JP2022513131A - 複数の免疫細胞タイプの同時増殖のための方法、関連する組成物および癌免疫療法におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本明細書に記載のいくつかの態様は、混合細胞集団を生成するために、複数のタイプの免疫細胞を共に増殖させるための方法およびプロセスに関する。いくつかの態様は、様々な亜集団の所望の比率を有する免疫細胞の増殖集団を生成するために、培養プロセスの特定の時間にそれらの亜集団の増殖を達成するために、様々な亜集団に特異的な様々な刺激を用いることに関する。いくつかの態様において、そのような混合細胞集団は、癌免疫療法の効果を高める腫瘍細胞に対する細胞毒性効果などの望ましい特性を示す。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６２／７７１，４８２号に基づく優先権の利益を主張するものであり、その内容全体は引用により本明細書中に包含される。

ＡＳＣＩＩテキストファイルの資料の引用による包含
本出願は、同時に提出された以下のＡＳＣＩＩテキストファイル：ファイル名：NKT0028WO_ST25.txt；２０１９年１１月２２日作成、サイズは９．４ＫＢ、に含まれる配列表を引用により包含させる。

背景
悪性腫瘍は、体内の細胞の無制御の増殖の結果である。同様に、多くの疾患または感染症は、正常な組織増殖および細胞死の調節不全に起因する。外科的方法または薬物療法は長い間、最前線の処置法として用いられてきたが、免疫療法は、癌組織または病変組織を処置するための新たな選択肢である。

概要
従来の抗癌剤療法は、外科的アプローチ、放射線療法、化学療法またはこれらの方法の組み合わせに依存していた。同様に、多くの疾患または感染症は、従来の薬物療法で処置されているが、最近では生物学的製剤の開発が進み、治療方法が変わってきている。ある種の癌のメカニズムが研究によって解明されると、それを利用して癌の標的化治療法が開発された。標的療法とは、癌細胞または癌の増殖を補助する細胞（血管細胞など）に見出される特定の遺伝子またはタンパク質を標的として、癌細胞の増殖を抑制または阻止する特定の薬物を用いた癌治療法である。最近では、遺伝子工学を利用して、免疫系の特定の面を利用して癌と闘う方法を開発できるようになった。場合によっては、患者自身の免疫細胞を、その患者の癌タイプを特異的に根絶するように改変される。以下に詳述するように、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ細胞）などの種々のタイプの免疫細胞を用いることができる。

いくつかの態様において、免疫細胞の複数の集団の同時増殖法が提供される。一態様において、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の異なる細胞タイプが、（i）共に同時増殖されるか、または（ii）並行して同時増殖された後に組み合わされる。いくつかの態様において、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、ＮＫ細胞：Ｔ細胞の比率が約５：１、約１０：１、約２０：１、例えば、５：１、７：１、１０：１、１２：１、１５：１、１７：１、２０：１またはそれらの間の任意の比率で、共にまたは別個に増殖され、組み合わされる。別の態様において、Ｔ細胞よりもＮＫ細胞が少なくとも２倍多い。これらの比率（Ｔ細胞よりもＮＫ細胞が多い）は、いくつかの態様において特に有利であり、Ｔ細胞からの長期的な細胞毒性と併せて、（より増殖したＮＫ細胞とその細胞毒性活性による）ロバストな急性抗腫瘍反応を可能にする。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖が抑制されるだけでなく、ＮＫ細胞のＴ細胞に対する阻害効果により、Ｔ細胞のみのアプローチと比較して、Ｔ細胞のサイトカイン放出が調整される。Ｔ細胞のみの治療では、Ｔ細胞から放出された種々のサイトカインが自己分泌的に作用し、Ｔ細胞増殖および活性を上方制御する。増殖および活性化を放置すると、神経毒性、“標的／非標的”認識、アナフィラキシー、さらにはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ、“抗体、養子Ｔ細胞療法の投与後に見られる、生命を脅かす可能性のある全身性炎症性反応”）などの様々な副作用を引き起こす可能性がある。いくつかの態様により、Ｔ細胞は依然として特定のサイトカインを放出するが、Ｔ細胞刺激（およびＣＲＳを引き起こす可能性のあるさらなるサイトカインの放出）を引き起こすのではなく、これらのサイトカインはＮＫ細胞を積極的に刺激するように作用する。従って、いくつかの対応において、ＮＫ細胞は、増殖（およびより多くの細胞毒性）を誘導することによって、Ｔ細胞が自己刺激する能力を弱める。従って、ＮＫ細胞の存在は、Ｔ細胞の増殖性およびサイトカイン放出活性を低下させる。このように、いくつかの態様において、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組み合わせにより、より効果的かつ安全な癌免疫療法製品が提供される。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、以下のサブタイプ、すなわち細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ＮＫＴ細胞またはガンマデルタＴ細胞の１つ、２つ、３つまたはそれ以上を含む。一態様において、複数のサブタイプの総合計（collective total）は、本明細書に記載の比率（５～１０：１、１０～１５：１、１５～２０：１を含むが、これらに限定されない）で計算される。別の態様において、サブタイプの１つの合計が、本明細書に記載された比（５：１を含むが、これに限定されない）について計算される。

いくつかの態様において、第１の細胞タイプは、約５～１０：１、例えば、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１および１０：１の比率で第２の細胞タイプと組み合わされる。いくつかの態様において、第１の細胞タイプは、約１１～１５：１、例えば、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１および１５：１の比率で第２の細胞タイプと組み合わされる。いくつかの態様において、第１の細胞タイプは、約１６～２０：１、例えば、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１および２０：１の比率で第２の細胞タイプと組み合わされる。別の態様において、細胞タイプ２よりも細胞タイプ１の方が少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上存在する。別の態様において、第３の細胞タイプも含まれる。一態様において、細胞タイプ１にはＮＫ細胞が含まれ、細胞タイプ２にはＴ細胞が含まれる。他の態様では、他の細胞タイプが用いられる。

従って、本発明は、混合集団の亜集団（subpopulation）の特定の相対的割合を有する免疫細胞（例えば、遺伝子改変免疫細胞(engineered immune cells)）の混合集団を生成する方法を提供する。いくつかの態様において、これらの方法は、腫瘍細胞などの標的細胞に対してロバストな細胞毒性効果を提供する細胞集団の生成を可能にし、一方で、遺伝子改変免疫細胞の特定の亜集団がより多く存在する場合に生じる可能性のある有害な免疫効果の可能性を低減する。いくつかの態様において、少なくとも２つの遺伝子改変免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を生成する方法であって、血液サンプルから単核細胞集団を単離すること、ここで、単離された単核細胞集団は、少なくとも第１および第２の免疫細胞亜集団を含み、単離された単核細胞から免疫細胞の第１の亜集団を単離し、単離された免疫細胞の第１の亜集団をフィーダー細胞の集団と共に培養容器内で培養すること、ここで、前記フィーダー細胞が、前記第１の免疫細胞亜集団内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現して、ＮＫ細胞の増殖集団を生成するように構成されており、前記単離された単核細胞から第２の免疫細胞亜集団を単離し、前記第２の免疫細胞亜集団を前記第２の免疫細胞亜集団内のＴ細胞の増殖を刺激する少なくとも１つの分子と共に培養容器内で培養して、Ｔ細胞の集団を増殖すること、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞を、細胞毒性を向上させ、かつ／または副作用を低減させるタンパク質または薬物を発現するように遺伝子操作し、遺伝子操作された細胞毒性ＮＫ細胞の一部と遺伝子操作された細胞毒性Ｔ細胞の一部を組み合わせることにより、遺伝子改変免疫細胞の混合集団を生成すること、を含む方法を提供する。いくつかの態様において、２つ（またはそれ以上）の増殖された遺伝子改変免疫細胞の組み合わせはインビトロで行われ、一方、他の態様において、組み合わせはインビボで行われる（例えば、増殖された細胞タイプの併用投与または逐次投与による）。

いくつかの態様において、ＮＫ細胞を刺激するための少なくとも１つの分子は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様において、ＮＫ細胞の増殖を刺激するための分子は、４－１ＢＢＬおよびＩＬ１５の組み合わせを含む。いくつかの態様において、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）は、フィーダー細胞に膜結合している。いくつかの態様において、単離された免疫細胞の第１の亜集団の培養は、可溶性インターロイキン２、可溶性インターロイキン１２、可溶性インターロイキン１８、またはそれらの組み合わせのうちの１以上を培養物に添加することをさらに含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子は、ＣＤ３に対する抗体またはＣＤ２８に対する抗体の１以上を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子は、抗ＣＤ３抗体を含む。さらなる態様において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の混合物が用いられる。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子は、抗ＣＤ２８抗体を含む。態様に応じて、ＣＤ３に対する抗体は、要すればＯＫＴ３抗体を含む。いくつかの態様において、ＯＫＴ３抗体、他の抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２８抗体は、免疫細胞の第２の亜集団と共培養されるフィーダー細胞によって発現される。さらなる態様において、抗体または他の刺激分子は、固体支持体に結合している。固体支持体は、態様に応じて、培養容器、標識を含む生体適合性ビーズ、または超常磁性ビーズを含む。このように、いくつかの態様において、刺激分子はフィーダー細胞によって発現されることによって提供されるが、いくつかの態様において、無細胞増殖(cell-free exansion)が用いられる（例えば、刺激分子を培養液に添加するか、さもなければフィーダー細胞ではない固体支持体に結合させる）。

いくつかの態様において、本方法は、増殖されたＮＫ細胞集団に、癌細胞によって発現された標的に結合し、結合時に癌細胞に対する細胞毒性活性を誘発するように構成された遺伝子改変受容体をコードする核酸を導入して、遺伝子改変細胞毒性ＮＫ細胞を生成することを含む。同様に、いくつかの実施形態では、この方法は、増殖したＴ細胞集団に、癌細胞によって発現された標的に結合し、結合時に癌細胞に対する細胞毒性活性を誘発するように構成された遺伝子改変受容体をコードする核酸を導入して、遺伝子改変細胞毒性細胞を生成することをさらに含む。いくつかの態様において、ＮＫ細胞およびＴ細胞は同じ遺伝子改変受容体で導入され、他の態様において、ＮＫ細胞およびＴ細胞は異なる遺伝子改変受容体で導入される。いくつかの態様において、さらなるサブタイプの細胞が混合集団に用いられる場合、それらの細胞は、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞と同じ遺伝子改変受容体を発現するように設計されてもよいし、異なる受容体タイプを発現するように設計されてもよい。いくつかの態様において、増殖された細胞に導入された核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードしている。ＣＡＲは、腫瘍細胞によって発現される様々な標的に対する受容体であり得て、これには、腫瘍細胞によって特異的に発現されるものだけでなく、腫瘍細胞によって過剰に発現されるものも含まれる（それによって、マーカーを用いた天然細胞の標的化が制限される）。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＢＣＭＡ、ガラクチン、Ｒａｌ－Ｂ、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、ＤＬＬ３、ＣＤ５、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＥＧＦＲ、ＫＲＥＭＥＮ２、ＰＳＭＡ、ＡＬＰＰＬ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８、ＧＰＲ１４３、ＧＲＭ８、ＬＰＡＲ３、ＧＤ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＥＣＴ１またはＴＭＥＭ１８６に対する受容体である。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５および／またはＵＬＢＰ６を含むがこれらに限定されない、１以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する受容体である。いくつかの態様において、遺伝子改変細胞は、ある態様では、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の異なる腫瘍標的に対して集合的に指向されるＮＫ細胞およびＴ細胞の混合物を含む、異なる標的に対するＣＡＲを発現するように構成される。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＤ１９に対する受容体である。いくつかの態様において、混合集団の各亜集団は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する。いくつかの態様において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖに作動可能に連結されたＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの態様において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号２に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、遺伝子改変細胞毒性ＮＫ細胞および遺伝子改変細胞毒性Ｔ細胞を、（i）遺伝子改変ＮＫ細胞が、遺伝子改変ＮＫ細胞単独と比較して、癌細胞に対して増強された細胞毒性を示す、（ii）遺伝子改変細胞毒性Ｔ細胞が、増殖する遺伝子改変ＮＫ細胞の数を増加させることができる、および／または（iii）遺伝子改変Ｔ細胞が、遺伝子改変Ｔ細胞単独の場合と比較して、減少したサイトカイン放出を示す、比率で組み合わせる。用いられる比率は、所定の患者、腫瘍タイプ、重篤度または腫瘍進行段階に合わせて調整することができるか、または他の診断因子もしくは予後因子に基づき得る。いくつかの態様において、遺伝子改変ＮＫ細胞と遺伝子改変Ｔ細胞の比率は約５：１である。他の態様では、他の比率が用いられる。例えば、いくつかの態様では、第１の細胞タイプと第２の細胞タイプの比率は、約２：１、約４：１、約６：１、約８：１、約１０：１、約１２：１、約１４：１、約１６：１、約１８：１、約２０：１またはそれ以上（または記載されたそれらの間の任意の比率）である。

いくつかの態様では、免疫細胞が単離される血液サンプルは、末梢血サンプルである。さらなる態様では、血液サンプルは臍帯血サンプルである。いくつかの態様では、遺伝子改変免疫細胞の混合集団は、約１ｘ１０^７～約１ｘ１０^１０個の遺伝子改変細胞毒性ＮＫ細胞と、約１ｘ１０^５～約１ｘ１０^８個の遺伝子改変細胞毒性Ｔ細胞とを含んでいる。本明細書に記載のように、様々な態様が、２種以上の免疫細胞タイプを、ＣＲＳを含む有害な免疫効果のリスクを低減または排除して、標的腫瘍細胞に対する効果的な細胞障害を可能にする比率で組み合わせている。いくつかの態様では、遺伝子改変免疫細胞の混合集団は、腫瘍細胞に対して迅速な細胞毒性効果を示し、その後、腫瘍細胞に対する永続性の細胞毒性効果が増強される。いくつかの態様では、遺伝子改変免疫細胞の混合集団のうちのＮＫ部分は、ＮＫ細胞またはＴ細胞のみの場合と比較して、腫瘍細胞に対する永続性の細胞毒性効果の持続時間が長い。

いくつかの態様において、遺伝子改変細胞毒性免疫細胞の混合集団が提供され、これは、ＮＫ細胞を含む免疫細胞の第１の亜集団であって、ＮＫ細胞が、癌細胞によって発現された標的に結合し、結合時に癌細胞に対して細胞毒性活性を誘発するように構成された遺伝子改変受容体を発現するように設計されており、ここで、第１の亜集団は、約１ｘ１０^８～約１ｘ１０^１０のＮＫ細胞を含み、第２の亜集団は、Ｔ細胞を含む免疫細胞を含み、ここで、Ｔ細胞は、癌細胞によって発現された標的に結合し、結合時に癌細胞に対して細胞毒性活性を誘発するように構成された遺伝子改変受容体を発現するように設計されており、第２の亜集団は、約１ｘ１０^４～約１ｘ１０^６個のＴ細胞を含み、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の混合集団は、所定のエフェクター対標的細胞比において、同等のエフェクター対標的比において、ＮＫ細胞単独またはＴ細胞単独のいずれかよりも、癌細胞に対してより大きな細胞毒性を示す。

上記のように、いくつかの態様において、遺伝子改変受容体は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ガラクチン、Ｒａｌ－Ｂ、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、ＤＬＬ３、ＣＤ５、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＥＧＦＲ、ＫＲＥＭＥＮ２、ＰＳＭＡ、ＡＬＰＰＬ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８、ＧＰＲ１４３、ＧＲＭ８、ＬＰＡＲ３、ＧＤ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＥＣＴ１またはＴＭＥＭ１８６などの様々な標的に対して向けられ得るキメラ抗原受容体を含む。いくつかの態様において、混合集団の各亜集団は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現している。いくつかの態様において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖに作動可能に連結されたＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの態様において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

さらに、本発明は、少なくとも２つの免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を増殖させる方法であって、血液サンプルから単核細胞の集団を単離すること、単離された単核細胞集団を少なくとも第１のサブパートおよび第２のサブパートに分割すること、単離された単核細胞の第１のサブパートを、第１の培地を含む培養容器内でフィーダー細胞の第１の集団と共に培養すること、ここで、フィーダー細胞の第１の集団が、単離された単核細胞の第１のサブパート内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現し、および／または第１の培地が、単離された単核細胞の第１のサブパート内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を含み、ここで、少なくとも１つの分子は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびそれらの組み合わせから選択され、それによってＮＫ細胞の増殖集団を生成すること、単離された単核細胞の第２のサブパートを第２の培養液を含む培養容器内でフィーダー細胞の第２の集団と共に培養すること、ここで、フィーダー細胞の第２の集団が、単離された単核細胞の第２のサブパート内のＴ細胞の１以上の亜集団の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現し、および／または第２の培養液が、単離された単核細胞の第２のサブパート内のＴ細胞の１以上の亜集団の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を含み、それによってＴ細胞の１以上の亜集団の増殖集団を生成し、かつＮＫ細胞の増殖集団の少なくとも一部をＴ細胞の１以上の亜集団の増殖集団の少なくとも一部と組み合わせて、免疫細胞の少なくとも２つの亜集団を含む免疫細胞の混合集団を生成することを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、混合集団は、Ｔ細胞の１以上の亜集団の合計の割合と比較して、より高割合でＮＫ細胞を含んでいる。いくつかの態様において、Ｔ細胞の１以上の亜集団は、ガンマ－デルタＴ細胞を含む。

本発明は、本明細書に記載の方法によって産生される免疫細胞の混合集団を提供する。いくつかの態様において、免疫細胞の混合集団は、腫瘍が固形腫瘍であるか懸濁性腫瘍であるかにかかわらず、腫瘍の処置に用いられるように構成される。また、本発明は、癌の処置のための、本明細書に記載の免疫細胞の混合集団の使用を提供する。いくつかの態様において、癌の処置のための医薬品の製造における、免疫細胞の混合集団の使用を提供する。

また、いくつかの態様において、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組み合わせが提供され、ここで、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率は少なくとも５：１である。いくつかの態様において、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組み合わせが提供され、ここでＮＫ細胞とＴ細胞の比率は少なくとも１０：１である。いくつかの態様において、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組み合わせが提供され、ここで、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率は少なくとも１２：１である。いくつかの態様において、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組み合わせが提供され、ここで、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率は少なくとも１５：１である。いくつかの態様において、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組み合わせが提供され、ここで、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率は少なくとも２０：１である。

いくつかの態様において、示された比率でまたはおよそ示された比率での細胞の組合せが、標的腫瘍に対する遺伝子改変ＮＫ細胞の増強された細胞毒性活性を誘導する。いくつかの態様において、示された比率でまたはおよそ示された比率での細胞の組合せは、遺伝子改変ＮＫ細胞単独と比較して、標的腫瘍に対する遺伝子改変ＮＫ細胞の細胞毒性活性の増強された持続性を誘導する。いくつかの態様において、示された比率でまたはおよそ示された比率での細胞の組合せは、遺伝子改変Ｔ細胞単独と比較して、遺伝子改変Ｔ細胞によるサイトカイン放出の減少を誘導する。いくつかの態様において、示された比率でまたはおよそ示された比率での細胞の組合せは、遺伝子改変Ｔ細胞単独と比較して、遺伝子改変Ｔ細胞の増殖の低下を誘導する。

いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞の混合集団を用いた癌の処置方法を提供する。本明細書に記載するように、いくつかの態様において、細胞の組合せは、増殖後および患者への送達の前に、所望の比率で細胞タイプを混合することによって達成される。いくつかの態様において、この組合せは、投与によって行われる（例えば、所望の比率がインビボで達成されるように、各細胞タイプからの必要数の細胞が投与される）。いくつかの態様において、処置方法は、ＩＬ２の投与をさらに含む。結果として得られる組合せをインビボで生成させることを含む態様では、第１の細胞タイプを最初に投与することによって達成されてもよいし、第２の細胞タイプを最初に投与することによって達成されてもよい。いくつかの態様において、第１のタイプの遺伝子改変免疫細胞の投与は、第２のタイプ（または第３タイプなど）の免疫細胞のための改善された微小環境を提供することができる。

いくつかの態様において、複数の免疫細胞集団の共増殖のための方法、例えば、ＮＫ細胞とＴ細胞の共増殖のための方法を提供する。また、２以上の免疫細胞の亜集団の混合物を含む免疫細胞集団、ならびに、癌および他の疾患または損傷組織の原因の処置のための方法およびかかる組成物の使用も提供する。いくつかの態様において、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合細胞集団は、有利にも標的細胞に対する二重の効果、例えば、ＮＫ細胞によって誘導される細胞毒性効果の急速な段階と、Ｔ細胞活性の結果としての腫瘍制御のより長い期間とを合した効果を提供する。有利なことに、いくつかの態様において、２種類の細胞は単一のプロセスで共に製造され、互いに組み合わせて投与することができる。いくつかの態様において、増殖プロセスの第１の部分でＮＫ細胞を製造し、次いでＴ細胞を製造し、増殖プロセスの第２の部分で、結果として得られるＮＫ細胞集団およびＴ細胞集団を組み合わせて、ＮＫ：Ｔ細胞の所望の比率を達成する。さらなる態様において、ＮＫ細胞およびＴ細胞を共に培養し、方法（methodology）を調整して、合併された増殖培養プロセスの後に所望の比率が達成されるように、一方の細胞タイプの他方の細胞タイプに対する増殖率（ならびに、混合物に含まれる任意の第３、第４またはそれ以上の細胞タイプに関するもの）を制御する。

