CN113613664A - 在抗原特异性免疫细胞中调节cd160功能的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了表达外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体，比如工程化的TCR或CAR。本发明还提供了调节抗原特异性免疫细胞中CD160活性的方法。本发明还提供了使用本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞和CD160活性的调节剂治疗癌症的方法和药物组合物。

Description

在抗原特异性免疫细胞中调节CD160功能的方法及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月1日提交的美国临时申请号62/812,897的权益，其每篇的整体内容通过引用并入本文。
以ASCII文本文件提交序列表
以下提交的ASCII文本文件的内容以其整体通过引用并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：756592000240SEQLIST.TXT，记录日期：2020年2月24日，大小：17KB)。
技术领域
本发明涉及调节抗原特异性免疫细胞中CD160功能的方法及其用途，抗原特异性免疫细胞包括天然和工程化的抗原特异性αβT细胞以及其他免疫细胞，比如具有或不具有工程化的抗原识别的天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T-like细胞、γδT细胞和巨噬细胞。本发明还涉及表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞，及其用于调节抗原特异性免疫细胞在治疗癌症中的功能的方法。
背景技术
T细胞是天然的药物，其可保护我们的身体免受感染和癌症。值得注意的是，靶向肿瘤的T细胞可以通过检查点阻断和嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法有效地重新接合(re-engage)以治疗癌症患者。这些免疫疗法的成功明确地表明T细胞对癌症治疗非常有效，激发了探索多种方法来激活并且使T细胞对抗癌症的。在过去的半个世纪里，开拓性的研究人员和临床医生已经探索靶向肿瘤的T细胞的过继转移来治疗人实体瘤。包括体外激活的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、携带识别肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的特异性T细胞受体(TCR)的T细胞(TCR-T)和源自装载肿瘤抗原的树突状细胞的T细胞(DC-T)的多种靶向肿瘤的T细胞进行测试并且在临床前模型和人患者中显示出有希望的功效。最近，识别来自突变的癌细胞的新抗原的T细胞被用于肺癌和乳腺癌的过继性T细胞疗法，并且在一些情况下显示出功效。然而，即使借助其他疗法，比如放射、疫苗接种、化学疗法和抗肿瘤细胞因子IL-2的共同输注，也难于以靶向肿瘤的T细胞的过继转移来可重复地实现实体瘤的持续控制和消除。
通过输注的靶向肿瘤的T细胞控制的肿瘤的相对低的应答率和最终损失可归因于T细胞的多种内在和外在屏障。这些屏障起源于内衡免疫耐受机制以及肿瘤诱导的免疫抑制机制。值得注意的是，这些耐受力造成了阻止T细胞有效控制肿瘤的屏障。例如，受涉及正负胸腺选择的中枢耐受机制控制的天然存在的抗肿瘤T细胞通常具有针对未突变的肿瘤抗原或肿瘤相关抗原具有低或中等亲和力的T细胞受体(TCR)。此外，发育的肿瘤可降低I类和II类主要组织相容性复合体(MHC)分子的表达，并且实际上限制了肿瘤抗原在肿瘤细胞上的呈递，并且从而限制了以同源TCR通过T细胞的识别。该领域的许多努力都致力于克服这些屏障，并且具有不同程度的成功。CAR可以有效地使T细胞接合肿瘤细胞，并且有助于克服T细胞对肿瘤识别的不足或损失。惊人地，靶向CD19或BCMA抗原的CAR-T细胞可分别消除B细胞白血病/淋巴瘤或多发性骨髓瘤。其他方法聚焦于经由体外进化通过提高肿瘤特异性TCR的亲和力或通过选择识别新抗原的TCR来克服识别屏障，从而适度提高功效。
虽然这些策略显示出前景，但为了使靶向肿瘤的T细胞能够消除或持续控制已建立的肿瘤，必须克服除抗原识别之外的另外屏障。值得注意的是，冷肿瘤—肿瘤内缺乏激活的T细胞—与预后不良和对免疫疗法的低反应性相关。据推测，除了肿瘤微环境中的许多其他未知因素外，检查点抑制、T细胞特异性化学引诱物的关闭、不利的营养和缺氧导致的T细胞耗竭也可有助于冷肿瘤现象。探索了多种基因工程化策略以增强肿瘤中的T细胞运输(trafficking)和激活。肿瘤特异性T细胞中趋化因子受体或识别VEGFR的CAR的异位表达显示出通过转移的T细胞增加肿瘤控制。此外，肿瘤特异性T细胞中的负向T细胞调节剂，比如PD-1或CBLB或腺苷2A受体的失活导致T细胞的抗肿瘤功能的增强。有趣地，增强线粒体生物发生和氧化磷酸化的信号，比如PGC1α或OPA1或携带CD278信号传导结构域的CAR的异位表达，也可以增加转移的T细胞的抗肿瘤功能。虽然肿瘤控制中的T细胞功能可通过不同的分子和细胞过程加强，但这些策略通常不足以通过T细胞能够进行持续的肿瘤控制或消除已建立的肿瘤，因此寻找可用于改编靶向肿瘤的T细胞的分子，以持续控制和消除实体瘤是重要的。
CD160是27kDa糖蛋白，它最初是用单克隆抗体BY55在人天然杀伤细胞上鉴定的(
Figure BDA0003238294980000031
等，1993，J Exp Med..178(3):1121-6)。后来，CD160的主要形式是糖基-磷脂酰肌醇(GPI)锚定的免疫球蛋白(Ig)样细胞膜受体，其在主要CD16+NK细胞子集、NK-T细胞、γδ-T细胞、CD4 T细胞的一些子集和CD8+溶细胞T细胞上以及激活的内皮细胞中发现(LeBouteiller等，2011，Immunol Lett.,138(2):93-6)。人CD160的cDNA序列编码具有单个Ig样结构域的181个氨基酸的富含半胱氨酸的、糖基磷脂酰肌醇锚定的蛋白质。随后，已鉴定出具有跨膜结构域和/或缺乏细胞外Ig样结构域的其他同种型。CD160在细胞表面表达为紧密地二硫键连接的多聚体。CD160是HVEM的配体，并且CD160与HVEM的结合导致T细胞抑制和无反应性(Cai等，2009，Nat Immunol.，9(2):176–185)。CD160通常与抗PD-1抗体一起被认为是具有抗癌症活性的免疫检查点抑制剂(Stecher等，2017，Front Immunol.，8:572)。已经建议CD160与BTLA(CD272)竞争结合至HVEM(Kojima等，2011，J Mol Biol.，413(4):762-72)。NK细胞和一些人T细胞子集上的鼠和人CD160对MHC Ia类和Ib类具有低的亲和力，并且可在NK和T细胞激活中起作用(Maeda等，2005，J Immunol.，175(7):4426-32；Agrawal等，1999，J Immunol.,162(3):1223-6)。CD160也由内皮细胞表达，并且已被提议作为人类病理性眼部和肿瘤新血管生成的情况下潜在新靶标，所述人类病理性眼部和肿瘤新血管生成对现有的抗血管生成药物没有应答或变得抗性(Chabot等，2011，J Exp Med.，208(5):973-86)。小鼠中CD160功能丧失分析显示出CD160对NK-介导的IFN-γ产生至关重要，但对NK细胞的溶细胞活性是不重要的，并且显然不需要T淋巴细胞发育和功能(Tu等，2015，J ExpMed.，212(3):415-29)。迄今为止，还没有公开的证据显示在控制和消除已建立的肿瘤方面CD160对抗原特异性T细胞的作用。
本文中提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。
发明内容
本申请提供了在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，及其用于治疗癌症的方法。本发明还提供了调节抗原特异性免疫细胞中CD160活性的方法。
本申请的一个方面提供了在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、抗原呈递细胞(APC)-激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，APC激活的抗肿瘤T细胞是树突细胞(DC)-激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的其变体。
在根据以上所述的任何一种修饰的抗原特异性免疫细胞的一些实施方式中，外源CD160蛋白质是膜结合的。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质经GPI连接体结合至膜。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分结合至免疫细胞的表面分子。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括跨膜结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质进一步包括细胞内结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质进一步包括来自CD160剪接变体的细胞内结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括源自TCR复合物的信号传导亚单位的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，TCR复合物的信号传导亚单位选自由以下组成的组中：CD3γ、CD3δ和CD3ε。
在根据以上所述的任何一种修饰的抗原特异性免疫细胞的一些实施方式中，外源CD160蛋白质是膜结合的并且包括细胞内结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或二者。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括初级信号传导结构域。在一些实施方式中，初级信号传导结构域包括CD3ζ结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域不包括初级信号传导结构域。
在根据以上所述的任何一种修饰的抗原特异性免疫细胞的一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。
本申请的一个方面提供了产生在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，其包括：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，APC激活的抗肿瘤T细胞是DC-激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。
在根据以上所述的任何一种产生方法的一些实施方式中，方法包括将前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质接触。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括结合至免疫细胞的表面分子的免疫细胞结合部分。在一些实施方式中，产生方法包括将编码外源CD160蛋白质的核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，核酸是mRNA。在一些实施方式中，核酸是DNA。在一些实施方式中，通过转染将核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，通过转导或电穿孔将核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的其变体。
在根据以上所述的任何一种产生方法的一些实施方式中，外源CD160蛋白质是膜结合的。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质经GPI连接体结合至膜。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分结合至免疫细胞的表面分子。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括跨膜结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质进一步包括细胞内结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质进一步包括来自CD160剪接变体的细胞内结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括源自TCR复合物的信号传导亚单位的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，TCR复合物的信号传导亚单位选自由以下组成的组中：CD3γ、CD3δ和CD3ε。
在根据以上所述的任何一种产生方法的一些实施方式中，外源CD160蛋白质是膜结合的并且包括细胞内结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或二者。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括初级信号传导结构域。在一些实施方式中，初级信号传导结构域包括CD3ζ结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域不包括初级信号传导结构域。
在根据以上所述的任何一种产生方法的一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞包括编码功能性外源受体的第二核酸。在一些实施方式中，产生方法进一步包括使前体抗原特异性免疫细胞与编码功能性外源受体的第二核酸接触。在一些实施方式中，功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至相同的启动子。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至单独的启动子。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸在相同的载体上。在一些实施方式中，第一核酸和/或第二核酸在单独的载体上。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体选自由以下组成的组中：腺病毒载体、腺相关的病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、附加型载体表达载体、单纯性疱疹病毒载体及其衍生物。在一些实施方式中，载体是非病毒载体。
在根据以上所述的任何一种产生方法的一些实施方式中，方法进一步包括分离或富集包括第一和/或第二核酸的免疫细胞。在一些实施方式中，方法进一步包括将表达CD160的修饰的抗原特异性免疫细胞与至少一种药学上可接受的载体配制。
还提供了通过根据以上所述的任何一种产生方法的方法产生的修饰的抗原特异性免疫细胞。
进一步提供了药物组合物，其包括根据以上所述的任何一种修饰的免疫细胞的修饰的抗原特异性免疫细胞，和药学上可接受的载体。
本申请的另一方面提供了治疗个体中的疾病的方法，其包括向个体施用有效量的根据以上所述的任何一种修饰的抗原特异性免疫细胞的修饰的抗原特异性免疫细胞或根据以上所述的任何一种药物组合物的药物组合物。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞源自个体。本申请的还另一方面提供了治疗个体中的疾病的方法，其包括向个体施用有效量的外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸，其中外源CD160蛋白质包括识别个体中免疫细胞上的表面分子的结合部分。
在根据以上所述的任何一种治疗方法的一些实施方式中，施用是瘤内施用。在一些实施方式中，施用是施用入淋巴结。在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是实体瘤。在一些实施方式中，癌症是转移癌症。在一些实施方式中，癌症选自由以下组成的组中：黑素瘤、肺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、脑癌、卵巢癌。在一些实施方式中，个体是人。
本发明的一个方面提供了激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的方法，其包括将抗原特异性免疫细胞与有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂接触。在一些实施方式中，方法包括增强抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性，并且其中试剂增强抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。
本发明的一个方面提供了治疗个体中免疫学疾病的方法，包括向个体施用治疗有效量的调节抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性的试剂。在一些实施方式中，免疫学疾病是自身免疫性疾病或炎症性疾病，并且试剂抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。
本发明的一个方面提供了治疗个体中癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。本发明的另一方面提供了治疗个体中感染的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。
还提供了包括任何一种修饰的抗原特异性免疫细胞的组合物、用途、试剂盒和制品。
附图说明
图1A显示了与对照Pmel T细胞相比，Pmel T细胞中小鼠CD160的异位表达，如通过FACS分析的。图1B显示了与对照相比，用外源CD160修饰的Pmel T细胞的CD160染色的中值荧光强度(MFI)。
图2A显示了外源CD160表达对T细胞中颗粒酶A和穿孔素水平的影响，如通过细胞内染色和FACS分析确定的。图2B显示了外源CD160表达对T细胞中INF-γ和TNFα水平的影响，如通过细胞内染色和FACS分析确定的。图2C显示了当与B16F0黑素瘤肿瘤细胞共培养时，用对照病毒或CD160病毒感染的Pmel T细胞的溶细胞活性分析。
图3A显示了对用对照Pmel T细胞(对B16F0中肿瘤抗原特异性的T细胞)或0.1、0.2、0.3或0.4百万个CD160修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0的小鼠的肿瘤大小的影响。图3B显示了对用对照Pmel T细胞、CD160-修饰的脾脏T细胞(对B16F0抗原非特异性的)以及CD160-修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0的小鼠的肿瘤大小的影响。
图4A显示了用环磷酰胺(CYP)预处理和(a)对照Pmel T细胞；或(b)CD160-修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0的小鼠的肿瘤大小的相对变化。图4B显示了用CD160-修饰的Pmel T细胞处理的代表性小鼠在不同时间点的生长曲线和选择的肿瘤图像。图4C显示了用CYP预处理和(a)对照Pmel T细胞；或(b)CD160-修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0黑素瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活分析。
图5A显示了用CYP预处理和(a)PBS；(b)0.15百万个对照Pmel T细胞；或(c)0.15百万个对照CD160-修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0的小鼠的肿瘤大小的相对变化。图5B显示了用CYP预处理和(a)PBS；(b)0.3百万个对照Pmel T细胞；或(c)0.3百万个对照CD160-修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0的小鼠的肿瘤大小的相对变化。图5C显示了用CYP预处理和(a)PBS；(b)对照Pmel T细胞；(c)0.15百万个对照CD160-修饰的Pmel T细胞；或(d)0.3百万个对照CD160-修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0黑素瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活分析。
图6A显示了留下未治疗的或用CYP预处理和(a)PBS；(b)对照Pmel T细胞；或(c)CD160-修饰的Pmel T细胞施用的携带转移性B16F10的小鼠的平均肿瘤大小的影响。图6B显示了留下未治疗的或用CYP预处理和(a)PBS；(b)对照Pmel T细胞；或(c)CD160-修饰的PmelT细胞施用的携带转移性B16F10的小鼠的各个肿瘤的影响。
图7A显示了用CYP预处理和(a)对照Pmel T细胞；或(b)CD160-修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F10的小鼠的肿瘤大小的的相对变化。图7B显示了用CYP预处理和(a)PBS；(b)对照Pmel T细胞；或(c)CD160-修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F10黑素瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活分析。
图8A-C显示了用CYP预处理和PBS、mCD160-修饰的Pmel T细胞或用如阐释的CD160嵌合体之一修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0的小鼠的肿瘤大小的相对变化(图8A中的GEM 124、125；图8B中的GEM 126、127；和图8C中的GEM 123、128)。
图9A是从左向右显示GPI-锚定的mCD160、GPI-锚定的hCD160同种型、跨膜hCD160同种型和含有细胞内结构域的跨膜hCD160同种型的示意图。图9B显示了小鼠和人CD160同种型之间的核苷酸序列和保守程度。
图10A显示了用CYP预处理和(a)对照Pmel T细胞(VECTOR)；或(b)分别用外源GPI-锚定的mCD160、GPI-锚定的hCD160同种型、跨膜hCD160同种型或含有细胞内结构域的跨膜hCD160同种型修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0的小鼠的肿瘤大小的相对变化。图10B显示了用CYP预处理和(a)对照Pmel T细胞(VECTOR)；或(b)分别用外源GPI-锚定的hCD160同种型、跨膜hCD160同种型或含有细胞内结构域的跨膜hCD160同种型修饰的Pmel T细胞施用的携带B16F0黑素瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活分析。
图11A显示了当与LLC细胞共培养时，从用对照病毒或mCD160病毒感染的路易斯肺癌(LLC)提取的肿瘤浸润T细胞(TIL)的溶细胞活性分析。图11B显示了用外源CD160或CD160嵌合体(GEM 124)修饰的LLC TIL对LLC肿瘤控制能力的体内实验的代表性示意图。图11C显示了留下未治疗的或用CYP预处理和(a)PBS；(b)对照TIL；(c)mCD160-修饰的TIL；或(d)用CD160嵌合体GEM124修饰的TIL施用的携带LLC的小鼠的Kaplan-Meier存活分析。
图12A显示了过度表达人CD160或其变体比如CD160TC的CD19-CAR-T细胞的代表性示意图。图12B显示了慢病毒载体配置，其设计为与识别肿瘤特异性抗原的CAR比如CD19一起过度表达人CD160或其变体。
图13A显示了过度表达huCD160TC的CD19-CAR-T细胞与不过度表达CD160的CD19-CAR-T细胞(野生型CD19-CAR-T)的增殖。图13B显示了在培养2周后过度表达huCD160TC的CD19-CAR-T细胞与野生型CD19-CAR-T细胞的生存力(viability)。图13C显示了以各种效应子与靶(E：T)比例的过度表达huCD160TC的CD19-CAR-T细胞与野生型CD19-CAR-T细胞的溶细胞活性分析。图13D显示了过度表达huCD160TC的CD19-CAR-T细胞与野生型CD19-CAR-T细胞中IFN-g产生。图13E显示了示出用：(a)无CAR-T细胞(没有)；(b)对照CD19-CAR-T细胞(19CAR)或(c)过度表达huCD160TC的CD19-CAR-T细胞(CD160TC 19CAR)施用的携带Nalm6肿瘤的小鼠中的肿瘤大小的趋势。图13F显示了用(a)无CAR-T细胞(--)；(b)野生型CD19-CAR-T细胞或(c)过度表达huCD160TC的CD19-CAR-T细胞(CD160TC)施用的携带Ramos肿瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活分析。
图14A显示了过度表达人CD160或其变体比如huCD160TC的NY-ESO-1特异性TCR-T细胞的代表性示意图。图14B显示了慢病毒载体配置，其设计为与识别肿瘤特异性抗原的TCR比如NY-ESO-1-特异性TCR一起过度表达人CD160或其变体。
图15A显示了示出如由Tetramer分析确定的对野生型1G4-TCR-T细胞和表达huCD160TC的1G4-TCR-T细胞的NY-ESO-1特异性1G4-TCR水平的FACS分析。图15B显示了过度表达huCD160TC的1G4-TCR-T细胞与不过度表达CD160的1G4-TCR-T细胞(野生型1G4-TCR-T)的增殖。图15C显示了野生型1G4-TCR-T细胞和表达huCD160TC的1G4-TCR-T细胞中干细胞/记忆T细胞的百分比。图15D显示了以各种效应子与靶(E：T)比例的过度表达huCD160TC的1G4-TCR-T细胞与野生型1G4-TCR-T细胞的溶细胞活性分析。图15E显示了过度表达huCD160TC的1G4-TCR-T细胞与野生型1G4-TCR-T细胞中的IFN-g产生。图15F显示了用：(a)无TCR-T细胞(没有)；(b)对照1G4-TCR-T细胞或(c)过度表达huCD160TC的1G4-TCR-T细胞施用的携带A375黑素瘤的小鼠中的肿瘤大小。
图16显示了患者来源的异种移植(PDX)小鼠肿瘤模型中自体TIL疗法的实验示意图。在NSG免疫缺陷小鼠中被植入和被传入来自具有各种癌症比如肺癌、食道癌、结肠癌、胃癌或胰腺癌的癌症患者切除的肿瘤组织，以生成具有人肿瘤的PDX模型。从切除的肿瘤中提取自体肿瘤浸润白细胞(TIL)，用于PDX模型中自体人肿瘤中CD160修饰和随后的功能测试。
图17A显示了过度表达人CD160或其变体，比如huCD160TC的抗肿瘤TIL的代表性示意图。图17B显示了用于过度表达人CD160或其变体的慢病毒载体配置，其中GFP作为共表达的报告基因。
图18A显示了以各种效应子与靶(E：T)比例的过度表达huCD160TC的肿瘤特异性TIL(CD160TC)与不过度表达CD160的相应的TIL(没有；载体)的溶细胞活性分析。图18B显示了用：(a)不过度表达CD160的对照TIL(没有)或(c)过度表达huCD160TC的TIL施用的携带自体食道肿瘤的小鼠中的肿瘤大小。GEM表示由相应的TIL表达的遗传增强修饰剂。
发明详述
本申请提供了用于调节CD160的免疫刺激活性的方法和组合物。本申请基于令人惊讶的发现，CD160以前被认为主要功能为T细胞的抑制检查点分子，可负责刺激抗原特异性免疫细胞，比如T细胞中的免疫应答。
我们证明了肿瘤特异性T细胞可以用CD160重编以控制和消除有免疫能力的小鼠中已建立的实体瘤。而且，在这些非常难以治疗的小鼠模型中，CD160编程的T细胞也显示在控制转移黑素瘤和肺癌中非常有效。CD160的异位表达增强了携带特异性识别GP100的TCR的肿瘤特异性T细胞和识别多个抗原的多克隆肺癌肿瘤浸润T细胞(“TIL”)的功能。CD160修饰的肿瘤特异性T细胞提供了有效控制不同组织来源的实体瘤，而不管它们的转移性质如何。此外，通过创建具有TCR和共刺激信号传导结构域的CD160嵌合体，我们已经显示CD28共刺激信号与CD160协同并且进一步增强了抗原特异性T细胞的功能。
重要地，人和小鼠CD160具有增强抗原特异性T细胞在体内肿瘤控制和消除中的功能的保守功能，提示了CD160可控制调节抗原特异性T细胞功能的高度保守途径。这些发现首次证明了CD160可用于将抗原特异性T细胞转变为控制和消除癌症，包括已建立的实体瘤的强效药物。此外，发现强烈建议基于CD160的免疫细胞(比如T细胞)重编可广泛适用于所有靶向肿瘤的免疫细胞(比如T细胞)和不同组织来源的肿瘤。
以上讨论的发现进一步建议，CD160可以是促进或抑制抗原特异性T细胞功能的外在调节的重要靶标。例如，可以靶向抗原特异性免疫细胞中的内源性CD160以促进抗原特异性T细胞的活性并且激活炎症性应答，比如针对病毒和细菌感染。相反地，可以靶向CD160以在非期望的免疫应答期间，例如在炎症和自身免疫性疾病中抑制抗原特异性T细胞的活性。考虑到抗原特异性T细胞中CD160的重要功能，CD160表达水平可能与包括肿瘤或炎症性组织的炎症性位点处抗原特异性T细胞的有效和功能状态相关。那些细胞中较高的CD160表达可提示抗原特异性T细胞的激活状态，而低水平或不存在的CD160表达可提示抗原特异性T细胞的非激活状态。因此，CD160可用作预测抗原特异性T细胞的功能状态以及免疫疗法功效的生物标志物。
因此，在一个方面中，提供了包括(例如在其表面上)外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞(例如，T细胞)，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质经GPI连接体结合至修饰的抗原特异性免疫细胞的细胞膜。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质为包括跨膜结构域的跨膜蛋白质。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括源自共刺激分子的跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分，比如识别和激活T细胞表面分子的抗体结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体，比如修饰的T-细胞受体、工程化的T-细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。还提供了产生以上所述的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法。
在另一方面中，提供了调节抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性，例如用于治疗免疫学疾病比如自身免疫性疾病和炎症性疾病的方法。在一些实施方式中，提供了通过使抗原特异性免疫细胞与激活(例如提高)CD160活性的试剂(例如，激动剂抗CD160抗体)接触，激活(例如增强)抗原特异性免疫细胞的CD160的免疫刺激活性的方法。在一些实施方式中，提供了通过使抗原特异性免疫细胞与抑制(例如下调)CD160活性的试剂(例如，拮抗剂抗CD160抗体)接触，抑制(例如下调)CD160的免疫刺激活性的方法。
还提供了包括修饰的抗原特异性免疫细胞的组合物(比如药物组合物)、试剂盒和制品，以及使用本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞治疗癌症的方法。
I.定义
如本文使用的，“治疗”是用于获得包括临床结果的有益或期望的结果的方法。对于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下一种或多种：减轻由疾病引起的一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延缓疾病的恶化)、预防或延缓疾病的传播(例如，转移)、预防或延缓疾病的复发、延缓或减缓疾病的进展、减轻疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延缓疾病的进展，提高生活质量和/或延长生存期。“治疗”还涵盖减少疾病的病理结果。本发明的方法考虑了任何一个或多个这些治疗方面。
术语“预防”和类似的单词比如“预防的”等，指示用于预防、抑制或减少疾病或病症，例如癌症复发的可能性的方法。其还指延缓疾病或病症复发或延缓疾病或病症的症状复发。如本文使用的，“预防”和类似的单词还包括在疾病或病症复发之前减少疾病或病症的强度、效果、症状和/或负担。
