BR112020015512A2 - método de produção de células exterminadoras naturais e composição para tratamento de câncer - Google Patents
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Abstract
MÉTODO DE PRODUÇÃO DE CÉLULAS EXTERMINADORAS NATURAIS E COMPOSIÇÃO PARA TRATAMENTO DE CÂNCER.
É revelado um método para produzir células exterminadoras naturais. O método compreende isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de uma amostra de sangue; isolar pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ das PBMCs; e cocultura as pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ com uma combinação de células alimentadoras na presença de uma citocina. Também é revelada uma composição para o tratamento de câncer. A composição compreende as células exterminadoras naturais CD56+ produzidas pelo método revelado e uma citocina.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO DE
PRODUÇÃO DE CÉLULAS EXTERMINADORAS NATURAIS E COMPOSIÇÃO PARA TRATAMENTO DE CÂNCER” Incorporação a título de referência em quaisquer pedidos de prioridade
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Coreana Nº. KR-10-2018-0012938, depositado em 1 de fevereiro de 2018, Pedido de Patente Coreana Nº. KR-10- 2018-0012942, depositado em 1 de fevereiro de 2018, Pedido de Patente Coreana Nº. KR-10-2019-0001981, depositado em 7 de janeiro de 2019, e Pedido de Patente Coreana Nº. KR-10- 2019-0001983, depositado em 7 de janeiro de 2019, cujas revelações são incorporadas ao presente documento a título de referência em suas totalidades.
Fundamentos Campo
[002] A presente revelação refere-se a um método de fabricação de células exterminadoras naturais de alta pureza.
Descrição da Técnica Relacionada
[003] O corpo humano é protegido de patógenos por uma resposta imune, coordenada pelo sistema imunológico, que é composto por muitas células imunorrelacionadas, mediadores químicos, como citocinas, e semelhantes. Os Leucócitos, especialmente linfócitos, desempenham um importante papel nesse sistema imunológico. Os linfócitos estão envolvidos tanto na imunidade inata quanto na adquirida.
[004] As células exterminadoras naturais (células NK) são um tipo de células de imunidade inata, que são conhecidas por matar não especificamente o câncer, reconhecer e matar os vírus, bactéria, e semelhantes, e matar os patógenos com enzimas como perforina e granzima ou pela interação Fas-FasL. No caso de pacientes com câncer, foi relatado que uma diminuição nas citotoxicidade das células cancerígenas dessas células NK está associada ao aparecimento de vários tipos de câncer, como câncer de pulmão (Carrega P, et al., Câncer, 2008: 112: 863 a 875), câncer de fígado (Jinushi M, et al., J Hepatol., 2005: 43; 1013 a 1020), câncer de mama (Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 2003: 33: 119 a 124), câncer de útero (Mocchegiani E., et al., Br j Câncer., 1999: 79: 244 a 250), câncer de sangue (Tajima F., et al, Lekemia 1996: 10: 478 a 482), e semelhantes. Consequentemente, para a terapia do câncer, é desejável aumentar a citotoxicidade das células cancerígenas das células NK.
[005] Para obter o efeito terapêutico da morte mediada por NK das células cancerígenas, é necessária uma grande quantidade de células NK com alta pureza, mas não é fácil obter uma grande quantidade de sangue do paciente com câncer, e da proporção de células NK no sangue é pequena, apenas cerca de 5 a 20%. Assim, tem sido difícil o uso das células NK como um agente imunoterapêutico.
[006] Como resultado, é desejável expandir e proliferar efetivamente apenas as células NK, mas em um método convencional de proliferação de células NK, várias citocinas caras precisam ser usadas a uma alta concentração, assim, a terapia correspondente está disponível apenas para alguns pacientes financeiramente estáveis. Além disso, de acordo com métodos convencionais de proliferação de células NK, outros tipos (por exemplo, células T, células B, etc.) de células imunes podem estar presentes juntamente com as células NK, e a administração alogênica das células NK que contém células T pode causar uma doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) e a administração alogênica das células NK que contém células B a indivíduos incompatíveis com o tipo sanguíneo podem causar uma síndrome de linfócitos B do passageiro e, assim, o efeito anticâncer não é maximizado.
[007] Além disso, além de expandir e proliferar células NK, é desejável manter altamente as funções das células NK até que as células NK expandidas e proliferadas sejam realmente usadas. Como resultado, o desenvolvimento de uma composição capaz de promover a proliferação das células NK, aumentando a produção de citocinas como TNF-,
INF- e GM-CSF derivadas das células NK, e é buscado aumentar a citotoxicidade das células cancerígenas das células NK.
Sumário
[008] Este pedido está relacionado a métodos de produção de células exterminadoras naturais de alta pureza, e uma composição terapêutica celular para o tratamento de câncer que compreende células exterminadoras naturais de alta pureza e citocinas. Quaisquer recursos, estruturas, ou etapas reveladas no presente documento podem ser substituídas ou combinadas com quaisquer outros recursos, estruturas ou etapas reveladas no presente documento, ou omitidas. Além disso, para fins de resumir a revelação, certos aspectos, vantagens, e recursos das invenções foram descritos no presente documento. Deve ser entendido que nem todas ou quaisquer vantagens não necessariamente são alcançadas de acordo com qualquer modalidade específica das invenções reveladas no presente documento. Nenhum aspecto individual dessa revelação é essencial ou indispensável.
[009] Em uma modalidade, é revelado um método de produção de células exterminadoras naturais. O método inclui: isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de uma amostra de sangue; isolar pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ das PBMCs; e cocultura as pelo menos uma das células CD56+ e/ou células
CD3-/CD56+ com uma combinação de células alimentadoras na presença de uma citocina.
[010] Em certas modalidades, o isolamento de pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ das PBMCs é conduzido ao usar pelo menos uma das microesferas CD56 e microesferas CD3. Em certas modalidades, a citocina é selecionada de um grupo que consiste em IL-2, IL-21, IL- 15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, interferons do tipo I, GM-CSF, IGF 1, e combinações dos mesmos. Em certas modalidades, a citocina pode ser adicionada a uma concentração de 50 a 1.000 IU/ml.
[011] Em certas modalidades, a combinação de células alimentadoras inclui células Jurkat irradiadas e células de linha contínua de linfócitos transformadas pelo vírus Epstein-Barr irradiadas (EBV-LCL). Em uma variação, a proporção das células Jurkat irradiadas e as células EBV- LCL irradiadas pode ser cerca de 1:0,1 a 5. Cada uma das células Jurkat irradiadas e as células EBV-LCL irradiadas podem ser obtidas por irradiação de 50 a 500 Gy.
[012] Em certas modalidades, a cocultura pode incluir cocultura por 1 a 50 dias.
[013] Em certas modalidades, o método pode incluir adicionalmente cocultura as pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ com uma combinação de células alimentadoras, na presença de uma primeira citocina por um primeiro período; e subsequentemente cocultura as pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ com a combinação de células alimentadoras, na presença de uma segunda citocina por um segundo período. Em uma variação, a segunda citocina pode ser adicionada uma vez ou mais durante o dia 0-6 do segundo período. A segunda citocina pode ser adicionada uma vez ou mais durante os primeiros seis dias de cada ciclo de catorze dias durante o segundo período. A primeira citocina pode ser IL-2. A segunda citocina pode ser IL-21. A segunda citocina pode ser adicionada a uma concentração de 10 a 100 ng/ml.
[014] Em certas modalidades, as pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ e a combinação de células alimentadoras são cocultivadas com uma proporção de cerca de 1:1 a 100 de células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ para células alimentadoras.
[015] Em certas modalidades, é revelada uma composição feita pelo método.
[016] Em uma modalidade, é revelada uma composição para o tratamento de câncer em um paciente com necessidade.
A composição inclui: uma quantidade eficaz de células exterminadoras naturais CD56+ derivadas de sangue periférico, em que a quantidade eficaz está em uma faixa de cerca de 1 x 106 a 5 x 108 células por kg de peso corporal do paciente, e em que as células exterminadoras naturais
CD56+ são pelo menos cerca de 90% puros; IL-2 que tem uma concentração de 50 a 50.000 IU/ml; e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[017] Em certas modalidades, a citocina pode ser selecionada de um grupo que consiste em IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, interferons do tipo I, GM- CSF, IGF 1, e combinações dos mesmos. Em uma variação, a citocina pode ser IL-2. A citocina pode ter uma concentração de 50 a 50.000 IU/ml.
[018] Em certas modalidades, o câncer é selecionado de um grupo que consiste em: câncer de sangue, câncer de estômago, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de rim, câncer de próstata e neuroblastoma.
[019] Em certas modalidades, a composição inclui menos de cerca de 1% de células T.
Breve descrição dos desenhos
[020] Várias modalidades são representadas nos desenhos anexos para fins ilustrativos, e não devem ser interpretadas como limitativas do escopo das modalidades.
Além disso, vários recursos de diferentes modalidades reveladas podem ser combinados para formar modalidades adicionais, que são parte desta revelação.
[021] A Figura 1A ilustra um gráfico que mostra as taxas de crescimento celular de células NK produzidas a partir de PBMCs, células CD56+, e células CD3-/CD56+.
[022] A Figura 1B ilustra gráficos que mostram as taxas de crescimento celular de células NK produzidas a partir de PBMCs e células CD56+ com ou sem tratamento com IL-21.
[023] A Figura 2 ilustra um gráfico que mostra a pureza das células NK CD3-/CD56+ produzidas a partir de PBMCs ou células CD56+ com ou sem tratamento com IL-21.
[024] A Figura 3 ilustra um projeto de placa para analisar a atividade anticâncer de células NK.
[025] A Figura 4A ilustra gráficos que mostram a citotoxicidade a curto prazo de células NK produzidas a partir de PBMCs e células CD56+ para várias proporções célula efetora: célula alvo (E:T).
[026] A Figura 4B ilustra gráficos que mostram a citotoxicidade a longo prazo de células NK produzidas a partir de PBMCs e células CD56+ contra células AGS, A549, e MDA-MB-231.
[027] As Figuras 5A-5B ilustram gráficos que mostram as taxas de crescimento celular de células NK produzidas por tratamento com IL-21 durante vários períodos.
[028] A Figura 6 ilustra gráficos que mostram as taxas de crescimento celular de células NK produzidas por tratamento com IL-21 com várias concentrações.
[029] A Figura 7A ilustra um gráfico que mostra a citotoxicidade a curto prazo de células NK produzidas por tratamento com IL-21 durante vários períodos para várias proporções E:T.
[030] As Figuras 7B-7C ilustram gráficos que mostram a citotoxicidade a longo prazo de células NK produzidas por tratamento com IL-21 durante vários períodos contra células AGS, A549, e MDA-MB-231.
[031] A Figura 8A ilustra gráficos que mostram a citotoxicidade a curto prazo de células NK produzidas por tratamento com IL-21 com várias concentrações para várias proporções E:T.
[032] A Figura 8B ilustra gráficos que mostram a citotoxicidade a longo prazo de células NK produzidas por tratamento com IL-21 com várias concentrações contra células AGS, A549, e MDA-MB-231.
[033] A Figura 9 ilustra gráficos que mostram as taxas de crescimento celular de células NK com estímulos de células alimentadoras.
