC-I se realiza mediante el uso de un inhibidor de la expresión del gen de beta-2-microglobulina.

Como se indicó anteriormente, dicha célula accesoria presentará un fenotipo ERK5 negativo. El término "célula que presenta un fenotipo ERK5 negativo" significa una célula que tiene una reducción de al menos el 10 %, preferentemente del 25 % al 90 %, por ejemplo del 25 % al 50 % o del 50 % al 75 % en el nivel de expresión o la cantidad de la proteína ER 5 presente en la célula, en particular en la fracción mitocondrial, en comparación con su nivel de expresión basal.

La inhibición o reducción de la expresión del gen ER 5 en dicha célula se puede realizar mediante cualquier método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, dichos métodos se ejemplifican en la publicación de la solicitud de patente internacional WO2009141729A2. Típicamente, dicha inhibición o reducción de la expresión del gen ER 5 se realiza mediante el uso de un inhibidor de la expresión del gen ER 5.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde dichas células accesorias se han inmortalizado, preferentemente mediante transformación con el virus de Epstein Barr (EBV).

Como resultado, dicha célula accesoria constituirá una línea celular que proliferará indefinidamente en cultivo. Los métodos para inmortalizar células son bien conocidos en la técnica, particularmente mediante el uso del proceso del "virus de Epstein Barr" ("EBV") para inmortalizar linfocitos humanos.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde dicho medio adecuado comprendía interleucina-2 (IL-2), IL-7 y/o IL-12 como factor activador de NK adecuado y/o IL-15, o con interferón alfa o beta, preferentemente un factor activador recombinante humano.

Cuando no se usan células accesorias para activar las células NK, la activación se puede llevar a cabo mediante el uso del siguiente medio posible que contenga el factor de activación de las células NK:

1 /IL-25 ng/ml /- anti-CD350 ng/ml IL-710 ng/ml IL-1210 ng/ml, preferentemente después de 7 días; 21 hIL-1530 ng/ml hIL-21 30 ng/ml (PeproTech) hidrocortisona 10<"6> M > CD34 21 días de cultivo por lo tanto 21 días de cultivo para la maduración/activación de las células NK;

3/ IL-2500 U/ml perlas CD335 (NKp46) y CD2;

4 / Mezcla de citosinas IL-7, SCF, IL-2, IL-15 (concentración alta) y GM-CSF, G-CSF, IL-6 (concentración baja) para la expansión de células NK de D14 a D42, en biorreactor, de amplificación de CD34 ; DO-9 = heparina de bajo peso molecular mezcla de citosinas (concentración alta) SCF, Flt3L, TPO, IL-7 y (concentración baja) GM-CSF, G-CSF, IL-6 (amplificación de CD34 ); J9-14 = heparina de bajo peso molecular mezcla de citosinas (concentración alta) SCF, Flt3L, IL-15, IL-7 y g M-CSF, G-c Sf , IL-6 (concentración baja, diferenciación de NK). (También se pueden usar IL-18 e IFN alfa).

- Activación y expansión en presencia de células accesorias:

1 / IL-2 500U/ml PBMC de alimentación irradiada autólogo/alogénico (25 Gy) o EBV-LCL (1OOGy), proporción de células alimentadoras: NK 20: 1 (o 10: l para la ampliación de la unidad de SCU) en DO 21 IL-2200U/ml alimentador tratado con mitomicina (proporciones PBMC K5621:1) proporción de células alimentadoras: NK 8:1

3 /IL-2 500U/ml PBMC alogénico de alimentación irradiado (5000 rad) en proporción DO abd D7 células alimentadoras: total 10:1 OKT3 (anti-CD3) 30ng/ml en el medio de cultivo o preincubado con células alimentadoras

4/ IL-2500U/ml alimentador irradiado Jurkat-KLl (300Gy) en DO

5 / IL-2 500U/ml PBMC alimentador irradiado autólogo (2000 rad, OKT3 lO ng/ml al principio para estimular los linfocitos T de las células alimentadoras (empobrecidas en la fracción no irradiada) proporción de células alimentadoras: NK 5:110

6 / IL-2 IL-15 alimentador irradiado K562-mbl5-41BBL (1OOGy)

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde la etapa de empobrecimiento de las células T se lleva a cabo mediante un método que comprende la etapa de:

- poner en contacto las células con un anticuerpo de empobrecimiento; y

- eliminar las células detectadas por dicho anticuerpo de empobrecimiento.

El anticuerpo de empobrecimiento puede ser al menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD3, un anti-CD 14 y un anticuerpo anti-CD 20, preferentemente un anticuerpo anti-CD3.

En la población de células empobrecidas obtenida, menos del 0,5 % o incluso menos del 0,1 % o incluso menos del 0,001 % son células CD3 positivas.