如本文使用的，“延缓”癌症的发展意味着推迟、阻碍、减缓、迟延、稳定和/或延迟疾病的发展。这种延缓可具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或待治疗的个体。“延缓”癌症的发展的方法是当与不使用该方法相比时，在给定时间范围内降低疾病发展概率和/或在给定时间范围内降低疾病程度的方法。这种比较通常基于临床研究，使用统计学上显著的个体数量。使用包括但不限于计算机轴向断层扫描(CAT扫描)、磁性共振成像(MRI)、腹部超声、凝血试验、动脉造影或活检的标准方法，癌症发展可以是可检测的。发展还可以指最初可能无法检测到的癌症进展，包括发生、复发和发作。
本文使用的术语“有效量”指试剂或试剂组合的量，其足以治疗特定失调、病症或疾病，比如减轻、缓和、减少和/或延缓一种或多种其症状。关于癌症，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(比如抑制肿瘤生长)或预防或延缓其他不希望的细胞增殖的量。在一些实施方式中，有效量是足以延缓疾病发展的量。在一些实施方式中，有效量是足以预防或延缓复发的量。有效量可以以一次或多次给药施用。有效量的药物或组合物可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、迟延、减缓并且优选地停止癌细胞浸润入外周器官；(iv)抑制(即在一定程度上减缓并且优选地停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延缓肿瘤的发生和/或复发和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。
如本文使用的，“个体”或“受试者”指哺乳动物，包括但不限于人、牛科动物、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方式中，个体是人。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
如本文使用的术语“载体”指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。这种载体在本文中称为“表达载体”。
如本文使用的术语“转染”或“转化”或“转导”指将异源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”细胞是已经用异源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括初代受试者细胞及其子代。
相对于本文鉴定的多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”或“同源性”定义为在考虑任何保守替换作为部分序列同一性比对序列后，候选序列中与被比较的多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。例如，使用公开可用的计算机软件比如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件，可以以本领域技术范围内的各种方式实现确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，对于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE(Edgar,RC,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797,2004；Edgar,RC,BMC Bioinformatics 5(1):113,2004)生成氨基酸序列同一性值％。
如本文使用的，“抗原特异性免疫细胞”是具有通过天然和/或工程化的抗原识别受体特异性识别靶细胞上的抗原的免疫细胞。免疫细胞包括但不限于具有或不具有工程化的抗原识别的αβT细胞、γδT细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞和巨噬细胞。抗原特异性免疫细胞可以是多克隆或单克隆的。例如，在一些实施方式中，“抗原特异性免疫细胞”是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其可以从切除的肿瘤中分离；或新抗原特异性T细胞，其可使用各自的抗原结合四聚体分离；或树突细胞激活的T细胞，其由外周血液T细胞与负载肿瘤抗原的树突细胞共培养和激活生成；或其他免疫细胞，比如表达CAR或TCR样抗原受体的γδT细胞、NK细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞和巨噬细胞。
如本文使用的，“抗原-特异性受体”是天然的或工程化的T细胞受体(TCR)或工程抗原受体，比如嵌合抗原受体(CAR)。
如本文使用的“T-细胞受体”或“TCR”指内源或修饰的T细胞受体，其包括结合至MHC分子中结合的特定抗原肽的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方式中，TCR包括TCRα多肽链和TCRβ多肽链。在一些实施方式中，TCR特异性结合肿瘤抗原。“TCR-T”指表达重组TCR的T细胞。
如本文使用的“嵌合抗原受体”或“CAR”指基因工程化的受体，其将一种或多种抗原特异性移植到细胞上，比如αβT细胞、γδT细胞、NK细胞、巨噬细胞。CAR也称为“人工T-细胞受体”、“嵌合T-细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施方式中，CAR包括对肿瘤抗原特异性的抗体的细胞外可变结构域和T细胞或其他受体的细胞内信号传导结构域，比如一个或多个共刺激结构域。“CAR-T”指表达CAR的T细胞。
本文的术语“抗体”是以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示出期望的抗原结合活性。术语抗体包括但不限于能够结合抗原的片段，比如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)2。术语抗体包括常规的四链抗体和单结构域抗体，比如只有重链的抗体或其片段，例如VHH。
如本文所用的，术语“结合”、“特异性结合”或“对……特异性”是指可测量的和可再现的相互作用，比如靶和抗体之间的结合，其在包括生物分子的异质分子群存在的情况下决定靶的存在。例如，结合或特异性结合至靶标(其可以是表位)的抗体是比其结合至其他靶标具有更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间的结合该靶标的抗体。在一个实施方式中，抗体与无关靶标的结合程度小于抗体与靶标结合的约10％，如例如，通过放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方式中，特异性结合至靶标的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方式中，抗体特异性结合至蛋白质上的表位，该蛋白质在来自不同物种的蛋白质之中是保守的。在另一实施方式中，特异性结合可包括但不要求排他性结合。
应当理解，本文所述的本发明的实施方式包括“由实施方式组成”和/或“基本上由实施方式组成”。
本文提及的“约”值或参数包括(并且描述)针对该值或参数本身的变化。例如，参考“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文使用的，提及“不是”一个值或参数通常意味着并且描述“除了”一个值或参数。例如，该方法不用于治疗X型癌症意味着该方法用于治疗除X以外类型的癌症。
本文使用的术语“约X-Y”与“约X至约Y”具有相同的含义。
如本文和所附的权利要求中使用的，除非上下文另外清楚地指示，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。
II.表达外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞
本发明的一个方面提供了包括(例如在其表面上)外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，上调包括增加溶细胞淋巴细胞(CTL)活性。在一些实施方式中，上调包括提高有免疫能力的宿主的肿瘤杀伤活性。在一些实施方式中，上调包括提高T细胞-和/或NK细胞-介导的杀伤。在一些实施方式中，上调包括提高颗粒酶A和/或穿孔素的表达。在一些实施方式中，上调包括提高炎症性反应。在一些实施方式中，上调包括提高炎症性细胞因子的表达和/或分泌。在一些实施方式中，炎症性细胞因子包括IFN-γ和/或TNF-α。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约80％同一性的其变体。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何一种的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞表面上的外源CD160蛋白质是以多聚体(比如，但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体)的形式。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素αβT细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，APC激活的抗肿瘤T细胞是DC-激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是从个体肿瘤分离的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，工程化的T细胞受体(TCR)识别肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在进一步的实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，修饰的免疫细胞是多种对相同表位特异性的免疫细胞。非限制示例包括各自包括相同的功能性外源受体(比如CAR)的多种T细胞。在一些实施方式中，修饰的免疫细胞是各自对多个非相同表位之一(比如局部重叠，或完全不同表位)特异性的多种免疫细胞。非限制示例包括多种多克隆免疫细胞，比如多克隆TIL。
在一些实施方式中，提供了在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，并且其中外源CD160蛋白质是膜结合的。
在一些实施方式中，提供了在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，并且其中外源CD160蛋白质经糖磷脂酰肌醇(GPI)连接体结合至膜。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括GPI-锚定肽序列。
在一些实施方式中，提供了在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，和其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T细胞受体(TCR)α亚单位、TCRβ亚单位或TCRζ亚单位。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1。
在一些实施方式中，提供了在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，并且其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T细胞受体(TCR)α亚单位、TCRβ亚单位或TCRζ亚单位。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1。在一些实施方式中，细胞内结构域源自CD160剪接变体。在一些实施方式中，细胞内结构域包括源自TCR复合物的信号传导亚单位的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，TCR复合物的信号传导亚单位选自由以下组成的组：CD3γ、CD3δ和CD3ε。在一些实施方式中，细胞内结构域包括源自T细胞刺激分子的一种或多种信号传导结构域。在一些实施方式中，信号传导结构域是4-1BB、OX40、CD27、CD28、CD80或CD258的一种或多种。在一些实施方式中，细胞内结构域包括选自由以下组成的组中两种信号传导结构域的组合：OX40、CD27、CD28、CD80和CD258。[[CD160-TM+co-stim；覆盖5-7+]]
在一些实施方式中，提供了在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，并且其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域和细胞内结构域，并且其中细胞内结构域包括一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括任何1、2、3、4、5、6、7、8或更多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域含有不大于1、2、3、4或5个共刺激信号传导结构域的任何一种。在一些实施方式中，细胞内结构域不包括CD3ζ信号传导结构域或4-1BB和CD3ζ结构域的组合。在一些实施方式中，共刺激信号传导结构域源自选自由以下组成的组中的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、CD80、CD258、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合。在一些实施方式中，细胞内结构域包括CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或二者。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。在一些实施方式中，CD28共刺激结构域邻近跨膜结构域。在一些实施方式中，CD28共刺激结构域邻近跨膜结构域的C-末端。在一些实施方式中，细胞内结构域包括初级信号传导结构域。在一些实施方式中，初级信号传导结构域包括CD3ζ结构域。在其他实施方式中，细胞内结构域不包括初级信号传导结构域。在其他实施方式中，细胞内结构域不包括CD3ζ结构域或4-1BB和CD3ζ结构域的组合。
在一些实施方式中，提供了在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，和其中外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分结合至免疫细胞的表面分子。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分包括识别T-细胞表面分子的抗体。在一些实施方式中，抗体可以是全长抗体或抗体片段，比如scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(sdAb)或VHH结构域。非限制示例包括识别TCR和/或激活TCR信号传导的抗CD3ε抗体。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分包括结合相关T细胞表面受体的配体。非限制示例包括识别TCR和IL-2的肿瘤特异性肽MHC复合物。
在根据本文所述的任何修饰的抗原特异性免疫细胞的一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约80％同一性的其变体。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ IDNO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何一种的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞表面上的外源CD160蛋白质是以多聚体(比如，但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体)的形式。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，APC激活的抗肿瘤T细胞是DC-激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是从个体肿瘤分离的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，工程化的T细胞受体(TCR)识别肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在进一步的实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，修饰的免疫细胞是多种对相同表位特异的免疫细胞。非限制示例包括各自包括相同的功能性外源受体(比如CAR)的多种T细胞。在一些实施方式中，修饰的免疫细胞是多种各自对多个非相同表位之一(比如局部重叠，或完全不同表位)特异性的免疫细胞。非限制示例包括多种多克隆免疫细胞，比如多克隆TIL。
在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞展示天然抗原识别。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞展示工程化的抗原识别。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞的抗原识别至少部分由功能性外源受体，比如但不限于CAR和TCR赋予。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞靶向肿瘤相关抗原、突变的致癌抗原和随机体细胞抗原，和其他新抗原。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是人免疫细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞鼠免疫细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是从TCR-T细胞、CAR-T细胞、TIL或内源抗原特异性T细胞的一种或多种修饰。人和鼠TCR-T细胞、CAR-T细胞、TIL或内源抗原特异性T细胞的一些示例被报道在Tran等，Nat Immunol.2017；18(3):255-62.，MacKay等,Nat Biotechnol.2020；38(2):233-44和Schumacher等，Cancer Neoantigens..Annu Rev Immunol.2019；37:173-200中，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞靶向广谱的抗原。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞靶向表1中列出的抗原的一种或多种。
表1：肿瘤抗原和相关的癌症症状的示例性列表
Figure BDA0003238294980000231
Figure BDA0003238294980000241
Figure BDA0003238294980000251
在一些实施方式中，提供了包括本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种的药物组合物。在一些实施方式中，提供了用于生成本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种的方法。
包括外源CD160的修饰的抗原特异性免疫细胞的文库和用于抗原特异性免疫细胞的筛选方法
在一些实施方式中，提供了各自具有识别不同抗原(比如肿瘤抗原或肿瘤相关抗原)的功能性外源受体的抗原特异性免疫细胞(比如T细胞)的文库。在一个方面中，提供了各自具有识别不同肿瘤或肿瘤相关抗原的功能性外源受体的抗原特异性免疫细胞(比如T细胞)的文库，其中文库中的每种抗原特异性免疫细胞进一步在其表面上包括外源CD160蛋白质，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的免疫细胞的上调。
在一个方面中，提供了多克隆免疫细胞(比如TIL)的文库，其中多克隆组合物中的每种免疫细胞对多种非相同表位(比如局部重叠，或完全不同表位)之一是特异的，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的免疫细胞的上调。
在一些实施方式中，提供用于包括对测试抗原特异性的功能性外源受体的免疫细胞的筛选方法，包括使测试抗原与各自具有识别不同抗原(比如肿瘤或肿瘤相关抗原)的功能性外源受体的抗原特异性免疫细胞(比如T细胞)的文库接触，其中文库中的每种抗原特异性免疫细胞进一步在其表面上包括外源CD160蛋白质，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的免疫细胞的上调。表达功能性外源受体(比如期望的功能性外源受体)的期望的抗原特异性免疫细胞可通过如下鉴定：使测试抗原与各自具有识别不同抗原的功能性外源受体的抗原特异性免疫细胞(比如T细胞)的文库接触，随后分析文库中细胞与测试抗原的结合活性，或测量文库中细胞的抗原特异性免疫活性，比如但不限于任何细胞因子分泌(例如IFN-γ、TNF-α和/或IL-2)的ELISA分析。
在一些实施方式中，提供了用于对测试抗原特异性的免疫细胞的筛选方法，包括使测试抗原与多克隆免疫细胞(比如TIL)的文库接触，其中多克隆组合物中的每种免疫细胞对多种非相同表位(比如局部重叠，或完全不同表位)之一是特异的，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的免疫细胞的上调。多克隆组合物内期望的抗原特异性免疫细胞可通过如下鉴定：使测试抗原与多克隆免疫细胞(比如TIL)的文库接触，其中每个细胞对多个非相同表位之一是特异性的，随后分析文库中细胞对测试抗原的结合活性，或测量文库中细胞的抗原特异性免疫活性，比如但不限于ELISA分析任何细胞因子分泌(例如IFN-γ、TNF-α和/或IL-2)的ELISA分析。
在根据任何一个以上所述的方法的一些实施方式中，测试抗原包括一个或多个免疫原性表位。在一些实施方式中，测试抗原源自裂解物，比如肿瘤裂解物。在一些实施方式中，在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的文库由以下过程产生，其包括：使多个前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞的文库。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括任何SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4具有至少约80％鉴定同一性的其变体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，APC激活的抗肿瘤T细胞是DC-激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。
CD160蛋白质
本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞表达外源CD160蛋白质，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。本申请还提供外源CD160蛋白质及其组合物。表2显示示例性外源CD160蛋白质的序列。
Figure BDA0003238294980000271
在一些实施方式中，提供了包括天然存在的CD160多肽或其片段的外源CD160蛋白质，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质由天然存在的CD160蛋白质或其片段组成或基本上由天然存在的CD160蛋白质或其片段组成。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括天然存在的CD160蛋白质或其片段的Ig-样V-型结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括天然存在的CD160蛋白质或其片段的半胱氨酸富集结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括天然存在的CD160蛋白质的氨基酸25-133，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:1-3的任何一个。
在一些实施方式中，细胞表面上的外源CD160蛋白质是以单体形式。在一些实施方式中，细胞表面上的外源CD160蛋白质是以多聚体。在一些实施方式中，细胞表面上的外源CD160蛋白质是以多聚体，比如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体。在一些实施方式中，多聚体包括一种或多种外源CD160蛋白质和一种或多种天然存在的CD160蛋白质。在一些实施方式中，多聚体包括一种或多种外源CD160蛋白质和一种或多种内源CD160蛋白质。在一些实施方式中，细胞表面上的CD160蛋白质多聚体是共价连接的。在一些实施方式中，细胞表面上的CD160蛋白质多聚体是二硫化连接的。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质中至少1、2、3或4个半胱氨酸残基是突变的。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQID NO:1-3的任何一个的氨基酸序列，进一步包括半胱氨酸残基Cys26、Cys44、Cys61、Cys68、Cys112、Cys113中的一个或多个突变或其任何组合。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列，进一步包括半胱氨酸残基Cys29、Cys47、Cys64、Cys71、Cys115、Cys116中的一个或多个突变或其任何组合。在一些实施方式中，携带一个或多个以上所述的突变的外源CD160蛋白质不能够形成多聚体。
在一些实施方式中，外源CD160蛋白质展示出与天然存在的CD160蛋白质对MHC-I相同或基本上相同的结合亲和力。在一些实施方式中，与天然存在的CD160蛋白质相比，外源CD160蛋白质展示出对MHC-I增加的结合亲和力。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质的MHC-I结合亲和力比天然存在的CD160蛋白质的MHC-I结合亲和力高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的任何一种。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质的MHC-I结合亲和力比天然存在的CD160蛋白质的MHC-I结合亲和力高约2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或100倍的任何一种。在一些实施方式中，与天然存在的CD160蛋白质相比，外源CD160蛋白质展示出对MHC-I减少的结合亲和力。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质的MHC-I结合亲和力比天然存在的CD160蛋白质的MHC-I结合亲和力低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的任何一种。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质的MHC-I结合亲和力比天然存在的CD160蛋白质的MHC-I结合亲和力低约2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或100倍的任何一种。
在一些实施方式中，外源CD160蛋白质展示出与天然存在的CD160蛋白质对疱疹病毒入侵介质(HVEM)相同或基本上相同的结合亲和力。在一些实施方式中，与天然存在的CD160蛋白质相比，外源CD160蛋白质展示出对HVEM增加的结合亲和力。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质的HVEM结合亲和力比天然存在的CD160蛋白质的HVEM结合亲和力高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的任何一种。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质的HVEM结合亲和力比天然存在的CD160蛋白质的HVEM结合亲和力高约2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或100倍的任何一种。在一些实施方式中，与天然存在的CD160蛋白质相比，外源CD160蛋白质展示出对HVEM减少的结合亲和力。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质的HVEM结合亲和力比天然存在的CD160蛋白质的HVEM结合亲和力低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的任何一种。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质的HVEM结合亲和力比天然存在的CD160蛋白质的HVEM结合亲和力低约2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或100倍的任何一种。
在一些实施方式中，外源CD160蛋白质与BTLA(也称为CD272)竞争结合至HVEM。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质与BTLA不竞争结合至HVEM。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质展示出与BTLA对HVEM类似的结合亲和力。在一些实施方式中，与BTLA相比，外源CD160蛋白质展示出对HVEM更高的结合亲和力。在一些实施方式中，与BTLA相比，外源CD160蛋白质展示出对HVEM更低结合亲和力。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质展示出与BTLA对HVEM相同或基本上相同的结合亲和力。在一些实施方式中，与BTLA相比，外源CD160蛋白质展示出对HVEM更高结合亲和力。在一些实施方式中，与BTLA相比，外源CD160蛋白质展示出对HVEM更低结合亲和力。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质展示出与BTLA从HVEM结合相同或基本上相同的解离速率。在一些实施方式中，与BTLA相比，外源CD160蛋白质展示出从HVEM结合更高解离速率。在一些实施方式中，与BTLA相比，外源CD160蛋白质展示出从HVEM结合更低解离速率。
在一些实施方式中，与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，并且其中CD160蛋白质包括SEQID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的其变体。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约80％序列同一性，比如至少约85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的任何一种的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的任何一种的氨基酸序列。
在一些实施方式中，外源CD160蛋白质源自哺乳动物的CD160蛋白质。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质源自小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔子的CD160蛋白质。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质源自人的CD160蛋白质。
在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括全长CD160蛋白质。在一些实施方式中，外源CD160包括选自由SEQ ID NO:1-4组成的组中的氨基酸序列。CD160蛋白质序列是本领域已知的，包括但不限于具有UniProt(worldwide web.uniprot.org)登录号O95971和O88875的序列。编码CD160蛋白质的mRNA的序列也是本领域已知的，包括但不限于具有NCBI(wordwide web ncbi.nlm.nih.gov)登录号NM_007053.3、XM_005272929.3和NM_001163497.1的序列。