いくつかの態様において、定義されたパラメーターの範囲内で、最適化された構築物を用いて、ＮＫ細胞およびＴ細胞（および要すれば追加の免疫細胞タイプ）の両方を増殖および導入することを可能にする方法を提供し、その結果得られる複合細胞集団は、構成される免疫細胞亜集団のそれぞれの最適化された活性を表す、標的細胞に対する相乗効果を有利に示す。

いくつかの態様によれば、少なくとも２つの免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を増殖させる方法であって、血液サンプルから単核細胞集団を単離すること、単離された単核細胞をフィーダー細胞の集団と共に培養容器内で培養すること（フィーダー細胞は、ＮＫ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現するように構成されている)、前記フィーダー細胞と共培養した単核細胞を単離された単核細胞内のＴ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子に曝すこと、かつ前記フィーダー細胞と共培養し、前記Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子に曝された単核細胞を、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両亜集団の増殖を可能にするのに十分な期間、培養することを含み、これにより、少なくとも２つの免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を生成する方法を提供する。いくつかの態様において、単離された単核細胞集団が、例えば、ＮＫ細胞および１以上のＴ細胞サブタイプ（例えば、細胞毒性Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞など）などの、少なくとも２つの異なるタイプの免疫細胞を含むことを特徴とする。

いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、単離された単核細胞集団と比較して、ＮＫ細胞の相対的な割合を増加させるために、単離された単核細胞を富化することをさらに含んでいてよい。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、単離された単核細胞集団と比較して、Ｔ細胞の相対的な割合を減少させるために、単離された単核細胞を枯渇させることをさらに含んでいてよい。

いくつかの態様において、単離された単核細胞内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）またはそれらの組合せである。いくつかの態様において、他のインターロイキン類を含む、他の刺激分子を用いてもよい。いくつかの態様において、フィーダー細胞による刺激分子の発現に加えて、またはそれに代えて、培養液にそのような刺激分子を添加する。いくつかの態様において、ＮＫ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子は、４－１ＢＢＬおよびＩＬ１５の組み合わせを含む。いくつかの態様において、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）はフィーダー細胞に膜結合している。

いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体の一部と相互作用する抗体を含む。いくつかの態様において、用いられる抗体は、ＣＤ３に対するまたはＣＤ２８に対する抗体である。いくつかの態様において、二重特異的抗体（例えば、ＣＤ３およびＣＤ２８の両方を標的とする抗体）が用いられる。いくつかの態様において、抗体は、ＯＫＴ３抗体を含む。いくつかの態様において、ＣＤ３、ＣＤ２８および／またはＯＫＴ３抗体は、フィーダー細胞によって発現される。さらなる態様において、ＣＤ３、ＣＤ２８および／またはＯＫＴ３抗体は、培養液中に提供される。

いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子は、抗ＣＤ３抗体を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子は、抗ＣＤ２８抗体を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の混合物を含む。いくつかの態様において、抗体は、固体支持体に結合している。いくつかの態様において、固体支持体は、培養容器、標識を含む生体適合性ビーズまたは超常磁性ビーズを含む。

いくつかの態様において、フィーダー細胞と共培養された単核細胞を、単離された単核細胞内のＴ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子に曝すことは、単核細胞がフィーダー細胞と共培養されるのと同時に行われる。しかしながら、いくつかの態様において、曝露は連続的に行われる（例えば、共培養の前または後に行われる）。例えば、いくつかの態様において、フィーダー細胞と共培養された単核細胞を、単離された単核細胞内のＴ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子に曝露することは、単核細胞がフィーダー細胞と共培養されるよりも後の時点で行われる。態様によっては、フィーダー細胞と共培養された単核細胞が、Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子に曝される時間が遅いほど、単核細胞集団からのＴ細胞の増殖の程度と逆相関する。したがって、いくつかの態様において、曝露のタイミングが、結果として得られる混合細胞集団におけるＴ細胞（またはＴ細胞のサブタイプ）の増殖の程度を調整するために用いられる。

いくつかの態様において、フィーダー細胞と単核細胞の比率は、約１０：１～１：１０の範囲である。いくつかの態様において、フィーダー細胞と単核細胞との比は約１：１である。他の比率は、いくつかの態様で用いられ、例えば、フィーダー細胞：単核細胞の比率は、１０００：１、５００：１、２５０：１、１００：１、５０：１、または列挙された比率の間およびそれを含む何れか他の比率である。

いくつかの態様において、血液サンプルは末梢血サンプルである。いくつかの態様において、血液サンプルは臍帯血サンプルである。いくつかの態様において、血液サンプルは、胎盤などの胎児－母体組織由来である。いくつかの態様において、供給源は、受容者と同種である混合免疫細胞集団を生成するために用いられる。いくつかの態様において、受容者はドナーである。いくつかの態様において、血液サンプルおよび／または増殖された混合集団は、受容者への送達の準備ができるまで貯蔵される（例えば、凍結）。

いくつかの態様において、免疫細胞の混合集団は、約１００：１～約１：１００の範囲のＮＫ細胞対Ｔ細胞（様々なＴ細胞亜集団を含む）の比率を有する。いくつかの態様において、ほぼ等分のＮＫ細胞とＴ細胞が用いられ、その結果、免疫細胞の混合集団は、約１：１のＮＫ細胞とＴ細胞の比率を有する。

いくつかの態様において、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率が約１：１～約１００：１である免疫細胞の混合集団は、ＮＫ細胞単独またはＴ細胞単独と比較して、腫瘍細胞に対して迅速な細胞毒性効果を示し、その後、腫瘍細胞に対して持続的な細胞毒性効果を示す。いくつかのそのような態様において、約１：１～約１：１００の間のＮＫ細胞とＴ細胞の比率を有する免疫細胞の混合集団は、ＮＫ細胞単独またはＴ細胞単独と比較して、腫瘍細胞に対してより長い持続的な細胞毒性効果を示す。

また、いくつかの態様において、本発明は、単核細胞集団からの免疫細胞の少なくとも２つの亜集団の増殖を刺激するように構成されたフィーダー細胞の集団であって、ここで、該フィーダー細胞が、ＮＫ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つのシグナルと、Ｔ細胞（またはＴ細胞の亜集団）の増殖を刺激するための少なくとも１つのシグナルとを発現し、ここで、ＮＫ細胞の増殖のための少なくとも１つのシグナルは、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびそれらの組合せから選択され、ここで、ＮＫ細胞の増殖のための少なくとも１つのシグナルは、Ｔ細胞受容体のＣＤ３と相互作用する分子、および任意にＴ細胞上のＣＤ２８と相互作用する分子から選択される、フィーダー細胞の集団を提供する。

本発明はまた、ＮＫ細胞およびＴ細胞を含む混合細胞集団を生成するために、フィーダー細胞のそのような集団の使用を提供する。いくつかの態様において、混合細胞集団中のＮＫ細胞の割合が全体の約１０％よりも大きく、混合細胞集団中のＴ細胞の割合が全体の約３０％よりも大きくなる。いくつかの態様において、混合細胞集団におけるＮＫ細胞の割合と、混合細胞集団におけるＴ細胞の割合とが、それぞれ全体の約４０％から６０％の間である。

いくつかの態様において、ＮＫ細胞およびＴ細胞（Ｔ細胞の亜集団を含む）の混合集団も提供しており、混合細胞集団におけるＮＫ細胞の割合は全体の約１０％よりも大きく、混合細胞集団におけるＴ細胞の割合は全体の約３０％よりも大きい。いくつかの態様において、混合細胞集団におけるＮＫ細胞の割合と、混合細胞集団におけるＴ細胞の割合が、それぞれ全体の約４０％から６０％の間である。いくつかの態様において、混合細胞集団は、標的細胞に対して二相性（bi-phasic）の細胞毒性動態を示す。このようないくつかの態様において、二相性の細胞毒性動態は、急速で強烈な初期の細胞毒性相と、それに続く低強度の細胞毒性相を含む。いくつかの態様において、標的細胞は腫瘍組織を含む。いくつかの態様において、腫瘍組織は固体腫瘍であり、一方、さらなる態様において、腫瘍組織は懸濁性腫瘍（例えば、血液腫瘍）である。

また、本発明は、癌の処置のための、および／または癌の処置のための医薬品の製造における、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団の使用を提供する。

本明細書で提供されるいくつかの追加の態様は、少なくとも２つの免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を増殖するための方法に関し、この方法は、血液サンプルから単核細胞の集団を単離すること、ここで、単離された単核細胞の集団は、少なくとも２つの異なるタイプの免疫細胞を含み、単離された単核細胞をフィーダー細胞の集団と共に培養液を含む培養容器内で培養すること、ここで、培養は、ＮＫ細胞亜集団およびＴ細胞亜集団の両方の増殖を可能にするのに十分な時間行われ、それによって、少なくとも２つの免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を生成することを含む。

いくつかの態様において、フィーダー細胞は、単離された単核細胞内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現し、および／または培養液が、単離された単核細胞内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの分子は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびそれらの組合せから選択される。いくつかの態様において、フィーダー細胞は、単離された単核細胞内のＴ細胞またはＴ細胞の１以上の亜集団の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現し、および／または培養液が、単離された単核細胞内のＴ細胞またはＴ細胞の１以上の亜集団の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞の１以上の亜集団は、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、粘膜関連不変性Ｔ細胞のうちの１以上である。いくつかの態様において、血液サンプルは臍帯血サンプルである。

本発明はまた、少なくとも２つの免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を増殖するための方法であって、この方法は、血液サンプルから単核細胞の集団を単離すること、ここで単離された単核細胞の集団は、少なくとも２つの異なるタイプの免疫細胞を含み、単離された単核細胞の集団を少なくとも第１のサブパートと第２のサブパートに分割すること、単離された単核細胞の第１のサブパートを、第１の培地を含む培養容器内でフィーダー細胞の第１の集団と共に培養すること、単離された単核細胞の第２のサブパートを、第２の培地を含む培養容器内でフィーダー細胞の第２の集団と共に培養し、増殖されたＮＫ細胞の集団の少なくとも一部を、増殖された１以上のＴ細胞の亜集団の少なくとも一部と組み合わせて、少なくとも２つの免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を生成することを含む方法を提供する。

いくつかの態様において、フィーダー細胞の第１の集団は、単離された単核細胞の第１のサブパート内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現し、および／または第１の培養液が単離された単核細胞の第１のサブパート内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの分子は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびそれらの組合せから選択され、第２のフィーダー細胞の集団は、を発現し、および／または第２の培養培地が、単離された単核細胞の第２のサブパート内の１以上のＴ細胞の亜集団の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を含む。

いくつかの態様において、混合集団は、Ｔ細胞の１以上の亜集団の合計の割合と比較して、より高い割合のＮＫ細胞を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞の１以上の亜集団は、ガンマ－デルタＴ細胞を含む。

また、いくつかの態様において、本明細書に記載の態様のいずれか１つによる癌性腫瘍の処置における組成物またはその使用が提供される。

以下の図面の説明は、本明細書に記載の発明の限定されない態様を表す試験および結果に関するものである。
図１Ａ～１Ｄは、４名の健康なドナー由来のドナー細胞組成の概要図である。図１Ａは、第１のドナーから採血した血液サンプル中のＴ細胞、ＮＫ細胞およびその他の細胞のおおよその割合の内訳を示す。図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、さらなる３名のドナー由来の対応するデータを示している。 図２は、本明細書に記載の特定の態様に従って、ＮＫ細胞およびＴ細胞の同時増殖に有効な種々のＫ５６２クローンを同定することができる概略的なプロセスフロー図を示す。すなわち、プールされたＫ５６２の集団を限界希釈し、選択された数の個々のクローンについて、培養中のＮＫ細胞とＴ細胞の両方を増殖させる能力について試験する。図１Ａ～１Ｄに示される４名のドナーの血液サンプルが用いられる。ＮＫ細胞およびＴ細胞の同時増殖に用いたフィーダー細胞株（およびクローン）は、４１ＢＢＬ、膜結合型ＩＬ－１５および膜結合型の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＯＫＴ３を発現するように遺伝子操作された改変Ｋ５６２細胞である。このフィーダークローンをマイトマイシンＣで処理し、１ウェルあたり５×１０^５個の細胞を培養容器に播種する。培養０日目に、ドナーの末梢血単核細胞を、フィーダークローンと同じウェルに、１ウェルあたり５×１０^５細胞密度で播種する。共培養０日目にインターロイキン２（ＩＬ－２）を４０ユニット／ｍＬで添加し、共培養４日目にこれを反復し、共培養６日目には再び４００ユニット／ｍＬのＩＬ－２を添加する。共培養７日目から１３日目まで細胞を増殖させ、この期間にＮＫ細胞とＴ細胞の比率を評価する。共培養１４日目から２０日目までを用いて、共培養工程の初期に調整された変数(variables)、例えば改変されたＫ５６２細胞によって提供される刺激を補足する二次刺激の導入などに基づいて、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率で最終的に得られる細胞集団を決定する。

図３Ａ～３Ｂは、２４個の異なるＫ５６２クローンを用いて７日間培養した後、４名のドナーから得られたＮＫ細胞またはＴ細胞の増殖における変化倍数の増加に関係するデータを示す。図３Ａは、特定のＫ５６２クローンが、天然遺伝子改変Ｋ５６２刺激フィーダー細胞株（例えば、単一の複製クローンからなる集団ではなく、遺伝子改変Ｋ５６２細胞の混合集団）を用いた場合と同様の増殖効率を示したことを示している。図３Ｂは、試験した各クローンが、Ｔ細胞増殖を強力に刺激する能力を有することを示す。 図４Ａ～４Ｂは、２４個の異なるＫ５６２クローンを用いて７日間増殖培養した後、４名の異なるドナーから得られた細胞組成に関係するデータを示す。図４Ａは、フィーダー細胞として用いた２４個の個々のクローンのＫ５６２集団のそれぞれで増殖させたとき、４名のドナーのそれぞれから得られた、培養７日後の増殖した細胞集団に存在するＮＫ細胞の割合に関するデータを示す。図４Ｂは、培養７日後に示されたＴ細胞の割合についての対応するデータを示している。これらのデータは、一般的に、培養７日後に得られる細胞組成は、当初(例えば出発点)のＮＫ：Ｔ細胞の比率を反映している。以下でより詳細に説明する、いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、ＮＫ細胞：Ｔ細胞の当初(incoming)の比率か、または方法の変更により、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞の差次的増殖を可能にして所望の最終的なＮＫ細胞とＴ細胞の比率の何れかを操作することを可能にした。 図５は、補充刺激（supplemental stimulation）源を可変時点で培養物に添加する本明細書に記載のいくつかの態様による増殖プロトコールの概略を示す。図２と同様に、図５は、増殖プロトコールの３つの段階のタイムラインを示している。再び０時点で、培養物に低用量のＩＬ－２を添加し、これを４日目に繰り返し、さらに６日目に再び（高用量のＩＬ－２を）添加する。図５の概略図は、培養の最初の６日間の何れかでＴ細胞増殖のための補充刺激源（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）の添加、または全く添加しない（“ビーズなし”、対照）を説明するマトリックスを示す。共培養中のいくつかのステップで経時的にＦＡＣＳ分析を行い、ＮＫ細胞およびＴ細胞の相対的な増殖ならびに形質導入効率を評価する。

図６Ａ～６Ｂは、補充増殖刺激を加えたときのＮＫ細胞およびＴ細胞の増殖に関係するデータを示す。図６Ａは、ビーズの有無を評価した７日間の培養後のＮＫ細胞の変化と、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔ細胞に対する補充刺激）を共培養に添加した日を示す。図６Ｂは、Ｔ細胞増殖に関する対応するデータを示す。 図７Ａ～７Ｄは、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを培養物に添加する時間に関連して、発現のための外因性遺伝子を含むベクターをＮＫ細胞およびＴ細胞の両方に同時に形質導入する能力、および形質導入された遺伝子の発現を維持する両細胞タイプの能力に関係するデータを示す。図７Ａおよび７Ｂは、フローサイトメトリーで測定した、導入３日後の４名のドナーにおける各細胞タイプの導入効率を示す。図７Ｃおよび７Ｄは、導入後７日目における発現の維持を示す。 図８Ａ～８Ｄは、共培養の増殖時間をより長くしたときのＮＫ細胞とＴ細胞の比率の変化に関するデータを示す。 図９Ａ～９Ｃは、ＮＫ／Ｔ細胞の混合集団をインビトロおよび／またはインビボで評価するための様々な遺伝子改変細胞の模式図である。 図１０は、再暴露アッセイにおけるＮK細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞＋Ｔ細胞混合集団の細胞毒性効果に関するデータを示す。 図１１は、インビトロ３－Ｄ培養環境における本明細書に記載の態様による免疫細胞集団の評価に関するデータを示す。

図１２Ａは、標的腫瘍細胞に対する併用療法として、キメラ抗原受容体を含むＮＫ細胞およびキメラ抗原受容体を含むＴ細胞の効果的な比率を同定するために設計された試験設定を示す。図１２Ｂは、IncuCyteアッセイで測定した細胞毒性を示す（シグナルの消失は標的細胞に対する細胞毒性効果を示す）。Ｎａｌｍ６標的細胞に対して最大の細胞毒性を示すＥ：Ｔ比およびＮＫ：Ｔ比を識別するためにボックスが加えられている。 図１３は、示された対照ＮＫのみ構築物、Ｔのみ構築物またはＮＫ＋Ｔ構築物の標的腫瘍細胞に対する細胞毒性に関するデータを、第１段階で、および腫瘍細胞の２回目の再暴露で示す。 図１４Ａ～１４Ｂは、ＮＫ細胞およびＴ細胞のそれぞれが、他方の細胞タイプの細胞数に与える影響を決定する試験に関する。図１４Ａは、ＮＫ ＣＡＲ細胞が３つの異なるＮＫ：Ｎａｌｍ６比で存在し、Ｔ細胞が示された比で存在するとき、ＮＫ細胞数を評価した結果を示す（Ｘ軸）。図１４Ｂは、Ｔ ＣＡＲ細胞を６つの異なるＴ：Ｎａｌｍ６比で存在させ、ＮＫ細胞を示された比（Ｘ軸）で存在させたとき、Ｔ細胞数を評価した結果である。試験は、ＮＫ細胞およびＴ細胞（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（１９－１と示す）の限定されない例を発現している）をＮａｌｍ６細胞と共培養して７日後に行った。 図１５Ａ～１５Ｆは、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞の存在下でのＮＫ細胞増殖に関するデータを示す。図１５Ａは、Ｔ細胞の不存在下でのＮＫ細胞（抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含み、標的Ｎａｌｍ６細胞と１：１比で存在する）の増殖を示す。図１５Ｂは、同じ限定されない例のＣＡＲを有するＴ細胞が１：１６のＴ：Ｎａｌｍ６比で存在するときのＮＫ１９－１細胞の増殖を示す。図１５Ｃは、ＣＡＲの同じ限定されない例を有するＴ細胞が１：８のＴ：Ｎａｌｍ６比で存在するときのＮＫ１９－１細胞の増殖を示す。図１５Ｄは、ＣＡＲの同じ限定されない例を有するＴ細胞が１：４のＴ：Ｎａｌｍ６比で存在するときのＮＫ１９－１細胞の増殖を示す。図１５Ｅは、ＣＡＲの同じ限定されない例を有するＴ細胞が１：２のＴ：Ｎａｌｍ６比で存在するときのＮＫ１９－１細胞の増殖を示す。図１５Ｆは、ＮＫ細胞の２つの異なるＥ：Ｔ比における追加のＮＫ細胞増殖データ（可変Ｔ細胞数）を示す。

図１６Ａ～１６Ｄは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを有するＮＫ細胞の存在下でのＴ細胞増殖に関するデータを示す。図１６Ａは、ＮＫ細胞が存在しない場合の、Ｔ細胞（抗ＣＤ１９ ＣＡＲを有し、１：２比で標的Ｎａｌｍ６細胞と共に存在する）の増殖を示す。図１６Ｂは、ＣＡＲの同じ限定されない例を有するＮＫ細胞が、１：１のＮＫ：Ｎａｌｍ６比で存在する場合のＴ１９－１細胞の増殖を示す。図１６Ｃは、ＣＡＲの同じ限定されない例を有するＮＫ細胞が２：１のＮＫ：Ｎａｌｍ６比で存在する場合のＴ１９－１細胞の増殖を示す。図１６Ｄは、ＮＫ細胞の多様なＥ：Ｔ比での追加のＴ細胞増殖データ（可変ＮＫ細胞数）を示す。 図１７Ａ～１７Ｃは、増殖に関するＮＫ細胞とＴ細胞の相互作用をまとめた概略図である。図１７Ａは、腫瘍細胞のみが存在する場合のＮＫ細胞増殖の概略図である。図１７Ｂは、腫瘍細胞のみが存在する場合のＴ細胞増殖の概略図である。図１７Ｃは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方が腫瘍細胞と共に存在する場合の、ＮＫ細胞およびＴ細胞の増殖の概略図を示す。 図１８Ａ～１８Ｌは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団によるサイトカイン放出に関連するデータを示す。示されているのは、ＧＭ－ＣＳＦ（１８Ａ）、ＩＬ６（１８Ｂ）、ＩＬ４（１８Ｃ）、ＩＬ１０（１８Ｄ）、ＩＦＮｇ（１８Ｅ）、ＩＬ２（１８Ｆ）、ＴＮＦａ（１８Ｇ）、ＩＬ２１（１８Ｈ）、ＩＬ５（１８Ｉ）、ＩＬ１３（１８Ｊ）、ＩＬ９（１８Ｋ）およびＩＬ２２（１８Ｌ）の濃度である。