También se describe un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde cada unidad de SCU o las n unidades de SCU combinadas se empobrece en glóbulos rojos/eritrocitos, preferentemente por separación en gradiente de densidad, con mayor preferencia por separación por gradiente de densidad Ficoll-Paque®, por el método Hetastarch (hidroxietil almidón; HES), mediante el uso del dispositivo PrepaCyte® CB o por una etapa de congelación y descongelación.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde cada unidad de SCU o las n unidades de SCU combinadas se empobrecen en glóbulos rojos mediante un método que comprende la lisis de los glóbulos rojos, particularmente por un método que incluye una etapa de congelación y descongelación de las células contenidas en cada una de las unidades de SCU o en las n unidades de SCU combinadas.

También se describe un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde las unidades de SCU usadas en la etapa b) o en la etapa i) son unidades de SCU descongeladas a partir de unidades de SCU almacenadas congeladas.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde las unidades de SCU usadas en la etapa b) o en la etapa i) son unidades de SCU descongeladas a partir de unidades de SCU almacenadas congeladas.

Dichas unidades de SCU combinadas, o fracción de las mismas que contienen células, obtenidas al final del método, se almacenan preferentemente a una temperatura por debajo de -70 °C, preferentemente por debajo de -80 °C, con mayor preferencia en nitrógeno líquido.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde:

- cada unidad de SCU se diluye preliminarmente en un medio de cultivo adecuado, preferentemente en un medio RPMI antes de su uso; y/o

- después del empobrecimiento de glóbulos rojos/eritrocitos de cada unidad de SCU o de las n unidades de SCU combinadas, las células recolectadas se resuspenden en un medio de cultivo adecuado, preferentemente en un medio RMPI, o en un medio tipo X-VIVO ™ (Lonza), AIM -Medio V ™ (Invitrogen) o CellGro ™ (CellGenix), este medio contiene opcionalmente suero bovino fetal AB negativo (FBS); y/o

- si las células recolectadas de cada unidad de SCU empobrecida en glóbulos rojos o de las unidades de SCU empobrecidas en glóbulos rojos combinadas se almacenan congeladas, las células recolectadas se resuspenden en un cultivo adecuado que comprende un crioprotector de glóbulos blancos.

También se describe un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCUB, en donde la relación entre las células NK y las células accesorias presentes en el medio adecuado para la expansión/activación de las células NK está comprendida entre 0,01 y 2, preferentemente entre 0,05 y 1,0, con mayor preferencia entre 0,1 y 0,5.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde las células accesorias presentes en el medio adecuado para la expansión/activación de las células NK y las células NK que se van a expandir/activar no son compatibles para HLA-KIR.

Se describe además un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, comprendiendo dicho método además una etapa de enriquecimiento de células NK CD56+.

Se describe además un método para la producción de al menos dos combinaciones distintas de una población de células NK expandidas, opcionalmente activadas a partir de unidades de SCU, en donde el grupo principal de HLA clase I reconocido por las células NK para cada n unidad de SCU combinada es diferente, y en donde cada combinación de una población de células NK expandidas, opcionalmente, activadas a partir de n unidades de SCU se produce mediante un método para producir células NK activadas y/o expandidas combinadas de acuerdo con la presente invención.

También se describe un método para la producción de al menos 2, 3, preferentemente 4 combinaciones distintas de una población de células NK expandidas, opcionalmente, activadas a partir de unidades de SCU de acuerdo con la presente invención, en donde el grupo principal HLA de clase I reconocido por las células NK para cada n SCU combinadas es diferente y se selecciona del grupo que consiste en HLA A3/A11 que es reconocido por KIR3DL2, HLA Bw4, que es reconocido por KIR3DL1, HLA C grupo 1 que es reconocido por KIR2DL2/3 y HLA C grupo 2 que es reconocido por KIR2DL2.

Se describe además una población de células:

- obtenidas por el método descrito anteriormente, u

- obtenible mediante el método descrito anteriormente y en donde dicha población de células "obtenibles" contiene células, preferentemente células NK originadas a partir de al menos n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene células NK, con n > 2, preferentemente 2 <n < 100 o 3 < n < 50, con mayor preferencia 3 < n < 25, y, preferentemente, en donde dichas n unidades de SCU presentan además el mismo patrón para el genotipo de los grupos principales HLA clase I, preferentemente en donde el grupo principal HLA clase I reconocido por las células NK para cada n SCU combinadas es diferente y se selecciona del grupo que consiste en HLA A3/A11 que es reconocido por KIR3DL2, HLA Bw4, que es reconocido por KlR3DLl, HLA C grupo 1 que es reconocido por KIR2DL2/3 y HLA C grupo 2 que es reconocido por KIR2DL2.

También se describe un método para producir una población de células NK expandidas y activadas a partir de n unidades de SCU, en donde dicha población de células obtenible mediante el método anterior presenta además para cada n SCU combinadas una expresión errónea de uno de los KIR seleccionados del grupo de KIR2DL2 y KIR2DL3, KIR2DL1, KIR3DL1 y KIR3DL2.

Se describe además una composición farmacéutica que comprende una población de células combinadas y activadas y/o expandidas, particularmente células NK, obtenidas u obtenibles mediante el método de acuerdo con la presente invención.