在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括至少约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600或更多个氨基酸的任何一种。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括不大于约600、550、500、450、350、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50或更少个氨基酸的任何一种。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括约50-60、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-150、100-200、100-250、150-250、250-500或50-550个氨基酸的任何一种。
在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括天然存在的CD160蛋白质或其片段的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善CD160蛋白质的结合亲和力和/或其他生物特性。其CD160蛋白质的氨基酸序列变体可通过将合适的修饰引入编码CD160蛋白质的核苷酸序列，或通过肽合成制备。这种修饰包括，例如，从CD160蛋白质的氨基酸序列删除，和/或向CD160蛋白质的氨基酸序列内的插入和/或CD160蛋白质的氨基酸序列内的残基的置换。可以进行删除、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有期望的特征，例如，促炎活性。
在一些实施方式中，与天然存在的CD160蛋白质或其片段的序列相比，外源CD160蛋白质包括具有一个或多个(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20个氨基酸或更多)保守置换的天然存在的CD160蛋白质或其片段。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与天然存在的CD160蛋白质或其片段的序列具有至少约80％序列同一性，比如至少约85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的任何一种的天然存在的CD160蛋白质或其片段。
在以下表3显示保守置换。
表3：保守置换
Figure BDA0003238294980000311
Figure BDA0003238294980000321
根据通常的侧链特性，氨基酸可被分组为不同类别：
a.疏水的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c.酸性：Asp、Glu；
d.碱性：His、Lys、Arg；
e.影响链定向的残基：Gly、Pro；
f.芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守置换需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。
本领域技术人员将认识到任何合适的方法可用于在感兴趣的基因中产生突变，包括诱变、聚合酶链反应、同源重组或本领域技术人员已知的任何其他基因工程技术。突变可涉及单个核苷酸(比如点突变，其涉及去除、添加或替换DNA序列内的单个核苷酸碱基)，或其可涉及大量核苷酸的插入或删除。突变可以由比如DNA复制保真度中的错误事件自发产生，或在暴露于化学或物理诱变剂后诱发。还可以通过使用本领域技术人员熟知的特定靶向方法来定点进行突变。
如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085描述的，用于鉴定可以靶向诱变的多肽的残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，通过中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)鉴定并且取代一个残基或一组目标残基(例如，带电的残基比如arg、asp、his、lys和glu)，以确定多肽试剂(例如，CD160变体)的免疫上调是否受影响。可以在证明对初始置换的功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步置换。可选地或另外地，可以确定CD160:MHC I复合物或CD160:HVEM复合物的晶体结构以分别鉴定CD160和MHC-1之间或CD160和HVEM之间的接触点。这种接触残基和相邻残基可以作为置换的候选物被靶向或消除，以根据疾病适应症增强或抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的功能。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。
在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从修饰的抗原特异性免疫细胞分泌。在一些实施方式中，外源CD160蛋白包括信号肽。信号肽(也称为“前导序列”)通常在Met起始子之后立即在蛋白质的N末端处插入。信号肽可在来自修饰的抗原特异性免疫细胞的外源CD160蛋白质输出时被切割，形成成熟蛋白。信号肽可以是天然的或合成的，并且它们可以与它们所连接的蛋白质异源或同源。信号肽的选择是广泛的，并且本领域技术人员可以得到的，包括，例如，在新加坡国立大学生物化学系维护的在线前导序列数据库中。参见Choo等，BMCBioinformatics，6：249(2005)和PCT公开号WO 2006/081430。
功能性外源受体
任何以上所述的修饰的抗原特异性免疫细胞可进一步表达功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是工程化的受体。示例性功能性外源受体包括但不限于CAR和工程化的TCR。在一些实施方式中，功能性外源受体包括特异性结合至抗原(例如，肿瘤抗原)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括初级细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括TCR共受体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，功能性外源受体由编码外源CD160蛋白质的异源核酸序列编码。在一些实施方式中，功能性外源受体由可操作地连接至启动子(比如组成型启动子或诱导型启动子)的第二异源核酸编码。在一些实施方式中，通过将蛋白质插入细胞膜，同时使细胞穿过微流体系统，比如CELL
Figure BDA0003238294980000341
将功能性外源受体引入修饰的抗原特异性免疫细胞(参见，例如，美国专利申请公开号20140287509)。在一些实施方式中，通过CRISPR-介导的基因编辑，将功能性外源受体引入修饰的免疫细胞。功能性外源受体可增强修饰的抗原特异性免疫细胞的功能，比如通过靶向修饰的抗原特异性免疫细胞，通过传导信号，和/或通过增强修饰的抗原特异性免疫细胞的细胞毒性。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞不表达功能性外源受体，比如CAR或TCR。
在一些实施方式中，功能性外源受体包括靶向至少一种肿瘤抗原的一个或多个特异性结合结构域，和一个或多个细胞内效应子结构域，比如一种或多种初级细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。
在一些实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。许多嵌合抗原受体是本领域已知的并且可适于本发明的修饰的抗原特异性免疫细胞。还可以通过利用，例如抗体分子的抗原结合片段或抗体可变结构域构建对任何细胞表面标志物具有特异性的CAR。本文可以使用产生CAR的任何方法。参见，例如，US6,410,319、US7,446,191、US7,514,537、US9765342B2、WO 2002/077029、WO2015/142675、US2010/065818、US 2010/025177、US2007/059298、WO2017025038A1和Berger C等，J.Clinical Investigation 118：1 294-308(2008)，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是CAR-αβT细胞、CAR-γδT细胞、CAR-NK细胞或CAR-巨噬细胞。
本发明的CAR包括包含特异性结合至少一种肿瘤抗原的至少一个靶向结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域生成促进含CAR的细胞，例如CAR-T细胞的免疫效应子功能的信号。“免疫效应子功能或免疫效应子应答”指例如，免疫效应细胞的功能或应答，其增强或促进靶细胞的免疫攻击。例如，免疫效应子功能或应答可指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞的生长或增殖的T或NK细胞的性质。例如，CAR-T细胞中的免疫效应子功能的示例，包括溶细胞活性(比如抗体依赖性细胞毒性，或ADCC)和辅助活性(比如细胞因子的分泌)。在一些实施方式中，CAR具有具备衰减的免疫效应子功能的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，与具有全长和野生型CD3ζ和任选地一个或多个共刺激结构域的CAR相比，CAR具有的细胞内信号传导结构域具有不大于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少的免疫效应子功能(比如针对靶细胞的溶细胞功能)的任何一种。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域生成促进含CAR的细胞的增殖和/或生存的信号。在一些实施方式中，CAR包括选自CD28、CD137、CD3、CD27、CD40、ICOS、GITR和OX40的信号传导结构域的一种或多种细胞内信号传导结构域。天然存在的分子的信号传导结构域可包括分子或其片段或衍生物的整个细胞内(即，细胞质)部分，或整个天然细胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包括初级细胞内信号传导结构域。“初级细胞内信号传导结构域”指以刺激方式作用来诱导免疫效应子功能的细胞质信号传导序列。在一些实施方式中，初级细胞内信号传导结构域含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序，或ITAM的信号传导基序。在一些实施方式中，初级细胞内信号传导结构域包括选自由以下组成的组中的蛋白质的功能信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、普通FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12。在一些实施方式中，初级细胞内信号传导结构域包括选自由以下组成的组中的蛋白质的无功能的或衰减的信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、普通FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12。无功能的或衰减的信号传导结构域可以是突变体信号传导结构域，其具有减弱或消除一种或多种免疫效应子功能(比如溶细胞活性或辅助活性，包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC))的点突变、插入或删除。在一些实施方式中，CAR包括无功能的或衰减的CD3ζ(即CD3ζ或CD3z)信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域不包括初级细胞内信号传导结构域。与具有相同构建体但具有野生型初级细胞内信号传导结构域的CAR相比，衰减的初级细胞内信号传导结构域可诱导不大于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少的免疫效应子功能(比如针对靶细胞的溶细胞功能)的任何一种。
在一些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包括一个或多个(比如1、2、3或更多个)共刺激结构域。“共刺激结构域”可以是共刺激分子的细胞内部分。术语“共刺激分子”指与共刺激配体特异性结合的免疫细胞(比如T细胞)上的相关结合伙伴，从而通过免疫细胞介导共刺激反应，比如，但不限于增殖和生存。共刺激分子是除了抗原受体或它们的配体之外的细胞表面分子，其有助于有效的免疫应答。共刺激分子可以表示在以下蛋白质家族中：TNF受体蛋白质、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整合蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白质)和激活NK细胞受体。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这种共刺激分子的另外示例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方式中，CAR包括单个共刺激结构域。在一些实施方式中，CAR包括两个或更多个共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括功能初级细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在一些实施方式中，CAR不包括功能初级细胞内信号传导结构域(比如CD3ζ)。在一些实施方式中，CAR包括由一个或多个共刺激结构域组成或基本上由一个或多个共刺激结构域组成的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，CAR包括由无功能的或衰减的初级细胞内信号传导结构域(比如突变体CD3ζ)和一个或多个共刺激结构域组成或基本上由无功能的或衰减的初级细胞内信号传导结构域(比如突变体CD3ζ)和一个或多个共刺激结构域组成的细胞内信号传导结构域。当靶向结构域与肿瘤抗原结合，CAR共刺激结构域可转导增强具有CAR的工程化的免疫细胞(比如T细胞)的增殖、生存和分化的信号，并且抑制激活诱导细胞死亡。在一些实施方式中，一个或多个共刺激信号传导结构域源自选自由以下组成的组中的一种或多种分子：CD27、CD28、4-1BB(即，CD137)、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合至CD83的配体。
在一些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包括源自CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞质信号传导结构域和CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，本申请的嵌合受体中的细胞内信号传导结构域包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域(即，CD137)。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞质信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在一些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包括CD28的共刺激信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞质信号传导结构域、CD28的共刺激信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括多肽，其从N-末端至C-末端包含：CD28的共刺激信号传导结构域、4-1BB的共刺激信号传导结构域和CD3ζ的细胞质信号传导结构域。
在一些实施方式中，CAR的靶向结构域是抗体或抗体片段，比如scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(sdAb)或VHH结构域。在一些实施方式中，CAR的靶向结构域是特异性结合至肿瘤抗原的受体的配体或细胞外部分。在一些实施方式中，CAR的一个或多个靶向结构域特异性结合至单个肿瘤抗原。在一些实施方式中，CAR是具有结合两种或更多种肿瘤抗原的靶向结构域的双特异性或多特异性CAR。在一些实施方式中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(比如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮蛋白、PSMA、ROR1、WT1和具有临床显著性的其他肿瘤抗原，及其组合。
在一些实施方式中，CAR的跨膜结构域包括选自以下的跨膜结构域的跨膜结构域：T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD11a，CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRFl)，CD160，CD19，IL-2Rβ，IL-2Rγ，IL-7R a，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(触觉)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A，Lyl08)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D和/或NKG2C。在一些实施方式中，CAR的跨膜结构域是CD4、CD3、CD8α或CD28跨膜结构域。在一些实施方式中，CAR的跨膜结构域包括CD8α的跨膜结构域。
在一些实施方式中，细胞外结构域通过铰链区连接至跨膜结构域。在一个实施方式中，铰链区包括CD8α的铰链区。
在一些实施方式中，CAR包括信号肽，比如CD8αSP。
在一些实施方式中，功能性外源受体是修饰的T-细胞受体。在一些实施方式中，工程化的TCR对肿瘤抗原是特异性的。在一些实施方式中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(比如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮蛋白、PSMA、ROR1、WT1和具有临床显著性的其他肿瘤抗原。在一些实施方式中，肿瘤抗原源自肿瘤细胞的细胞内蛋白质。已经描述了对肿瘤抗原(包括肿瘤相关抗原)特异性的许多TCR，包括，例如，NY-ESO-1癌症-睾丸抗原、p53肿瘤抑制因子抗原、黑素瘤中肿瘤抗原的TCR(例如，MARTI、gp 100)、白血病(例如，WT1、次要组织相容性抗原)和乳腺癌(HER2、NY-BR1，例如)。在本申请中可使用本领域已知的任何TCR。在一些实施方式中，TCR具有对肿瘤抗原增强的亲和力。已经在，例如，US5830755和Kessels等Immunotherapy through TCR gene transfer.Nat.Immunol.2，957-961(2001)中描述了用于将TCR引入免疫细胞的示例性TCR和方法。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是TCR-T细胞。
TCR受体复合物是由具有三个二聚信号传导模块CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247(T-细胞表面糖蛋白CD3ζ链)ζ/ζ或ζ/η的可变TCR受体α和β链(γδT细胞的情况下的γ和δ链)形成的八聚复合物。每个亚单位的跨膜结构域中的可电离残基形成将复合物结合在一起的相互作用的极性网络。TCR复合物具有激活T细胞中的信号传导级联的功能。
在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞表达不止一种功能性外源受体，比如CAR或TCR受体的任何组合。
在一些实施方式中，由修饰的抗原特异性免疫细胞表达的功能性外源受体(比如CAR或TCR)靶向一种或多种肿瘤抗原。肿瘤抗原是由可引起免疫应答，特别地T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的靶向抗原的选择将取决于待治疗的特定类型的癌症。示例性肿瘤抗原包括，例如，神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒膜促性腺素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素-反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、生存蛋白和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮蛋白。
在一些实施方式中，肿瘤抗原包括一种或多种与恶性肿瘤相关抗原癌症表位。恶性肿瘤表达许多蛋白质，其可用作免疫攻击的靶抗原。这些分子包括但不限于组织特异性抗原比如MART-1、酪氨酸酶和黑素瘤中的gp100和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子的组，比如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。靶抗原的还另一组是癌胎(onco-fetal)抗原，比如癌胎抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性个体基因型免疫球蛋白构成真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，其对个体肿瘤是独特的。B细胞分化抗原，比如CD 19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。
在一些实施方式中，肿瘤抗原是肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对肿瘤细胞是独特的，并且不出现在身体中的其他细胞上。TAA相关的抗原对肿瘤细胞不是独特的，而是在不能诱导对抗原的免疫学耐受状态的条件下在正常细胞上表达。肿瘤上抗原的表达可能发生在使免疫系统能够对抗原应答的条件下。TAA可以是在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，当免疫系统不成熟且无法应答时，或它们可以是正常细胞上通常以极低水平存在的抗原，但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性示例包括以下：分化抗原比如MART-1/MelanA(MART-I)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原比如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过度表达的胚胎抗原比如CEA；过度表达的癌基因和突变的肿瘤抑制因子基因比如p53、Ras、HER2/neu；来源于染色体易位的独特的肿瘤抗原比如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原比如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白质\亲环蛋白C相关的蛋白质、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
核酸
在一些实施方式中，本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞包括编码本文所述的外源CD160蛋白质的任何一种和/或功能性外源受体的任何一种的一个或多个异源核酸序列。
在一些实施方式中，提供了包括编码本文所述的外源CD160蛋白质的任何一种的核酸序列的分离的核酸。在一些实施方式中，提供了包括编码本文所述的功能性外源受体的任何一种的核酸序列的分离的核酸。在一些实施方式中，核酸是DNA。在一些实施方式中，核酸是mRNA。在一些实施方式中，核酸是直链的。在一些实施方式中，核酸是环的。
编码外源CD160蛋白质的核酸序列和/或编码功能性外源受体的核酸可以可操作地连接至一种或多种调节序列。控制编码序列的转录和/或翻译的示例性调节序列是本领域已知的并且可包括，但不限于启动子，用于转录的适当启动、调节和/或终止(例如polyA转录终止序列)，mRNA传输(例如细胞核定位信号序列)，加工(例如剪接信号)，稳定(例如内含子和非编码5’和3’序列)，翻译(例如起始子Met、三联的前导序列、IRES核糖体结合位点、信号肽等)和将插入物引入病毒载体的插入位点的另外元件。在一些实施方式中，调节序列是允许适当表达外源CD160蛋白质和/或功能性外源受体的启动子、转录增强子和/或序列。
术语“调节序列”或“控制序列”指影响与其可操作连接的编码序列的表达的DNA序列。这种调节序列的性质取决于宿主生物而不同。在原核生物中，调节序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，调节序列包括启动子、终止子，和在某些情况下，增强子、反式激活因子或转录因子。
术语“可操作地连接”指并列，其中如描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。“可操作地连接”至编码序列的调节序列以在与调节序列相容的条件下实现编码序列的表达的这样方式连接。
如本文使用的，“启动子”或“启动子区域”指控制与其可操作连接的DNA或RNA的转录的DNA或RNA片段。启动子区包括参与RNA聚合酶识别、结合和转录启动的特定序列。另外，启动子包括调节RNA聚合酶的识别、结合和转录启动活性(即，一种或多种转录因子的结合)的序列。这些序列可以是顺式作用的或可以响应反式作用因子。取决于调节的性质，启动子可以是组成型或调节型的。调节型启动子可以是诱导型或环境响应型的(例如应答比如pH、厌氧条件、渗透压、温度、光或细胞密度的线索)。许多这种启动子序列是本领域已知的。参见，例如，美国专利号4,980,285、5,631,150、5,707,928、5,759,828、5,888,783、5,919,670和Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborPress(1989)。
在一些实施方式中，编码外源CD160蛋白质的核酸序列可操作地连接至第一启动子。在一些实施方式中，编码功能性外源受体的核酸序列可操作地连接至第二启动子。在一些实施方式中，编码外源CD160蛋白质的核酸序列和编码功能性外源受体的核酸序列可操作地连接至相同的启动子。在一些实施方式中，编码外源CD160蛋白质的核酸序列和编码功能性外源受体的核酸序列可操作地连接至不同的启动子。
在一些实施方式中，启动子是内源启动子。例如，使用本领域已知的任何方法，例如CRISPR/Cas9方法，将编码外源CD160蛋白质和/或功能性外源受体的核酸敲入内源启动子下游的修饰的抗原特异性免疫细胞的基因组。在一些实施方式中，内源启动子是丰富蛋白质，比如β-肌动蛋白的启动子。在一些实施方式中，内源启动子是诱导型启动子，例如，可通过修饰的抗原特异性免疫细胞的内源激活信号诱导。在一些实施方式中，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是T细胞，启动子是T细胞激活依赖性启动子(比如IL-2启动子、NFAT启动子或NFκB启动子)。在一些实施方式中，启动子是异源启动子。
已经探索了多种启动子用于哺乳动物细胞中的基因表达，并且本领域已知的任何启动子都可以用于本发明。启动子可以粗略地分类为组成型启动子或调节型启动子，例如诱导型启动子。在一些实施方式中，编码外源CD160蛋白质和/或功能性外源受体的异源核酸序列可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方式中，编码外源CD160蛋白质和/或功能性外源受体的异源核酸序列可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方式中，组成型启动子可操作地连接至编码外源CD160蛋白质的核酸序列，并且诱导型启动子可操作地连接至编码功能性外源受体的核酸序列。在一些实施方式中，组成型启动子可操作地连接至编码功能性外源受体的核酸序列，并且诱导型启动子可操作地连接至编码外源CD160蛋白质的核酸序列。在一些实施方式中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码外源CD160蛋白质的核酸序列，并且第二诱导型启动子可操作地连接至编码功能性外源受体的核酸序列。在一些实施方式中，第一诱导型启动子由第一诱导条件诱导，并且第二诱导型启动子由第二诱导条件诱导。在一些实施方式中，第一诱导条件与第二诱导条件相同。在一些实施方式中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子同时诱导。在一些实施方式中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子依次诱导，例如，在第二诱导型启动子之前诱导第一诱导型启动子，或在第二诱导型启动子之后诱导第一诱导型启动子。
组成型启动子允许宿主细胞中组成型表达异源基因(也称为转基因)。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)和与CMV早期增强子(CAGG)偶联的鸡β-肌动蛋白启动子。这种组成型启动子对驱动转基因表达的效率已在大量研究中得到广泛比较。在一些实施方式中，启动子是hEF1α启动子。
在一些实施方式中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子的类别。诱导型启动子可由一种或多种条件诱导，比如物理条件、修饰的抗原特异性免疫细胞的微环境或修饰的抗原特异性免疫细胞的生理状态、诱导剂(即，诱导试剂)或其组合来诱导。在一些实施方式中，诱导条件不诱导修饰的抗原特异性免疫细胞和/或接受药物组合物的受试者中的内源基因的表达。在一些实施方式中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导剂、辐照(比如电离辐射、光)、温度(比如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和修饰的抗原特异性免疫细胞的激活状态。
在一些实施方式中，启动子通过诱导剂诱导。在一些实施方式中，诱导剂是小分子，比如化学化合物。在一些实施方式中，小分子选自由以下组成的组：强力霉素、四环素、醇、金属或类固醇类。化学诱导的启动子已被最广泛地探索。这种启动子包括其转录活性受小分子化学品，比如强力霉素、四环素、醇、类固醇类、金属和其他化合物的存在或不存在调节的启动子。具有反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)和四环素响应元件启动子(TRE)的强力霉素诱导的系统是目前最成熟的系统。WO9429442描述了四环素响应启动子对真核细胞中基因表达的严格控制。WO9601313公开了四环素调节的转录调节剂。另外，Tet技术，例如Tet-on系统，已经在例如TetSystems.com的网站上描述。在本申请中，可以使用任何已知的化学调节的启动子来驱动治疗性蛋白质的表达。
在一些实施方式中，诱导剂是多肽，比如细胞表面受体的生长因子、激素或配体，例如，特异性结合肿瘤抗原的多肽。在一些实施方式中，通过修饰的抗原特异性免疫细胞表达多肽。在一些实施方式中，通过异源核酸中的核酸编码多肽。许多多肽诱导剂是也本领域已知的，并且他们可能适合用于本发明。例如，基于蜕皮激素受体的基因开关、基于孕酮受体的基因开关和基于雌激素受体的基因开关都属于采用类固醇受体衍生的反式激活因子的基因开关(WO9637609和WO9738117等)。
在一些实施方式中，诱导剂包括小分子组分和一种或多种多肽二者。例如，取决于多肽的二聚化的诱导型启动子是本领域已知的，并且可适合用于本发明。1993年开发的第一小分子CID系统使用FK1012，一种药物FK506的衍生物，来诱导FKBP的同型二聚化。通过采用相似的策略，Wu等通过使用Rapalog/FKPB-FRB*和Gibberelline/GID1-GAI二聚化依赖性基因开关，通过ON-开关方式成功地使CAR-T细胞可滴定(C.-Y.Wu等，Science 350，aab4077(2015))。其他二聚化依赖性开关系统包括香豆霉素/GyrB-GyrB(Nature 383(6596)：178-81)和HaXS/Snap-tag-HaloTag(Chemistry and Biology 20(4)：549-57)。