[034] A Figura 10A ilustra gráficos que mostram as taxas de crescimento celular de células NK produzidas a partir de PBMCs de um paciente com câncer com ou sem tratamento de IL-21.
[035] A Figura 10B ilustra um gráfico que mostram a pureza das células CD3-/CD56+ NK produzidas a partir de PBMCs de um paciente com câncer com ou sem tratamento de IL-21.
[036] A Figura 10C ilustra um gráfico que mostra a citotoxicidade a curto prazo de células NK produzidas a partir de PBMCs com ou sem tratamento de IL-21 contra células K562.
[037] A Figura 10D ilustra gráficos que mostram a citotoxicidade a longo prazo de células NK produzidas a partir de PBMCs com ou sem tratamento de IL-21 contra células AGS, A549, e MDA-MB-231.
[038] A Figura 11 ilustra gráficos que mostram a taxa de sobrevivência de células NK tratadas com ou sem IL-
2.
[039] A Figura 12 ilustra gráficos que mostram a citotoxicidade de células NK tratadas com ou sem IL-2 contra várias células cancerígenas em várias proporções E:T.
[040] A Figura 13 ilustra fotografias das células NIH:OVCAR-3 restantes tratadas com células NK tratadas com ou sem IL-2.
[041] A Figura 14 ilustra fotografias de células AGS restantes tratadas com células NK tratadas com ou sem IL-2.
Descrição detalhada
[042] Um método para produzir células NK de alta pureza sem o uso de citocinas caras foi desenvolvido pelos inventores. Os inventores descobriram que, após as células CD56+ serem isoladas das células mononucleares do sangue periférico, quando as células CD56+ isoladas das células mononucleares do sangue periférico são cocultivadas com células alimentadoras na presença de citocinas, as células CD56+ NK de alta pureza poderiam ser produzidas. Além disso, os presentes inventores desenvolveram uma composição terapêutica celular para o tratamento de câncer que compreende células NK que são efetivamente utilizáveis para terapia alogênica. Como resultado, os inventores descobriram que quando uma citocina específica foi adicionada às células CD56+ NK isoladas das células mononucleares do sangue periférico, foram exibidas altas taxas de sobrevivência e alta atividade anticâncer.
Portanto, os inventores buscaram desenvolver um método para expandir células NK e fornecer uma composição terapêutica celular para o tratamento de câncer que compreende células NK CD56+ derivadas de sangue periférico expandidas juntamente com citocinas.
[043] De acordo com algumas modalidades, um método para produzir células NK de alta pureza pode incluir: isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de uma amostra de sangue (“Primeira Etapa de Isolamento”);
isolar células selecionadas a partir de um grupo que consiste em células CD56+ e células CD3-/CD56+ das células mononucleares do sangue periférico (“Segunda Etapa de Isolamento”); e cocultura as células selecionadas de um grupo que consiste em células CD56+ e células CD3-/CD56+ juntamente com células alimentadoras na presença de citocina (“Etapa de Cultivo”). Cada etapa é descrita em mais detalhes no presente documento. As células CD3-/CD56+ produzidas de acordo com o método revelado podem exibir não apenas maior pureza e maior atividade anticâncer, mas também outras características distintas, como ter marcadores de superfícies diferentes ou receptores ativados, por exemplo, um ou mais de CD16, CD25, CD27, CD28, CD69, CD94/NKG2C, CD94/NKG2E, CD266, CD244, NKG2D, KIR2S, KIR3S, Ly94D, NCRs, IFN-a, IFN-b,CXCR3, CXCR4, CX3CR1, CD62L e CD57, conforme comparado com células NK produzidas a partir de células mononucleares do sangue periférico sem isolar células CD56+.
Primeira Etapa de Isolamento
[044] Na presente especificação, a “amostra de sangue” pode ser, mas não limitada a, sangue total do sangue periférico ou leucócitos isolados do sangue periférico usando leucaférese. Além disso, o sangue periférico pode ser obtido de uma pessoa normal, um paciente que tem risco de câncer, ou um paciente com câncer, mas a fonte do sangue periférico não está limitada a isso.
[045] Na presente especificação, o termo “leucaférese” pode se referir a um método de remover seletivamente (isolar) leucócitos do sangue coletado e então doar o sangue a um paciente novamente, e em algumas modalidades, os leucócitos isolados pelo método podem ser usados sem métodos adicionais, como o método de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque.
[046] Na presente especificação, o termo “célula mononuclear do sangue periférico” pode ser usado de forma intercambiável com “PBMC”, “célula mononuclear” ou “monócito”, e pode se referir a uma célula mononuclear isolada do sangue periférico que é geralmente usada para imunoterapia anticâncer. As células mononucleares do sangue periférico podem ser obtidas a partir do sangue humano coletado usando métodos conhecidos como um método gradiente de densidade Ficoll-Hypaque.
[047] Em algumas modalidades, as células mononucleares do sangue periférico podem ser autólogas, mas as células mononucleares do sangue periférico alogênico também podem ser usadas para produzir células NK de alta pureza para imunoterapia anticâncer, de acordo com os métodos descritos no presente documento. Além disso, em algumas modalidades, as células mononucleares do sangue periférico podem ser obtidas de uma pessoa normal, mas as células mononucleares do sangue periférico também podem ser obtidas de um paciente que tem um risco de câncer e/ou um paciente com câncer.
[048] Na presente especificação, o termo “células CD56+” pode ser usado de forma intercambiável com “células CD56+ NK”, ou “células exterminadoras naturais CD56+”, e o termo “células CD3-/CD56+” pode ser usado de forma intercambiável com “células CD3-/CD56+ NK”. As células CD56+ ou células CD3-/CD56+ podem incluir células nas quais a glicoproteína CD56 na superfície da célula é expressa, ou adicionalmente, células nas quais a glicoproteína CD3 não é expressa enquanto a glicoproteína CD56 é expressa. Mesmo o mesmo tipo de células imunes pode ter diferenças no tipo de CD ligado à superfície da célula e na taxa de expressão e assim, as funções das mesmas podem ser diferentes.
Segunda Etapa de Isolamento
[049] Em algumas modalidades, o isolamento das células exterminadoras naturais de CD56+ a partir da amostra de sangue pode ser realizado por um método de isolamento que usa pelo menos um selecionado do grupo que consiste em microesferas CD56 e microesferas CD3, ou um método de isolamento que usa equipamentos como CliniMACSs, um classificador de células para a citometria de fluxo, etc.
[050] Por exemplo, o método de isolamento que usa as microesferas CD56 e/ou as microesferas CD3 pode ser realizado ao adicionar as microesferas CD56 às PBMCs e em seguida, remover a ligação não específica, ou realizado ao adicionar as microesferas CD3 às PBMCs para remover a ligação não específica e em seguida, adicionar as microesferas CD56 novamente para remover a ligação não específica. Em alguns exemplos, através do isolamento de células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ de PBMCs, células T ou outras células exterminadoras naturais podem ser removidas.
Etapa de Cultivo
[051] Na presente especificação, o termo “citocina” pode se referir a um composto imunoativo que é utilizável para induzir as células mononucleares do sangue periférico a se diferenciarem em células NK.
[052] Em algumas modalidades, a citocina pode ser interleucina-2 (IL-2), IL-15, IL-21, ligante de tirosina quinase 3 tipo FMS (Flt3-L), um fator de célula-tronco (SCF), IL-7, IL-18, IL-4, interferons do tipo I, um fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM- CSF), e um fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF 1), mas não limitado a isso.
[053] Em algumas modalidades, a citocina pode ser usada a uma concentração de 50 a 1.000, 50 a 900, 50 a 800,
50 a 700, 50 a 600, 50 a 550, 100 a 550, 150 a 550, 200 a 550, 250 a 550, 300 a 550, 350 a 550, 400 a 550, 450 a 550 IU/ml. Os métodos convencionais de proliferação de células NK utilizam altas concentrações de várias citocinas. Por outro lado, em algumas modalidades do método de proliferação de células NK descrito no presente documento, uma vez que dois tipos de células alimentadoras podem ser usados com as células CD56+ de alta pureza, as células NK com alto rendimento e alta pureza podem ser proliferadas usando apenas baixas concentrações de uma citocina.
[054] Na presente especificação, o termo “células alimentadoras” pode se referir a uma célula que não se divide e prolifera, mas tem atividade metabólica para produzir vários metabólitos e, assim, ajuda na proliferação de células alvo.
[055] Em algumas modalidades, as células alimentadoras podem ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em células Jurkat irradiadas, células da linha contínua de linfócitos transformadas pelo vírus Epstein- Barr irradiadas (EBV-LCL), e PBMC, HFWT, RPMI 1866, Daudi, MM-170, K562 ou células geneticamente modificadas visando o K562 (por exemplo, ligante K562-mbIL-15-41BB). Por exemplo, em uma modalidade, as células alimentadoras podem ser as células Jurkat irradiadas e as células EBV-LCL.
[056] Na presente especificação, o termo “célula
Jurkat” ou “linha de célula Jurkat” pode se referir a câncer de sangue (leucemia aguda de células T), que foi desenvolvida pelo Dr. Arthur Weiss da Universidade da Califórnia em São Francisco. As células Jurkat, nas quais vários receptores de quimiocinas são expressos e capazes de produzir IL-2, geralmente não são considerados como um candidato possível das células alimentadoras para imunoterapia anticâncer porque o MHC classe I, que é um inibidor de ativação da célula exterminadora natural, é altamente expresso na sua superfície celular. As células Jurkat podem ser obtidas a partir do ATCC (ATCC TIB-152).
[057] Na presente especificação, o termo “célula EBV-LCL” ou “linha de célula EBV-LCL” refere-se a uma linha contínua de linfócitos transformados pelo vírus Epstein- Barr (EBV-LCL) (D.M.Koelle et al., J Clin Invest, 1993: 91: 961 a 968), que é uma linha de células B que é feita pela infecção de células B humanas de com o vírus Epstein-Barr em um tubo de ensaio. As células EBV-LCL podem ser diretamente preparadas e usadas em um laboratório geral por um método de adição de ciclosporina A em um processo de infectar EBV no PBMC. Em algumas modalidades, a célula EBV- LCL pode ser preparada seguindo as etapas. São adicionados 30 x 106 PBMCs em 9 ml de um meio de cultura, a mistura é adicionada em um balão de cultura T 25, e em seguida, são adicionados 9 ml de um EBV sobrenadante. 80 µl de ciclosporina A (50 µg/ml) são adicionados e depois cultivados a 37 °C. Após 7 dias de cultura, remove-se metade do sobrenadante, adiciona-se um meio de cultura fresco e, em seguida, adiciona-se 40 µl de ciclosporina A.
O mesmo processo pode ser repetido uma vez a cada 7 dias até 28 dias de cultura. A linha de célula pode ser utilizável após 28 dias de cultura, e a partir deste momento, a linha de célula pode ser cultivada no meio de cultura sem adição de ciclosporina A.
[058] As células Jurkat e as células EBV-LCL podem ser usadas como as células alimentadoras após irradiação.