También se describe una composición farmacéutica que comprende una población de células combinadas y activadas y/o expandidas, particularmente células NK, obtenidas u obtenibles mediante el método según la presente invención para su uso como fármaco.

Se describe además una composición farmacéutica según la presente invención que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En la presente descripción, "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un compuesto o una combinación de compuestos que forman parte de una composición farmacéutica que no provocan reacciones secundarias y que, por ejemplo, facilitan la administración de los compuestos activos, aumentan su vida útil y/o efectividad en el organismo, aumentan su solubilidad en solución o mejoran su conservación. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por los expertos en la técnica de acuerdo con la naturaleza y el modo de administración de los compuestos activos seleccionados.

También se describe un método para una colección de contenedores de almacenamiento para células de mamíferos, preferentemente para células humanas, en donde cada uno de dichos contenedores de almacenamiento contiene una fracción de un lote de producción de una población de células obtenible u obtenida por el método de acuerdo con la presente invención.

Se describe además que dicha colección de contenedores de almacenamiento para células de mamífero contiene células NK expandidas y/o activadas.

También se describe que dicha colección de contenedores de almacenamiento para células de mamífero o dicha composición, contiene al menos 107, preferentemente 2 a 10. 107 o 10 a 100. 10 7 células NK activadas y/o expandidas, dependiendo del peso del paciente a tratar.

Se describe además un método para que dicha colección de contenedores de almacenamiento o dicha composición contenga células NK y esté esencialmente libre de células T CD3 , preferentemente menos del 0,1 % o menos del 0,01 %.

También se describe que dicha colección de contenedores de almacenamiento para células de mamífero de acuerdo con la presente invención o dicha composición de acuerdo con la presente invención, contiene:

- al menos el 75 %, preferentemente más del 85 o el 90 % de las células NK que exhiben el marcador CD56 ;

y / o

- al menos el 75 %, preferentemente más del 80 % de las células NK que exhiben CD45RAdim.

Se describe además un contenedor de almacenamiento de una colección de contenedores de almacenamiento, o dicha composición, para su uso para suprimir la proliferación de células tumorales, preferentemente para la prevención y/o el tratamiento del cáncer o para el tratamiento de la infección.

También se describe que dichas células tumorales o cáncer a tratar se seleccionan del grupo de células tumorales malignas hematológicas, células tumorales sólidas o células de carcinoma, preferentemente células de leucemia, células de leucemia de células T aguda, células de linfoma mieloide crónico (LMC), células de células de leucemia mielógena, células de leucemia mielógena crónica (LMC), células de mieloma múltiple o cáncer de pulmón, colon, próstata o glioblastoma.

Se describe además que las células NK activadas y/o expandidas combinadas preparadas de acuerdo con la invención o dicha composición también pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades disinmunitarias/autoinmunitarias.

Finalmente, también se describe que las células contenidas en el contenedor de almacenamiento o la composición de acuerdo con la presente invención, se administran al sujeto por vía sistémica o local, dependiendo de la enfermedad/patología a tratar. Preferentemente, dichos compuestos pueden administrarse sistémicamente por vía intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por vía oral. La composición que comprende los anticuerpos de acuerdo con la invención puede administrarse en varias dosis, repartidas en el tiempo.

Sus modos óptimos de administración, esquemas de dosificación y formas galénicas pueden determinarse según criterios generalmente considerados en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente como, por ejemplo, la edad o el peso del paciente, la gravedad de la situación general de salud del paciente, tolerancia al tratamiento y efectos secundarios observados.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención.

Descripción de figuras:

Las Figuras 1-1 a 1-3 (subfiguras 1, 2 y 3 de la figura 1) es un esquema que ilustra un ejemplo de un proceso de fabricación de la presente invención

Las Figuras 2 y 3 ilustran la proliferación de NK obtenidas después o sin empobrecimiento en CD3

La Figura 4 ilustra la proliferación de NK obtenida a partir de unidades de SCU combinadas empobrecidas en CD3.

La Figura 5 ilustra la proliferación de NK obtenida de 5 unidades de SCU combinadas empobrecidas en CD3. La Figura 6 ilustra la proliferación de NK obtenida a partir de unidades de SCU combinadas sin empobrecimiento previo de CD3

La Figura 7 ilustra la proliferación de NK a partir de unidades UCB combinadas después de 9 días de cultivo con UCB no empobrecidas en CD3

La Figura 8 ilustra el factor de amplificación de proliferación de NK obtenido con 2 UCB emparejados con KIR-HLA y amplificado con células accesorias PLH

La Figura 9 ilustra el factor de amplificación de la proliferación de NK obtenido con 2 KIR-HLA SCU emparejados y discordantes amplificados con células accesorias PLH.

Ejemplo 1: Materiales y métodos

A) Células:

PLH (Ejemplo 4): sin HLA-C1, banco ECACC n°88052047, número IHW 9047

Esta línea celular se obtuvo por inmortalización con EBV de linfocitos B procedentes de una mujer escandinava. Esta célula tiene un HLA completamente genotipado y tiene la particularidad de expresar alelos ^hL^aClase I de los tipos C grupo 2, A3/A11 y Bw4 pero no del C grupo 1 (información completa en la base de datos IMGT/HLA).

