TW202102237A - 於抗原特異性免疫細胞中調控ｃｄ１６０功能的方法及其用途 - Google Patents

於抗原特異性免疫細胞中調控ｃｄ１６０功能的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供表現有外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體，諸如經改造的TCR或CAR。本發明亦提供於抗原特異性免疫細胞中調控CD160活性的方法。本發明還提供使用本文所述之經修飾抗原特異性免疫細胞和CD160活性的調控劑用於癌症治療的方法以及醫藥組成物。

Description

於抗原特異性免疫細胞中調控CD160功能的方法及其用途
本發明係關於在經過或未經改造抗原辨識的情況下，於抗原特異性免疫細胞(包括天然與經改造的抗原特異性αβT細胞，以及其他免疫細胞，諸如自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T（NK-T like）細胞、γδT細胞與巨噬細胞)中調控CD160功能的方法及其用途。本發明亦關於表現有外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，及其在治療癌症時供調控抗原特異性免疫細胞之功能的方法與用途。
T細胞是保護人體免於感染和癌症的自然界藥物。值得注意的是，可以透過檢查點阻斷和嵌合抗原受體(CAR)T細胞療法有效地重新利用靶向腫瘤的T細胞來治療癌症患者。這些免疫療法的成功明確地證實了T細胞對癌症治療極為有效，從而激發了探索各種活化和利用T細胞供對抗癌症的方法。在過去半個世紀中，開創性研究人員和臨床醫生一直在探索授受性轉移(adoptive transfer)靶向腫瘤的T細胞來治療人類實體腫瘤。對多種靶向腫瘤的T細胞(包括活體外經活化T細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、帶有識別腫瘤抗原或腫瘤相關抗原之特異性T細胞受體(TCR)的T細胞(TCR-T)，與源自負載有腫瘤抗原的樹突細胞之T細胞(DC-T))進行了測試，並在臨床前模型和人類患者中顯示出有希望的療效。近來，識別來自突變癌細胞之新生抗原的T細胞被用於肺癌和乳癌的授受性T細胞療法，並在某些病例中證明有療效。然而，即使在其他療法(諸如輻射、疫苗接種，化學療法和共輸注抗腫瘤細胞激素IL-2)的協助之下，也難以利用授受性轉移靶向腫瘤的T細胞來重複地實現對實體腫瘤的持續控制和消除。
經輸注的靶向腫瘤之T細胞其相對反應率低且最終失去對腫瘤的控制，可能歸因於T細胞的各種內在和外在障礙。這些障礙起源自穩態性免疫耐受機制以及腫瘤誘導的免疫抑制機制。值得注意的是，這些耐受性造成阻礙T細胞有效控制腫瘤的障礙。例如，天然抗腫瘤T細胞受到涉及正向和負向胸腺篩選的中央耐受機制所控制，其通常具有對未突變腫瘤抗原或腫瘤相關抗原為低或中等親和力的T細胞受體(TCR)。此外，逐漸形成的腫瘤可能會降低第I型或第II型主要組織相容性複合體(MHC)分子的表現，並實際上限制了腫瘤抗原在腫瘤細胞上的呈獻，從而限制了T細胞與相關TCR的識別。本領域為了克服這些障礙做出許多努力，並獲得了不同程度的成功。CAR可使T細胞與腫瘤細胞有效接合，並有助於克服T細胞對腫瘤識別的不充分或喪失。值得注意的是，靶向CD19或BCMA抗原的CAR-T細胞，可以分別消除B細胞白血病/淋巴瘤或多發性骨髓瘤。其他方法則著重於透過在活體外形成時所增強之腫瘤特異性TCR的親和力，或透過選出以適度增進的功效來識別新抗原的TCR以克服識別障礙。
儘管這些策略顯示有希望，但除抗原識別外，還有其他障礙必須要克服，以使靶向腫瘤的T細胞消除或持續控制已生成的腫瘤。要注意的是，冷腫瘤(cold tumors)(腫瘤內缺乏活化T細胞)與預後不良和對免疫療法的反應性低有關。據推測，除了檢查點抑制、關閉T細胞特異性化學誘引物質、因營養不利和缺氧所引起的T細胞耗竭以外，在腫瘤微環境中諸多其他未知因素也會促成冷腫瘤現象。探究了各式各樣基因工程策略以增強T細胞運輸和在腫瘤中的活化。趨化因子受體或識別VEGFR的CAR在腫瘤特異性T細胞中的異位表現，已證明會增強經轉移T細胞對腫瘤的控制。此外，腫瘤特異性T細胞中的負向T細胞調節因子(諸如PD-1或CBLB或腺苷2A受體)的失活，係導致T細胞的抗腫瘤功能升高。有趣的是，提高粒線體生體合成和氧化磷酸化的信號(諸如PGC1α或OPA1的異位表現)，或帶有CD278信號傳導結構域的CAR，也可以增強經轉移T細胞的抗腫瘤功能。雖然T細胞在腫瘤控制中的功能可能會因為多種分子和細胞過程獲得增強，但這些策略通常不足以透過T細胞實現腫瘤的持續控制或消除已生成的腫瘤，因此尋找可用於重新程式化靶向腫瘤的T細胞，以供持續控制和消除實體腫瘤的分子十分重要。
CD160是一個27 kDa的糖蛋白，它最初是使用單株抗體BY55在人類自然殺手細胞上被鑑定出來(Maïza et al., 1993,J Exp Med.. 178(3):1121-6)。後來，CD160的主要形式是糖基磷脂醯肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)錨定的類免疫球蛋白(Ig-like)細胞膜受體，存在於大多數CD16+ NK細胞亞群、NK-T細胞、γδ-T細胞、CD4 T細胞和CD8+細胞裂解性T細胞的某些亞群中，以及經活化內皮細胞中(Le Bouteiller et al., 2011,Immunol Lett ., 138(2):93-6)。人類CD160的cDNA序列編碼具有單個類Ig結構域，具有181個胺基酸的富含半胱胺酸、且為糖基磷脂醯肌醇錨定的蛋白質。之後已經鑑定出具有跨膜結構域及/或沒有細胞外類Ig結構域的其他同功型。CD160係在細胞表面上表現為以二硫鍵緊密連接的多聚體形式。CD160是HVEM的配體，而CD160與HVEM的結合係導致T細胞的抑制和無反應性(anergy)。(Cai et al., 2009,Nat Immunol. , 9(2):176–185)。通常將CD160與抗PD-1抗體一起視為具有抗癌活性的免疫檢查點抑制劑(Stecher et al., 2017,Front Immunol ., 8:572)。CD160已被建議係與BTLA (CD272)競爭結合至HVEM(Kojima et al., 2011,J Mol Biol. , 413(4):762-72)。NK細胞和某些人類T細胞亞群上的鼠類和人類CD160，對第Ia型與第Ib型MHC的親和力低，並且可能在NK和T細胞活化時發揮作用(Maeda et al., 2005,J Immunol. , 175(7):4426-32；Agrawal et al., 1999,J Immunol., 162(3):1223-6)。CD160也由內皮細胞表現，且在人類病理眼部和腫瘤血管新生的病例中(不反應或對現有抗血管新生藥物具抗性)已被提議是一個潛在的新目標(Chabot et al., 2011,J Exp Med. , 208(5):973-86)。在小鼠中，CD160功能喪失的分析顯示CD160對NK媒介的IFN-γ生成至為關鍵，但對NK細胞的細胞裂解活性並不重要，且似乎不需要T淋巴細胞的發育和功能(Tu et al., 2015,J Exp Med. , 212(3):415-29)。迄今，還沒有發表過CD160對抗原特異性T細胞在控制和消除已生成腫瘤方面之功能的證據。
在本文中引用的所有出版物、專利案，專利申請案和已公告專利申請案的揭示內容，均以整體引用的方式併入本文。
本申請案提供經修飾抗原特異性免疫細胞，其表面上包含有外源性CD160蛋白，以及其用於治療癌症的方法。本發明還提供於抗原特異性免疫細胞中調控CD160活性的方法。
本申請案的一個態樣，係提供一種在其表面上包含有外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有該外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中該外源性CD160蛋白係導致該經修飾抗原特異性免疫細胞的上調（up-modulation），其中該免疫細胞是T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由細胞毒性αβT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞、經抗原呈獻細胞(APC)活化的抗腫瘤T細胞以及自然殺手T細胞(NK-T細胞)所組成之群組。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經APC活化的抗腫瘤T細胞是經樹突細胞(DC)活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞所組成之群組。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的變異體。
在依據上述任一經修飾抗原特異性免疫細胞的一些具體例中，外源性CD160蛋白是膜結合的。在一些具體例中，外源性CD160蛋白是經由GPI連接子結合至膜。在一些具體例中，外源性CD160蛋白是經由免疫細胞結合部分結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，免疫細胞結合部分係結合至免疫細胞的表面分子。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含跨膜結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白進一步包含細胞內結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白進一步包含來自CD160剪接變異體的細胞內結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含衍生自TCR複合體之信號傳導次單位的細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，TCR複合體的信號傳導次單位是選自由CD3γ、CD3δ和CD3ε所組成之群組。
在依據上述任一經修飾抗原特異性免疫細胞的一些具體例中，外源性CD160蛋白是膜結合的，且包含細胞內結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含CD28共刺激結構域、4-1BB共刺激結構域或兩者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、CD28共刺激結構域和4-1BB共刺激結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域和CD28共刺激結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含初級訊號傳導結構域(primary signaling domain)。在一些具體例中，初級訊號傳導結構域包含CD3ζ結構域。在一些具體例中，細胞內結構域不包含初級訊號傳導結構域。
在依據上述任一經修飾抗原特異性免疫細胞的一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是經改造的(engineered)T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。
本申請案的一個態樣，係提供一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含：使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的第一核酸接觸，從而產生該經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中該外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該免疫細胞為T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由細胞毒性αβT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞，經APC活化的抗腫瘤性T細胞和自然殺手T細胞(NK-T細胞)所組成之群組。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經APC活化的抗腫瘤T細胞是經DC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞所組成之群組。
在依據上述任一種產生方法的一些具體例中，該方法包含使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白接觸。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含結合至免疫細胞之表面分子的免疫細胞結合部分。在一些具體例中，產生方法包含將編碼外源性CD160蛋白的核酸導入前體抗原特異性免疫細胞中。在一些具體例中，核酸是mRNA。在一些具體例中，核酸是DNA。在一些具體例中，係透過轉染將核酸導入前體抗原特異性免疫細胞中。在一些具體例中，係透過轉導或電穿孔將核酸導入前體抗原特異性免疫細胞中。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的變異體。
在依據上述任一種產生方法的一些具體例中，外源性CD160蛋白是膜結合的。在一些具體例中，外源性CD160蛋白經由GPI連接子結合至膜。在一些具體例中，免疫細胞結合部分係結合至免疫細胞的表面分子。在一些具體例中，外源性CD160蛋白係經由免疫細胞結合部分來結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含跨膜結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白進一步包含細胞內結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白進一步包含來自CD160剪接變異體的細胞內結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含衍生自TCR複合體的信號傳導次單位的細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，TCR複合體的信號傳導次單位是選自由CD3γ、CD3δ和CD3ε所組成之群組。
在依據上述任一種產生方法的一些具體例中，外源性CD160蛋白是膜結合的，且包含細胞內結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含CD28共刺激結構域、4-1BB共刺激結構域或兩者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、CD28共刺激結構域和4-1BB共刺激結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域和CD28共刺激結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含初級訊號傳導結構域。在一些具體例中，初級訊號傳導結構域包含CD3ζ結構域。在一些具體例中，細胞內結構域不包含初級訊號傳導結構域。
在依據上述任一種產生方法的一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞包含編碼功能性外源性受體的第二核酸。在一些具體例中，產生方法進一步包含使前體抗原特異性免疫細胞與編碼功能性外源性受體的第二核酸接觸。在一些具體例中，功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸係可操作地連接至相同的啟動子。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸係可操作地連接至個別的啟動子。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸是在同一個載體上。在一些具體例中，第一核酸及/或第二核酸是在個別的載體上。在一些具體例中，載體是病毒載體。在一些具體例中，病毒載體是選自由腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、游離型載體表現載體，單純皰疹病毒載體及其衍生物所組成之群組。在一些具體例中，載體是非病毒載體。
在依據上述任一種產生方法的一些具體例中，該方法進一步包含分離或富集包含第一及/或第二核酸的免疫細胞。在一些具體例中，該方法進一步包含將表現CD160的經修飾抗原特異性免疫細胞與至少一種醫藥上可接受的載劑進行調配。
亦提供藉由依據上述任一種產生方法所產生的經修飾抗原特異性免疫細胞。
進一步提供一種醫藥組成物，其包含依據上述任一種產生方法所產生的經修飾抗原特異性免疫細胞，以及醫藥上可接受的載劑。
本申請案的另一個態樣，係提供一種治療個體中疾病的方法，包含向該個體投予有效量之依據上文所述任一種經修飾抗原特異性免疫細胞的經修飾抗原特異性免疫細胞，或依據上文所述任一種醫藥組成物。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是衍生自該個體。本申請案的再一個態樣，係提供一種治療個體中疾病的方法，包含向該個體投予有效量之外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的核酸，其中該外源性CD160蛋白包含識別個體中免疫細胞上之表面分子的結合部分。
在依據上述任一種治療方法的一些具體例中，投予是腫瘤內投予。在一些具體例中，投予是向淋巴結內投予。在一些具體例中，疾病是癌症。在一些具體例中，癌症是實體腫瘤。在一些具體例中，癌症是轉移性癌症。在一些具體例中，該癌症是選自由以下組成之群組：黑色素瘤、肺癌、食道癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、腦癌、卵巢癌。在一些具體例中，個體是人類。
本發明的一個態樣提供一種於抗原特異性免疫細胞中活化CD160之免疫刺激活性的方法，包含使抗原特異性免疫細胞與有效量的藥劑接觸，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160之免疫刺激活性。在一些具體例中，該方法包含於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性，且其中該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性。
本發明的一個態樣，係提供一種治療個體中免疫疾病的方法，包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中調控CD160的內源性免疫刺激活性。在一些具體例中，免疫疾病是自體免疫疾病或發炎性疾病，且該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160的內源性免疫刺激活性。
本發明的一個態樣，係提供一種治療個體中癌症的方法，包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。本發明的另一個態樣提供一種治療個體中感染的方法，包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。
本文還提供了包含有任一種經修飾抗原特異性免疫細胞的組成物、用途、套組和製品。
本申請案提供用於調控CD160之免疫刺激活性的方法及組成物。本申請案是基於意外發現到，先前被認為主要用作T細胞的抑制性檢查點分子的CD160於抗原特異性免疫細胞(諸如T細胞)中可能是刺激免疫反應的主因。
吾等證實，可以用CD160重新程式化腫瘤特異性T細胞，以在免疫活性小鼠體內控制並消除已生成的實體腫瘤。此外，在這些非常難以治療的小鼠模型中，經CD160程式化的T細胞在控制轉移性黑色素瘤和肺癌方面也顯示出非常有效。CD160的異位表現提高了帶有特異地識別GP100之TCR的腫瘤特異性T細胞的功能，還有識別多種抗原的多株肺癌腫瘤浸潤性T細胞(「TIL」)的功能。經CD160修飾的腫瘤特異性T細胞可有效控制不同組織來源的實體腫瘤，無論其轉移性質如何。此外，透過創造帶有TCR和共刺激信號傳導結構域的CD160嵌合體，吾等已經證明CD28共刺激信號係與CD160有協同作用，並進一步提高抗原特異性T細胞的功能。
重要的是，人類和小鼠CD160在強化抗原特異性T細胞於活體內腫瘤控制和清除功能方面具有保守的功能，暗示著CD160在調節抗原特異性T細胞功能方面可能支配著一個高度保守的路徑。這些發現首次證實，CD160可用於將抗原特異性T細胞變成一個控制並消除癌症(包括已生成的實體腫瘤)的有效藥物。此外，這些發現強烈暗示著，基於CD160的免疫細胞(諸如T細胞)重新程式化，可廣泛應用於所有靶向腫瘤的免疫細胞(諸如T細胞)和不同組織來源的腫瘤。
上文討論的發現進一步暗示著，CD160可能是外源性調控的重要目標，外源性調控可增強或削弱抗原特異性T細胞的功能。例如，可靶向抗原特異性免疫細胞中的內源性CD160以增強抗原特異性T細胞的活性，並活化發炎性反應，諸如對抗病毒和細菌感染。相反地，在不想要有免疫反應的期間(例如在發炎和自體免疫疾病時)，可靶向CD160以抑制抗原特異性T細胞活性。考慮到CD160在抗原特異性T細胞中的重要功能，CD160表現量可能與抗原特異性T細胞在發炎部位(包括腫瘤或發炎性組織)的有效和功能狀態相關。在那些細胞中較高的CD160表現可能暗示抗原特異性T細胞處於活化狀態，而CD160表現量低或不存在，可能暗示抗原特異性T細胞處於不活化狀態。因此，CD160可以用作預測抗原特異性T細胞的功能狀態及因此預測免疫療法功效的生物標記。
因此，在一個態樣中，係提供一種包含(例如在其表面上)有外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞(例如T細胞)，其中相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，該外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調(up-modulation)。在一些具體例中，外源性CD160蛋白係經由GPI連接子結合至經修飾抗原特異性免疫細胞的細胞膜。在一些具體例中，外源性CD160蛋白是包含跨膜結構域的跨膜蛋白。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含跨膜結構域和衍生自共刺激性分子的細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白經由免疫細胞結合部分(諸如識別並活化T細胞表面分子的抗體)結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體，諸如經修飾T細胞受體、經改造的T細胞受體或嵌合抗原受體(CAR)。產生上述經修飾抗原特異性免疫細胞的方法亦有提供。
在另一個態樣中，係提供一種於抗原特異性免疫細胞中調控CD160之免疫刺激活性的方法，例如用於治療免疫疾病(諸如自體免疫疾病和發炎性疾病)。在一些具體例中，係提供一種藉由使抗原特異性免疫細胞與活化(例如增強) CD160活性的藥劑(例如，促效性抗CD160抗體)接觸，來活化(例如增強)抗原特異性免疫細胞之CD160的免疫刺激活性的方法。在一些具體例中，係提供一種藉由使抗原特異性免疫細胞與抑制(例如下調)CD160活性的藥劑(例如拮抗劑抗CD160抗體)接觸，來抑制(例如下調) CD160之免疫刺激活性的方法。
包含該等經修飾抗原特異性免疫細胞的組成物(諸如醫藥組成物)、套組和製品，以及使用本文所述經修飾抗原特異性免疫細胞來治療癌症的方法，亦有提供。 I.    定義
如本文所用，「治療(treatment或treating)」是用於獲得有益或期望結果(包括臨床結果)的方法。為了本發明之目的，有益或期望的臨床結果係包括但不限於以下一或多者：緩和由疾病引起的一或多種症狀、減輕疾病的程度、穩定疾病(例如，預防或延緩疾病惡化)、預防或延緩疾病的擴散(例如轉移)、預防或延緩疾病的復發、延緩或減慢疾病的進展、改善疾病狀態、提供(部分或完全)疾病緩解、減少治療疾病所需的一或多種其他藥物的劑量、延緩疾病的進展、提高生活質量及/或延長存活期。「治療」還含括減少疾病的病理後果。本發明的方法含括這些治療態樣中的任何一或多者。
術語「預防(prevent)」和類似用詞(諸如預防(prevented、preventing)等)表示防止，抑制或減少疾病或病況(例如癌症)復發可能性的方法。它也指延緩疾病或病況的復發或延緩疾病或病況的症狀復發。如本文所用，「預防」和類似用詞還包括在疾病或病況復發之前減輕疾病或病況的強度、影響，症狀及/或負荷。
如本文所用，「延緩」癌症的進展表示推遲、阻礙、減緩、減緩，穩定及/或推遲疾病的進展。這個延緩可以具有不同的時間長度，端視疾病的病史及/或所治療的個體而定。與不使用該方法相比時，「延緩」癌症進展的方法是一種在給定時間區間內降低疾病發展可能性及/或在給定時間區間內降低疾病程度的方法。這樣的比較通常是基於臨床研究，其使用統計學上顯著數量的個體。使用標準方法可以檢測到癌症的發展，其包括但不限於：電腦軸向斷層掃描(CAT Scan)、核磁共振成像(MRI)、腹部超音波、凝血測試、動脈攝影術或生物採檢。進展還可以指最初可能無法檢測到的癌症進展，包括發生、復發和發作。
本文中所用術語「有效量」是指藥劑或組合藥劑的量，其足以治療指定的病症、病況或疾病，諸如改善、減輕，減少及/或延緩一或多種症狀。當提到癌症，有效量係包含足以引起腫瘤縮小及/或降低腫瘤生長速率(例如抑制腫瘤生長)或防止或延緩其他不想要之細胞其增殖量。在一些具體例中，有效量是足以延緩疾病發展之量。在一些具體例中，有效量是足以預防或延緩復發之量。可用一或多次投予來施加有效量。藥物或組成物的有效量可以：(i)減少癌細胞的數量；(ii)縮小腫瘤大小；(iii)抑制、延緩，減慢達某個程度，並較佳地停止癌細胞浸潤到周邊器官中；(iv)抑制(即減慢達某個程度並且較佳地停止)腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)防止或延緩腫瘤的發生及/或復發；及/或(vii)緩解與癌症有關的一或多種症狀達某個程度。
如本文所用，「個體(individual或subject)」是指哺乳動物，包括但不限於人類、牛、馬、貓、犬，囓齒動物或靈長類動物。在一些具體例中，個體是人類。
「經分離」核酸是指已經自其天然環境的組分分離的核酸分子。經分離核酸包括細胞中所含的核酸分子，該細胞一般係含有該核酸分子，但是該核酸分子係存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置的染色體位置。
如本文所用，術語「載體」是指能夠增殖與其連接的另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體，以及併入至已引入宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠指揮與其可操作連接的核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用，術語「經轉染」或「經轉形」或「經轉導」是指一個將異源性核酸轉移或引入宿主細胞的過程。「經轉染」或「經轉形」或「經轉導」細胞是已經用異源性核酸轉染、轉形或轉導的細胞。該細胞包括初代目標細胞及其後代。
關於在本文所指之多肽序列的「胺基酸序列同一性百分比(%)」或「同源性」被定義為，在比對序列後，考量到任何保守取代作為序列同一性的一部分，候選序列中與待比較多肽中胺基酸殘基相同的胺基酸殘基其百分比。用於確定胺基酸序列同一性百分比的比對，可以按照習於技藝者所知的各種方式來實現，例如，使用公眾可用的電腦軟體(諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR)或MUSCLE軟體)。習於技藝者可以決定用於測量比對的合適參數，包括在所比較的序列全長上實現最大比對所需的任何演算法。但是，出於本文目的，係使用序列比較電腦程式MUSCLE (Edgar, R.C.,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004；Edgar, R.C.,BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004)來產生胺基酸序列同一性百分比的值。
如本文所用，「抗原特異性免疫細胞」是免疫細胞，透過天然及/或經改造的抗原識別受體特異性識別目標細胞上的抗原。免疫細胞包括但不限於具有或沒有經改造抗原識別的αβT細胞、γδT細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞，類自然殺手T細胞和巨噬細胞。抗原特異性免疫細胞可以是多株或單株。例如，在一些具體例中，「抗原特異性免疫細胞」是腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，其可以從經切除的腫瘤中分離出來；或新抗原特異性T細胞，其可使用各自的抗原結合四聚體予以分離；或經樹突細胞活化的T細胞，其是透過將周邊血液T細胞與負載有腫瘤抗原的樹突細胞共培養並活化而產生；或表現CAR或類TCR抗原受體的其他免疫細胞，諸如γδT細胞、NK細胞，NK-T細胞、iNK-T細胞，類自然殺手T細胞和巨噬細胞。
如本文所用，「抗原特異性受體」是天然或經改造的T細胞受體(TCR)；或工程改造抗原受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)。
「T細胞受體」或「TCR」如本文所用是指內源性或經修飾T細胞受體，其包含結合至特定抗原肽的細胞外抗原結合結構域，該特定抗原肽係結合在MHC分子中。在一些具體例中，TCR包含TCRα多肽鏈和TCRβ多肽鏈。在一些具體例中，TCR係特異地結合腫瘤抗原。「TCR-T」是指表現重組TCR的T細胞。
「嵌合抗原受體」或「CAR」如本文所用是指將一或多種抗原特異性移植到細胞上的經遺傳工程改造的受體，該等細胞為諸如αβT細胞、γδT細胞、NK細胞，巨噬細胞。CAR也被稱為「人工T細胞受體」、「嵌合T細胞受體」，或「嵌合免疫受體」。在一些具體例中，CAR包含對腫瘤抗原具有特異性之抗體的細胞外可變結構域，以及T細胞或其他受體的細胞內信號傳導結構域(諸如一或多個共刺激結構域)。「CAR-T」是指表現CAR的T細胞。
術語「抗體」在本文中以最廣義使用，並且含括各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展現出所需的抗原結合活性即可。術語抗體包括但不限於能夠結合抗原的片段，諸如Fv、單鏈Fv (scFv)、Fab，Fab'和(Fab')2 。術語抗體包括常規的四鏈抗體和單域抗體，諸如僅有重鏈的抗體或其片段(例如VH H)。
如本文所用，術語「結合」，「特異地結合」或「對…具有特異性」是指可測量到且可再現的交互作用(諸如目標與抗體之間的結合)，在包括生物分子的異質分子群存在下，其為目標存在的決定性因子。例如，結合至或特異地結合至目標(可能是表位)的抗體是以比其結合至其他目標更高的親和力、更高的結合力，更容易及/或持續時間更長結合這個目標的抗體。在一個具體例中，抗體對不相干目標的結合程度小於該抗體對目標結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所測定。在某些具體例中，特異地結合至目標的抗體的解離常數(Kd)為≤1 μM、≤100 nM、≤10 nM，≤1 nM或≤0.1 nM。在某些具體例中，抗體特異地結合至蛋白質上的表位，該表位在不同物種的蛋白質中是保守的。在另一個具體例中，特異性結合可以包括但不必要排他結合。
應理解，本文所述的本發明具體例包括「組成」及/或「基本上由…組成」的具體例。
在本文中提到「約」值或參數時包括(並描述)針對該值或參數本身的變化。例如，提到「約X」的描述包括「X」的描述。
如本文所用，提到「非」某值或某參數通常表示並描述某值或某參數「以外者」。例如，方法不用於治療X型癌症，意味著該方法用於治療X型以外的癌症。
本文中所用的術語「約X至Y」具有與「約X至約Y」相同的含義。
除非另外明確指出，否則如本文和隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a，an)」和「該」包括複數指示物。 II.   表現外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞
本發明的一個態樣提供一種包含(例如在其表面上)外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中該外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調。在一些具體例中，上調包含細胞裂解性淋巴細胞(CTL)活性增加。在一些具體例中，上調包含於免疫活性宿主中的腫瘤殺滅活性提高。在一些具體例中，上調包含T細胞及/或NK細胞媒介的殺滅提高。在一些具體例中，上調包含顆粒酶A及/或穿孔素的增強提高。在一些具體例中，上調包含發炎性反應提高。在一些具體例中，上調包含發炎性細胞激素的表現及/或分泌提高。在一些具體例中，發炎性細胞激素包含IFN-γ及/或TNF-α。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約80%同一性的變異體。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性中任一者的胺基酸序列。在一些具體例中，細胞表面上的外源性CD160蛋白呈多聚體形式(諸如但不限於二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：細胞毒性αβT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞、經APC活化的抗腫瘤T細胞和自然殺手T細胞(NK-T細胞)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性αβT細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經APC活化的抗腫瘤T細胞是經DC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞分離自個體的腫瘤。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是經修飾T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，經改造的T細胞受體(TCR)識別腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在進一步的具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，經修飾免疫細胞是對同一表位具有特異性的複數個免疫細胞。非限制性實例包括複數個各自含有相同功能性外源性受體(諸如CAR)的T細胞。在一些具體例中，經修飾免疫細胞是複數個免疫細胞，其各自對多個不同表位(諸如部分重疊或完全不同的表位)中之一者具有特異性。非限制性實例包括複數個多株免疫細胞，諸如多株型TIL。