[059] Em algumas modalidades, as células Jurkat irradiadas e as células EBV-LCL irradiadas podem ser incluídas em uma proporção de conteúdo de 1:0,1 a 5, 1:0,1 a 4, 1:0,1 a 3, 1:0,1 a 2, 1:0,1 a 1,5, 1:0,5 a 1,5, 1:0,75 a 1,25, 0,1 a 5:1, 0,1 a 4:1, 0,1 a 3:1, 0,1 a 2:1, 0,1 a 1,5:1, 0,5 a 1,5:1 ou 0,75 a 1,25:1. Por exemplo, as células Jurkat irradiadas e as células EBV-LCL irradiadas podem ser incluídas na proporção de conteúdo de 1:1.
[060] Em algumas modalidades, as células Jurkat irradiadas e as células EBV-LCL irradiadas podem ser obtidas pelo tratamento com irradiação de 50 a 500, 50 a 400, 50 a 300, 50 a 200, 50 a 150, 70 a 130, 80 a 120 ou 90 a 110 Gy. Por exemplo, as células Jurkat irradiadas e/ou as células EBV-LCL irradiadas podem ser obtidas pelo tratamento de células Jurkat e/ou células EBV-LCL com irradiação de 100 Gy.
[061] Em algumas modalidades, a cultura pode ser realizada por 1 a 50, 1 a 42, 1 a 40, 1 a 35, 1 a 20, 1 a 19, 1 a 18, 1 a 17, 1 a 16, 1 a 15 ou 1 a 14 dias.
[062] Em algumas modalidades, a etapa de cultura pode incluir adicionalmente as seguintes etapas: cocultura com as células alimentadoras e uma primeira citocina (“primeira etapa de cultura”); e adicionalmente cocultura após a adição de uma segunda citocina (“segunda etapa de cultura”).
[063] A segunda etapa de cultura pode incluir a adição da segunda citocina uma ou mais vezes entre o dia 0- 6 de cultura. Por exemplo, a segunda etapa de cultura pode incluir a adição da segunda citocina uma vez em cada dia 0 e dia 3 de cultura.
[064] A segunda etapa de cultura pode incluir a adição da segunda citocina e as células alimentadoras durante os primeiros 6 dias do ciclo de 14 dias de cultura.
Por exemplo, a segunda etapa de cultura pode incluir a adição das células alimentadoras durante um ciclo de 14 dias, e adicionar a segunda citocina no dia 3 e 6 de cada ciclo, uma vez cada.
[065] Em algumas modalidades, a primeira citocina pode ser IL-2. Em algumas modalidades, a segunda citocina pode ser IL-21. Em algumas modalidades, a segunda citocina pode ser usada na concentração de 10 a 1.000, 10 a 500, 10 a 100, 20 a 100, 30 a 100, 40 a 100, 50 a 100 ou 10 a 50 ng/ml. Em algumas modalidades, o cultura com a adição de uma segunda citocina uma ou mais vezes durante o dia 0-6 pode exibir a proliferação superior e/ou atividade anticâncer. Em algumas modalidades, cultivar com a adição das células alimentadoras e a segunda citocina por seis dias no ciclo de 14 dias pode exibir proliferação superior e/ou atividade anticâncer.
[066] Em algumas modalidades, o cocultura pode ser realizado incluindo-se as células mononucleares do sangue periférico e as células alimentadoras (por exemplo, as células Jurkat e as células EBV-LCL) a uma proporção de mistura de 1:1 a 100, 1:1 a 90, 1:1 a 80, 1:1 a 70, 1:10 a 65, 1:20 a 65, 1:30 a 65, 1:40 a 65, 1:50 a 65 ou 1:55 a
65.
[067] O cocultura pode ser realizado em um meio e qualquer meio adequado geralmente usado para indução e proliferação das células mononucleares do sangue periférico para as células NK na técnica pode ser usado sem uma limitação como um meio. Por exemplo, um meio RPMI-1640, DMEM, x-vivo10, x-vivo20, ou cellgro SCGM pode ser usado como um meio. Além disso, as condições de cultura como uma temperatura, podem seguir quaisquer condições das células mononucleares do sangue periférico conhecidas na técnica.
[068] Em algumas modalidades, dentro das células NK produzidas, uma proporção ou pureza das células CD56+ NK pode ser de 85% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais, ou 98% ou mais em relação às células inteiras. Em algumas modalidades, dentro das células NK produzidas, uma proporção de células T para as células inteiras pode ser 15% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, 2% ou menos, 1% ou menos.
Composição Terapêutica Celular para o Tratamento de Câncer
[069] De acordo com algumas modalidades, uma composição terapêutica celular para o tratamento de câncer pode incluir células CD56+ NK derivadas de sangue periférico e uma citocina.
[070] Na presente especificação, o termo “derivado de sangue periférico” pode significar que as células são derivadas de “sangue total do sangue periférico” ou “leucócitos isolados do sangue periférico que usam leucaférese”. As células CD56+ NK derivadas de sangue periférico podem ser usadas de forma intercambiável com células CD56+ NK derivadas de células mononucleares (PBMC) de sangue periférico.
[071] Em algumas modalidades, a citocina pode ser usada em uma concentração de 18 a 180.000, 20 a 100.000, 50 a 50.000, 50 a 1.000, 50 a 900, 50 a 800, 50 a 700, 50 a 600, 50 a 550, 100 a 550, 150 a 550, 200 a 550, 250 a 550, 300 a 550, 350 a 550, 400 a 550, 450 a 550 IU/ml. Quando a citocina é usada nessas faixas, ela pode suprimir a apoptose das células NK incluídas na composição de tratamento de câncer e aumentar a atividade anticâncer das células NK.
[072] Em algumas modalidades, a composição pode incluir IL-2 como a citocina.
[073] Em algumas modalidades, as células CD56+ NK podem ser obtidas conforme descrito em outra parte no presente documento. Por exemplo, as células CD56+ NK podem ser obtidas cocultivando-se com células alimentadoras (por exemplo, células Jurkat irradiadas e células EBV-LCL irradiadas). Em algumas modalidades, a proporção de células CD56+ NK para células inteiras (pureza) pode ser de 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, ou 98% ou mais.
[074] Em algumas modalidades, o câncer pode ser câncer de sangue, câncer de estômago, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de rim, câncer de próstata ou neuroblastoma, mas não limitado aos mesmos.
[075] Em algumas modalidades, a composição pode não incluir células T, ou pode incluir apenas uma quantidade vestigial de células T. Por exemplo, a proporção de células T para células inteiras na composição pode ser menor que 15%, menor que 10%, menor que 5%, menor que 2%, menor que 1% ou menor.
[076] Na presente especificação, o termo “célula T” refere-se a um linfócito derivado do timo, que pode “memorizar” antígenos encontrados anteriormente e fornecer informações às células B, facilitando assim, a produção de anticorpos e desempenhando um papel importante no sistema imunológico celular. Como essas células T podem distinguir diferenças muito pequenas entre diferentes antígenos para induzir uma resposta imune a antígenos alogênicos, a terapia autóloga é possível, mas pode haver um limite a ser usado para a terapia alogênica. Consequentemente, a composição terapêutica celular sem células T pode ser adequada para alotransplante.
[077] Na presente especificação, o termo “agente terapêutico celular” refere-se a um medicamento usado para tratamento, diagnóstico, e prevenção através de uma série de ações, como proliferar e rastrear células vivas autólogas, alogênicas, e xenogênicas in vitro para restaurar funções de células e tecidos ou alterar as características biológicas das células por outros métodos.
Os agentes terapêuticos celulares foram regulamentados como produtos médicos desde 1993 nos EUA e 2002 na Coréia. Esses agentes terapêuticos celulares podem ser amplamente classificados em dois campos, que são, primeiro, agentes terapêuticos celulares para regeneração de tecido ou recuperação de funções de órgãos, e segundo, agentes terapêuticos celulares imunes para regulação de respostas imunes, como inibição da resposta imune ou aumento da resposta imune in vivo.
[078] Uma via de administração de composições terapêuticas celulares descritas no presente documento pode ser qualquer via adequada, desde que a composição atinja um tecido alvo. A administração pode ser administração parentérica, por exemplo, administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração intramuscular, administração subcutânea, ou administração intradérmica, mas não limitada a ela.
[079] A composição terapêutica celular descrita no presente documento pode ser formulada em uma forma adequada juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável adequado ou geralmente usado para terapia celular. O “farmaceuticamente aceitável” refere-se a uma composição que é fisiologicamente aceitável e geralmente não causa uma reação alérgica, como distúrbios gastrointestinais, tonturas, ou semelhantes, ou reações semelhantes, quando administrada ao corpo humano. O transportador farmaceuticamente aceitável pode incluir, por exemplo,
administração parentérica como água, óleos adequados, solução salina, glicose aquosa e glicol, e semelhantes, e inclui adicionalmente estabilizadores e conservantes. O estabilizador adequado inclui um antioxidante como hidrogenossulfito de sódio, sulfito de sódio ou ácido ascórbico, sacarose, albumina, ou semelhante. O conservante adequado inclui DMSO, glicerol, etileno glicol, sacarose, trealose, dextrose, polivinilpirrolidona ou semelhantes.
[080] A composição terapêutica celular também pode ser administrada por qualquer dispositivo no qual o agente terapêutico celular possa se mover para a célula alvo.
[081] A composição terapêutica celular pode incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz de agente terapêutico celular para tratamento de doenças. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade de um ingrediente ativo ou uma composição terapêutica celular que induz respostas biológicas ou médicas em sistemas de tecidos, animais, ou humanos que são considerados por pesquisadores, veterinários, médicos ou outros clínicos, e inclui uma quantidade de alívio indutor de sintomas de doenças ou distúrbios a serem tratados. Será evidente para os especialistas no assunto da técnica que o agente terapêutico celular incluído na composição terapêutica celular pode ser alterado e acordo com um efeito desejado. Portanto, o conteúdo ideal do agente terapêutico celular pode ser facilmente determinado pelos especialistas no assunto da técnica, e pode ser ajustado de acordo com vários fatores, que inclui um tipo de doença, gravidade da doença, conteúdo de outros ingredientes contidos na composição, um tipo de formulação, e uma idade, um peso, condição geral de saúde, sexo e dieta de um paciente, tempo de administração, via de administração, taxa de secreção da composição, período de tratamento, medicamentos usados simultaneamente. É importante incluir uma quantidade capaz de obter um efeito máximo por uma quantidade mínima sem efeitos colaterais, considerando todos os fatores. Por exemplo, a composição terapêutica celular pode incluir um agente terapêutico celular de 1 x 106 a 5 x 108 células por kg de peso corporal.
Método para prevenir ou tratar câncer
[082] Ademais, de acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método para prevenir ou tratar o câncer, o método compreende administrar uma composição terapêutica celular para anticâncer, que inclui células exterminadoras naturais CD56+ derivadas de sangue periférico e citocinas a um indivíduo. O termo “indivíduo” refere-se a um mamífero que é um assunto para tratamento, observação, ou teste, e de preferência, um humano. O indivíduo pode ser um paciente de câncer de sangue, câncer de estômago, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de rim, câncer de próstata ou neuroblastoma, mas não limitado a isso.