在一些实施方式中，启动子是光诱导型启动子，并且诱导条件是光。哺乳动物细胞中用于调节基因表达的光诱导型启动子是也本领域熟知的(参见，例如，Science 332，1565-1568(2011)；Nat.Methods 9，266-269(2012)；Nature 500：472-476(2013)；NatureNeuroscience 18:1202-1212(2015))。这种基因调节系统基于他们以下的调节可大体上分为两个类别：(1)DNA结合或(2)将转录激活结构域募集至DNA结合蛋白质。例如，在哺乳动物细胞中开发并且测试了基于黑素蛋白的合成哺乳动物蓝光控制转录系统，其响应蓝光(480nm)触发细胞内钙增加，导致钙调磷酸酶介导的NFAT动员。最近，Motta-Mena等描述了从天然存在的EL222转录因子开发的新的可诱导的基因表达系统，其赋予人细胞系和斑马鱼胚胎中转录启动的高水平、蓝光灵敏控制(Nat.Chem.Biol.10(3):196-202(2014))。另外，采用拟南芥的红光诱导相互作用的光感受器植物光敏素B(PhyB)和植物光敏素相互作用因子6(PIF6)，用于红光触发的基因表达调节。此外，还开发了紫外B(UVB)-可诱导的基因表达系统并且证明在哺乳动物细胞中靶基因转录是有效的(Gene and Cell Therapy的第25章:Therapeutic Mechanisms and Strategies，第四版CRC Press，2015年1月20日)。本文所述的任何光诱导型启动子可用于驱动本发明中治疗性蛋白质的表达。
在一些实施方式中，启动子是由光诱导的分子和光的组合诱导的光诱导型启动子。例如，化学诱导剂上的光可裂解光笼化基团使诱导剂非活性，除非光笼化基团通过辐射或其他方式去除。这种光诱导的分子包括小分子化合物、寡核苷酸和蛋白质。例如，已经开发了笼状蜕皮激素、用于与lac操纵子一起使用的笼状IPTG、用于核酶介导的基因表达的笼状丰加霉素、用于与Tet-on系统一起使用的笼状强力霉素和用于光介导的FKBP/FRB二聚化的笼状Rapalog(参见，例如，Curr Opin Chem Biol.16(3-4)：292-299(2012))。
在一些实施方式中，启动子是辐射-诱导型启动子，并且诱导条件是辐射，比如电离辐射。辐射诱导型启动子也是本领域已知的用于控制转基因表达。基因表达的改变发生在细胞辐照后。例如，一组被称为“即刻早期基因”的基因可以在电离辐射后迅速地反应。示例性即刻早期基因包括但不限于Erg-1、p21/WAF-1、GADD45α、t-PA、c-Fos、c-Jun、NF-κB和AP1。即刻早期基因在其启动子区域包括辐射响应序列。在Erg-1启动子中发现了共有序列CC(A/T)6GG(SEQ ID NO:7)，并且称为血清响应元件或称为CArG元件。已经深入研究了辐射诱导的启动子和转基因的组合，并且证明了具有治疗性益处是有效的。参见，例如，CancerBiol Ther.6(7):1005-12(2007)和Gene and Cell Therapy的第25章:TherapeuticMechanisms and Strategies，第四版CRC Press，2015年1月20日。
在一些实施方式中，启动子是热诱导型启动子，并且诱导条件是热。驱动转基因表达的热诱导型启动子也在本领域中广泛地研究。包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10等的热休克或应激蛋白(HSP)在热或其他物理和化学应激下保护细胞中起着重要作用。在临床前研究中已经尝试了几种热诱导型启动子，包括热休克蛋白(HSP)启动子和生长停滞和DNA损伤(GADD)153启动子。1985年首次描述的人hsp70B基因的启动子似乎是最高度有效的热诱导启动子之一。Huang等报道，在引入hsp70B-EGFP、hsp70B-TNFα和hsp70B-IL12编码序列后，肿瘤细胞在热处理时表达了极高的转基因表达，而在没有热处理的情况下，未检测到转基因的表达。在IL12转基因加热处理的组的小鼠体内，肿瘤生长显著延迟(CancerRes.60:3435(2000))。另一组科学家将HSV-tk自杀基因与hsp70B启动子连接，并且在携带小鼠乳腺癌的裸鼠中测试该系统。与未进行热处理的对照相比，其肿瘤已被施用hsp70B-HSVtk编码序列和热处理的小鼠显示出肿瘤消退和显著的存活率(Hum.Gene Ther.11:2453(2000))。本领域已知的另外热诱导型启动子可以在例如，Gene and Cell Therapy的第25章:Therapeutic Mechanisms and Strategies，第四版CRC Press，2015年1月20日中发现。本文讨论的任何热诱导型启动子可以用于驱动本发明的治疗性蛋白质的表达。
在一些实施方式中，启动子通过氧化还原状态诱导。通过氧化还原状态诱导的示例性启动子包括诱导型启动子和缺氧诱导型启动子。例如，Post DE等开发了在HIF活性肿瘤细胞中特异性且强烈地诱导转基因表达的缺氧诱导因子(HIF)响应启动子(GeneTher.8:1801-1807(2001)；Cancer Res.67:6872-6881(2007))。
在一些实施方式中，启动子通过修饰的抗原特异性免疫细胞的生理状态比如内源激活信号诱导。在一些实施方式中，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是T细胞，启动子是T细胞激活依赖性启动子，其通过修饰的T细胞的内源激活信号诱导。在一些实施方式中，修饰的T细胞通过诱导剂，比如佛波醇豆蔻酸乙酸酯(PMA)、离子霉素或植物血凝素激活。在一些实施方式中，修饰的T细胞通过经功能性外源受体(比如CAR或TCR)识别肿瘤细胞上的肿瘤抗原激活。在一些实施方式中，T细胞激活依赖性启动子是IL-2启动子。在一些实施方式中，T细胞激活依赖性启动子是NFAT启动子。在一些实施方式中，T细胞激活依赖性启动子是NFκB启动子。
本文所述的异源核酸序列可存在于异源基因表达盒，其包括一种或多种蛋白质编码序列和任选地一种或多种启动子。在一些实施方式中，异源基因表达盒包括单个蛋白质编码序列。在一些实施方式中，异源基因表达盒包括由单个启动子(即，多顺反子的)驱动的两个或更多个蛋白质编码序列。在一些实施方式中，异源基因表达盒进一步包括一种或多种调节序列(比如5’UTR、3’UTR、增强子序列、IRES、转录终止序列)、重组位点、一种或多种选择标志物(比如抗生素抗性基因、报告基因等)、信号序列或其组合。
在一些实施方式中，提供了包括编码本文所述的外源CD160蛋白质和/或功能性外源受体的核酸的任何一种的载体。在一些实施方式中，提供了包括编码本文所述的外源CD160蛋白质的任何一种的第一核酸序列和编码本文所述的功能性外源受体的任何一种的第二核酸序列的载体。在一些实施方式中，提供了包括包含编码本文所述的外源CD160蛋白质的任何一种的第一核酸序列的第一载体和包含编码本文所述的功能性外源受体的任何一种的第二核酸序列的第二载体的组合物。
“载体”是物质组合物，其包括分离的核酸并且其可用于将分离的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于直链多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。一般而言，合适的载体含有至少一种生物体中的复制功能的起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标志物。术语“载体”也应解释为包括促进核酸转移入细胞中的非质粒和非病毒化合物，比如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。
在一些实施方式中，载体是病毒载体。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的，并且在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)，以及其他病毒学和分子生物学手册中描述。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因传递系统提供了方便的平台。使用本领域已知的技术可以将异源核酸插入载体并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后，可以分离重组病毒并且在体外或离体将其递送至修饰的抗原特异性免疫细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施方式中，使用自我失活型慢病毒载体。例如，自失活型慢病毒载体可以用本领域已知的方案包装。使用本领域已知的方法，所得慢病毒载体可用于转导哺乳动物细胞(比如人T细胞)。
在一些实施方式中，载体是非病毒载体，比如质粒，或附加型表达载体。
在一些实施方式中，载体是表达载体。“表达载体”是可用于转化选择宿主并且提供选择宿主中编码序列的表达的构建体。表达载体可以是例如克隆载体、双元载体或整合载体。表达包括将核酸分子优选地转录至可翻译的mRNA。确保在真核细胞中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。在真核细胞的情况下，它们通常包括确保转录起始的启动子和任选地确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的示例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。此外，取决于表达系统，所使用的能够将多肽引导至细胞区室或将其分泌到介质中的前导序列可被添加至所述核酸序列的编码序列并且是本领域熟知的。前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装，优选地，能够指引翻译的蛋白质或其部分分泌到周质空间或细胞外介质中的前导序列。任选地，核酸序列可编码包括赋予期望的特征的N-末端识别肽的融合蛋白，例如表达重组产物的稳定化或简化纯化。合适的表达载体是本领域已知的，比如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pEF-DHFR和pEF-ADA(Raum等，Cancer Immunol Immunother(2001)50(3),141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
制备包括外源CD160的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法
本申请还提供了产生本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种的方法。
在某些方面中，提供了产生其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，包括：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，方法包括将前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质接触。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括结合至免疫细胞的表面分子的免疫细胞结合部分。在一些实施方式中，方法包括将编码外源CD160蛋白质的核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，核酸是mRNA。在一些实施方式中，核酸是DNA。使用本领域已知的任何转染或转导方法，包括病毒或非病毒方法，可将核酸引入修饰的抗原特异性免疫细胞。示例性非病毒转染方法包括但不限于基于化学的转染，比如使用磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体或阳离子聚合物(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)；非化学方法，例如电穿孔、细胞挤压、声穿孔、光学转染、穿刺、原生质体融合、流体动力递送或转座子；基于颗粒的方法，比如使用基因枪、磁转染或磁体辅助转染、颗粒轰击；和混合方法，比如核转染。在一些实施方式中，通过转染将核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，通过转导或电穿孔将核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。
在一些实施方式中，提供了产生在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，包括：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一种的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4具有至少约80％同一性的其变体。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQID NO:1-4具有至少约95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何一种的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞表面上的外源CD160蛋白质是以多聚体(比如，但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体)的形式。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，APC激活的抗肿瘤T细胞是DC-激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是从个体中的肿瘤分离的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，工程化的T细胞受体(TCR)识别肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在进一步的实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是多种对相同表位特异性的免疫细胞。非限制示例包括各自包括相同的功能性外源受体(比如CAR)的多种T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是各自对非相同表位(比如局部重叠，或完全不同表位)特异性的多种免疫细胞。非限制示例包括多种多克隆免疫细胞，比如多克隆TIL。
在一些实施方式中，提供了产生其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，包括：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，并且其中外源CD160蛋白质是膜结合的。
在一些实施方式中，提供产生其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，其包括：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，并且其中外源CD160蛋白质经糖磷脂酰肌醇(GPI)连接体结合至膜。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括GPI-锚定肽序列。
在一些实施方式中，提供产生其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，包括：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，并且其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T细胞受体(TCR)α亚单位、TCRβ亚单位或TCRζ亚单位。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD1。
在一些实施方式中，提供产生其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，包括：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，并且其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T细胞受体(TCR)α亚单位、TCRβ亚单位或TCRζ亚单位。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1。在一些实施方式中，细胞内结构域源自CD160剪接变体。在一些实施方式中，细胞内结构域包括源自TCR复合物的信号传导亚单位的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，TCR复合物的信号传导亚单位选自由以下组成的组中：CD3γ、CD3δ和CD3ε。在一些实施方式中，细胞内结构域包括源自T细胞刺激分子的一种或多种信号传导结构域。在一些实施方式中，信号传导结构域是4-1BB、OX40、CD27、CD28、CD80或CD258的一种或多种。在一些实施方式中，细胞内结构域包括选自由以下组成的组中两种信号传导结构域的组合：OX40、CD27、CD28、CD80和CD258。
在一些实施方式中，提供了产生其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，其包括：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，其中CD160蛋白质包括跨膜结构域和细胞内结构域，并且其中细胞内结构域包括一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括任何1、2、3、4、5、6、7、8或更多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域含有不大于1、2、3、4或5个共刺激信号传导结构域的任何一种。在一些实施方式中，细胞内结构域不包括CD3ζ信号传导结构域或4-1BB和CD3ζ结构域的组合。在一些实施方式中，共刺激信号传导结构域源自选自由以下组成的组中的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、CD80、CD258、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合。在一些实施方式中，细胞内结构域包括CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或二者。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。在一些实施方式中，CD28共刺激结构域邻近跨膜结构域。在一些实施方式中，CD28共刺激结构域邻近跨膜结构域的C-末端。在一些实施方式中，细胞内结构域包括初级信号传导结构域。在一些实施方式中，初级信号传导结构域包括CD3ζ结构域。在其他实施方式中，细胞内结构域不包括初级信号传导结构域。在其他实施方式中，细胞内结构域不包括CD3ζ结构域或4-1BB和CD3ζ结构域的组合。
在一些实施方式中，提供了产生其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，其包括：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸接触，从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，并且其中外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分结合至免疫细胞的表面分子。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分包括识别T-细胞表面分子的抗体。在一些实施方式中，抗体可以是全长抗体或抗体片段，比如scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(sdAb)或VHH结构域。非限制示例包括识别TCR和/或激活TCR信号传导的抗CD3ε抗体。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分包括结合相关T细胞表面受体的配体。非限制示例包括识别TCR和IL-2的肿瘤特异性肽MHC复合物。
在根据本文所述的方法的任何一种的一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4具有至少约80％同一性的其变体。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4具有至少约95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何一种的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞表面上的外源CD160蛋白质是以多聚体(比如，但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体)的形式。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，APC激活的抗肿瘤T细胞是DC-激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是从个体中的肿瘤分离的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，工程化的T细胞受体(TCR)识别肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在进一步的实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是多种对相同表位特异性的免疫细胞。非限制示例包括各自包括相同的功能性外源受体(比如CAR)的多种T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是各自对非相同表位(比如局部重叠，或完全不同表位)特异性的多种免疫细胞。非限制示例包括多种多克隆免疫细胞，比如多克隆TIL。
在根据产生本文所述的其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法的任何一种的一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞进一步包括编码功能性外源受体的第二核酸。在一些实施方式中，方法进一步包括使前体抗原特异性免疫细胞与编码功能性外源受体的第二核酸接触。在一些实施方式中，功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，功能性外源受体是修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，工程化的T细胞受体(TCR)识别肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在进一步的实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至相同的启动子。在一些实施方式中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至不同的启动子。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸在相同的载体上。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸在不同的载体上。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、腺相关的病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯性疱疹病毒载体及其衍生物。在一些实施方式中，载体是非病毒载体。在一些实施方式中，载体是附加型基因表达载体。在一些实施方式中，方法进一步包括分离或富集包括第一核酸和/或第二核酸的免疫细胞。在一些实施方式中，方法进一步包括用至少一种药学上可接受的载体配制修饰的抗原特异性免疫细胞。
在一些实施方式中，提供了通过本文所述的方法的任何一种获得的修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，提供了包括本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种，和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施方式中，提供了包括本文所述的核酸或载体的任何一种的分离的宿主细胞。宿主细胞可用于表达或克隆外源CD160蛋白质和/或功能性外源受体、编码外源CD160蛋白质和/或功能性外源受体的核酸或载体。合适的宿主细胞可包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞比如哺乳动物细胞。在一些实施方式中，宿主细胞包括编码第一多肽的第一载体和编码第二多肽的第二载体。在一些实施方式中，宿主细胞包括包含编码第一多肽和第二多肽的分离的核酸的单个载体。在一些实施方式中，第一多肽是外源CD160蛋白质。在一些实施方式中，第二多肽是功能性外源受体。
前体抗原特异性免疫细胞可使用本领域已知的各种方法制备。例如，初级免疫细胞，比如T细胞可从许多来源，包括外周血液单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤获得。在一些实施方式中，免疫细胞(比如T细胞)可使用任何数量的本领域已知的技术，比如FICOLLTM分离，从个体收集的血液单位中获得。在一些实施方式中，来自个体的循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方式中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并且将细胞置于合适的缓冲液或培养基中，用于后续处理步骤。在一些实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或缺乏二价阳离子，比如钙和镁的洗液洗涤细胞。如本领域普通技术人员很容易理解，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，比如根据制造商的说明通过使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、BaxterCytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，细胞可再悬浮于各种生物相容的缓冲液中，比如，例如，无Ca2+、无Mg2+PBS、PlasmaLyte A或具有或不具有缓冲液的其他盐水溶液。可选地，可以去除单采血液成分术样品的非期望的组分并且将细胞直接再悬浮于培养基中。
在一些实施方式中，通过裂解红细胞并且消耗单核细胞，例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血液淋巴细胞中分离原代T细胞。特定的T细胞亚群，比如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA和CD45RO细胞，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一个实施方式中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3x28)-缀合的珠，比如
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M-450 CD3/CD28 T孵育足以进行阳性选择期望的T细胞的时间段来分离T细胞。
在一些实施方式中，T细胞群体通过使用针对负选择细胞特有的表面标志物的抗体组合进行负选择进一步富集。例如，一种方法涉及经负磁性免疫粘附或流式细胞术的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物(cocktail)。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方式中，可期望富集或正选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节T细胞。可替选地，在某些实施方式中，T调节细胞被抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法耗尽。
将载体或核酸引入宿主细胞(比如前体抗原特异性免疫细胞)的方法是本领域已知的。可以通过物理、化学或生物方法将载体或核酸转移入宿主细胞中。
将载体或核酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、颗粒轰击、微注射、电穿孔等。产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York。在一些实施方式中，将载体通过电穿孔引入细胞。
将载体或核酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物，例如人细胞的方法。
将载体或核酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，比如大分子络合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送媒介(vehicle)的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜小泡)。
在一些实施方式中，在引入异源核酸后离体增殖转导或转染的前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，将转导或转染的前体抗原特异性免疫细胞培养以增殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天的任何一个。在一些实施方式中，将转导或转染的前体抗原特异性免疫细胞培养不大于约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天的任何一个。在一些实施方式中，进一步评估或筛选转导或转染的前体抗原特异性免疫细胞以选择修饰的抗原特异性免疫细胞。
报告基因可用于鉴定潜在转染的细胞和用于评估调节序列的功能。一般而言，报告基因是不存在于接受者生物体或组织中或不由接受者生物体或组织表达并且编码多肽的基因，该多肽的表达通过一些易于检测的特性例如酶活性来证明。在将DNA引入接受者细胞后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，FEBS Letters 479:79-82(2000))。
确认前体抗原特异性免疫细胞中异源核酸存在的其他方法，包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，比如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；生物化学测定，比如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(比如ELISA和蛋白质印迹)。
在一些实施方式中，提供了表达一种或多种本文所述的外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，提供了过度表达CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，CD160蛋白质是内源蛋白质。在一些实施方式中，CD160蛋白质是外源蛋白质。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞展示增加的增殖和/或增加的生存力。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、或10000倍或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍或1000倍至10000倍的任何一种。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至100％的任何一种。
在一些方面中，提供了增加抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力的方法，包括将编码外源CD160蛋白质的核酸引入免疫细胞。在一些实施方式中，与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、或10000倍或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍或1000倍至10000倍的任何一种。在一些实施方式中，与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、或80％至90％或90％至100％的任何一种。在一些实施方式中，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的产量的增加由CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的增殖率的增加引起。