在一些具體例中，提供在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，且其中外源性CD160蛋白是膜結合的。
在一些具體例中，提供在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白經由糖磷脂醯肌醇(glycophosphatidylinositol，GPI)連接子結合至膜。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含GPI錨定肽序列。
在一些具體例中，提供在其表面上包含有外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白包含跨膜結構域。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T細胞受體(TCR)α次單位、TCRβ次單位或TCRζ次單位。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1所組成之群組的分子。
在一些具體例中，提供在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白包含跨膜結構域和細胞內結構域。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T細胞受體(TCR)α次單位、TCRβ次單位或TCRζ次單位。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1所組成之群組的分子。在一些具體例中，細胞內結構域衍生自CD160剪接變異體。在一些具體例中，細胞內結構域包含衍生自TCR複合體的信號傳導次單位的細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，TCR複合體的信號傳導次單位選自由CD3γ、CD3δ和CD3ε所組成之群組。在一些具體例中，細胞內結構域包含一或多個衍生自T細胞刺激性分子的信號傳導結構域。在一些具體例中，信號傳導結構域是4-1BB、OX40、CD27、CD28、CD80或CD258中的一或多者。在一些具體例中，細胞內結構域包含選自由OX40、CD27、CD28，CD80和CD258所組成之群組的兩個信號傳導結構域的組合。[[CD160-TM+costim；covers 5-7+]]
在一些具體例中，提供在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白包含跨膜結構域和細胞內結構域，且其中細胞內結構域包含一或多個共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個中任一者的共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含不超過1、2、3、4或5個中任一者的共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內結構域不包含CD3ζ信號傳導結構域或4-1BB和CD3ζ結構域的組合。在一些具體例中，共刺激信號傳導結構域衍生自選自由以下所組成之群組的共刺激性分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、CD80、CD258、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配體及其組合。在一些具體例中，細胞內結構域包含CD28共刺激結構域，4-1BB共刺激結構域或兩者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、CD28共刺激結構域和4-1BB共刺激結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域和CD28共刺激結構域。在一些具體例中，CD28共刺激結構域與跨膜結構域相鄰。在一些具體例中，CD28共刺激結構域鄰接跨膜結構域的C端。在一些具體例中，細胞內結構域包含初級訊號傳導結構域(primary signaling domain)。在一些具體例中，初級訊號傳導結構域包含CD3ζ結構域。在其他具體例中，細胞內結構域不包含初級訊號傳導結構域。在其他具體例中，細胞內結構域不包含CD3ζ結構域或4-1BB和CD3ζ結構域的組合。
在一些具體例中，提供在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白經由免疫細胞結合部分結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，免疫細胞結合部分結合至免疫細胞的表面分子。在一些具體例中，免疫細胞結合部分包含識別T細胞表面分子的抗體。在一些具體例中，抗體可以是全長抗體或抗體片段，諸如scFv、Fv、Fab、(Fab')2 ，單域抗體(sdAb)或VH H結構域。非限制性實例包括抗CD3ε抗體，其識別TCR及/或活化TCR信號傳導。在一些具體例中，免疫細胞結合部分包含結合同源T細胞表面受體的配體。非限制性實例包括識別TCR和IL-2的腫瘤特異性肽MHC複合體。
在依據本文所述任一種經修飾抗原特異性免疫細胞的一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約80%同一性的變異體。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性中任一者的胺基酸序列。在一些具體例中，細胞表面上的外源性CD160蛋白呈多聚體形式(諸如但不限於二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性αβT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞、經APC活化的抗腫瘤T細胞和自然殺手T細胞(NK-T細胞)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經APC活化的抗腫瘤T細胞是經DC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞分離自個體的腫瘤。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是經修飾T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，經改造的T細胞受體(TCR)識別腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在進一步的具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，經修飾免疫細胞是對同一表位具有特異性的複數個免疫細胞。非限制性實例包括複數個各自含有相同功能性外源性受體(諸如CAR)的T細胞。在一些具體例中，經修飾免疫細胞是複數個免疫細胞，其各自對多個不同表位(諸如部分重疊或完全不同的表位)中之一者具有特異性。非限制性實例包括複數個多株免疫細胞，諸如多株型TIL。
在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞展現出天然抗原識別。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞展現出經改造的抗原識別。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞的抗原識別至少部分地由功能性外源性受體(諸如但不限於CAR和TCR)賦予。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞靶向腫瘤相關抗原，突變的致癌抗原和隨機體細胞抗原以及其他新抗原。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是人類免疫細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是鼠類免疫細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是TCR-T細胞、CAR-T細胞，TIL或內源性抗原特異性T細胞中的一或多者經修飾。人類和鼠類TCR-T細胞、CAR-T細胞、TIL或內源性抗原特異性T細胞的一些實例報導於Tran et al.,Nat Immunol . 2017;18(3):255-62.、MacKay et al.,Nat Biotechnol . 2020;38(2):233-44與Schumacher et al.,Cancer Neoantigens. Annu Rev Immunol. 2019;37:173-200中，其以引用的方式併入本文。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞靶向廣泛的抗原。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞靶向表1中列舉的一或多種抗原。 表1：腫瘤抗原及相關癌症適應症的例示性列表
腫瘤-抗原 原發性癌症適應症 其他癌症適應症
1 CD19 白血病/淋巴瘤 骨髓瘤
2 BCMA 骨髓瘤 白血病/淋巴瘤
3 LILRB4 骨髓性白血病  
4 WT1 白血病  
5 GPRCD5 骨髓瘤  
6 CD22 白血病/淋巴瘤 白血病/淋巴瘤
7 CD20 白血病/淋巴瘤  
8 CD123 白血病/淋巴瘤 骨髓發育不良症候群
9 CD30 骨髓性白血病 骨髓瘤、骨髓發育不良症候群
10 CD38 白血病/淋巴瘤 骨髓瘤、骨髓發育不良症候群
11 CD33 白血病/淋巴瘤 骨髓瘤、骨髓發育不良症候群
12 CD138 骨髓瘤  
13 CD56 骨髓瘤 骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群
14 CD7 白血病/淋巴瘤 骨髓發育不良症候群
15 CLL-1 骨髓性白血病 骨髓發育不良症候群
16 CD10 淋巴性白血病  
17 CD34 骨髓性白血病 骨髓發育不良症候群
18 CS1 骨髓瘤  
19 CD16 淋巴性白血病 淋巴瘤
20 CD4 淋巴性白血病 淋巴瘤
21 CD5 淋巴性白血病 淋巴瘤
22 IL-1_RAP 骨髓性白血病  
23 ITGB7 骨髓瘤  
24 k-IgG 白血病/淋巴瘤 骨髓瘤
25 TAC-1 骨髓瘤  
26 TRBC-1 淋巴瘤  
27 MUC1 胰、腦、肝、肺、結腸、乳房、胃 食道、肉瘤、子宮頸、骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群
28 NKG2D 結腸 胰、乳房、卵巢、尿道上皮
29 PD-L1 肺 胰、腦、肝、結腸、乳房、腎
30 CD133 腦、骨髓性白血病 胰、肝、結腸、乳房、卵巢
31 CD117 骨髓性白血病 肉瘤、骨髓發育不良症候群
32 LeY 骨髓性白血病 骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群、肉瘤
33 CD70 淋巴性白血病、淋巴瘤 胰、乳房、卵巢、腎、黑色素瘤
34 ROR1 淋巴性白血病、淋巴瘤 肺、乳房
35 AFP 肝  
36 AXL 腎  
37 CD80 肺  
38 DLL3 肺  
39 DR5 肺  
40 FAP 肝  
41 FBP 間皮瘤  
42 LMP1 子宮內膜  
43 MAGE-A1 肺、骨髓瘤、黑色素瘤  
44 MAGE-A2 黑色素瘤  
45 MAGE-A3 胰、肺、骨髓瘤  
46 MAGE-A4 肺鱗狀、膀胱、黑色素瘤、卵巢、頭頸部、食道、胃 頭頸部、卵巢、乳房、子宮內膜、食道、胃、肺腺癌
47 MAGE-C1 肝  
48 MAGE-A10 肺鱗狀、膀胱、黑色素瘤 頭頸部、卵巢、乳房、子宮內膜、食道、胃、肺腺癌
49 MG7 肝  
50 MUC16 腹膜、卵巢  
51 Mart1 黑色素瘤  
52 PMEL 黑色素瘤  
53 ROR2 腎  
54 BVEGFR2 腎、黑色素瘤  
55 CD171 神經母細胞瘤  
56 CLD18 胃(stomach)、胃(gastric) 胃食道交接處
57 EphA2 腦/CNS  
58 ErB 肝、肺、卵巢、頭頸部  
59 FRa 卵巢、腹膜、膀胱  
60 PSCA 胰 肺、胃/胃、前列腺
61 cMet 肝、乳房 結腸、卵巢、前列腺、腎
62 IL13Ra2 腦/CNS  
63 EPCAM 肝、胃/胃 胰、結腸、乳房、前列腺、食道、鼻咽
64 EGFR 腦、結腸 胰、肝、肺、卵巢、神經母細胞瘤、腎、肉瘤、眼、生殖系、腎
65 PSMA 前列腺 頸椎、頭頸部
66 EGFRvIII 腦 胰、肝、肺
67 GPC3 肝 肺
68 CEA 胰、肝、肺、結腸、乳房、卵巢、胃/胃 前列腺、腎、食道、肉瘤
69 HER2 胰、腦、肺、結腸、乳房、卵巢、胃/胃 肝、前列腺、腎、食道、腹膜、子宮頸
70 GD2 神經母細胞瘤、腦 肺、黑色素瘤、肉瘤
71 間皮素 胰、肺、乳房、胃/胃、間皮瘤 神經母細胞瘤、腹膜、頭頸部、子宮內膜
72 封閉蛋白(Claudin) 18.2 胰、胃  
73 NY-ESO-1 骨髓瘤、肉瘤、 肺、乳房、黑色素瘤、頭頸部、卵巢、乳房、子宮內膜、食道、胃
74 TAG-72 腺癌  
75 h5T4致癌胎兒抗原 各種腫瘤  
76 EBV-特異性抗原 淋巴瘤  
77 HPV-特異性抗原 子宮頸、肛門、陰莖、口咽、陰道、外陰  
78 HBV-特異性抗原 肝、膽管、瀰漫性大B細胞淋巴瘤  
79 HCV-特異性抗原 肝癌  
80 突變型ERB2 膀胱、小腸、壺腹、皮膚非黑色素瘤、子宮頸  
81 突變型Kras 肺、胰、結腸直腸  
在一些具體例中，提供一種醫藥組成物，其包含本文所述的任一種經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，提供一種用於產生本文所述之任一種經修飾抗原特異性免疫細胞的方法。 包含外源性CD160的經修飾抗原特異性免疫細胞庫以及篩選抗原特異性免疫細胞的方法
在一些具體例中，係提供一種抗原特異性免疫細胞(諸如T細胞)之庫，該等抗原特異性免疫細胞各自具有識別不同抗原(諸如腫瘤抗原或腫瘤相關抗原)的功能性外源性受體。在一個態樣中，係提供一種抗原特異性免疫細胞(諸如T細胞)之庫，該等抗原特異性免疫細胞各自具有識別不同腫瘤或腫瘤相關抗原的功能性外源性受體，其中該庫中的各個抗原特異性免疫細胞在其表面上進一步包含外源性CD160蛋白，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾免疫細胞的上調。
在一個態樣中，係提供一種多株免疫細胞(諸如TIL)之庫，其中多株組成物中的各個免疫細胞對多個不同表位(諸如部分重疊或完全不同的表位)中之一者具有特異性，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾免疫細胞的上調。
在一些具體例中，提供一種篩選免疫細胞的方法，該免疫細胞包含對測試抗原具有特異性的功能性外源性受體，該方法包含使測試抗原與各自具有識別不同抗原(諸如腫瘤或與腫瘤相關抗原)的功能性外源性受體的抗原特異性免疫細胞(諸如T細胞)之庫接觸，其中庫中的各個抗原特異性免疫細胞在其表面上進一步包含外源性CD160蛋白，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體免疫細胞，其中該外源性CD160蛋白係導致經修飾免疫細胞的上調。表現功能性外源性受體(諸如所需功能性外源性受體)的所需抗原特異性免疫細胞可以藉由使測試抗原與各自具有識別不同抗原之功能性外源性受體的抗原特異性免疫細胞(諸如T細胞)之庫接觸，然後分析庫中細胞與測試抗原的結合活性，或透過測量庫中細胞的抗原特異性免疫活性(諸如但不限於對任何細胞激素分泌進行ELISA分析，細胞激素舉例如IFN-γ，TNF-α及/或IL-2)來予以鑑定。
在一些具體例中，係提供一種篩選對測試抗原具有特異性之免疫細胞的方法，包含使測試抗原與多株型免疫細胞(諸如TIL)之庫接觸，其中多株型組成物中的各個免疫細胞對複數個不相同表位(諸如部分重疊或完全不同表位)之一者具有特異性，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體免疫細胞，其中該外源性CD160蛋白係導致經修飾免疫細胞的上調。多株型組成物中的所需抗原特異性免疫細胞可以藉由使測試抗原與多株免疫細胞(諸如TIL)之庫接觸，其中各個細胞對複數個不相同表位之一者具有特異性，然後分析庫中細胞與測試抗原的結合活性，或透過測量庫中細胞的抗原特異性免疫活性(諸如但不限於對任何細胞激素分泌進行ELISA分析，細胞激素為例如IFN-γ，TNF-α及/或IL-2)來予以鑑定。
在依據上述任一方法的一些具體例中，測試抗原係包含一或多個免疫原性表位。在一些具體例中，測試抗原衍生自裂解物，諸如腫瘤裂解物。在一些具體例中，在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞之庫是藉由包含以下的方法產生：使複數個前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白的核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞之庫。在一些具體例中，CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4具有至少約80%同一性的變異體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：細胞毒性αβT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞、經APC活化的抗腫瘤性T細胞，和自然殺手T細胞(NK-T細胞)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經APC活化的抗腫瘤T細胞是經DC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。 CD160蛋白
本文所述的經修飾抗原特異性免疫細胞表現外源性CD160蛋白，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調。本申請案還提供外源性CD160蛋白及其組成物。表2顯示例示性外源性CD160蛋白的序列。
表2：例示性外源性CD160蛋白的序列
SEQ ID NO: 說明 序列(跨膜結構域 (TMD) 標示粗體 ；細胞內結構域標示底線)
1 人類CD160 (GPI錨定) MLLEPGRGCCALAILLAIVDIQSGGCINITSSASQEGTRLNLICTVWHKK EEAEGFVVFLCKDRSGDCSPETSLKQLRLKRDPGIDGVGEISSQLMFTIS QVTPLHSGTYQCCARSQKSGIRLQGHFFSILFTETGNY
2 人類CD160 (TMD) MLLEPGRGCCALAILLAIVDIQSGGCINITSSASQEGTRLNLICTVWHKK EEAEGFVVFLCKDRSGDCSPETSLKQLRLKRDPGIDGVGEISSQLMFTIS QVTPLHSGTYQCCARSQKSGIRLQGHFFSILFTETGNYTVTGLKQRQHLE FSHNEGTLSSGFLQEKVWVMLVTSLVALQAL
3 人類CD160 (TMD，細胞內) MLLEPGRGCCALAILLAIVDIQSGGCINITSSASQEGTRLNLICTVWHKK EEAEGFVVFLCKDRSGDCSPETSLKQLRLKRDPGIDGVGEISSQLMFTIS QVTPLHSGTYQCCARSQKSGIRLQGHFFSILFTETGNYTVTGLKQRQHLE FSHNEGTLSSGFLQEKVWVMLVTSLVALQ GMSKRAVSTPSNEGAIIFLPP WLFSRRRRLERMSRGREKCYSSPGYPQESSNQFH
4 小鼠CD160 MQRILMAPGQSCCALAILLAIVNFQHGGCIHVTSSASQKGGRLDLTCTLW HKKDEAEGLILFWCKDNPWNCSPETNLEQLRVKRDPETDGITEKSSQLVF TIEQATPSDSGTYQCCARSQKPEIYIHGHFLSVLVTALYTL
在一些具體例中，提供一種包含天然CD160多肽或其片段的外源性CD160蛋白，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中該外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調。在一些具體例中，外源性CD160蛋白係由天然CD160蛋白或其片段組成或基本上由其組成。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含天然CD160蛋白的類IgV型結構域或其片段。在一些具體例中，外源性CD160蛋白係包含天然CD160蛋白的富含半胱胺酸結構域或其片段。在一些具體例中，外源性CD160蛋白係包含天然CD160蛋白的胺基酸25至133，其中該胺基酸序列是依據SEQ ID NO:1至3中任一者進行編號。
在一些具體例中，細胞表面上的外源性CD160蛋白呈單體形式。在一些具體例中，細胞表面上的外源性CD160蛋白呈多聚體。在一些具體例中，細胞表面上的外源性CD160蛋白呈多聚體，諸如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體。在一些具體例中，多聚體包含一或多個外源性CD160蛋白和一或多個天然CD160蛋白。在一些具體例中，多聚體包含一或多個外源性CD160蛋白和一或多個內源性CD160蛋白。在一些具體例中，細胞表面上的CD160蛋白多聚體是共價連接的。在一些具體例中，細胞表面上的CD160蛋白多聚體經二硫鍵連接。在一些具體例中，外源性CD160蛋白中的至少1、2、3或4個半胱胺酸殘基突變。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至3中任一者的胺基酸序列，進一步包含下列半胱胺酸殘基中的一或多個突變：Cys26、Cys44、Cys61、Cys68、Cys112、Cys113或其任何組合。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列，進一步包含下列半胱胺酸殘基中的一或多個突變：Cys29、Cys47、Cys64、Cys71、Cys115、Cys116或其任何組合。在一些具體例中，帶有上述突變中之一或多者的外源性CD160蛋白不能形成多聚體。
在一些具體例中，外源性CD160蛋白對MHC-I展現出與天然CD160蛋白相同或基本上相同的結合親和力。在一些具體例中，與天然CD160蛋白相比，外源性CD160蛋白對MHC-I展現出的結合親和力增加。在一些具體例中，外源性CD160蛋白的MHC-I結合親和力比天然CD160蛋白高約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白的MHC-I結合親和力比天然CD160蛋白高約2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或100倍中任一者。在一些具體例中，與天然CD160蛋白相比，外源性CD160蛋白對MHC-I展現出的結合親和力降低。在一些具體例中，外源性CD160蛋白的MHC-I結合親和力比天然CD160蛋白低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白的MHC-I結合親和力比天然CD160蛋白低約2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或100倍中任一者。
在一些具體例中，外源性CD160蛋白對皰疹病毒進入媒介因子(Herpeersvirus entry mediator, HVEM)展現出與天然CD160蛋白相同或基本上相同的結合親和力。在一些具體例中，與天然CD160蛋白相比，外源性CD160蛋白對HVEM展現出的結合親和力增加。在一些具體例中，外源性CD160蛋白的HVEM結合親和力比天然CD160蛋白高約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白的HVEM結合親和力比天然CD160蛋白高約2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或100倍中任一者。在一些具體例中，與天然CD160蛋白相比，外源性CD160蛋白對HVEM表現出的結合親和力降低。在一些具體例中，外源性CD160蛋白的HVEM結合親和力比天然CD160蛋白低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白的HVEM結合親和力比天然CD160蛋白者約2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或100倍中任一者。
在一些具體例中，外源性CD160蛋白與BTLA (也稱為CD272)競爭結合至HVEM。在一些具體例中，外源性CD160蛋白不與BTLA競爭結合至HVEM。在一些具體例中，外源性CD160蛋白對HVEM展現出與BTLA相似的結合親和力。在一些具體例中，與BTLA相比，外源性CD160蛋白對HVEM展現出更高的結合親和力。在一些具體例中，與BTLA相比，外源性CD160蛋白對HVEM展現出更低的結合親和力。在一些具體例中，外源性CD160蛋白對HVEM展現出與BTLA相同或基本上相同的結合親和力。在一些具體例中，與BTLA相比，外源性CD160蛋白對HVEM展現出更高的結合親和力。在一些具體例中，與BTLA相比，外源性CD160蛋白對HVEM展現出更低的結合親和力。在一些具體例中，外源性CD160蛋白展現出與BTLA相同或基本上相同的HVEM結合解離速率。在一些具體例中，與BTLA相比，外源性CD160蛋白展現出更高的HVEM結合解離速率。在一些具體例中，與BTLA相比，外源性CD160蛋白展現出更低的HVEM結合解離速率。
在一些具體例中，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，且其中CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%的同一性的變異體。在一些具體例中，CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約80%的序列同一性，諸如至少約85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性中任一者的胺基酸序列。在一些具體例中，CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約95%的序列同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約99%的序列同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性中任一者的胺基酸序列。
在一些具體例中，外源性CD160蛋白衍生自哺乳動物的CD160蛋白。在一些具體例中，外源性CD160蛋白衍生自小鼠、狗、貓、馬、大鼠、山羊或兔子的CD160蛋白。在一些具體例中，外源性CD160蛋白衍生自人類的CD160蛋白。
在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含全長CD160蛋白。在一些具體例中，外源性CD160包含選自由SEQ ID NO：1至4所組成之群組的胺基酸序列。CD160蛋白序列是本技藝中已知的，包括但不限於具有UniProt (worldwide web.uniprot.org)登錄號O95971和O88875的序列。編碼CD160蛋白的mRNA序列也是本技藝中已知的，包括但不限於具有NCBI (wordwide web ncbi.nlm.nih.gov)登錄號NM_007053.3，XM_005272929.3和NM_001163497.1的序列。
在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含至少約50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600個或更多個胺基酸中任一者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含不超過約600、550、500、450、350、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50個或更少個胺基酸中任一者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含約50至60、50至75、50至100、50至150、50至200、50至250、100至150、100至200、100至250、150至250，250至500或50至550個胺基酸中任一者。
在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含天然CD160蛋白或其片段的胺基酸序列變異體。例如，可能需要增進CD160蛋白的結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼CD160蛋白的核苷酸序列或藉由肽合成來製備CD160蛋白的胺基酸序列變異體。此類修飾包括，例如在CD160蛋白的胺基酸序列內殘基的缺失及/或插入及/或取代。可準備缺失，插入和取代的任何組合以獲得最終構建體，只要最終構建體具有所需特性(例如促發炎活性)即可。
在一些具體例中，與天然CD160蛋白或其片段的序列相比，外源性CD160蛋白包含具有一或多個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20個胺基酸或更多個)保守取代的天然CD160蛋白或其片段。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與天然CD160蛋白或其片段的序列具有至少約80%的序列同一性，諸如至少約85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的天然CD160蛋白或其片段。
保守取代顯示在下表3中。 表3：保守取代
原有殘基 例示性取代 偏好的取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp, Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
依據共同的側鏈特性，胺基酸可分為不同的類別： a.    疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； b.   中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； c.    酸性：Asp、Glu； d.   鹼性：His、Lys、Arg； e.    影響鏈位向的殘基；Gly、Pro； f.    芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代需要將這些類別之一的成員換成另一個類別。
習知技藝者將認知到，可以使用任何合適的方法在感興趣基因中產生突變，包括誘變、聚合酶鏈反應，同源重組或習於技藝者已知的任何其他遺傳工程技術。突變可能牽涉到單個核苷酸(諸如點突變，涉及在DNA序列內去除，添加或取代單個核苷酸鹼基)，或者可能牽涉到大量核苷酸的插入或缺失。突變可能是事件(諸如DNA複製忠誠度錯誤)所引發，或在暴露於化學或物理誘變劑後引發。也可以透過使用習於技藝者周知的特定靶向方法來進行定點突變。
如Cunningham and Wells (1989)Science , 244:1081-1085所述，用於鑑定可被靶向誘變的多肽的殘基或區域的可用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在這個方法中，鑑定目標殘基的殘基或群(例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys和glu)，並用中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)替換，以確定免疫是否受到多肽劑(例如CD160變異體)上調。可以在胺基酸位置引入更多取代，證明對初始取代的功能敏感性。另外或額外，可以分別測定CD160：MHC I複合體或CD160：HVEM複合體的晶體結構以鑑定出CD160和MHC-I之間或CD160和HVEM之間的接觸點。視疾病適應症而定，此類接觸殘基和鄰近殘基可被靶向或消除作為替代候選物，以增強或減弱抗原特異性免疫細胞中的CD160功能。可以篩選變異體以確定它們是否包含所需的屬性。
胺基酸序列插入包括長度範圍從一個殘基到含有一百個或更多個殘基的多肽的胺基端融合及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。