図１９は、本明細書に記載の態様に従って増殖されたＮＫ細胞の細胞毒性を評価するために用いられるインビボ腫瘍異種移植モデルの概略図である。 図２０Ａ～２０Ｅは、示された処置を受けたマウスの腫瘍負荷を反映する生物発光および生存データを示す。図２０Ａは、ＰＢＳ（対照）、ＮＫ１９－１（ＮＫ細胞によって発現された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）、Ｔ１９－１（Ｔ細胞によって発現された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）を高用量または低用量で、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せ（示された用量で）を投与された動物を示す。図２０Ａのすべてのグループが、３日目に示された処置を受けた。図２０Ｂは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せを示された用量で投与したマウスを示し、左カラムのグループは３日目にＮＫ細胞を投与され、４日目にＴ細胞を投与され、右カラムのグループは３日目にＴ細胞を投与後、４日目にＮＫ細胞を投与される。図２０Ａ－２０Ｂは、腫瘍細胞を移植してから３１日目までのデータを示す。図２０Ｃは、示されたタイミングおよび細胞用量で腫瘍細胞の移植後４３日目から１２１日目までの選択グループ（マウスが生存しているグループ）のデータを示す。図２０Ｄは、実験グループそれぞれの生存データを示す。図２０Ｅは、選択された実験グループ（図２０Ｄに示すもののうち）の生存データを示す。

詳細な説明
癌は、細胞の異常な増殖である。多種の癌が存在し、固形腫瘍として、または浮遊細胞（例えば、血液の癌）として現れる得る。最近まで、癌処置には、化学療法、放射線療法および／または外科手術が含まれていた。より最近では、癌特有の特徴が明らかになってきており、診断だけでなく、癌免疫療法の成長分野にも関連して、癌の識別が容易になってきている。癌免疫療法は、免疫系の様々な細胞の防御機構を利用して、癌細胞と相互作用し、癌細胞を減少させるかまたは除去するものである。この方法は、癌を標的にして処置するために使用できるだけでなく、例えば細菌またはウイルスに感染した細胞など、細胞が感染している可能性のある他の適応症を処置するためにも使用できる。いくつかの態様において、免疫細胞は、損傷したまたは罹患組織／細胞に対する有効性がさらに高まるように遺伝子操作されている。本明細書でより詳細に記載するようないくつかの態様において、治療に用いる免疫細胞の数を増やすために、免疫細胞の増殖が、それらの天然形態での患者への投与のためであれ、それらの天然形態の細胞の混合物として投与するためであれ、あるいはその後の細胞の遺伝子操作のためであれ、実施される。

増殖のための免疫細胞および免疫療法における使用
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法により免疫系の細胞が収集され増殖され、該細胞は、特定の標的細胞に対して細胞毒性効果を発揮する能力を利用される。いくつかの態様において、収集された／増殖された細胞は、腫瘍細胞などの標的細胞に対する増強された細胞毒性効果を有するように遺伝子操作される。いくつかの態様において、白血球（white blood cell, leukocyte）は、異常な細胞の増殖および感染症から身体を守るというそれら本来の機能を有しているため、白血球が用いられる。白血球には、ヒト免疫系において特定の役割を果たす様々な種類があり、したがって、本明細書に記載の細胞の操作のための好ましい出発点である。白血球には、顆粒球および無顆粒球がある（それぞれ、細胞質に顆粒が存在するかどうかによる）。顆粒球には、好塩基球、好酸球、好中球およびマスト細胞が含まれる。無顆粒球には、リンパ球および単球が含まれる。

免疫療法のための単球
単球は、白血球のサブタイプである。単球は、マクロファージおよび骨髄系樹状細胞に分化することができる。単球は、適応免疫系に関連し、貪食、抗原提示およびサイトカイン産生の主な機能を果たす。貪食（ファゴサイトーシス）とは、細胞物質または細胞全体を取り込み、その後、取り込まれた細胞物質を消化および破壊するプロセスである。いくつかの態様において、単球は、本明細書に記載の１以上のさらなる遺伝子操作された細胞と関連して用いられる。

免疫療法のためのリンパ球
白血球の他の主要なサブタイプであるリンパ球には、Ｔ細胞（細胞介在性、細胞毒性の適応免疫）、ナチュラルキラー細胞（細胞介在性、細胞毒性の自然免疫）およびＢ細胞（体液性、抗体駆動性の適応免疫）が含まれる。Ｂ細胞は、本明細書に記載のいくつかの態様により遺伝子操作されているが、いくつかの態様は、遺伝子操作されたＴ細胞または遺伝子操作されたＮＫ細胞にも関係している（いくつかの実施形態では、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の混合物が用いられる）。

免疫療法のためのＴ細胞
Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在に基づいて、他のリンパ球サブタイプ（例えば、Ｂ細胞またはＮＫ細胞）と区別される。Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連不変性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞など、多種多様なサブタイプに分類できる。いくつかの態様において、Ｔ細胞の特定のサブタイプが遺伝子操作される。いくつかの態様において、Ｔ細胞サブタイプの混合プールが遺伝子操作される。いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞毒性受容体複合体を発現するように遺伝子操作されるＴ細胞のタイプの特定の選択はない。いくつかの態様において、特定のマーカープロファイルを有するＴ細胞の増殖／収集を促進するために、サイトカイン刺激の使用などの特定の技術が用いられる。例えば、いくつかの態様において、特定のヒトＴ細胞、例えば、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性化は、刺激分子としてＣＤ３および／またはＣＤ２８を用いることによって達成される。いくつかの態様において、治療的有効量のＴ細胞を、単独で、または本明細書に記載のＮＫ細胞および／または他の免疫細胞と組み合わせて投与することを含む、癌または感染症を処置または予防する方法を提供する。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、標的細胞に対する細胞毒性効果が強化されるように遺伝子操作される。いくつかの態様において、Ｔ細胞は自己細胞であり、一方、いくつかの態様において、Ｔ細胞は同種他家細胞である。

免疫療法のためのＮＫ細胞
いくつかの態様において、本明細書に記載の、治療的有効量のＮＫ細胞を単独で、またはＴ細胞および／または他の免疫細胞と組み合わせて投与することを含む、癌または感染症の処置または予防の方法を提供する。いくつかの態様において、ＮＫ細胞は、標的細胞に対して増強された細胞毒性効果を有するように遺伝子操作される。いくつかの態様において、ＮＫ細胞は自己細胞であり、一方、いくつかの態様において、ＮＫ細胞は同種他家細胞である。いくつかの態様において、ＮＫ細胞の天然の細胞毒性が比較的高いため、ＮＫ細胞が好ましい。いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞の組み合わせ（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞）が相乗的に相互作用して、ＮＫ細胞単独またはＴ細胞単独のいずれかと比較して、標的細胞（例えば、腫瘍細胞または他の罹患細胞）に対してさらに効果的な活性をもたらすことが予想外に有益である。

癌免疫療法のための造血幹細胞
いくつかの実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、本明細書に記載の免疫療法に用いられる。いくつかの態様において、細胞は、ホーミング部位および／または細胞毒性受容体複合体を発現するように遺伝子操作される。いくつかの態様において、ＨＳＣは、その生着能力を利用して長期的な血球生産を行うために用いられ、これは、例えば、癌の寛解に対抗するために、標的化された抗癌エフェクター細胞の持続的な供給源となり得る。いくつかの態様において、この継続的な産生は、例えば、腫瘍微小環境に起因する他の細胞タイプのアレルギーまたは消耗を相殺するのに役立つ。いくつかの態様において、同種他家造血幹細胞が用いられ、一方、いくつかの態様において、自家造血幹細胞が用いられる。いくつかの態様において、ＨＳＣは、本明細書に記載の１以上のさらなる免疫細胞タイプと組み合わせて用いられる。

免疫細胞増殖のためのフィーダー細胞
いくつかの態様において、ドナー（いくつかの態様において、患者でもあり得る）の血液サンプルからＮＫ細胞およびＴ細胞の両方を増殖させるように機能するフィーダー細胞集団（クローン集団または混合集団のいずれか）の使用を提供する。

いくつかの態様において、細胞株は、増殖されるべき免疫細胞の集団との共培養に用いられる。そのような細胞株は、本明細書中、“刺激細胞”と称されるか、または“フィーダー細胞”と称される。いくつかの態様において、免疫細胞の集団全体が増殖されるべきであるが、一方、いくつかの態様において、選択された免疫細胞の亜集団または複数の亜集団が優先的に増殖される。例えば、いくつかの態様において、ＮＫ細胞が他の免疫細胞亜集団に比べて優先的に増殖される。いくつかの態様において、２以上の亜集団が共に、いくつかの態様では、同時に、増殖される。態様によっては、以下でより詳細に説明するように、２以上の亜集団が互いに同じ程度に増殖される必要はない。むしろ、いくつかの態様において、増殖期間の終わりに集団１ 対 集団２の所望の比率が得られるように、1つの亜集団を他の亜集団よりも多くまたは少なく増殖させることができる。

いくつかの態様では、フィーダー細胞は野生型細胞であるが、いくつかの態様では、フィーダー細胞は、特に１以上の追加の刺激シグナルの存在下で、免疫細胞の増殖および／または活性化に特に適した状態になるように遺伝子改変されている。以下で詳しく説明するように、様々な細胞株は、ＮＫ活性化を刺激する特定の分子の表面発現をもたらすことができる遺伝子改変に適応している。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子の発現が低い、制限されている、またはそうでなければ欠如しているなどの特定の細胞種は、ＭＨＣ Ｉ分子がＮＫ細胞に対して阻害効果を有するため、ＮＫ細胞およびＴ細胞（および／または、態様によって、所望される他の単核細胞）の同時増殖に特に有用である。いくつかの態様において、Ｋ５６２細胞が用いられ、一方、いくつかの態様において、Ｋ５６２細胞、ウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、メラノーマ細胞株ＨＭＶ－ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ－６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ－１３０またはＬｕ－１３４－Ａ、神経芽細胞腫細胞株ＮＢ１９またはＮＢ６９、胚性癌精巣細胞株ＮＥＣ１４、子宮頸癌細胞株ＴＣＯ－２、および神経芽細胞腫細胞株ＴＮＢ１が用いられる。

いくつかの態様において、細胞はＭＨＣ Ｉ発現を完全に欠く必要はないが、野生型細胞よりも低いレベルでＭＨＣ Ｉ分子を発現していてよい。例えば、いくつかの態様において、野生型細胞がＸのレベルでＭＨＣを発現する場合、用いられる細胞株は、Ｘの９５％未満、Ｘの９０％未満、Ｘの８５％未満、Ｘの８０％未満、Ｘの７０％未満、Ｘの５０％未満、Ｘの２５％未満およびこれらの値の間（およびそれらを含む）の何れかの発現レベルでＭＨＣを発現していてよい。いくつかの態様において、刺激細胞は不死化されており、例えば、癌細胞株である。しかしながら、いくつかの態様において、刺激細胞は初代細胞である。いくつかの態様において、フィーダー細胞はまた、ＭＨＣ ＩＩ発現が減少した（または欠失した）細胞でもある。いくつかの態様において、ＭＨＣクラスＩ分子を発現し得る他の細胞株（またはクローン株）を、ＭＨＣ Ｉ発現を低減またはノックアウトするためにそれらの細胞の遺伝子改変と併せて用いることができる。そのような遺伝子改変は、ブロッキング抗体、干渉リガンド（例えば、競合的阻害剤、非競合的阻害剤など）に加えて、ＭＨＣ Ｉ分子の発現を阻止および／または低下させるために、様々な遺伝子編集技術（例えば、crispr／cas-9システム）、阻害性ＲＮＡ（例えば、siRNA）、または他の分子方法を用いることによって達成することができる。

以下でより詳細に記載するように、特定の刺激分子がフィーダー細胞によって発現されるように任意に遺伝子操作され、そのような刺激分子は、免疫細胞の増殖および／または活性化を促進するように作用する。刺激分子は、いくつかの態様において、フィーダー細胞によって発現させることができるが、別個に提供することもできる。いくつかの態様において、刺激分子は培養液に直接添加することができ、その濃度を容易に評価し、補充（replenished）することができるという利点がある。いくつかの態様において、分子は、例えば、金属、ガラス、プラスチック、高分子材料、粒子（例えば、ビーズまたはミクロスフェア）、および／または脂質（天然または合成のいずれか）などの添加材、または刺激分子が結合され得る何らかの他の材料に、固定または他の方法で結合されて提供される。

特定の分子は、免疫細胞の増殖、生存および／または活性化を促進し、いくつかの態様において、免疫細胞の特定の亜集団の増殖、生存および／または活性化を促進する。態様に応じて、刺激分子または分子は、免疫集団（または複数の集団）を増殖させるために用いられるフィーダー細胞の表面上に発現させることができる。さらなる態様において、１以上の刺激分子を、直接または何れかの添加材（例えば、ビーズ）に付着させて、細胞培養培地を補充するために用いる。いくつかの態様において、免疫細胞集団は比較的均一に増殖される（例えば、特定の亜集団が優先的に増殖されることはない）。しかしながら、いくつかの態様において、２以上の亜集団が増殖される。態様に応じて、２つの亜集団は、互いに同程度に増殖されてもよいし、そうでなくてもよい。いくつかの態様において、それらは、同じか、または類似の相対的な程度まで増殖されてもよいが、結果として得られる増殖された免疫細胞集団の細胞の絶対数に関しては、少なくとも部分的に、２つの亜集団のそれぞれの細胞の異なる開始数に基づいて、数が異なる。いくつかのそのような態様において、要すれば、すべての免疫細胞集団の増殖の前または後に、さらなる使用のために、所望の亜集団が選択的に分離される（例えば、ＮＫ細胞がＴ細胞から分離されるか、またはその逆である）。

いくつかの態様において、インターロイキン１５（ＩＬ１５）が、ＮＫ細胞などの免疫細胞の増殖を促進するために用いられる。いくつかの態様において、ＩＬ１５はフィーダー細胞上に膜結合している（本明細書中、“ｍｂＩＬ１５”と称する）。いくつかの態様において、ＩＬ１５は、膜貫通分子または内在性膜タンパク質に結合または複合体化されていることにより、膜結合している。いくつかの態様において、ＣＤ８αの膜貫通ドメインが用いられる。いくつかの態様において、野生型（例えば、完全長）ＩＬ１５が、フィーダー細胞上で、またはフィーダー細胞によって発現される。いくつかの態様において、ＩＬ１５は、完全長ＩＬ１５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の相同性を有する。いくつかの態様において、ＩＬ１５の切断型が用いられる。この、および免疫細胞の増殖に関係するこのおよび他の構築物についてのさらなる詳細は、２０１８年３月２７日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８に記載されており、その内容全体は引用により本明細書に包含させる。

いくつかの態様において、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）は、免疫細胞の増殖を促進するために用いられる。４－１ＢＢＬは、Ｔ細胞上のその受容体である４－１ＢＢと相互作用する細胞外ドメインを有し、それによってＴ細胞に生存、増殖および分化のための共刺激性シグナルを提供する。いくつかの態様において、４－１ＢＢＬは、膜貫通分子または内在性膜タンパク質に結合または複合体化されていることにより、フィーダー細胞上で膜結合している。いくつかの態様において、野生型（例えば、完全長）の４－１ＢＢＬは、フィーダー細胞上で、またはフィーダー細胞によって発現される。いくつかの態様において、４－１ＢＢＬは、完全長４－１ＢＢＬと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の相同性を有する。いくつかの態様において、４－１ＢＢＬの切断型が用いられる。いくつかの態様において、４－１ＢＢＬは、発現されるか、またはフィーダー細胞上での発現による以外の方法で培養に提供される。いくつかの態様において、４－１ＢＢＬは、ｍｂＩＬ－１５と組み合わせて、フィーダー細胞の表面上で発現される（フィーダー細胞のクローン集団によるものを含む）。いくつかの態様において、この刺激シグナルの組み合わせは、免疫細胞または末梢血単核細胞の出発サンプルにおいて、ＮＫ細胞の増殖を誘導する刺激を提供する。

本明細書で説明するように、いくつかの態様において、免疫細胞の１以上の亜集団の増殖をさらに増強するように機能する補足的な増殖激も提供される。例えば、いくつかの態様において、ＮＫ細胞の増殖拡張を増強する補足的な刺激が提供される。いくつかの態様において、補足的な刺激は、Ｔ細胞の増殖を増強するように機能する（一方で、別の刺激分子または分子が、ＮＫ細胞の増殖を誘導する）。いくつかの態様において、補足的な刺激は、単一の追加的な刺激分子によって達成され得る。しかしながら、いくつかの態様において、補足的な刺激は、互いに協調して作用する２つまたはそれ以上の刺激分子によってもたらされる。

例えば、いくつかの態様において、１以上のサイトカインが、ＮＫ細胞およびＴ細胞が培養される培地に添加される。いくつかの態様において、ＩＬ１２、ＩＬ１８またはＩＬ２１（またはそれらの組み合わせ）が添加される。いくつかの態様において、サイトカイン（複数可）は、サイトカイン（複数可）を発現するようにフィーダー細胞を遺伝子操作することによって添加される。いくつかの態様において、膜結合型サイトカインを用い、他の態様において、可溶性サイトカインを発現するように設計されたフィーダー細胞を用いる。いくつかの態様において、１以上の可溶性サイトカインが、ＮＫ細胞およびＴ細胞の増殖の開始時、またはその間の様々な時点で培養液に添加される。

いくつかの態様において、抗ＣＤ３抗体は、免疫細胞の増殖を促進するために用いられる。いくつかの態様において、抗ＣＤ３抗体はフィーダー細胞に膜結合している。いくつかの態様において、完全長抗ＣＤ３抗体がフィーダー細胞上で発現される。しかしながら、いくつかの態様において、抗ＣＤ３抗体は、一本鎖フラグメント可変領域（ｓｃＦｖ）フラグメントを含む。態様に応じて、抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。いくつかの態様において、抗ＣＤ３抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（例えば、二重特異性抗体、ナノボディ）から選択される様々な抗原性フラグメントおよび／または融合体を含む。いくつかの態様において、抗体は、ムロモナブ－ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブおよびビシリズマブからなる群、またはムロモナブ－ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブおよびビシリズマブの１以上と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の相同性（または機能的等価性）を有する抗体（またはフラグメント）からなる群より選択される。いくつかの態様において、抗ＣＤ３抗体は、フィーダー細胞を増殖すべき免疫細胞と共培養する際に培養液に添加されるさらなる材料に結合させて提供される。いくつかの態様において、このさらなる材料は、フィーダー細胞による抗ＣＤ３抗体の発現に加えて、その表面上にまたは分泌を介して提供される。

いくつかの態様において、抗ＣＤ２８抗体は、免疫細胞の増殖を促進するために用いられる。いくつかの態様において、抗ＣＤ２８抗体はフィーダー細胞上に膜結合している。いくつかの態様において、完全長抗ＣＤ２８抗体がフィーダー細胞上で発現される。しかしながら、いくつかの態様において、抗ＣＤ２８抗体は、一本鎖フラグメント可変領域（ｓｃＦｖ）フラグメントを含む。態様によっては、抗体はモノクローナルまたはポリクローナルである。いくつかの態様において、抗ＣＤ２８抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（例えば、二重特異性抗体、ナノボディ）から選択される様々な抗原性フラグメントおよび／または融合体を含む。いくつかの態様において、抗体は、セラリズマブおよびセラリズマブの１以上と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の相同性（または機能的等価性）を有する抗体（またはフラグメント）からなる群より選択される。いくつかの態様において、抗ＣＤ２８抗体は、フィーダー細胞を増殖すべき免疫細胞と共培養する際に培養液に添加されるさらなる材料に付着して提供される。いくつかの態様において、このさらなる材料は、フィーダー細胞による抗ＣＤ２８抗体の発現に加えて、その表面上にまたは分泌を介して提供される。

いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖を相乗的に高めるために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体が共に提供される。いくつかの態様において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、ビーズまたは他の幾何学的形状などの固体支持体または他のさらなる材料に結合して提供される。いくつかの態様において、ビーズの集団は、抗ＣＤ３抗体に結合された部分と抗ＣＤ２８抗体に結合された別の部分を有し、一方、いくつかの態様において、抗体はビーズ（または他の材料）上に両方が存在する。