Esta línea celular se usa como célula accesoria para el protocolo de activación/amplificación de NK porque permite elegir una incompatibilidad de HLA específica entre la célula accesoria y las SCU (que expresan el grupo 1 de HLA C y potencialmente el receptor inhibidor asociado KIR2DL2/3). Al ser transformado por la infección por EBV aumenta su capacidad de activación de NK debido a la expresión en membrana de algunos ligandos inducidos por virus para los receptores activadores de NK.

HOM-2 (Ejemplo 4): sin HLA-C2, ID n°HC107505, IHW número 9005

Esta línea celular se obtuvo por inmortalización con EBV de linfocitos B procedentes de una mujer canadiense/norteamericana. Esta célula tiene el HLA completamente genotipado y tiene la particularidad de expresar alelos HLA Clase I de los tipos C grupo 1, A3/A11 y Bw4 pero no del C grupo 2 (información completa en la base de datos IMGT/HLA).

Esta línea celular se usa como célula accesoria para el protocolo de activación/amplificación de NK porque permite elegir una incompatibilidad de HLA específica entre la célula accesoria y las SCU (que expresan el grupo 2 de HLA C y potencialmente el receptor inhibidor asociado KIR2DL1). Al ser transformado por la infección por EBV aumenta su capacidad de activación de NK debido a la expresión en la membrana de algunos ligandos inducidos por virus para los receptores activadores de NK.

B) Medios, tampones y citosinas:

1/Medio de separación celular en gradiente de densidad de Ficoll y diatrizoato de sodio usado para la separación de linfocitos: Histopaque-1077 de Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU.

2/Kit para contar células y ver su viabilidad con la máquina Muse, marcando las células con 7AAD y una sonda de ADN fluorescente: kit de recuento y viabilidad de Millipore, Darmstadt, Alemania

3/Medio de cultivo celular: RPMI 1640 Glutamax de Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU., Comprado al distribuidor de Francia Thermo Fisher Scientific

4/Fuente de nutrientes en medio de cultivo celular: Suero fetal bovino de Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU., Comprado al distribuidor francés Thermo Fisher Scientific

5/Disolvente orgánico para la congelación de células: dimetilsulfóxido, DMSO de B. Braun, Melsungen, Alemania

6/Tampón para el marcaje de citometría de flujo: PBS de Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU., Comprado al distribuidor de Francia Thermo Fisher Scientific

7/Citosina para la amplificación/activación de NK: rhIL-2 humana recombinante de ebioscience, San Diego, CA, EE. UU.

8/Citosina para la amplificación/activación de NK: rh-IL15 humana recombinante de Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania

Ejemplo 2: Ejemplo de proceso de fabricación

Detalles del proceso: consulte las Figuras 1-1 a 1-3

- Las SCU se procesaron mediante aislamiento de células mononucleares SCU de Ficoll antes de la primera congelación.

- Los empobrecimientos en CD3 se realizaron con un kit de empobrecimiento magnético manual.

- Los SCU combinados presentan el mismo patrón para el genotipo de los principales grupos HLA de clase I (cada grupo HLA es reconocido por un KIR inhibidor principal de las células NK): HLA A3/A11, reconocido por KIR3DL2; HLA Bw4, reconocido por KIR3DL1; HLA C grupo 1, reconocido por KIR2DL2/3; HLA C grupo 2 reconocido por KIR2DL1.

- Los SCU combinados se activan con una celda accesoria a la que le falta uno de los HLA reconocidos por los iKIR expresados por las SCU combinadas.

- Las células NK se amplificaron durante 20-24 días.

- Las citosinas usadas son IL-2 (100 UI/ml) e IL-15 (5 ng/ml). Estas concentraciones se pueden modificar para obtener resultados similares.

- Las células accesorias son líneas celulares inmortalizadas con EBV (células que expresan ligandos activadores inducidos por virus) con genotipos de HLA específicos (falta un grupo principal de HLA de clase I).

- Las células accesorias se pueden irradiar de diferentes maneras con diferentes dosis de irradiación (aquí usamos principalmente 20 segundos de irradiación UV, pero también irradiación gamma 105Gy para el último experimento, que mostró mejores resultados de amplificación).

- Las células accesorias irradiadas se pueden usar con o sin crioconservación previa: células recién irradiadas o como células crioconservadas irradiadas (irradiación justo antes de la congelación).

- Para los 3 últimos experimentos, se agregaron células accesorias irradiadas a las células SCU a una relación NK: célula accesoria 1: 4, cada 3-4 días (días 0; 4; 8; 12; /- 15; /- 18). Algunos resultados (resultados anteriores y otros no mostrados) se obtuvieron mediante el uso de la relación 1:2, o la relación células totales: células accesorias de 1:1 a 1:3, con frecuencias de adición de 3 días a 7 días. Este parámetro se puede cambiar, obteniendo resultados de amplificación/activación similares.