在一些具體例中，外源性CD160蛋白是從經修飾抗原特異性免疫細胞分泌的。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含信號肽。信號肽(也稱為「前導序列」)通常會在Met起始子之後立即插入蛋白質的N端。從經修飾抗原特異性免疫細胞輸出外源性CD160蛋白後，信號肽可能會被切割，形成成熟蛋白。信號肽可以是天然的或合成的，且它們與其所連接的蛋白質可以是異源或同源的。信號肽的選擇是廣泛的，並且是習於技藝者可取得的，包括例如在新加坡國立大學生物化學系維護的線上前導序列數據庫中。參見Chooet al .,BMC Bioinformatics , 6: 249 (2005)；以及PCT公開案第WO 2006/081430號。 功能性外源性受體
上述任一種經修飾抗原特異性免疫細胞可以進一步表現功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是經改造的受體。例示性功能性外源性受體包括，但不限於CAR和經改造的TCR。在一些具體例中，功能性外源性受體包含特異性結合至抗原(例如腫瘤抗原)的細胞外結構域，跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域包括初級細胞內信號傳導結構域(primary intracellular signaling domain)及/或共刺激結構域。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域包含TCR共受體的細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，功能性外源性受體由編碼外源性CD160蛋白的異源性核酸序列所編碼。在一些具體例中，功能性外源性受體由可操作地連接至啟動子(諸如持續性啟動子(constitutive promoter)或誘導型啟動子)的第二異源性核酸所編碼。在一些具體例中，外源性功能性受體藉由將蛋白質插入細胞膜，同時使細胞通過微流體系統(諸如CELL SQUEEZE® )而被引入經修飾抗原特異性免疫細胞中(參見例如，美國專利申請公開案第20140287509號)。在一些具體例中，藉由CRISPR媒介的基因編輯將功能性外源性受體引入經修飾免疫細胞。功能性外源性受體可以提高經修飾抗原特異性免疫細胞的功能，諸如透過靶向經修飾抗原特異性免疫細胞，透過轉導信號，及/或透過增強經修飾抗原特異性免疫細胞的細胞毒性。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞不表現功能性外源性受體，諸如CAR或TCR。
在一些具體例中，功能性外源性受體包含靶向至少一個腫瘤抗原的一或多個特異性結合結構域，以及一或多個細胞內效應結構域，諸如一或多個初級細胞內信號傳導結構域及/或共刺激結構域。
在一些具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。許多嵌合抗原受體是本技藝中是已知的，並且可能適用於本發明的經修飾抗原特異性免疫細胞。透過利用例如抗體分子的抗原結合片段或抗體可變域，也可以構建對任何細胞表面標記具有特異性的CAR。本文中可以使用任何產生CAR的方法。參見，例如US6,410,319、US 7,446,191、US 7,514,537、US9765342B2、WO 2002/077029，WO2015/142675，US2010/065818，US 2010/025177，US 2007/059298、WO2017025038A1，以Berger C.et al ., J. Clinical Investigation 118: 1 294-308 (2008)，其以引用的方式併入本文。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是CAR-αβT細胞、CAR-γδT細胞、CAR-NK細胞，或CAR-巨噬細胞。
本發明的CAR包含細胞外結構域(包含至少一個特異地結合至少一個腫瘤抗原的靶向結構域)，跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域產生促進包含CAR的細胞(例如CAR-T細胞)之免疫效應功能的信號。「免疫效應功能或免疫效應反應」是指(例如免疫效應細胞)提高或促進目標細胞的免疫攻擊的功能或反應。例如，免疫效應功能或反應可以指T細胞或NK細胞促進目標細胞的殺滅，或抑制生長或增殖的特性。例如在CAR-T細胞中的免疫效應功能的實例包括細胞裂解活性(諸如抗體依賴性細胞毒性或ADCC)和輔助活性(諸如細胞激素的分泌)。在一些具體例中，CAR具有的細胞內信號傳導結構域帶有減弱的免疫效應功能。在一些具體例中，與具有全長和野生型CD3ζ以及視情況一或多個共刺激結構域的CAR相比，CAR具有的細胞內信號傳導結構域帶有不超過約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更少中任一者的免疫效應功能(諸如針對目標細胞的細胞裂解功能)。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域產生促進含有CAR的細胞的增生及/或存活的信號。在一些具體例中，CAR包含一或多個選自CD28、CD137、CD3、CD27、CD40、ICOS、GITR和OX40之信號傳導結構域的細胞內信號傳導結構域。天然分子的信號傳導結構域可包含分子或其片段或衍生物的整個細胞內(即細胞質)部分，或整個天然細胞內信號傳導結構域。
在一些具體例中，CAR的細胞內信號傳導結構域包含初級細胞內信號傳導結構域。「初級細胞內信號傳導結構域」是指以刺激方式發揮作用來誘導免疫效應功能的細胞質信號傳導序列。在一些具體例中，初級細胞內信號傳導結構域含有被稱為免疫受體基於酪胺酸的活化模體或ITAM的信號傳導模體。在一些具體例中，初級細胞內信號傳導結構域包含選自由以下所組成之群組的蛋白質的功能性信號傳導結構域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、共有FcRγ (FCER1G)、FcRβ (Fc Epsilon Rib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12。在一些具體例中，初級細胞內信號傳導結構域包含選自由以下所組成之群組的蛋白質的非功能性或減弱的信號傳導結構域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、共有FcRγ (FCER1G)、FcRβ (Fc Epsilon Rib)、CD79a、CD79b，FcγRIIa、DAP10和DAP 12。非功能性或減弱的信號傳導結構域可以是具有會減弱或消除一或多種免疫效應功能(諸如細胞裂解活性或輔助活性，包括抗體依賴性細胞毒性(ADCC))的點突變、插入或缺失的突變型信號傳導結構域。在一些具體例中，CAR包括非功能性或減弱的CD3ζ (即CD3ζ或CD3Z)信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域不包含初級細胞內信號傳導結構域。與具有相同構建體，但帶有野生型初級細胞內信號傳導結構域的CAR相比，減弱的初級細胞內信號傳導結構域可誘導不超過約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更少免疫效應功能(諸如對標目標細胞的細胞裂解功能)中任一者。
在一些具體例中，CAR的細胞內信號傳導結構域包含一或多個(諸如1、2、3或更多個中任一者)共刺激結構域。「共刺激結構域」可以是共刺激性分子的細胞內部分。術語「共刺激性分子」是指在免疫細胞(諸如T細胞)上的一種同源結合配偶體，其與共刺激配體特異地結合，從而媒介免疫細胞的共刺激反應，諸如但不限於增生與存活。共刺激性分子是抗原受體或其配體以外的細胞表面分子，它們有助於有效的免疫反應。共刺激性分子可以下列蛋白質家族來表示：TNF受體蛋白、類免疫球蛋白蛋白、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)，和活化NK細胞受體。共刺激性分子包括但不限於第I型MHC分子、BTLA和鐸樣配體受體，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD 11a/CD18)、ICOS (CD278)和4-1BB (CD137)。這種共刺激性分子的更多實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CDIOO (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELLPG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和與CD83特異地結合的配體。
在一些具體例中，CAR包含一個單獨共刺激結構域。在一些具體例中，CAR包含兩個或更多個共刺激結構域。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域包含功能性初級細胞內信號傳導結構域和一或多個共刺激結構域。在一些具體例中，CAR不包含功能性初級細胞內信號傳導結構域(如CD3ζ)。在一些具體例中，CAR包含由一或多個共刺激結構域組成或基本上由一或多個共刺激結構域組成的細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，CAR包含由或基本上由無功能性或減弱的初級細胞內信號傳導結構域組成的細胞內信號傳導結構域(諸如突變CD3ζ)和一或多個共刺激結構域。在目標結構域結合至腫瘤抗原之後，CAR的共刺激結構域可轉導信號以提高具有CAR的經改造免疫細胞(諸如T細胞)的增生、存活和分化，並抑制誘導細胞死亡的活化。在一些具體例中，一或多個共刺激信號傳導結構域衍生自選自由以下所組成之群組的一或多個分子：CD27、CD28、4-1BB (即CD137)、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特異地結合至CD83的配體。
在一些具體例中，CAR的細胞內信號傳導結構域包含衍生自CD28的共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域包含CD3ζ的細胞質信號傳導結構域，和CD28的共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，本申請案之嵌合受體的細胞內信號傳導結構域包含衍生自4-1BB (即CD137)的共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域包含CD3ζ的細胞質信號傳導結構域，和4-1BB的共刺激信號傳導結構域。
在一些具體例中，CAR的細胞內信號傳導結構域包含CD28的共刺激信號傳導結構域，和4-1BB的共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域包含CD3ζ的細胞質信號傳導結構域、CD28的共刺激信號傳導結構域，和4-1BB的共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內信號傳導結構域包含從N端至C端包含下列的多肽：CD28的共刺激信號傳導結構域、4-1BB的共刺激信號傳導結構域和CD3ζ的細胞質信號傳導結構域。
在一些具體例中，CAR的靶向結構域是抗體或抗體片段，諸如scFv、Fv、Fab、(Fab')2 、單域抗體(sdAb)或VH H結構域。在一些具體例中，CAR的靶向結構域是特異地結合至腫瘤抗原的配體或受體的細胞外部分。在一些具體例中，CAR的一或多個靶向結構域特異地結合至單一腫瘤抗原。在一些具體例中，CAR是具有結合兩個或更多個腫瘤抗原之靶向結構域的雙特異性或多特異性CAR。在一些具體例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群組：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR (諸如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1和其他具有臨床意義的腫瘤抗原及其組合。
在一些具體例中，CAR的跨膜結構域包含選自由以下的跨膜結構域：T細胞受體的α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CDIOO (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELLPG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D及/或NKG2C的跨膜結構域。在一些具體例中，CAR的跨膜結構域是CD4、CD3、CD8α、或CD28跨膜結構域。在一些具體例中，CAR的跨膜結構域包括CD8α的跨膜結構域。
在一些具體例中，細胞外結構域藉由鉸鏈區連接至跨膜結構域。在一個具體例中，鉸鏈區包含CD8α的鉸鏈區。
在一些具體例中，CAR包含信號肽，諸如CD8αSP。
在一些具體例中，功能性外源性受體是經修飾的T細胞受體。在一些具體例中，經改造的TCR對腫瘤抗原具有特異性。在一些具體例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群組：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR (諸如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1和其他具有臨床意義的腫瘤抗原。在一些具體例中，腫瘤抗原衍生自腫瘤細胞的細胞內蛋白。已經描述過許多對腫瘤抗原(包括腫瘤相關抗原)具有特異性的TCR，腫瘤抗原包括例如NY-ESO-1癌-睪丸抗原、p53腫瘤抑制因子抗原、黑色素瘤 (例如MARTI、gp 100)、白血病(例如WT1，次要組織相容性抗原)和乳癌(例如HER2，NY-BR1)中腫瘤抗原的TCR。本技藝中已知的任何TCR都可以用於本申請案中。在一些具體例中，TCR對腫瘤抗原具有的親和力提高。例示性TCR和用於將TCR引入免疫細胞的方法已描述於例如US5830755和Kesselset al. Immunotherapy through TCR gene transfer.Nat. Immunol. 2, 957-961 (2001)中。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是TCR-T細胞。
TCR受體複合體是由可變TCR受體α鏈和β鏈(在γδ T細胞的情況下為γ鏈和δ鏈)與三個二聚信號傳導模體CD3δ/ε，CD3γ/ε和CD247 (T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈) ζ/ζ或ζ/η形成的八聚體複合體。每個次單位之跨膜結構域中的可離子化殘基形成交互作用的極性網絡，其將複合體結合在一起。TCR複合體具有活化T細胞信號傳導級聯的功能。
在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞表現超過一種功能性外源性受體，諸如CAR或TCR受體的任何組合。
在一些具體例中，由經修飾抗原特異性免疫細胞表現的功能性外源性受體(諸如CAR或TCR)靶向一或多種腫瘤抗原。腫瘤抗原是由腫瘤細胞產生的蛋白質，可以引起免疫反應，特別是T細胞媒介的免疫反應。本發明的靶向抗原的選擇將取決於待治療癌症的特定類型。例示性腫瘤抗原包括例如神經膠質瘤相關抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人類絨毛膜促性腺激素、α胎蛋白(AFP)、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2 (AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特異性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原1 (PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性球彈性蛋白酶、蝶素(ephrin) B2、CD22、胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II，IGF-I受體和間皮素。
在一些具體例中，腫瘤抗原包含與惡性腫瘤相關的一或多種抗原性癌症表位。惡性腫瘤表現多種蛋白質，其可充當免疫攻擊的目標抗原。這些分子包括但不限於組織特異性抗原，例如黑色素瘤中的MART-1、酪胺酸酶和gp 100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特異性抗原(PSA)。其他目標分子屬於轉型相關分子，諸如致癌基因HER2/Neu/ErbB-2。另一組目標抗原是癌胎抗原，諸如癌胚抗原(CEA)。在B細胞淋巴瘤中，腫瘤特異性個體遺傳型免疫球蛋白構成了真正的腫瘤特異性免疫球蛋白抗原，該抗原對於個別腫瘤是獨一無二的。B細胞分化抗原(諸如CD19、CD20和CD37)是B細胞淋巴瘤中目標抗原的其他候選。
在一些具體例中，腫瘤抗原是腫瘤特異性抗原(TSA)或腫瘤相關抗原(TAA)。TSA對腫瘤細胞是特有的，不會出現在體內其他細胞上。TAA相關抗原並非腫瘤細胞特有，而是在無法誘導對該抗原的免疫耐受性時表現於正常細胞上。在使免疫系統對抗原做出反應的條件下，可能會發生腫瘤上的抗原表現。TAA可以是在胎兒發育過程中表現在正常細胞上的抗原，當免疫系統不成熟，並且無法反應，或者它們通常可以是以極低的量存在於正常細胞上的抗原，但它們在腫瘤細胞上的表現量高得多。
TSA或TAA抗原的非限制性實例包括下列：分化抗原(諸如MART-1/MelanA (MART-I)、gp 100 (Pmel 17)、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2)；和腫瘤特異性多譜系抗原(諸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5)；過度表現的胚抗原，諸如CEA；過度表現的致癌基因和突變的腫瘤抑制因子基因，例如p53、Ras、HER2/neu；染色體易位導致的獨特腫瘤抗原；諸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，諸如艾巴病毒抗原EBVA和人類乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基於蛋白質的大型抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-連環蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合蛋白\親環蛋白C相關蛋白、TAAL6、TAG72，TLP和TPS。 核酸
在一些具體例中，本文所述的經修飾抗原特異性免疫細胞包含一或多個編碼本文所述任一種外源性CD160蛋白及/或任一種功能性外源性受體的異源性核酸序列。
在一些具體例中，提供了經分離核酸，其包含編碼任一種本文所述外源性CD160蛋白的核酸序列。在一些具體例中，提供經分離核酸，其包含編碼任一種本文所述功能性外源性受體的核酸序列。在一些具體例中，核酸是DNA。在一些具體例中，核酸是mRNA。在一些具體例中，核酸是線性的。在一些具體例中，核酸是環狀的。
編碼外源性CD160蛋白的核酸序列及/或編碼功能性外源性受體的核酸可以可操作地連接至一或多個調節序列。控制編碼序列的轉錄及/或轉譯之例示性調節序列，在本技藝中係為已知的，並且可包括但不限於啟動子、正確起始、調節及/或終止轉錄的其他單元(例如聚A轉錄終止序列)、mRNA轉運(例如核定位信號序列)、加工(例如剪接信號)、穩定性(例如內含子和非編碼5'和3'序列)、轉譯(例如起始子Met、三方前導序列、IRES核醣體結合位點、信號肽等)，以及用於將插入序列引入病毒載體的插入位點。在一些具體例中，調節序列是啟動子，轉錄增強子及/或允許正確表現外源性CD160蛋白及/或功能性外源性受體的序列。
術語「調節序列」或「控制序列」是指一個DNA序，其影響其可操作連接之編碼序列的表現。這種調節序列的性質取決於宿主生物而不同。在原核生物中，調節序列通常包括啟動子、核醣體結合位點和終止子。在真核生物中，調節序列包括啟動子、終止子，以及在某些情況下包括增強子、反式活化因子或轉錄因子。
術語「可操作地連接」是指並列，其中所述組分處於允許它們以其預期方式發揮作用的關聯。調節序列以編碼序列在與調節序列相容的條件下表現的方式「可操作地連接」至編碼序列。
如本文所用，「啟動子」或「啟動子區」是指一段DNA或RNA，其控制其所可操作地連接的DNA或RNA的轉錄。啟動子區包括參與RNA聚合酶識別，結合和轉錄起始的特定序列。另外，啟動子包括調控RNA聚合酶的識別，結合和轉錄起始活性(即一或多種轉錄因子的結合)的序列。這些序列可以是順式作用或可以對反式作用因子發生反應。依據調節的性質，啟動子可以是組成型的或受調節型。受調節的啟動子可以是可誘導型或環境反應型(例如，對諸如pH、厭氧條件、滲透劑、溫度，光或細胞密度等提示有反應)。許多這樣的啟動子序列是技藝中熟知的。參見，例如美國專利第4,980,285號；第5,631,150號；第5,707,928號；第5,759,828號；第5,888,783號；第5,919,670號，以及Sambrook,et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)。
在一些具體例中，編碼外源性CD160蛋白的核酸序列可操作地連接至第一啟動子。在一些具體例中，編碼功能性外源性受體的核酸序列可操作地連接至第二啟動子。在一些具體例中，編碼外源性CD160蛋白的核酸序列和編碼功能性外源性受體的核酸序列可操作地連接至相同的啟動子。在一些具體例中，編碼外源性CD160蛋白的核酸序列和編碼功能性外源性受體的核酸序列可操作地連接至個別的啟動子。
在一些具體例中，啟動子是內源性啟動子。例如，可以使用技藝中已知的任何方法(諸如CRISPR/Cas9方法)，在內源性啟動子下游處將編碼外源性CD160蛋白及/或功能性外源性受體的核酸敲入經修飾抗原特異性免疫細胞的基因組。在一些具體例中，內源性啟動子是大量蛋白質(諸如β-肌動蛋白)的啟動子。在一些具體例中，內源性啟動子是可誘導型啟動子，例如可受到經修飾抗原特異性免疫細胞的內源性活化信號所誘導。在一些具體例中，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是T細胞，啟動子是T細胞活化依賴性啟動子(諸如IL-2啟動子、NFAT啟動子或NFkβ啟動子)。在一些具體例中，啟動子是異源性啟動子。
多種啟動子在哺乳動物細胞中的基因表現已被探討過，且技藝中已知的任一啟動子均能使用於本發明中。啟動子可被大致分為持續性啟動子(constitutive promoters)或受調節啟動子，諸如可誘導型啟動子。在一些具體例中，編碼外源性CD160蛋白及/或功能性外源性受體的異源性核酸序列可操作地連接至持續性啟動子。在一些具體例中，編碼外源性CD160蛋白及/或功能性外源性受體的異源性核酸序列可操作地連接至誘導型啟動子。在一些具體例中，持續性啟動子可操作地連接至編碼外源性CD160蛋白的核酸序列，而誘導型啟動子可操作地連接至編碼功能性外源性受體的核酸序列。在一些具體例中，持續性啟動子可操作地連接至編碼功能性外源性受體的核酸序列，而誘導型啟動子可操作地連接至編碼外源性CD160蛋白的核酸序列。在一些具體例中，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼外源性CD160蛋白的核酸序列，而第二誘導型啟動子可操作地連接至編碼功能性外源性受體的核酸序列。在一些具體例中，第一誘導型啟動子是受第一誘導條件所誘導，而第二誘導型啟動子是受第二誘導條件所誘導。在一些具體例中，第一誘導條件與第二誘導條件相同。在一些具體例中，第一誘導型啟動子和第二誘導型啟動子同時受到誘導。在一些具體例中，依序誘導第一誘導型啟動子和第二誘導型啟動子，例如，在第二誘導型啟動子之前誘導第一誘導型啟動子，或者在第二誘導型啟動子之後誘導第一誘導型啟動子。
持續性啟動子允許異源性基因(也被稱為轉基因)於宿主細胞中持續性地(constitutively)表現。本文考量的例示性持續性啟動子包括，但不限於細胞巨大病毒(CMV)啟動子、人類延長因子-1α (hEF1α)、泛素C啟動子(UbiC)、磷酸甘油激酶啟動子(PGK)、猿猴病毒40早期啟動子(SV40)，和雞β肌動蛋白啟動子加上CMV早期增強子(CAGG)。此等持續性啟動子對於驅動轉基因表現的效率已在大量研究中進行廣泛比較。在一些具體例中，啟動子是hEF1α啟動子。
在一些具體例中，啟動子是誘導型啟動子。誘導型啟動子屬於受調節啟動子的範疇。誘導型啟動子可以受一或多種條件所誘導，諸如物理條件、經修飾抗原特異性免疫細胞的微環境，或經修飾抗原特異性免疫細胞的生理狀態，誘導物(inducer)(即誘導劑(inducing agent))或其組合。在一些具體例中，誘導條件在經修飾抗原特異性免疫細胞中及/或在接受醫藥組成物的個體體內不誘導內源性基因的表現。在一些具體例中，誘導條件選自由以下組成之群組：誘導物、輻射(諸如電離輻射，光)、溫度(諸如熱)、氧化還原狀態，腫瘤環境和經修飾抗原特異性免疫細胞的活化狀態。
在一些具體例中，啟動子可受誘導物誘導。在一些具體例中，誘導物是小分子，諸如化合物。在一些具體例中，小分子是選自由以下組成之群組：去氧羥四環素、四環素、醇、金屬或類固醇。化學誘導型啟動子被最為廣泛地探討。這樣的啟動子包括其轉錄活性受小分子化學物質(諸例如去氧羥四環素、四環素、醇、類固醇，金屬和其他化合物)存在或不存在所調節的啟動子。具有反向四環素控制反式活化因子(rtTA)和四環素反應性單元啟動子(TRE)的去氧羥四環素誘導型系統是目前最成熟的已建立系統。WO9429442描述了藉由四環素反應性啟動子嚴格控制真核細胞中的基因表現。WO9601313揭示了四環素調節的轉錄調節子。另外，已在TetSystems.com的網站上描述過Tet技術(例如Tet-on系統)。在本申請案中，任何已知的化學調節型啟動子均可用於驅動治療性蛋白的表現。
在一些具體例中，誘導物是多肽，諸如生長因子，激素或細胞表面受體的配體，例如特異地結合至腫瘤抗原的多肽。在一些具體例中，多肽由經修飾抗原特異性免疫細胞表現。在一些具體例中，多肽由異源性核酸中的核酸編碼。許多多肽誘導物在本技藝中也是已知的，且它們可能適用於本發明。例如，蛻皮激素受體為基礎的基因開關、助孕素受體為基礎的基因開關，以及雌激素受體為基礎的基因開關屬於採用類固醇受體衍生的反式活化因子的基因開關(WO9637609和WO9738117等)。
在一些具體例中，誘導物包含小分子組分以及一或多種多肽。例如，仰賴多肽二聚化的誘導型啟動子是本技藝中熟知的，並且可能適用於本發明。在1993年開發出的第一個小分子CID系統使用FK1012 (藥物FK506的衍生物)來誘導FKBP的同二聚化。透過採用相似的策略，Wu等人藉由使用Rapalog/FKPB-FRB*和吉貝素/GID1-GAI二聚化依賴性基因開關，透過ON-切換方式成功使CAR-T細胞可滴定(C.-Y. Wuet al ., Science 350, aab4077 (2015))。其他仰賴二聚化開關系統的二聚化包括香豆黴素/GyrB-GyrB (Nature 383 (6596): 178-81)，和HaXS/Snap-tag-HaloTag (Chemistry and Biology 20 (4): 549-57)。
在一些具體例中，啟動子是光誘導型啟動子，並且誘導條件是光。用於在哺乳動物細胞中調節基因表現的光誘導型啟動子在本技藝中也是周知的(參見， 例如Science 332, 1565-1568 (2011)；Nat. Methods 9, 266-269 (2012)；Nature 500: 472-476 (2013)；Nature Neuroscience 18:1202-1212 (2015))。這樣的基因調節系統可以基於其調節下列而粗略分為兩類：(1) DNA結合或(2)招募轉錄活化結構域至DNA結合蛋白。例如，在哺乳動物細胞中基於視黑素開發並測試了合成哺乳動物藍光控制轉錄系統，其對藍光(480 nm)有反應，觸發細胞內的鈣增加，導致鈣調神經磷酸酶(calcineurin)媒介的NFAT移動。最近，Motta-Mena等人描述 一種從天然EL222轉錄因子發展而來的新式誘導型基因表現系統，其在人類細胞株以及斑馬魚胚胎中賦予高水平，藍光敏感性的轉錄起始控制(Nat. Chem. Biol. 10(3):196-202 (2014))。另外，針對紅光觸發的基因表現調節來探究紅光誘發阿拉伯芥的光受器植物色素B (PhyB)和植物色素交互作用因子6 (PIF6)的交互作用。此外，還開發了紫外線B (UVB)誘導型基因表現系統，並經證明可有效地在哺乳動物細胞中進行目標基因轉錄(Chapter 25 of Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Fourth Edition CRC Press, Jan. 20th ,2015)。本文所述的任一種光誘導型啟動子均可用於在本發明中驅動治療性蛋白的表現。
在一些具體例中，啟動子是受光誘導型分子和光的組合所誘導的光誘導型啟動子。例如，化學誘導物上的可光裂解光籠基團使誘導物保持不活化，除非是透過輻射或其他方式移除光籠基團。這樣的光誘導分子包括小分子化合物，寡核苷酸和蛋白質。例如，已開發了籠狀蛻皮激素、與lac操縱子一起使用的籠狀IPTG、用於核糖核酸酵素媒介基因表現的籠狀豐加黴素(toyocamycin)、與Tet-on系統一起使用的籠狀去氧羥四環素，以及用於光媒介FKBP/FRB二聚化的籠狀Rapalog (參見例如Curr Opin Chem Biol. 16(3-4): 292-299 (2012))。
在一些具體例中，啟動子是輻射誘導型啟動子，並且誘導條件是輻射，諸如電離輻射。輻射誘導型啟動子在本技藝中也是已知用來控制轉基因表現。基因表現的改變在細胞輻射時發生。例如，一組稱為「立即早期基因」的基因可以在電離輻射後迅速反應。例示性立即早期基因包括，但不限於Erg-1、p21/WAF-1、GADD45α、t-PA、c-Fos、c-Jun、NF-κB和AP1。立即早期基因在其啟動子區域中包含輻射反應性序列。已在ERG-1啟動子中發現到共有序列CC(A/T)6 GG (SEQ ID NO：7)，並且被稱為血清反應單元或稱為CArG單元。已深入研究輻射誘導型啟動子和轉基因的組合，並證明有效帶有治療益處。參見例如，Cancer Biol Ther. 6(7):1005-12 (2007)以及Chapter 25 of Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Fourth Edition CRC Press, Jan. 20th , 2015。
在一些具體例中，啟動子是熱誘導型啟動子，並且誘導條件是熱。在本技藝中也已廣泛研究熱誘導型啟動子驅動轉基因表現。熱休克或壓力蛋白(HSP)(包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10等)在熱或其他物理和化學壓力下保護細胞方面發揮重要作用。在臨床前研究中已嘗試過數種熱誘導型啟動子，包括熱休克蛋白(HSP)啟動子，以及生長停滯和DNA損傷(GADD) 153啟動子。首次於1985年描述的人類hsp70B 基因啟動子似乎是最有效率的熱誘導型啟動子之一。Huang等人報導，在引入hsp70B-EGFP ，hsp70B-TNFα 和hsp70B-IL12 編碼序列後，腫瘤細胞於熱處理後表現極高的轉基因表現，而在沒有熱處理的情況下，未偵測到轉基因表現。而在活體內，於IL-12轉基因加上小鼠熱處理組中，腫瘤生長顯著延遲(Cancer Res. 60:3435 (2000))。另一群科學家將HSV-tk 自殺基因與hsp70B啟動子連接起來，並在帶有小鼠乳癌的裸鼠體內測試了該系統。與未經熱處理對照相比，腫瘤已被投予hsp70B -HSVtk 編碼序列並經熱處理的小鼠顯示出腫瘤消退和顯著生存能力(Hum. Gene Ther. 11:2453 (2000))。本技藝中已知的其他熱誘導型啟動子可以在例如Chapter 25 of Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Fourth Edition CRC Press, Jan. 20th , 2015中找到。本文探討的任一種熱誘導型啟動子均可用於驅動本發明的治療性蛋白表現。
在一些具體例中，啟動子可受到氧化還原狀態所誘導。可受到氧化還原狀態誘導的例示性啟動子，包括誘導型啟動子和缺氧誘導型啟動子。例如，Post DE等人開發出缺氧誘導型因子(HIF)反應性啟動子，其在HIF活化腫瘤細胞中特異地並強烈地誘導轉基因表現(Gene Ther. 8: 1801-1807 (2001)；Cancer Res. 67: 6872-6881 (2007))。
在一些具體例中，啟動子可受到經修飾抗原特異性免疫細胞的生理狀態(諸如內源性活化信號)所誘導。在一些具體例中，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是T細胞，啟動子是T細胞活化依賴性啟動子，該啟動子可受到經修飾T細胞的內源性活化信號所誘導。在一些具體例中，經修飾T細胞受到誘導物(諸如佛波醇乙酸肉荳蔻酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)，離子黴素或植物性凝血球素)所活化。在一些具體例中，經修飾T細胞受到經由功能性外源性受體(諸如CAR或TCR)識別腫瘤細胞上的腫瘤抗原而被活化。在一些具體例中，T細胞活化依賴性啟動子是IL-2啟動子。在一些具體例中，T細胞活化依賴性啟動子是NFAT啟動子。在一些具體例中，T細胞活化依賴性啟動子是NFκB啟動子。
本文所述之異源性核酸序列可以存在於異源性基因表現匣中，該表現匣包含一或多個蛋白質編碼序列以及視情況一或多個啟動子。在一些具體例中，異源性基因表現盒包含單一個蛋白質編碼序列。在一些具體例中，異源性基因表現匣包含受到單一個啟動子(即多順反子)所驅動的兩個或更多個蛋白質編碼序列。在一些具體例中，異源性基因表現匣進一步包含一或多個調節序列(諸如5'UTR、3'UTR、增強子序列、IRES、轉錄終止序列等)、重組位點、一或多個篩選標記(諸如抗生素抗性基因，報導基因等)，信號序列或其組合。
在一些具體例中，提供一種載體，其包含編碼本文所述外源性CD160蛋白及/或功能性外源性受體之核酸中任一者。在一些具體例中，提供一種載體，其包含編碼本文所述外源性CD160蛋白中任一者的第一核酸序列和編碼本文所述功能性外源性受體中任一者的第二核酸序列。在一些具體例中，提供包含第一載體的組成物，該第一載體包含編碼本文所述外源性CD160蛋白中任一者的第一核酸序列；以及第二載體，該第二載體包含編碼本文所述功能性外源性受體中任一者的第二核酸序列。