在一些方面中，提供了增加抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力的方法，包括引起免疫细胞中CD160蛋白质的过度表达。在一些实施方式中，CD160蛋白质是内源蛋白质。在一些实施方式中，CD160蛋白质是外源蛋白质。在一些实施方式中，与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、或10000倍或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍或1000倍至10000倍的任何一种。在一些实施方式中，与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力增加至少约10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、或80％至90％或90％至100％的任何一种。在一些实施方式中，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的产量的增加由CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的增殖率的增加引起。
在一些实施方式中，提供了制造治疗性抗原特异性免疫细胞的方法，包括增加根据本文所述的方法的任何一种选择的抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力的方法。在一些实施方式中，治疗性抗原特异性免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方式中，治疗性抗原特异性免疫细胞包括功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。还提供了根据本文所述的方法的任何一种制造的治疗性抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，提供的是CD160过度表达来增加治疗性TIL、TCR-T细胞和/或CAR-T细胞产生的产量和/或生存力的用途。在一些实施方式中，提供的是外源CD160表达来增加治疗性TIL、TCR-T和/或CAR-T细胞产生的产量和/或生存力的用途。
在一些实施方式中，提供了表达一种或多种本文所述的外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，提供了过度表达CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，CD160蛋白质是内源蛋白质。在一些实施方式中，CD160蛋白质是外源蛋白质。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞展示增加的体外和/或体内溶细胞活性。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、或10000倍或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍或1000倍至10000倍的任何一种。在一些实施方式中，与不是CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞相比，CD160-修饰的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％的任何一种。
在一些方面中，提供了增加抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性的方法，包括将编码外源CD160蛋白质的核酸引入免疫细胞。在一些实施方式中，与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、或10000倍或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍或1000倍至10000倍的任何一种。在一些实施方式中，与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、或80％至90％或90％至100％的任何一种。
在一些方面中，提供了增加抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性的方法，包括引起免疫细胞中CD160蛋白质的过度表达。在一些实施方式中，CD160蛋白质是内源蛋白质。在一些实施方式中，CD160蛋白质是外源蛋白质。在一些实施方式中，与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、或10000倍或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多的任何一种。在一些实施方式中，与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约1倍至2倍、2倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍或1000倍至10000倍的任何一种。在一些实施方式中，与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性增加至少约10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、或80％至90％或90％至100％的任何一种。在一些实施方式中，提供了制造治疗性抗原特异性免疫细胞的方法，包括增加根据本文所述的任何一种方法选择的抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性的方法。在一些实施方式中，治疗性抗原特异性免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方式中，治疗性抗原特异性免疫细胞包括功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。还提供了根据本文所述的方法的任何一种制造的治疗性抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，提供的是CD160过度表达以体外和/或体内增加治疗性抗原特异性T细胞(包括但不限于TIL、TCR-T细胞和CAR-T细胞)的溶细胞活性的用途。在一些实施方式中，提供的是外源CD160表达以体外和/或体内增加治疗性抗原特异性T细胞(包括但不限于TIL、TCR-T细胞和CAR-T细胞)的溶细胞活性的用途。
III.使用外源CD160蛋白质或表达外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的治疗方法
本申请的一个方面涉及治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的任何一种本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞或任何一种本文所述的药物组合物。本申请考虑了修饰的抗原特异性免疫细胞，其可单独或以与另一疗法的任何组合施用，并且在至少一些方面中，与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用。在一些实施方式中，在施用之前，修饰的抗原特异性免疫细胞可与本领域熟知的合适的药学载体和赋形剂组合。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞源自个体。
本申请的另一方面涉及治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸，其中外源CD160蛋白质包括识别个体中免疫细胞上的表面分子的结合部分。
因此，在一些实施方式中，提供了治疗个体(例如，人)的疾病(例如，癌症)的方法，包括向个体施用有效量的包括(例如在其表面上)外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，提供了治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的包括(例如在其表面上)外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，所述修饰的抗原特异性免疫细胞通过包括以下的工艺产生：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞源自个体。在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括(a)包括(例如在其表面上)外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调；和(b)药学上可接受的载体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞源自个体。在根据任何一种本文所述的治疗方法的一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约80％同一性的其变体。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何一种的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞表面上的外源CD160蛋白质是以多聚体(比如，但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体)的形式。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，APC激活的抗肿瘤T细胞是DC-激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是从个体中的肿瘤分离的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，工程化的T细胞受体(TCR)识别肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在进一步的实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是对相同表位特异性的多种免疫细胞。非限制示例包括各自包括相同的功能性外源受体(比如CAR)的多种T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是各自对非相同表位(比如局部重叠，或完全不同表位)特异性的多种免疫细胞。非限制示例包括多种多克隆免疫细胞，比如多克隆TIL。
在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，并且其中外源CD160蛋白质是膜结合的。在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，所述修饰的抗原特异性免疫细胞通过包括以下的工艺产生：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的。
在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，和其中外源CD160蛋白质经GPI连接体结合至膜。在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，所述修饰的抗原特异性免疫细胞通过包括以下的工艺产生：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中修饰的抗原特异性免疫细胞源自个体，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，和其中外源CD160蛋白质经GPI连接体结合至膜。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括GPI-锚定肽序列。
在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，和其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域。在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，所述修饰的抗原特异性免疫细胞通过包括以下的工艺产生：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，和其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T细胞受体(TCR)α亚单位、TCRβ亚单位或TCRζ亚单位。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1。
在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，并且其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，所述修饰的抗原特异性免疫细胞通过包括以下的工艺产生：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中修饰的抗原特异性免疫细胞源自个体，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，并且其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD160、CD4、CD8、CD5、CD6、CD16、CD22、CD33、CD37、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD244、T细胞受体(TCR)α亚单位、TCRβ亚单位或TCRζ亚单位。在一些实施方式中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组中的分子：CD28、4-1BB、CD80、CD152和PD-1。在一些实施方式中，细胞内结构域源自CD160剪接变体。在一些实施方式中，细胞内结构域包括源自TCR复合物的信号传导亚单位的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，TCR复合物的信号传导亚单位选自由以下组成的组中：CD3γ、CD3δ和CD3ε。在一些实施方式中，细胞内结构域包括源自T细胞刺激分子的一种或多种信号传导结构域。在一些实施方式中，信号传导结构域是4-1BB、OX40、CD27、CD28、CD80或CD258的一种或多种。在一些实施方式中，细胞内结构域包括选自由OX40、CD27、CD28、CD80和CD258组成的组中的两种信号传导结构域的组合。
在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域和细胞内结构域，并且其中细胞内结构域包括一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，所述修饰的抗原特异性免疫细胞通过包括以下的工艺产生：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域和细胞内结构域，并且其中细胞内结构域包括一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域包括任何1、2、3、4、5、6、7、8或更多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域含有不大于1、2、3、4或5个共刺激信号传导结构域的任何一种。在一些实施方式中，细胞内结构域不包括CD3ζ信号传导结构域或4-1BB和CD3ζ结构域的组合。在一些实施方式中，共刺激信号传导结构域源自选自由以下组成的组中的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、CD80、CD258、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合。在一些实施方式中，细胞内结构域包括CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或二者。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。在一些实施方式中，CD28共刺激结构域邻近跨膜结构域。在一些实施方式中，CD28共刺激结构域邻近跨膜结构域的C-末端。在一些实施方式中，细胞内结构域包括初级信号传导结构域。在一些实施方式中，初级信号传导结构域包括CD3ζ结构域。在其他实施方式中，细胞内结构域不包括初级信号传导结构域。在其他实施方式中，细胞内结构域不包括CD3ζ结构域或4-1BB和CD3ζ结构域的组合。
在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，和其中外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，提供治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，所述修饰的抗原特异性免疫细胞通过包括以下的工艺产生：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中外源CD160蛋白质是膜结合的，和其中外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分结合至免疫细胞的表面分子。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分包括识别T-细胞表面分子的抗体。在一些实施方式中，抗体可以是全长抗体或抗体片段，比如scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(sdAb)或a VHH结构域。非限制示例包括识别TCR和/或激活TCR信号传导的抗CD3ε抗体。在一些实施方式中，免疫细胞结合部分包括结合相关T细胞表面受体的配体。非限制示例包括识别TCR和IL-2的肿瘤特异性肽MHC复合物。
在根据任何一种本文所述的治疗方法的一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约80％同一性的其变体。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括与SEQ IDNO:1-4的任何一个具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何一种的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞表面上的外源CD160蛋白质是以多聚体(比如，但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体)的形式。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，APC激活的抗肿瘤T细胞是DC-激活的抗肿瘤T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组中：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是从个体中的肿瘤分离的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是单克隆的。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞来自多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体。在一些实施方式中，功能性外源受体是修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，工程化的T细胞受体(TCR)识别肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在进一步的实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是对相同表位特异性的多种免疫细胞。非限制示例包括各自包括相同的功能性外源受体(比如CAR)的多种T细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是各自对非相同表位(比如局部重叠，或完全不同表位)特异性的多种免疫细胞。非限制示例包括多种多克隆免疫细胞，比如多克隆TIL。
在根据任何一种本文所述的治疗方法的一些实施方式中，产生修饰的抗原特异性免疫细胞的方法包括使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质接触。在一些实施方式中，外源CD160蛋白质包括结合至免疫细胞的表面分子的免疫细胞结合部分。在一些实施方式中，方法包括将编码外源CD160蛋白质的核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，核酸是mRNA。在一些实施方式中，核酸是DNA。使用本领域已知的任何转染或转导方法，包括病毒或非病毒方法，核酸可引入修饰的抗原特异性免疫细胞。示例性非病毒转染方法包括但不限于基于化学的转染，比如使用磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体或阳离子聚合物(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)；非化学方法，例如电穿孔、细胞挤压、声穿孔、光学转染、穿刺、原生质体融合、流体动力递送或转座子；基于颗粒的方法，比如使用基因枪、磁转染或磁体辅助转染、颗粒轰击；和混合方法，比如核转染。在一些实施方式中，通过转染将核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，通过转导或电穿孔将核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID No:1-4的任何一个具有至少约80％鉴定同一性的其变体。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD160蛋白质包括与SEQ IDNO:1-4具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何一种的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的修饰的抗原特异性免疫细胞，所述修饰抗原特异性免疫细胞通过包括以下的工艺产生：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是修饰的T细胞。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞是前体T细胞。在一些实施方式中，前体抗原特异性免疫细胞进一步包括编码功能性外源受体的第二核酸。在根据任何一种本文所述的治疗方法的一些实施方式中，产生修饰的抗原特异性免疫细胞的方法进一步包括将编码功能性外源受体的第二核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，功能性外源受体是修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，工程化的T细胞受体(TCR)识别肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在进一步的实施方式中，功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至相同的启动子。在一些实施方式中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至不同的启动子。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸在相同的载体上。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸在不同的载体上。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体选自由以下组成的组中：腺病毒载体、腺相关的病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯性疱疹病毒载体及其衍生物。在一些实施方式中，载体是非病毒载体。在一些实施方式中，载体是附加型基因表达载体。在一些实施方式中，方法进一步包括分离或富集包括第一核酸和/或第二核酸的免疫细胞。在根据任何一种本文所述的治疗方法的一些实施方式中，产生修饰的抗原特异性免疫细胞的方法进一步包括将修饰的抗原特异性免疫细胞与至少一种药学上可接受的载体配制。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的癌症的方法，包括向个体施用有效量的包括(例如在其表面上)外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，提供治疗个体的癌症的方法，包括向个体施用有效量的修饰的抗原特异性免疫细胞，所述修饰的抗原特异性免疫细胞通过包括以下的工艺产生：使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调。在一些实施方式中，癌症是实体癌症。在一些实施方式中，癌症是白血病或淋巴瘤。在一些实施方式中，癌症选自由以下组成的组中：黑素瘤、肺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、脑癌、卵巢癌。在一些实施方式中，癌症是病毒相关的癌症，比如HPV相关的癌症或EBV相关的癌症。在一些实施方式中，癌症是转移癌症。在一些实施方式中，治疗癌症的方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀死癌细胞；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)诱导外周T细胞重新分布；(4)在肿瘤中诱导免疫应答；(5)减小肿瘤大小；(6)缓解具有癌症的患者的一种或多种症状；(7)抑制肿瘤转移；(8)延长生存期；(9)延长癌症进展的时间；(10)预防、抑制或降低癌症复发的可能性；(11)提高个人的生活质量；(12)促进在肿瘤中的T细胞浸润和(13)降低先前存在的肿瘤转移(比如转移至淋巴结)的发生率或负担。在一些实施方式中，方法实现了至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的任何一种的肿瘤细胞死亡率。在一些实施方式中，方法减小了至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％的任何一种)的肿瘤大小。在一些实施方式中，方法抑制了至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％的任何一种)的转移。在一些实施方式中，方法延长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多个月的个体的生存期。在一些实施方式中，方法延长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多个月的癌症进展的时间。
在根据任何一种本文所述的治疗方法的一些实施方式中，施用是瘤内施用的。在一些实施方式中，施用是施用入淋巴结。在一些实施方式中，肠胃外、经皮(进入真皮)、腔内、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、鞘内或静脉内进行施用。在一些实施方式中，皮下(在皮肤下)施用药物组合物。在一些实施方式中，静脉内进行施用。
本文所述的方法适合于治疗各种癌症，包括实体癌症和液体癌症二者。方法应用于癌症的所有阶段，包括早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解期癌症。本文所述的方法可用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域已知的其他类型的癌症疗法，比如化学疗法、外科手术、激素疗法、放射、基因疗法、免疫疗法(比如T细胞疗法)、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等的组合疗法，在辅助设置或新辅助设置中(即，该方法可以在初级/最终疗法之前进行)。在一些实施方式中，方法用于治疗先前已被治疗的个体。在一些实施方式中，癌症对先前的治疗是难治的。在一些实施方式中，方法用于治疗先前未接受过治疗的个体。
在根据本文所述的方法的任何一种的一些实施方式中，包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞用作用于控制和消除已生成的实体瘤的短期溶细胞试剂。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞包括外源CD160蛋白质。在一些实施方式中，方法包括约每7、10、14、21或30天施用修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物。在一些实施方式中，方法包括约每2、3、4、5、6、7、8、9、10周施用修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物。在一些实施方式中，多次(比如2、3、4、5、6或更多次的任何一种)施用修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物。在一些实施方式中，方法进一步包括施用一种或多种治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂是以下的一种或多种：放射疗法、化学疗法或免疫疗法。在一些实施方式中，治疗剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA的任何一种。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂靶向PD-1和/或PD-L1。在一些实施方式中，治疗剂包括细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子是IL-2、IL-7、IL-12a IL-12b或IL-15。在一些实施方式中，治疗剂是进一步调节和/或引起免疫应答的物质。在一些实施方式中，治疗剂包括TLR激动剂。在一些实施方式中，治疗剂包括TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
在一些实施方式中，方法进一步包括处理治疗或预处理治疗。在一些实施方式中，处理治疗或预处理治疗用于减少或消除潜在疾病以为新骨髓创造空间。在一些实施方式中，方法进一步包括化学疗法。在一些实施方式中，在施用修饰的抗原特异性免疫细胞或修饰的药物组合物之前施用化学疗法。在一些实施方式中，在施用修饰的抗原特异性免疫细胞或修饰的药物组合物之后施用化学疗法。在一些实施方式中，化学疗法用于预处理携带癌症的个体。在一些实施方式中，方法不包括预处理。在一些实施方式中，方法不进一步包括化学疗法或化学疗法预处理。在一些实施方式中，方法不进一步包括放射疗法或放射预处理。在一些实施方式中，方法不进一步包括使用疫苗接种。在一些实施方式中，方法不进一步包括使用白细胞介素，比如但不限于白细胞介素-2(IL-2)。
在本文所述的方法中施用的有效量的修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物将取决于许多因素，比如正治疗的癌症的特定类型和阶段、施用途径、外源CD160蛋白质和/或功能性外源性受体的活性等。适当的剂量方案可由医生基于临床因素确定，包括患者的大小、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况以及同时施用的其他药物。在一些实施方式中，有效量的修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物低于诱导毒理学效应的水平(即高于临床可接受的毒性水平的效应)或处于当药物组合物施用至个体时可以控制或耐受的潜在副作用的水平。在一些实施方式中，有效量的修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物包括约105至约1010个修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，有效量的修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物包括约0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、5、10、20、50、100、200、500百万个修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种。在一些实施方式中，有效量的修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物包括约0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个十亿的修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种。