- En los experimentos mostrados, no realizamos la selección de CD56+ al final del proceso porque las células NK derivadas de SCU empobrecidas en CD3 combinadas representaban ya más del 90 % de las células vivas al final del proceso. La etapa de selección de CD56 no es esencial, pero probablemente mejorará la pureza de NK y será preferible (y potencialmente necesario) para un producto farmacéutico.

Algunas etapas del proceso se pueden cambiar:

- Los SCU se procesarán de manera diferente antes de la primera congelación, mediante el uso de un método compatible con GMP como el dispositivo Hetastarch™ o PrepaCyte CB™ (u otro método existente y clínicamente aceptado).

- Incluso si el conocimiento clínico y preclínico actual muestra que una incompatibilidad de iKIR-HLA da mejores resultados que el acoplamiento de iKIR-HLA, todavía es posible que en nuestro caso iKIR-HLA tenga una influencia diferente en el resultado clínico. Entonces, por el momento, el desarrollo basado en el conocimiento de la literatura debería realizarse con un proceso que use la incompatibilidad de NK/células accesorias y la misma incompatibilidad de NK/paciente. Los datos preclínicos y clínicos futuros podrían cambiar este parámetro si no fuera necesario.

- La duración del cultivo de amplificación de NK se puede optimizar: de 14 a 28 días.

- Se pueden optimizar las concentraciones de IL-2 e IL-15.

- El empobrecimiento en CD3 se realizará con un dispositivo automático clínicamente aceptado como cliniMACS.

- El empobrecimiento en CD3 también se puede realizar justo después de la eliminación de eritrocitos y la reducción del volumen (tal vez mejores resultados en términos de recuperación de NK).

- Uno de los resultados demuestra que, en algunos casos indefinidos, el empobrecimiento en CD3 no es necesario para una buena amplificación/activación de células NK combinadas de SCU.

- Para obtener una cantidad importante de células NK activadas derivadas de donantes múltiples caracterizadas en un lote único definido farmacéuticamente, las unidades de SCU preferentemente empobrecidas en CD3 se pueden combinar en varios momentos del proceso: antes del cultivo de amplificación, durante el cultivo de amplificación o al final del cultivo de amplificación.

Ejemplo 3: objetivos

1. Primer experimento

Debido a que se sabe que los linfocitos T de diferentes donantes se matarán entre sí mediante el reconocimiento de diferencias de HLA, y debido a que las células NK necesitan una señal de activador para ser citotóxicas, preguntamos si es posible combinar SCU empobrecidas en CD3 que expresan los mismos grupos principales de HLA (según su reconocimiento por KIR inhibitorios) pero no los mismos alelos HLA. Se combinaron las células mononucleares totales y las células mononucleares empobrecidas en CD3 de 3 SCU para verificar si el empobrecimiento en CD3 era esencial.

2. Segundo experimento

Debido a que queremos producir 4 clases de células NK que presenten una incompatibilidad de iKIR-HLA para cada par principal de iKIR/HLA, necesitábamos investigar si el éxito de la combinación de SCU se debió solo a la primera genotipificación de HLA particular usado anteriormente o si podría reproducirse con otra genotipificación de HLA de SCU: preguntamos si otra línea de células accesorias que usa otra incompatibilidad de iKIR-HLA permitirá la amplificación/activación de NK a partir de una combinación de 3 SCU empobrecidas en CD3 que expresan los mismos grupos HLA.

3. Tercer experimento

Debido a que para tratar alrededor de 100 pacientes necesitaremos combinar 10 SCU, preguntamos si una combinación de 5 SCU (la mitad) que expresan los mismos grupos HLA permiten la misma amplificación/activación de NK.

Ejemplo 4: Experimentos realizados

1. Primer experimento

Las células mononucleares SCU obtenidas por separación de Ficoll se crioconservaron, luego se descongelaron y se empobrecieron en CD3 mediante el uso de un kit de células madre como parte. Tres SCU empobrecidas en CD3 o totales con el mismo genotipo de los principales grupos HLA clase 1 A3/A11+, Bw4+, C1+, C2+ se combinaron y cultivaron durante 21-25 días con IL-2, IL-15 y células accesorias PLH irradiadas (genotipo A3/A11+, Bw4+, C1-, C2+) añadido cada 4 días.

2. Segundo experimento

Las células mononucleares de SCU obtenidas por separación de Ficoll se crioconservaron, luego se descongelaron y se empobrecieron en CD3 mediante el uso de un kit de células madre. Se combinaron tres SCU empobrecidas en CD3 con el mismo genotipo A3/A11-, Bw4+, C1-, C2+ de los principales grupos HLA de clase 1 y se cultivaron durante 21-25 días con iL-2, IL-15 y células accesorias irradiadas HOM-2 (genotipo A3/A11+, Bw4+, C1+, C2-) añadidos cada 4 días.