「載體」是包含經分離核酸並且可以用於將經分離核酸遞送至細胞內部的物質組成物。許多載體是本技藝中已知的，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物締合的多核苷酸，質體和病毒。通常，合適的載體含有在至少一種生物中具功能的複製源點、啟動子序列，方便的限制性核酸內切酶位點和一或多個篩選標記。術語「載體」也應被解釋為包括有助於核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物，脂質體以及類似物。
在一些具體例中，載體是病毒載體。病毒載體的實例包括，但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、牛痘載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物。病毒載體技術是本技藝中周知的，並且例如描述於Sambrooket al . (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)以及其他病毒學與分子生物學手冊中。
已經開發出許多基於病毒的系統以供用於將基因轉移到哺乳動物細胞中。例如，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供了一個便利的平台。可以使用本技藝中已知的技術將異源性核酸插入載體並包裝在逆轉錄病毒顆粒中。然後可以分離重組病毒，並在活體外或離體將其遞送至經修飾抗原特異性免疫細胞。許多逆轉錄病毒系統是本技藝中已知的。在一些具體例中，使用腺病毒載體。在一些具體例中，使用慢病毒載體。在一些具體例中，使用自身不活化的慢病毒載體。例如，可以用本技藝中已知的方案包裝自身不活化的慢病毒載體。使用本技藝中已知的方法，所得的慢病毒載體可用於轉導哺乳動物細胞(諸如人類T細胞)。
在一些具體例中，載體是非病毒載體，諸如質體或游離型表現載體。
在一些具體例中，載體是表現載體。「表現載體」是可用於轉形所選宿主並提供編碼序列在所選宿主中表現的構建體。表現載體可以例如是選殖載體，二元載體或整合載體。表現包含較佳地將核酸分子轉錄成可轉譯的mRNA。確保在真核細胞中表現的調節單元是習於技藝者眾所周知的。在真核細胞的情況下，它們通常包含確保轉錄起始的啟動子和視情況確保轉錄終止和轉錄本穩定的聚A信號。允許在真核宿主細胞中表現的調節單元實例是酵母中的AOX1或GAL1啟動子，或哺乳動物和其他動物細胞中的CMV-、SV40-、RSV-啟動子(勞斯肉瘤病毒)、CMV-增強子，SV40-增強子或球蛋白內含子。此外，取決於所使用的表現系統，可以將能夠把多肽引導至細胞區室或將其分泌至培養基中的前導序列添加至所述核酸序列的編碼序列，並且是本技藝中周知的。前導序列在適當的階段與轉譯，起始和終止序列組裝在一起，且較佳地，前導序列能夠將已轉譯的蛋白質或其部分引導分泌到周質空間或細胞外介質中。視情況，核酸序列可以編碼融合蛋白，該融合蛋白包括賦予期望特徵的N端鑑別肽，例如所表現重組產物的穩定或簡化。合適的表現載體是本技藝已知的，諸如Okayama-Berg cDNA表現載體pcDV1 (Pharmacia)、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3 (Invitrogen)、pEF-DHFR和pEF-ADA，(Raum et al., Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150)或pSPORT1 (GIBCO BRL)。 製備包含外源性CD160之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法
本申請案還提供產生本文所述之經修飾抗原特異性免疫細胞中任一者的方法。
在某些態樣中，提供一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含：使前體抗原特異性免疫細胞與該外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調。在一些具體例中，該方法包含使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白接觸。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含結合至免疫細胞表面分子的免疫細胞結合部分。在一些具體例中，該方法包含將編碼外源性CD160蛋白的核酸導入前體抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，核酸是mRNA。在一些具體例中，核酸是DNA。核酸可使用本技藝中已知的任何轉染或轉導方法(包括病毒或非病毒方法)被引入該經修飾抗原特異性免疫細胞。例示性非病毒轉染方法包括，但不限於基於化學的轉染，諸如使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物、脂質體或陽離子聚合物(例如，DEAE-葡聚醣或聚乙烯亞胺)；非化學方法，諸如電穿孔、細胞擠壓、音波穿孔、光學轉染、刺穿轉染、原生質體融合、流體動力遞送或轉座子；基於粒子的方法，諸如使用基因槍、磁轉染或磁體輔助轉染、粒子轟擊；以及雜交方法，諸如核轉染。在一些具體例中，核酸透過轉染被導入前體抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，核酸透過轉導或電穿孔被導入前體抗原特異性免疫細胞。
在一些具體例中，提供一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含：使前體抗原特異性免疫細胞與該外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或者其與SEQ ID NO：1至4具有至少約80%同一性的變異體。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4具有至少約90%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4具有至少約95%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性中任一者的胺基酸序列。在一些具體例中，細胞表面上的外源性CD160蛋白呈多聚體形式(諸如但不限於二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由細胞毒性αβT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞、經APC活化的抗腫瘤T細胞，和自然殺手T細胞(NK-T細胞)所組成之群組。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經APC活化的抗腫瘤T細胞是經DC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是從個體的腫瘤分離而來。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是經修飾的T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，經改造的T細胞受體(TCR)識別腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在進一步的具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是對同一表位具有特異性的複數個免疫細胞。非限制性實例包括複數個各自含有相同功能性外源性受體(諸如CAR)的T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是複數個免疫細胞，其各自對不同表位(諸如部分重疊或完全不同的表位)具有特異性。非限制性實例包括複數個多株免疫細胞，諸如多株型TIL。
在一些具體例中，係提供一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含：使前體抗原特異性免疫細胞與該外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，且其中外源性CD160蛋白是膜結合的。
在一些具體例中，係提供一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含：使前體抗原特異性免疫細胞與該外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白的核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中外源性CD160蛋白經由糖磷脂醯肌醇(GPI)連接子結合至膜。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含GPI錨定肽序列。
在一些具體例中，係提供一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含：使前體抗原特異性免疫細胞與該外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白的核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中外源性CD160蛋白包含跨膜結構域。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T細胞受體(TCR) α次單位、TCRβ次單位或TCRζ次單位。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD1。
在一些具體例中，提供一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含：使前體抗原特異性免疫細胞與該外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中外源性CD160蛋白包含跨膜結構域和細胞內結構域。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T細胞受體(TCR) α次單位、TCRβ次單位或TCRζ次單位。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1。在一些具體例中，細胞內結構域衍生自CD160剪接變異體。在一些具體例中，細胞內結構域包含衍生自TCR複合體之信號傳導次單位的細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，TCR複合體的信號傳導次單位選自由以下組成之群組：CD3γ、CD3δ和CD3ε。在一些具體例中，細胞內結構域包含一或多個衍生自T細胞刺激性分子的信號傳導結構域。在一些具體例中，信號傳導結構域是4-1BB、OX40、CD27、CD28、CD80或CD258中的一或多者。在一些具體例中，細胞內結構域包含選自由OX40、CD27，CD28、CD80和CD258所組成之群組的兩個信號傳導結構域的組合。
在一些具體例中，提供一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含：使前體抗原特異性免疫細胞與該外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，其中CD160蛋白包含跨膜結構域和細胞內結構域，且其中細胞內結構域包含一或多個共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個共刺激信號傳導結構域中之任一者。在一些具體例中，細胞內結構域含有不超過1、2、3、4或5個共刺激信號傳導結構域中之任一者。在一些具體例中，細胞內結構域不包含CD3ζ信號傳導結構域或4-1BB和CD3ζ結構域的組合。在一些具體例中，共刺激信號傳導結構域衍生自選自由以下所組成之群組的共刺激性分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、CD80、CD258、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配體及其組合。在一些具體例中，細胞內結構域包含CD28共刺激結構域、4-1BB共刺激結構域或兩者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、CD28共刺激結構域和4-1BB共刺激結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域和CD28共刺激結構域。在一些具體例中，CD28共刺激結構域與跨膜結構域相鄰。在一些具體例中，CD28共刺激結構域鄰接跨膜結構域的C端。在一些具體例中，細胞內結構域包含初級訊號傳導結構域。在一些具體例中，初級訊號傳導結構域包含CD3ζ結構域。在其他具體例中，細胞內結構域不包含初級訊號傳導結構域。在其他具體例中，細胞內結構域不包含CD3ζ結構域或4-1BB和CD3ζ結構域的組合。
在一些具體例中，提供一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含：使前體抗原特異性免疫細胞與該外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白的核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中外源性CD160蛋白經由免疫細胞結合部分結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，免疫細胞結合部分係結合至免疫細胞的表面分子。在一些具體例中，免疫細胞結合部分包含識別T細胞表面分子的抗體。在一些具體例中，抗體可以是全長抗體或抗體片段，諸如scFv、Fv、Fab、(Fab')2 、單域抗體(sdAb)或VH H結構域。非限制性實例包括識別TCR及/或活化TCR信號傳導的抗CD3ε抗體。在一些具體例中，免疫細胞結合部分包含結合同源T細胞表面受體的配體。非限制性實例包括識別TCR和IL-2的腫瘤特異性肽MHC複合體。
在依據本文所述方法中任一者的一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4具有至少約80%同一性的變異體。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4具有至少約90%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4具有至少約95%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性中任一者的胺基酸序列。在一些具體例中，細胞表面上的外源性CD160蛋白呈多聚體形式(諸如但不限於二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由細胞毒性αβT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞、經APC活化的抗腫瘤T細胞和自然殺手T細胞(NK-T細胞)所組成之群組。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經APC活化的抗腫瘤T細胞是經DC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是從個體的腫瘤中分離而來。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是經修飾的T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，經改造的T細胞受體(TCR)識別腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在進一步的具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是對同一表位具有特異性的複數個免疫細胞。非限制性實例包括複數個各自含有相同功能性外源性受體(諸如CAR)的T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是複數個免疫細胞，其各自對不同表位(諸如部分重疊或完全不同的表位)具有特異性。非限制性實例包括複數個多株免疫細胞，諸如多株型TIL。
在依據本文所述任一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法的一些具體例中，該前體抗原特異性免疫細胞進一步包含編碼功能性外源性受體的第二核酸。在一些具體例中，該方法進一步包含使前體抗原特異性免疫細胞與編碼功能性外源性受體的第二核酸接觸。在一些具體例中，功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，功能性外源性受體是經修飾的T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，經改造的T細胞受體(TCR)識別腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在進一步的具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸可操作地連接至相同的啟動子。在一些具體例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地連接至個別的啟動子。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸在同一個載體上。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸在個別的載體上。在一些具體例中，載體是病毒載體。在一些具體例中，病毒載體選自由腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物所組成之群組。在一些具體例中，載體是非病毒載體。在一些具體例中，載體是游離型表現載體。在一些具體例中，該方法進一步包含分離或富集包含第一核酸及/或第二核酸的免疫細胞。在一些具體例中，該方法進一步包含利用至少一種醫藥上可接受的載劑來調配經修飾抗原特異性免疫細胞。
在一些具體例中，係提供一種藉由本文所述方法中任一者所獲得的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，提供一種醫藥組成物，其包含本文所述之經修飾抗原特異性免疫細胞中任一者以及醫藥上可接受的載劑。
在一些具體例中，係提供一種包含本文所述核酸或載體中任一者的經分離宿主細胞。該宿主細胞可用於表現或選殖外源性CD160蛋白及/或功能性外源性受體、編碼外源性CD160蛋白及/或功能性外源性受體的核酸或載體。合適的宿主細胞可包括，但不限於原核細胞、真菌細胞，酵母細胞或更高等的真核細胞，諸如哺乳動物細胞。在一些具體例中，宿主細胞包含編碼第一多肽的第一載體和編碼第二多肽的第二載體。在一些具體例中，宿主細胞包含單一個載體，其包含編碼第一多肽和第二多肽的經分離核酸。在一些具體例中，第一多肽是外源性CD160蛋白。在一些具體例中，第二多肽是功能性外源性受體。
前體抗原特異性免疫細胞可以使用各種本技藝中已知的方法來製備。例如，可以從許多來源獲得初代免疫細胞(諸如T細胞)，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位的組織、腹水、胸膜滲液、脾臟組織和腫瘤。在一些具體例中，可以使用本技藝中已知的任何一些技術(諸如FICOLLTM 分離)，從個體收集的單位血液中獲得免疫細胞(諸如T細胞)。在一些具體例中，來自個體的循環血液的細胞是透過血球分離術獲得。血球分離術產品通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、顆粒球、B細胞、其他有核白血球，紅血球細胞和血小板。在一些具體例中，透過血球分離術收集的細胞可以經過洗滌以除去血漿部分，並將細胞放置於適當緩衝液或介質中用於隨後的處理步驟。在一些具體例中，用磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)，或無二價陽離子(諸如鈣和鎂)的洗滌溶液來洗滌細胞。如習於技藝者容易理解的，洗滌步驟可以透過習於技藝者熟知的方法來完成，諸如按照製造商的說明書透過使用半自動「流通式」離心(例如Cobe 2991細胞處理器，Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗滌後，可將細胞重新懸浮於各式各樣的生物相容性緩衝液中，例如無Ca2+ 、無Mg2+ PBS，PlasmaLyte A或其他含或不含緩衝劑的食鹽水溶液。或者，可以去除血球分離術樣品的不想要的組分，並將細胞直接重新懸浮在培養基中。
在一些具體例中，初代T細胞是從周邊血液淋巴細胞藉由裂解紅血球和移除(depleting)單核細胞，例如藉由透過PERCOLL™梯度離心或藉由逆流離心淘析。可以藉由陽性或陰性篩選技術進一步分離T細胞的特定亞群，諸如CD3+ 、CD28+ 、CD4+ 、CD8+ ，CD45RA和CD45RO細胞。例如，在一個具體例中，T細胞是藉由與抗CD3/抗CD28 (即3x28)接合珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育一段時間而加以分離，該段時間對於陽性篩選所需T細胞來說足夠的。
在一些具體例中，可以使用針對陰性篩選細胞獨有的表面標記的抗體組合，藉由陰性篩選來進一步富集T細胞群。例如，一種方法涉及經由負向磁性免疫吸附或流式細胞術進行細胞分選及/或篩選，該方法使用針對存在於負向篩選之細胞上的細胞表面標記的單株抗體混合物。例如，為了藉由負向篩選來富集CD4+ 細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16，HLA-DR和CD8的抗體。在某些具體例中，可能需要富集或正向篩選通常表現CD4+ 、CD25+ 、CD62L高 ，GITR+ 和FoxP3+ 的調節T細胞。或者，在某些具體例中，調節T細胞是藉由抗C25綴合珠粒或其它類似的篩選方法來耗盡。
將載體或核酸引入宿主細胞(諸如前體抗原特異性免疫細胞)的方法是本技藝中已知的。可以藉由物理、化學或生物學方法將載體或核酸轉移到宿主細胞中。
用於將載體或核酸引入宿主細胞中的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔以及類似方法。產生包含載體及/或外源性核酸的細胞的方法是本技藝中周知的。參見，例如Sambrooket al . (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。在一些具體例中，係藉由電穿孔將載體引入細胞。
用於將載體或核酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體已經成為將基因插入哺乳動物(例如人類細胞)中的最廣泛使用的方法。
用於將載體或核酸引入宿主細胞的化學方法包括膠體分散系統，諸如大分子複合體、奈米膠囊、微球、珠粒；以及基於脂質的系統，包括水包油乳液、微胞、混合型微胞和脂質體。用作活體外遞送載體的例示性膠體系統是脂質體(例如人工膜囊泡)。
在一些具體例中，在引入異源性核酸之後，離體增殖經轉導或經轉染的前體抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，培養經轉導或經轉染的前體抗原特異性免疫細胞以增殖歷時至少約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中任一者。在一些具體例中，培養經轉導或經轉染的前體抗原特異性免疫細胞歷時不超過約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中任一者。在一些具體例中，進一步評估或篩選經轉導或經轉染的前體抗原特異性免疫細胞以選出經修飾抗原特異性免疫細胞。
報導基因可用來鑑定可能經轉染的細胞並且評估調節序列的功能性。通常，報導基因是在受體生物體或組織中不存在或不表現的基因，並且編碼透過一些易於檢測的性質(例如酶活性)來證明其表現的多肽。在將DNA引入受體細胞中後的一段適當時間分析報導基因的表現。合適的報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶的基因，或綠色螢光蛋白基因 (例如Ui-Teiet al . FEBS Letters 479: 79-82 (2000))。
在前體抗原特異性免疫細胞中確認異源性核酸存在的其他方法包括，例如那些習於技藝者周知的分子生物學分析，諸如南方和北方墨點，RT-PCR與PCR；生物化學分析，諸如偵測特定肽存在或不存在，例如藉由免疫學方法(諸如ELISA和西方墨點)。
在一些具體例中，提供一種本文所述表現一或多種外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，提供一種過度表現CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，CD160蛋白是內源性蛋白。在一些具體例中，CD160蛋白是外源性蛋白。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞展現出增生增加及/或生存能力增加。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍或更多中任一者。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或更高中任一者。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍，500倍至1000倍或1000倍至10000倍中任一者。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%或90%至100%中任一者。
在一些態樣中，係提供一種增加抗原特異性免疫細胞之產量及/或生存能力的方法，其包含將編碼外源性CD160蛋白的核酸引入免疫細胞。在一些具體例中，相較於不表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍或更多中任一者。在一些具體例中，相較於不表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或更高中任一者。在一些具體例中，相較於不表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍，500倍至1000倍或1000倍至10000倍中任一者。在一些具體例中，相較於不表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%或90%至100%中任一者。在一些具體例中，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的產量增加是因為經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的增生速率增加所致。
在一些態樣中，提供一種增加抗原特異性免疫細胞之產量及/或生存能力的方法，其包含在免疫細胞中使CD160蛋白過度表現。在一些具體例中，CD160蛋白是內源性蛋白。在一些具體例中，CD160蛋白是外源性蛋白。在一些具體例中，相較於未過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍或更多中任一者。在一些具體例中，相較於不過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或更高中任一者。在一些具體例中，相較於不過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍、或1000倍至10000倍中任一者。在一些具體例中，相較於未過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力增加至少約10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、或80%至90%、或90%至100%中任一者。在一些具體例中，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的產量增加是因為經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的增生速率增加所致。
在一些具體例中，係提供一種製造治療性抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含用於增加依據本文所述任一種方法選出的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力的方法。在一些具體例中，治療性抗原特異性免疫細胞包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。在一些具體例中，治療性抗原特異性免疫細胞包含功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)。也提供依據本文所述任一種方法製造的治療性抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，提供CD160過度表現以增加治療性TIL、TCR-T細胞，及/或CAR-T細胞產生的產量及/或生存能力的用途。在一些具體例中，提供外源性CD160表現以增加治療性TIL、TCR-T，及/或CAR-T細胞產生的產量及/或生存能力的用途。
在一些具體例中，係提供一種本文所述表現一或多種外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，係提供過度表現CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，CD160蛋白是內源性蛋白。在一些具體例中，CD160蛋白是外源性蛋白。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞展現出活體外及/或活體內細胞裂解活性增加。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、或10000倍或更多中任一者。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或更高中任一者。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍、或1000倍至10000倍中任一者。在一些具體例中，相較於未經CD160修飾的抗原特異性免疫細胞，經CD160修飾抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%、或90%至100%中任一者。
在一些具體例中，提供一種增加抗原特異性免疫細胞之活體外及/或活體內細胞裂解活性的方法，其包含將編碼外源性CD160蛋白的核酸導入免疫細胞。在一些具體例中，相較於未表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、或10000倍或更多中任一者。在一些具體例中，相較於未表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或更高中任一者。在一些具體例中，相較於未表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍、或1000倍至10000倍中任一者。在一些具體例中，相較於未表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、或80%至90%、或90%至100%中任一者。
在一些態樣中，係提供一種增加抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性的方法，其包含在免疫細胞中使CD160蛋白過度表現。在一些具體例中，CD160蛋白是內源性蛋白。在一些具體例中，CD160蛋白是外源性蛋白。在一些具體例中，相較於不過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍或更多中任一者。在一些具體例中，相較於不過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或更高中任一者。在一些具體例中，相較於不過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少約1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍、或1000倍至10000倍中任一者。在一些具體例中，相較於不過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性增加至少10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%、或90%至100%中任一者。在一些具體例中，提供一種製造治療性抗原特異性免疫細胞的方法，其包含用於增加依據本文所述任一種方法選出的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性的方法。在一些具體例中，治療性抗原特異性免疫細胞包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。在一些具體例中，治療性抗原特異性免疫細胞包含功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)。也提供依據本文所述任一種方法製造的治療性抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，提供CD160過度表現以增加治療性抗原特異性T細胞(包括，但不限於TIL、TCR-T細胞，及/或CAR-T細胞)在活體外及/或活體內的細胞裂解活性的用途。在一些具體例中，提供外源性CD160表現以增加治療性抗原特異性T細胞(包括但不限於TIL、TCR-T細胞，及/或CAR-T細胞)在活體外及/或活體內的細胞裂解活性的用途。 III.  使用外源性CD160蛋白或表現外源性CD160蛋白外源性之經修飾抗原特異性免疫細胞的治療方法