在一些实施方式中，单次(例如弹丸注射)施用修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物。在一些实施方式中，多次(比如2、3、4、5、6或更多次的任何一种)施用修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物。如果多次施用，它们可以通过相同或不同的途径进行，并且可以在相同位点或可替选的位点发生。药物组合物可以以合适的频率，比如每天一次至每年一次施用。医学领域的技术人员可以通过监测患者的疾病迹象并且相应地调整治疗来容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在一些实施方式中，方法包括约每7、10、14、21或30天施用修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物。在一些实施方式中，方法包括约每2、3、4、5、6、7、8、9、10周施用修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物。在一些实施方式中，方法包括每1、2、3、4、5、6、7或8个月施用修饰的抗原特异性免疫细胞或药物组合物。在一些实施方式中，待治疗的个体是哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于人、猴、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猫、兔子、猪、绵羊、山羊、马、牛等。在一些实施方式中，个体是人。
药物组合物
本申请进一步提供了药物组合物，其包括本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种，和任选地药学上可接受的载体。
本申请人的药物组合物可以包括任何数量的修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，药物组合物包括修饰的抗原特异性免疫细胞的单个拷贝(copy)。在一些实施方式中，药物组合物包括至少约1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109或更多个拷贝的修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种。在一些实施方式中，药物组合物包括至少约0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、5、10、20、50、100、200、500百万个修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种。在一些实施方式中，药物组合物包括至少约0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个十亿的修饰的抗原特异性免疫细胞的任何一种。在一些实施方式中，药物组合物包括单一类型的修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，药物组合物包括至少两种类型的修饰抗原的特异性免疫细胞，其中不同类型的修饰的抗原特异性免疫细胞在它们细胞来源、细胞类型、表达的嵌合受体和/或启动子等方面不同。
如本文使用的“载体(carrier)”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其以所采用的剂量和浓度对暴露于其中的细胞或个体无毒的。通常生理学上可接受的载体是水性pH缓冲溶液。合适的药物载体的示例是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液比如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。可接受的载体、赋形剂或稳定剂以所采用的剂量和浓度对接受者无毒。
包括这种载体的药物组合物可以通过熟知的常规方法配制。溶剂或稀释剂优选地是等渗的、低渗的或弱高渗的并且具有相对低的离子强度。代表性示例包括无菌水、生理盐水(例如氯化钠)、林格氏溶液、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、汉克氏溶液和其他生理平衡盐水溶液(参见，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins的最新版本)。
本文所述的药物组合物可经任何合适的途径施用。在一些实施方式中，药物组合物肠胃外、经皮(进入真皮)、腔内、动脉内(进入动脉)、肌肉内(进入肌肉)、鞘内或静脉内施用。在一些实施方式中，药物组合物皮下(在皮肤下)施用。在一些实施方式中，静脉内施用药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物经输注或注射施用至个体。在一些实施方式中，将药物组合物直接施用至靶位点，例如通过生物射弹递送至内部或外部靶位点或通过导管至动脉中的位点。在一些实施方式中，局部，例如瘤内施用药物组合物。施用可使用常规注射器和针头或本领域可获得的能够促进或改善活性剂在受试者中的递送的任何化合物或装置。
肠胃外施用的制剂包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油比如橄榄油和可注射的有机酯比如油酸乙酯。水性载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化的林格氏液或不挥发油。静脉内媒介包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(比如那些基于林格氏右旋糖)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本公开的药物组合物可包括蛋白质载体等，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选地人来源的。各种病毒制剂可在本领域中以冷冻、液体形式或冻干形式获得(例如WO98/02522、WO01/66137、WO03/053463、WO2007/056847和WO2008/114021等)。固体(例如干粉或冻干)组合物可以通过涉及真空干燥和冷冻干燥的工艺获得(参见例如WO2014/053571)。设想除了本文所述的修饰的抗原特异性免疫细胞之外，本公开的药物组合物可包括其他生物活性剂，这取决于药物组合物的预期用途。
在一些实施方式中，药物组合物被适当地缓冲以供人使用。合适的缓冲液包括但不限于能够保持生理或微碱性pH(例如从约pH 7至约pH 9)的磷酸缓冲液(例如PBS)、碳酸氢盐缓冲液和/或Tris缓冲液。在一些实施方式中，还可以通过添加合适的张度调节剂，比如甘油使药物组合物与血液等渗。
在一些实施方式中，在一次性使用的小瓶，例如一次性使用的密封小瓶中含有药物组合物。在一些实施方式中，在多次使用的小瓶中含有药物组合物。在一些实施方式中，在容器中大量含有药物组合物。
在一些实施方式中，药物组合物必须满足用于向个体施用的某些标准。例如，美国食品和药物管理局已发布监管指南，为基于细胞的免疫治疗产品设置标准，包括21CFR 610和21CFR 610.13。评估药物组合物的外观、一致性(identity)、纯度、安全性和/或功效的方法是本领域已知的方法。在一些实施方式中，药物组合物基本上不含能够产生过敏作用的外来蛋白质，比如用于细胞培养的动物来源的蛋白质，而不是修饰的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方式中，“基本上不含”是小于药物组合物总体积或重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更少中的任何一种。在一些实施方式中，药物组合物在GMP水平车间中制备。在一些实施方式中，药物组合物包括小于约5EU/kg体重/小时的内毒素用于肠胃外施用。在一些实施方式中，药物组合物中至少约70％的修饰的抗原特异性免疫细胞对于静脉内施用是活的。在一些实施方式中，当使用美国药典(USP)中描述的14天直接接种测试方法评估时，药物组合物具有“无生长”结果。在一些实施方式中，在施用药物组合物之前，应在最终收获之前约48-72小时(或与培养物的最后一次重新饲喂一致)采集包括修饰的抗原特异性免疫细胞和药学上可接受的赋形剂二者的样品进行无菌测试。在一些实施方式中，药物组合物不含支原体污染。在一些实施方式中，药物组合物不含可检测的微生物剂。在一些实施方式中，药物组合物不含传染性疾病试剂，例如I型HIV、II型HIV、HBV、HCV、人T淋巴细胞病毒I型和人T淋巴细胞病毒II型。
在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞展示出天然抗原识别。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞展示出工程化的抗原识别。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞的抗原识别至少部分由功能性外源受体，比如但不限于CAR和TCR赋予。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞靶向肿瘤相关抗原、突变的致癌和随机体细胞的抗原，和其他新抗原。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是人免疫细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是鼠免疫细胞。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞是从TCR-T细胞、CAR-T细胞、TIL或内源抗原特异性T细胞的一种或多种修饰。人和鼠TCR-T细胞、CAR-T细胞、TIL或内源抗原特异性T细胞的一些示例被报道在Tran等，Nat Immunol.2017；18(3):255-62.、MacKay等，Nat Biotechnol.2020；38(2):233-44和Schumacher等，Cancer Neoantigens.Annu Rev Immunol.2019；37:173-200，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞靶向广谱的抗原。在一些实施方式中，修饰的抗原特异性免疫细胞靶向表1中列出的抗原的一种或多种。
IV.调节抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性
本发明的一个方面提供了用于调节抗原特异性免疫细胞中CD160蛋白的免疫刺激活性的方法，包括施用治疗有效量的调节抗原特异性免疫细胞的CD160的免疫刺激活性的试剂。
在一些方面中，还提供了用于鉴定内源CD160表达、功能或活性的调节剂的方法，包括使表达CD160的免疫细胞(比如NK细胞)与测试试剂接触；并且测量测试的免疫细胞中溶细胞或炎症性途径的效应子表达和/或功能。在一个实施方式中，如果与对照免疫细胞相比，试剂调节测试的免疫细胞中溶细胞或炎症性途径的效应子表达和/或功能，则测试试剂被鉴定为CD160表达、功能或活性的调节剂。在一些实施方式中，与正常基线对照相比，CD160表达、功能或活性实质上被调节。在一些实施方式中，调节剂是CD160表达、功能或活性的抑制剂。在一些实施方式中，调节剂是CD160表达、功能或活性的激活剂。
在一些方面中，提供了用于鉴定内源CD160表达、功能或活性的调节剂的方法，包括使表达CD160的抗原特异性免疫细胞(比如NK细胞)与测试试剂接触；并且测量由测试的免疫细胞引发的体内免疫功能，比如抗原挑战后通过免疫细胞的细胞因子分泌。在一个实施方式中，如果与对照免疫细胞相比，试剂调节测试的免疫细胞中溶细胞或炎症性途径的效应子表达和/或功能，则测试试剂被鉴定为CD160表达、功能或活性的调节剂。优选地，与正常基线对照相比，CD160的表达、功能或活性实质上被调节。在一些实施方式中，调节剂是CD160表达、功能或活性的抑制剂。在一些实施方式中，调节剂是CD160表达、功能或活性的激活剂。
本发明的一个方面提供了治疗个体中免疫学疾病的方法，包括向个体施用治疗有效量的调节抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性的试剂。在一些实施方式中，免疫学疾病是自身免疫性疾病或炎症性疾病，并且其中试剂抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。
抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性
本发明的一个方面提供了抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性的方法，包括使抗原特异性免疫细胞与有效量的抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂接触。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的自身免疫性疾病的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性的试剂。在一些实施方式中，提供了治疗个体的炎症性疾病的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性的试剂。
在一些实施方式中，抑制CD160蛋白质的内源免疫刺激活性的试剂包括拮抗抗体。在一些实施方式中，抑制CD160蛋白质的内源免疫刺激活性的试剂包括拮抗蛋白质。在一些实施方式中，抑制CD160蛋白质的内源免疫刺激活性的试剂包括一种或多种核酸。在一些实施方式中，试剂是RNA干扰(RNAi)形式。在一些实施方式中，试剂是以下的一种或多种：siRNA、shRNA或miRNA。在一些实施方式中，抑制CD160蛋白质的内源免疫刺激活性的试剂包括小分子。在一些实施方式中，试剂包括显性负性形式的CD160蛋白质。
在一些实施方式中，试剂抑制CD160的内源免疫刺激活性约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一种。在一些实施方式中，试剂抑制CD160的内源免疫刺激活性约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍的任何一种。
在一些实施方式中，治疗自身免疫应答的方法包括抑制免疫应答和/或诱导耐受。减少自身免疫应答可包括但不限于针对与I型糖尿病、风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、阿尔茨海默氏疾病、ALS、亨廷顿病、帕金森氏病、系统性红斑狼疮、斯耶格伦氏病、克罗恩病或溃疡性结肠炎相关的抗原的减少免疫应答或诱导耐受。在一些实施方式中，抑制免疫应答和/或诱导耐受包括减少过敏反应。例如，减少过敏反应可包括针对与过敏哮喘、遗传过敏性皮炎、过敏鼻炎(枯草热)、食品过敏和谷蛋白过敏相关的抗原的减少免疫应答或诱导耐受。在一些实施方式中，抗原是与移植组织相关的抗原。在一些实施方式中，抑制免疫应答和/或诱导耐受包括针对移植组织的减少免疫应答或诱导耐受。在一些实施方式中，抗原与病毒相关。在一些实施方式中，抑制免疫应答和/或诱导耐受包括对病毒的减少病原性免疫应答或诱导耐受。例如，病原性免疫应答可包括由某些病毒产生的细胞因子风暴。细胞因子风暴是由细胞因子和白细胞之间的正反馈回路组成的潜在地致命的免疫反应。因此，在一些实施方式中，抑制免疫应答和/或诱导耐受包括降低或消除细胞因子风暴。
在一些实施方式中，由抗原特异性免疫细胞识别的抗原是蛋白质。在一些实施方式中，抗原是自体抗原。在一些实施方式中，自体抗原与I型糖尿病或风湿性关节炎相关。在一些实施方式中，抗原与治疗剂相关。在一些实施方式中，抗原是治疗性多肽或治疗性多肽的片段。在一些实施方式中，治疗剂是凝血因子，比如但不限于，因子VIII和因子IX。在一些实施方式中，治疗剂是抗体。在一些实施方式中，治疗剂是激素。在一些实施方式中，治疗剂是胰岛素。在一些实施方式中，治疗剂是重组细胞因子。在一些实施方式中，治疗剂是免疫检查点抑制剂。
激活免疫细胞中CD160的免疫刺激活性
在一些实施方式中，提供激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的方法，包括使抗原特异性免疫细胞与有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂接触。在一些实施方式中，方法增强了抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性并且试剂增强了抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。在一些实施方式中，方法包括使外源CD160蛋白质与抗原特异性免疫细胞接触。在一些实施方式中，方法包括使编码外源CD160蛋白质的核苷酸与抗原特异性免疫细胞接触。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。在一些实施方式中，提供治疗个体中感染的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。
在一些实施方式中，激活CD160蛋白质的免疫刺激活性的试剂包括激动肽或蛋白质。在一些实施方式中，试剂包括小分子。在一些实施方式中，激活CD160蛋白质的内源免疫刺激活性的试剂包括激动抗体。
在一些实施方式中，激活CD160蛋白质的内源免疫刺激活性的试剂包括一种或多种核酸。在一些实施方式中，试剂是DNA和/或mRNA。
在一些实施方式中，试剂激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性，其中抗原特异性免疫细胞在与试剂接触之前不展示出可检测的CD160活性。在一些实施方式中，试剂增强了抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。在一些实施方式中，试剂增强CD160的内源免疫刺激活性约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一种。在一些实施方式中，试剂增强CD160的内源免疫刺激活性约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍的任何一种。
在一些实施方式中，治疗癌症的方法包括增加对肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的免疫应答。在一些实施方式中，由抗原特异性免疫细胞识别的抗原是蛋白质。在一些实施方式中，抗原特异性免疫细胞对肿瘤抗原或肿瘤相关抗原是特异性的。在一些实施方式中，肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：间皮蛋白、EGFRvIII、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、白细胞介素-11受体a(IL-l lRa)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生的生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、MUCl、表皮生长因子受体(EGFR)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白质17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期蛋白B l、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。在一些实施方式中，抗原源自新抗体，例如，癌症相关的新抗体。在一些实施方式中，抗原包括新表位，例如，癌症相关的新表位。
在一些实施方式中，提供了治疗个体中感染的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。在一些实施方式中，提供治疗个体中感染的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。
在一些实施方式中，治疗感染的方法包括增加对与传染剂相关的抗原的免疫应答。在一些实施方式中，抗原是非自身抗原。在一些实施方式中，抗原是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
V.基于肿瘤环境中CD160的水平或活性治疗癌症的方法。
本发明的一个方面涉及治疗癌症的方法，其中CD160可用作预测抗原特异性T细胞的功能状态并且因此预测免疫疗法的功效的生物标志物。那些细胞中较高的CD160表达可显示抗原特异性T细胞的激活状态，而CD160表达的低水平或不存在可显示抗原特异性T细胞的非激活状态。
因此，在一些实施方式中，提供了治疗个体的癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的包括抗原特异性免疫细胞的组合物，其中个体中内源CD160水平或活性用作选择用于治疗的个体的基础。在一些实施方式中，如果个体具有高CD160水平或活性，则个体被选择用于治疗。在一些实施方式中，如果个体具有低CD160水平或活性，则个体被选择用于治疗。在一些实施方式中，CD160水平或活性通过免疫组织化学方法确定。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160蛋白质表达水平。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160 mRNA水平。在一些实施方式中，测量个体的肿瘤中CD160水平或活性。在一些实施方式中，测量个体的肿瘤浸润T细胞(TIL)中CD160水平或活性。在一些实施方式中，测量个体的外周T细胞中CD160水平或活性。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的包括包含(例如在其表面上)外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的组合物，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中免疫细胞是T细胞，和其中个体中内源CD160水平或活性用作选择用于治疗的个体的基础。在一些实施方式中，如果个体具有高CD160水平或活性，则个体被选择用于治疗。在一些实施方式中，如果个体具有低CD160水平或活性，则个体被选择用于治疗。在一些实施方式中，CD160水平通过免疫组织化学方法确定。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160蛋白质表达水平。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160 mRNA水平。在一些实施方式中，测量个体的肿瘤中CD160水平或活性。在一些实施方式中，测量个体的肿瘤浸润T细胞(TIL)中CD160水平或活性。在一些实施方式中，测量个体的外周T细胞中CD160水平或活性。
在一些实施方式中，提供治疗个体的癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的包括一种或多种免疫检查点抑制剂的组合物，其中个体中内源CD160水平或活性用作选择用于治疗的个体的基础。在一些实施方式中，如果个体具有高CD160水平或活性，则个体被选择用于治疗。在一些实施方式中，如果个体具有低CD160水平或活性，则个体被选择用于治疗。在一些实施方式中，CD160水平通过免疫组织化学方法确定。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160蛋白质表达水平。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160 mRNA水平。在一些实施方式中，测量个体的肿瘤中CD160水平或活性。在一些实施方式中，测量个体的肿瘤浸润T细胞(TIL)中CD160水平或活性。在一些实施方式中，测量个体的外周T细胞中CD160水平或活性。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA的任何一种。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的包括激活CD160的免疫刺激活性的试剂的组合物，其中个体中内源CD160水平或活性用作选择用于治疗的个体的基础。在一些实施方式中，如果个体具有高CD160水平或活性，则个体被选择用于治疗。在一些实施方式中，如果个体具有低CD160水平或活性，则个体被选择用于治疗。在一些实施方式中，CD160水平通过免疫组织化学方法确定。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160蛋白质表达水平。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160 mRNA水平。在一些实施方式中，测量个体的肿瘤中CD160水平或活性。在一些实施方式中，测量个体的肿瘤浸润T细胞(TIL)中CD160水平或活性。在一些实施方式中，测量个体的外周T细胞中CD160水平或活性。在一些实施方式中，激活CD160蛋白质的免疫刺激活性的试剂包括激动肽或蛋白质。在一些实施方式中，试剂包括小分子。在一些实施方式中，激活CD160蛋白质的内源免疫刺激活性的试剂包括激动抗体。在一些实施方式中，激活CD160蛋白质的内源免疫刺激活性的试剂包括一种或多种核酸。在一些实施方式中，试剂是DNA和/或mRNA。在一些实施方式中，试剂激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性，其中抗原特异性免疫细胞在与试剂接触之前不展示出可检测的CD160活性。在一些实施方式中，试剂增强了抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。在一些实施方式中，试剂增强CD160的内源免疫刺激活性约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一种。在一些实施方式中，试剂增强CD160的内源免疫刺激活性约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍的任何一种。
在其他方面中，提供了选择(包括鉴定)具有癌症(比如黑素瘤或肺癌)的个体以用包括治疗剂的组合物治疗的方法，其中方法包括确定个体的CD160水平或活性。在一些实施方式中，提供了选择(包括鉴定)具有癌症(比如黑素瘤或肺癌)的个体以用包括免疫疗法的组合物治疗的方法，其中方法包括确定个体的CD160水平或活性。在一些实施方式中，选择具有高水平CD160的个体用于治疗。在一些实施方式中，选择具有低水平CD160的个体用于治疗。在一些实施方式中，CD160的水平基于蛋白质表达水平确定。在一些实施方式中，CD160的水平基于mRNA水平确定。在一些实施方式中，CD160的水平通过免疫组织化学测定确定。
在一些实施方式中，通过与对照(比如本文所述的任何一种对照)比较来确定水平(例如，高或低)。在一些实施方式中，方法进一步包括将CD160水平或活性与对照比较。在一些实施方式中，基于评分系统，比如本文所述的H-评分系统来确定水平(例如，高或低)。可以使用与非对照样品相同的来源和方法获得对照样品。在一些实施方式中，对照样品获得自不同个体(例如不具有癌症的个体和/或共享相似种族、年龄和性别特征的个体)。在一些实施方式中，当样品是肿瘤组织样品时，对照样品可以是来自相同个体的非癌性样品。在一些实施方式中，多个对照样品(例如来自不同个体)用于确定特定组织、器官或细胞群中CD160活性水平的范围。在一些实施方式中，对照样品是已被确定为合适对照的培养组织或细胞。在一些实施方式中，对照是不表达CD160的细胞。在一些实施方式中，对照是表达高水平CD160的细胞。在一些实施方式中，标准化测试中临床接受的正常水平用作确定相关组织中CD160活性的对照水平。在一些实施方式中，根据评分系统，比如用于CD160染色的基于免疫组织化学的评分系统，例如本文进一步讨论的H-评分，将受试者中的参考CD160水平或活性分类为高、中或低。在一些实施方式中，当H-分数小于或等于总中值H-分数时，受试者中的参考CD160水平或活性被分类为低样本。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的包括在其表面上包含功能性外源受体的修饰的抗原特异性免疫细胞的组合物，其中免疫细胞是T细胞，和其中个体中CD160水平或活性用作选择用于癌症治疗的修饰的抗原特异性免疫细胞的基础。在一些实施方式中，如果细胞具有高CD160水平或活性，则修饰的抗原特异性免疫细胞被选择用于治疗。在一些实施方式中，如果细胞具有低CD160水平或活性，则修饰的抗原特异性免疫细胞被选择用于治疗。在一些实施方式中，CD160水平通过免疫组织化学方法确定。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160蛋白质表达水平。在一些实施方式中，CD160水平或活性基于CD160 mRNA水平。在一些实施方式中，CD160水平或活性与不包括外源功能受体的前体免疫细胞比较。在一些实施方式中，在其表面上包括外源功能受体的修饰的抗原特异性免疫细胞的CD160水平或活性与在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞比较。在一些实施方式中，在其表面上包括外源功能受体的修饰的抗原特异性免疫细胞的CD160水平或活性与在其表面上包括外源显性负性形式的CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞比较。
在根据本文所述的方法的任何一种的一些实施方式中，CD160的水平基于CD160蛋白质表达水平确定。在一些实施方式中，CD160的水平基于mRNA水平确定。在一些实施方式中，核苷转运蛋白的水平通过免疫组织化学测定确定。在一些实施方式中，通过与对照(比如本文所述的任何对照)比较确定水平(例如，高或低)。在一些实施方式中，基于评分系统，比如本文所述的H-评分系统确定水平(例如，高或低)。在一些实施方式中，评分基于如美国专利公开号2013/0005678中描述的“H-评分”。H-评分由下式获得：3×强染色细胞的百分数+2×中等染色细胞的百分数+弱染色细胞的百分数，得出0至300的范围。
VI.试剂盒和制品
还提供了包括本文所述的任何一种修饰的抗原特异性免疫细胞或组合物(例如药物组合物)的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施方式中，提供了含有本文所述的任何一种药物组合物和优选地提供其使用说明的试剂盒。在一些实施方式中，除了修饰的抗原特异性免疫细胞之外，试剂盒进一步包括第二癌症疗法，比如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法。试剂盒可以针对个体的特定癌症定制，并且包括对个体的相应的第二癌症疗法。
还提供了包括任何一种CD160表达、功能或活性的调节剂(比如抑制剂或活化剂)或任何一种调节(比如抑制或激活)CD160活性的试剂的试剂盒、单位剂量和制品。
试剂盒可含有一种或多种另外组分，比如容器、试剂、培养基、诱导剂、细胞因子、缓冲剂、抗体等，以允许修饰的抗原特异性免疫细胞的增殖或诱导。试剂盒还可含有用于将药物组合物局部施用(比如瘤内注射)至肿瘤位点的装置。
在另一方面中，提供试剂盒，其包括1)包括包含外源功能受体(比如CAR)的修饰抗原特异性细胞、CD160活性的调节剂和/或免疫疗法(比如免疫检查点抑制剂)的组合物和2)用于确定CD160水平或活性的试剂。在一些实施方式中，用于确定CD160表达水平的试剂是识别CD160蛋白质的抗体。
本申请的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可任选地提供另外组分，比如缓冲剂和解释性信息。本申请因此还提供制品，其包括小瓶(比如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、软包装等。试剂盒的一些组分可以以水性介质或冻干形式包装。
制品可包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料比如玻璃或塑料形成。一般而言，容器容纳对治疗本文所述的疾病或失调(比如癌症)有效的组合物，并且可具有无菌入口(例如，容器可以是具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定病症。标签或包装插页将进一步包括用于向个体施用组合物的说明。标签可指示重构和/或使用的说明书。容纳药物组合物的容器可以是多用途小瓶，其允许重构制剂的重复施用(例如，2-6次施用)。包装插页指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明，其含有有关使用这种治疗性产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。此外，制品还可进一步包括第二容器，其包括药学上可接受的缓冲液，比如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。从商业和用户的角度来看，它可进一步包括其他期望的材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