3. Tercer experimento

Las células mononucleares de SCU obtenidas por separación de Ficoll se crioconservaron, luego se descongelaron y se empobrecieron en CD3 mediante el uso de un kit de células madre. Se combinaron cinco SCU empobrecidas en CD3 con el mismo genotipo A3/A11-, Bw4+, C1+, C2- de los principales grupos HLA clase 1 y se cultivaron durante 21 días con IL-2, IL-15 y células accesorias PLH irradiadas (A3/A11+, Genotipo Bw4 , C1-, C2+) añadido cada 4 días.

4. Parámetros evaluados

Las células NK vivas se contaron regularmente mediante el uso del sistema MUSE MiMipore y la caracterización por citometría de flujo de la composición celular en el cultivo.

La expresión de los marcadores de activación de las células NK se evaluó regularmente mediante citometría de flujo (CD16 para un potente efecto sinérgico con terapias de anticuerpos monoclonales; CD69 como receptor de activación común).

En el día 20 de cultivo, se evaluó la citotoxicidad frente a células diana K562 bien conocidas y células tumorales para los experimentos 2 y 3 (incubación de 2 h con relación NK: K562 3:1, relación NK: células de linfoma B purificadas 3:1, relación n K: células de AML (en la muestra total de PBMC del paciente) 10:1).

Ejemplo 5: Resultados

1. Primer experimento (ver figuras 2 y 3)

UCB 1: HLA A11:01/A29:02, B35:01/B44:02, C04:01/C16/01> HLA A3/A11+, Bw4+, C1+, C2+

UCB2: HLA A11:01/A23:01, B35:02/B49:01, C04:01/07:01> HLA A3/A11+, Bw4+, C1+, C2+

UCB3: HLA A2/A3, B18/B51, C5/C14> HLA A3/A11+, Bw4+, C1+, C2+

La proliferación de NK a partir de SCU aisladas muestra mejores resultados después del empobrecimiento en CD3 porque los linfocitos T compiten con las células NK por la proliferación con las citocinas usadas (y los linfocitos T CD8-T dirigidos contra el antígeno del EBV también son estimulados por células accesorias).

Las NK de las SCU empobrecidas en CD3 combinadas proliferan de manera similar que de las SCU aisladas, pero si las SCU no están empobrecidas en CD3, los linfocitos T de los diferentes donantes son citotóxicos para el otro y las células NK no pueden proliferar.

Tabla 1:

El factor de amplificación de NK es relativamente bajo en este experimento debido a problemas técnicos.

Los receptores de activación están bien expresados y la citotoxicidad contra las células diana comunes K562 de las células NK cultivadas es mucho mejor que con las células NK no activadas.

Este experimento mostró que la combinación de SCU con los mismos grupos principales de HLA genotipados para la amplificación de NK es factible pero requiere un empobrecimiento previo en CD3. Las células NK amplificadas están bien activadas.

2. Segundo experimento (ver Figura 4)

UCB1: HLA A01/02, B27: 05/B40:02/C02:02/C15:02> HLA A3/A11-, Bw4+, C1-, C2+

UCB2: HLA A2/A31, B50/B51, C06:02/15:02> HLA A3/A11-, Bw4+, C1-, C2+

UCB3: HLA A23/A24, B44/B44, C4/C5> HLA A3/A11-, Bw4+, C1-, C2+

La proliferación de NK a partir de SCU empobrecidas en CD3 combinadas con este nuevo genotipo es similar a la proliferación de NK con SCU empobrecidas en CD3 aisladas.

Tabla 2:

El factor de amplificación de NK es mayor en este experimento (sin problemas técnicos), pero aún puede mejorarse mediante la optimización del protocolo específicamente para la nueva línea celular accesoria.

Los receptores activadores se expresan muy bien. La citotoxicidad contra la célula diana común K562 de las células NK cultivadas es mucho mejor que con las células NK inactivadas, y observamos una citotoxicidad significativa contra las células tumorales de linfoma B con una incubación de 2 horas.

Es factible combinar SCU empobrecidas en CD3 con otro genotipo de grupos HLA principales y amplificar las células NK con otra incompatibilidad de iKIR-HLA y otra línea celular accesoria. Las células NK amplificadas están bien activadas.

3. Tercer experimento (ver Figura 5)

UCB: HLA A3/A11-, Bw4+, C1+, C2-Tabla 3:

El factor de amplificación de NK es mayor en este experimento.

Los receptores activadores se expresan muy bien. La citotoxicidad contra la célula diana común K562 de las células NK cultivadas es mucho mejor que con las células NK inactivadas, y observamos una pequeña citotoxicidad específica contra las células tumorales de AML con una incubación de 2 horas (pero no pudimos observar la citotoxicidad después de 20 h porque en este momento las células del paciente murieron debido a la descongelación).

La combinación de 5 SCU empobrecidas en CD3 y la amplificación de células NK con un factor de amplificación importante es factible con nuestro proceso de fabricación. Las células NK amplificadas están bien activadas.