態様に応じて、また目的の刺激分子（複数可）に応じて、刺激分子は、免疫細胞集団、または複数の免疫細胞亜集団との共培養の過程において、特定の時点で導入されてよい（例えば、培養物に添加されるか、またはフィーダー細胞によって発現されてもよい）。例えば、共培養中に構成的に発現されるのではなく、１つまたは複数の刺激分子が、誘導可能なプロモーター、またはそうでなければ制御可能なプロモーターの制御下にあり得る。このように、トリガーとなる分子や刺激物を所望の時点で共培養に添加することで、増殖・活性化プロトコールの特定の時点で所望の刺激分子（複数可）を発現させることができる。例えば、いくつかの態様において、最初にＮＫ細胞を優先的に増殖させ、次いでＴ細胞を増殖させることが望ましい場合がある。そのため、増殖の初期段階では、ＮＫ細胞を刺激する分子を“オン（turned on）”にし、後の段階では、Ｔ細胞を刺激する分子を“オン”にすることができる。上記のように、“オン”とは、刺激分子の調節された発現の結果であるか、または単に刺激分子の培養物への添加の結果であり得る。本明細書で用いる用語“誘導可能なプロモーター”および“調節可能なプロモーター”は、その通常の意味を与えられるものとし、また、転写活性が特定の生物学的因子または非生物学的因子の存在によって調節される（例えば、刺激または阻害される）プロモーターを意味するものとする。本明細書で用いる用語“トリガー分子”または“トリガー刺激”とは、通常の意味で用いられるものとし、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属および他の化合物、ならびに培養温度の高低など、誘導可能なプロモーターまたは調節可能なプロモーターに作用する化学的または物理的な物質または条件を意味する。さらに、刺激分子の調節可能な発現を利用して、培養プロセス中に特定の刺激分子の発現を低減および／または排除することもできる。そのような態様は、例えば、ＮＫ細胞がそのようなシグナル伝達に対して特に感受性が高い活性化および増殖プロセス中のある時点で特定の刺激シグナルを提供することにより、ＮＫ細胞などの免疫細胞の特定の亜集団の優先的な増殖を促進することができる。いくつかの態様において、このようなアプローチは、ＮＫ細胞の予想外にロバストな活性化および増殖をもたらし得る。さらなる追加の態様において、ＮＫ細胞の増殖期間が延長され、最終的には、例えば癌免疫療法に用いるための活性化されたＮＫ細胞のより大きな集団をもたらす。同様に、いくつかの態様において、Ｔ細胞などの免疫細胞の第２の（またはさらなる）所望の亜集団を増殖させるために、別のシグナルを提供することができる。その結果、いくつかの態様において、結果的に増殖された細胞集団は、ドナーに存在するＮＫ：Ｔ細胞の相対的な量とは異なる程度に増殖された、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合物を含み得る。

いくつかの態様において、フィーダー細胞の所定の集団内で、集団内の特定の個々の細胞が、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方を同時に増殖するなど、２種以上の所望の免疫細胞を増殖するのに特に適している。そのような個体（例えば、クローン）の同定については、以下でより詳細に説明する。いくつかの態様において、同定されたクローンは、フィーダー細胞のクローン集団が提供されるように複製され、各個体は、ＮＫ細胞およびＴ細胞などの２以上のタイプの免疫細胞を同時に増殖する能力に関して、元の親細胞の有益な特性を共有している。このように、いくつかの実施形態では、フィーダー細胞のクローン集団を用いて、免疫細胞の１以上の亜集団を一緒に、要すれば同時に（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞など）増殖させる。

ドナー材料およびプロセシング
いくつかの態様において、免疫細胞の複数の集団を増殖するための方法は、ドナー細胞集団の変動を考慮するための十分な柔軟性を提供するので、特に有利である。図１Ａから１Ｄに示すように、ベースラインの血液サンプルにおける他の細胞に対するＮＫ細胞およびＴ細胞の相対的な分布は、かなり変化し得る。正常な末梢血では、Ｔ細胞の相対的存在率は約１０～約２５％の範囲であり、一方、正常なＴ細胞の存在率は約２～約５％の範囲である（例えば、https://www.bio-rad-antibodies.com/static/2017/flow/flow-cytometry-cell-frequency.pdf 参照）。図１Ａは、Ｔ細胞が約１２．５％、ＮＫ細胞が約１２．５％、残りの約７５％が他の細胞タイプで構成されているドナー１からのそれらの割合を示している。図１Ｂに示したドナー２は、Ｔ細胞が約３５％で、ＮＫ細胞はわずか約５％であった。図１Ｃに示したドナー３は、Ｔ細胞が約２０％、ＮＫ細胞が約１０％であった。同様に、図１Ｄに示したドナー４は、Ｔ細胞が約２５％、ＮＫ細胞が約５％であった。これらのサンプルデータは、ドナー間のばらつきがかなり大きく、時にはＮＫ細胞とＴ細胞の“正常な”期待範囲外になることがあることを示している。

上記のデータからわかるように、いくつかの態様により、培養方法または培養プロセスを調整することで、出発物質におけるこの変動に対応することができる。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載の方法およびプロセスにより、Ｔ細胞集団において実質的に異なる初期ＮＫで開始する場合でさえ、所望のＮＫ：Ｔ細胞比を達成することができる。いくつかの態様において、出発物質として提供されるＮＫ細胞の割合は、血液サンプルの末梢血単核細胞の約０．５％～約３５％の範囲とすることができ、これには約０．５％～約１％、約１％～約２％、約２％～約４％、約３％～約５％、約２％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約１５％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約３５％、および明示的に記載された値（エンドポイントを含む）の間の出発サンプル中のＮＫ細胞の何れかの割合が含まれる。いくつかの態様において、出発サンプル中のＮＫ細胞の割合は、約２％から約５％の範囲である。同様に、血液サンプル中に存在するＴ細胞の割合も変化し得る。例えば、いくつかの態様において、出発サンプル中に供されるＴ細胞の割合は、約５％から約３０％の範囲であり、これには約５％から約１０％、約１０％から約１５％、約１５％から約２０％、約２０％から約２５％、約２５％から約３０％、および明示的に記載された値（エンドポイントを含む）の間の出発サンプル中のＴ細胞の何れかの割合が含まれる。

いくつかの態様において、本明細書に記載の方法およびプロセスの実施中に生じるかなりの程度の増殖により、出発物質のばらつきが最終的な混合細胞集団に与える影響は最小限である。言い換えれば、いくつかの態様において、細胞集団は、互いに比較して細胞の絶対数が異なる可能性があるにもかかわらず、結果として得られるＮＫ細胞数、Ｔ細胞数および／または他の所望の免疫細胞亜集団の数が臨床的に適切であるように、かなりの程度まで増殖される。

以下でより詳細に記載されるように、有利には、出発血液サンプルにおけるＮＫ細胞 対 Ｔ細胞の相対的存在率に潜在的にかなりの違いがあるにもかかわらず、本明細書に記載の方法およびプロセスは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の最終的な混合集団における所望の比率を達成するために、両細胞タイプ（要すれば、調整可能な追加の免疫細胞亜集団を含む）の調整された増殖を可能にする。例えば、いくつかの態様において、細胞の究極の混合集団におけるＮＫ細胞とＴ細胞の比率は、態様に応じて、約１００ 対 １から約１対１００の範囲とすることができる。

免疫細胞の複合増殖
上記のように、いくつかの態様において、免疫細胞の複数の亜集団を互いに共に培養にて増殖させる。態様に応じて、単一の増殖プロトコールを用いて、複数の細胞集団を順に（例えば、ＮＫ細胞の最初の増殖、続いてＴ細胞の増殖）または並行して（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞の同時共培養）増殖してもよい。いくつかの態様による単一の増殖プロトコールは、例えば、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方が同時に培養物中に存在する場合であっても、１つの細胞タイプを他の細胞タイプよりも優先的に増殖するように向けられた複数の増殖期（フェーズ）を含んでもよい。

上記の通り、様々なタイプのフィーダー細胞を用いて、複数のタイプの所望の免疫細胞の増殖を誘導することができる。用いるフィーダー細胞は、いくつかの態様において、全体的に刺激性の増殖促進効果を有するが、集団内の個々の細胞がフィーダー細胞集団の他のメンバーと比較して潜在的に様々な特性を有するフィーダー細胞集団を含む、フィーダー細胞の混合集団から構成されてもよい。しかしながら、いくつかの態様において、複数の免疫細胞亜集団の増殖を刺激するための望ましい特性を有するフィーダー細胞が特定され、クローン増殖され、その結果得られたフィーダー細胞のクローン集団が、複数の免疫細胞タイプの複合的な増殖のために用いられる。態様によっては、２種類、３種類、４種類（またはそれ以上）の免疫細胞を共に増殖させることができる。いくつかの態様において、共に増殖された免疫細胞は、ＮＫ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、粘膜関連不変性Ｔ細胞および／または様々なタイプのＮＫ細胞亜集団（例えば、阻害性受容体シグナル伝達と比較してより強力な活性化受容体シグナル伝達を有するＮＫ細胞、またはその逆）のうちの２以上である。共増殖のためのアプローチの限定されない態様は、図２に模式的に記載されており、以下の実施例でより詳細に説明される。

態様に応じて、フィーダー細胞（混合集団またはクローン集団のいずれか）を培養容器に播種する。播種密度は、態様によって異なり、例えば、約０．５×１０^５細胞／ｃｍ^２～約５×１０^７細胞／ｃｍ^２の範囲であり、この範囲には約１．０×１０^５細胞／ｃｍ^２～約１．５×１０^５細胞／ｃｍ^２、約１．５×１０^５細胞／ｃｍ^２～約５×１０^５細胞／ｃｍ^２、約５×１０^５細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^６細胞／ｃｍ^２、約１．０×１０^６細胞／ｃｍ^２～約５×１０^６細胞／ｃｍ^２、約５×１０^６細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^７細胞／ｃｍ^２、約１．０×１０^７細胞／ｃｍ^２～約５．０×１０^７細胞／ｃｍ^２、およびそれらの間の任意の播種密度（エンドポイントを含む）が含まれる。いくつかの態様において、フィーダー細胞と共に培養される免疫細胞の予想される数に応じて、より多いまたは少ない初期播種密度を用いることができる。いくつかの態様において、１ｃｍ^２あたり約１×１０^６個の細胞の初期播種密度が用いられる。

いくつかの態様において、フィーダー細胞は、フィーダー細胞自体の増殖速度を低下させるために、１以上の薬剤で前処理されてもよい。例えば、いくつかの態様において、フィーダー細胞は、増殖すべき免疫細胞集団と共に培養する前に放射線照射される。いくつかの態様において、放射線照射の代りにまたは補足として、フィーダー細胞は、例えばマイトマイシンＣなどの抗増殖剤で処理される。

上記のように、いくつかの態様において、フィーダー細胞のより大きな集団内の特定の個々の細胞は、２以上の免疫細胞サブタイプの増殖に望ましい特性を有する。いくつかの態様において、免疫細胞集団の増殖に用いられるフィーダー細胞は、フィーダー細胞のクローン由来の集団である。言い換えれば、１以上のタイプの免疫細胞の増殖に望ましい特性を有すると同定された個々のクローンは、それ自体がクローン的に増殖され、結果として生じる集団がすべてそれらの有益な特性を共有するようになる。いくつかの態様において、増殖すべき免疫細胞をフィーダー細胞のクローン集団に曝すことで、最終的に増殖された免疫細胞集団のばらつきを有利に低減することができる。その結果、いくつかの態様において、より大きな製品の一貫性が達成される。

また、上記のように、いくつかの態様において、増殖培養液に１以上の刺激分子を補充することができる。いくつかの態様において、そのような分子は、フィーダー細胞層の一般的な健康状態を促進し、増殖される免疫細胞集団を刺激し、増殖前、増殖中または増殖後の免疫細胞集団の健康状態を強化し、またはこれらのいくつかの組み合わせを機能させる。いくつかの態様において、インターロイキン－２（ＩＬ２）を培養液の補充に用いる。態様によっては、インターロイキン２の濃度は、免疫細胞の増殖が行われる期間にわたって変化し得る。ＩＬ２濃度は、約１０単位／ｍＬ～約２０単位／ｍＬ、約２０単位／ｍＬ～約４０単位／ｍＬ、約４０単位／ｍＬ～約６０単位／ｍＬ、約６０単位／ｍＬ～約８０単位／ｍＬ、約８０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬ、約１００単位／ｍＬ～約１５０単位／ｍＬ、約１５０単位／ｍＬ～約２００単位／ｍＬ、約２００単位／ｍＬ～約３００単位／ｍＬ、約３００単位／ｍＬ～約４００単位／ｍＬ、約４００単位／ｍＬ～約５００単位／ｍＬ、約５００単位／ｍＬ～約７５０単位／ｍＬ、約７５０単位／ｍＬ～約１０００単位／ｍＬ、およびこれらの間の任意の濃度（エンドポイントを含む）を含む、約１０単位／ｍＬ～約１０００単位／ｍＬの範囲とすることができる。ＩＬ－２による刺激は、特定の態様によれば、増殖プロトコールごとに複数回繰り返すことができる。さらに、再刺激を行うことができるだけでなく、様々な濃度での刺激を、増殖プロトコール中の異なる時点で行うことができる。態様によっては、他のインターロイキン類または他の刺激分子を、本明細書に記載のプロセスで用いることができる。

態様によっては、細胞の増殖期間は、約４日から約２０日の範囲内である。いくつかの態様において、フィーダー細胞との培養期間に応じて、異なる免疫細胞亜集団が異なる速度で増殖する。例えば、特定の細胞タイプは初期の時点でより急速に増殖し、他の細胞タイプは後期の時点でより急速に増殖する。このように、最終的な免疫細胞集団内での異なる免疫細胞サブタイプの割合を所望する場合は、それに応じて増殖のタイミングを調整することができる。いくつかの態様において、増殖条件は、約４～６日、約６～８日、約８～１０日、約１０～１４日または約１４～２１日間が採用される。いくつかの態様において、増殖培養時間を長くすることで、増殖細胞の全体的な絶対数を大きくすることができる。しかしながら、いくつかの態様において、予備的な濃縮ステップを実行して、増殖する各免疫細胞サブタイプの開始数が、元の収集されたサンプル中のそれよりも大きくなるようにして、増殖時間を調整的に短縮させることができる。

態様によっては、増殖させる免疫細胞に対するフィーダー細胞の比率を、最終的な所望の結果および増殖させる免疫細胞集団の構成に応じて調整することができる。例えば、いくつかの態様において、フィーダー細胞：“標的”細胞の比率が約５：１で用いられる。いくつかの態様において、１：１の比率が用いられ、さらなる態様において、約１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１００，０００：１、５０，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、および列記されたそれらの間のすべての比率の範囲およびエンドポイントを含むものとすることができる。いくつかの態様において、細胞タイプの組合せ（例えば、Ｋ５６２と１以上のさらなる細胞タイプとの組合せ）が用いられ、その結果、ＮＫ細胞の活性化および／または増殖は、何れかの単一細胞タイプを単独で用いた場合に達成され得るよりも大きい（例えば、細胞タイプ間の相乗効果の結果として）。いくつかのそのような態様において、ＭＨＣ Ｉの発現は、組み合わせて用いられる細胞株のそれぞれにおいて、必ずしも減少および／または欠失される必要はない。いくつかの態様において、所望の免疫細胞集団の増殖および活性化を最大化するために、組み合わせた１つの細胞タイプと他の細胞タイプの相対頻度を変化させることができる。例えば、２つのフィーダー細胞集団を用いる場合、相対頻度は、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１００，０００：１、５０，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、および列記されたそれらの間のすべての比率の範囲およびエンドポイントを含むものとすることができる。

同様に、本明細書に記載のいくつかの態様に従って、複数の免疫細胞亜集団が組み合わせて増殖されることを考慮すると、特定の態様において、互いに対する免疫細胞サブタイプの初期比率を調整することができる。例えば、上記のように、所定の血液サンプルにおけるＴ細胞に対するＮＫ細胞の相対的な存在量には、ドナー間でばらつきがある可能性がある。したがって、いくつかの態様において、特定のサンプルにおいて一方の細胞タイプが他方の細胞タイプに比べて相対的に過剰である場合、細胞タイプ１と細胞タイプ２の所望の使用比（input ratio）を達成するために、濃縮工程または枯渇工程を実施することができる。例えば、限定されない例として、ドナーから採血された血液サンプルで、Ｔ細胞が収集された細胞集団の約２５％を占め、ＮＫ細胞が収集された細胞集団の約５％を占めている場合を考えてみる。このような態様において、予備的な増殖工程を用いて、ＮＫ細胞の絶対数が収集した血液サンプルからのＴ細胞の絶対数とほぼ同等になるように、ＮＫ細胞数を増やすことができる。その後、同等のＮＫ細胞数およびＴ細胞数で、ＮＫ細胞およびＴ細胞をフィーダー細胞と共に培養し、増殖を誘導して、最終的に増殖細胞集団におけるＮＫ細胞とＴ細胞の比率を所望の比率、例えば１：１にすることができる。別のアプローチでは、Ｔ細胞の大きな集団を枯渇させてＴ細胞数をＮＫ細胞数とほぼ同等の量に減らし、その後、本明細書に記載のように、同数のＮＫ細胞およびＴ細胞をフィーダー細胞と共培養することができる。

増殖すべき免疫細胞に対するフィーダー細胞の比率の調整と同様に、所定の培養内で増殖すべき様々なタイプの免疫細胞の比率を相対的に調整することができる。例えば、所定の培養の初期段階におけるＮＫ細胞とＴ細胞の比率は、約１０,０００：１、約７５００：１、約５０００：１、約２５００：１、約２０００：１、約１５００：１、約１０００：１、約７５０：１、約５００：１、約２５０：１、約１００：１、約７５：１０、約５０：１、約２５：１、約１５：１、約１０：１、約５：１、約１：１、約１：５、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：２５０、約１：５００、約１：７５０、約１：１０００、約１：１５００、約１：２０００、約１：２５００、約１：５０００、約１：７５００、約１：１０，０００、および列記されたそれらの間のすべての比率およびエンドポイントを含む、約１０,０００：１～約１：１０,０００細胞の範囲とすることができる。

以下でより詳細に記載されるように、いくつかの態様において、他のタイプの免疫細胞ならびにフィーダー細胞との組み合わせで培養されている複数のタイプの免疫細胞のうちの１つの優先的な増殖を誘導することを意図する補助的刺激（supplemental stimulus）を使用する。いくつかの態様において、補助的刺激は、増殖段階の開始時に追加され、本質的に元の刺激環境の一部と見なされ得る。さらなる態様において、補助的刺激の導入を遅らせて、例えば、特定の細胞タイプの第１段階の増殖に続いて、異なる細胞タイプの第２段階の増殖を行い、後者を補助的刺激の導入によって誘導することができる。態様によっては、共培養開始から約３日後、約４日後、約５日後、約７日後、約１０日後、約１４日後、またはこれらの間の共培養開始後の何れかの時点で、補助的刺激を投与することができる。換言すれば、補助的刺激は、増殖プロトコールの約０％が完了した後、増殖プロトコールの約１０％が完了した後、増殖プロトコールの約２５％が完了した後、増殖プロトコールの約５０％が完了した後、または増殖プロトコールの約７５％が完了した後に追加することができる。

態様によっては、以下でより詳細に説明するように、２以上の亜集団が互いに同じ程度に増殖される必要はない。むしろ、いくつかの態様において、増殖期間の終わりに集団１対集団２の所望の比率が得られるように、１つの亜集団を他の亜集団よりも多くまたは少なく増殖することができる。増殖後の所望の比率は、例えば、約１０，０００：１、約７５００：１、約５０００：１、約２５００：１、約２０００：１、約１５００：１、約１０００：１、約７５０：１、約５００：１、約２５０：１、約１００：１、約７５：１０、約５０：１、約２５：１、約１５：１、約１０：１、約５：１、約１：１、約１：５、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：２５０、約１：５００、約１：７５０、約１：１０００、約１：１５００、約１：２０００、約１：２５００、約１：５０００、約１：７５００、約１：１０，０００、および列記されたそれらの間のすべての比率およびエンドポイントを含む、約１０，０００：１～約１：１０，０００細胞の範囲のＮＫ細胞対Ｔ細胞の比率であり得る。

増殖された細胞の遺伝子操作
態様によっては、増殖後の免疫細胞を、免疫療法を必要とする対象に、さらなる修飾なしに投与することができる。いくつかの態様において、増殖された免疫細胞集団は、薬学的に許容される担体と混合された後、投与される。以下に詳述するように、投与は、様々な経路のいずれかによって行うことができ、自己（autologous）または同種異系（allogeneic）の状況で行うことができる。いくつかの態様において、増殖された細胞は、標的腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を高めるように遺伝子操作される。例えば、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞は、該ＮＫ細胞および／またはＴ細胞が例えば腫瘍細胞を認識する能力および／または細胞毒性効果を発揮する能力を増強するキメラ受容体を発現するように遺伝子操作することができる。細胞は、２０１８年３月２７日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２４６５０号（その内容全体は引用により本明細書に包含させる）に詳細に記載されているものを含む、様々な異なる方法で遺伝子操作することができる。

細胞毒性受容体複合体
本明細書に記載のＮＫ／Ｔ細胞によって、様々な細胞毒性受容体が発現され得る。いくつかの態様において、受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、本明細書に記載の標的腫瘍マーカーの１以上に対して向けされる。いくつかの態様において、ＣＡＲは、アミノ酸配列をコードする特定のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの態様において、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ζキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される。このポリヌクレオチドは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含むか、またはこれらからなる。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む。かかる態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ３ｚｅｔａドメイン、２Ａ切断部位およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むか、またはこれらからなる。いくつかの態様において、この受容体複合体は、配列番号１の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、ＮＫ１９キメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号１と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性（homology）および／または機能的等価性を有する配列を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＮＫ１９キメラ抗原受容体は、配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的等価性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、Ｆｌａｇタグを含まない。いくつかの態様において、ヒト化および／またはコドン最適化されたＣＡＲが用いられる。本明細書に記載の態様に従って用いられ得る腫瘍結合構築物のさらなる例は、２０１８年３月２７日出願のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２４６５０号、２０１９年３月５日出願の米国仮特許出願第６２／８１４，１８０号、２０１９年９月４日出願の米国仮特許出願第６２／８９５，９１０号、２０１９年１１月７日出願の米国仮特許出願第６２／９３２，１６５号、および２０１９年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６２／９２４，９６７号に記載されており、それぞれの内容全体が引用により本明細書に包含される。