试剂盒或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其以足以在药房例如医院药房和复合药房中储存和使用的量包装。
示例性实施方式
本发明提供以下列举的实施方式。
实施方式1.一种在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中免疫细胞是T细胞。
实施方式2.根据实施方式1所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、抗原呈递细胞(APC)-激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。
实施方式3.根据实施方式1所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。
实施方式4.根据实施方式2所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。
实施方式5.根据实施方式1所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。
实施方式6.根据实施方式1-5的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的其变体。
实施方式7.根据实施方式1-5的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质是膜结合的。
实施方式8.根据实施方式7所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质经GPI连接体结合至膜。
实施方式9.根据实施方式7所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域。
实施方式10.根据实施方式9所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质进一步包括细胞内结构域。
实施方式11.根据实施方式9或10所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质进一步包括来自CD160剪接变体的细胞内结构域。
实施方式12.根据实施方式10所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中细胞内结构域包括源自TCR复合物的信号传导亚单位的细胞内信号传导结构域。
实施方式13.根据实施方式12所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中TCR复合物的信号传导亚单位选自由以下组成的组：CD3γ、CD3δ和CD3ε。
实施方式14.根据实施方式10所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中细胞内结构域包括CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或二者。
实施方式15.根据实施方式14所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
实施方式16.根据实施方式14所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
实施方式17.据实施方式10-16的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中细胞内结构域包括初级信号传导结构域。
实施方式18.根据实施方式17所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中初级信号传导结构域包括CD3ζ结构域。
实施方式19.据实施方式10-16的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中细胞内结构域不包括初级信号传导结构域。
实施方式20.根据实施方式7所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。
实施方式21.根据实施方式20所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中免疫细胞结合部分结合至免疫细胞的表面分子。
实施方式22.根据实施方式1-21的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体。
实施方式23.根据实施方式22所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。
实施方式24.根据实施方式22所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式25.一种产生其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，其包括：
使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，
其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中免疫细胞是T细胞。
实施方式26.根据实施方式25所述的方法，其中修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。
实施方式27.根据实施方式25所述的方法，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。
实施方式28.根据实施方式26所述的方法，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。
实施方式29.根据实施方式26所述的方法，其中免疫细胞选自由以下组成的组：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。
实施方式30.根据实施方式25-29的任一项所述的方法，其中方法包括将前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质接触。
实施方式31.根据实施方式30所述的方法，其中外源CD160蛋白质包括结合至免疫细胞的表面分子的免疫细胞结合部分。
实施方式32.根据实施方式25-29的任一项所述的方法，其中方法包括将编码外源CD160蛋白质的核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。
实施方式33.根据实施方式32所述的方法，其中核酸是mRNA。
实施方式34.根据实施方式32所述的方法，其中核酸是DNA。
实施方式35.根据实施方式32-34的任一项所述的方法，其中通过转染将核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。
实施方式36.根据实施方式32-34的任一项所述的方法，其中通过转导或电穿孔将核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。
实施方式37.根据实施方式25-36的任一项所述的方法，其中CD160蛋白质包括SEQID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的其变体。
实施方式38.根据实施方式25-37的任一项所述的方法，其中外源CD160蛋白质是膜结合的。
实施方式39.根据实施方式38所述的方法，其中外源CD160蛋白质经GPI连接体结合至膜。
实施方式40.根据实施方式38所述的方法，其中外源CD160蛋白质包括跨膜结构域。
实施方式41.根据实施方式39所述的方法，其中外源CD160蛋白质进一步包括细胞内结构域。
实施方式42.根据实施方式40或41所述的方法，其中外源CD160蛋白质进一步包括来自CD160剪接变体的细胞内结构域。
实施方式43.根据实施方式41所述的方法，其中细胞内结构域包括源自TCR复合物的信号传导亚单位的细胞内信号传导结构域。
实施方式44.根据实施方式43所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中TCR复合物的信号传导亚单位选自由以下组成的组：CD3γ、CD3δ和CD3ε。
实施方式45.根据实施方式41所述的方法，其中细胞内结构域包括CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或二者。
实施方式46.根据实施方式45所述的方法，其中外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
实施方式47.根据实施方式45所述的方法，其中外源CD160蛋白质从N-末端至C-末端包括：细胞外CD160结构域、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
实施方式48.根据实施方式41-47的任一项所述的方法，其中细胞内结构域包括初级信号传导结构域。
实施方式49.根据实施方式48所述的方法，其中初级信号传导结构域包括CD3ζ结构域。
实施方式50.根据实施方式41-47的任一项所述的方法，其中细胞内结构域不包括初级信号传导结构域。
实施方式51.根据实施方式38所述的方法，其中外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。
实施方式52.根据实施方式51所述的方法，其中免疫细胞结合部分结合至免疫细胞的表面分子。
实施方式53.根据实施方式25-52的任一项所述的方法，其中前体抗原特异性免疫细胞包括编码功能性外源受体的第二核酸。
实施方式54.根据实施方式25-52的任一项所述的方法，其进一步包括使前体抗原特异性免疫细胞与编码功能性外源受体的第二核酸接触。
实施方式55.根据实施方式53或54所述的方法，其中功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。
实施方式56.根据实施方式53或54所述的方法，其中功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式57.根据实施方式54-56的任一项所述的方法，其中第一核酸和第二核酸可操作地连接至相同的启动子。
实施方式58.根据实施方式54-56的任一项所述的方法，其中第一核酸和第二核酸可操作地连接至不同的启动子。
实施方式59.根据实施方式54-58的任一项所述的方法，其中第一核酸和第二核酸在相同的载体上。
实施方式60.根据实施方式54-59的任一项所述的方法，其中第一核酸和/或第二核酸在不同的载体上。
实施方式61.根据实施方式59或60所述的方法，其中载体是病毒载体。
实施方式62.根据实施方式61所述的方法，其中病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、腺相关的病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、附加型载体表达载体、单纯性疱疹病毒载体及其衍生物。
实施方式63.根据实施方式59或60所述的方法，其中载体是非病毒载体。
实施方式64.根据实施方式25-63的任一项所述的方法，其进一步包括分离或富集包括第一和/或第二核酸的免疫细胞。
实施方式65.根据实施方式25-64的任一项所述的方法，其进一步包括将表达CD160的修饰的抗原特异性免疫细胞与至少一种药学上可接受的载体配制。
实施方式66.通过实施方式25-65的任一项所述的方法获得的修饰的抗原特异性免疫细胞。
实施方式67.一种药物组合物，其包括根据实施方式1-24和66的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞和药学上可接受的载体。
实施方式68.治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的根据实施方式1-24和66的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞或实施方式67所述的药物组合物。
实施方式69.根据实施方式68所述的方法，其中修饰的抗原特异性免疫细胞源自个体。
实施方式70.一种治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸，其中外源CD160蛋白质包括识别个体中免疫细胞上的表面分子的结合部分。
实施方式71.根据实施方式68-70的任一项所述的方法，其中施用是瘤内施用。
实施方式72.根据实施方式68-70的任一项所述的方法，其中施用是施用入淋巴结。
实施方式73.根据实施方式68-72的任一项所述的方法，其中疾病是癌症。
实施方式74.根据实施方式73所述的方法，其中癌症是实体瘤。
实施方式75.根据实施方式73或74所述的方法，其中癌症是转移癌症。
实施方式76.根据实施方式73-75的任一项所述的方法，其中癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、脑癌、卵巢癌。
实施方式77.根据实施方式68-76的任一项所述的方法，其中个体是人。
实施方式78.一种抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性的方法，包括使抗原特异性免疫细胞与有效量的抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂接触。
实施方式79.一种激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的方法，包括使抗原特异性免疫细胞与有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂接触。
实施方式80.根据实施方式79所述的方法，其中方法增强了抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性，和其中试剂增强抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。
实施方式81.一种治疗个体中免疫学疾病的方法，包括向个体施用治疗有效量的调节抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性的试剂。
实施方式82.根据实施方式81所述的方法，其中免疫学疾病是自身免疫性疾病或炎症性疾病，并且其中试剂抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。
实施方式83.一种治疗个体中癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。
实施方式84.一种治疗个体中感染的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。
实施方式85.一种增加抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力的方法，包括将编码外源CD160蛋白质的核酸引入免疫细胞。
实施方式86.一种增加抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力的方法，包括引起免疫细胞中CD160蛋白质的过度表达。
实施方式87.根据实施方式86所述的方法，其中CD160蛋白质是内源蛋白质。
实施方式88.根据实施方式86所述的方法，其中CD160蛋白质是外源蛋白质。
实施方式89.根据实施方式85所述的方法，其中与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量增加至少约：0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍的任何一种。
实施方式90.根据实施方式85所述的方法，其中与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的生存力增加至少约：0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍的任何一种。
实施方式91.根据实施方式85-88的任一项所述的方法，其中与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的产量增加至少约：0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍的任何一种。
实施方式92.根据实施方式85-88的任一项所述的方法，其中与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的生存力增加至少约：0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍的任何一种。
实施方式93.一种制造治疗性抗原特异性免疫细胞的方法，其包括选自根据实施方式85至92的任一项所述的方法的用于增加抗原特异性免疫细胞的产量和/或生存力的方法。
实施方式94.根据实施方式93所述的方法，其中治疗性抗原特异性免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
实施方式95.根据实施方式93所述的方法，其中治疗性抗原特异性免疫细胞包括功能性外源受体。
实施方式96.根据实施方式95所述的方法，其中功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式97.根据实施方式95所述的方法，其中功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。
实施方式98.一种增加抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性的方法，包括将编码外源CD160蛋白质的核酸引入免疫细胞。
实施方式99.一种增加抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性的方法，包括引起免疫细胞中CD160蛋白质的过度表达。
实施方式100.根据实施方式99所述的方法，其中CD160蛋白质是内源蛋白质。
实施方式101.根据实施方式99所述的方法，其中CD160蛋白质是外源蛋白质。
实施方式102.根据实施方式98所述的方法，其中与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外溶细胞活性增加至少约：0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍的任何一种。
实施方式103.根据实施方式98所述的方法，其中与不表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，表达外源CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体内溶细胞活性增加至少约：0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍的任何一种。
实施方式104.根据实施方式98-101的任一项所述的方法，其中与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体外溶细胞活性增加至少约：0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍的任何一种。
实施方式105.根据实施方式98-101的任一项所述的方法，其中与不过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞相比，过度表达CD160蛋白质的抗原特异性免疫细胞的体内溶细胞活性增加至少约：0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或10000倍的任何一种。
实施方式106.一种制造治疗性抗原特异性免疫细胞的方法，其包括选自根据实施方式98至105的任一项所述的方法的用于增加抗原特异性免疫细胞的体外和/或体内溶细胞活性的方法。
实施方式107.根据实施方式106所述的方法，其中治疗性抗原特异性免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
实施方式108.根据实施方式106所述的方法，其中治疗性抗原特异性免疫细胞包括功能性外源受体。
实施方式109.根据实施方式108所述的方法，其中功能性外源受体是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方式110.根据实施方式108所述的方法，其中功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)。
实施例
实施例1：Pmel T细胞中mCD160的异位表达
为了检查免疫细胞中CD160的功能，在抗肿瘤T细胞中异位表达小鼠CD160的GPI锚定形式并且通过FACS分析进行量化。
具体地，将小鼠全长CD160(mCD160)克隆至基于MSCV的逆转录病毒载体并且通过P2A间隔子与GFP报告基因融合，从而允许CD160和GFP蛋白质的独立合成(图1A)。然后将mCD160病毒转导入Pmel T细胞中，其带有识别人黑素瘤抗原GP100的小鼠同系物的TCR。
如通过FACS分析指示的，CD160的异位表达导致Pmel T细胞上CD160表达增加约2.5倍，其通常表达低内源水平的CD160(图1B、1C)。
实施例2：CD160表达增强了Pmel T细胞针对培养中的B16F0黑素瘤细胞的CTL功能
为了显示异位CD160表达对T细胞的溶细胞功能的影响，测量了颗粒酶A和穿孔素的表达、炎症性细胞因子的表达以及CD160修饰的Pmel T细胞的杀伤活性。模拟感染的PmelT细胞用作对照。
具体地，如实施例1中描述的将mCD160病毒转导入Pmel T细胞中，并且通过FACS测量颗粒酶A和穿孔素的表达。颗粒酶A和穿孔素是颗粒胞吐途径中的两种必需蛋白质，用于T细胞和NK细胞介导的杀伤。如图2A中显示的，与对照Pmel T细胞相比，增加了颗粒酶A和穿孔素的表达，指示外源mCD160增强了肿瘤特异性T细胞的内在CTL功能。
使用FACS，与对照Pmel T细胞相比，在CD160修饰的Pmel T细胞中测量炎症性细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达谱。如图2B中显示的，与对照Pmel T细胞相比，增加了IFN-γ和TNF-α的表达，指示外源mCD160增强了肿瘤特异性T细胞的炎症性活性。
还检查了CD160修饰的Pmel T细胞杀伤肿瘤细胞的能力并且与对照Pmel T细胞比较。简言之，用抗CD3和抗CD28珠刺激Pmel T细胞，并且在具有IL-2的T细胞扩增培养基中培养3天。在第3天，靶肿瘤细胞B16F0在37℃温热10min，用1μM CELLTRACETM Violet(Invitrogen)在37℃标记30min，并且然后接种到96孔培养板上。将对照或CD160修饰的Pmel T细胞以限定的效应子与靶细胞的比例添加入每个孔中，并且然后孵育四到六小时。随后收获靶细胞，用7-氨基放线菌素D(7-AAD，BD Pharmingen)标记，并且通过FACS分析以确定效应T细胞的任何杀伤。CELLTRACETM Violet染料+/7-AAD+细胞的群体代表已被杀死的靶细胞，并且CELLTRACETM Violet染料+/7-AAD-群体代表剩余的活靶细胞。如图2C中显示的，与对照T细胞相比，CD160修饰的Pmel T细胞在杀伤共培养中的B16F0黑素瘤细胞更有效。
综上所述，结果显示CD160的异位表达增强了内在溶细胞活性、促进了炎症性功能和提高了抗原特异性T细胞的肿瘤杀伤活性。
实施例3：CD160表达增强了Pmel T细胞对小鼠的B16F0黑素瘤的控制
为了检查异位CD160是否可以增强体内抗原特异性T细胞的肿瘤控制活性，将CD160修饰的Pmel T细胞过继转移入携带皮下B16F0黑素瘤肿瘤的接受者小鼠中。
具体地，将1x105B16F0细胞皮下注射入6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠中。在过继细胞转移之前，将小鼠随机分配以确保在实验开始时没有大小偏差。在一项实验中，在植入后第8天，将单剂量的0.1、0.2、0.3或0.4百万个CD160修饰的Pmel T细胞或0.3百万个对照Pmel T细胞过继转移入携带肿瘤的小鼠中(图3A)。每周两次通过触诊检查小鼠的肿瘤形成，并且通过卡尺测量肿瘤面积。肿瘤面积代表每组至少5只小鼠的平均测量值(+/-SEM，双尾t检验)。如图3A中显示的，CD160修饰的Pmel显示出对应答于CD160-Pmel T细胞转移的肿瘤控制的剂量依赖性影响。
在单独的实验中，分析了CD160修饰的抗原特异性T细胞和非抗原特异性T细胞的过继转移对B16F0黑素瘤肿瘤的控制的影响(图3B)。简言之，在植入后第8天，将单剂量的0.3百万个每种(i)对照Pmel T细胞、(ii)CD160修饰的抗原特异性Pmel T细胞或(iii)CD160修饰的非抗原特异性脾脏T细胞过继转移入携带肿瘤的小鼠中。如图3B中显示的，尽管通过非抗原特异性脾脏T细胞对肿瘤控制仅有助于适度且统计上不显著的影响，但CD160的异位表达显著增强了肿瘤特异性Pmel T细胞的肿瘤控制活性。
综上所述，这些结果表明，肿瘤特异性T细胞中的异位CD160表达可增强了同基因有免疫能力的小鼠肿瘤模型中的肿瘤控制。
实施例4：不具有IL-2和疫苗接种的情况下CD160修饰的T细胞可控制和消除已建立的B16F0黑素瘤肿瘤
为了检查CD160-修饰的Pme1 T细胞在消除已建立的肿瘤的能力，在化学疗法预处理后将CD160-Pmel T细胞过继转移至携带建立的B16F0黑素瘤肿瘤的小鼠。
简言之，将1x105B16F0细胞皮下注射入6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠中。在肿瘤植入后，每天观察小鼠并且在出现发病迹象时处死。每周两次通过触诊检查小鼠的肿瘤形成，通过卡尺测量测量肿瘤面积。在过继细胞转移之前，将小鼠随机分配以确保在实验开始时没有大小偏差。从在肿瘤植入后第7天开始，在间隔14天时用Pmel T细胞输注小鼠，其中每次T细胞输注前均用环磷酰胺(CYP)预处理方案(每次治疗100mg/kg)，但没有任何接种疫苗和IL-2输注。平均肿瘤大小在植入后第35天达到峰值。相应地绘制了标准化蜘蛛图，将第35天的峰值肿瘤大小标准化为“1”，以阐释应答于使用对照Pmel T细胞或CD160修饰的Pmel T细胞治疗的肿瘤大小的相对变化。如图4A中显示的，在小鼠中CD160修饰的Pmel T细胞的过继转移登记了接近100％应答率，在超过80％的小鼠中肿瘤缩小了大于90％或完全消除。
还测量了通过CD160修饰的Pmel T细胞的过继转移的存活率改善。如图4C中显示的，在以CYP和CD160修饰的Pmel T细胞的每两周治疗施用的小鼠中，在植入后直至110天未观察到死亡。相反地，用单独的CYP或用CYP和对照Pmel T细胞治疗的小鼠在植入后75天之前死亡，并且分别在植入后27天或60天展示出中位存活期。
综上所述，结果表明，过继转移CD160修饰的Pmel T细胞与CYP预处理可有效地控制和消除已建立的B16F0黑素瘤肿瘤，并且特别是不需要任何IL-2细胞因子或疫苗接种方案。
实施例5：CD160修饰的Pmel T细胞对B16F0黑素瘤的控制是剂量依赖性的
为了表征CD160修饰的Pmel T细胞对B16F0黑素瘤的控制的剂量依赖性影响，以0.15百万或0.3百万个CD160修饰的Pmel T细胞输注携带B16F0的小鼠。
简言之，将1x105B16F0细胞皮下注射入6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠中。在肿瘤植入后，每天观察小鼠并且在出现发病迹象时处死。每周两次通过触诊检查小鼠的肿瘤形成，通过卡尺测量测量肿瘤面积。在过继细胞转移之前，将小鼠随机分配以确保在实验开始时没有大小偏差。从在肿瘤植入后第7天开始，以14天的间隔(每两周)用(A)0.15百万或(B)0.3百万个CD160修饰的Pmel T细胞输注小鼠，其中每次T细胞输注之前CYP处理方案(每次治疗100mg/kg)。如实施例4中描述的类似地标准化并且绘制蜘蛛图。
在每两周转移0.15百万个CD160修饰的Pmel T细胞的剂量方案，在治疗的小鼠之中观察到肿瘤控制的100％的应答率，尽管只有20-30％小鼠展现出肿瘤尺寸减小90％以上(图5A)。相比之下，在每两周转移0.3百万CD160-Pmel T细胞的剂量方案，在治疗的小鼠中观察到肿瘤缩小的100％应答率，约40-50％的小鼠展示出肿瘤尺寸减小90％以上(图5B)。
还测量了通过在2个剂量下过继转移CD160修饰的Pmel T细胞的存活率改善。在两种剂量下，用CD160修饰的Pmel T细胞治疗的携带肿瘤的小鼠显示出显著的存活率改善，对于分别用0.15或0.3百万个CD160修饰的Pmel T细胞治疗的小鼠在植入后120天时具有80％或100％存活率(图5C)。相反地，用单独CYP或CYP和对照Pmel T细胞治疗的小鼠在90天之前死亡，分别具有在植入后61.5天或56天的中位存活期。
综上所述，这些结果表明过继转移CD160修饰的Pmel T细胞与CYP预处理可有效控制和消除已建立的B16F0黑素瘤肿瘤，并且肿瘤控制效果是剂量依赖性的。
实施例6：CD160修饰的Pmel T细胞有效控制转移性B16F10黑素瘤肿瘤的生长
为了检查CD160修饰的Pmel1 T细胞抑制转移性肿瘤的生长的能力，在化学疗法预处理后将CD160-Pmel T细胞过继转移至携带转移性B16F10黑素瘤肿瘤的小鼠中。
简言之，将1x105B16F10细胞皮下注射入6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠中。在肿瘤植入后，每天观察小鼠并且在出现发病迹象时处死。每周两次通过触诊检查小鼠的肿瘤形成，通过卡尺测量测量肿瘤面积。在过继细胞转移之前，将小鼠随机分配以确保在实验开始时没有大小偏差。从在肿瘤植入后第7天开始，以14天间隔(每两周)用0.3百万个CD160修饰的Pmel T细胞输注小鼠，其中每次T细胞输注前均采用CYP处理方案(每次治疗100mg/kg)。
如图6A显示的，CD160修饰的Pmel T细胞，当与CYP预处理组合时，与未治疗的小鼠、仅用CYP化学疗法治疗的小鼠或用对照Pmel T细胞和CYP预处理治疗的小鼠相比，能够显著阻止平均肿瘤大小的增加。肿瘤面积代表每组至少5只小鼠的平均测量值(+/-SEM，双尾t检验)。图6B显示了与未治疗、仅CYP治疗或用对照Pmel T细胞和CYP的治疗相比，CD160修饰的Pmel T细胞(具有CYP预处理)控制个体肿瘤生长的能力。
综上所述，与未经治疗的小鼠、仅用CYP化学疗法治疗的小鼠或用对照Pmel T细胞和CYP预处理治疗的小鼠相比，过继转移的CD160修饰的Pmel T细胞当与CYP预处理组合时，显示出有效控制皮下肿瘤的生长。
还检查了CD160修饰的Pmel T细胞的长期肿瘤控制和生存率改善。与实施例4类似地标准化肿瘤大小的蜘蛛图。
如图7A中显示的，可通过在治疗期间过继转移CD160-Pmel T细胞来控制或消除皮下肿瘤。如图7B中显示的，未治疗的小鼠、仅用CYP化学疗法治疗的小鼠和用对照Pmel T细胞和CYP预处理治疗的小鼠由于转移在植入后80天之前均死亡，分别具有植入后39天、39天和59天的中位生存期。相反地，用CD160-Pmel T细胞和CYP预处理治疗的小鼠的组在植入后120天(图7B)和整个连续输注CD160修饰的Pmel T细胞的持续时间(数据未显示)保持80％存活率。
综上所述，这些结果表明CD160修饰的Pmel T细胞，除了控制皮下肿瘤的生长，还可主张控制和抑制肿瘤转移。
实施例7：增强的小鼠CD160激活嵌合体的肿瘤抑制活性
为了研究CD160的肿瘤抑制活性是否可以用另外结构域调节，小鼠CD160的细胞外结构域以各种构造与来自TCR的细胞内信号传导结构域及其共刺激途径融合，包括CD3ξ、CD28和4-1BB，来驱动CD160激活嵌合体，如图8A-C中显示的。测量了在控制已建立的B16F0黑素瘤小鼠中表达这些CD160嵌合体的Pmel T细胞的能力，并且与表达GPI-锚定小鼠CD160(mCD160)的比较。
简言之，将1x105B16F10细胞皮下注射入6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠中。在肿瘤植入后，每天观察小鼠并且在出现发病迹象时处死。每周两次通过触诊检查小鼠的肿瘤形成，通过卡尺测量测量肿瘤面积。在过继细胞转移之前，将小鼠随机分配以确保在实验开始时没有大小偏差。从在肿瘤植入后第7天开始，以14天的间隔(每两周)用0.3百万个分别异位表达mCD160、GEM 123、GEM124、GEM 125、GEM 126、GEM 127或GEM 128的Pmel T细胞输注小鼠，其中每次T细胞输注之前用CYP处理方案(每次治疗100mg/kg)。