本申請案的一個態樣是有關治療個體中疾病的方法，其包含向個體投予有效量之本文所述任一種經修飾抗原特異性免疫細胞或本文所述任一種醫藥組成物。本申請案考量到經修飾抗原特異性免疫細胞，其可以單獨投予或與另一種療法以任何組合投予，並且在至少一些態樣中與醫藥上可接受的載劑或賦形劑一起投予。在一些具體例中，在投予之前，可以將經修飾抗原特異性免疫細胞與本技藝中周知的合適醫藥載劑和賦形劑組合。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞係衍生自該個體。
本申請案的另一個態樣係有關治療個體中疾病的方法，其包含向該個體投予有效量的外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的核酸，其中該外源性CD160蛋白包含在個體體內識別免疫細胞上之表面分子的結合部分。
因此，在一些具體例中，係提供一種在個體(例如人類)體內治療疾病(例如癌症)的方法，其包含向該個體投予有效量的經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞(例如在其表面上)包含外源性CD160蛋白，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調。在一些具體例中，係提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向該個體投予有效量之(例如在其表面上)包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞是藉由包含以下的方法來製造：使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白的第一核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞，當相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外​​源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞衍生自該個體。在一些具體例中，提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向該個體投予有效量的醫藥組成物，該醫藥組成物包含(a)包含(例如在其表面上)外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調；以及(b)醫藥上可接受的載劑。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞衍生自該個體。在依據本文所述任一種治療方法的一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4具有至少約80%同一性的變異體。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4具有至少約90%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性中任一者的胺基酸序列。在一些具體例中，細胞表面上的外源性CD160蛋白呈多聚體形式(諸如但不限於二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由細胞毒性αβT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞、經APC活化的抗腫瘤T細胞，和自然殺手T細胞(NK-T細胞)所組成之群組。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經APC活化的抗腫瘤T細胞是經DC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是從個體的腫瘤分離而來。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是經修飾的T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，經改造的T細胞受體(TCR)識別腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在進一步的具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是對同一表位具有特異性的複數個免疫細胞。非限制性實例包括複數個各自含有相同功能性外源性受體(諸如CAR)的T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是複數個免疫細胞，其各自對不同表位(諸如部分重疊或完全不同的表位)具有特異性。非限制性實例包括複數個多株免疫細胞，諸如多株型TIL。
在一些具體例中，提供一種治療個體中疾病的方法，該方法包含向該個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，且其中外源性CD160蛋白是膜結合的。在一些具體例中，提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向該個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞是藉由包含以下的方法所產生：使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白的第一核酸接觸，從而產生該經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的。
在一些具體例中，係提供一種治療個體中疾病的方法，該方法包含向該個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中外源性CD160蛋白經由GPI連接子結合至膜。在一些具體例中，係提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞是藉由包含以下的方法所產生：使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白之第一核酸接觸，從而產生該經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該經修飾抗原特異性免疫細胞衍生自該個體，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中外源性CD160蛋白經由GPI連接子結合至膜。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含GPI錨定肽序列。
在一些具體例中，係提供一種治療個體中疾病的方法，該方法包含向該個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白包含跨膜結構域。在一些具體例中，提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞是藉由包含以下的方法所產生：使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白之第一核酸接觸，從而產生該經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白包含跨膜結構域。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T細胞受體(TCR) α次單位、TCRβ次單位或TCRζ次單位。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1。
在一些具體例中，係提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白包含跨膜結構域及細胞內結構域。在一些具體例中，提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向該個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞是藉由包含以下的方法所產生：使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白之第一核酸接觸，從而產生該經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中經修飾抗原特異性免疫細胞衍生自該個體，其中外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白包含跨膜結構域及細胞內結構域。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T細胞受體(TCR) α次單位、TCRβ次單位或TCRζ次單位。在一些具體例中，跨膜結構域衍生自選自由以下所組成之群組的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1。在一些具體例中，細胞內結構域衍生自CD160剪接變異體。在一些具體例中，細胞內結構域包含衍生自TCR複合體的信號傳導次單位的細胞內信號傳導結構域。在一些具體例中，TCR複合體的信號傳導次單位選自由以下組成之群組：CD3γ、CD3δ和CD3ε。在一些具體例中，細胞內結構域包含一或多個衍生自T細胞刺激性分子的信號傳導結構域。在一些具體例中，信號傳導結構域是4-1BB、OX40、CD27、CD28、CD80或CD258中的一或多者。在一些具體例中，細胞內結構域包含選自由OX40、CD27、CD28、CD80和CD258所組成之群組的兩個信號傳導結構域的組合。
在一些具體例中，係提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白包含跨膜結構域和細胞內結構域，且其中細胞內結構域包含一或多個共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞是藉由包含以下的方法所產生：使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白之第一核酸接觸，從而產生該經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該外源性CD160蛋白是膜結合的，其中該外源性CD160蛋白包含跨膜結構域和細胞內結構域，且其中細胞內結構域包含一或多個共刺激信號傳導結構域。在一些具體例中，細胞內結構域包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個共刺激信號傳導結構域中任一者。在一些具體例中，細胞內結構域包含不超過1、2、3、4或5個共刺激信號傳導結構域中任一者。在一些具體例中，細胞內結構域不包含CD3ζ信號傳導結構域或4-1BB和CD3ζ結構域的組合。在一些具體例中，共刺激信號傳導結構域衍生自選自由以下所組成之群組的共刺激性分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、CD80、CD258、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配體及其組合。在一些具體例中，細胞內結構域包含CD28共刺激結構域，4-1BB共刺激結構域或兩者。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、CD28共刺激結構域和4-1BB共刺激結構域。在一些具體例中，外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域和CD28共刺激結構域。在一些具體例中，CD28共刺激結構域與跨膜結構域相鄰。在一些具體例中，CD28共刺激結構域鄰接跨膜結構域的C端。在一些具體例中，細胞內結構域包含初級訊號傳導結構域。在一些具體例中，初級訊號傳導結構域包含CD3ζ結構域。在其他具體例中，細胞內結構域不包含初級訊號傳導結構域。在其他具體例中，細胞內結構域不包含CD3ζ結構域或4-1BB和CD3ζ結構域的組合。
在一些具體例中，係提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中外源性CD160蛋白經由免疫細胞結合部分結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，係提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向個體投予有效量之在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞是藉由包含以下的方法所產生：使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白之第一核酸接觸，從而產生該經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中該外源性CD160蛋白是膜結合的，且其中該外源性CD160蛋白經由免疫細胞結合部分結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，免疫細胞結合部分結合至免疫細胞的表面分子。在一些具體例中，免疫細胞結合部分包含識別T細胞表面分子的抗體。在一些具體例中，抗體可以是全長抗體或抗體片段，諸如scFv、Fv、Fab、(Fab')2 、單域抗體(sdAb)或VH H結構域。非限制性實例包括抗CD3ε抗體，其識別TCR及/或活化TCR信號傳導。在一些具體例中，免疫細胞結合部分包含結合同源T細胞表面受體的配體。非限制性實例包括識別TCR和IL-2的腫瘤特異性肽MHC複合體。
在依據本文所述治療方法中任一者的一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約80%同一性的變異體。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性中任一者的胺基酸序列。在一些具體例中，細胞表面上的外源性CD160蛋白呈多聚體形式(諸如但不限於二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自細胞毒性αβT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞、經APC活化的抗腫瘤T細胞，和自然殺手T細胞(NK-T細胞)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經APC活化的抗腫瘤T細胞是經DC活化的抗腫瘤T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是從個體的腫瘤分離而來。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是單株的。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞來自多株群體。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體。在一些具體例中，功能性外源性受體是經修飾的T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，經改造的T細胞受體(TCR)識別腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在進一步的具體例中，功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是對同一表位具有特異性的複數個免疫細胞。非限制性實例包括複數個各自含有相同功能性外源性受體(諸如CAR)的T細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是複數個免疫細胞，其各自對不同表位(諸如部分重疊或完全不同的表位)具有特異性。非限制性實例包括複數個多株免疫細胞，諸如多株型TIL。
在依據本文所述治療方法中任一者的一些具體例中，製造經修飾抗原特異性免疫細胞的方法係包含使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白接觸。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含結合至免疫細胞表面分子的免疫細胞結合部分。在一些具體例中，該方法包含將編碼外源性CD160蛋白的核酸導入前體抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，核酸是mRNA。在一些具體例中，核酸是DNA。核酸可使用本技藝中已知的任何轉染或轉導方法(包括病毒或非病毒方法)被引入該經修飾抗原特異性免疫細胞。例示性非病毒轉染方法包括，但不限於基於化學的轉染，諸如使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物、脂質體或陽離子聚合物(例如，DEAE-葡聚醣或聚乙烯亞胺)；非化學方法，諸如電穿孔、細胞擠壓、音波穿孔、光學轉染、刺穿轉染、原生質體融合、流體動力傳遞或轉座子；基於粒子的方法，諸如使用基因槍、磁轉染或磁體輔助轉染、粒子轟擊；以及雜交方法，諸如核轉染。在一些具體例中，核酸透過轉染被導入前體抗原特異性免疫細胞中。在一些具體例中，核酸透過轉導或電穿孔被導入前體抗原特異性免疫細胞中。在一些具體例中，外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約80%同一性的變異體。在一些具體例中，CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約95%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約99%同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，CD160蛋白包含與SEQ ID NO：1至4具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性中任一者的胺基酸序列。
在一些具體例中，提供一種治療個體中疾病的方法，其包含向個體投予有效量之經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞是藉由包含使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白之第一核酸接觸，從而產生該經修飾抗原特異性免疫細胞的方法所產生，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞為經修飾T細胞。在一些具體例中，前體抗原特異性免疫細胞進一步包含編碼功能性外源性受體的第二核酸。在依據本文所述治療方法中任一者的一些具體例中，產生經修飾抗原特異性免疫細胞的方法進一步包含將編碼功能性外源性受體的第二核酸導入該前體抗原特異性免疫細胞中。在一些具體例中，功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，功能性外源性受體是經修飾的T細胞受體(TCR)。在一些具體例中，經改造的T細胞受體(TCR)識別腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在進一步的具體例中，功能性外源性受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸可操作地連接至相同的啟動子。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸可操作地連接至個別的啟動子。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸在同一個載體上。在一些具體例中，第一核酸和第二核酸在個別載體上。在一些具體例中，載體是病毒載體。在一些具體例中，病毒載體選自由腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體，單純皰疹病毒載體及其衍生物所組成之群組。在一些具體例中，載體是非病毒載體。在一些具體例中，載體是游離型表現載體。在一些具體例中，該方法進一步包含分離或富集含有第一核酸及/或第二核酸的免疫細胞。在依據本文所述治療方法中任一者的一些具體例中，產生經修飾抗原特異性免疫細胞的方法進一步包含利用至少一種醫藥上可接受的載劑來調配經修飾抗原特異性免疫細胞。
在一些具體例中，係提供一種治療個體中癌症的方法，其包含向該個體投予有效量之(例如在其表面上)包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，其中與不包含外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞相比，CD160蛋白上調經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，提供一種治療個體中癌症的方法，其包含向個體投予有效量之經修飾抗原特異性免疫細胞，該經修飾抗原特異性免疫細胞是藉由包含使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白之第一核酸接觸，從而產生該經修飾抗原特異性免疫細胞的方法所產生，相較於前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調。在一些具體例中，癌症是實體癌症。在一些具體例中，癌症是白血病或淋巴瘤。在一些具體例中，該癌症是選自由以下組成之群組：黑色素瘤、肺癌、食道癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、腦癌、卵巢癌。在一些具體例中，該癌症是病毒相關的癌症，諸如HPV相關的癌症或EBV相關的癌症。在一些具體例中，癌症是轉移性癌症。在一些具體例中，治療癌症的方法具有以下生物學活性中的一或多者：(1)殺死癌細胞；(2)抑制癌細胞的增生；(3)誘導周邊T細胞的重新分佈；(4)在腫瘤中誘導免疫反應；(5)縮小腫瘤尺寸；(6)減輕患有癌症的個體的一或多種症狀；(7)抑制腫瘤轉移；(8)延長存活期；(9)延長癌症進展時間；(10)預防，抑制或減少癌症復發的可能性；(11)提高個體的生活品質；(12)促進腫瘤中的T細胞浸潤，和(13)減少已存在的腫瘤轉移(例如轉移至淋巴結)的發生率或負荷。在一些具體例中，該方法達到至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高中任一者的腫瘤細胞死亡率。在一些具體例中，該方法減小腫瘤尺寸至少約10% (包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者)。在一些具體例中，該方法抑制至少約10% (包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者)的轉移。在一些具體例中，該方法將個體的存活期延長達至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多個月中任一者。在一些具體例中，該方法將癌症進展時間延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多個月中任一者。
在依據本文所述任一種治療方法的一些具體例中，投予是腫瘤內投予。在一些具體例中，投予是投予至淋巴結內。在一些具體例中，非經腸、經皮(進入真皮)、血管腔內、動脈內(進入動脈)、肌肉內(進入肌肉)，鞘內或靜脈內進行投予。在一些具體例中，皮下(皮膚下)投予醫藥組成物。在一些具體例中，係以靜脈內進行投予。
本文所述方法適用於治療各種癌症，包括實體癌症和液體癌症。該等方法可應用於所有時期的癌症，包括早期癌症、非轉移性癌症、原發性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、轉移性癌症或緩解期癌症。本文所述方法可以用作一線療法、二線療法、三線療法或與本技藝中已知的其他類型癌症療法一起的組合療法，其他類型癌症療法為諸如化學療法、手術、激素療法、輻射、基因療法、免疫療法(諸如T細胞療法)、骨髓移植、幹細胞移植、標靶療法、冷凍療法、超音波療法、光動力療法、射頻燒灼(radio-frequency ablation)或類似者，在佐劑環境或新佐劑環境中進行(即該方法可以在主要/確定性治療之前進行)。在一些具體例中，該方法用於治療先前已接受過治療的個體。在一些具體例中，癌症對於先前的療法是頑抗的。在一些具體例中，該方法用於治療先前未曾接受過治療的個體。
在依據本文所述任一種方法的一些具體例中，包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞用作短期細胞裂解劑，以供控制並消除已生成的實體腫瘤。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞包含外源性CD160蛋白。在一些具體例中，該方法包含約每7、10、14、21或30天投予經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物。在一些具體例中，該方法包含約每2、3、4、5、6、7、8、9、10週投予經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物。在一些具體例中，投予多次經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物(諸如2、3、4、5、6或更多次中任一者)。在一些具體例中，該方法進一步包含投予一或多種治療劑。在一些具體例中，治療劑是輻射療法、化學療法或免疫療法中的一或多者。在一些具體例中，治療劑是免疫檢查點抑制劑。在一些具體例中，免疫檢查點抑制劑係靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中任一者。在一些具體例中，免疫檢查點抑制劑係靶向PD-1及/或PD-L1。在一些具體例中，治療劑包括細胞激素。在一些具體例中，細胞激素是IL-2、IL-7、IL-12a、IL-12b或IL-15。在一些具體例中，治療劑是進一步調控及/或引起免疫反應的物質。在一些具體例中，治療劑包含TLR促效劑。在一些具體例中，該治療劑包含TLR3促效劑、TLR4促效劑、TLR7促效劑、TLR8促效劑或TLR9促效劑。
在一些具體例中，該方法進一步包含調理處理(conditioning treatment)或預調理處理(preconditioning treatment)。在一些具體例中，調理處理或預調理處理用於減少或消除潛在疾病以便為新骨髓創造空間。在一些具體例中，該方法進一步包含化學療法。在一些具體例中，在投予經修飾抗原特異性免疫細胞或經修飾醫藥組成物之前投予化學療法。在一些具體例中，在投予經修飾抗原特異性免疫細胞或經修飾醫藥組成物之後投予化學療法。在一些具體例中，化學療法用於預調理帶有癌症的個體。在一些具體例中，該方法不包含預調理。在一些具體例中，該方法不進一步包含化學療法或化學療法預調理。在一些具體例中，該方法不進一步包含輻射療法或輻射預調理。在一些具體例中，該方法不進一步包含使用免疫接種。在一些具體例中，該方法不進一步包含使用介白素，諸如但不限於介白素-2 (IL-2)。
在本文所述方法中投予的經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物的有效量將取決於許多因素，諸如待治療癌症的特定類型和時期、投藥路徑、外源性CD160蛋白及/或功能性外源性受體的活性及類似因素。臨床醫師可以基於臨床因素(包括患者的身材、體表面積、年齡、要投予的特定化合物、性別、投予時間和路徑、整體健康狀況以及同時投予的其他藥物)來決定適當的劑量方案。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物的有效量低於會誘發毒理學作用(亦即高於臨床上可接受毒性水準的作用)的量，或當醫藥組成物投予給個體時，或為潛在副作用可受控制或耐受的量。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物的有效量包含約105 至約1010 個經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物的有效量包含約0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、5、10、20、50、100、200、500百萬個經修飾抗原特異性免疫細胞中任一者。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物的有效量包含約0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個十億個經修飾抗原特異性免疫細胞中任一者。
在一些具體例中，係投予經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物一次(例如單次快速注射)。在一些具體例中，係投予經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物多次(諸如2、3、4、5、6或更多次中任一者)。如果是多次投予，則它們可以透過相同或不同的途徑來執行，並且可以在相同部位或其他部位進行。可以按合適的頻率(諸如每天至每年一次)來投予醫藥組成物。藉由監測患者的疾病徵象並對應地調整治療，習於醫學技藝者可以容易地針對特定患者決定最佳劑量和治療方案。
在一些具體例中，該方法包含約每7、10、14、21或30天投予經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物。在一些具體例中，該方法包含約每2、3、4、5、6、7、8、9、10週投予經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物。在一些具體例中，該方法包含約每1、2、3、4、5、6、7或8個月投予經修飾經修飾抗原特異性免疫細胞或醫藥組成物。在一些具體例中，待治療的個體是哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限於人類、猴子、大鼠、小鼠、倉鼠、天竺鼠、狗、貓、兔、豬、綿羊、山羊、馬、牛和類似者。在一些具體例中，個體是人類。 醫藥組成物
本申請案進一步提供的是包含本文所述經修飾抗原特異性免疫細胞中任一者，以及視情況存在的醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
申請人的醫藥組成物可包含任何數量的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，醫藥組成物包含單一複本的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，醫藥組成物包含至少約1、10、100、1000、104 、105 、106 、107 、108 、109 個或更多個複本中任一者的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，醫藥組成物包含至少約0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、5、10、20、50、100、200、500個百萬個經修飾抗原特異性免疫細胞中任一者。在一些具體例中，醫藥組成物包含至少約0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個十億個經修飾抗原特異性免疫細胞中任一者。在一些具體例中，醫藥組成物包含單一類型的經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，醫藥組成物包含至少兩種類型的經修飾抗原特異性免疫細胞，其中不同類型的經修飾抗原特異性免疫細胞的區別在於它們的細胞來源、細胞類型、所表現的嵌合受體及/或啟動子等。
「載劑」如本文所用包括醫藥上可接受的載劑，賦形劑或穩定劑，其在所採用劑量與濃度下對暴露於其的細胞或個體是無毒的。生理上可接受的載劑通常是pH緩衝水溶液。合適醫藥載劑的實例是本技藝中公知的，包括磷酸鹽緩衝食鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型的潤濕劑、無菌溶液等。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在所採用劑量和濃度下對接受者是無毒。
可以藉由周知的常規方法調配包含此類載劑的醫藥組成物。溶劑或稀釋劑較佳為等滲的、低滲的或弱高滲的，並且具有相對較低的離子強度。代表性實例包括無菌水、生理食鹽水(例如氯化鈉)、林格氏溶液、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、漢克氏(Hank’s)溶液以及其他生理平衡鹽水溶液(例如，參見最新版Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins)。
本文所述的醫藥組成物可以經由任何合適的途徑來投予。在一些具體例中，非經腸、經皮(進入真皮)、血管腔內、動脈內(進入動脈)、肌肉內(進入肌肉)，鞘內或靜脈內投予該醫藥組成物。在一些具體例中，皮下(皮膚下)投予該醫藥組成物。在一些具體例中，靜脈內投予該醫藥組成物。在一些具體例中，經由輸注或注射向個體投予該醫藥組成物。在一些具體例中，將醫藥組成物直接投予至目標部位，例如藉由生物槍遞送至內部或外部目標位點或藉由導管至動脈中的位點。在一些具體例中，局部(例如腫瘤內)投予該醫藥組成物。投藥可以使用常規注射器和針頭或本技藝中可獲得的能夠促進或改善活性劑在個體體內遞送的任何化合物或裝置。