4. Resultados complementarios

- Experimento que muestra una buena amplificación de células NK de SCU combinadas sin empobrecimiento previo en CD3 (sin ensayo de reproducibilidad): (ver Figura 6)

3 SCU con incompatibilidad de iKIR-HLA amplificados con PLH:

UCB 1: HLA A2: 01/A68:01; B38: 01/B57:01; C6: 02/C12: 03> C1+, C2+, A3/A11-, Bw4+

UCB 2: HLA A1:01/A2:01; B52:01/B57:01; C6:02/C12:02> C1+, C2+, A3/A11-, Bw4+

UCB 3: HLA A02/02; B15:09/B50:02; C06/C07> C1+, C2+, A3/A11-, Bw4-La amplificación de NK puede ser similar en SCU aisladas o combinadas sin empobrecimiento previo en CD3.

- Experimentos que muestran la posibilidad de combinación después de 9 días de cultivo (con SCU no empobrecidas en CD3):

1 / mismo experimento anterior (ver Figura 7)

Tabla 4:

Es posible combinar células NK activadas durante 9 días (aquí sin empobrecimiento previo en CD3) manteniendo una amplificación de NK significativa pero menor.

2/ Experimento con 2 SCU con iKIR-HLA compatibles amplificados con PLH: (consulte la Figura 8)

UCB 1: HLA A11: 01/A29:02, B35:01/B44:02, C04:01/C16/01> HLA A3/A11+, Bw4+, C1+, C2+

Cuando las NK sin empobrecimiento en CD3 no se amplificaron correctamente, la combinación de SCU después de 9 días de amplificación (aumentando el % de NK y el estado de activación de NK, pero aún con un porcentaje alto de linfocitos T) pareció solucionar el problema. Mostraron una buena citotoxicidad in vitro similar contra las células tumorales de linfoma B (durante la noche, relación E: T 1:1).

3/ Experimento con 2 SCU no compatibles para iKIR-HLA amplificados con PLH: (ver Figura 9)

UCB1: HLA A02: 02/30:01, B42:01/B53:01, C04:01/17:01> HLA A3/A11-, Bw4+, C1-, C2+

UCB2: HLA A11: 01/A23:01, B35:02/B49:01, C04:01/07:01> HLA A3/A11+, Bw4+, C1+, C2+

Tabla 5:

Las células NK de SCU combinadas no empobrecidas en CD3 con iKIR-HLA no compatible mostraron un factor de amplificación más bajo, y la combinación de estas SCU después de 9 días de amplificación dio una mejor amplificación de NK. Mostraron una buena citotoxicidad in vitro similar contra las células tumorales del linfoma B (durante la noche, relación E: T 1:1).

Ejemplo 6: perspectivas

1. Optimización de procesos

Preferentemente, el proceso de fabricación de células NK activadas/expandidas combinadas de acuerdo con la presente invención se adaptará a las obligaciones regulatorias farmacéuticas, y cada etapa del proceso se adaptará para la mejor garantía de calidad.

- Primero, y por ejemplo, se deben establecer los criterios de aceptación de las unidades de SCU, como más de 1,4 o 1,6 106 células nucleadas totales (actualmente 1,85 106 células nucleadas totales para nuestro banco de SCU local), con potencialmente un umbral mínimo para el porcentaje de NK tal como 7 % (3-15 % NK generalmente observado en células nucleadas totales SCU).

- El método "Ficoll" usado en los ejemplos anteriores para el aislamiento de células mononucleares SCU (UCBMC) se puede reemplazar fácilmente por un método estándar bien adaptado y conocido para aplicaciones clínicas y condiciones farmacéuticas, por ejemplo, mediante el uso de un sistema cerrado estéril con bolsas de un solo uso, mediante el uso de procedimientos adaptados como HES 6 % y centrifugación de eliminación de eritrocitos y reducción de volumen, o sistema de aislamiento Prepacyte CB. Estos sistemas ciertamente mejoran la recuperación total de células nucleadas en la primera etapa.

- Preferentemente, el empobrecimiento en CD3 de UCBMC se puede adaptar mejor a las normativas y/o el proceso GMP para usos farmacéuticos, por ejemplo, con un material adaptado clínicamente actualizable como CliniMACS ™, y determinando el mejor tiempo de la etapa de empobrecimiento en CD3, ya sea necesario, antes o después de la primera etapa de crioconservación para la mejor recuperación celular y la mejor calidad de empobrecimiento en CD3.

- Preferentemente, los procedimientos de congelación, crioconservación y descongelación de UCBMC pueden mejorarse mediante el uso de procedimientos autorizados para aplicaciones clínicas después de la validación del proceso de fabricación. Puede usarse material adaptado para el sistema de bolsa cerrada y las condiciones de crioconservación (medio, concentración de células) pueden ser optimizadas fácilmente por el experto en el método de la presente invención. Estas etapas de optimización solo deberían ciertamente mejorar la recuperación celular total después de la descongelación. Al mismo tiempo, se deben establecer los criterios de aceptación para que cada UCBMC descongelado avance en el proceso de fabricación de acuerdo con las pautas farmacéuticas.