[083] Em algumas modalidades, no caso de um adulto, a composição terapêutica celular pode ser administrada uma vez a várias vezes ao dia. A composição terapêutica celular pode ser administrada todos os dias ou em um intervalo de 2 a 180. O agente terapêutico celular incluído na composição pode incluir 1 x 106 a 1 x 1011 células exterminadoras naturais CD56+ derivadas de sangue periférico, por exemplo, cerca de 1 x 106 a 1 x 108 células NK por kg de peso corporal. Em algumas modalidades, as células exterminadoras naturais CD56+ derivadas de sangue periférico na composição terapêutica celular são pelo menos cerca de 90% puras. Em algumas modalidades, a citocina é IL-2 em uma concentração que varia de cerca de 50 a 50.000 IU/ml.
[084] Em algumas modalidades, a composição terapêutica celular da presente invenção pode ser administrada por qualquer método adequado, como administração através de uma via retal, intravenosa, intra- arterial, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal, percutânea, tópica, intraocular, ou intradérmica. Em algumas modalidades, as células NK incluídas na composição podem ser alogênicas, isto é, obtidas de uma pessoa que não seja o indivíduo a ser tratado. Em algumas modalidades, a pessoa pode ser uma pessoa normal ou um paciente com câncer. Em algumas modalidades, as células NK incluídas na composição podem ser autólogas, isto é, obtidas de um indivíduo a ser tratado.
[085] Em algumas modalidades, as células NK reveladas no presente documento e a composição terapêutica celular que inclui as células NK reveladas no presente documento podem ser usadas para o tratamento de doenças ou outras condições diferentes do câncer. Foi relatado que as células NK desempenham um importante papel na regulação do sistema imunológico, por exemplo, através da regulação de células T, assim, a composição terapêutica celular que tem as células NK podem ser administradas para tratar condições associadas ao sistema imunológico. Por exemplo, a composição terapêutica celular pode ser administrada para tratar distúrbios neurodegenerativos (por exemplo, doença de Alzheimer e doença de Parkinson) ou doenças autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide, esclerose múltipla, psoríase, espondiloartropatias, LES, síndrome de Sjogren, esclerose sistêmica).
Efeitos vantajosos
[086] Os recursos e vantagens da presente invenção estão resumidos a seguir:
[087] (a) A presente invenção refere-se a um método de produção de células exterminadoras naturais.
[088] (b) De acordo com o método de produção de células exterminadoras naturais, uma vez que as células exterminadoras naturais de alta pureza nas quais as células T e semelhantes são removidas podem ser produzidas sem o uso de várias citocinas caras, é possível aumentar um efeito de prevenção e tratamento de câncer, particularmente, terapia alogênica usando as células exterminadoras naturais.
[089] (c) A presente invenção refere-se a uma composição terapêutica celular para anticâncer que compreende células CD56+ NK derivadas de sangue periférico e citocinas.
[090] (d) A composição da presente invenção inclui células exterminadoras naturais de alta pureza com células T mínimas (por exemplo, inferiores a cerca de 1%), e assim, a composição pode ser efetivamente usada para a terapia alogênica, bem como a terapia autóloga.
Exemplos
[091] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar certos recursos específicos e/ou modalidades.
Estes exemplos não devem ser interpretados para limitar a revelação aos recursos específicos ou modalidades descritas.
Exemplo 1. Produção de células exterminadoras naturais
CD56+ (NK)
[092] As células CD56+ e células CD3-/CD56+ foram isoladas das PBMCs pelo método a seguir. Primeiro, as PBMCs foram isoladas do sangue usando um método de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque e em seguida, as células foram contadas.
Exemplo 1-1. Preparação para a produção de células CD56+
[093] As PBMCs contadas foram adicionadas com um tampão MACS (1x PBS+0,5% HSA) e suspensas, e adicionadas com microesferas CD56 (Miltenyi Biotec) para serem de 1 para 20 µl por 1,0 x 107 PBMCs, e em seguida, incubadas a 2 a 8 °C por 5 a 30 minutos. Após a incubação, o tampão MACS foi adicionado e misturado, e em seguida, a mistura foi centrifugada (600 x g) para precipitar as células. Após a centrifugação, um sobrenadante foi removido, e as células foram suspensas adicionando-se o tampão MACS e adicionadas em uma coluna conectada a um separador MACS. O tampão MACS passou através da coluna para remover a ligação não específica. A coluna foi separada do separador MACS e transferida para um tubo cônico de 15 ml, e em seguida, adicionada com o tampão MACS para isolar as células CD56+ ligadas à coluna.
Exemplo 1-2. Preparação para a produção de células CD3-/CD56 +
[094] As PBMCs contadas foram adicionadas com um tampão MACS (1x PBS±0,5% HSA) e suspensas, e adicionadas com microesferas CD3 (Miltenyi Biotec) para serem de 1 a 20 µl por 1,0 x 107 PBMCs, e em seguida, incubadas a 2 a 8 °C por 5 a 30 minutos.
Após a incubação, o tampão MACS foi adicionado e misturado, e em seguida, a mistura foi centrifugada (600 x g) para precipitar as células.
Após a centrifugação, um sobrenadante foi removido, e as células foram suspensas adicionando-se o tampão MACS e adicionadas em uma coluna conectada a um separador MACS.
O tampão MACS passou através da coluna para coletar as células CD3. As células CD3 coletadas foram adicionadas com um tampão MACS
(1x PBS+0,5% HSA) e suspensas, e adicionadas com microesferas CD56 (Miltenyi Biotec) para serem de 1 a 20 µl por 1,0 x 107 células CD3, e em seguida, em 2 a 8 °C por 5 a 30 minutos.
Após a incubação, o tampão MACS foi adicionado e misturado, e em seguida, a mistura foi centrifugada (600 x g) para precipitar as células.
Após a centrifugação, um sobrenadante foi removido, e as células foram suspensas adicionando-se o tampão MACS e adicionadas em uma coluna conectada a um separador MACS.
O tampão MACS passou através da coluna para remover a ligação não específica.
A coluna foi separada do separador MACS e transferida para um tubo cônico de 15 ml, e em seguida,
adicionada com o tampão MACS para isolar as células CD3- /CD56+ ligadas à coluna.
Exemplo 1-3. Produção de células NK usando as células CD56+ e células CD3-/CD56+
[095] As células CD56+ ou as células CD3-/CD56+ isoladas das PBMCs como nos Exemplos 1-1 e 1-2 foram adicionadas em um meio RPMI-1640 que contém FBS 10% adicionado com IL-2 a uma concentração de 500 IU/ml juntamente com combinação preparada de células alimentadoras (células Jurkat e células EBV-LCL) irradiadas com radiação 100 Gy e em seguida, cocultivadas em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2. A proporção de (células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+):(células Jurkat):(células EBV-LCL) foi cerca de 1:30:30.
[096] Enquanto isso, as células Jurkat podem ser obtidas da ATCC (ATCC TIB-152), e as células EBV-LCL foram preparadas pelo seguinte método: 30 x 106 PBMCs foram adicionados em 9 ml de um meio de cultura, a mistura foi adicionada em um balão de cultura T 25, e em seguida, 9 m de um sobrenadante de EVB foi adicionado. 80 µl de ciclosporina A foi adicionada e em seguida, cultivados a 37 °C. Após 7 dias de cultura, uma metade do sobrenadante foi removido, um meio de cultura fresco foi adicionado, e em seguida, 40 µl de ciclosporina A foi adicionada. O mesmo processo do 7º dia foi repetido a cada 7 duas até 28 dias de cultura. A linha de célula foi utilizável após 28 dias de cultura, e a partir desse momento, a linha de célula foi cultivada no meio de cultura sem adição de ciclosporina A.
Exemplo 2. Produção de células exterminadoras naturais CD56+ (NK) (IL-2/IL-21 tratadas)
[097] As células NK foram produzidas usando o mesmo método do Exemplo 1 (1-1 a 1-3), exceto para adicionar IL-2 (500 IU/ml) e IL-21 (50ng/ml) em vez de IL-2 (500 IU/ml).
Exemplo Comparativo 1. Produção de células exterminadoras naturais (NK) sem a etapa de isolamento das células CD56+ (IL-2 tratada)
[098] As PBMCs foram isoladas do sangue usando um método de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. As PBMCs foram adicionadas em um meio RPMI-1640 que contém FBS 10% adicionado com IL-2 em uma concentração de 500 IU/ml junto com células alimentadoras preparadas (células Jurkat e células EBV-LCL) irradiadas com radiação 100 Gy e, em seguida, cocultivadas em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2.
Exemplo Comparativo 2. Produção de células exterminadoras naturais (NK) sem a etapa de isolamento das células CD56+ (IL-2/IL-21 tratadas)
[099] As células NK foram produzidas usando o mesmo método do Exemplo Comparativo 1, exceto para adicionar IL-2 (500 IU/ml) e IL-21 (50 ng/ml) em vez de IL- 2 (500 IU/ml).
Exemplos Comparativos 3&4. Produção de células exterminadoras naturais (NK) sem a etapa de isolamento das células CD56+
[100] As células NK foram produzidas usando métodos semelhantes de Exemplos Comparativos 1&2, respectivamente, exceto para que uma proporção de PBMC: (células Jurkat): (células EBV-LCL) era de 1:0.5:0.5.
Exemplo Experimental 1. Confirmação de capacidade de proliferação de células NK
[101] Em relação a cada uma das células NK cultivadas em uma incubadora de CO2, de acordo com Exemplos 1, 2 e Exemplos Comparativos 1, 2, no Dia 6 da cultura em um balão T 25, as células foram inoculadas em um saco de 350 ml com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e adicionalmente cultivadas por 4 dias. No Dia 10 da cultura, as células foram inoculadas foram inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivada por 4 dias. Finalmente, no Dia 14 da cultura, as células foram inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por mais 3 a 6 dias.
[102] A Figura 1A ilustra o aumento de vezes das células NK durante a cultura. Conforme ilustrado na Figura 1A e Tabela 1 abaixo, as células CD56+ NK (CD56+ e CD3- /CD56+) do Exemplo 1 foram proliferadas 2.675 e 1.903 vezes, respectivamente, no Dia 17 em comparação com o Dia 0, enquanto as PBMC células do Exemplo Comparativo 1 foram proliferadas 1.768 vezes no Dia 17 em comparação com o Dia
0.
Tabela 1 Vezes de Expansão DIA 0 DIA 6 DIA 10 DIA 14 DIA 17 PBMC 1 2 52 608 1.768 CD56+ 1 8 188 1.311 2.675 CD3-/CD56+ 1 6 142 966 1.903
[103] A Figura 1B ilustra o aumento de vezes e o nível de duplicação da população (PDL) de células NK. Além disso, conforme ilustrado na Figura 1B, as PBMCs do Exemplo Comparativo 1 (PBMC sem IL-21) e Exemplo Comparativo 2 (PBMC com IL-21) foram proliferados 243 e 1.248 vezes, respectivamente, em comparação com o Dia 0, enquanto as células CD56+ NK do Exemplo 1 (CD56 w/o IL-21) e Exemplo 2 (CD56 w/ IL-21) foram proliferados 2.990 e 20.434 vezes, respectivamente, em comparação com o Dia 0.