投与および投与量
本明細書中、癌を有する対象を処置する方法であって、該対象に、増殖された免疫細胞の混合集団（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合物）を含む組成物を投与することを含む方法をさらに提供する。いくつかの態様において、増殖細胞は、細胞毒性受容体複合体（例えば、キメラ受容体またはキメラ抗原受容体）を発現するように遺伝子操作される。癌を処置するためのそのような遺伝子改変免疫細胞の使用も提供される。特定の態様において、本明細書に記載の増殖された混合細胞集団による対象の処置は、例えば、以下の効果の１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上を達成する：(i）疾患またはそれに関連する症状の重篤度の軽減または改善、（ii）疾患に関連する症状の持続時間の短縮、（iii）疾患またはそれに関連する症状の進行に対する保護、（iv）疾患またはそれに関連する症状の退行、（v）疾患に関連する症状の発生または発症に対する保護、（vi）疾患に関連する症状の再発に対する保護、(vii）対象の入院の削減、（viii）入院期間の短縮、（ix）疾患を有する対象の生存期間の延長、（x）疾患に関連する症状の数の減少、（xi）別の治療法の予防または治療効果の強化、改善、補足、補完または増強、（xii）標的細胞に対する二相性（例えば、即効かつ長時間）の細胞毒性効果。これらの比較はそれぞれ、例えば、疾患に対する異なる治療法に対するものであり、これには、本明細書に記載の構築物を発現しない細胞を用いた疾患に対する細胞ベースの免疫療法が含まれる。

投与は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、肝臓内、腹腔内および／または罹患組織への局所的な送達を含むが、これらに限定されない、様々な経路によって行うことができる。免疫細胞の増殖された混合集団の投与量は、対象の体重、疾患の種類および状態ならびに処置の所望の侵攻性（aggressiveness）に基づいて、所定の対象に対して容易に決定することができるが、態様に応じて、１ｋｇあたり約１０^５細胞から１ｋｇあたり約１０^１２細胞の範囲（例えば、１０^５－１０^７、１０^７－１０^１０、１０^１０－１０^１２およびその中の重複範囲）である。いくつかの態様において、免疫細胞の混合集団は、様々な細胞タイプの遺伝子操作された比率を有する。例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団では、ＮＫ：Ｔ細胞の比率は、約１０００：１、約７５０：１、約５００：１、約２５０：１、約１００：１、約７５：１、約５０：１、約２５：１、約１０：１、約５：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：５、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：２５０、約１：５００、約１：７５０または約１：１０００（または列記されたそれらの間の何れかの比率）の範囲であり得る。いくつかの態様において、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率は、標的細胞数に関して表される。例えば、いくつかの態様において、ＮＫ：標的細胞の比率は、約１：１、１：２、１：４、１：８または１：１０であり、Ｔ細胞：標的細胞の比率は、約１：２、１：４、１：８または１：１０である。いくつかの態様において、これらの比率の組合せが用いられ、例えば、ＮＫ細胞：標的細胞が１：４であり、Ｔ細胞：標的細胞が１：８である。

同様に、いくつかの態様において、３つ（またはそれ以上）の異なるタイプまたはサブタイプの細胞を混合集団で用いることができる。そこでの比率は、３つのサブタイプの細胞が互いにほぼ同等である約１：１：１から、１つの細胞タイプが他の細胞タイプよりも優勢である約１０００：１：１または約１：１：１０００までの範囲とすることができる。同様に、態様に応じて、中間の比率も用いることができ、例えば、約１０：５：１、または約１：５：１０、または約５：１：１０の比率などが挙げられる。さらに、亜集団は、互いに一定の比率の範囲で組み合わせることができる。例えば、集団を２つの細胞タイプで構成する場合、所定のパラメーターを用いて第１の細胞タイプの集団サイズを決定し、これを用いて第２の（または第３、第４などの）細胞タイプの集団サイズを決定することができる。限定されない例として、標的細胞集団に対するＮＫ細胞の細胞毒性を計算して、集団に加えるべきＮＫ細胞数を決定することができ、これを、集団に加えるべきＴ細胞数を計算するその後の計算の入力値として使用する。顕著に効果的なＮＫ細胞の集団を用いる場合、ＮＫ細胞は例えば混合集団の２５％を占め、残りをガンマデルタＴ細胞が占めてもよい（第３または第４の細胞タイプを追加する場合、残りはより少なくなる）。

いくつかの態様において、用量漸増レジメンも提供される。いくつかの態様において、例えば、約１×１０^６細胞／ｋｇから約１×１０^８細胞／ｋｇの間の範囲の免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞）が投与される。態様に応じて、様々な種類の癌を処置することができる。いくつかの態様において、肝細胞癌が処置される。本明細書で提供されるさらなる態様には、以下の限定されない例の癌の処置または予防が含まれ、それらには、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、カポジ肉腫、リンパ腫、胃腸癌、虫垂癌、中枢神経系癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、脳腫瘍（星状細胞腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、神経膠芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫を含むがこれらに限定されない）、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、大腸癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、管癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛細胞白血病、腎細胞癌、白血病、口腔癌、鼻咽頭癌、肝臓癌、肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌を含むがこれらに限定されない）、膵臓癌、腸癌、リンパ腫、黒色腫、眼癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、下垂体癌、子宮癌および膣癌が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書でより詳細に論じられるように、様々な遺伝子改変細胞を用いて、多数の異なる腫瘍タイプを標的化することができる。態様に応じて、固形腫瘍または浮遊腫瘍を標的とすることができる。いくつかの態様において、本明細書に記載の遺伝子改変細胞を用いて血液腫瘍を処置する。例えば、いくつかの態様において、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ
）細胞が標的とされる。ＡＭＬは、骨髄、血液または他の組織における芽球のクローン性増殖に起因する。ＡＭＬは、全癌の約３％を占め、ＡＭＬの発生率は年齢とともに増加する。６５歳以下の患者では、約７０～８０％の患者で完全寛解が得られ、全生存率は約３５％となっている。６５歳以上の患者では、その数は減少し、４０～６０％の症例で寛解し、全生存率は約５％に減少する。図２の免疫組織化学パネルに示されているのは、白血病芽球が陽性に染色された骨髄吸引液である。

本明細書に記載の遺伝子改変細胞を用いて、様々なマーカーを標的化することができる。ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＮＹ－ＥＳＯ、ＢＣＭＡなどは、多くの癌で発現されている。いくつかの態様において、特にＡＭＬでは、ＣＤ１２３およびＮＫＧ２Ｄリガンドが上方制御される。特定の患者（例えば、ＡＭＬ患者）では、ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＰＢ１、ＵＬＰＢ２、ＵＬＰＢ３を含むが、これらに限定されない）の表面発現が上方制御される。同様に、それらの患者の一部では、かなりの割合（例えば、約８０％以上）の芽球細胞、白血病幹細胞および内皮細胞がＣＤ１２３陽性である。したがって、いくつかの態様において、ＮＫＧ２Ｄリガンドおよび／またはＣＤ１２３を標的とするように免疫細胞が遺伝子操作される。

以下のリストは、本明細書に記載の結合部位／活性化部位によって結合することができる抗原の限定されない例を含む：Ｈｅｒ２、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、クローディン６、ＮＹ－ＥＳＯ、ＧＤ－２、ＧＤ－３、デクチン－１、癌抗原－１２５（ＣＡ－１２５）、ＣＡ１９－９、カルレチニン、ＭＵＣ－１、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、総嚢胞性疾患液タンパク質（ＧＣＤＦＰ－１５）、ＨＭＢ－４５抗原、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、プロテインメランＡ（Ｔリンパ球によって認識されるメラノーマ抗原；ＭＡＲＴ－１）、Ｍｙｏ－Ｄｏｌ、筋特異的アクチン（ＭＳＡ）、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィジン（synaptophysis）、サイログロブリン、甲状腺転写因子－１、ピルビン酸キナーゼアイソザイムタイプＭ２の二量体（腫瘍Ｍ２－ＰＫ）、異常なｒａｓタンパク質、異常なｐ５３タンパク質、ｆｕｃ－ＧＭｌ、ＧＭ２（胎児腫瘍性抗原－免疫原性－１；ＯＦＡ－Ｉ－１）；ＧＤ２（ＯＦＡ－Ｉ－２）、ＧＭ３、ＧＤ３、α－アクチニン－４、Ｂａｇｅ－１、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＣＲ－Ａｂｌ融合タンパク、β－カテニン、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、Ｃａｓｐ－８、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、Ｃｏａ－１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＢＮＡ、ＥＦ２、エプスタインバンウイルス抗原、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ１１、ｈｓｐ７０－２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ－１、２、３、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ－９、ｐｍｌ－ＲＡＲａ融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、トリオースリン酸イソメラーゼ、Ｇａｇｅ３，４，５，６，７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ－Ｋ－ｍｅｌ、Ｌａｇｅ－１、ＮＡ－８８、ＮＹ－Ｅｓｏ－ｌ／Ｌａｇｅ－２、ＳＰ１７、ＳＳＸ－２、ＴＲＰ２－Ｉｎｔ２、ｇｐｌＯＯ（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＲＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５（５８）、ＲＡＧＥ、ＳＣＰ－１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ－１８０、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、１３－カテニン、Ｍｕｍ－１、ｐｉ６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ）、精子タンパク質１７（Ｓｐｌ７）、メソセリン、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、プロステイン、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ代替リーディングフレームタンパク質）、Ｔｒｐ－ｐ８、ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原１）、インテグリンανβ３（ＣＤ６１）、ガラクチン、Ｒａｌ－Ｂ、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、ＤＬＬ＃、ＣＤ５、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＥＧＦＲ、ＫＲＥＭＥＮ２、ＰＳＭＡ、ＡＬＰＰＬ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８、ＧＰＲ１４３、ＧＲＭ８、ＬＰＡＲ３、ＧＤ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＥＣＴ１、ＴＭＥＭ１８６など。

実施例
以下は、下記の実施例で用いた試験方法および材料の限定されない説明である。

実施例１－Ｋ５６２クローン配列決定
上記のように、いくつかの態様において、フィーダー細胞株を用いて、ドナーの血液サンプルからＮＫ細胞およびＴ細胞の両方を増殖させる。この実施例は、改変されたＫ５６２の集団から識別するために実施された。

上記の観点から、いくつかの態様において、ドナーから単離された免疫細胞の集団内の特定の細胞タイプの相対的な比率を調整するために予備的工程が実施される。例えば、いくつかの態様において、増殖プロセス中にＴ細胞がＮＫ細胞を圧倒的に超えるのを防ぐために、初期サンプルからＴ細胞の一部を選択的に除去することができる。態様によっては、ＮＫ細胞とＴ細胞の任意の比率を、このような予備的ステップによって達成することができる。例えば、いくつかの態様において、１：１のＮＫ：Ｔ細胞の比率が増殖の開始時に用いられる。さらなる態様において、必要に応じて、ＮＫ細胞をＴ細胞に対して開始材料プールで濃縮することができる。例えば、いくつかの態様において、これには、約１０００：１、約７５０：１、約５００：１、約２５０：１、約１００：１、約７５：１、約５０：１、約２５：１、約１０：１、または明示的に記載されたそれらの間の何れかの比が含まれる、約１０００：１～約１０：１のＮＫ：Ｔ細胞の開始比が用いられる。

図２に示すように、限界希釈をＫ５６２細胞の集団に適用して、スクリーニングのためのより少ない数の個々のＫ５６２クローンを生成した。開始Ｋ５６２細胞は、４－１ＢＢＬならびに膜結合ＩＬ１５を発現するように遺伝子操作された。態様によっては、Ｋ５６２細胞をさらに改変して、例えばＩＬ１２および／またはＩＬ１８などの１以上の追加の刺激分子を発現させることができる。さらなる態様において、Ｋ５６２細胞は改変される必要はないが、要すれば改変され、培養液には１以上のそのような追加の刺激分子が補充される。このようなＫ５６２細胞に関する詳細な情報は、２０１８年３月２７日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８に記載されており、その内容全体が引用より本明細書に包含される。他の態様でも適用されるこの特定の例では、Ｋ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂＩＬ１５クローンは、免疫グロブリンＩｇＧ２ａアイソタイプのマウスモノクローナル抗体であるＯＫＴ３抗体の一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）を発現するようにも遺伝子操作された。この抗体は、成熟Ｔ細胞にのみ存在する多分子複合体の一部であるＣＤ３を標的としている。Ｔ細胞とＯＫＴ３の相互作用により、Ｔ細胞が活性化される。マウスＯＫＴ３抗体は、ヒトＣＤ３複合体のイプシロンサブユニット上のエピトープと反応するため、ＮＫ細胞を刺激するＫ５６２細胞にＴ細胞を刺激する能力を増強させることができる。限られた希釈率でクローニングすることにより、導入された遺伝子（ここではｍｂＩＬ１５、４－１ＢＢＬおよびｓｃＦｖ ＯＫＴ３）を異なる量で発現する可能性のある異なるサブクローンを同定することができる。特に、フィーダー細胞に導入された遺伝子の発現の変動性は、免疫細胞の増殖に関して異なる特徴をもたらし得る。換言すれば、所定のクローンは、Ｔ細胞よりもＮＫ細胞をよりロバストに（例えば、効率的に）増殖することができる。いくつかの態様において、所定のクローンは、ＮＫ細胞よりもＴ細胞をよりロバストに（例えば、効率的に）増殖することができる。さらに別の態様において、所定のクローンは、一般的により健康であり、より長く生存することができ、標的細胞に対してより効果的であるなどの免疫細胞の増殖集団をもたらし得る。特定の増殖特性を有するクローンを同定することは、混合細胞集団の最終的な構成を調整する上で有用である。例えば、特定のクローンがＴ細胞増殖の２倍の速さでＮＫ細胞を増殖させることが分かっており、約２：１の比率で混合細胞集団を形成したい場合、このクローンを用いて開始集団をその所望の比率まで増殖させることができる。いくつかの態様において、２以上のクローンを用いて独立して免疫細胞を増殖させ、最終的な混合細胞集団は、独立して増殖た免疫細胞集団の組合せとすることができる。このようなアプローチでは、特定の免疫細胞タイプを優先的に増殖する能力に基づいて、所定のクローンを選択することができる。例えば、ＮＫ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞の混合集団の場合、これら３つの集団の１つを増殖するために３つのクローンを利用することができ、選択されたクローンは、細胞タイプのうち１つを増殖するために有益な特性を有するために選択される。

この実施例では２４個のクローンを同定し、クローン増殖させた（各クローンを３週間クローン増殖させた）が、より多数のクローンを容易に調製することができる。クローン増殖後、Ｋ５６２細胞（マイトマイシンＣで前処理したもの）を１ウェルあたり５×１０^５細胞でプレーティングした（２４ウェルプレート）。この試験では、ガス透過性膜培養容器を用いた（G-Rex, Wilson Wolf, ST Paul Minnesota）。他の態様において、標準的な培養容器を使用することもできる。４名のドナーからそれぞれ５×１０^５個の免疫細胞（ＮＫ細胞およびＴ細胞）を０日目にプレーティングし、各サンプルをクローン増殖したＫ５６２集団と共にプレーティングした。培養液には、０日目、４日目に４０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を添加し、共培養の６日目には４００Ｕ／ｍＬの高濃度のＩＬ－２を添加した。共培養は合計２０日間行った。

図３Ａ～３Ｂは、ＮＫ細胞（図３Ａ）およびＴ細胞（図３Ｂ）の増殖に関連するデータを示す。これらのデータを合わせると、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方が、フィーダー細胞としてクローン由来のＫ５６２細胞集団を用いて増殖できることが示される。図３Ａに示すように、特定のクローンは特に効果的なＮＫ細胞の増殖を示した。特に図３Ａは、クローンＫ５６２フィーダー細胞が、用いるクローンおよびドナーに応じて、約１５倍から約９０倍の範囲でＮＫ細胞の増殖を誘導することを示している。図３Ｂは、試験したすべてのＫ５６２クローンによってＴ細胞増殖が強力に刺激され、試験したクローンおよびドナーに応じて、約５０倍から約３５０倍の増殖が見られたことを示している。Ｔ細胞の倍加時間は、すべてのドナーで約２４時間以下であった。これらのデータは、同じ培養でＮＫ細胞とＴ細胞の両方を増殖することが可能であるだけでなく、個々の細胞タイプのロバストな増殖が起こり得ることを示している。

図４Ａ～４Ｂは、２４個のＫ５６２クローンのそれぞれをフィーダー細胞として用いて、４名のドナーそれぞれからのＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団を７日間に亘って増殖させたときのデータを示している。要するに、増殖した細胞集団の組成は、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率を大きく反映している。図４Ａに示すように、増殖後のＮＫ細胞は、親サンプルの細胞の約２％～約２３％の範囲であった（例えば、図１Ａ～１Ｄに示す元のドナーサンプルからの同じ割合と比較して、増殖後に全集団のうち存在する細胞総数を大まかに比較）。図４Ｂは、Ｔ細胞についての同様のデータを示しており、その割合は親集団の約６５％～約９５％の範囲である。一般に、増殖後のそれぞれのＮＫ：Ｔ細胞の比率は、元のサンプル（例えば、図１Ａ～１Ｄのもの）からの相対的な比率を反映している。したがって、いくつかの態様において、開始時のＮＫ細胞とＴ細胞の比率は、増殖後に生じる最終的なＮＫ細胞とＴ細胞の比率のガイドラインとして使用することができる。上記の通り、特定の態様において、増殖を開始する前の細胞比の初期調整を、増殖が完了した後に異なる細胞タイプの最終的な比率を互いに指示するために用いることができる。さらに、以下に詳述するように、増殖後に生じる細胞の比率をさらに微調整するために、増殖中に方法の変更を実施することができる。

実施例２－混合細胞集団のデュアルモダリティ増殖（Dual Modality Expansio）
上記のように、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、培養中に共に増殖させることができ、最初の血液サンプルからの細胞の開始比率をほぼ反映した細胞タイプの比率を得ることができる。この実施例は、ＮＫ細胞およびＴ細胞の亜集団の相対的な増殖率の調整を可能にするデュアルモダリティ増殖プロトコールを実施するために行われた。

図５は、実施した試験デザインの概略を示す。増殖タイムラインおよび細胞の初期播種は、上記のものと実質的に同様であるが、培養物は、共培養開始後の様々な時点で補足的な増殖刺激に曝されるか、または上記のように維持される（対照として）。図５の模式図は、共培養の最初の６日間をカバーするマトリックスで、補足的な増殖刺激を追加したことを示している。この実施例では、上記のように、補足的な増殖刺激は、Ｔ細胞増殖を刺激するために、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを培養液に添加することを含む。さらなる態様において、これらの（または他の）補足的な増殖刺激を加えることができる－例えば、Ｔ細胞増殖を刺激するために１以上の抗体を直接添加することができる。模式図に示すように、培養物には様々な時点でＩＬ－２が補充され、ＦＡＣＳ分析を用いて、増殖因子およびＮＫ：Ｔ細胞比、ならびに増殖中および増殖後の形質導入効率を評価する。

図６Ａ～６Ｂは、培養７日後に測定したＮＫ細胞（図６Ａ）およびＴ細胞（図６Ｂ）の増殖に関連するデータを示しており、増殖開始後の様々な時点でＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズ（Ｔ細胞の補足的な増殖刺激として、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングしたビーズ）を添加した時のものである。換言すれば、２日目のカラムは、２日目にＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズを添加し、７日目（ビーズを用いて５日間のインキュベーション）に増殖を測定したときのＮＫ細胞またはＴ細胞の相対的な増殖量である。図６Ａは、最初に、ＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズを添加しても、ＮＫ細胞の増殖には悪影響がなかったことを示している。“ビーズなし”のデータ点に示されているように、倍数変化の拡大は、図３Ａのデータに示されているものと同程度であった。ＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズを０日目（共培養開始時）と培養６日目の間に添加しても、４名のドナーのいずれにおいても、ＮＫ細胞の増殖に有意な変化は見られず、各集団は依然として約１５倍からピーク時には約８５～９０倍の増殖を示した。さらに、ＮＫ細胞の増殖は、所定のドナー内で経時的に比較的一貫していた。例えば、ドナー６６９は、ビーズがない場合でも、あるいは培養の最初の６日以内の何れかの時点でビーズを追加した場合でも、一貫して約４０倍のＮＫ細胞の増加を示した。いくつかの態様において、ＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズの添加は、単にプロセスを阻害するのではなく、実際にＮＫ細胞の増殖を増強し得る。