用於非經腸投予的製劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液和乳液。非水溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)和可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液(包括食鹽水和緩衝介質)。非經腸載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油。靜脈內載體包括液體和營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏葡萄糖的補充劑)與類似物。也可能存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑，和惰性氣體與類似物。另外，本發明醫藥組成物可包含蛋白質載劑，像是較佳為人類來源的血清白蛋白或免疫球蛋白。各種病毒調配物在本技藝中可呈冷凍，液體形式或凍乾形式中的任一者(例如WO98/02522、WO01/66137、WO03/053463、WO2007/056847和WO2008/114021等)。固體(例如乾粉或凍乾的)組成物可以透過牽涉真空乾燥和冷凍乾燥的方法獲得(參見例如WO2014/053571)。可以設想，依據醫藥組成物的預期用途，除本文所述的經修飾抗原特異性免疫細胞外，本發明醫藥組成物還可包含其他生物活性劑。
在一些具體例中，醫藥組成物經適當地緩衝以供人類使用。合適的緩衝劑包括，但不限於磷酸鹽緩衝劑(例如PBS)、碳酸氫鹽緩衝劑及/或Tris緩衝劑，其能夠維持生理或略鹼性的pH (例如約pH 7至約pH 9)。在一些具體例中，還可以透過添加合適的滲壓性調節劑(諸如甘油)來使醫藥組成物與血液為等滲。
在一些具體例中，醫藥組成物容納在一次性小瓶中，諸如一次性密封小瓶中。在一些具體例中，醫藥組成物容納在多次性小瓶中。在一些具體例中，醫藥組成物散裝在容器中。
在一些具體例中，醫藥組成物必須滿足關於向個體投藥的某些標準。例如，美國食品和藥物管理局(FDA)已發布了管理指南，為基於細胞的免疫治療產品設下了標準，包括21 CFR 610和21 CFR 610.13。評估醫藥組成物的外觀、特性、純度、安全性及/或效力的方法是本技藝已知的。在一些具體例中，醫藥組成物基本上不含能夠產生過敏性作用的外源性蛋白質，諸如細胞培養時使用的動物來源的蛋白質，而不是經修飾抗原特異性免疫細胞。在一些具體例中，「基本上不含」是小於醫藥組成物的總體積或重量約10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、1ppm或更少中任一者。在一些具體例中，醫藥組成物在GMP等級的工廠中製備。在一些具體例中，用於非經腸投予的醫藥組成物包含小於約5 EU/kg體重/小時的內毒素。在一些具體例中，用於靜脈內投予的醫藥組成物中至少約70%的經修飾抗原特異性免疫細胞是活的。在一些具體例中，當使用如美國藥典(USP)中所述的14天直接接種測試方法進行評估時，醫藥組成物具有「無生長」結果。在一些具體例中，在投予醫藥組成物之前，應當在最終收取之前(或與培養最後一次進料同時)大概約48至72小時，採集包括經修飾抗原特異性免疫細胞和醫藥上可接受的賦形劑兩者的樣品，以用於無菌測試。在一些具體例中，醫藥組成物沒有黴漿菌污染。在一些具體例中，醫藥組成物不含可檢測到的微生物劑。在一些具體例中，醫藥組成物不含傳染媒介物，諸如第I型HIV、第II型HIV、HBV、HCV、第I型人類T淋巴病毒；以及人類第II型T淋巴病毒。
在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細展現出天然抗原識別。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞展現出經改造的抗原識別。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞的抗原識別至少部分地由功能性外源性受體(諸如但不限於CAR和TCR)賦予。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞係靶向腫瘤相關抗原、突變的致癌抗原和隨機體細胞抗原以及其他新抗原。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是人類免疫細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是鼠類免疫細胞。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞是由TCR-T細胞、CAR-T細胞，TIL或內源性抗原特異性T細胞中的一或多者修飾而來。人類與鼠類TCR-T細胞、CAR-T細胞，TIL或內源性抗原特異性T細胞的一些實例報導於Tran et al.,Nat Immunol . 2017;18(3):255-62、 MacKay et al.,Nat Biotechnol . 2020;38(2):233-44以及Schumacher et al.,Cancer Neoantigens. Annu Rev Immunol. 2019;37:173-200中，其以引用的方式併入本文。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞靶向廣泛的抗原。在一些具體例中，經修飾抗原特異性免疫細胞係靶向表1中列舉的一或多種抗原。 IV.  於抗原特異性免疫細胞中調控CD160的免疫刺激活性
本發明的一個態樣，係提供於抗原特異性免疫細胞中調控CD160蛋白之免疫刺激活性的方法，其包含投予治療有效量的藥劑，該藥劑於抗原特異性免疫細胞中調控CD160的免疫刺激活性。
在一些態樣中，亦提供鑑別內源性CD160表現、功能或活性之調控劑的方法，其包含使表現CD160的免疫細胞(諸如NK細胞)與測試試劑接觸；並測量所測試之免疫細胞中細胞裂解或發炎性途徑的效應表現及/或功能。在一個具體例中，相較於免疫細胞，若測試試劑在所測試之免疫細胞中調控細胞裂解或發炎性路徑的效應表現及/或功能，則該測試試劑被鑑定為CD160表現、功能或活性的一個調控劑。在一些具體例中，相較於正常基線對照，CD160表現、功能或活性係受到顯著調控。在一些具體例中，調控劑是CD160表現、功能或活性的抑制劑。在一些具體例中，調控劑是CD160表現、功能或活性的活化劑。
在一些態樣中，還提供鑑別內源性CD160表現、功能或活性之調控劑的方法，其包含使表現CD160的抗原特異性免疫細胞(諸如NK細胞)與測試試劑接觸；並測量由所測試之免疫細胞引起的活體內免疫功能，諸如免疫細胞在抗原挑戰之後的細胞激素分泌。在一個具體例中，相較於對照免疫細胞，若測試試劑在所測試之免疫細胞中調控細胞裂解或發炎性路徑的效應表現及/或功能，則該測試試劑被鑑定為CD160表現、功能或活性的一個調控劑。較佳地，相較於正常基線對照，CD160表現、功能或活性係受到顯著調控。在一些具體例中，調控劑是CD160表現、功能或活性的抑制劑。在一些具體例中，調控劑是CD160表現、功能或活性的活化劑。
本發明的一個態樣，係提供治療個體中免疫疾病的方法，其包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中調控CD160的內源性免疫刺激活性。在一些具體例中，該免疫疾病是自體免疫疾病或發炎性疾病，且其中該藥劑於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160的內源性免疫刺激活性。 於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160的免疫刺激活性
本發明的一個態樣，係提供一種於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160之內源性免疫刺激活性的方法，其包含使抗原特異性免疫細胞與有效量的藥劑接觸，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160的免疫刺激活性。
在一些具體例中，係提供一種在個體體內治療自體免疫疾病的方法，其包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160的內源性免疫刺激活性。在一些具體例中，提供一種在個體體內治療發炎性疾病的方法，其包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160的內源性免疫刺激活性。
在一些具體例中，抑制CD160蛋白之內源性免疫刺激活性的藥劑包含拮抗性抗體。在一些具體例中，抑制CD160蛋白之內源性免疫刺激活性的藥劑包括拮抗性蛋白。在一些具體例中，抑制CD160蛋白之內源性免疫刺激活性的藥劑包含一或多種核酸。在一些具體例中，該藥劑為RNA干擾(RNAi)的形式。在一些具體例中，該藥劑為下列的一或多者：siRNA、shRNA或miRNA。在一些具體例中，抑制CD160蛋白之內源性免疫刺激活性的藥劑包含小分子。在一些具體例中，該藥劑包含CD160蛋白的顯性失活(dominant negative)形式。
在一些具體例中，該等藥劑抑制CD160的內源性免疫刺激活性達約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%中任一者。在一些具體例中，該等藥劑抑制CD160的內源性免疫刺激活性達約1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍中任一者。
在一些具體例中，治療自體免疫反應的方法包含免疫反應受抑制及/或耐受性受誘發。自體免疫反應降低可包括，但不限於對與以下相關的抗原的免疫反應降低或耐受性受誘發：第I型糖尿病、類風濕性關節炎、牛皮癬、多發性硬化症、阿茲海默症、ALS、亨廷頓氏症、帕金森氏症、全身性紅斑狼瘡、休格倫氏症(Sjogren’s Disease)、克隆氏症(Crohn's disease)或潰瘍性結腸炎。在一些具體例中，免疫反應受抑制及/或耐受性受誘發包含過敏性反應降低。例如，過敏性反應降低可包括對與以下相關的抗原的免疫反應降低或耐受性受誘發：過敏性氣喘、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎(花粉熱)、食物過敏和麩質過敏。在一些具體例中，抗原是與移植組織相關的抗原。在一些具體例中，免疫反應受抑制及/或耐受性受誘發包含對移植組織的免疫反應降低或耐受性受誘發。在一些具體例中，抗原與病毒相關。在一些具體例中，免疫反應受抑制及/或耐受性受誘發包含病原性免疫反應降低或對病毒的耐受性受誘導。例如，病原性免疫反應可以包括某些病毒感染產生的細胞激素風暴。細胞激素風暴是一種潛在的致命性免疫反應，由細胞激素和白血球之間的正回饋迴路組成。因此，在一些具體例中，免疫反應受抑制及/或耐受性受誘導包含細胞激素風暴減少或消除。
在一些具體例中，被抗原特異性免疫細胞識別的抗原是蛋白質。在一些具體例中，抗原是自身抗原。在一些具體例中，自身抗原與第I型糖尿病或類風濕性關節炎相關。在一些具體例中，抗原與治療劑有關。在一些具體例中，抗原是治療性多肽或治療性多肽的片段。在一些具體例中，治療劑是凝血因子，諸如但不限於因子VIII和因子IX。在一些具體例中，治療劑是抗體。在一些具體例中，治療劑是激素。在一些具體例中，治療劑是胰島素。在一些具體例中，治療劑是重組型細胞激素。在一些具體例中，治療劑是免疫檢查點抑制劑。 於免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性
在一些具體例中，提供一種於抗原特異性免疫細胞中活化CD160之免疫刺激活性的方法，其包含使抗原特異性免疫細胞與有效量之於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性的藥劑接觸。在一些具體例中，該方法於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性，且該藥劑於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性。在一些具體例中，該方法包含使外源性CD160蛋白與抗原特異性免疫細胞接觸。在一些具體例中，該方法包含使編碼外源性CD160蛋白的核苷酸與抗原特異性免疫細胞接觸。
在一些具體例中，提供一種治療個體中癌症的方法，其包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。在一些具體例中，提供一種治療個體中感染的方法，其包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。
在一些具體例中，活化CD160蛋白的免疫刺激活性的藥劑包括促效性肽或蛋白。在一些具體例中，該藥劑包含小分子。在一些具體例中，活化CD160蛋白的內源性免疫刺激活性的藥劑包含促效性抗體。
在一些具體例中，活化CD160蛋白的內源性免疫刺激活性的藥劑包含一或多種核酸。在一些具體例中，該藥劑是DNA及/或mRNA。
在一個具體例中，該藥劑於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性，其中在與該藥劑接觸之前，該抗原特異性免疫細胞未展現出可偵測到的CD160活性。在一些具體例中，該藥劑於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性。在一些具體例中，該藥劑提高CD160的內源性免疫刺激活性達約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%中任一者。在一些具體例中，該藥劑提高CD160的內源性免疫刺激活性達約1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍中任一者。
在一些具體例中，治療癌症的方法包含增加對腫瘤抗原或腫瘤相關抗原的免疫反應。在一些具體例中，被抗原特異性免疫細胞識別的抗原是蛋白質。在一些具體例中，抗原特異性免疫細胞對腫瘤抗原或腫瘤相關抗原具有特異性。在一些具體例中，腫瘤相關抗原選自由以下組成之群組：間皮素、EGFRvIII、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、介白素11受體a (IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生的生長因子受體-β (PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、葉酸受體α (FRa)、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、表皮生長因子受體(EGFR)、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、蝶素(ephrin) B2、IGF-1受體、CAIX、LMP2、gp 100、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、鄰乙醯基GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆莢蛋白(legumain)、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、prostein、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。在一些具體例中，抗原衍生自新抗原，例如癌症相關新抗原。在一些具體例中，抗原包含新表位，例如癌症相關的新表位。
在一些具體例中，係提供一種治療個體中感染的方法，其包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。在一些具體例中，提供一種治療個體中感染的方法，其包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。
在一些具體例中，治療感染的方法包含增加對與傳染媒介物相關的抗原的免疫反應。在一些具體例中，抗原是非自身抗原。在一些具體例中，抗原是腫瘤抗原、病毒抗原，細菌抗原或真菌抗原。 V.   在腫瘤環境中基於CD160的量或活性來治療癌症的方法
本發明的一個態樣是有關治療癌症的方法，其中CD160可以用作預測抗原特異性T細胞之功能狀態的生物標記，並因此預測免疫療法的功效。在那些細胞中，CD160的表現偏高可能暗示著抗原特異性T細胞的活化狀態，而CD160的表現量低或無表現可能暗示著抗原特異性T細胞的不活化狀態。
因此，在一些具體例中，提供一種治療個體中癌症的方法，其包含向該個體投予治療有效量之包含抗原特異性免疫細胞的組成物，其中個體體內的內源性CD160的量或活性被用作為選定治療個體的基礎。在一些具體例中，如果個體的CD160的量或活性為高，則選定該個體進行治療。在一些具體例中，如果個體的CD160的量或活性為低，則選定該個體進行治療。在一些具體例中，CD160的量或活性是藉由免疫組織化學方法測定。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160蛋白的表現量。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160 mRNA的量。在一些具體例中，係測量個體腫瘤中的CD160量或活性。在一些具體例中，係測量個體的腫瘤浸潤性T細胞(TIL)中的CD160量或活性。在一些具體例中，係測量個體的周邊T細胞中的CD160量或活性。
在一些具體例中，提供一種治療個體中癌症的方法，其包含向該個體投予治療有效量的組成物，該組成物包含(例如在其表面)含有外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，相較於未含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中免疫細胞是T細胞，且其中個體體內的內源性CD160的量或活性被用作選定治療個體的基礎。在一些具體例中，如果個體的CD160的量或活性為高，則選定該個體進行治療。在一些具體例中，如果個體的CD160的量或活性為低，則選定該個體進行治療。在一些具體例中，藉由免疫組織化學方法來測定CD160的量。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160蛋白的表現量。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160 mRNA量。在一些具體例中，係測量個體腫瘤中的CD160量或活性。在一些具體例中，係測量個體的腫瘤浸潤性T細胞(TIL)中的CD160量或活性。在一些具體例中，係測量個體的周邊T細胞中的CD160量或活性。
在一些具體例中，係提供了一種治療個體中癌症的方法，其包含向該個體投予治療有效量的包含一或多種免疫檢查點抑制劑的組成物，其中該個體體內的內源性CD160的量或活性被用作為選擇治療個體的基礎。在一些具體例中，如果個體的CD160的量或活性為高，則選定該個體進行治療。在一些具體例中，如果個體的CD160的量或活性為低，則選定該個體進行治療。在一些具體例中，藉由免疫組織化學方法來測定CD160的量。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160蛋白的表現量。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160 mRNA量。在一些具體例中，係測量個體腫瘤中的CD160量或活性。在一些具體例中，係測量個體的腫瘤浸潤性T細胞(TIL)中的CD160量或活性。在一些具體例中，係測量個體的周邊T細胞中的CD160量或活性。在一些具體例中，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中任一者。
在一些具體例中，提供一種治療個體中癌症的方法，其包含向該個體投予治療有效量的組成物，該組成物包含活化CD160的免疫刺激活性的藥劑，其中該個體體內的內源性CD160的量或活性被用作為選定治療個體的基礎。在一些具體例中，如果個體的CD160的量或活性為高，則選定該個體進行治療。在一些具體例中，如果個體的CD160的量或活性為低，則選定該個體進行治療。在一些具體例中，藉由免疫組織化學方法來測定CD160的量。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160蛋白的表現量。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160 mRNA量。在一些具體例中，係測量個體腫瘤中的CD160的量或活性。在一些具體例中，係測量個體的腫瘤浸潤性T細胞(TIL)中的CD160的量或活性。在一些具體例中，係測量個體的周邊T細胞中的CD160的量或活性。在一些具體例中，活化CD160蛋白的免疫刺激活性的藥劑包括促效性肽或蛋白。在一些具體例中，該藥劑包含小分子。在一些具體例中，活化CD160蛋白的內源性免疫刺激活性的藥劑包括促效性抗體。在一些具體例中，活化CD160蛋白的內源性免疫刺激活性的藥劑包含一或多種核酸。在一些具體例中，該藥劑是DNA及/或mRNA。在一些具體例中，該藥劑於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性，其中在與該藥劑接觸之前，該抗原特異性免疫細胞未展現出可偵測到的CD160活性。在一些具體例中，該藥劑於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性。在一些具體例中，該藥劑提高CD160的內源性免疫刺激活性達約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%中任一者。在一些具體例中，該藥劑提高CD160的內源性免疫刺激活性達約1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍中任一者。
在其他態樣中，提供一種選出(包括識別)患有癌症(諸如黑色素瘤或肺癌)之個體以供利用包含治療劑之組成物進行治療的方法，其中該方法包含測定個體體內的CD160的量或活性。在一些具體例中，提供一種選出(包括識別)患有癌症(諸如黑色素瘤或肺癌)之個體以供利用包含免疫療法之組成物治療的方法，其中該方法包含測定個體體內的CD160的量或活性。在一些具體例中，選出具有高量的CD160的個體進行治療。在一些具體例中，選出具有低量的CD160的個體進行治療。在一些具體例中，基於蛋白質的表現量來確定CD160的量。在一些具體例中，基於mRNA的量來確定CD160的量。在一些具體例中，藉由免疫組織化學分析來測定CD160的量。
在一些具體例中，藉由與對照(諸如本文所述的任何對照)比較來確定其量(例如，高或低)。在一些具體例中，該方法進一步包含將CD160的量或活性與對照進行比較。在一些具體例中，基於計分系統(諸如本文所述的H計分系統)來確定其量(例如，高或低)。可以使用與非對照樣品相同的來源和方法獲得對照樣品。在一些具體例中，對照樣品獲自不同的個體(例如，沒有癌症的個體及/或具有相似種族、年齡和性別的個體)。在一些具體例中，當樣品是腫瘤組織樣品時，對照樣品可以是來自同一個體的非癌樣品。在一些具體例中，多個對照樣品(例如來自不同的個體)用於確定特定組織、器官或細胞群體中CD160活性位準的範圍。在一些具體例中，對照樣品是已被確定為適當對照的培養組織或細胞。在一些具體例中，對照是不表現CD160的細胞。在一些具體例中，對照是高表現量之CD160的細胞。在一些具體例中，在標準化測試中的臨床上可接受正常位準被用作為供確定相關組織中CD160活性的對照位準。在一些具體例中，依據計分系統，諸如用於CD160染色的基於免疫組織化學的計分系統(例如本文進一步討論的H計分)，將個體的參考CD160量或活性歸為高、中或低。在一些具體例中，當H計分小於或等於總體中位H計分時，個體的參考CD160量或活性被歸為低量樣品。
在一些具體例中，提供一種治療個體中癌症的方法，其包含向該個體投予治療有效量的組成物，該組成物包含在其表面上含有功能性外源性受體的經修飾抗原特異性免疫細胞，其中免疫細胞是T細胞，且其中個體體內的CD160的量或活性被用作為選出經修飾抗原特異性免疫細胞於癌症治療中使用的基礎。在一些具體例中，如果細胞的CD160的量或活性為高，則選定經修飾抗原特異性免疫細胞進行治療。在一些具體例中，如果細胞的CD160的量或活性為低，則選定經修飾抗原特異性免疫細胞進行治療。在一些具體例中，藉由免疫組織化學方法來測定CD160的量。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160蛋白的表現量。在一些具體例中，CD160的量或活性是基於CD160 mRNA量。在一些具體例中，CD160的量或活性係與不包含外源性功能性受體的前體免疫細胞進行比較。在一些具體例中，其表面上包含有外源性功能性受體的經修飾抗原特異性免疫細胞的CD160的量或活性，係與在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞進行比較。在一些具體例中，其表面上包含有外源性功能性受體的經修飾抗原特異性免疫細胞的CD160的量或活性，係與在其表面上包含外源性顯性失活形式之CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞進行比較。
在依據本文所述方法中任一者的一些具體例中，基於CD160蛋白的表現量來確定CD160的量。在一些具體例中，係基於mRNA的量來確定CD160的量。在一些具體例中，核苷轉運蛋白的量是藉由免疫組織化學分析來確定。在一些具體例中，透過與對照(諸如本文所述對照中的任一者)比較來確定其量(例如，高或低)。在一些具體例中，基於計分系統(諸如本文所述的H計分系統)來確定水平(例如，高或低)。在一些具體例中，計分是基於美國專利公開案第2013/0005678號中所述的「H計分」。藉由以下公式獲得H計分：3 × 強烈染色細胞百分比 + 2 × 中度染色細胞百分比 + 弱染色細胞百分比，範圍為0至300。 VI.  套組以及製品
本文還提供套組、單位劑量和製品，其包含本文所述經修飾抗原特異性免疫細胞或組成物(例如醫藥組成物)中任一者。在一些具體例中，係提供一種套組，其含有本文所述醫藥組成物中的任一者，且較佳地提供其使用說明書。在一些具體例中，套組除了經修飾抗原特異性免疫細胞外，還包含第二種癌症療法，諸如化學療法、激素療法及/或免疫療法。套組可以針對個體的特定癌症量身訂做，並包含針對該名個體的對應第二種癌症療法。
本文也提供套組、單位劑量和製品，其包含CD160表現、功能或活性之調控劑(諸如抑制劑或活化劑)中任一者，或調控CD160活性之藥劑(諸如抑制劑或活化劑)中任一者。
套組可包含一或多種其他組分，例如容器、試劑、培養基、誘導物、細胞激素、緩衝劑、抗體及類似物，以允許增殖或誘導經修飾抗原特異性免疫細胞。套組還可含有用於將醫藥組成物局部投予(諸如腫瘤內注射)至腫瘤部位的裝置。
在另一個態樣中，提供一種套組，其包含：1)包含經修飾抗原特異性細胞的組成物，該經修飾抗原特異性細胞包含外源性功能性受體(諸如CAR)、CD160活性的調控劑及/或免疫療法(諸如免疫檢查點抑制劑)，以及2)測定CD160的量或活性的試劑。在一些具體例中，用於測定CD160的表現量的試劑是識別CD160蛋白的抗體。
本申請案的套組是為合適包裝。合適包裝包括，但不限於小瓶、瓶子、廣口瓶、軟包裝(例如，密封的麥拉(Mylar)或塑膠袋)與類似物。套組可以視情況提供其他組分，諸如緩衝劑和說明性資訊。因此，本申請案還提供製品，其包括小瓶(諸如密封小瓶)、瓶子、廣口瓶、軟包裝與類似物。套組的某些組分可以包裝在水性介質中或呈凍乾形式。
製品可包含容器和在容器上或與容器連結的標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由各式材料形成，諸如玻璃或塑膠。通常，容器容納有效治療本文所述疾病或病症(諸如癌症)的組成物，並且可以具有無菌進入口(例如，容器可以是靜脈內溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的小瓶)。標籤或包裝插頁指明該組成物用於治療個體的特定病況。標籤或包裝插頁將進一步包含用於向個體投予組成物的說明書。標籤可以指示還原及/或使用的指導。容納醫藥組成物的容器可以是多次性小瓶，其允許重複投藥(例如，投藥2至6次)經還原的調配物。包裝插頁是指通常包含在治療產品的商業包裝中的說明書，該說明書含有關於使用此類治療產品的適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症及/或警告的資訊。另外，該製品還可以包含第二容器，該第二容器包含醫藥上可接受的緩衝液，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝食鹽水，林格氏溶液和葡萄糖溶液。從商業和用戶的角度來看，它還可包括其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
套組或製品可包括多個單位劑量的醫藥組成物和使用說明書，其以足夠在藥局(例如醫院藥局和複合式藥局)中儲存和使用之量包裝。 例示性具體例
本發明提供以下列舉的具體例。
具體例1.  一種在其表面上包含外源性CD160蛋白的經修飾抗原特異性免疫細胞，其中相較於未包含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，外源性CD160蛋白上調經修飾抗原特異性免疫細胞，其中免疫細胞是T細胞。
具體例2.  如具體例1之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：細胞毒性αβT細胞、γδ T細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞，經抗原呈獻細胞(APC)活化的抗腫瘤T細胞以及自然殺手T細胞(NK-T細胞)。
具體例3.  如具體例1之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。
具體例4.  如具體例2之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。
具體例5.  如具體例1之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。
具體例6.  如具體例1至5中任一項之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的變異體。
具體例7.  如具體例1至5中任一項之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白是膜結合的。
具體例8.  如具體例7之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白經由GPI連接子結合至膜。
具體例9. 如具體例7之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白包含跨膜結構域。
具體例10.       如具體例9之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白進一步包含細胞內結構域。
具體例11.       如具體例9或10之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白進一步包含來自CD160剪接變異體的細胞內結構域。
具體例12.       如具體例10之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中細胞內結構域包含衍生自TCR複合體的信號傳導次單位的細胞內信號傳導結構域。
具體例13.       如具體例12之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中TCR複合體的信號傳導次單位選自由CD3γ、CD3δ和CD3ε所組成之群組。
具體例14.       如具體例10之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中細胞內結構域包含CD28共刺激結構域、4-1BB共刺激結構域或兩者。
具體例15.       如具體例14之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、CD28共刺激結構域和4-1BB共刺激結構域。
具體例16.       如具體例14之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域和CD28共刺激結構域。
具體例17.       如具體例10至16中任一項之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中細胞內結構域包含初級訊號傳導結構域。
具體例18.       如具體例17之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中初級訊號傳導結構域包含CD3ζ結構域。
具體例19.       如具體例10至16中任一項之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中細胞內結構域不包括初級訊號傳導結構域。
具體例20.       如具體例7之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白經由免疫細胞結合部分結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。
具體例21.       如具體例20之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中免疫細胞結合部分結合至免疫細胞的表面分子。
具體例22.       如具體例1至21中任一項之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體。
具體例23.       如具體例22之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)。
具體例24.       如具體例22之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。
具體例25.       一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含： 使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白的第一核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞， 其中，相較於前體抗原特異性免疫細胞，外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中免疫細胞是T細胞。