Exemplo Experimental 2. Confirmação de pureza das células CD56+ NK
[104] As células NK dos Exemplos 1, 2 e Exemplos
Comparativos 1, 2 foram lavadas uma vez com um tampão de coloração FACS e suspensas em 100 µl, e, em seguida, armazenadas de 2 a 8 °C por 20 a 30 minutos em uma condição escura após mistura com um anticorpo monoclonal que se liga à fluorescência. Após uma lavagem adicional, as células foram suspensas em 300 a 500 µl do tampão de coloração FACS e, em seguida, 10.000 a 100.000 células por tubo foram obtidas e analisadas usando um CD56-FITC/CD3-PE/CD20- PerCP5/CD14-APC painel de um citômetro de fluxo. A pureza das células CD56+ NK foi definida como uma proporção de células introduzidas em uma região CD3-/CD56+ após o bloqueio do FSC/SSC, e foi ainda confirmado que CD20 e CD14 não eram expressos nas células da região CD3-/CD56+.
[105] Conforme ilustrado na Figura 2, a pureza das células NK do Exemplo Comparativo 1 (PBMCs sem IL-21) e Exemplo Comparativo 2 (PBMCs com IL-21) foi de 84,2% e 84,7%, respectivamente, enquanto a pureza das células NK do Exemplo 1 (CD56 sem IL-21) e Exemplo 2 (CD56 com IL-21) foi de 98,6% e 99,2%, respectivamente.
Exemplo Experimental 3. Confirmação da citotoxicidade das células cancerígenas de células NK
[106] Primeiro, a citotoxicidade contra células K562 (câncer de sangue, ATCC® CCL-243™), uma linha de célula de leucemia mieloide crônica foi confirmada.
[107] Antes de serem usadas no experimento, as células K562 foram preparadas subcutivando células K562 suspensas em um meio RPMI 1640 que contém FBS 10%, a 37±1 °C em um intervalo de três dias, por 7 dias ou mais.
[108] As células K562 preparadas foram suspensas no meio RPMI-1640 em uma concentração de 1,0 x 106 células/ml, e adicionadas com um material fluorescente (Calcein-AM) em uma concentração de 4 µM. As células K562 foram coradas a 37±1 °C por 30 minutos, e, em seguida, invertidas em um intervalo de dez minutos. As células K562 coradas com o material fluorescente foram centrifugadas a
3.300 rpm por 3 minutos, lavadas três vezes, e, em seguida, suspensas em um meio SNK que contém FBS 10%, na proporção de 1,0 x 106 células/ml. As células K562 foram inoculadas em uma placa de micropoços de fundo redondo (96 poços) em uma quantidade de 1,0 x 104 células por poço.
[109] As células NK do Exemplo Experimental 1 (células efetoras) nos 14º ao 20º dias de cultura foram suspensas e diluídas em um meio RPMI-1640 que contém FBS 10% em proporções de 1,0 x 106 células/ml, 3,0 x 105 células/ml, 1,0 x 105 células/ml e 0,5 x 105 células/ml, respectivamente.
[110] As células efetoras diluídas foram inoculadas na placa inoculada com as células alvo (as células K562) a uma concentração de 100 µl por poço três poços cada (triplicação), respectivamente. Nesse caso, as proporções das células efetoras e as células alvo são mostradas na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2 Efetor:Alvo Células efetoras Células alvo 10 : 1 1,0 x 105 1,0 x 104 3 : 1 3,0 x 104 1,0 x 104 1: 1 1,0 x 104 1,0 x 104 0,5 : 1 0,5 x 104 1,0 x 104
[111] O projeto da placa usado no presente experimento é mostrado na Figura 3, em um grupo controle negativo (espontâneo), células K562 vivas coradas por fluorescência foram adicionadas e, em um grupo controle positivo (liberação máxima), as células K562 foram completamente mortas usando TX-100 e apresentaram uma fluorescência máxima.
[112] A placa inoculada com as células alvo e as células efetoras foram centrifugadas a 1.000 rpm por 5 minutos, cultivada a 37±1 °C por 3 a 4 horas, e, em seguida, centrifugada novamente a 1.000 rpm por 5 minutos.
Após a centrifugação, 80 µl de um sobrenadante foram transferidos para uma placa preta (96 poços), e, em seguida, uma quantidade de fluorescência foi medida usando um leitor de microplacas e a citotoxicidade contra células cancerígenas foi calculada usando a Equação 1 abaixo.
Equação 1 +,-./0çã3 4.56. − +,-./0çã3 8593:6â:.0 Citotoxidade = @ 100 +,-./0çã3 <á>,?0 − +,-./0çã3 8593:6â:.0
[113] A Figura 4A e Tabela 3 abaixo mostram % de lise de células K562 em várias proporções E:T. Conforme ilustrado na Figura 4A e Tabela 3 abaixo, em comparação com o Exemplo Comparativo 3 (PBMCs sem IL-21) e Exemplo Comparativo 4 (PBMCs com IL-21), as células CD56+ cultivadas de acordo com o Exemplo 1 (CD56+ sem IL-21) e Exemplo 2 (CD56+ com IL-21) apresentaram maior atividade anticâncer.
Tabela 3 % de lise E:T E:T E:T (3:1) E:T (1:1) (10:1) (0,5:1) PBMC(SEM IL-21) 97,5 94,6 75,3 60,0 PBMC(COM IL-21) 102,3 97,1 84,8 66,9 CD56+(SEM IL-21) 103,3 99,9 83,8 67,4 CD56+(COM IL-21) 102,9 100,7 87,7 80,0
[114] Em seguida, a citotoxicidade contra células tumorais sólidas, que são conhecidas por ter maior tolerância contra células NK, é confirmada. AGS (câncer de estômago, ATCC® CRL-1739™), A549 (câncer de pulmão, ATCC® CRL-185™), e MDA-MB0231 (câncer de mama, ATCC® HTB-26™) foram usados como linhas celulares tumorais sólidas.
[115] Cada célula tumoral sólida foi marcada com marcador verde fluorescente usando o kit rastreador de longo prazo CYTO-ID® Green (Enzo Life Sciences Inc.), inoculado em uma placa, e cultivado por 24 horas. No dia seguinte, as células NK e células cancerígenas reagiram por 48 horas na proporção 0,5:1. Após 48 horas, a citotoxicidade foi confirmada medindo-se o número de células exibindo fluorescência verde usando o citômetro de fluxo.
[116] Conforme ilustrado na Figura 4B, conforme comparado com o Exemplo Comparativo 1 (PBMCs sem IL-21) e Exemplo Comparativo 2 (PBMCs com IL-21), as células CD56+ cultivadas de acordo com o Exemplo 1 (CD56+ sem IL-21) e Exemplo 2 (CD56+ com IL-21) apresentaram maior atividade anticâncer.
Exemplo Experimental 4. Comparação da capacidade proliferativa de células NK dependendo do tempo e do número de tratamento IL-21
[117] Para avaliar a capacidade proliferativa das células NK de acordo com o tempo de tratamento com IL-21, foram realizados experimentos conforme descritos abaixo.
[118] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método do Exemplo 1, mas tratado com IL-21 (50ng/ml) durante o Dia 0-6 (grupo D0-6), Dia 6-10 (grupo D6-10), Dia 10-14 (grupo D10-14), ou Dia 14-17 (grupo D-14- 17), e a capacidade proliferativa das células CD56+ NK foram comparadas usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 1.
[119] As células NK foram tratadas com IL-21: para o grupo D0-6, duas vezes, no Dia 0 e 3; para o grupo D6-10, uma vez, no Dia 6; para o grupo D10-14, uma vez, no Dia 10; para o grupo D14-17, uma vez, no Dia 14. Para um grupo controle, as células NK não foram tratadas com IL-21.
[120] Conforme mostrado na Figura 5A e Tabela 4, o grupo D10-14 e o grupo D14-17 não apresentaram diferenças significativas na capacidade proliferativa em comparação com o grupo controle, enquanto o grupo D0-6 e o grupo D6-10 apresentaram capacidade de proliferação aumentada em comparação com o grupo de controle. Especialmente, o grupo D0-6 apresentou o maior aumento de vezes de expansão.
Tabela 4 Vezes de Expansão contro D0-6 D6-10 D10-14 D14-17 le Doador 1 2.996 21.859 6.388 2.894 2.330
[121] Para avaliar a capacidade proliferativa de células NK de acordo com o número de tratamentos IL-21, foram realizados experimentos como descrito abaixo.
[122] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método do Exemplo 1, mas tratadas com IL-21 (50 ng/ml) durante o Dia 0-3 (grupo D0-3), Dia 3-6 (grupo
D3-6), ou Dia 0-6 (grupo D0-6), e a capacidade proliferativa das células CD56+ NK foi comparada usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 1.
[123] As células NK foram tratadas com IL-21: para o grupo D0-3, uma vez, no Dia 0; para o grupo D3-6, uma vez, no Dia 3; para o grupo D0-6, duas vezes, no Dia 0 e 3.
Para um grupo controle, as células NK não foram tratadas com IL-21.
[124] Conforme mostrado na Figura 5B e Tabela 5, todo grupo com tratamento com IL-21 durante o estágio inicial da cultura apresentou aumento de vezes de expansão em comparação com o grupo controle. Especialmente, D0-6 apresentou maior aumento de vezes de expansão.
Tabela 5 Vezes de Expansão controle D0-3 D3-6 D0-6 Doador 1 2.996 16.420 4.360 21.859 Exemplo Experimental 5. Comparação da capacidade proliferativa de células NK dependendo da concentração do tratamento com IL-21
[125] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método do Exemplo 1, mas tratadas com IL-21 com uma concentração de 0 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml, 50 ng/ml ou 100 ng/ml duas vezes, e a capacidade proliferativa das células CD56+ NK foi comparada usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 1.
[126] Conforme mostrado na Figura 6, mesmo quando tratadas com IL-21 com uma concentração de 10 ng/ml, as células NK apresentaram maior número de vezes de expansão em comparação com as células NK sem tratamento IL-21, e o número de vezes de expansão das células NK aumentou à medida que a concentração de IL-21 aumenta entre 10 ng/ml- 50 ng/ml. No entanto, quando tratadas com IL-21 com uma concentração de 100 ng/ml, as células NK não apresentaram diferenças significativas na expansão das células NK tratadas com IL-21 com uma concentração de 50 ng/ml.
Exemplo Experimental 6. Comparação da citotoxicidade de células NK dependendo no tempo e do número de tratamento com IL-21
[127] Para avaliar a citotoxicidade de células NK contra células cancerígenas de acordo com o tempo do tratamento com IL-21, foram realizados experimentos conforme descrito abaixo.
[128] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método do Exemplo 1, mas tratadas com IL-21 (50ng/ml) durante o Dia 0-6 (grupo D0-6), Dia 6-10 (grupo D6-10), Dia 10-14 (grupo D10-14), ou Dia 14-17 (grupo D-14- 17), e a citotoxicidade das células CD56+ NK contra células cancerígenas do sangue (células K562, CCL-243™) foram comparadas usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 3.
[129] As células NK foram tratadas com IL-21: para o grupo D0-6, duas vezes, no Dia 0 e 3; para o grupo D6-10, uma vez, no Dia 6; para o grupo D10-14, uma vez, no Dia 10; para o grupo D14-17, uma vez, no Dia 14. Para um grupo controle, as células NK não foram tratadas IL-21.
[130] Conforme mostrado na Figura 7A e Tabela 6, todos os grupos de células NK com tratamento com IL-21, exceto o grupo D14-17, apresentou maior atividade anticâncer em comparação com o grupo controle.