図６Ｂは、補足的な増殖刺激としてＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズを添加した場合のＴ細胞の増殖に関する関連データを示す。ＮＫ細胞とは対照的に、Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズの有無およびＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズの添加タイミングによって顕著に異なる。“ビーズなし”の部分に示されているように、ＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズがない場合、７日目に測定すると、Ｔ細胞の増殖はほとんど乃至全く起こらなかった。図６Ｂの曲線の一般的な形状から分かるように、ＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズを培養プロセスの初期に添加した場合、Ｔ細胞はよりロバストに増殖した。例えば、ＮＫ細胞およびＫ５６２フィーダー細胞との共培養開始時にＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズを添加すると、すべてのドナーでＴ細胞が１００倍近く増加した。この誘導は、培養１日後にビーズを追加すると、約７５倍の増加に低下した。相対的な増殖は、ビーズの添加が後になるほど低下し続けた。このように、いくつかの態様において、補足的な増殖刺激が初期の時点、例えば、共培養の開始時、共培養の約６時間以内、共培養の約１２時間以内、共培養の約１８時間以内または共培養の約２４時間以内に存在する場合に、最大のＴ細胞増殖が生じる。いくつかの態様において、Ｔ細胞の相対的な増殖は、最終的な増殖集団における所望のＮＫ：Ｔ細胞の比率を達成するために、補足的な増殖刺激を提供する時期に基づいて微調整することができる。換言すれば、所望の最終集団がＮＫ細胞と比較してＴ細胞の比率が大きい場合、補足的なＴ細胞増殖刺激を共培養プロセスの比較的早い段階で提供することができる。あるいは、所望の最終的な細胞集団がＮＫ細胞とＴ細胞との間でより均等に分布している場合には、補足的なＴ細胞増殖刺激の添加を共培養プロセスの後半まで遅らせることができる。このように、態様に応じて、Ｔ細胞を増殖するための補足的な刺激を含める（または排除する）培養条件および相対的なタイミングを微調整して、最終的な増殖免疫細胞集団における細胞の最終的な比率を制御することができる。

上記のように、いくつかの態様において、増殖された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞）の集団は、“そのまま”ベースで、および／または薬学的に許容される担体に組み込んだ後に、処置を必要とする対象に投与することができる。しかしながら、いくつかの態様において、細胞は、標的細胞に対する細胞毒性を高めるために、キメラ構築物で遺伝子操作されている（例えば、２０１８年３月２７日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２４６５０号を参照のこと。その内容全体を引用により本明細書に包含させる）。増殖したＮＫ細胞およびＴ細胞の集団の能力を評価するために、細胞を形質導入する能力を決定する試験を行った。

共増殖させたＮＫ細胞およびＴ細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするγレトロウイルスを導入した。７日目に細胞を形質導入し、１０日目および１４日目にＦＡＣＳで形質導入効率を測定した。データを図７Ａから７Ｄに示す。図７Ａは、ＣＤ３／ＣＤ２８ポリスチレンビーズの有無（“ビーズなし”対照）またはＴ細胞およびＫ５６２フィーダー細胞との共培養開始時に対するビーズの添加時間に応じて、１０日目の培養液中に存在する全ＮＫ細胞に対するＧＦＰ陽性ＮＫ細胞の割合をドナーごとに示す。示されるように、ビーズの有無も添加時期も、１０日目のＮＫ細胞の導入効率に大きな影響を与えないようであった。全体として、４名のドナーすべてにおいて、導入効率は約８０％から約９５％の範囲であった（収集された元の血液サンプル中のＮＫ細胞の開始集団との比較）。同様に、図７Ｂに示すように、Ｔ細胞も１０日目には容易に形質導入された。１０日目の形質導入効率はＮＫ細胞と比較してわずかに低いように見えるが、４名のドナーすべてにおいて、効率は約２５％から約６５％の範囲であった（収集した元の血液サンプルのＮＫ細胞の開始集団と比較して）。

形質導入効率の分析を共培養開始後１４日まで行うと、導入後のＮＫ細胞およびＴ細胞の両方における導入遺伝子発現の安定性は、最初のドナーのばらつきおよびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの有無、またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの添加のタイミングとは無関係に、少なくとも培養２週目まで維持されることが示された。これらのデータは、図７Ｃ（ＮＫ細胞の場合）および図７Ｄ（Ｔ細胞の場合）に示されている。図７Ｃは、すべてのドナーにおいて、Ｔ細胞を増殖させるためのＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの添加、または添加のタイミングにかかわらず、導入効率は約７８％から９５％の間に留まることを示す。共培養１０日目のＴ細胞と同様に、１４日目では、４名のドナーすべてにおいて、Ｔ細胞の導入率は約３０％から約７０％の範囲であった。これらのデータを合すると、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方が互いの存在下で容易に増殖するだけでなく、それぞれの細胞タイプが形質導入を受けやすいことを示しており、このことは、標的細胞に対する細胞促成効果を高めるように該細胞を遺伝子操作できることを示している。

上記のように、ＮＫ：Ｔ細胞の比率は、増殖期間中に用いられる条件に基づいて調整することができる（また、開始時の細胞集団の比率を調整したり、増殖後に調整したりするための特定の手順を踏むこともできる）。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの添加時期によってＮＫ／Ｔ細胞の比率がどのように変化するかを調べるために、最終培養液中の各細胞タイプの比率を７日目と１４日目に測定し、その結果を図８Ａから８Ｄに示した。図８Ａは、７日目のＮＫ細胞数のデータを示す（“ビーズなしの対照”、または各ドナーの細胞集団をＫ５６２－４１ＢＢ－ｍｂＩＬ１５細胞と共培養し、様々な時点でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを添加したもの）。各細胞タイプの相対的な増殖と一致して、図８Ａは、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの添加が増殖期間の後半になるにつれて、最終培養物に占めるＮＫ細胞の割合が増加するという興味深い傾向を示す。興味深いことに、図８Ｃに示すように、１４日目に最終培養液に占めるＮＫ細胞の割合が増加し続けており、いくつかのドナーでは最初のサンプルに存在した細胞のほぼ１００％がＮＫ細胞であった。このことは、１４日目の評価が形質導入後であるという点でも注目に値する。これは、Ｔ細胞がより早い刺激を必要としたり、培養期間中に疲弊したりする可能性があるのに対し、ＮＫ細胞は外因性ベクターによる形質導入の結果、その増殖能力を失わないことを示している。

ＮＫ細胞とは対照的に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを培養期間中に添加すると、Ｔ細胞の割合が減少する。共培養期間の後半にビーズに曝されたＴ細胞集団は、全体的なＴ細胞の割合が減少していることを示す。これは、おそらく、それらのＴ細胞集団がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの刺激効果にさらされた期間が短縮されたことによるものである。また、図８Ｄのデータは、１４日目のデータで表されるように、培養２週目にＴ細胞の割合が低下することを示している。これらのデータは、１４日目のＴ細胞割合が、親細胞数の約７０％でピークに達したが、１～２％程度の低さになったことを示している（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを共培養の４日目、５日目または６日目に添加したサンプルの場合）。これは、Ｔ細胞を刺激する期間が短くなったこと、および／または、形質導入プロトコール中に多数の刺激性ビーズが除去されたことによる影響を反映している可能性がある。また、Ｔ細胞の疲弊を反映している可能性もある。しかしながら、これらのデータを合すると、２週間の共培養期間中、ＮＫ細胞は増加し、Ｔ細胞は減少する傾向があることがわかる。この一般的な挙動を知ることで、所望の特性を有する増殖後の混合細胞集団を得るために、ＮＫ細胞の増加率とＴ細胞の減少率を最適化するように培養条件を調整することができる。

この試験データ（実施例１と同様）をまとめると、本明細書に記載のいくつかの態様に従って、ＮＫ細胞およびＴ細胞を成功裏に共増殖させ得ることが示される。いくつかの態様によれば、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、２つの免疫細胞集団を、いくつかの態様において４－１ＢＢＬおよび／またはｍｂＩＬ１５を発現するように改変されるＫ５６２細胞と共培養することによって同時に共増殖させることができる。さらに追加の態様において、Ｋ５６２細胞は、例えば、Ｔ細胞と相互作用してその増殖を刺激する抗体または他の分子などの特定のＴ細胞刺激シグナルを提示するようにさらに改変される。いくつかの態様において、Ｋ５６２細胞は、ＯＫＴ３抗体を発現するように改変される。あるいは、またはそれに加えていくつかの態様によれば、別個のＴ細胞刺激が提供される。例えば、いくつかの態様によれば、Ｔ細胞増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体が提供される。このように、これらのデータは、ＮＫ細胞およびＴ細胞を共増殖させ得る複数の異なる方法があることを示している。有利なことに、用いる方法の選択は、最終的な増殖後の免疫細胞集団におけるＮＫ細胞とＴ細胞の望ましい比率に応じて調整することができる。例えば、本明細書に記載するデータは、Ｋ５６２．４１ＢＢＬ.ｍｂＩＬ１５.ｓｃＦｖ－ＯＫＴ３クローンは、ＮＫ細胞を増殖でき、一方でＴ細胞も確実に増殖できることを示す。従って、このようなアプローチは、Ｔ細胞：ＮＫ細胞の比率が高いことが望ましい場合に好適である。さらに、特定のＫ５６２クローンは、増殖後に高いＮＫ比率をもたらすことが確認されている。したがって、ある態様において、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率をよりバランスよくしたい場合に、そのようなクローンを用いることができる。さらに、最終的なＮＫ／Ｔ細胞比をより細かく制御したい場合は、Ｔ細胞刺激をフィーダー細胞株に組み込むのではなく、ＮＫ細胞を優先的に増殖させるように遺伝子操作されたフィーダー細胞株を、別の補足的なＴ細胞増殖刺激と組み合わせることができる。いくつかの態様によれば、これは、Ｋ５６２．４１ＢＢＬ.ｍｂＩＬ１５フィーダー細胞などのフィーダー細胞を、例えばＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞刺激ビーズと組み合わせることで達成できる。別のＴ細胞刺激を導入するタイミングを、ＮＫ細胞とＴ細胞の最終的な比率を微調整するために用いることもできる。例えば、より高いＮＫ：Ｔ比は、Ｔ細胞刺激を共培養プロセスの後半に導入することで達成でき、一方、より高いＴ：ＮＫ比は、別個のＴ細胞刺激を共培養プロセスの前半に導入することで達成できる。このように、本明細書に記載の増殖方法は、様々な出発物質および手順の調整に関して有利な柔軟であり、最終的に、得られる増殖集団における様々な細胞タイプ間の所望の比率を有する複合免疫細胞集団を得ることができる。

実施例３－混合免疫細胞集団を評価するモデルシステム
理解できるように、本明細書に記載の方法の様々な態様によって行われた、本明細書に記載の新規の混合細胞集団の開発には、革新的な評価パネルが必要となる場合がある。従って、いくつかの態様において、混合免疫細胞集団の生存、増殖、持続性、血管内侵入および／または有効性（例えば、細胞毒性）の１以上を評価するための特定のモデルシステムが提供される。

図９Ａ～９Ｃは、複合免疫細胞集団の有効性を評価するための様々なカスタム細胞タイプの生成を模式的に示す。Daudi細胞は、バーキットリンパ腫の患者に由来するＢリンパ芽球性浮遊細胞である。図９Ａに示すように、レンチウイルス構築物を用いて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、核赤色（ＮｕｃＲｅｄ）、ホタルルシフェラーゼに結合したＣＤ１９（細胞内ドメインを欠く）（ｆｆｌｕｃＣＤ１９）などの種々のレポーターをDaudi細胞にトランスフェクトすることができる。図９Ｂに示すように、別のヒトＢリンパ球浮遊細胞株であるRaji細胞も同様の方法で遺伝子操作される。図９Ｂは、ヒト骨髄芽球浮遊細胞株であるＨＬ６０細胞にＣＤ１９（細胞内ドメインを欠く）およびルシフェラーゼを導入するための模式図である。これらのＮｕｃＲｅｄおよびＧＦＰの構築物はインビトロの試験に使用し、ホタルルシフェラーゼの構築物はインビボの試験に使用した。各ＣＤ１９構築物（細胞内ドメインを欠く）は、通常はＣＤ１９を発現していない腫瘍細胞が実際にＣＤ１９を発現するように遺伝子操作されており、ＣＤ１９を発現する標的細胞に対して細胞毒性作用を引き起こすように遺伝子操作されたＮＫ細胞およびＴ細胞の標的となり得る。また、ＮＫ細胞およびＴ細胞がそれぞれ標的細胞に対して細胞毒性効果を誘発する時間枠（timeframe）を決定するために、動態分析による細胞死アッセイ（killing assay）を用いて機能的評価も行った。

ＣＤ１９を発現するＨＬ６０標的細胞を再暴露アッセイに用い、ＮＫ細胞単独、Ｔ細胞単独あるいはＮＫ＋Ｔ細胞の組合せによる細胞毒性効果を評価した。０日目に、ＮＫ細胞集団、Ｔ細胞集団、ＮＫ＋Ｔ細胞集団を、２０，０００個のＣＤ１９発現ＨＬ６０細胞に暴露した。４日目に、これらの細胞集団にさらに１０，０００個のＣＤ１９発現ＨＬ６０細胞を加えて再暴露した。標的のみの細胞を同じ条件で培養したが、２回目の標的細胞を加える前にＰＢＳで洗浄した（対照として）。結果として得られたデータを図１０に示すが、ＮｕｃＲｅｄ数は、ウェルごとに計数された生きたＣＤ１９発現ＨＬ６０細胞数を表している。

ＮＫ（ＣＡＲ１９）曲線からわかるように、ＣＤ１９を標的とするＮＫ細胞は標的細胞の迅速な初期細胞死を示す。しかしながら、４日目に再暴露した後、生き残ったＨＬ６０細胞数は着実に増加した。対照的に、Ｔ細胞曲線（Ｔ（ＣＡＲ１９））では、初期細胞死の速度が遅いことがわかる。Ｔ細胞はほとんどの標的を排除したが、ＮＫ細胞での迅速な効果とは対照的に、Ｔ細胞は、最初のボーラスのＣＤ１９発現ＨＬ６０細胞を排除するのに４日目までかかった。４日目に追加のＨＬ６０細胞を暴露後も、Ｔ細胞は、ＣＤ１９発現ＨＬ６０細胞に対する安定した細胞毒性効果を維持した。

ＮＫ＋Ｔ細胞集団は、ＮＫ（ＣＡＲ１９）細胞の集団の５０％をＴ（ＣＡＲ１９）細胞で置換することによって生成された。ＣＤ１９を発現するＨＬ６０細胞で最初に暴露したとき、集団のＮＫ細胞部分は、標的細胞の迅速な細胞死を誘導する能力を保持していた。しかしながら、ＮＫのみの集団とは対照的に、４日目にＣＤ１９発現ＨＬ６０細胞で再暴露すると、Ｔ細胞の長期的な細胞毒性効果が発揮され、再暴露後の全体的な細胞毒性効果は、Ｔ細胞のみの集団と同様の結果となった。この試験で示されたように、エフェクター細胞（ＮＫ、ＴまたはＮＫ＋Ｔ）の総数を一定にしたとき、ＮＫ＋Ｔ（１：１の比率）は、Ｔ（ＣＡＲ１９）単独よりも迅速な細胞死効果を示し、ＮＫ（ＣＡＲ１９）単独よりも持続的な細胞死効果を示した。

このように、ＮＫ＋Ｔ細胞集団は、有利には、迅速な細胞死効果および持続的な細胞死効果を保持していた。この“混合”細胞毒性は、癌免疫療法においていくつかの利点をもたらす。多くの癌は適応性があり、免疫系による検出を避けるために“カモフラージュ”メカニズムを有していることが知られている。ＮＫ＋Ｔ混合集団におけるＮＫ細胞の迅速な細胞死効果は、そのようなカモフラージュ作用が働く前に癌細胞を排除するのに役立つ。さらに、癌細胞を速やかに死滅させたとしても、少数の細胞が残存することで腫瘍が再発する可能性がある。そのため、ＮＫ＋Ｔ細胞集団のＴ細胞部分は、長期的な細胞毒性効果を誘発し、再発のリスクを低減することができる。この試験では、上記のようにエフェクター細胞の比率（ＮＫ：Ｔ）が１：１であることが示されたが、いくつかの態様において、本明細書に記載の方法で他の比率を達成することができる。いくつかの態様において、最終的な比率は、特定の治療状況に合わせて調整することができる。例えば、増殖が遅い腫瘍は、より低いＮＫ：Ｔ比で最適に処置することができ、これはまた、細胞毒性動態をより遅いがより長い持続時間の抗癌作用に向かわせ得る。対照的に、侵攻性の腫瘍の場合、より高いＮＫ：Ｔ比が望まれ得て、これは、初期の細胞毒性動態が速いことで、腫瘍細胞の迅速な破壊および／または腫瘍の除去が達成され、Ｔ細胞の動態が長いことで腫瘍の残りの部分が“クリーンアップ”されるためである。同様に、いくつかの態様において、様々な比率のＮＫ＋Ｔ細胞集団を、患者の処置期間中の異なる時点で投与することができる。例えば、初期の腫瘍増殖を抑制するために、投与初期に細胞毒性の高い比率のＮＫ：Ｔ細胞集団を投与し、その後、長期的に効果維持および腫瘍増殖を抑制するために、比率の低いＮＫ：Ｔ細胞集団に移行することができる（医薬の負荷容量とその後の維持用量のようなもの）。

実施例４－三次元培養での機能評価
いくつかの腫瘍、特に固形腫瘍の天然環境をより容易に再現するために、腫瘍内浸潤をモデル化し、混合免疫細胞集団がモデル化された腫瘍微小環境においてどのように反応し、挙動（perform）するかを試験するために、３－Ｄ培養システムを開発した。

図１１は、そのようなモデル環境の１つの概略図である。VersaGel（登録商標）（Cypre, Inc. San Francisco, CA）は、細胞をカプセル化するために使用することができるヒドロゲルであり、細胞を分析するための下流の光学イメージングに適した光学特性を有する。９６ウェル培養皿の中央部にVersaGel（登録商標）を置き、１０，０００個のＣＤ１９発現ＨＬ６０細胞をゲルに播種した。図１１の左上は、０日目の播種された細胞を示しており、ウェルの中央領域にゲルの縁を示す細胞があり、外側には通常の培養ウェルがある領域が円形になっていることに注意されたい。左下のパネルは、８日目の代表的な培養ウェルを示しており、中央の挿入図はスフェロイドの生成を示す。挿入図の左側の部分は、スフェロイドの生成がVersaGel（登録商標）の領域に限定されていることを示し、点線はゲルと通常の培養液の間の分かれ目を示し、右側の部分は、ＨＬ６０細胞の通常の細胞培養の増殖を示す。図１１の右上部分は、NucRedを発現するＨＬ６０スフェロイド（ラベル／矢印）の短時間露光による視覚化を示す。より長時間の露光（左下）は、VersaGel（登録商標）境界の外側にあるためスフェロイドを形成していない単一のNucRed発現ＨＬ６０細胞を示す。

いくつかの態様において、スフェロイドは３Ｄ腫瘍微小環境を再現し、ＮＫ＋Ｔ細胞の混合集団などの免疫細胞が再現された腫瘍微小環境でどのように機能するかを試験することができる。例えば、このアプローチは、ＮＫ＋Ｔ細胞集団が、単に表面細胞に作用するたけでなく、腫瘍に浸潤し、腫瘍の深部で細胞毒性効果を発揮する能力を試験するために用いることができる。

いくつかの態様において、３Ｄ腫瘍スフェロイドを様々な比率のＮＫ＋Ｔ細胞集団に暴露し、腫瘍細胞の生存率を、例えばＣＤ１９発現ＮｕｃＲｅｄ発現ＨＬ６０（または他の）腫瘍細胞の場合には赤色チャンネル蛍光シグナルの検出によって評価する。いくつかの態様において、ＮＫ＋Ｔ細胞の混合集団は、ＮＫ細胞単独またはＴ細胞単独のいずれかと比較して、増強された細胞毒性活性を示し得る。同様に、いくつかの態様において、ＮＫ＋Ｔ細胞の混合集団は、ＮＫ細胞単独またはＴ細胞単独のいずれかと比較して、増強された腫瘍浸潤を示し得る。いくつかの態様において、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率を変化させて細胞毒性の動態を変化させ、上記のように、初期の急速な細胞毒性効果の発現とそれに続く長期の細胞毒性効果を達成するか、あるいは、（Ｔ細胞に基づいて）初期段階が遅く、より長期の細胞毒性段階となるような比率を実施することができる。

実施例５－ＮＫ細胞およびＴ細胞の併用療法の評価
ＮＫ細胞およびＴ細胞の併用療法における有益な相互作用をさらに評価するために、インビトロとインビボの両方でさらなる試験を行った。上記のように、また以下の実験データに基づいてさらに詳しく説明すると、いくつかの態様において、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、細胞の増殖および標的腫瘍細胞に対するそれらの細胞毒性の影響に関して、相乗的に相互作用することが分かった。下記の試験の概要のように、ＮＫ細胞とＴ細胞の相互作用は、細胞毒性（マトリックスアッセイを使用）と、細胞毒性の持続性（腫瘍の再暴露アッセイを使用）の観点から評価された。さらに、ＮＫ細胞およびＴ細胞の相乗効果をもたらす細胞メカニズムを解明するための試験も行った。ＮＫ細胞およびＴ細胞のサイトカインプロファイルも、異種移植マウスモデルでのインビボ抗腫瘍効果と同様に評価された。

この試験の目的は、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せが、効率的な抗腫瘍活性（tumor killing activity）、活性の持続性の向上および改善されたサイトカイン放出を、改善された患者の安全性（例えば、サイトカイン放出症候群のリスクを低減するサイトカイン放出プロファイル）の観点から達成できるかどうかを決定することであった。