具體例26.       如具體例25之方法，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：細胞毒性αβT細胞、γδ T細胞、輔助T細胞，腫瘤浸潤性T細胞，經APC活化的抗腫瘤T細胞和自然殺手T細胞(NK-T細胞)。
具體例27.       如具體例25之方法，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。
具體例28.       如具體例26之方法，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。
具體例29.       如具體例26之方法，其中免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。
具體例30.       如具體例25至29中任一項之方法，其中該方法包含使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白接觸。
具體例31.       如具體例30之方法，其中外源性CD160蛋白包含結合至免疫細胞之表面分子的免疫細胞結合部分。
具體例32.       如具體例25至29中任一項之方法，其中該方法包含將編碼該外源性CD160蛋白的核酸導入前體抗原特異性免疫細胞。
具體例33.       如具體例32之方法，其中該核酸是mRNA。
具體例34.       如具體例32之方法，其中該核酸是DNA。
具體例35.       如具體例32至34中任一項之方法，其中透過轉染將核酸導入前體抗原特異性免疫細胞。
具體例36.       如具體例32至34中任一項之方法，其中透過轉導或電穿孔將核酸導入前體抗原特異性免疫細胞。
具體例37.       如具體例25至36中任一項之方法，其中CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的變異體。
具體例38.       如具體例25至37中任一項之方法，其中外源性CD160蛋白是膜結合的。
具體例39.       如具體例38之方法，其中外源性CD160蛋白經由GPI連接子結合至膜。
具體例40.       如具體例38之方法，其中外源性CD160蛋白包含跨膜結構域。
具體例41.       如具體例39之方法，其中外源性CD160蛋白進一步包含細胞內結構域。
具體例42.       如具體例40或41之方法，其中外源性CD160蛋白進一步包含來自CD160剪接變異體的細胞內結構域。
具體例43.       如具體例41之方法，其中細胞內結構域包含衍生自TCR複合體的信號傳導次單位的細胞內信號傳導結構域。
具體例44.       如具體例43之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中TCR複合體的信號傳導次單位選自由CD3γ、CD3δ和CD3ε所組成之群組。
具體例45.       如具體例41之方法，其中細胞內結構域包含CD28共刺激結構域、4-1BB共刺激結構域或兩者。
具體例46.       如具體例45之方法，其中外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、CD28共刺激結構域和4-1BB共刺激結構域。
具體例47.       如具體例45之方法，其中外源性CD160蛋白從N端至C端包含：細胞外CD160結構域、跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域和CD28共刺激結構域。
具體例48.       如具體例41至47中任一項之方法，其中細胞內結構域包含初級訊號傳導結構域。
具體例49.       如具體例48之方法，其中初級訊號傳導結構域包含CD3ζ結構域。
具體例50.       如具體例41至47中任一項之方法，其中細胞內結構域不包含初級訊號傳導結構域。
具體例51.       如具體例38之方法，其中外源性CD160蛋白經由免疫細胞結合部分結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。
具體例52.       如具體例51之方法，其中免疫細胞結合部分係結合至免疫細胞的表面分子。
具體例53.       如具體例25至52中任一項之方法，其中前體抗原特異性免疫細胞包含編碼功能性外源性受體的第二核酸。
具體例54.       如具體例25至52中任一項之方法，其進一步包含使前體抗原特異性免疫細胞與編碼功能性外源性受體的第二核酸接觸。
具體例55.       如具體例53或54之方法，其中功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)。
具體例56.       如具體例53或54之方法，其中功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。
具體例57.       如具體例54至56中任一項之方法，其中第一核酸和第二核酸可操作地連接於相同的啟動子。
具體例58.       如具體例54至56中任一項之方法，其中第一核酸和第二核酸酸可操作地連接至個別的啟動子
具體例59.       如具體例54至58中任一項之方法，其中第一核酸和第二核酸在同一個載體上。
具體例60.       如具體例54至59中任一項之方法，其中第一核酸及/或第二核酸在個別的載體上。
具體例61.       如具體例59或60之方法，其中載體是病毒載體。
具體例62.       如具體例61之方法，其中病毒載體選自由以下組成之群組：腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、游離型載體表現載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物。
具體例63.       如具體例59或60之方法，其中載體是非病毒載體。
具體例64.       如具體例25至63中任一項之方法，進一步包含分離或富集包含第一及/或第二核酸的免疫細胞。
具體例65.       如具體例25至64中任一項之方法，進一步包含用至少一種醫藥上可接受的載劑來調配表現CD160的經修飾抗原特異性免疫細胞。
具體例66.       一種經修飾抗原特異性免疫細胞，其是藉由具體例25至65中任一項之方法獲得。
具體例67.       一種醫藥組成物，其包含具體例1至24和66中任一項的經修飾抗原特異性免疫細胞，以及醫藥上可接受的載劑。
具體例68.       一種治療個體中疾病的方法，包含向個體投予有效量之具體例1至24中任一項的經修飾抗原特異性免疫細胞或如具體例67之醫藥組成物。
具體例69.       如具體例68之方法，其中經修飾抗原特異性免疫細胞衍生自該個體。
具體例70.       一種治療個體中疾病的方法，包含向該個體投予有效量的外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的核酸，其中該外源性CD160蛋白包含在個體體內識別免疫細胞上之表面分子的結合部分。
具體例71.       如具體例68至70中任一項之方法，其中投予是腫瘤內投予。
具體例72.       如具體例68至70中任一項之方法，其中投予是投予至淋巴結中。
具體例73.       如具體例68至72中任一項之方法，其中疾病是癌症。
具體例74.       如具體例73之方法，其中癌症是實體腫瘤。
具體例75.       如具體例73或74之方法，其中癌症是轉移性癌症。
具體例76.       如具體例73至75中任一項之方法，其中癌症選自由以下組成之群組：黑色素瘤、肺癌、食道癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、腦癌、卵巢癌。
具體例77.       如具體例68至76中任一項之方法，其中個體是人類。
具體例78.       一種於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160之內源性免疫刺激活性的方法，包含使抗原特異性免疫細胞與有效量的藥劑接觸，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160之免疫刺激活性。
具體例79.       一種於抗原特異性免疫細胞中活化CD160之免疫刺激活性的方法，包含使抗原特異性免疫細胞與有效量的藥劑接觸，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160之免疫刺激活性。
具體例80.       如具體例79之方法，其中該方法於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性，且其中該藥劑於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性。
具體例81.       一種治療個體中免疫疾病的方法，包含向個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中調控CD160的內源性免疫刺激活性。
具體例82.       如具體例81之方法，其中該免疫疾病是自體免疫疾病或發炎性疾病，且其中該藥劑於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160的內源性免疫刺激活性。
具體例83.       一種治療個體中癌症的方法，包含向個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。
具體例84.       一種治療個體中感染的方法，包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。
具體例85.       一種增加抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力的方法，包含將編碼外源性CD160蛋白的核酸引入免疫細胞。
具體例86.       一種增加抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力的方法，包含在免疫細胞中使CD160蛋白過度表現。
具體例87.       如具體例86之方法，其中CD160蛋白是內源性蛋白。
具體例88.       如具體例86之方法，其中CD160蛋白是外源性蛋白。
具體例89.       如具體例85之方法，其中相較於不表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍中任一者。
具體例90.       如具體例85之方法，其中相較於不表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的生存能力增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍中任一者。
具體例91.       如具體例85至88中任一項之方法，其中與未過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞相比，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的產量增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍中任一者。
具體例92.       如具體例85至88中任一項之方法，其中與未過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞相比，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的生存能力提高至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍中任一者。
具體例93.       一種製造治療性抗原特異性免疫細胞的方法，包含增加選自具體例85至92中任一項之方法的抗原特異性免疫細胞的產量及/或生存能力的方法。
具體例94.       如具體例93之方法，其中治療性抗原特異性免疫細胞包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
具體例95.       如具體例93之方法，其中治療性抗原特異性免疫細胞包含功能性外源性受體。
具體例96.       如具體例95之方法，其中功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。
具體例97.       如具體例95之方法，其中功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)。
具體例98.       一種增加抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性的方法，包含將編碼外源性CD160蛋白的核酸引入免疫細胞。
具體例99.       一種增加抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性的方法，包含在免疫細胞中使CD160蛋白過度表現。
具體例100.     如具體例99之方法，其中CD160蛋白是內源性蛋白。
具體例101.     如具體例99之方法，其中CD160蛋白是外源性蛋白。
具體例102.     如具體例98之方法，其中與不表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞相比，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外細胞裂解活性增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍中任一者。
具體例103.     如具體例98之方法，其中與不表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞相比，表現外源性CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體內細胞裂解活性增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍中任一者。
具體例104.     如具體例98至101中任一項之方法，其中與未過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞相比，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體外細胞裂解活性增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍中任一者。
具體例105.     如具體例98至101中任一項之方法，其中與未過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞相比，過度表現CD160蛋白的抗原特異性免疫細胞的活體內細胞裂解活性增加至少約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍中任一者。
具體例106.     一種製造治療性抗原特異性免疫細胞的方法，包含增加選自具體例98至105中任一項之方法的抗原特異性免疫細胞的活體外及/或活體內細胞裂解活性的方法。
具體例107.     如具體例106之方法，其中治療性抗原特異性免疫細胞包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
具體例108.     如具體例106之方法，其中治療性抗原特異性免疫細胞包含功能性外源性受體。
具體例109.     如具體例108之方法，其中功能性外源性受體是嵌合抗原受體(CAR)。
具體例110.     如具體例108之方法，其中功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)。 實例 實例1：mCD160在Pmel T細胞上的異位表現
為了檢驗CD160在免疫細胞中的功能，係於抗腫瘤T細胞中異位表現小鼠CD160的GPI錨定形式，並以FACS分析法來定量。
具體來說，小鼠全長CD160 (mCD160)係選殖到基於MSCV的逆轉錄病毒載體中，並透過P2A間隔子與GFP報導子融合，從而容許CD160和GFP蛋白的獨立合成(圖1A)。然後將mCD160病毒轉導至Pmel T細胞中，Pmel T細胞帶有一個識別人類黑色素瘤抗原GP100其小鼠同源物的TCR。
如藉由FACS分析所表明，CD160的異位表現係導致Pmel T細胞(通常表現低量內源性的CD160)上的CD160表現增加約2.5倍 (圖1B)。 實例2：CD160的表現在培養時強化Pmel T細胞對抗B16F0黑色素瘤細胞的CTL功能
為了證明異位CD160表現對T細胞之細胞裂解功能的影響，係測定顆粒酶A和穿孔素的表現；發炎性細胞激素的表現；還有經CD160修飾Pmel T細胞的殺滅活性。經模擬感染的Pmel T細胞用作為對照。
具體來說，如實例1中所述，mCD160病毒係轉導至Pmel T細胞中，並藉由FACS來測定顆粒酶A和穿孔素的表現。對於T細胞和NK細胞媒介的殺滅作用來說，顆粒酶A與穿孔素在顆粒胞吐途徑中是兩個重要的蛋白質。如圖2A中所示，與對照Pmel T細胞相比，顆粒酶A和穿孔素的表現增加，表示外源性mCD160強化了腫瘤特異性T細胞的固有CTL功能。
相較於對照Pmel T細胞，在經CD160修飾Pmel T細胞中使用FACS測定發炎性細胞激素IFN-γ和TNF-α的表現概況。如圖2B中所示，IFN-γ和TNF-α的表現相較於對照Pmel T細胞有增加，這表示外源性mCD160強化腫瘤特異性T細胞的發炎性活性。
也對經CD160修飾Pmel T細胞殺滅腫瘤細胞的能力進行檢驗，並與對照Pmel T細胞相比較。簡言之，用抗CD3和抗CD28珠粒刺激Pmel T細胞，並在具有IL-2的T細胞擴增培養基中培養歷時3天。在第3天，於37℃下加熱目標腫瘤細胞歷時10分鐘，於37℃下用1 μM CELLTRACE™ Violet (Invitrogen)標記歷時30分鐘，然後接種到一個96孔培養盤。對照或經CD160修飾Pmel T細胞以所限定之效應細胞對目標細胞比例被添加至各孔中，接著孵育歷時四到六小時。接而收取目標細胞，用7-胺基放線菌素D (7-AAD, BD Pharmingen)標記，並藉由FACS分析法測定效應T細胞的殺滅。CELLTRACE™ Violet染料+/7-AAD +細胞的群體代表已被殺滅的目標細胞，而CELLTRACE™ Violet染料+/7-AAD-群體代表剩餘的活目標細胞。如圖2C中所示，經CD160修飾Pmel T細胞在共培養時相較於對照T細胞更為強力殺死B16F0黑色素瘤細胞。
綜上所述，結果係證明CD160的異位表現強化了固有的細胞裂解活性、增強發炎性功能並提高抗原特異性T細胞的腫瘤殺滅活性。 實例3：CD160的表現透過Pmel T細胞在小鼠體內強化對B16F0黑色素瘤的控制
為檢驗異位CD160是否能在活體內強化抗原特異性T細胞的腫瘤控制活性，經CD160修飾Pmel T細胞係授受性轉移至帶有皮下B16F0黑色素瘤腫瘤的受體小鼠體內。
具體來說，將1×105 個B16F0細胞皮下注射至6至8週大雌性C57BL/6小鼠中。在授受性細胞轉移之前，將小鼠隨機分組以確保實驗開始時沒有尺寸偏差。在一個實驗中，於植入後第8天，單劑量的0.1、0.2、0.3 或0.4百萬個經CD160修飾Pmel T細胞或0.3百萬個對照Pmel T細胞係授受性轉移到荷瘤小鼠體內(圖3A)。每週兩次透過觸診小鼠來檢查腫瘤形成，並且藉由卡尺測量來測量腫瘤面積。腫瘤面積表示為每組至少5隻小鼠的平均測量值(+/-SEM，雙尾t檢定)。如圖3A中所示，經CD160修飾Pmel顯示對CD160-Pmel T細胞的轉移有反應且在腫瘤控制方面有劑量依賴性效應。
在另外的實驗中，係分析經CD160修飾抗原特異性T細胞和非抗原特異性T細胞的授受性轉移在控制B16F0黑色素瘤腫瘤方面的影響(圖3B)。簡言之，在植入後第8天，將單一劑量之0.3百萬個下列細胞授受性轉移至荷瘤小鼠中：(i)對照Pmel T細胞，(ii)經CD160修飾抗原特異性Pmel T細胞，或(iii)經CD160修飾，非抗原特異性脾臟T細胞。如圖3B中所示，儘管透過非抗原特異性脾臟T細胞在腫瘤控制上只獲得有中度且統計學上不顯著的效應，但CD160的異位表現因為腫瘤特異性Pmel T細胞而顯著提高了腫瘤控制活性。
總之，這些結果證實，於腫瘤特異性T細胞中的異位CD160表現可以在同基因免疫活性小鼠腫瘤模型中強化腫瘤控制。 實例4：經CD160修飾T細胞在沒有IL-2和疫苗接種的情況下即可控制並消除已生成的B16F0黑色素瘤腫瘤
為了檢驗經CD160修飾Pme1 T細胞消除已生成腫瘤的能力，在化學療法預調理後，CD160-Pmel T細胞係授受性轉移至帶有已生成B16F0黑色素瘤腫瘤的小鼠。
簡言之，將1×105 個B16F0細胞皮下注射至6至8週大雌性C57BL/6小鼠中。腫瘤植入後，每天觀察小鼠且一旦有發病徵象之後便犧牲。每週兩次透過觸診小鼠來檢查腫瘤形成，並且藉由卡尺測量來測量腫瘤面積。在授受性細胞轉移之前，將小鼠隨機分組以確保實驗開始時沒有尺寸偏差。從腫瘤植入後第7天開始，以14天的間隔向小鼠輸注Pmel T細胞，在每次輸注T細胞之前先進行環磷醯胺(CYP)調理方案(每次處理100 mg/kg)，但不進行任何疫苗接種和IL-2輸注。平均腫瘤大小在植入後第35天達到高峰。對應繪製標準化的蜘蛛網圖，將在第35天的峰值腫瘤大小標準化為「1」，以說明對應於使用對照Pmel T細胞或經CD160修飾Pmel T細胞處理的腫瘤尺寸相對變化。如圖4A中所示，經CD160修飾Pmel T細胞的授受性轉移在小鼠體內標示接近100%反應率，腫瘤縮小了超過90%的尺寸或在超過80%的小鼠中完全消除。
還測量了透過授受性轉移經CD160修飾Pmel T細胞的生存能力改善。如圖4C中所示，在每兩週一次投予CYP和經CD160修飾Pmel T細胞處理的小鼠中，植入後至多110天觀察到無死亡。相反地，用單獨CYP處理，或用CYP和對照Pme1 T細胞處理的小鼠在植入後75天前便死亡，並且其中位存活期分別為植入後27天或60天。
綜上所述，結果證實，經CYP預調理的經CD160修飾Pmel T細胞授受性轉移可以有效控制並消除已生成的B16F0黑色素瘤腫瘤，且值得注意的是不需要任何IL-2細胞激素或疫苗接種方案。 實例5：經CD160修飾Pmel T細胞對B16F0黑色素瘤的控制為劑量依賴性
為了表徵經CD160修飾Pmel T細胞對於對照B16F0黑色素瘤的劑量依賴性效應，用0.15百萬個或0.3百萬個經CD160修飾Pmel T細胞輸注帶有B16F0的小鼠。
簡言之，將1×105 個B16F0細胞皮下注射至6至8週大雌性C57BL/6小鼠中。腫瘤植入後，每天觀察小鼠且一旦有發病徵象之後便犧牲。每週兩次透過觸診小鼠來檢查腫瘤形成，並且藉由卡尺測量來測量腫瘤面積。在授受性細胞轉移之前，將小鼠隨機分組以確保實驗開始時沒有尺寸偏差。從腫瘤植入後第7天開始，以14天的間隔(每兩週)向小鼠輸注(A) 0.15百萬個或(B) 0.3百萬個經CD160修飾Pmel T細胞，在每次輸注T細胞之前先進行CYP調理方案(每次處理100 mg/kg)。以與實例4中所述類似的方式將蜘蛛網圖標準化並作圖。
在每兩週轉移0.15百萬個經CD160修飾Pmel T細胞的劑量方案下，於受治療小鼠中觀察到腫瘤控制為100%反應率，儘管只有20至30%小鼠其腫瘤尺寸減少超過90% (圖5A)。相比之下，在每兩週轉移0.3百萬個CD160-Pmel T細胞的劑量方案下，於受治療小鼠中觀察到腫瘤縮小為100%反應率，其中約40至50%小鼠展現出腫瘤尺寸減少超過90% (圖5B)。
還在2種劑量下測量經CD160修飾Pmel T細胞授受性轉移的生存能力改善。在兩種劑量下，用經CD160修飾Pmel T細胞處理的荷瘤小鼠均表現出顯著的生存能力改善，於植入後120天，分別用0.15或0.3百萬個經CD160修飾Pmel T細胞處理的小鼠具有80%或100%的生存能力(圖5C)。相反地，用單獨CYP或CYP和對照Pmel T細胞處理的小鼠在90天之前死亡，中位存活期分別為植入後61.5天或56天。
總之，這些結果證實，經CD160修飾Pmel T細胞的授受性轉移與CYP預處理能有效地控制和消除已生成的B16F0黑色素瘤腫瘤，且腫瘤控制作用是劑量依賴性的。 實例6：經CD160修飾Pmel T細胞有效地控制轉移性B16F10黑色素瘤腫瘤的生長
為了檢驗經CD160修飾Pmel T細胞在抑制轉移性腫瘤生長方面的能力，在化學療法預調理之後，CD160-Pmel T細胞係授受性轉移至帶有轉移性B16F10黑色素瘤腫瘤的小鼠。
簡言之，將1×105 個B16F10細胞皮下注射至6至8週大雌性C57BL/6小鼠中。腫瘤植入後，每天觀察小鼠且一旦有發病徵象之後便犧牲。每週兩次透過觸診小鼠來檢查腫瘤形成，並且藉由卡尺測量來測量腫瘤面積。在授受性細胞轉移之前，將小鼠隨機分組以確保實驗開始時沒有尺寸偏差。從腫瘤植入後第7天開始，以14天的間隔(每兩週)向小鼠輸注0.3百萬個經CD160修飾Pmel T細胞，在每次輸注T細胞之前先進行CYP調理方案(每次處理100 mg/kg)。
如圖6A中所示，與未經處理小鼠、僅用CYP化學療法處理的小鼠，或用對照Pmel T細胞與CYP預調理處理的小鼠相比，當與CYP預調理組合時，經CD160修飾Pmel T細胞能夠顯著地抑止平均腫瘤尺寸的增加。腫瘤面積表示為每組至少5隻小鼠的平均測量值(+/-SEM，雙尾t檢定)。圖6B顯示與無處理、僅CYP處理或用對照Pmel T細胞和CYP一起處理相比，經CD160修飾Pmel T細胞(有CYP預調理)有控制個別腫瘤生長的能力。
總之，授受性轉移經CD160修飾Pmel T細胞當與CYP預調理組合時，證明與未經處理小鼠、僅用CYP化學療法處理的小鼠，或用對照Pmel T細胞與CYP預調理處理的小鼠相比更有效地控制皮下腫瘤的生長。
也檢驗經CD160修飾Pmel T細胞對長期腫瘤控制和存活期的改善。以與實例4中類似的方式標準化腫瘤尺寸的蜘蛛網圖。
如圖7A中所示，皮下腫瘤在治療持續時間內可以因為授受性轉移CD160-Pmel T細胞而受到控制或消除。如圖7B中所示，在植入後80天之前，未經處理小鼠、僅以CYP化療處理的小鼠，或以對照Pmel T細胞與CYP預調理處理的小鼠都因為癌轉移而死亡，具有中值存活期分別為植入後39天，39天和59天。相反地，用CD160-Pmel T細胞和CYP預調理處理的小鼠組別在植入後120天(圖7B)以及整個經CD160修飾Pmel T細胞持續輸注期間維持80%生存能力(數據未顯示)。
總之，這些結果證實，經CD160修飾Pmel T細胞除了控制皮下腫瘤的生長以外，也顯示能控制並抑制腫瘤轉移。 實例7：小鼠CD160活化嵌合體之強化腫瘤抑制活性
為了研究CD160的腫瘤抑制活性是否可以利用其他結構域予以調控，將小鼠CD160的細胞外結構域與TCR的細胞內信號傳導結構域及其共刺激途徑(包括CD3ξ、CD28和4-1BB)以各種構型融合，得到CD160活化嵌合體，如圖8A致C中所示。測量了表現這些CD160嵌合體的Pmel T細胞在小鼠體內控制已生成之B16F0黑色素瘤的能力，並將其與表現GPI錨定的小鼠CD160 (mCD160)的能力進行比較。
簡言之，將1×105 個B16F10細胞皮下注射至6至8週大雌性C57BL/6小鼠中。腫瘤植入後，每天觀察小鼠且一旦有發病徵象之後便犧牲。每週兩次透過觸診小鼠來檢查腫瘤形成，並且藉由卡尺測量來測量腫瘤面積。在授受性細胞轉移之前，將小鼠隨機分組以確保實驗開始時沒有尺寸偏差。從腫瘤植入後第7天開始，以14天的間隔(每兩週)向小鼠輸注0.3百萬個分別異位表現mCD160、GEM 123、GEM124、GEM 125、GEM 126、GEM 127或GEM 128的Pmel T細胞，其中在每次輸注T細胞前先進行CYP調理方案(每次處理100 mg/kg)。
如圖8A中所觀察到的，與表現mCD160的Pmel T細胞相比，表現GEM 125 (具有跨膜結構域遠端的CD28信號傳導結構域的嵌合體)的Pmel T細胞所展現出的腫瘤控制較弱；而與表現mCD160的Pmel T細胞相比，表現GEM 124 (具有鄰近跨膜結構域的CD28信號傳導結構域的嵌合體)的Pmel T細胞所展現出的腫瘤控制較強。這些結果表明，與跨膜結構域相鄰的CD28信號傳導結構域可以進一步提高CD160嵌合體強化抗原特異性T細胞免疫反應的能力。
如圖8B中所觀察到的，相較於表現mCD160的Pmel T細胞，表現GEM 127 (具有鄰近跨膜結構域的4-1BB信號傳導結構域的嵌合體)的Pmel T細胞所展現出的腫瘤控制較弱；而相較於表現mCD160的Pmel T細胞，表現GEM 126 (具有鄰近跨膜結構域的CD28信號傳導結構域的嵌合體)的Pmel T細胞所展現出的腫瘤控制較強。這些結果表明，當與跨膜結構域相鄰時，CD28信號傳導結構域而非4-1BB結構域可以進一步提高CD160嵌合體強化抗原特異性T細胞免疫反應的能力。
如圖8C中所觀察到的，相較於表現mCD160的Pmel T細胞，表現GEM 123 (具有鄰近跨膜結構域的CD3ξ信號傳導結構域的嵌合體)的Pmel T細胞所展現出的腫瘤控制較弱。此外，相較於mCD160，儘管帶有鄰近跨膜結構域的CD28信號傳導結構域，GEM 128 (具有三個信號傳導結構域的嵌合體，包括一個在跨膜結構域遠端的CD3ξ結構域)所展現出的腫瘤控制明顯更低。
總之，這些結果表明，當CD28共刺激結構域位於跨膜結構域旁邊時，可以進一步提高CD160嵌合體強化抗原特異性T細胞免疫反應的能力(圖8A、8B中的GEM 124、GEM 126)。然而，CD160強化腫瘤控制的能力可能與經整合的CD3ξ (圖8B、8C中的GEM 123、GEM 127、GEM 128)不相容。 實例8：人類CD160及其變異體在小鼠體內控制已生成的B16F0黑色素瘤方面具有保守功能
為了比較人類CD160變異體與小鼠CD160的腫瘤壓抑活性，測定表現這些對應形式的CD160的Pmel T細胞在小鼠體內控制已生成B16F0黑色素瘤方面的能力。
簡言之，將1×105 個B16F10細胞皮下注射至6至8週大雌性C57BL/6小鼠中。腫瘤植入後，每天觀察小鼠且一旦有發病徵象之後便犧牲。每週兩次透過觸診小鼠來檢查腫瘤形成，並且藉由卡尺測量來測量腫瘤面積。在授受性細胞轉移之前，將小鼠隨機分組以確保實驗開始時沒有尺寸偏差。為了實現CD160分子的異位表現，用帶有GPI錨定小鼠CD160、GPI錨定人類CD160變異體、跨膜人類CD160變異體，或跨膜人類CD160連同細胞內結構域的病毒感染Pmel T細胞。從腫瘤植入後第7天開始，以14天的間隔(每兩週)向小鼠輸注0.3百萬個異位表現所述小鼠或人類CD160變異體的Pmel T細胞，其中在每次輸注T細胞前先進行CYP調理方案(每次處理100 mg/kg)。
如圖10A中所觀察到，相較於表現mCD160的Pmel T細胞，所有表現人類CD160變異體的Pmel T細胞在控制和消除已生成之B16F0黑色素瘤腫瘤方面均展現出更強的活性。特別地，表現GPI錨定人類CD160的Pmel T細胞和表現帶有細胞內結構域的人類CD160的Pmel T細胞在腫瘤控制方面展現出最強的活性。
還測量了因為授受性轉移表現各種CD160變異體的Pmel T細胞的生存能力增進。如圖10B中所示，最強的生存能力改善是由表現GPI錨定人類CD160的Pmel T細胞以及由表現帶有細胞內結構域之人類CD160的Pmel T細胞所提供。
總之，這些結果證實，在小鼠體內控制並消除已生成B16F0黑色素瘤腫瘤方面，人類CD160變異體展示出如同小鼠CD160強化腫瘤特異性T細胞的保守功能，暗示著它們在人類體內控制已生成實體腫瘤方面可能具有相似的功能。 實例9：經CD160修飾LLC TIL在小鼠體內抑制轉移性路易士肺癌(Lewis lung cancer)的生成
為了檢驗經CD160修飾抗原特異性免疫細胞抑制轉移性肺癌生成的能力，係檢驗經CD160修飾腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)於路易士肺癌小鼠模型中在活體外殺滅路易士肺癌的能力，以及其在活體內改善生存能力的能力。
為了得到TIL，從帶有路易士肺癌的小鼠分離肺部腫瘤並仔細切碎成小塊，然後用膠原蛋白酶V在37℃下消化。藉由將已消化的樣品通過70至100 μm細胞過濾器，獲得單細胞懸浮液。若需要的話，以注射器柱塞輕輕擠壓已消化組織，使其穿透細胞過濾器。然後將單細胞懸浮液以接合至藻紅蛋白(PE)的抗TCR β染色，進一步用抗PE磁珠富集，最後在SONY SH800 FACS分選儀上進行分選。如藉由FACS分析法所確定，在所述實驗中使用的經分選TIL純度係高於85%。然後修飾TIL以表現mCD160或CD160嵌合體GEM124 (參見圖8A)。
首先檢驗經CD160修飾TIL殺滅腫瘤細胞的能力，並將其與對照TIL進行比較。簡言之，用抗CD3和抗CD28珠粒刺激TIL，並在具有IL-2的T細胞擴增培養基中培養歷時3天。在第3天，目標腫瘤細胞LLC在37℃下加熱歷時10分鐘，在37℃下用1 μM CELLTRACE™ Violet (Invitrogen)標記歷時30分鐘，然後接種到一個96孔培養盤。對照或經CD160修飾TIL以所限定之效應細胞對目標細胞的比例被添加至各孔中，接著孵育歷時四至六小時。接而收取目標腫瘤細胞，用7-胺基放線菌素D (7-AAD, BD Pharmingen)標記，並藉由FACS分析法來測定任何因為TIL所引起的殺滅。CELLTRACE™ Violet染料+/7-AAD+細胞群體代表已被殺死的目標細胞，而CELLTRACE™ Violet染料+/7-AAD-群體代表剩餘的活目標細胞。
如圖11A中所示，在共培養時，經mCD160修飾TIL比TIL更有力地殺死路易士肺癌細胞。
也檢驗經CD160修飾TIL在活體內抑制轉移性肺癌生成的能力。為了要產生轉移性肺癌模型，將2×105 -2×106 個路易士肺癌細胞(LLC)透過氣管內滴灌直接引入6至8週大雌性C57BL/6小鼠的肺部。在授受性細胞轉移之前，將小鼠隨機分組以確保實驗開始時沒有尺寸偏差。腫瘤植入後第10天開始，以12天的間隔向小鼠輸注0.3百萬個對照TIL或異位表現mCD160或GEM124的TIL，其中每次T細胞輸注之前都要進行CYP調理方案(每次處理100 mg/kg)。原發性皮下腫瘤通常會因為CYP處理方案而獲得控制，但隨後由於肺轉移而導緻小鼠死亡。腫瘤植入後，每天觀察小鼠且一旦有發病徵象之後便犧牲。每週兩次藉由觸診或卡尺測量檢查小鼠的腫瘤形成。一旦腫瘤尺寸達到直徑1.2至1.5 cm或一旦皮膚潰爛，犧牲小鼠並收取腫瘤(圖11B)。