Tabela 6 Proporção E:T 10:1 3:1 1:1 0,5:1 Controle (Sem 98,8 96,9 73,1 55,1 tratar) D0-6 98,6 97,0 77,8 68,4 D6-10 96,78 99,1 80,3 69,8 D10-14 98,4 96,6 68,5 52,4 D14-17 104,5 98,8 79,1 68,8
[131] Além disso, para cada um dos grupos produzidos de células CD56+ NK, a citotoxicidade das células CD56+ NK contra células tumorais sólidas foram comparadas usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 3. AGS (câncer de estômago, ATCC® CRL-1739™), A549 (câncer de pulmão, ATCC® CRL-185™), e MDA-MB0231
(câncer de mama, ATCC® HTB-26™) foram usadas como linhas celulares tumorais sólidas.
[132] Conforme mostrado na Figura 7B, as células NK com tratamento com IL-21 durante um estágio anterior da cultura (o grupo D0-6) apresentou a maior atividade anticâncer contra todos os três tipos de células tumorais sólidas.
[133] Para avaliar a citotoxicidade das células NK de acordo com o número de tratamentos com IL-21, foram realizados experimentos conforme descrito abaixo.
[134] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método do Exemplo 1, mas tratadas com IL-21 (50 ng/ml) durante o Dia 0-3 (grupo D0-3), Dia 3-6 (grupo D3-6), ou Dia 0-6 (grupo D0-6), e a citotoxicidade das células CD56+ NK contra células tumorais sólidas foi comparada usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 3. AGS (câncer de estômago, ATCC® CRL-1739™), A549 (câncer de pulmão, ATCC® CRL-185™), e MDA-MB0231 (câncer de mama, ATCC® HTB-26™) foram usados como linhas celulares tumorais sólidas.
[135] As células NK foram tratadas com IL-21: para o grupo D0-3, uma vez, no Dia 0; para o grupo D3-6, uma vez, no Dia 3; para o grupo D0-6, duas vezes, no Dia 0 e 3.
Para um grupo controle, as células NK não foram tratadas com IL-21.
[136] Conforme mostrado na Figura 7C, todos os grupos com tratamento IL-21 durante os estágios anteriores da cultura apresentaram maior atividade anticâncer em comparação com o grupo controle.
Exemplo Experimental 7. Comparação de citotoxicidade de células NK dependendo da concentração de tratamento com IL-21
[137] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método do Exemplo 1, mas tratado com IL-21 com a concentração de 0 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml, 50 ng/ml ou 100 ng/ml duas vezes, e a citotoxicidade das células CD56+ NK contra células cancerígenas do sangue (células K562, CCL-243™) foi comparada usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 3.
[138] Conforme mostrado na Figura 8A, a maioria das células NK tratadas com IL-21 apresentou maior citotoxicidade em comparação com as células NK com nenhum tratamento IL-21, quando tratada com IL-21 com a concentração de 100 ng/ml, as células NK não apresentaram diferenças significativas na expansão das células NK não tratadas com IL-21.
[139] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método do Exemplo 1, mas tratadas com IL-21 com a concentração de 0 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml, 50 ng/ml ou 100 ng/ml duas vezes, e a citotoxicidade das células
CD56+ NK contra células tumorais sólidas (células K562, CCL-243™) foram comparadas usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 3. AGS (câncer de estômago, ATCC® CRL- 1739™), A549 (câncer de pulmão, ATCC® CRL-185™), e MDA- MB0231 (câncer de mama, ATCC® HTB-26™) foram usadas como linhas celulares tumorais sólidas.
[140] Conforme mostrado na Figura 8B, as células NK tratadas com IL-21 com a concentração de 50 ng/ml apresentou a maior atividade anticâncer.
Exemplo Experimental 8. Comparação da atividade proliferativa de células NK dependendo do número de tratamento de células alimentadoras
[141] Para analisar se múltiplos tratamentos com células alimentadoras sustentariam a proliferação de células NK, as células NK durante a cultura foram tratadas com células alimentadoras em um intervalo de 14 dias, e a expansão de células NK foi monitorada por 42 dias.
[142] Para analisar melhor o aumento da expansão das células NK dependendo do tratamento IL-21, as células NK foram tratadas com IL-21 (50 ng/ml) duas vezes no intervalo de 3 dias, durante um período de seis dias de cada tratamento com células alimentadoras (Dia 0-6, 14-20, 28-34).
[143] Conforme mostrado na Figura 9, quando tratadas com células alimentadoras duas vezes ou mais e IL-
21 juntas, as células NK apresentaram vezes de expansão significativamente aumentadas, e as células NK tratadas com IL-21 apresentaram maior número de vezes de expansão no Dia 42, em comparação com as células NK não tratadas com IL-21 (aproximadamente 3,4x1010 vs. aproximadamente 5,3x108).
Exemplo Experimental 9. Confirmação do efeito da cultura de células NK usando sangue de certos pacientes com câncer
[144] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método do Exemplo 1 por 17 dias, exceto que foram usados PBMCs de pacientes com câncer colorretal. A capacidade proliferativa e a pureza das células NK produzidas foram medidas usando métodos de acordo com os Exemplos Experimentais 1 e 2.
[145] Para alguns grupos, as células NK foram tratadas com IL-21 com a concentração de 50 ng/ml duas vezes (Dia 0 e Dia 3 da cultura), para confirmar o efeito do tratamento com IL-21.
[146] Conforme ilustrado na Figura 10A, o número das células NK não tratadas com IL-21 aumentou 8 vezes desde o Dia 0, enquanto quando tratado com IL-21, o número das células NK aumentou 1.461 vezes desde o Dia 0.
[147] Ademais, conforme ilustrado na Figura 10B, a pureza das células NK não tratadas com IL-21 foi apenas 84,2%, enquanto quando tratada com IL-21, a pureza das células NK foi 99,19%.
[148] Ademais, a citotoxicidade das células NK tratadas com IL-21, e células NK não tratadas com IL-21 contra células cancerígenas do sangue (células K562, CCL- 243™) foram comparadas usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 3. Conforme ilustrado na Figura 10C, as células NK tratadas com IL-21 apresentaram maior atividade anticâncer em comparação com as células NK não tratadas com IL-21.
[149] Também, adicionalmente, para cada uma das células NK tratadas com IL-21, e células NK não tratadas com IL-21, a citotoxicidade das células NK contra células tumorais sólidas foi comparada usando o método de acordo com o Exemplo Experimental 3. AGS (câncer de estômago, ATCC® CRL-1739™), A549 (câncer de pulmão, ATCC® CRL-185™), e MDA-MB-231 (câncer de mama, ATCC® HTB-26™) foram usados como linhas celulares tumorais sólidas. Conforme ilustrado na Figura 10D, as células NK tratadas com IL-21 apresentara, maior atividade anticâncer em comparação com as células NK não tratadas com IL-21.
[150] Consequentemente, ao usar métodos conforme estabelecidos no presente documento, pode ser possível produzir células NK mesmo para certos pacientes com câncer que geralmente não mostram um crescimento suficiente de células NK.
Exemplo Experimental 10. Confirmação da taxa de sobrevivência de células NK na composição terapêutica
[151] Em relação a cada uma das células NK cultivadas em uma incubadora de CO2 de acordo com os Exemplos 1, 2 no Dia 6 da cultura, as células foram inoculadas em um saco de 350 ml com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e adicionalmente cultivadas por 4 dias. No Dia 10 da cultura, as células foram inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por 4 dias. Finalmente, no Dia 14 da cultura, as células foram inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por mais 3 a 6 dias.
[152] As células CD56+ NK no 14º ao 20º dias de cultura foram lavadas três vezes e, em seguida, suspensas em um composto base (solução salina fisiológica e solução de Barman) que contém albumina a 1% para ser de 2 x 107 /ml. As células foram armazenadas a 4 °C por 48 horas e, em seguida, a taxa de sobrevivência celular foi medida.
[153] Ademais, a fim de comparar o efeito de IL-2, as células CD56+ NK foram lavadas e suspensas em um composto base que contém albumina a 1% (solução salina fisiológica e solução de Hartmann ou solução salina tamponada com fosfato), e, em seguida, adicionadas com IL-2 a uma concentração de 500 IU/ml. Após ser mantida em 4 ˚C por 48 horas, a taxa de sobrevivência celular foi medida.
[154] Foram tomados 100 µl de cada composição para obter um total de 2 x 106 células CD56+ NK, lavadas uma vez com 1 ml do tampão de coloração FACS, centrifugadas e suspensas em 100 µl de um tampão de ligação à anexina V.
Foram adicionados 5 µl de Anexina V-FITC e 5 µl de 7-AAD (Biolegend) na suspensão e misturadas bem, armazenados em uma condição escura, e reagiram à temperatura ambiente por 15 minutos, e, em seguida, adicionados com 400 µl de um tampão de ligação à Anexina V antes da citometria de fluxo e misturada por 5 segundos. Depois disso, 10.000 a 100.000 células por tubo foram obtidas e analisadas. Um ponto de corte foi determinado pela coloração de um tubo de ensaio que não foi corado com a Anexina V-FITC e a 7-AAD como controle negativo, e a taxa de sobrevivência foi representada por uma porcentagem da fração de células nas quais a Anexina V-FITC ou a 7-AAD foi negativo.
[155] Conforme ilustrado na Figura 11, quando tratada IL-2 (com IL2), a apoptose das células CD56+ NK foi inibida.
Exemplo Experimental 11. Confirmação da citotoxicidade de células NK na composição terapêutica
[156] Em relação a cada uma das células NK cultivadas em uma incubadora de CO2 de acordo com os Exemplos 1, 2 no Dia 6 da cultura, as células foram inoculadas em um saco de 350 ml com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e adicionalmente cultivadas por 4 dias. No Dia 10 da cultura, as células foram inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivada por 4 dias. Finalmente, no Dia 14 da cultura, as células foram inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivada por 3 a 6 dias.
[157] Antes de serem usadas no experimento, as linhas de células cancerígenas foram preparadas suspendendo-se nas seguintes condições, e subcultivando-se a 37±1 °C a um intervalo de três dias por 1 semana ou mais:
[158] CCRF-SB (câncer de sangue, ATCC® CCL-120™), AGS (câncer de estômago, ATCC® CRL-1739™) e MIA-PACA2 (câncer de pâncreas, ATCC® CRL-1420™): meio RPMI + 10% FBS,
[159] SNU245 (colangiocarcinoma, KCLB No. 00245), HCT15 (câncer colorretal, ATCC® CCL-225™) e NIH:OVCAR-3 (câncer de ovário, ATCC® HTB-161™): meio RPMI + 10% FBS + 25 mM HEPES, e
[160] MDA-MB-231 (câncer de mama, ATCC® HTB-26™): meio DMEM + 10% FBS.
[161] As linhas de células cancerígenas (exceto para uma linha de célula de câncer de sangue) durante a cultura foram destacadas de um placa de cultura usando tripsina e suspensas no meio para ser de 5 x 104/ml, e, em seguida, inoculadas em uma placa de 24 poços por 1 ml por poço e anexado por um dia. Para distinguir das células NK, as linhas de células de câncer de sangue, que era uma célula de cultura suspensa, foi marcada com fluorescência verde, suspensa no meio para ser de 5 x 104/ml, e inoculada em uma placa de 24 poços por 1 ml por poço.