図１２Ａは、（キメラ抗原受容体の限定されない例としての）抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する様々な濃度のＮＫ細胞およびＴ細胞、ならびに（標的癌種の例としての）Ｎａｌｍ６腫瘍細胞に対する結果としての細胞毒性効果を評価するための、概略的なマトリックスを示す。本明細書に記載の態様で用いられるＮＫ細胞およびＴ細胞に使用できるＣＡＲの限定されない例である、この試験で用いられたＣＡＲ構築物に関しては、抗ＣＤ１９結合体はＦＭＣ６３ ｓｃＦｖである。いくつかの態様において、結合体はヒト化されている。本明細書に記載の試験では、ＣＡＲはＦｌａｇタグを有するが、いくつかの態様によれば、例えば、臨床的な構築物では、タグが用いられないことが理解され得る。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ刺激ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲをコードする核酸は、ＩＬ１５ドメインをさらにコードしている。いくつかの態様において、ＩＬ１５は、膜結合ポリペプチドとして、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞によって別個に発現される。図に示すように、この構築物を発現するＴ細胞は、Ｔ１９－１として示され、この構築物を発現するＮＫ細胞は、ＮＫ１９－１として示される。図１２Ａは、マトリックスのＸ軸上の様々なＴ１９－１とＮａｌｍ６の比率を示す（Ｔ１９－１＝０、または１：１、１：２、１：４もしくは１：８として示す）。Ｙ軸は、様々なＮＫ１９－１とＮａｌｍ６の比率を示す（ＮＫ１９－１=０、または１：１、１：２、１：４、１：８もしくは１：１６と示す）。Ｘ軸とＹ軸の交点を辿ることで、Ｎａｌｍ６標的細胞に対してＮＫ細胞とＴ細胞がどのような比率で存在していたかを確認することができる。Ｎａｌｍ６標的細胞は、ＣＤ１９陽性のＢ細胞前駆体白血病細胞株であり、ＮｕｃＲｅｄも安定的に発現しているので、Ｎａｌｍ６細胞の生存の指標として用いることができる（従って、ＮＫ／Ｔ細胞の細胞毒性と相関する）。

図１２Ｂは、赤色蛍光シグナルの減少がＮａｌｍ６腫瘍細胞に対するより強い細胞毒性と相関している試験結果を示す。データから分かるように、Ｅ：Ｔ比が減少すると（ＮＫ細胞またはＴ細胞のいずれかについて）、Ｎａｌｍ６細胞の生存率が上昇する。例えば、Ｔ１９－１：Ｎａｌｍ６が１：８で、ＮＫ１９－１＝０の場合を参照（右上の円形画像のペア）。このＥ：Ｔでは、Ｔ細胞はＮａｌｍ６標的細胞に対して顕著な細胞毒性効果を生じることができなかった。同様に、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方が存在していても、低濃度であれば、Ｎａｌｍ６細胞は増殖し続けた（１：８のＴ１９－１と１：１６のＮＫ１９－１の最右下のペアの円形画像を参照）。しかしながら、他の多くのＥ：Ｔ比では、ＮＫ細胞とＴ細胞の組合せが共に働き、強力な抗腫瘍効果を発揮した。この結果からわかるように、ＮＫ１９－１またはＴ１９－１のいずれかの細胞がＥ：Ｔ比１：１で存在するとき、他のエフェクター細胞と腫瘍細胞の比率にかかわらず、Ｎａｌｍ６の増殖はほぼ完全に阻止された。同様の結果は、ＮＫ細胞またはＴ細胞のどちらかが１：２で存在する場合にも見られた。これらの１：１のＥ：Ｔ比を、（各エフェクター細胞タイプを単独で用いて）漸減させた。注目すべきことに、Ｅ：Ｔが１：２の時にＮＫ１９－１細胞を単独で用いた場合と、Ｔ１９－１細胞を単独で用いた場合に、Ｎａｌｍ６細胞の増殖が見られた。しかしながら、Ｔ細胞およびＮＫ細胞をＥ：Ｔが１：２になるように併用して、エフェクターと標的の比率を１：１にすると、Ｎａｌｍ６の増殖は見られなくなった。これらの結果は、ＮＫ細胞およびＴ細胞が互いに相乗的に作用していることを示している。どちらの細胞種も単独では１：２でＮａｌｍ６の増殖を抑えられないが、単独では“効果がない”濃度で組み合わせると、ＮＫ＋Ｔ細胞の組合せで細胞毒性効果が増強された（“（ＮＫ＋Ｔ）：Ｎａｌｍ６＝１：１”と記載された破線枠の画像参照）。ＮＫ細胞とＴ細胞の相乗効果は、２つの細胞タイプをそれぞれエフェクターと標的の比率を１：４にして組み合わせたときに、より顕著に現れた。ＮＫ細胞もＴ細胞も、１：４で単独で用いた場合はＮａｌｍ６の顕著な増殖を可能にした。しかしながら、ＮＫ細胞とＴ細胞をＥ：Ｔ比１：４で併用した場合、全体の比率は１：２で、何れかの細胞を単独で用いた場合に比べて、Ｎａｌｍ６の増殖が大幅に抑制され、細胞毒性が増強されたことがわかった。繰り返しになるが、これらのデータは、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方を用いた併用療法によって、２つの免疫細胞タイプが互いに相乗的に作用し、標的細胞に対する細胞毒性効果が高まることを示している。

図１３は、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団が標的腫瘍細胞に細胞毒性作用する能力の強化に関連する追加データを示す。図１３に示したデータは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞単独、ならびにＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せを用いた再暴露モデルにおけるＮａｌｍ６腫瘍細胞の増殖を示す。腫瘍細胞への最初の暴露は試験のゼロ時点で、２回目の暴露は７日後に行われた。理解されるように、最初の７日間と２回目の再暴露の間に、標的となる腫瘍細胞のみが顕著に増殖している。Ｔ細胞を単独で用いた場合（この限定されない試験では、Ｔ細胞は抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現している）、最初の７日間でＮａｌｍ６細胞の継続的な増殖が見られた。２回目の暴露で標的細胞の増殖が急増したが、そのレベルは試験期間中ほぼ一定に維持された。本明細書に記載のいくつかの態様に従って抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現させたＮＫ細胞は、最初の暴露期間中の増殖を効果的に制御した。２回目の暴露の直後には標的細胞の増殖に若干の遅れが見られたが、その後は標的腫瘍細胞は顕著に増殖した。しかしながら、特に、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せは、１回目の暴露期間中と２回目の暴露期間中の標的細胞の増殖を制御し、試験の全期間に亘って標的細胞の増殖を効果的に阻止した。これらのデータは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せが、（上記の結果からも分かるように）細胞毒性を高めるだけでなく、細胞毒性の持続性も高めることを示している。いくつかの態様によれば、この持続性の向上は、標的細胞に対する細胞毒性の持続時間を長くすることができるだけでなく、投与間隔を短くすることができ、潜在的な副作用を抑制するのに有利である。

ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せを用いた場合のメカニズムのいくつかを明らかにするために、さらなる試験を行った。ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せは、少なくとも免疫細胞数の質的な増加をもたらし、細胞数の増加が観察された増加した持続性の仲介者となるかどうかの調査につながることが特記される。さらに、細胞数の増加が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞またはそれらの組合せのいずれの増加に起因するかどうかを明らかにすることも目的とした。図１４Ａ－１４Ｂは、蛍光細胞毒性アッセイ（上記の試験で使用したもの）とＦＡＣＳによる細胞の表現型を組み合わせて収集した細胞数データを示す。これらのデータは、免疫細胞と標的細胞を混合した後、７日目に収集した。図１４Ａは、示されたＴ：標的比（Ｘ軸）で示されたＮＫ：標的（Ｎａｌｍ６）比（トレース）を使用したときのＮＫ細胞数を示す。この場合も、限定されない態様として、この試験のＮＫ細胞およびＴ細胞の両方が、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（１９－１）を発現するように遺伝子操作された。一番下のトレース（黒丸）に示すように、ＮＫ細胞の導入数（input number）がゼロのとき、どのＴ細胞：標的比でもＮＫ細胞は検出されなかった。対照的に、ＮＫ細胞：Ｎａｌｍ６の比率が１：４のとき、Ｔ細胞：Ｎａｌｍ６の比率が低下する（例えば、より多くのＴ細胞が存在する）と、検出されるＮＫ細胞の数（黒四角）が増えた。ＮＫ細胞数は、Ｔ細胞：Ｎａｌｍ６の比率が１：８から１：４になると、１：２よりも非線形的に増加した。この一般的なパターンはまた、ＮＫ細胞：Ｎａｌｍ６の比率が低いとき（１：２、黒三角）にも検出された。Ｔ細胞が存在しないときは、ＮＫ細胞の開始数に関わらず、ＮＫ細胞の増殖は限られていたことが特記される（Ｔ１９－１＝０参照）。Ｔ細胞が１：１６の比率で存在するとき、ＮＫ：Ｎａｌｍ６が１：２または１：４の比率で開始しても、ＮＫ細胞数（ＮＫ細胞の増殖を示す）はほとんど変化しなかった。しかしながら、Ｔ細胞の相対濃度が高い場合、ＮＫ：Ｎａｌｍ６が１：２のサンプルでは、より高度なＮＫ細胞の増殖が誘導された。図１４Ｂは、様々な濃度のＮＫ細胞の存在下でのＴ細胞数の測定に関連する対応するデータを示す。各トレースは、Ｎａｌｍ６標的腫瘍細胞に対するＴ細胞の比率を示したものの１つに関係しており、Ｘ軸はＮＫ細胞：Ｎａｌｍ６標的腫瘍細胞の様々な濃度を示す。Ｔ細胞：Ｎａｌｍ６の比率が１：４または１：２の場合の２つのトレースを除いて、ＮＫ細胞はＴ細胞数にほとんど影響を与えなかった。しかしながら、ＮＫ細胞と：Ｎａｌｍ６の比率が１：４または１：２のＮＫ細胞の存在下では、最終的なＴ細胞数は著しく減少した（閉じた逆三角形と閉じたひし形のトレースを参照）。

細胞数の変化が細胞増殖の変化に起因しているかどうかを監視するために、追加の調査を行った。細胞数の増加に伴う蛍光の変化をモニターするアプローチが用いられた。この方法では、ゼロ時点の細胞に蛍光色素を添加する（ThermoFisher社のCellTrace(商標) Violet Cell Proliferation Kit Violetを使用）。親細胞の有糸分裂毎に、蛍光シグナルは２つの細胞に分割されるため、同調的に減少する。同様に、２回目の有糸分裂時に、２つの第１世代の娘細胞のそれぞれが２つの孫娘細胞を生じ、それに応じて相対的な蛍光シグナルが減少する。従って、このアッセイでは、蛍光シグナルの減少が標識された細胞の増殖に相当する。これらの試験では、上記のように、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方を、抗ＣＤ１９ＣＡＲの限定されない態様を発現するように遺伝子操作し、Ｎａｌｍ６標的細胞に対して細胞毒性効果を発揮できるようにした。遺伝子導入後、ＮＫ細胞およびＴ細胞を共培養し、細胞増殖蛍光分析を行った。このＮＫ／Ｔ細胞にＮａｌｍ６細胞を暴露し、６日間インキュベートした。その後、ＣＤ５６－ＰＥ色素およびＣＤ３－ＡＰＣ色素で細胞を染色し、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－またはＣＤ５６^－ＣＤ３^＋細胞（それぞれＮＫ細胞またはＴ細胞）のゲートを用いてＦＡＣＳ解析を行い、ＮＫ細胞またはＴ細胞を検出した。ＦＡＣＳ解析の結果データを図１５Ａ－１５Ｅに示す。図１５Ａ～１５Ｅのそれぞれは、Ｔ細胞の数の増加（減少したＴ細胞：Ｎａｌｍ６比）を有するＮＫ細胞数と、１：１のＮＫ１９－１：Ｎａｌｍ６比を示す。理解できるように、Ｔ細胞数が増えるごとに、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－でゲートされた曲線の傾斜が広くなり、増殖しているＮＫ細胞数が増えていることを示す。データは図１５Ｆにまとめられており、ＮＫ１９－１：Ｎａｌｍ６の比率が１：１のときの曲線（図１５Ａ－１５Ｅの生データ）と、ＮＫ細胞：Ｎａｌｍ６の比率が２：１のときのＮＫ細胞の増殖を示す曲線の２つが示される。この要約データは、ＮＫ細胞が増加するＴ細胞の存在に対応して、ＮＫ細胞の増殖が同調的に増加することを示す。

対応するデータをＴ細胞について図１６Ａ～１６Ｄに示す。図１６Ａ～１６Ｃは、連続的に増加したＮＫ細胞数（ＡではＮＫ＝０、ＢではＮＫ：Ｎａｌｍ６＝１：１、ＣではＮＫ：Ｎａｌｍ６＝２：１）の存在下でのＴ細胞数を測定する。Ｔ細胞：Ｎａｌｍ６の比率は１：２であった。図１５に示した曲線とは対照的に、増殖中のＴ細胞に関連するシグナルは、ＮＫ細胞数が増えるにつれて連続的に減少する。これらのデータは図１６Ｄにまとめられており、標的細胞に対するＮＫ細胞の比率が増加すると、増殖しているＴ細胞の割合が一貫して減少することを示している。最も注目すべきは、最も希薄なＴ細胞濃度（１：１６のＴ１９－１：Ｎａｌｍ６）を用いて検出された実質的な減少である。

理論にとらわれることなく、Ｔ細胞数の増加が増殖するＮＫ細胞数の増加を促進することに関連するデータおよびＮＫ細胞数の増加が増殖するＴ細胞数の減少につながることを示すデータをもとに、図１７Ａ－１７Ｃに示す概略モデルを開発した。図１７Ａは、標的腫瘍細胞の存在下でのＮＫ細胞単独の増殖と、その結果としてのＣＡＲを発現するＮＫ細胞の制限された増殖を示す。図１７Ｂは、Ｔ細胞が標的腫瘍細胞の存在下で単独であるとき、該Ｔ細胞が強い増殖を示すときの対応する概略モデルを示す。図１７Ｃは、Ｔ細胞ならびに標的腫瘍細胞の存在下にあるときも、ＮＫ細胞の増殖を概略的に描いている。概略的に示されているように、そうでなければＴ細胞の増殖を引き起こし得る増殖シグナルの少なくとも一部が、ＮＫ細胞にプラスの影響を与える。その結果、ＮＫ細胞（それ自体では限られた増殖しかしなかった）が増殖する。これは、Ｔ細胞が標的腫瘍細胞と共に単独で培養されたとき強力な増殖を示すのと対照的に、ＮＫ細胞の存在下ではより限定された程度の増殖を示す。これらのデータを合すると、Ｔ細胞がＮＫ細胞増殖に与える正の影響は、ＮＫ細胞の閾値集団または濃度が存在するときに開始されるようである。従って、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団を用するいくつかの態様において、ＮＫ細胞とＴ細胞の比率は、ＮＫ細胞の増殖に対する有益な影響が実現されるように調整される。従って、上記のように、本明細書に記載のいくつかの態様に従って、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団は、集団全体が標的腫瘍細胞に対して増強された細胞毒性、ならびに増強された持続性を示すように生成され得て、これらの一方または両方は、少なくとも部分的には、Ｔ細胞ベースのＮＫ細胞増殖の増強に起因する。

ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団の細胞毒性の増強および持続性に役割を果たすメカニズムをさらに解明するために、サイトカインプロファイル分析を作成し、その結果を図１８Ａ～１８Ｌに示した。データは、２名の異なるドナーの細胞を用いて収集された。各ドナーについて、ＮＫ細胞の混合集団（ＮＫ＝０、ＮＫ：Ｎａｌｍ６＝１：４、ＮＫ：Ｎａｌｍ６＝１：２のいずれか）を用いて、Ｎａｌｍ６細胞のみ（Ｔ＝０）またはＴ細胞の存在下で、Ｔ：Ｎａｌｍ６の比率が１：２、１：４、１：８、１：１６のいずれかの場合に、ＮＫ細胞およびＴ細胞によるサイトカイン産生の分析を測定した。評価は、免疫細胞と標的の共培養を開始してから５日目に行った。一般に、図１８Ａ～１８Ｌのデータは、Ｔ細胞の量の減少に対応する選択されたサイトカインの産生の減少を示し、重要なのは、サイトカイン放出症候群のようなＴ細胞療法からの潜在的な副作用に関連するＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ６のようなサイトカインである。例えば、図１８Ａは、２名の異なるドナーのＴ細胞から放出されたＧＭ－ＣＳＦ濃度を示す。これらのデータは、Ｔ細胞：標的の比率が低いと、細胞から産生されるＧＭ－ＣＳＦが少なくなり、ＣＲＳの可能性が低くなることを示す。この傾向はＮＫ細胞の存在下でも同様であるが、図１８Ａは、共培養におけるＮＫ細胞の数を増やすと、開始時のＴ細胞濃度にかかわらず、システム内に蓄積するＧＭ－ＣＳＦのレベルが低下することを示す。もう一つの特記すべき傾向を図１８Ｅに示す。この図は、ＮＫ細胞数を増やしても、標的細胞に対する細胞毒性の誘導に重要なサイトカインであるＩＦＮｇ産生が減少しないことを示す。言い換えれば、本明細書に記載のいくつかの態様で用いられている細胞の組合せは、Ｔ細胞と共にＮＫ細胞が存在することで、一方の細胞の活性が乱れるという自己限定的なものではない。むしろ、本明細書で記載のように、これらの２種類の細胞は互いに連携して働き、標的細胞に対する相乗的な細胞毒性効果をもたらす。図１８Ｆは、ＩＬ２の産生を示す。最初のドナーでは、存在するＮＫ細胞数にかかわらず、Ｔ細胞によるＩＬ－２の産生はほとんどなかった。２番目のドナーでは、ＩＬ－２産生はＮＫ細胞が存在しない場合にのみＴ細胞によって検出されたが、産生は用量依存性とは相関していなかった。ＮＫ細胞の存在は、特定のＴ細胞による分泌の程度を変化させるか、サイトカインの蓄積に寄与するＴ細胞の全体的なレベルを変化させるか、あるいはＮＫ細胞が分泌されたサイトカインの結合のシンクとして働く（その結果、ＮＫ細胞増殖または活性に影響を与える）かのいずれかである。また、ここで試験したサイトカインに加えて、Ｔ細胞によって産生される他のサイトカインが、直接的または間接的にＮＫ細胞の増殖および／または持続に寄与する可能性もある。有利なことに、いくつかの態様において、ＮＫ細胞およびＴ細胞を併用した場合のサイトカイン産生の減少は、サイトカイン放出症候群のリスクを協調的に回復させると同時に、ＮＫ細胞の強化された細胞毒性および持続性を誘導する。

ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団による増強された細胞毒性および持続性をさらに評価するために、ＮＳＧマウスにＮａｌｍ６標的腫瘍細胞を移植した異種移植モデルを用いた。Ｎａｌｍ６細胞はＧＦＰならびにホタルルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作されており、後者は、生物発光の測定により移植を受けたマウスの腫瘍量を検出することができる。図１９は、異種移植モデルの概略的な試験計画を示す。マウスには、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（１９－１）の限定されない例を発現するように遺伝子操作されたＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せを注射した。腫瘍細胞は０日目に注入され、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、３日目に単独で、または組み合わせて注入された（図２０Ａ）。いくつかのグループでは、３日目にＮＫ細胞を投与した後、４日目にＴ細胞を投与するか、または３日目にＴ細胞を投与した後、４日目にＮＫ細胞を投与した（図２０Ｂ）。生物発光イメージングは、図１９に示した間隔で行った。生物発光の結果を図２０Ａ～２０Ｃに示し、この図は、データを移植後の日ごとに分けて示されるとともに、示された細胞の投与量および投与順で示される。図２０Ａは、ＰＢＳ、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ １９－１構築物を発現させたＮＫ細胞２．５×１０^６個、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ １９－１構築物発現させたＴ細胞を２．５×１０^６個または５×１０^５個、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せ（いずれも２．５×１０^６個）、あるいはＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せ（ＮＫ細胞は２．５×１０^６個およびＴ細胞は５ｘ１０^５細胞）を投与した試験群の、試験開始から２日目から３１日目までの発光データを示す。図２０Ｂは、３日目および４日目にＮＫ細胞およびＴ細胞を時差投与した試験群の同じ時間枠のデータである。左２つのカラムは、３日目にＮＫ細胞を投与され、４日目にＴ細胞を投与された試験群の結果を示し、右２つのカラムは、３日目にＴ細胞を投与され、４日目にＮＫ細胞を投与された試験群の結果を示す。各グループは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方を２．５ｘ１０^６細胞の用量で投与する群（高用量）と、ＮＫ細胞を２．５ｘ１０^６細胞およびＴ細胞を５ｘ１０^５細胞の用量で投与する群（低用量）の２つのサブグループに分けた。

試験の最初の３０日間に亘って、細胞の組合せを共に投与した場合、ＰＢＳ対照と比較して、ＮＫ細胞だけがより効果的に腫瘍増殖を阻害したことが特記される。本明細書に記載のいくつかの態様に従い、高用量のＮＫ細胞および低用量のＴ細胞の組合せ（図２０Ａの右端カラム）は、ＮＫ細胞単独（ＮＫ細胞が同じ用量の場合）と比較して、顕著に改善された腫瘍制御を示す。この処置群はまた、Ｔ細胞単独と比較して（Ｔ細胞が同じ用量の場合）、改善された腫瘍制御を示す。いくつかの態様において、ＮＫ：Ｔ細胞の比率は、腫瘍制御を可能にするだけでなく、サイトカイン放出の減少やＣＲＳのリスクの軽減と併せて同じことを達成している。高用量のＴ細胞のみ、および高用量のＮＫ／Ｔ細胞の両方が、３０日に亘って腫瘍制御を示した。