值得注意的是，用表現GEM124的TIL處理的小鼠，在實驗終止時於植入後75天的生存能力為90%，而輸注表現mCD160的TIL的小鼠，其中位存活期為70天。相反地，未受處理的小鼠、僅用CYP處理的小鼠或用對照TIL和CYP處理的小鼠，其中位存活期分別為42、47和47天(圖11C)。
總之，這些結果證實，CD160可以在活體外與活體內強化肺癌TIL的腫瘤控制活性。此外，由於從小鼠肺癌中萃取的TIL基本上是多株的，所以這些結果還指出CD160及其活化嵌合體可以透過這些帶有識別多個腫瘤抗原的TCR的內源性多株抗腫瘤T細胞來強化腫瘤控制能力。 實例10：經CD160修飾人類CAR-T細胞在活體內和活體外展現出改善增生、降低細胞凋亡並提高腫瘤控制
為了確定CD160是否能提高人類CAR-T細胞的功能，對CD19-CAR-T細胞進行修飾以使其過度表現CD160，然後在培養時檢驗其增生能力以及其在活體外與活體內對抗腫瘤的功能活性。
簡言之，將人類T細胞設計成共同表現具有跨膜結構域和細胞質結構域的人類CD160變異體(稱為huCD160TC)，以及用於識別CD19陽性腫瘤細胞上與腫瘤相關的抗原的CD19嵌合抗原受體(CD19-CAR)(圖12A)。也顯示使用慢病毒載體共同表現經由2A肽連接之CD19-CAR和huCD160TC的一個例示性方法(圖12B)。透過用慢病毒轉導人類T細胞產生經CD160修飾CD19-CAR-T細胞(圖12A，12B)，且隨後在培養物中和在腫瘤模型中測試功能增進。
為了檢驗CD160在培養時對人類CAR-T細胞功能增進的能力，對經CD160修飾CD19-CAR-T細胞進行擴增培養，每天記錄其生長速率並與未經CD160修飾CD19-CAR-T細胞進行比較。簡言之，從人類週邊血液分離出T細胞，並使用所述慢病毒載體藉由共同表現CD19-CAR和huCD160TC進行修飾。在培養第一週期間，透過用圖12B中的慢病毒轉導，使個別的T細胞經修飾成表現huCD160TC和CD19-CAR，或修飾成僅表現CD19-CAR。接而在含有適當生長因子的T細胞擴展培養基中培養僅表現CD19-CAR的T細胞，或經CD160修飾-CD19-CAR-T細胞。隨後，為了要測定細胞濃度與生存能力，將細胞用1 μg/ml碘化丙啶染色，與螢光計數珠粒(Spherotech)混合，並在SP6800 Sony Spectral流式細胞儀上進行分析。直接在儀器上或使用FCS Express分析數據，以確定絕對細胞計數以及活細胞和死細胞的百分比。T細胞在兩週長培養期間的擴增程度是藉由合併細胞計數和分裂係數計算，並使用PRISM軟體來繪圖。
如圖13A中所示，具有hu CD160TC過度表現的人類CD19-CAR T細胞比沒有過度表現者更有效地持續擴增。在這個培養系統中，T細胞在第一週期間經歷了活化和感染過程，通常擴增受限。與此相符的過程是，在第一週培養期間的增生差異不太明顯，但在第二週培養期間變得更加明顯。值得注意的是，在培養開始後第14至16天，與未過度表現huCD160TC的對照CAR-T細胞相比，在CD160TC過度表現的情況下人類CD19-CAR T細胞的死細胞百分比顯著更低(如藉由錐蟲藍染色或使用碘化丙啶(propidium iodide，PI)或7AAD進行FACS所確定)(圖13B)。這些結果證實，表現CD160TC的CD19-CAR T細胞展現出較高的增生潛力還有在細胞培養晚期不易發生細胞死亡，因此指出在CAR-T細胞中過度表現CD160可用來提高CAR-T細胞產生。重要的是，表現CD160TC的CD19-CAR T細胞和對照CAR T細胞基本上在培養兩週後便停止增生(數據未顯示)，表示在CAR-T細胞中過度表現CD160並不會導致T細胞擴增失控。
為了檢驗CD160TC過度表現在活體外對於腫瘤因為CD19-CAR-T細胞引起之功能活性增進，評估經CD160修飾CD19-CAR T細胞對CD19陽性腫瘤培養物的細胞裂解功能。簡言之，目標腫瘤細胞Nalm6、或Ramos、或CD19+/K562細胞在37℃下加熱歷時10分鐘，在37℃下用1 μM CELLTRACE™ Violet (Invitrogen)標記歷時30分鐘，然後接種到一個96孔培養盤。對照或經CD160修飾TIL以限定效應對目標細胞比例被添加至各孔中，接而培育歷時24至48小時。接著收取目標細胞，用7-胺基放線菌素D (7-AAD, BD PHARMINGENTM )標記，並藉由FACS分析來測定任何因為效應T細胞所引起的殺滅。CELLTRACE™ Violet染料+/7-AAD+細胞群體代表已被殺死的目標細胞，而CELLTRACE™ Violet染料+/7-AAD-群體代表剩餘的活目標細胞。如圖13C中所示，相較於照CD19-CAR T細胞，共同表現huCD160TC和CD19-CAR的人類T細胞在培養時展現出提高殺滅Ramos細胞(CD19+)。更重要的是，帶有huCD160TC的CD19-CAR T細胞也表現出如細胞內染色和FACS分析所示發炎性細胞激素IFN-γ水平升高(圖13D)。這些結果證實，CD160過度表現在培養時可增強人類CAR-T細胞的發炎性功能和細胞裂解活性。
為了檢驗CD160TC過度表現在活體內對於腫瘤因為CD19-CAR-T細胞引起之功能活性增進，評估經CD160修飾CD19-CAR-T細胞對三重免疫缺陷NCG小鼠(攜帶Nalm6或Ramos腫瘤(CD19陽性腫瘤))的腫瘤控制。將有或沒有CD160修飾的對應CD19-CAR-T細胞授受性轉移至攜帶靜脈內遞送Nalm6/Luc腫瘤的NCG小鼠。具體而言，在腫瘤植入後14、21與28天，每隻小鼠被轉移0.5百萬個經CD160修飾CD19-CAR T細胞或對照CD19-CAR T細胞，並透過測定螢光素酶活性使用Licor成像分析儀觀察對腫瘤生長的影響(圖13E)。對照小鼠未經處理(無)。結果顯示，經CD160修飾-CD19-CAR T細胞在腫瘤控制方面比對照CD19-CAR T細胞明顯更為有效。此外，與未接受CAR-T細胞的對照小鼠相比，在投予的CAR-T細胞劑量下，接受經CD160修飾CD19-CAR T細胞處理的NCG/Ramos模型小鼠展現出明顯的生存能力益處，而對照CD19-CAR-T細胞則沒有(圖13F)。總言之，這些結果證實，CD160表現在活體外與活體內顯著提高了CD19-CAR T細胞在腫瘤控制方面的活性。然而，要指出的是，以上對NCG小鼠進行的分析可能低估CD160於免疫活性人類患者體內增強CAR-T細胞功能的功能，這可能比上述結果所證實的更強。免疫缺陷NCG小鼠不能用來概括免疫活性人類患者體內的穩態和腫瘤固有屏障。鑑於CD160過度表現可以幫助抗原特異性T細胞克服免疫活性小鼠中的特異性壓制性屏障，CD160修飾在免疫活性人類患者體內受到CAR-T細胞同時針對血液癌症和實體腫瘤的控制腫瘤可能有更強作用。 實例11：經CD160修飾人類TCR-T細胞在活體內與活體外展現出改善增生並提高腫瘤控制
為了確定CD160是否能提高人類TCR-T細胞的功能，對1G4-TCR-T細胞進行了修飾以使其過度表現CD160，然後檢驗其在培養時的增生能力以及其在活體外與活體內對抗腫瘤的功能活性。
簡言之，人類T細胞被設計成共同表現具有跨膜結構域和細胞質結構域的人類CD160變異體(稱為huCD160TC)，以及1G4-T細胞受體(1G4-TCR)(一種經臨床驗證可識別NY-ESO-1腫瘤相關抗原之TCR)(圖14A)。也顯示使用慢病毒載體共同表現經由2A肽連接的三個多肽鏈：TCR α鏈、TCR β鏈和huCD160TC的一個例示性方法(圖14B)。透過用慢病毒轉導人類T細胞產生經CD160修飾1G4-TCR-T細胞(圖14A、14B)，且隨後在培養物中和在腫瘤模型中測試功能增進。
在共同表現huCD160TC和1G4-TCR的T細胞和僅表現1G4-TCR的T細胞中均測到1G4-TCR水平。如圖15A中所觀察，1G4TCR-T細胞與人類T細胞中的CD160TC共同表現引起1G4 TCR表現水平略降，如藉由NY-ESO-1四聚體的FACS分析所示。
為了檢驗CD160在TCR-T培養物中對於功能增進的能力，隨後對經CD160修飾1G4-TCR-T細胞進行擴增培養，每天記錄其生長速率並與未經CD160修飾1G4-TCR-T細胞進行比較。簡言之，從人類週邊血液分離的T細胞藉由用圖14B中的慢病毒轉導被修飾成表現huCD160TC和1G4-TCR兩者，或修飾成僅表現1G4-TCR。隨後含有適當生長因子的T細胞擴增培養基中培養僅表現1G4-TCR的T細胞或經CD160修飾1G4-TCR-T細胞。隨後，為了要測定細胞濃度與生存能力，將細胞用1 μg/ml碘化丙啶染色，與螢光計數珠粒(Spherotech)混合，並在SP6800 Sony Spectral流式細胞儀上進行分析。直接在儀器上或使用FCS Express分析數據，以確定絕對細胞計數以及活細胞和死細胞的百分比。T細胞在兩週長培養期間的擴增程度是藉由合併細胞計數和分裂係數計算，並使用PRISM軟體來繪圖。
如圖15B中所示，具有huCD160TC過度表現的人類1G4-TCR T細胞比那些沒有過度表現者更有效地持續擴增。在這個培養系統中，T細胞在第一週期間經歷了活化和感染過程，通常擴增受限。與此相符的過程是，在第一週培養期間的增生差異不太明顯，但在第二週培養變得更加明顯。值得注意的是，在培養開始後第14-16天，與對照TCR-T細胞相比，在CD160TC過度表現的情況下人類1G4 TCR-T細胞的死細胞百分比顯著更低(數據未顯示)，指出表現CD160TC的1G4-TCR-T細胞展現出較高的增生潛力以及在細胞培養晚期不易發生細胞死亡，指出在TCR-T細胞中過度表現CD160可用來提高TCR-T細胞產生。另外，重要的是，表現CD160TC的1G4-TCR-T細胞和對照TCR-T細胞基本上在培養兩週後便停止增生(數據未顯示)，表示在TCR-T細胞中過度表現CD160不會導致T細胞擴增失控。此外，如透過FACS分析所確定的，在1G4 TCR-T細胞中過度表現CD160不會顯著影響具有幹/記憶表型的T細胞百分比(CD45+ /CD62+ )(圖15C)。
為了檢驗CD160過度表現在活體外對於腫瘤因為1G4-TCR-T細胞引起之功能活性增進，評估經huCD160 TC修飾1G4-TCR-T細胞對NY-ESO-1陽性腫瘤的細胞裂解功能，如藉由IFN-γ的細胞內染色和基於FACS的CTL分析所指示。簡言之，目標NY-ESO-1陽性A375腫瘤細胞在37℃下加熱歷時10分鐘，在37℃下用1 μM CELLTRACE™ Violet (Invitrogen)標記歷時30分鐘，然後接種到一個96孔培養盤。對照或經CD160修飾1G4TCR-T細胞以所限定之效應細胞對目標細胞的比例被加入至各孔中，然後孵育歷時24至48小時。之後收取目標細胞，用7-胺基放線菌素D (7-AAD, BD PHARMINGENTM )標記，並藉由FACS分析來測定任何因為效應T細胞所引起的殺滅。CELLTRACE™ Violet染料+/7-AAD+細胞群體代表已被殺死的目標細胞，而CELLTRACE™ Violet染料+/7-AAD-群體代表剩餘的活目標細胞。如圖15D中所示，相較於未過度表現huCD160TC的對照1G4-TCR-T細胞，共同表現huCD160TC和1G4-TCR兩者的人類T細胞被認為在培養時更有效地殺滅NY-ESO-1陽性A375細胞。更重要地，過度表現huCD160TC的1G4-TCR-T細胞也展現出如細胞內染色和FACS分析所示發炎性細胞激素IFN-γ水平升高(圖15E)。這些結果證實，CD160過度表現在培養時可增強人類CAR-T細胞的發炎性功能和細胞裂解活性。
為了檢驗CD160TC過度表現於活體內對於腫瘤因為1G4-TCR-T細胞引起之功能活性增進，也評估經CD160修飾1G4-TCR-T細胞對帶有A375黑色素瘤腫瘤(NY-ESO-1-陽性腫瘤)的NCG小鼠的腫瘤控制。將有或沒有CD160修飾的對應CD19-CAR-T細胞授受性轉移至帶有皮下NY-ESO-1陽性A375黑色素瘤腫瘤的NCG小鼠。具體而言，在腫瘤皮下植入後14、21與28天，每隻小鼠被轉移1百萬個經CD160修飾CD19-CAR T細胞或對照CD19-CAR T細胞，並使用卡尺透過腫瘤尺寸測量來觀察對腫瘤生長的影響(圖15F)。對照小鼠未經處理(無)。如圖15F中所示，經CD160修飾1G4-TCR-T細胞在腫瘤控制方面比對照1G4-TCR-T細胞更明顯有效。總之，這些結果證實，CD160過度表現在活體內與活體外提高1G4 TCR-T細胞於腫瘤控制方面的活性。
然而，要指出的是，以上分析可能低估CD160於免疫活性人類患者體內增強CAR-T細胞功能的功能，這可能比上述結果所證實的更強烈。NCG小鼠為免疫缺陷型且不能用來概括免疫活性人類患者體內存在的穩態和腫瘤固有屏障。鑑於CD160過度表現可以幫助抗原特異性T細胞克服免疫活性小鼠中的特異性抑制性屏障，CD160修飾在免疫活性人類患者體內受到人類TAR-T細胞同時針對血液癌症和實體腫瘤的控制腫瘤可能有更強作用。 實例12：經CD160修飾人類TIL在活體內與活體外展現出提高腫瘤控制
為了確定CD160是否可以提高人類TIL的功能，自體TIL係經修飾以使其過度表現CD160，然後檢驗其在活體外與活體內對抗腫瘤的功能活性。
產生來自患者的異種移植(PDX)模型以檢驗CD160在腫瘤控制方面對人類TIL的影響。植入從帶有不同癌症(諸如肺癌、食道癌、結腸癌、胃癌、胰臟癌)的癌症患者所切下的腫瘤組織，並在NSG免疫缺陷型小鼠中繼代以產生帶有人類腫瘤的PDX模型。自體TIL是分離自肺癌、食道癌、結腸癌、胰臟癌、胃癌和其他癌症的對應腫瘤，予以擴增並冷凍保存，以供進行CD160修飾和在PDX模型中藉由TIL進行功能測試。
產生經CD160修飾TIL以確定CD160是否可以提高人類TIL的功能(圖16)。為此，人類患者的TIL被設計成過度表現huCD160TC (圖17A)。顯示使用慢病毒載體過度表現經由2A肽連接的huCD160TC和GFP標記的例示性方法(圖17B)。接著藉由使用慢病毒轉導人類T細胞產生經CD160修飾TIL (圖17A、17B)，隨後在培養物中以及帶有自體腫瘤的PDX腫瘤模型中測試功能增進。
為了檢驗CD160TC過度表現在活體外對於腫瘤因為人類TIL引起之功能活性增進，藉由使用基於FACS的CTL分析評估經CD160修飾人類TIL對於PDX模型之自體腫瘤細胞的細胞裂解功能。簡言之，自體食道腫瘤細胞在37℃下加熱歷時10分鐘，在37℃下用1 μM CSFE染料 (Invitrogen)標記歷時30分鐘，然後接種到一個96孔培養盤中。對照或經CD160修飾TIL以所限定之效應細胞對目標細胞之比例被添加各孔中，然後孵育歷時24小時。之後收取目標細胞，用7-胺基放線菌素D (7-AAD, BD PharmingenTM )標記，並藉由FACS分析來確定任何因為效應T細胞所引起的殺滅。CSFE染料+/7-AAD+細胞群體代表已被殺死的目標細胞，而CSFE染料+/7-AAD-群體代表剩餘的活目標細胞。如圖18A中所示，相較於未過度表現huCD160TC的對照人類TIL，過度表現huCD160TC的人類TIL被發現到在培養時更有效地殺滅自體食道癌細胞。
為了檢驗CD160TC過度表現在活體內對於腫瘤因為人類TIL引起之功能活性提高，也評估了經CD160修飾人類TIL對帶有皮下自體腫瘤的NCG小鼠發揮的腫瘤控制。將有或沒有經CD160修飾的對應人類TIL授受性轉移至帶有皮下自體食道腫瘤的NCG小鼠。具體而言，在腫瘤腫瘤皮下植入後7、14和21天，每隻小鼠被轉移了1百萬個經CD160修飾TIL或對照TIL，並使用卡尺透過腫瘤尺寸測量來觀察對腫瘤生長的影響(圖18B)。對照小鼠投予PBS (無)。圖18B中所示，經CD160修飾TIL在腫瘤控制方面比對照TIL明顯更有效。綜合來說，這些結果證實，CD160過度表現明顯提高TIL展現在活體外與活體內展現腫瘤控制的活性。
無
圖1A顯示如藉由FACS所分析者，小鼠CD160在Pmel T細胞中相較於對照Pmel T細胞的異位表現。圖1B顯示與對照相比，經外源性CD160修飾之Pmel T細胞的CD160染色螢光強度中位值(median fluorescence intensity，MFI)。
圖2A顯示如藉由細胞內染色和FACS分析所測定者，外源性CD160的表現對於T細胞中之顆粒酶A和穿孔素量的影響。圖2B顯示如藉由細胞內染色和FACS分析所測定者，外源性CD160的表現對於T細胞中之INF-γ和TNFα量的影響。圖2C顯示當與B16F0黑色素瘤腫瘤細胞共培養時，經對照病毒或CD160病毒所感染之Pmel T細胞其細胞裂解活性分析。
圖3A顯示投予對照Pmel T細胞(對B16F0中的腫瘤抗原具有特異性的T細胞)或0.1、0.2、0.3或0.4百萬個經CD160修飾Pmel T細胞，對帶有B16F0的小鼠其腫瘤尺寸的影響。圖3B顯示投予對照Pmel T細胞、經CD160修飾脾臟T細胞(對B16F0抗原不具特異性)以及經CD160修飾Pmel T細胞，對帶有B16F0的小鼠其腫瘤尺寸的影響。
圖4A顯示投予環磷醯胺(CYP)預調理和(a)對照Pmel T細胞；或(b)經CD160修飾Pmel T細胞，帶有B16F0的小鼠其腫瘤尺寸的相對變化。圖4B顯示在不同時間點，用經CD160修飾Pmel T細胞處理的代表性小鼠其生長曲線和選出的腫瘤圖像。圖4C顯示投予CYP預調理和(a)對照Pmel T細胞；或(b)經CD160修飾Pmel T細胞，帶有B16F0黑色素瘤的小鼠其卡普蘭-邁爾(Kaplan-Meier)存活分析。
圖5A顯示投予CYP預調理和(a)PBS；(b) 0.15百萬個對照Pmel T細胞；或(c) 0.15百萬個對照經CD160修飾Pmel T細胞，帶有B16F0的小鼠其腫瘤尺寸的相對變化。圖5B顯示投予CYP預調理和(a)PBS；(b) 0.3百萬個對照Pmel T細胞；或(c) 0.3百萬個對照經CD160修飾Pmel T細胞，帶有B16F0的小鼠其腫瘤尺寸的相對變化。圖5C顯示投予CYP預調理和(a)PBS；(b)對照Pmel T細胞；(c) 0.15百萬個對照經CD160修飾Pmel T細胞；或(d) 0.3百萬個對照經CD160修飾Pmel T細胞，帶有B16F0黑色素瘤的小鼠其卡普蘭-邁爾存活分析。
圖6A顯示未經處理或投予CYP預調理和(a)PBS；(b)對照Pmel T細胞；或(c)經CD160修飾Pmel T細胞，對帶有轉移性B16F10的小鼠其平均腫瘤尺寸的影響。圖6B顯示未經處理或投予CYP預調理和(a)PBS；(b)對照Pmel T細胞；或(c)經CD160修飾Pmel T細胞，對帶有轉移性B16F10的小鼠其個別腫瘤尺寸的影響。
圖7A顯示投予CYP預調理和(a)對照Pmel T細胞；或(b)經CD160修飾Pmel T細胞，帶有B16F10的小鼠其腫瘤尺寸的相對變化。圖7B顯示投予CYP預調理和(a)PBS；(b)對照Pmel T細胞；或(c)經CD160修飾Pmel T細胞，帶有B16F10黑色素瘤的小鼠其卡普蘭-邁爾存活分析。
圖8A至C顯示（由左至右）投予CYP預調理和PBS、經mCD160修飾Pmel T細胞或經如圖所示之CD160嵌合體(圖8A中的GEM 124、125；圖8B中的GEM 126、127；圖8C中的GEM 123、128)中之一者所修飾的Pmel T細胞，對帶有B16F0的小鼠其腫瘤尺寸的相對變化。
圖9A是示意圖，從左到右顯示GPI錨定的mCD160、GPI錨定的hCD160同功型、跨膜hCD160同功型，和含有細胞內結構域的跨膜hCD160同功型。圖9B顯示小鼠和人類CD160同功型之間的核苷酸序列和保守程度。
圖10A顯示投予CYP預調理和(a)對照Pmel T細胞(VECTOR)；或(b)分別經外源性GPI錨定的mCD160、GPI錨定的hCD160同功型、跨膜hCD160同功型或含有細胞內結構域的跨膜hCD160同功型修飾之Pmel T細胞，對帶有B16F0的小鼠其腫瘤尺寸的相對變化。圖10B顯示投予CYP預調理和(a)對照Pmel T細胞(VECTOR)；或(b)分別經GPI錨定的hCD160同功型、跨膜hCD160同功型或含有細胞內結構域的跨膜hCD160同功型修飾之Pmel T細胞，對帶有B16F0的黑色素瘤小鼠其t卡普蘭-邁爾存活分析。
圖11A顯示當與路易士肺癌(LLC)細胞共培養時，經對照病毒或mCD160病毒感染之從LLC萃取的腫瘤浸潤性T細胞(TIL)其細胞裂解活性分析。圖11B顯示經外源性CD160或CD160嵌合體(GEM 124)修飾之LLC TIL對LLC腫瘤控制能力的活體內實驗的代表性示意圖。圖11C顯示未經處理或投予CYP預調理和(a) PBS；(b)對照TIL；(c)經mCD160修飾TIL；或(d)經CD160嵌合體GEM124修飾TIL，帶有LLC的小鼠其卡普蘭-邁爾存活分析。
圖12A顯示代表過度表現人類CD160或其變異體(諸如CD160TC)的CD19-CAR-T細胞的示意圖。圖12B顯示被設計成過度表現人類CD160或其變異體與識別腫瘤特異性抗原(諸如CD19)之CAR的慢病毒載體構型。
圖13A顯示過度表現huCD160TC的CD19-CAR-T細胞相對於未過度表現CD160的CD19-CAR-T細胞(野生型CD19-CAR-T)的增生情況。圖13B顯示培養2週後，過度表現huCD160TC的CD19-CAR-T細胞相對於野生型CD19-CAR-T 細胞的生存能力。圖13C顯示在各種效應細胞對目標細胞(E：T)之比例下，過度表現huCD160TC的CD19-CAR-T細胞相對於野生型CD19-CAR-T細胞其細胞裂解活性分析。圖13D顯示過度表現huCD160TC的CD19-CAR-T細胞相對於野生型CD19-CAR-T細胞的IFN-g產生。圖13E展示形貌圖，顯示投予：(a)沒有CAR-T細胞(無)；(b)對照CD19-CAR-T細胞(19CAR)或(c)過度表現huCD160TC (CD160TC 19CAR)的CD19-CAR-T細胞，帶有Nalm6腫瘤的小鼠其腫瘤尺寸。圖13F顯示投予(a)沒有CAR-T細胞(-)；(b)野生型CD19-CAR-T細胞或(c)過度表現huCD160TC (CD160TC)之CD19-CAR-T細胞，帶有Ramos腫瘤的小鼠其卡普蘭-邁爾存活分析。
圖14A顯示表示過度表現人類CD160或其變異體(諸如huCD160TC)的NY-ESO-1特異性TCR-T細胞的示意圖。圖14B顯示被設計成過度表現人類CD160或與其變異體與識別腫瘤特異性抗原之TCR (諸如NY-ESO-1特異性TCR)的慢病毒載體構型。
圖15A展示FACS分析結果，其顯示如藉由四聚體分析的野生型1G4-TCR-T細胞和表現huCD160TC的1G4-TCR-T細胞的NY-ESO-1特異性1G4-TCR位準。圖15B顯示過度表現huCD160TC的1G4-TCR-T細胞相對於未過度表現CD160的1G4-TCR-T細胞(野生型1G4-TCR-T)的增生。圖15C顯示野生型1G4-TCR-T細胞和表現huCD160TC的1G4-TCR-T細胞中的幹/記憶T細胞百分比。圖15D顯示在各種效應細胞對目標細胞(E：T)之比例下，過度表現huCD160TC的1G4-TCR-T細胞相對於野生型1G4-TCR-T細胞的細胞裂解活性分析。圖15E顯示過度表現huCD160TC的1G4-TCR-T細胞相對於野生型1G4-TCR-T細胞的IFN-g產生。圖15F顯示投予：(a)沒有TCR-T細胞(無)；(b)對照1G4-TCR-T細胞或(c)過度表現huCD160TC的1G4-TCR-T細胞，帶有A375黑色素瘤的小鼠其腫瘤尺寸。
圖16顯示在來自患者之異種移植(PDX)小鼠腫瘤模型中，自體TIL療法的實驗示意圖。植入從患有不同癌症(諸如肺癌、食道癌、結腸癌、胃癌或胰臟癌)的患者所切下的腫瘤組織，並在NSG免疫缺陷型小鼠中繼代，以產生帶有人類腫瘤的PDX模型。從切除的腫瘤中萃取自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，以進行CD160修飾，並隨後在PDX模型中對自體人類腫瘤進行功能測試。
圖17A顯示代表過度表現人類CD160或其變異體(諸如huCD160TC)的抗腫瘤TIL的示意圖。圖17B顯示用於過度表現人類CD160或其變異體，以及作為共表現報導子之GFP的慢病毒載體構型。
圖18A顯示在各種效應細胞對目標細胞(E：T)之比例下，過度表現huCD160TC (CD160TC)的腫瘤特異性TIL相對於未過度表現CD160的相應TIL (無；載體)其細胞裂解活性分析。圖18B顯示投予：(a)未過度表現CD160的TIL (無)；或(c)過度表現huCD160TC的TIL，帶有自體食道腫瘤的小鼠其腫瘤尺寸。GEM表示由對應TIL表現的遺傳增強修飾子。
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Claims (49)

  1. 一種經修飾抗原特異性免疫細胞，在其表面上包含外源性CD160蛋白，其中相較於未包含有外源性CD160蛋白的前體抗原特異性免疫細胞，該外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中免疫細胞是T細胞。
  2. 如請求項1之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中該經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：細胞毒性αβT細胞、γδ T細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞，經抗原呈獻細胞(APC)活化的抗腫瘤T細胞以及自然殺手T細胞(NK-T細胞)。
  3. 如請求項1之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。
  4. 如請求項2之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。
  5. 如請求項1之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T（NK-T like）細胞，γδT細胞和巨噬細胞。
  6. 如請求項1至5中任一項之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的變異體。
  7. 如請求項1至5中任一項之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白是膜結合的。
  8. 如請求項7之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白：(a)經由GPI連接子結合至膜；或(b)包含跨膜結構域。
  9. 如請求項8之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白進一步包含細胞內結構域。
  10. 如請求項9之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中細胞內結構域包含細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域係衍生自TCR複合體的信號傳導次單位。
  11. 如請求項7之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中外源性CD160蛋白經由免疫細胞結合部分結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。
  12. 如請求項11之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中免疫細胞結合部分係結合至免疫細胞的表面分子。
  13. 如請求項1至12中任一項之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中經修飾抗原特異性免疫細胞進一步包含功能性外源性受體。
  14. 如請求項13之經修飾抗原特異性免疫細胞，其中功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)。
  15. 一種產生在其表面上包含外源性CD160蛋白之經修飾抗原特異性免疫細胞的方法，該方法包含： 使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白或編碼該外源性CD160蛋白的第一核酸接觸，從而產生經修飾抗原特異性免疫細胞， 其中，相較於前體抗原特異性免疫細胞，該外源性CD160蛋白係導致經修飾抗原特異性免疫細胞的上調，其中免疫細胞是T細胞。
  16. 如請求項15之方法，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是選自由以下組成之群組：細胞毒性αβT細胞、γδ T細胞、輔助T細胞，腫瘤浸潤性T細胞，經APC活化的抗腫瘤T細胞和自然殺手T細胞(NK-T細胞)。
  17. 如請求項15之方法，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是細胞毒性T細胞。
  18. 如請求項16之方法，其中經修飾抗原特異性免疫細胞是腫瘤浸潤性T細胞或經APC活化的抗腫瘤T細胞。
  19. 如請求項16之方法，其中免疫細胞是選自由以下組成之群組：自然殺手(NK)細胞、自然殺手T細胞(NK-T細胞)、iNK-T細胞、類自然殺手T細胞、γδT細胞和巨噬細胞。
  20. 如請求項15至19中任一項之方法，其中該方法包含使前體抗原特異性免疫細胞與外源性CD160蛋白接觸。
  21. 如請求項20之方法，其中外源性CD160蛋白包含免疫細胞結合部分，該免疫細胞結合部分係合至免疫細胞之表面分子。
  22. 如請求項15至19中任一項之方法，其中該方法包含將編碼該外源性CD160蛋白的核酸導入前體抗原特異性免疫細胞。
  23. 如請求項15至22中任一項之方法，其中CD160蛋白包含SEQ ID NO：1至4中任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：1至4中任一者具有至少約90%同一性的變異體。
  24. 如請求項15至23中任一項之方法，其中外源性CD160蛋白是膜結合的。
  25. 如請求項24之方法，其中外源性CD160蛋白：(a)經由GPI連接子結合至膜；或(b)包含跨膜結構域。
  26. 如請求項24之方法，其中外源性CD160蛋白經由免疫細胞結合部分結合至經修飾抗原特異性免疫細胞。
  27. 如請求項26之方法，其中免疫細胞結合部分係結合至免疫細胞的表面分子。
  28. 如請求項15至27中任一項之方法，其中前體抗原特異性免疫細胞包含編碼功能性外源性受體的第二核酸。
  29. 如請求項15至27中任一項之方法，其進一步包含使前體抗原特異性免疫細胞與編碼功能性外源性受體的第二核酸接觸。
  30. 如請求項28或29之方法，其中功能性外源性受體是經改造的T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)。
  31. 如請求項29或30之方法，其中第一核酸和第二核酸係可操作地連接於相同的啟動子。
  32. 如請求項29至31中任一項之方法，其中第一核酸和第二核酸係在同一個載體上。
  33. 如請求項15至32中任一項之方法，進一步包含分離或富集包含有第一及/或第二核酸的免疫細胞。
  34. 如請求項15至33中任一項之方法，進一步包含將表現CD160的經修飾抗原特異性免疫細胞與至少一種醫藥上可接受的載劑進行調配。
  35. 一種經修飾抗原特異性免疫細胞，其是藉由請求項15至34中任一項之方法獲得。
  36. 一種醫藥組成物，其包含請求項1至14和35中任一項的經修飾抗原特異性免疫細胞，以及醫藥上可接受的載劑。
  37. 一種治療個體中疾病的方法，包含向個體投予有效量之請求項1至14與35中任一項的經修飾抗原特異性免疫細胞或如請求項36之醫藥組成物。
  38. 如請求項37之方法，其中經修飾抗原特異性免疫細胞衍生自該個體。
  39. 一種治療個體中疾病的方法，包含向該個體投予有效量的外源性CD160蛋白或編碼外源性CD160蛋白的核酸，其中該外源性CD160蛋白包含結合部分，該結合部分係識別個體中免疫細胞上之表面分子。
  40. 如請求項37至39中任一項之方法，其中疾病是癌症。
  41. 如請求項40之方法，其中癌症選自由以下組成之群組：黑色素瘤、肺癌、食道癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、腦癌、卵巢癌。
  42. 如請求項38至41中任一項之方法，其中個體是人類。
  43. 一種於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160之內源性免疫刺激活性的方法，包含使抗原特異性免疫細胞與有效量的藥劑接觸，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160之免疫刺激活性。
  44. 一種於抗原特異性免疫細胞中活化CD160之免疫刺激活性的方法，包含使抗原特異性免疫細胞與有效量的藥劑接觸，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160之免疫刺激活性。
  45. 如請求項44之方法，其中該方法係於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性，且其中該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中提高CD160的內源性免疫刺激活性。
  46. 一種治療個體中免疫疾病的方法，包含向個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中調控CD160的內源性免疫刺激活性。
  47. 如請求項46之方法，其中該免疫疾病是自體免疫疾病或發炎性疾病，且其中該藥劑於抗原特異性免疫細胞中抑制CD160的內源性免疫刺激活性。
  48. 一種治療個體中癌症的方法，包含向個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。
  49. 一種治療個體中感染的方法，包含向該個體投予治療有效量的藥劑，該藥劑係於抗原特異性免疫細胞中活化CD160的免疫刺激活性。
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