[162] Primeiro, em uma placa de 24 poços inoculada com AGS (câncer de estômago, ATCC® CRL-1739™), MIA-PACA2 (câncer de pâncreas, ATCC® CRL-1420™), SNU245 (colangiocarcinoma, KCLB Nº. 00245), HCT15 (câncer colorretal, ATCC® CCL-225™) e MDA-MB-231 (câncer de mama, ATCC® HTB-26™) entre as linhas de células cancerígenas, as células CD56+ NK foram adicionadas após um dia para observar a citotoxicidade, e proporções de células efetoras (células CD56+ NK) e células alvo (linhas de células cancerígenas) são mostradas na Tabela 7 abaixo.
Tabela 7 Efetor: Alvo Célula Efetora Célula Alvo 0 : 1 0 5 x 104 1 : 1 5 x 104 5 x 104 1 : 10 5 x 103 5 x 104
1 : 20 2,5 x 103 5 x 104
[163] A placa inoculada com as células efetoras e as células alvo foram cultivadas a 37±1 °C por 1 a 3 dias, e, nesse momento, a fim de observar se a atividade anticâncer é aumentada por IL-2, 500 IU/ml de IL-2 foi adicionalmente adicionado a um grupo experimental. Em um grupo controle negativo, as células CD56+ NK (células efetoras) não foram adicionadas e não houve reação de atividade anticâncer.
[164] Após 1 a 3 dias de cultura, as células foram lavadas com RPMI três vezes para remover as células CD56+ NK presentes na forma suspensa, e, em seguida, as linhas de células cancerígenas remanescentes nos poços foram destacadas usando tripsina, corada com azul de tripano e contada. Subsequentemente, a placa inoculada com as células alvo e as células efetoras foram cultivadas a 37±1 °C para 1 a 3 dias, e, as células marcadas com fluorescência verde presente nos 24 poços foram contadas usando um citômetro de fluxo.
[165] A citotoxicidade para as linhas de células cancerígenas foi calculada usando a Equação 2 abaixo.
Equação 2
Citotoxidade :ú?./3 ?éE,3 E. FGH3/.5Iê:I,0 + IéGHG05 .? 93ç35 I3? IéGHG05 LM = @ 100 :ú?./3 ?éE,3 E. FGH3/.5Iê:I,0 + IéGHG05 .? 93ç35 09.:05 I3? IéGHG05 0GN3
[166] Como resultado, conforme ilustrado na Figura 12, foi confirmado que a citotoxicidade das células cancerígenas foi aumentada quando IL-2 foi tratada juntamente (com IL2), em comparação a quando apenas as células CD56+ NK foram tratadas (sem IL2).
[167] Em seguida, as células CD56+ NK foram adicionadas na placa de 24 poços às quais células NIH:OVCAR-3 (câncer de ovário, ATCC® HTB-161™) foram conectadas entre as linhas de células cancerígenas para observar a citotoxicidade, e proporções de células alvo (linhas de células cancerígenas) e células efetoras (células CD56+ NK) foram mostradas na Tabela 8 abaixo.
Tabela 8 Efetor : Alvo Células efetoras Células alvo 0 : 1 0 5 x 104 1 : 1 5 x 104 5 x 104 0,1 : 1 5 x 103 5 x 104 0,05 : 1 2,5 x 103 5 x 104
[168] A placa inoculada com as células efetoras e as células alvo foram cultivadas a 37±1 °C por 1 dia, e, a fim de observar se a atividade anticâncer é aumentada por IL-2, 500 IU/ml de IL-2 foi adicionalmente adicionado a um grupo experimental. Em um grupo controle negativo, as células CD56+ NK não foram adicionadas e não houve reação de atividade anticâncer.
[169] Após 1 dia de cultura, as células foram lavadas com RPMI três vezes para remover as células CD56+ NK presentes na forma suspensa, e, em seguida, as linhas de células cancerígenas remanescentes nos poços foram fotografadas usando uma câmera.
[170] Como resultado, conforme ilustrado na Figura 13, a citotoxicidade das células cancerígenas foi aumentada quando as linhas de células cancerígenas foram tratadas juntamente com IL-2(+ IL2), em comparação a quando as linhas de células cancerígenas foram tratadas apenas com as células CD56+ NK(-IL2).
[171] Em seguida, as células CD56+ NK foram adicionadas na placa de 24 poços às quais as células AGS (câncer de estômago, ATCC® CRL-1739™) foram conectadas entre as linhas de células cancerígenas para observar a citotoxicidade, e proporções de células alvo (linhas de células cancerígenas) e células efetoras (células CD56+ NK) foram mostradas na Tabela 9 abaixo.
Tabela 9 Efetor : Alvo Células efetoras Células alvo 0: 1 0 5 x 104 1: 1 5 x 104 5 x 104
0,1: 1 5 x 103 5 x 104 0,05: 1 2,5 x 103 5 x 104
[172] A placa inoculada com as células efetoras e as células alvo foram cultivadas a 37±1 °C por 1 dia, e, a fim de observar se a atividade anticâncer é aumentada por IL-2, 500 IU/ml de IL-2 foi adicionalmente adicionado a um grupo experimental. Em um grupo controle negativo, as células CD56+ NK não foram adicionadas e não houve reação de atividade anticâncer.
[173] Após 1 dia de cultura, as células foram lavadas com RPMI três vezes para remover as células CD56+ NK presentes na forma suspensa, e, em seguida, as linhas de células cancerígenas remanescentes nos poços foram fotografadas usando uma câmera.
[174] Como resultado, conforme ilustrado na Figura 14, a citotoxicidade das células cancerígenas foi aumentada quando as linhas de células cancerígenas foram tratadas juntamente com IL-2 (+IL2), em comparação a quando as linhas de células cancerígenas foram tratadas apenas com as células CD56+ NK (-IL2).
Exemplo Experimental 12. Confirmação do efeito anticâncer de células NK em animais modelos
[175] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método dos Exemplos 1, 2 e Exemplos
Comparativos 1, 2 por 17 dias, exceto que PBMCs de pacientes com câncer colorretal são usados. Em relação a cada uma das células NK cultivadas em uma incubadora de CO2 de acordo com os Exemplos 1, 2 e Exemplos Comparativos 1, 2, no Dia 6 da cultura em um balão de cultura T 25, as células são inoculadas em um saco de 350 ml com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e adicionalmente cultivadas por 4 dias. No Dia 10 da cultura, as células foram inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por 4 dias. Finalmente, no Dia 14 da cultura, as células foram inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por 3 a 6 dias.
[176] Modelos animais de câncer humano são construídos por xenoenxerto da linha de células cancerígenas humanas em ratos. As seguintes linhas de células cancerígenas humanas são usadas: AGS (câncer de estômago), MIA-PACA2 (câncer de pâncreas), SNU245 (colangiocarcinoma), HCT15 (câncer colorretal) e NIH:OVCAR- 3 (câncer de ovário), e MDA-MB-231 (câncer de mama). Após o xenoenxerto de câncer, os ratos são agrupados aleatoriamente e marcados. O grupo controle é injetado 200 µl de solução de Hartmann na veia da cauda. O grupo tratado com células NK (+IL-2) é injetado cinco vezes com 1×107 células NK/200 µl e 500 IU/ml de IL-2 em intervalos de 2 a 3 dias a partir de uma semana após o xenoenxerto de câncer na veia da cauda. O grupo tratado com células NK (-IL-2) é injetado cinco vezes com 1×107 células NK/200 µL em intervalos de 2 a 3 dias a partir de 1 semana após o xenoenxerto de câncer na veia da cauda.
[177] Para acompanhar o crescimento do tumor, durante o período de estudo, os ratos são testados quanto ao peso corporal e volume do tumor três vezes por semana. O comprimento do eixo principal e o eixo menor são medidos usando um paquímetro e o volume do tumor é determinado de acordo com a seguinte equação (Equação 3).
Equação 3 Volume do tumor (mm3) = (comprimento do eixo principal(mm)) x (comprimento do eixo menor(mm))2 x 0,5
[178] O grupo tratado com células NK (-IL-2) apresenta uma redução no crescimento do tumor após 8 semanas de tratamento de aproximadamente 50% comparado ao grupo controle com base nas imagens de luciferase para cada tipo de câncer. O grupo tratado com células NK (+IL-2) apresenta uma redução adicional no crescimento do tumor de aproximadamente 60% comparado ao grupo controle para cada tipo de câncer.
Exemplo Experimental 13. Confirmação do efeito anticâncer de células NK em pacientes com câncer
[179] As células CD56+ NK foram produzidas de acordo com o método dos Exemplos 1, 2 e Exemplos Comparativos 1, 2 por 18 dias, exceto que são usadas PBMCs de pacientes com câncer colorretal. Em relação a cada uma das células NK cultivadas em uma incubadora de CO2 de acordo com os Exemplos 1, 2 e Exemplos Comparativos 1, 2, no Dia 6 da cultura em um balão de cultura T 25, as células são inoculadas em um saco de 350 ml com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e adicionalmente cultivadas por 4 dias. No Dia 10 de cultura, as células são inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por 4 dias. Finalmente, no Dia 14 da cultura, as células são inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por 3 a 6 dias.
[180] Os pacientes com câncer colorretal são agrupados aleatoriamente e marcados. O grupo controle não é injetado com células NK. O grupo tratado com células NK (+IL-2) é injetado três vezes com 1 a 3×107 células NK/ por kg de peso corporal e 500 IU/ml de IL-2 em intervalos de seis semanas por via intravenosa. O grupo tratado com células NK (-IL-2) é injetado seis vezes com 1 a 3×107 células NK/ por kg de peso corporal em intervalos de seis semanas por via intravenosa.
[181] O crescimento do tumor é monitorado em 1, 3, 6, 12 meses. Após 12 meses, o grupo tratado com células NK (-IL-2) apresenta diminuição geral no tamanho do tumor, e o grupo tratado com células NK (+IL-2) apresenta diminuição geral adicional no tamanho do tumor.
Exemplo Experimental 14. Confirmação do efeito anticâncer de células NK em pacientes com Doença de Alzheimer
[182] As células CD56+ NK são produzidas de acordo com o método dos Exemplos 1, 2 e Exemplos Comparativos 1, 2 por 18 dias, exceto que são usadas PBMCs de pacientes com câncer colorretal. Em relação a cada uma das células NK cultivadas em uma incubadora de CO2 de acordo com os Exemplos 1, 2 e Exemplos Comparativos 1, 2, no Dia 6 da cultura em um balão de cultura T 25, as células são inoculadas em um saco de 350 ml com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e adicionalmente cultivadas por 4 dias. No Dia 10 da cultura, as células são inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por 4 dias. Finalmente, no Dia 14 da cultura, as células são inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por 3 a 6 dias.
[183] Os pacientes com Doença de Alzheimer são agrupados aleatoriamente e marcados. O grupo controle não é injetado com células NK. O grupo tratado com células NK é injetado seis vezes com 1 a 3×107 células NK/ por kg de peso corporal e 500 IU/ml de IL-2 em intervalos semanais por via intravenosa.