腫瘍量の増加を防ぐという点で、次に最も有効な処置は、開始用量のＮＫ細胞を投与し、翌日に低用量のＴ細胞を投与した処置法であった（図２０Ｂの第２カラム参照）。次に有効な処置は、Ｔ細胞のみを低用量で投与した場合であり、ほぼ３週間にわたって顕著に腫瘍増殖を防いだ。次に効果が高かったのは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の組合せであり、まずＴ細胞を低用量で投与し、その１日後にＮＫ細胞を投与した。次に効果が高かったのは、ＮＫ細胞および低用量のＴ細胞を同日に投与した場合であった。この場合も、この試験は、最初の３０日間で腫瘍の進行がある程度見られた処置群を対象としている。しかしながら、最初の３０日間のデータから、いくつかの態様に従って、Ｔ細胞と比較してより多くのＮＫ細胞の比率、例えば態様に応じて約５：１、約１０：１または約２０：１の比率が、強固な急性および中期の細胞毒性をもたらすことが確認された。上記の通り、Ｔ細胞数が少なくても、十分なＮＫ－細胞毒性およびNＫ－増殖刺激を与えることができる一方で、ＮＫ細胞がＴ細胞増殖をある程度抑制することができないほど大量ではなく、その結果、Ｔ細胞が誘導するサイトカイン放出を減少させることができる（従って、有害な炎症作用を軽減させることができる）。

試験した他のグループは、その時点以降まで腫瘍増殖を阻止し、図２０Ｃに示した。理論にとらわれることなく、これらのデータは、おそらくこれらの群ではよりロバストな初期反応があり、それによって長期的な制御が容易になること、および／またはＴ細胞増殖に対する何らかの初期段階での阻害または他の抑制があり、それによって枯渇する前のより長期的な活性寿命が付与される可能性があることを示唆する。最初の７４日間は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を高用量で投与し、３日目にＴ細胞を、４日目にＮＫ細胞を投与すると、約６５日間腫瘍増殖が抑制され、腫瘍移植後７４日目にやっと有意な腫瘍負荷が確認された。Ｔ細胞のみを高用量で投与した場合もまた、腫瘍の進行を大幅に遅らせることができ、７４日目にはわずかな腫瘍増殖しか検出されなかった。全体的に最も効果的な２つの処置法は、ＮＫ細胞およびＴ細胞を組み合わせた処置法であった。３日目にＮＫ細胞を投与し、その後４日目に高用量のＴ細胞を投与したところ、７４日目にはほとんど腫瘍が検出されず、８０％のマウスが生存した。同様に、３日目にＮＫ細胞およびＴ細胞の両方を大量に投与した場合は、腫瘍移植後７４日目に腫瘍がわずかに検出されただけで、処置群のマウスの１００％が生存し、効果はさらに高まった。その後、腫瘍移植後８１－１２１日目になっても、この傾向は続き、Ｔ細胞（高用量）を投与した後にＮＫ細胞を投与し、さらに高用量のＴ細胞を投与しても、同様に腫瘍増殖を抑えることができた。特に、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せでは腫瘍増殖をより強く制御し、ＮＫ細胞およびＴ細胞（高用量）の組合せを同日に投与した場合に最も効果的な制御が見られた。図２０Ｄは、すべてのグループの生存曲線をまとめて示しており、上記の生物発光データを反映している。図２０Ｅは、ＮＫ細胞およびＴ細胞を併用した場合に見られる４ヶ月間の腫瘍制御の強化をより明確に示すために、選択したグループのみを示している。特に、ＮＫ細胞を投与した後にＴ細胞を投与した場合と、ＮＫ細胞およびＴ細胞を共に投与した場合は、腫瘍制御が著しく向上していることを示す。これらのデータを総合すると、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せは非常に有効な癌処置法であることを示す。いくつかの態様によれば、ＮＫ細胞とＴ細胞の濃度を変化させることで、複合製品の細胞毒性だけでなく持続性も微調整し、長期的な腫瘍増殖の制御を達成することができる。同様に、いくつかの態様によれば、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組合せは、高い効果を得るために必ずしも同時に投与する必要はない。いくつかの態様によれば、２つの細胞タイプのうちの一方を初期の時点で投与し、他方の細胞タイプを後の時点で投与することができる。これにより、ＮＫ細胞などの一方の細胞タイプが初期の時点で効果を発揮し、その効果が後にＴ細胞などの第２の細胞タイプの細胞毒性効果および／または増殖促進効果によって相乗的に補完されることになる。例えば、処置すべき腫瘍の種類に応じて、第１の細胞タイプの投与が、第２の細胞タイプの１以上の特性を増強および／または最大化する有益な環境（例えば、人工腫瘍微小環境）を作り出すように、投与の順序を変えてもよい。言い換えれば、いくつかの態様において、第１の細胞タイプおよび第２の細胞タイプを連続投与することにより、第１の細胞タイプが、第２の細胞タイプによる最適な細胞毒性能のために腫瘍微小環境を準備する。さらに、本明細書に記載のいくつかの態様で提供されているように、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団を共投与して、顕著に効果的な抗腫瘍効果を得ることができる。

上記の態様の特定の特徴および面の様々な組み合わせまたはサブコンビネーションがなされても、本発明の１以上に該当することが企図される。さらに、ある態様に関連する何れかの特定の特徴、面、方法、特性、品質、属性、要素などの本明細書の記載は、本明細書に記載された他のすべての態様で使用することができる。従って、開示された態様の様々な特徴および面は、開示された発明の様々な態様を形成するために、互いに組み合わせたり、置換したりすることができることを理解すべきである。従って、本明細書に記載の本発明の範囲は、上記の特定の開示された態様によって限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は様々な変更、および代替形態の影響を受けやすいが、その具体例が図面に示されており、本明細書で詳細に説明されている。しかしながら、本発明は、開示された特定の形態または方法に限定されるものではなく、逆に、本発明は、記載された様々な態様および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に入るすべての改変、同等物および代替物を包含するものであることを理解すべきである。本明細書で開示されている方法は、記載されている順序で実行される必要はない。本明細書に開示された方法は、実施者が行う特定の行為を含むが、明示的または暗示的にそれらの行為を第三者が指示することも含み得る。例えば、“増殖したＮＫ細胞集団を投与する”などの行為は、“増殖したＮＫ細胞集団の投与を指示する”ことを含む。さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの観点から記載されている場合、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュグループのメンバーの何れかの個々のメンバーまたはサブグループの観点からも記載されていることを認識し得る。

本明細書に記載の範囲はまた、何れかおよび全ての重複、部分範囲およびそれらの組み合わせを包含する。“～まで（up to）”、“少なくとも（at least）”、“より大きい（greater than）”、“より少ない（less than）”、“～の間（between）”などの用語は、記載された数を含む。“約”または“およそ”などの用語が先行する数字は、記載された数字を含む。例えば、“９０％”は“９０％”を含む。いくつかの態様において、少なくとも９５％の相同性は、対照配列に対して９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の相同性を含む。さらに、配列がヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を“含む”として開示されている場合、そのような対照は、特記しない限り、その配列が記載された配列を“含む”、“からなる”または“本質的にからなる”ことも含むものとする。

“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”などの冠詞は、反対の指示があるか、または文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味する。本明細書および特許請求の範囲で用いられる“および／または”なる語句は、そのように結合された要素の“どちらかまたは両方”を意味すると理解されるべきである。“および／または”と共に記載されている複数の要素は、同じ方法で解釈されるべきであり、すなわち、そのように結合された要素の“１つまたは複数”を意味する。その他の要素は、“および／または”で具体的に特定された要素以外に、任意に存在してもよい。本明細書および特許請求の範囲で用いられる“または”は、上記で定義された“および／または”と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、要素のリストで用いられるとき、“または”または“および／または”は、包括的であると解釈されるものとし、すなわち、要素のリストのうち少なくとも１つ、要すれば１以上を含み、任意に追加のリストされていない要素を含むものとする。“ただ１つ（Only one of）”または“正確に１つ（actely one of）”など、明らかに反対を示す用語のみが、数または要素のリストのうち正確に１つの要素を含むことを意味する。従って、グループの１以上のメンバーの間に“または”を含む請求項は、反対の指示がない限り、グループメンバーの１つ、２以上または全てが所定の製品またはプロセスに存在するか、採用されているか、またはその他の関連性がある場合に満たされると考えられる。グループの正確に１つのメンバーが、所定の製品またはプロセスに存在する、採用される、またはその他の方法で関連する、態様が提供される。グループの複数のメンバー、または全てのメンバーが、所定の製品またはプロセスに存在し、採用され、またはその他の点で関連する態様が提供される。任意の１以上の請求項は、任意の態様、面、特徴、要素または特性あるいはそれらの組み合わせを明示的に除外するように修正されてもよい。何れか１以上の請求項は、任意の薬剤、組成物、量、投与量、投与経路、細胞タイプ、標的、細胞マーカー、抗原、標的化部位またはそれらの組み合わせを除外するように修正されてもよい。

本明細書で用いる任意のタイトルまたは副見出しは、整理のためのものであり、本明細書に記載の態様の範囲を限定するために用いられるべきではない。

Claims (50)

1. 遺伝子改変免疫細胞の少なくとも２つの亜集団を含む遺伝子改変免疫細胞の混合集団を生成するための方法であって、
   血液サンプルから単核細胞集団を単離する工程であって、ここで、前記単離された単核細胞集団が、少なくとも第１の免疫細胞亜集団および第２の免疫細胞亜集団を含む、工程；
   前記単離された単核細胞から第１の免疫細胞亜集団を単離する工程；
   前記単離された第１の免疫細胞亜集団を、フィーダー細胞集団と共に培養容器内で培養する工程であって、ここで、前記フィーダー細胞が、前記第１の免疫細胞亜集団内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現するように構成されており、かつ前記少なくとも１つの分子が、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびそれらの組合せから選択され、それにより、ＮＫ細胞の増殖集団を生成する、工程；
   単離された単核細胞から、第２の免疫細胞亜集団を単離する工程；
   第２の免疫細胞亜集団を、該第２の免疫細胞亜集団内のＴ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子と共に培養容器内で培養する工程であって、ここで、Ｔ細胞増殖を刺激するための少なくとも１つの分子が、ＣＤ３に対する抗体またはＣＤ２８に対する抗体の１以上を含み、それにより、Ｔ細胞の増殖集団を生成する、工程；
   がん細胞により発現される標的に結合し、結合時に癌細胞に対して細胞毒性活性を誘発するように構成された遺伝子改変受容体をコードする核酸を、増殖したＮＫ細胞集団に導入して、遺伝子改変細胞毒性ＮＫ細胞を生成する工程；
   癌細胞によって発現された標的に結合し、結合時に癌細胞に対する細胞毒性活性を誘発するように構成された遺伝子改変受容体をコードする核酸を、増殖したＴ細胞集団に導入して、遺伝子改変細胞毒性細胞を生成する工程；
   前記遺伝子改変細胞毒性ＮＫ細胞の一部と前記遺伝子改変細胞毒性Ｔ細胞の一部を組み合わせることにより、遺伝子改変免疫細胞の混合集団を生成する工程であって、ここで、前記遺伝子改変細胞毒性ＮＫ細胞と前記遺伝子改変細胞毒性Ｔ細胞が、（i）前記遺伝子改変ＮＫ細胞が遺伝子改変ＮＫ細胞単独と比較して癌細胞に対する細胞毒性の増強を示し、（ii）前記遺伝子改変細胞毒性Ｔ細胞が増殖する遺伝子改変ＮＫ細胞の数を増加させることができ、および／または（iii）前記遺伝子改変Ｔ細胞が遺伝子改変Ｔ細胞単独と比較してサイトカイン放出の低減を示す比率で組み合わされる、ここで、該比率は少なくとも約５：１である、工程；
   を含む、方法。
2. ＮＫ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子が、４－１ＢＢＬおよびインターロイキン１５（ＩＬ－１５）の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
3. ＩＬ－１５がフィーダー細胞に膜結合されている、請求項２に記載の方法。
4. 単離された第１の免疫細胞亜集団を培養することが、可溶性インターロイキン２、可溶性インターロイキン１２、可溶性インターロイキン１８、またはそれらの組合せのうちの１以上を培養物に添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方が同じ核酸で形質転換されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 核酸がキメラ抗原受容体をコードしている、請求項５に記載の方法。
7. キメラ抗原受容体が、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ガラクチン、Ｒａｌ－Ｂ、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、ＤＬＬ３、ＣＤ５、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＥＧＦＲ、ＫＲＥＭＥＮ２、ＰＳＭＡ、ＡＬＰＰＬ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８、ＧＰＲ１４３、ＧＲＭ８、ＬＰＡＲ３、ＧＤ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＥＣＴ１またはＴＭＥＭ１８６に対する受容体である、請求項６に記載の方法。
8. キメラ抗原受容体がＣＤ１９に対する受容体である、請求項７に記載の方法。
9. 抗ＣＤ１９ ＣＡＲが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖに作動可能に連結されたＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項８に記載の方法。
10. 抗ＣＤ１９ ＣＡＲが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸によってコードされている、請求項９に記載の方法。
11. 抗ＣＤ１９ ＣＡＲが、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
12. Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子が、抗ＣＤ３抗体を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子が、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の混合物を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
14. Ｔ細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子が、抗ＣＤ２８抗体を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
15. ＣＤ３に対する抗体が、ＯＫＴ３抗体を含む、請求項１２から１３のいずれか一項に記載の方法。
16. ＯＫＴ３抗体が、免疫細胞の第２の亜集団と共培養されたフィーダー細胞によって発現される、請求項１５に記載の方法。
17. 抗体が固体支持体に結合していることを特徴とする、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 固体支持体が、培養容器、標識を含む生体適合性ビーズ、または超常磁性ビーズを含む、請求項１７に記載の方法。
19. 血液サンプルが末梢血サンプルである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 血液サンプルが臍帯血サンプルである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
21. 遺伝子改変免疫細胞の混合集団が、約１×１０^８個から約１×１０^１０個の遺伝子改変細胞毒性ＮＫ細胞と、約１×１０^６個から約１×１０^８個の遺伝子改変細胞毒性Ｔ細胞とを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 遺伝子改変免疫細胞の混合集団が、ＮＫ細胞単独またはＴ細胞単独と比較して、腫瘍細胞に対する迅速な細胞毒性効果を示し、その後、腫瘍細胞に対する増強された永続性の細胞毒性効果を示す、請求項２１に記載の方法。
23. 遺伝子改変免疫細胞の混合集団が、ＮＫ細胞単独またはＴ細胞単独と比較して、腫瘍細胞に対する持続的な細胞毒性効果をより長く発揮する、請求項２１または２２に記載の方法。
24. 遺伝子改変された細胞毒性免疫細胞の混合集団であって、
    ＮＫ細胞を含む免疫細胞の第１の亜集団であって、ここで、前記ＮＫ細胞が、癌細胞により発現される標的に結合し、結合時に癌細胞に対する細胞毒性活性を誘発するように構成された遺伝子改変受容体を発現するように設計されており、かつ前記第１の亜集団が、約１×１０^８個から約１×１０^１０個のＮＫ細胞を含む、免疫細胞の第１の亜集団；および
    Ｔ細胞を含む免疫細胞の第２の亜集団であって、ここで、前記Ｔ細胞が、癌細胞によって発現される標的に結合し、結合時に癌細胞に対する細胞毒性活性を誘発するように構成された遺伝子改変受容体を発現するように設計されており、かつ前記第２の亜集団が、約１×１０^４個から約１×１０^６個のＴ細胞を含み、かつ遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の混合集団が、所定のエフェクター対標的細胞比において、同等のエフェクター対標的比におけるＮＫ細胞またはＴ細胞のいずれかよりも、癌細胞に対してより大きな細胞毒性を示す、免疫細胞の第２の亜集団；
    を含む、遺伝子改変された細胞毒性免疫細胞の混合集団。
25. 遺伝子改変受容体がキメラ抗原受容体を含む、請求項２４に記載の混合細胞集団。
26. キメラ抗原受容体が、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ガラクチン、Ｒａｌ－Ｂ、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、ＤＬＬ＃、ＣＤ５、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＥＧＦＲ、ＫＲＥＭＥＮ２、ＰＳＭＡ、ＡＬＰＰＬ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８、ＧＰＲ１４３、ＧＲＭ８、ＬＰＡＲ３、ＧＤ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＥＣＴ１またはＴＭＥＭ１８６に対する受容体である、請求項２５に記載の混合細胞集団。
27. キメラ抗原受容体がＣＤ１９に対する受容体である、請求項２６に記載の混合細胞集団。
28. 抗ＣＤ１９ ＣＡＲが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖに作動可能に連結されたＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項２７に記載の混合細胞集団。
29. 抗ＣＤ１９ ＣＡＲが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸によってコードされている、請求項２８に記載の混合細胞集団。
30. 抗ＣＤ１９ ＣＡＲが、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の混合細胞集団。
31. 少なくとも２つの免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を増殖するための方法であって、
    血液サンプルから単核細胞集団を単離する工程であって、ここで、前記単離された単核細胞集団が、少なくとも２つの異なるタイプの免疫細胞を含む、工程；
    前記単離された単核細胞集団を、少なくとも第１のサブパートおよび第２のサブパートに分割する工程；
    単離された単核細胞の第１のサブパートを、第１の培地を含む培養容器内で、第１のフィーダー細胞集団と共に培養する工程であって、ここで、前記第１のフィーダー細胞集団が、前記単離された単核細胞の第１サブパート内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現し、かつ／または前記第１の培養液が、前記単離された単核細胞の第１サブパート内のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を含み、ここで、少なくとも１つの分子は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびそれらの組合せから選択され、それによって、ＮＫ細胞の増殖集団を生成する、工程；
    前記単離された単核細胞の第２のサブパートを、第２の培養液を含む培養容器内で、第２のフィーダー細胞集団と共に培養する工程であって、ここで、第２のフィーダー細胞集団が、単離された単核細胞の第２のサブパート内のＴ細胞の１以上の亜集団の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を発現し、かつ／または第２の培養液が、単離された単核細胞の第２のサブパート内のＴ細胞の１以上の亜集団の増殖を刺激するための少なくとも１つの分子を含み、それによって、１以上のＴ細胞の亜集団の増殖集団を生成する、工程；および
    増殖したＮＫ細胞集団の少なくとも一部を、増殖したＴ細胞集団の少なくとも一部と組み合わせて、少なくとも２つの免疫細胞の亜集団を含む免疫細胞の混合集団を生成する工程；
    を含む、方法。
32. 混合集団が、Ｔ細胞の１以上の亜集団の合計の割合と比較して、より高い割合でＮＫ細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
33. Ｔ細胞の１以上の亜集団がガンマ－デルタＴ細胞を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
34. 請求項１から２３および３１から３３のいずれか一項に記載の方法によって産生される免疫細胞の混合集団。
35. 腫瘍の処置に用いるための、請求項３４に記載の免疫細胞の混合集団。
36. 腫瘍が固形腫瘍である、請求項３４に記載の免疫細胞の混合集団。
37. 腫瘍が懸濁性腫瘍であることを特徴とする、請求項３４に記載の免疫細胞の混合集団。
38. 癌の処置のための、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の混合集団の使用。
39. 癌の処置のための医薬品の製造における、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の混合集団の使用。
40. 遺伝子改変ＮＫ細胞と遺伝子改変Ｔ細胞の比率が少なくとも５：１である、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組合せ。
41. ＮＫ細胞とＴ細胞の比率が少なくとも１０：１である、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組合せ。
42. ＮＫ細胞とＴ細胞の比率が少なくとも１２：１である、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組合せ。
43. ＮＫ細胞とＴ細胞の比率が少なくとも１５：１である、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組合せ。
44. ＮＫ細胞とＴ細胞の比率が少なくとも２０：１である、遺伝子改変ＮＫ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞の組合せ。
45. 前記比率が、標的腫瘍に対する遺伝子改変ＮＫ細胞の細胞毒性活性を増強する、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の細胞の組合せ。
46. 前記比率が、遺伝子改変ＮＫ細胞単独と比較して、標的腫瘍に対する遺伝子改変ＮＫ細胞の細胞毒性活性の持続性を高める、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の細胞の組合せ。
47. 前記比率が、遺伝子改変Ｔ細胞単独と比較して、遺伝子改変Ｔ細胞によるサイトカイン放出を低減する、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の細胞の組合せ。
48. 前記比率が、遺伝子改変Ｔ細胞単独と比較して、遺伝子改変Ｔ細胞の増殖を低減する、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の細胞の組合せ。
49. 前記遺伝子改変ＮＫ細胞および前記遺伝子改変Ｔ細胞が、癌細胞によって発現される標的に結合し、結合時に前記癌細胞に対する細胞毒性活性を誘発するように構成されたキメラ抗原受容体を発現する、請求項４０から４８のいずれか一項に記載の細胞の組合せ。
50. ＩＬ２をさらに含む、請求項４０から４９のいずれか一項に記載の細胞の組合せ。

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