- Preferentemente, los procedimientos de evaluación de la expresión de KIR inhibitorios y de genotipificación de HLA deben validarse para seleccionar las diferentes unidades de SCU que pueden combinarse para la etapa de amplificación/activación: deben establecerse criterios de selección para cada lote.

- Preferentemente, células accesorias actualizables compatibles con GMP, ya sea que se incluyan en el método de la invención, con un tamizaje final en amplificación de NK: activación para selección de clones. Las células accesorias finales deben estar bien caracterizadas para su uso en un procedimiento de producción de agentes terapéuticos. Esta etapa de optimización también podría mejorar los resultados de activación/amplificación de NK.

- Preferentemente, el procedimiento de irradiación se optimizará y validará para obtener los mejores resultados de amplificación/activación con parámetros de calidad clínicamente adaptados, y se establecerán criterios de aceptación de lotes de células accesorias irradiadas crioconservadas, incluida la evaluación de no proliferación, viabilidad celular, inactivación del EBV... etc.

- El procedimiento exacto de adición de células accesorias irradiadas se optimizará para las clones finales usadas en el proceso, incluidas las células accesorias.

- Preferentemente, se usará un sistema cerrado de cultivo dinámico en biorreactores para la etapa de amplificación/activación con al menos 5, preferentemente 10 unidades de SCU combinadas, como el Wave system™ (GE Healthcare) ya probado para cultivo NK.

- Preferentemente, se puede usar el medio de cultivo usado para la etapa de amplificación/activación, mediante el uso de medios sin suero animal como los medios X-VIVO™ de Lonza, CellGro SCGM™ de Cellgenix o AIM V™ de Invitrogen (ya probado para cultivos NK).

- Preferentemente, se usará la selección positiva para CD56 de células NK amplificadas/activadas mediante el uso de un material adaptado clínicamente mejorable tal como CliniMACS ™.

2. Desarrollo farmacéutico: caracterización del producto final y criterios de aceptación

Preferentemente, se debe incluir en el proceso una etapa de los criterios de aceptación de los productos finales amplificados/activados, incluidas las etapas de identificación del producto (estabilidad genética, quimerismo, fenotipo) y un procedimiento estándar de evaluación de la potencia.

- Preferentemente, se comprobará la estabilidad genética de las células NK antes y después del proceso de la presente invención, observando su cariotipo (por ejemplo, mediante métodos de cariotipaje con bandas G o micromatrices cytoscanHD bien conocidos por la persona especialista en la técnica), y el quimerismo de las células NK combinadas finales de los diferentes donantes deben definirse (por ejemplo, mediante métodos estándar de PCR multiplex STR).

- Preferentemente y para identificar y caracterizar mejor el producto final y definir criterios de aceptación, se evaluará la expresión de más marcadores fenotípicos de NK (NKG2D, NKG2C, CD94, NKp44, NKp30, NKp46, CD158...) (por ejemplo mediante citometría de flujo).

- Preferentemente, cada lote de producto se probará con un ensayo de citotoxicidad validado frente a células diana conocidas comúnmente usadas.

- Preferentemente, la ausencia de contaminaciones como bacterias, hongos, micoplasmas y virus (particularmente EBV) debe verificarse durante o después de la etapa final del proceso, así como la ausencia de endotoxinas y citosinas usadas durante el proceso de fabricación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la producción de una población de células NK activadas expandidas, que comprende:

(b) combinar dichas al menos n unidades de SCU, o una fracción de las mismas que contiene dichas células, para producir la población de células

(C) recuperar dichas células NK activadas expandidas,

en donde dicho método comprende en la etapa (A),

- una etapa (c) de empobrecimiento de las células T de dicha población de células obtenidas en (b), o

- una etapa de empobrecimiento de las células T contenidas en cada una de dichas n unidades de SCU antes de la etapa (b) de combinación de dichas unidades de SCU,

en donde dichas n unidades de SCU cuando se combinan presentan el mismo patrón para los genotipos de los grupos principales de HLA de clase I y en donde dicho grupo principal de HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA A3/A11 que es reconocido por KIR3DL2, HLA Bw4 que es reconocido por KIR3DL1, HLA C grupo 1 que es reconocido por KIR2DL2/3 y HLA C grupo 2 que es reconocido por KIR2DL; y

en donde el medio adecuado para expandir y activar las células NK en la etapa (B) comprende células accesorias, dichas células accesorias y las células NK a expandir y activar no son compatibles para HLA-KIR.

2. El método de la reivindicación 1, en donde en la etapa a), 3 < n < 50).

3. El método de la reivindicación 1, en donde dichas células accesorias se irradian.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dichas células accesorias se inmortalizan.

5. El método de la reivindicación 1, en donde cada una de dichas n unidades de SCU o la combinación de unidades de SCU está empobrecida en glóbulos rojos.

6. El método de la reivindicación 1, en donde las unidades de SCU usadas en la etapa (A) son unidades de SCU descongeladas a partir de unidades de SCU almacenadas congeladas.