[184] As funções cognitivas do paciente são monitoradas em 1, 3, 6, 12 meses. Após 12 meses, o grupo tratado com células NK apresenta uma função cognitiva melhorada.
Exemplo Experimental 15. Confirmação do efeito anticâncer de células NK em pacientes com doenças autoimunes
[185] As células CD56+ NK são produzidas de acordo com o método dos Exemplos 1, 2 e Exemplos Comparativos 1, 2 por 18 dias, exceto que são usados PBMCs de pacientes com câncer colorretal. Em relação a cada uma das células NK cultivadas em uma incubadora de CO2 de acordo com os Exemplos 1, 2 e Exemplos Comparativos 1, 2, no Dia 6 da cultura em um balão de cultura T 25, as células são inoculadas em um saco de 350 ml com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e adicionalmente cultivadas por 4 dias. No Dia 10 da cultura, as células são inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por 4 dias. Finalmente, no Dia 14 da cultura, as células são inoculadas em um saco de 1 l com base no número de células de 1,0 x 105 a 2,0 x 106 /ml e, em seguida, adicionalmente cultivadas por 3 a 6 dias.
[186] Os pacientes com esclerose múltipla são agrupados aleatoriamente e marcados. O grupo controle não é injetado com células NK. O grupo tratado com células NK é injetado seis vezes com 1 a 3×107 células NK/ por kg de peso corporal e 500 IU/ml de IL-2 em intervalos semanais por via intravenosa.
[187] As funções cognitivas dos pacientes são monitoradas em 1, 3, 6, 12 meses. Após 12 meses, o grupo tratado com células NK apresenta função cognitiva melhorada.
Terminologia
[188] A descrição anterior das modalidades exemplificativas foi apresentada apenas para fins de ilustração e descrição e não se destina a ser exaustiva ou limitar a invenção às formas precisas reveladas. Muitas modificações e variações são possíveis à luz dos ensinamentos acima. É contemplado que várias combinações ou subcombinações dos recursos específicos e aspectos das modalidades reveladas acima pode ser feita e ainda se enquadram em uma ou mais das invenções. Ademais, a revelação no presente documento de qualquer recurso específico, aspecto, método, propriedade, característica, qualidade, atributo, elemento, ou semelhante em particular com uma modalidade pode ser usada em todas as outras modalidades estabelecidas no presente documento.
Consequentemente, deve ser entendido que vários recursos e aspectos das modalidades reveladas podem ser combinados com ou substituídos um pelo outro, a fim de formar modos variados das invenções reveladas. Assim, pretende-se que o escopo da presente invenção no presente documento revelada não deva ser limitativa pelas modalidades específicas reveladas descritas acima. Além disso, enquanto a invenção seja suscetível a várias modificações, e formas alternativas, exemplos específicos da mesma foram mostrados nos desenhos e são descritos no presente documento em detalhes. Deve ser entendido, no entanto, que a invenção não deve se limitar às formas específicas ou métodos revelados, mas, pelo contrário, a invenção deve abranger todas as modificações, equivalentes, e alternativas que se enquadram no espírito e escopo das várias modalidades descritas e as reivindicações anexas. Quaisquer métodos revelados no presente documento não precisam ser realizados na ordem recitada. Os métodos revelados no presente documento incluem certas ações tomadas por um profissional; no entanto, eles também podem incluir qualquer instrução de terceiros dessas ações, expressamente ou por implicação. Os intervalos revelados no presente documento também abrangem toda e qualquer sobreposição, subintervalos, e combinações dos mesmos.
[189] As modalidades foram escolhidas e descritas a fim de explicar os princípios da invenção e sua aplicação prática, de modo a ativar outros especialistas no assunto da técnica para utilizar a invenção e várias modalidades e com várias modificações, conforme adequado ao uso particular contemplado. As modalidades alternativas se tornarão evidentes aos especialistas no assunto da técnica para os quais a invenção é definida pelas reivindicações anexas, em vez da descrição anterior e as modalidades exemplificativas descritas no presente documento.
[190] A linguagem condicional, como “pode,” “poderia,” “pode,” ou “pode,” a menos que seja especificamente indicado o contrário, ou entendido o contrário dentro do contexto usado, geralmente se destina a transmitir que certas modalidades incluem, enquanto outras modalidades não incluem, certos recursos, elementos, e/ou etapas. Assim, essa linguagem condicional geralmente não pretende implicar que recursos, elementos, e/ou etapas sejam de qualquer forma necessários para uma ou mais modalidades.
[191] Os termos “compreende,” “inclui,” “que tem,” e semelhantes são sinônimos e são usados inclusive, de forma aberta, e não excluem elementos adicionais, recursos, atos, operações, e outros itens adicionais. Além disso, o termo “ou” é usado em seu sentido inclusivo (e não em seu sentido exclusivo) de modo que, quando usado, por exemplo, para conectar uma lista de elementos, o termo “ou” significa um, alguns, ou todos elementos na lista.
[192] Os intervalos revelados no presente documento também abrangem toda e qualquer sobreposição, subintervalos, e combinações dos mesmos. Idiomas como “até,” “pelo menos,” “maior que,” “menor que,” “entre,” e semelhante incluem o número recitado.
[193] Os números precedidos por um termo como “aproximadamente”, “sobre”, e “substancialmente” conforme usado no presente documento, incluem os números recitados (por exemplo, cerca de 10% = 10%), e também representam uma quantidade próxima à quantidade declarada que ainda desempenha uma função desejada ou alcança o resultado desejado. Por exemplo, os termos “aproximadamente”, “sobre”, e “substancialmente” podem se referir a uma quantidade que esteja dentro de menos de 10% de, dentro de menos de 5% de, dentro de menos de 1% de, dentro de menos de 0,1% de, e dentro de menos de 0,01% da quantidade declarada.
[194] O termo “geralmente”, conforme usado no presente documento, representa um valor, quantidade, ou característica que inclui predominantemente ou tende a um determinado valor, quantidade, ou característica. Como exemplo, em certas modalidades, o termo “geralmente uniforme” refere-se a um valor, quantidade, ou característica que sai exatamente uniforme em menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 1%, menos de 0,1%, e menos de 0,01%.
[195] Os intervalos revelados no presente documento também abrangem toda e qualquer sobreposição, subintervalos, e combinações dos mesmos. Idiomas como “até,” “pelo menos,” “maior que,” “menor que,” “entre” e semelhantes incluem o número recitado. Os números precedidos por um termo como “sobre” ou “aproximadamente” incluem os números recitados. Por exemplo, “cerca de 5,0 cm” inclui “5,0 cm”.
[196] Algumas modalidades foram descritas em conexão com desenhos esquemáticos. No entanto, deve ser entendido que os desenhos esquemáticos não são desenhados em escala. As distâncias são meramente ilustrativas e não têm necessariamente uma relação exata com as dimensões e o layout reais dos dispositivos ilustrados.
[197] Para os fins desta revelação, certos aspectos, vantagens, e novos recursos são descritos no presente documento. Deve ser entendido que não necessariamente todas essas vantagens podem ser alcançadas de acordo com qualquer modalidade específica. Assim, por exemplo, aqueles especialistas no assunto da técnica reconhecerão que a revelação pode ser incorporada ou realizada de uma maneira que atinja uma vantagem ou um grupo de vantagens conforme ensinado no presente documento sem necessariamente alcançar outras vantagens como ensinado ou sugerido no presente documento.
[198] Além disso, embora modalidades ilustrativas tenham sido descritas no presente documento, o escopo de toda e quaisquer modalidades com elementos equivalentes, modificações, omissões, combinações (por exemplo, de aspectos de várias modalidades), adaptações e/ou alterações conforme seriam apreciadas por aqueles na técnica com base na presente revelação. As limitações nas reivindicações devem ser interpretadas amplamente com base na linguagem empregada nas reivindicações e não limitada aos exemplos descritos na presente especificação ou durante o processo do pedido, cujos exemplos devem ser interpretados como não exclusivos. Além disso, as ações dos processos e métodos revelados podem ser modificadas de qualquer maneira, inclusive reordenando-se ações e/ou inserindo ações adicionais e/ou deletando ações. Pretende-se, portanto, que a especificação e exemplos sejam considerados apenas ilustrativos, com um verdadeiro escopo e espírito sendo indicados pelas reivindicações e seu completo escopo de equivalentes.
Claims (23)
1. Método para produzir células exterminadoras naturais, caracterizado pelo fato de que compreende: isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de uma amostra de sangue; isolar pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ das PBMCs; e cocultura de pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ com uma combinação de células alimentadoras na presença de uma citocina.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o isolamento de pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ das PBMCs é conduzido usando-se pelo menos uma das microesferas CD56 e microesferas CD3.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a citocina é selecionada a partir do grupo que consiste em IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, interferons do tipo I, GM-CSF, IGF 1, e combinações dos mesmos.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a citocina é adicionada a uma concentração de 50 a 1.000 IU/ml.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a combinação de células alimentadoras compreende células Jurkat irradiadas e células da linha contínua de linfócitos transformados pelo vírus Epstein-Barr irradiadas (EBV-LCL).
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proporção das células Jurkat irradiadas e as células EBV-LCL irradiadas é de cerca de 1:0,1 a 5 ou 0,1 a 5:1.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que cada uma das células Jurkat irradiadas e as células EBV-LCL irradiadas são obtidas pela irradiação de 50 a 500 Gy.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a cocultura compreende a cocultura por 1 a 50 dias.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: cocultura de pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ com uma combinação de células alimentadoras, na presença de uma primeira citocina por um primeiro período; e subsequentemente cocultura de pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ com a combinação de células alimentadoras, na presença de uma segunda citocina por um segundo período.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que uma segunda citocina é adicionada uma vez ou mais durante Dia 0-6 de um segundo período.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que uma segunda citocina e a combinação de células alimentadoras são adicionadas uma vez ou mais durante Dia 0-6 de um segundo período.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que uma segunda citocina é adicionada uma vez ou mais durante os primeiros seis dias de cada ciclo de catorze dias durante o segundo período.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a primeira citocina é IL-2.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que a segunda citocina é IL-21.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que a segunda citocina é adicionada a uma concentração de 10 a 100 ng/ml.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma das células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ e a combinação de células alimentadoras é cocultivada com uma proporção de cerca de 1:1 a 100 de células CD56+ e/ou células CD3-/CD56+ para células alimentadoras.
17. Composição caracterizada pelo fato de que é feita pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. Composição para tratamento de câncer em um paciente com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: uma quantidade eficaz de células exterminadoras naturais CD56+ derivadas do sangue periférico, em que a quantidade eficaz está em um intervalo de cerca de 1 x 106 a 5 x 108 células por kg de peso corporal do paciente, e em que as células exterminadoras naturais CD56+ são pelo menos cerca de 90% puro; IL-2 que tem uma concentração de 50 a 50.000 IU/ml; e um transportador farmaceuticamente aceitável.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a citocina é selecionada a partir de um grupo que consiste em IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, interferons do tipo I, GM- CSF, IGF 1, e combinações dos mesmos.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a citocina é IL-2.
21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que a citocina tem uma concentração de 50 a 50.000 IU/ml.
22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer de sangue, câncer de estômago, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de rim, câncer de próstata e neuroblastoma.
23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a composição compreende menos que cerca de 1% de células T.
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