如图8A中观察的，与表达mCD160的Pmel T细胞相比，表达GEM 125(一种具有远离跨膜结构域的CD28信号传导结构域的嵌合体)的Pmel T细胞展示出较弱的肿瘤控制；而与表达mCD160的Pmel T细胞相比，表达GEM 124(一种具有邻近跨膜结构域的CD28信号传导结构域的嵌合体)的Pmel T细胞展示出较强的肿瘤控制。这些结果指示，位于邻近跨膜的CD28信号传导结构域可进一步提高CD160嵌合体增强抗原特异性T细胞的免疫应答的能力。
如图8B中观察的，与表达mCD160的Pmel T细胞相比，表达GEM 127(一种具有邻近跨膜结构域的4-1BB信号传导结构域的嵌合体)的Pmel T细胞展示出较弱的肿瘤控制；而与表达mCD160的Pmel T细胞相比，表达GEM 126(一种具有域邻近跨膜结构域的CD28信号传导结构的嵌合体)的Pmel T细胞展示出较强的肿瘤控制。这些结果指示CD28信号传导结构域，而不是4-1BB结构域，当位于邻近跨膜结构域时，可进一步提高CD160嵌合体增强抗原特异性T细胞的免疫应答的能力。
如图8C中观察的，与表达mCD160的Pmel T细胞相比，表达GEM 123(一种具有邻近跨膜结构域的CD3ξ信号传导结构域的嵌合体)的Pmel T细胞展示出较弱的肿瘤控制。另外，与mCD160相比，GEM 128，一种具有在跨膜结构域的远端处包括CD3ξ结构域的三个信号传导结构域的嵌合体，展示出显著较低的肿瘤控制，尽管邻近跨膜结构域携带CD28信号传导结构域。
综上所述，这些结果指示CD28共刺激结构域，当邻近跨膜结构域，可进一步提高CD160嵌合体增强抗原特异性T细胞(图8A、B中的GEM 124、GEM 126)的免疫应答的能力。然而，CD160增强肿瘤控制的能力可能与整合的CD3ξ(图8B、8C中的GEM 123、GEM 127、GEM128)不相容。
实施例8：人CD160及其变体在控制小鼠的已建立的B16F0黑素瘤中具有保守功能
为了比较人CD160变体与小鼠CD160的肿瘤抑制活性，测量了表达这些各自形式的CD160的Pmel T细胞在控制已建立的B16F0黑素瘤小鼠中的能力。
简言之，将1x105B16F10细胞皮下注射入6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠中。在肿瘤植入后，每天观察小鼠并且在出现发病迹象时处死。每周两次通过触诊检查小鼠的肿瘤形成，通过卡尺测量测量肿瘤面积。在过继细胞转移之前，将小鼠随机分配以确保在实验开始时没有大小偏差。为了实现CD160实体的异位表达，分别用携带GPI锚定小鼠CD160、GPI锚定人CD160变体、跨膜人CD160变体或具有细胞内结构域的跨膜人CD160的病毒感染Pmel T细胞。在肿瘤植入后第7天开始，以14天的间隔(每两周)用0.3百万个异位表达描述的小鼠或人CD160变体的Pmel T细胞输注小鼠，其中每次T细胞输注前均采用CYP处理方案(每次治疗100mg/kg)。
如图10A中观察的，与表达mCD160的Pmel T细胞相比，所有表达人CD160变体的Pmel T细胞在控制和消除已建立的B16F0黑素瘤肿瘤中展示出更强的活性。特别地，表达GPI锚定人CD160的Pmel T细胞和表达具有细胞内结构域的人CD160的Pmel T细胞在肿瘤控制中展示出最强的活性。
还测量了通过过继转移表达各种CD160变体的Pmel T细胞的存活率改善。如图10B中显示的，表达GPI锚定人CD160的Pmel T细胞和表达具有细胞内结构域的人CD160的PmelT细胞提供了最强的存活率改善。
综上所述，这些结果表明人CD160变体在增强肿瘤特异性T细胞以控制和消除小鼠的已建立的B16F0黑素瘤肿瘤中展示出与小鼠CD160一样的保守功能，提示了它们在控制人的已建立的实体瘤中可能具有相似的功能。
实施例9：CD160修饰的LLC TIL抑制小鼠的转移性刘易斯肺癌的发展
为了检查CD160修饰的抗原特异性免疫细胞抑制转移性肺癌的发展的能力，检查了CD160修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在体外杀伤路易斯肺癌的能力和在路易斯肺癌小鼠模型中改善体内存活率的能力。
为了获得TIL，肺肿瘤从携带路易斯肺癌的小鼠分离并且小心地切成小块，然后在37℃用胶原酶V消化。单细胞悬浮液通过将消化的样品通过70-100μm的细胞过滤器获得。根据需要，使用注射器柱塞轻轻挤压消化的组织通过细胞过滤器。然后，用抗TCRβ缀合的藻红蛋白(PE)染色单细胞悬浮液，进一步用抗PE磁珠富集，并且最后在SONY SH800 FACS分拣机上分类。如通过FACS分析确定，在描述的实验中使用的分类的TIL的纯度是85％以上。然后，修饰TIL以表达mCD160或CD160嵌合体GEM124(参见图8A)。
首先检查CD160修饰的TIL杀伤肿瘤细胞的能力并且与对照TIL比较。简言之，用抗CD3和抗CD28珠刺激TIL，并且在具有IL-2的T细胞扩增培养基中培养3天。在第3天，靶肿瘤细胞LLC在37℃温热10min，在37℃用1μM CELLTRACETM Violet(Invitrogen)标记30min，并且然后接种到96孔培养板上。对照或CD160修饰的TIL以限定的效应子与靶细胞的比例添加入每个孔中，然后孵育四至六小时。随后收获靶肿瘤细胞，用7-氨基放线菌素D(7-AAD，BDPharmingen)标记，并且通过FACS分析以确定TIL的任何杀伤。CELLTRACETM Violet染料+/7-AAD+细胞的群体代表了已被杀死的靶细胞，并且CELLTRACETM Violet染料+/7-AAD-群体代表剩余的活靶细胞。
如图11A中显示的，mCD160修饰的TIL在杀死共培养的路易斯肺癌细胞中比TIL更有效。
还检查了CD160修饰的TIL抑制体内转移性肺癌的发展的能力。为了生成转移性肺癌模型，通过气管内滴注将2x105-2x106个路易斯肺癌细胞(LLC)直接引入6至8周龄雌性C57BL/6小鼠的肺中。在过继细胞转移之前，将小鼠随机分配以确保在实验开始时没有大小偏差。从在肿瘤植入后第10天开始，以12天间隔用0.3百万个对照TIL或异位表达mCD160或GEM124的TIL输注小鼠，其中每次T细胞输注前都采用CYP处理方案(每次治疗100mg/kg)。原发性皮下肿瘤一般由CYP治疗方案控制，并且随后小鼠由于肺转移发生死亡。在肿瘤植入后，每天观察小鼠并且在出现发病迹象时处死。通过触诊或卡尺测量每周两次检查小鼠的肿瘤形成。一旦肿瘤大小达到直径1.2-1.5cm或皮肤溃疡时处死小鼠并且收获肿瘤(图11B)。
值得注意的是，在实验终止时，用表达GEM124的TIL治疗的小鼠在植入后75天具有90％的存活率，而用表达mCD160的TIL输注的小鼠具有70天的中位生存期。相反地，未治疗的小鼠、仅用CYP治疗的小鼠或用对照TIL和CYP治疗的小鼠分别展示出42、47和47天的中位存活期(图11C)。
综上所述，这些结果表明CD160可增强在体外和体内肺癌TIL的肿瘤控制活性。此外，由于从小鼠肺癌中提取的TIL本质上是多克隆的，这些结果还指示CD160及其激活嵌合体可通过这种携带识别多种肿瘤抗原的TCR的内源性多克隆抗肿瘤T细胞增强肿瘤控制能力。
实施例10：CD160修饰的人CAR-T细胞展示出改善的增殖、减少的细胞凋亡和增强的体内和体外肿瘤控制
为了确定CD160是否可增强人CAR-T细胞的功能，将CD19-CAR-T细胞修饰为过度表达CD160，然后检查它们在培养中增殖的能力，以及它们体外和体内针对肿瘤的功能活性。
简言之，人T细胞被设计为共表达具有跨膜结构域和细胞溶质结构域二者的人CD160变体(称为huCD160TC)，以及用于识别CD19阳性肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原的CD19-嵌合抗原受体(CD19-CAR)(图12A)。还显示了使用慢病毒载体共表达由2A肽连接的CD19-CAR和huCD160TC的示例性方法(图12B)。CD160修饰的CD19-CAR-T细胞是通过用慢病毒转导人T细胞产生的(图12A、12B)，并且随后在培养和肿瘤模型中测试功能改善。
为了检查CD160对培养的人CAR-T细胞功能改善的能力，然后对CD160修饰的CD19-CAR-T细胞进行扩增培养，并且每天记录它们的生长率并且与非CD160修饰的CD19-CAR-T细胞进行比较。简言之，从人外周血中分离T细胞，并且通过使用描述的慢病毒载体共表达CD19-CAR和huCD160TC进行修饰。在培养的第一周期间，通过用图12B中的慢病毒转导修饰相应的T细胞以表达huCD160TC和CD19-CAR，或被修饰以仅表达CD19-CAR。然后将仅表达CD19-CAR的T细胞或CD160修饰的CD19-CAR-T细胞培养在具有适当生长因子的T细胞扩增培养基中。随后，为了确定细胞浓度和生存率，将细胞用1μg/ml碘化丙啶染色，与荧光计数珠(Spherotech)混合，并且在SP6800 Sony Spectral流式细胞计数器上进行分析。在仪器上或使用FCS Express直接分析数据，以确定绝对细胞计数以及活细胞和死细胞的百分比。通过组合细胞计数和分裂因子计算两周长的培养期间T细胞扩增的程度，并且使用PRISM软件绘制。
如图13A中显示的，具有huCD160TC过度表达的人CD19-CAR T细胞始终比不具有那些的更有效地扩增。在这个培养系统中，T细胞在第一周期间经历了激活和感染过程，并且通常扩增有限。与该过程一致，增殖的差异在培养的第一周期间不那么显著，但在培养的第二周期间变得更显而易见。值得注意的是，在培养开始后的第14-16天，与如通过台盼蓝染色或使用碘化丙啶(PI)或7AAD的FACS分析确定的，与未过度表达huCD160TC的对照CAR-T细胞相比，具有CD160TC过度表达的人CD19-CAR T细胞具有显著更低的死亡细胞的百分数(图13B)。这些结果表明表达CD160TC的CD19-CAR T细胞展示出更高的增殖潜力，并且在后期细胞培养中不易发生细胞死亡，因此指示CAR-T细胞中的CD160过度表达可用于增强CAR-T细胞产生。重要地，表达CD160TC的CD19-CAR T细胞和对照CAR T细胞在培养两周后基本上停止增殖(数据未显示)，指示CAR-T细胞中的过度表达CD160不会导致不受控制的T细胞扩增。
为了检查CD160TC过度表达对体外CD19-CAR-T细胞对肿瘤的功能活性的改善，评估了CD160修饰的CD19-CAR T细胞对CD19阳性肿瘤培养物的溶细胞功能。简言之，靶肿瘤细胞Nalm6或Ramos或CD19+/K562细胞在37℃温热10min，用1μM CELLTRACETM Violet(Invitrogen)在37℃标记30min，然后接种到96孔培养板上。对照或CD160修饰的CAR-T细胞以指定的效应子与靶细胞的比例添加入每个孔中，并且然后孵育24-48小时。随后收获靶细胞，用7-氨基放线菌素D(7-AAD，BD PHARMINGENTM)标记，并且通过FACS分析以确定效应T细胞的任何杀伤。CELLTRACETM Violet染料+/7-AAD+细胞的群体代表已被杀死的靶细胞，并且CELLTRACETM Violet染料+/7-AAD-群体代表剩余的活靶细胞。如图13C中显示的，与对照CD19-CAR T细胞相比，共表达huCD160TC CD19-CAR的人T细胞展示出增强培养中Ramos细胞(CD19+)(CD19+)的杀伤。更重要地，具有huCD160TC的CD19-CAR T细胞也表达升高水平的炎症性细胞因子IFN-γ，如通过细胞内染色和FACS分析指示的(图13D)。这些结果表明CD160过度表达可以增强培养中人CAR-T细胞的炎症性功能和溶细胞活性。
为了检查CD160TC过度表达对体内CD19-CAR-T细胞对肿瘤的功能活性的改善，评估了通过CD160修饰的CD19-CAR-T细胞对携带Nalm6或Ramos肿瘤(CD19阳性肿瘤)的三重免疫缺陷NCG小鼠施加的肿瘤控制。具有或不具有CD160修饰的相应的CD19-CAR-T细胞过继转移至携带静脉递送的Nalm6/Luc肿瘤的NCG小鼠中。具体地，在肿瘤植入后14、21和28天，每只小鼠转移0.5百万个CD160修饰的CD19-CAR T细胞或对照CD19-CAR T细胞，并且通过使用Licor成像分析仪方测量荧光素酶活性来观察对肿瘤生长的影响(图13E)。对照小鼠是未治疗的(无)。结果显示CD160修饰的CD19-CAR T细胞在肿瘤控制中比对照CD19-CAR T细胞显著更有效。而且，在施用CAR-T细胞剂量下，与未接受CAR-T细胞的对照小鼠相比，接受CD160修饰的CD19-CAR T细胞治疗的NCG/Ramos模型小鼠展现出显著的存活益处，而对照CD19-CAR-T细胞没有(图13F)。综上所述，这些结果表明CD160表达显著增强CD19-CAR T细胞体外和体内肿瘤控制的活性。然而，重要的是要指出，上述对NCG小鼠进行的分析可能低估了CD160增强有免疫能力的人患者的肿瘤控制中CAR-T细胞功能的功能，这可能比上述结果所证明的更强。免疫缺陷的NCG小鼠不能用于重现有免疫能力的人患者中存在的稳态和肿瘤内在屏障。鉴于CD160过度表达可以帮助抗原特异性T细胞克服免疫活性小鼠的特异性抑制屏障，很可能在靶向血液癌症和实体瘤二者的有免疫能力的人患者中，CD160修饰对CAR-T细胞的肿瘤控制将具有更强影响。
实施例11：CD160-修饰的人TCR-T细胞展示出体内和体外改善的增殖和增强的肿瘤控制
为了确定CD160是否可增强人TCR-T细胞的功能，将1G4-TCR-T细胞修饰为过度表达CD160，然后检查它们在培养中增殖的能力，以及它们体外和体内针对肿瘤的功能活性。
简言之，人T细胞被设计为共表达具有跨膜结构域和细胞溶质结构域的人类CD160变体(称为huCD160TC)，以及临床上验证的识别NY-ESO-1肿瘤相关抗原的TCR的1G4-T细胞受体(1G4-TCR)(图14A)。还显示了共表达三种多肽链：TCRα链、TCRβ链和huCD160TC的示例性方法，所有都使用慢病毒载体通过2A肽连接(图14B)。CD160修饰的1G4-TCR-T细胞通过用慢病毒转导人T细胞产生(图14A、14B)，并且随后在培养和肿瘤模型中测试功能改善。
在共表达huCD160TC和1G4-TCR的T细胞和仅表达1G4-TCR的T细胞中测量1G4-TCR水平。如图15A中观察的，人T细胞中1G4TCR-T细胞与CD160TC的共表达引起1G4TCR表达水平的轻微降低，如NY-ESO-1四聚体的FACS分析指示的。
为了检查CD160在TCR-T培养中改善功能的能力，然后对CD160修饰的1G4-TCR-T细胞进行扩增培养，并且每天记录它们的生长率并且与非CD160修饰的1G4-TCR-T细胞进行比较。简言之，从人外周血分离的T细胞通用过图14B中的慢病毒转导被修饰以表达huCD160TC和1G4-TCR二者，或修饰为仅表达1G4-TCR。仅表达1G4-TCR的T细胞或CD160修饰的1G4-TCR-T细胞随后在具有适当生长因子的T细胞扩增培养基中培养。随后，为了确定细胞浓度和生存率，将细胞用1μg/ml碘化丙啶染色，与荧光计数珠(Spherotech)混合，并且在SP6800Sony Spectral流式细胞计数器上进行分析。在仪器上或使用FCS Express直接分析数据，以确定绝对细胞计数以及活细胞和死细胞的百分比。通过组合细胞计数和分裂因子计算一周的培养期间T细胞扩增的程度，并且使用PRISM软件绘制。
如图15B中显示的，具有huCD160TC过度表达的人1G4-TCR T细胞始终比不具有的那些更有效地扩增。在这个培养系统中，T细胞在第一周期间经历了激活和感染过程，并且通常扩增有限。与该过程一致，增殖的差异在培养的第一周期间不那么显著，但在培养的第二周期间变得更显而易见。值得注意的是，在培养开始后的第14-16天，与对照TCR-T细胞(数据未显示)相比，具有CD160TC过度表达的人1G4 TCR-T细胞具有显著更低的死亡细胞的百分数，指示表达CD160TC的1G4-TCR-T细胞展示出更高的增殖潜力以及在后期细胞培养中不易发生细胞死亡，指示TCR-T细胞中CD160过度表达可用于增强TCR-T细胞产生。同样重要的是要注意表达CD160TC的1G4-TCR-T细胞和对照TCR-T细胞在培养两周后基本上停止增殖(数据未显示)，指示TCR-T细胞中过度表达CD160不会导致不受控制的T细胞扩增。而且，1G4TCR-T细胞中过度表达CD160没有显著影响具有干/记忆表型的T细胞的百分数，如通过FACS分析确定的(CD45+/CD62+)(图15C)。
为了检查CD160过度表达对体外1G4-TCR-T细胞对肿瘤的功能活性的改善，如通过IFN-γ的细胞内染色和基于FACS的CTL测定指示的评估了huCD160TC修饰的1G4-TCR-T细胞对NY-ESO-1阳性肿瘤培养物的溶细胞功能。简言之，将靶NY-ESO-1阳性A375肿瘤细胞在37℃温热10min，在37℃用1μM CELLTRACETM Violet(Invitrogen)标记30min，然后接种到96孔培养板上。对照或CD160修饰的1G4TCR-T细胞以指定的效应子与靶细胞的比例添加入每个孔中，然后孵育24-48小时。随后收获靶细胞，用7-氨基放线菌素D(7-AAD，BD PHARMINGENTM)标记，并且通过FACS分析以确定效应T细胞的任何杀伤。CELLTRACETM Violet染料+/7-AAD+细胞的群体代表已被杀死的靶细胞，并且CELLTRACETM Violet染料+/7-AAD-群体代表剩余的活靶细胞。如图15D中显示的，与未过度表达huCD160TC的对照1G4-TCR-T细胞相比，发现共表达huCD160TC和1G4-TCR二者的人T细胞在杀死培养中的NY-ESO-1阳性A375细胞更有效。更重要地，如通过细胞内染色和FACS分析指示的，过度表达huCD160TC的1G4-TCR-T细胞也展示出升高的炎症性细胞因子IFN-γ水平(图15E)。这些结果表明CD160过度表达可增强培养的人CAR-T细胞的炎症性功能和溶细胞活性。
为了检查CD160TC过度表达对体内1G4-TCR-T细胞对肿瘤的功能活性的改善，还评估了CD160修饰的1G4-TCR-T细胞对携带A375黑素瘤肿瘤(NY-ESO-1-阳性肿瘤)的NCG小鼠施加的肿瘤控制。将具有或不具有CD160修饰的相应CD19-CAR-T细胞过继转移至携带皮下NY-ESO-1阳性A375黑素瘤肿瘤的NCG小鼠。具体地，在皮下肿瘤植入后14、21和28天时，每只小鼠转移1百万个CD160修饰的CD19-CAR T细胞或对照CD19-CAR T细胞，并且通过用卡尺测量的肿瘤大小观察对肿瘤生长的影响(图15F)。对照小鼠是未治疗的(无)。如图15F中显示的，CD160修饰的1G4-TCR-T细胞在肿瘤控制中比对照1G4-TCR-T细胞显著更有效。综上所述，这些结果表明CD160过度表达显著增强了1G4 TCR-T细胞在体外和体内肿瘤控制中的活性。
然而，重要的是要指出，上述分析可能低估了CD160增强有免疫能力的人患者的肿瘤控制中的CAR-T细胞功能，其可能比上述结果所证明的更强。NCG小鼠是免疫缺陷的，并且不能用于来重现有免疫能力的人患者中存在的稳态和肿瘤内在屏障。鉴于CD160过度表达可以帮助抗原特异性T细胞，以克服有免疫能力的小鼠的某些抑制屏障，很可能在靶向血液癌症和实体瘤二者的人患者中CD160修饰对人TCR-T细胞对肿瘤控制将具有更强影响。
实施例12：CD160-修饰人TIL展示处体内和体外增强的肿瘤控制
为了确定CD160是否可以增强人TIL的功能，将自体TIL修饰为过度表达CD160，然后检查了它们体外和体内针对肿瘤的功能活性。
产生患者来源的异种移植(PDX)模型以检查CD160对肿瘤控制中人TIL的影响。将从具有各种癌症，比如肺癌、食道癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌的癌症患者中切除的肿瘤组织移植且传代入NSG免疫缺陷小鼠中，以生成具有人类肿瘤的PDX模型。自体TIL从肺癌、食道癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌和其他癌症的相应肿瘤中分离，扩增并且冷冻保存，用于PDX模型中TIL的肿瘤控制中CD160修饰和功能测试。
生成CD160修饰的TIL以确定CD160是否可以增强人TIL的功能(图16)。为此，来自人患者的TIL被设计为过度表达huCD160TC(图17A)。显示了使用慢病毒载体通过2A肽连接的过度表达huCD160TC和GFP标志物的示例性方法(图17B)。然后通过用慢病毒转导人T细胞生成CD160修饰的TIL(图17A、17B)，并且随后在培养和具有自体肿瘤的PDX肿瘤模型中测试功能改善。
为了检查CD160TC过度表达对体外人TIL对肿瘤的功能活性的改善，通过使用基于FACS的CTL测定评估了CD160修饰的人TIL对来自PDX模型的自体肿瘤细胞的溶细胞功能。简言之，自体食管肿瘤细胞在37℃温热10min，在37℃用1μM CSFE染料(Invitrogen)标记30min，然后接种到96孔培养板上。对照或CD160修饰的TIL以指定的效应子与靶细胞的比例添加入每个孔中，然后孵育24小时。随后收获靶细胞，用7-氨基放线菌素D(7-AAD，BDPHARMINGENTM)标记，并且通过FACS分析以确定效应T细胞的任何杀伤。CSFE染料+/7-AAD+细胞的群体代表已被杀死的靶细胞，并且CSFE染料+/7-AAD-群体代表剩余的活靶细胞。如图18A中显示的，与未过度表达huCD160TC的对照人TIL相比，发现过度表达huCD160TC的人TIL在杀死培养中的自体食道癌细胞中更有效。
为了检查CD160TC过度表达对体内人TIL对肿瘤的功能活性的增强，还评估了CD160修饰的人TIL对携带皮下自体肿瘤的NCG小鼠的肿瘤控制。将具有或不具有CD160修饰的相应人TIL过继转移至携带皮下自体食管肿瘤的NCG小鼠中。具体地，在皮下在肿瘤植入后在7、14和21天时，每只小鼠转移1百万个CD160修饰的TIL或对照TIL，并且通过用卡尺测量肿瘤大小来观察对肿瘤生长的影响(图18B)。对照小鼠施用PBS(无)。如图所示。如图18B中显示的，CD160修饰的TIL在肿瘤控制中比对照TIL显著更有效。综上所述，这些结果表明CD160过度度表达显著增强了TIL在体外和体内施加肿瘤控制的活性。
序列表
<110> 阿奇洛伊斯生物制药公司
<120> 在抗原特异性免疫细胞中调节CD160功能的方法及其用途
<130> 75659-20002.40
<140> 还未分配
<141> 同时在此
<150> US 62/812,897
<151> 2019-03-01
<160> 7
<170> Windows 版本 4.0 的FastSEQ
<210> 1
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Leu Leu Glu Pro Gly Arg Gly Cys Cys Ala Leu Ala Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ile Val Asp Ile Gln Ser Gly Gly Cys Ile Asn Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Ser Gln Glu Gly Thr Arg Leu Asn Leu Ile Cys Thr Val Trp His
35 40 45
Lys Lys Glu Glu Ala Glu Gly Phe Val Val Phe Leu Cys Lys Asp Arg
50 55 60
Ser Gly Asp Cys Ser Pro Glu Thr Ser Leu Lys Gln Leu Arg Leu Lys
65 70 75 80
Arg Asp Pro Gly Ile Asp Gly Val Gly Glu Ile Ser Ser Gln Leu Met
85 90 95
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100 105 110
Cys Ala Arg Ser Gln Lys Ser Gly Ile Arg Leu Gln Gly His Phe Phe
115 120 125
Ser Ile Leu Phe Thr Glu Thr Gly Asn Tyr
130 135
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Leu Leu Glu Pro Gly Arg Gly Cys Cys Ala Leu Ala Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ile Val Asp Ile Gln Ser Gly Gly Cys Ile Asn Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Ser Gln Glu Gly Thr Arg Leu Asn Leu Ile Cys Thr Val Trp His
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50 55 60
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65 70 75 80
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<210> 3
<211> 234
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Leu Leu Glu Pro Gly Arg Gly Cys Cys Ala Leu Ala Ile Leu Leu
1 5 10 15
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145 150 155 160
Gly Phe Leu Gln Glu Lys Val Trp Val Met Leu Val Thr Ser Leu Val
165 170 175
Ala Leu Gln Gly Met Ser Lys Arg Ala Val Ser Thr Pro Ser Asn Glu
180 185 190
Gly Ala Ile Ile Phe Leu Pro Pro Trp Leu Phe Ser Arg Arg Arg Arg
195 200 205
Leu Glu Arg Met Ser Arg Gly Arg Glu Lys Cys Tyr Ser Ser Pro Gly
210 215 220
Tyr Pro Gln Glu Ser Ser Asn Gln Phe His
225 230
<210> 4
<211> 141
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Met Gln Arg Ile Leu Met Ala Pro Gly Gln Ser Cys Cys Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ala Ile Val Asn Phe Gln His Gly Gly Cys Ile His Val
20 25 30
Thr Ser Ser Ala Ser Gln Lys Gly Gly Arg Leu Asp Leu Thr Cys Thr
35 40 45
Leu Trp His Lys Lys Asp Glu Ala Glu Gly Leu Ile Leu Phe Trp Cys
50 55 60
Lys Asp Asn Pro Trp Asn Cys Ser Pro Glu Thr Asn Leu Glu Gln Leu
65 70 75 80
Arg Val Lys Arg Asp Pro Glu Thr Asp Gly Ile Thr Glu Lys Ser Ser
85 90 95
Gln Leu Val Phe Thr Ile Glu Gln Ala Thr Pro Ser Asp Ser Gly Thr
100 105 110
Tyr Gln Cys Cys Ala Arg Ser Gln Lys Pro Glu Ile Tyr Ile His Gly
115 120 125
His Phe Leu Ser Val Leu Val Thr Ala Leu Tyr Thr Leu
130 135 140
<210> 5
<211> 185
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
Met Gln Arg Ile Leu Met Ala Pro Gly Gln Ser Cys Cys Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ala Ile Val Asn Phe Gln His Gly Gly Cys Ile His Val
20 25 30
Thr Ser Ser Ala Ser Gln Lys Gly Gly Arg Leu Asp Leu Thr Cys Thr
35 40 45
Leu Trp His Lys Lys Asp Glu Ala Glu Gly Leu Ile Leu Phe Trp Cys
50 55 60
Lys Asp Asn Pro Trp Asn Cys Ser Pro Glu Thr Asn Leu Glu Gln Leu
65 70 75 80
Arg Val Lys Arg Asp Pro Glu Thr Asp Gly Ile Thr Glu Lys Ser Ser
85 90 95
Gln Leu Val Phe Thr Ile Glu Gln Ala Thr Pro Ser Asp Ser Gly Thr
100 105 110
Tyr Gln Cys Cys Ala Arg Ser Gln Lys Pro Glu Ile Tyr Ile His Gly
115 120 125
His Phe Leu Ser Val Leu Val Thr Gly Asn His Thr Glu Ile Arg Gln
130 135 140
Arg Gln Arg Ser His Pro Asp Phe Ser His Ile Asn Gly Thr Leu Ser
145 150 155 160
Ser Gly Phe Leu Gln Val Lys Ala Trp Gly Met Leu Val Thr Ser Leu
165 170 175
Val Ala Leu Gln Ala Leu Tyr Thr Leu
180 185
<210> 6
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = M或无
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = Q或无
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = R或无
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa = I或M
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = M或L
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = A或E
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Q或R
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa = S或G
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> Xaa = N或D
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> Xaa = F或I
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> Xaa = H或S
<220>
<221> 变体
<222> 31
<223> Xaa = H或N
<220>
<221> 变体
<222> 32
<223> Xaa = V或I
<220>
<221> 变体
<222> 39
<223> Xaa = K或E
<220>
<221> 变体
<222> 41
<223> Xaa = G或T
<220>
<221> 变体
<222> 44
<223> Xaa = D或N
<220>
<221> 变体
<222> 46
<223> Xaa = T或I
<220>
<221> 变体
<222> 49
<223> Xaa = L或V
<220>
<221> 变体
<222> 54
<223> Xaa = D或E
<220>
<221> 变体
<222> 59
<223> Xaa = L或F
<220>
<221> 变体
<222> 60
<223> Xaa = I或V
<220>
<221> 变体
<222> 61
<223> Xaa = L或V
<220>
<221> 变体
<222> 63
<223> Xaa = W或L
<220>
<221> 变体
<222> 67
<223> Xaa = N或R
<220>
<221> 变体
<222> 68
<223> Xaa = P或S
<220>
<221> 变体
<222> 69
<223> Xaa = W或G
<220>
<221> 变体
<222> 70
<223> Xaa = N或D
<220>
<221> 变体
<222> 76
<223> Xaa = N或S
<220>
<221> 变体
<222> 78
<223> Xaa = E或K
<220>
<221> 变体
<222> 82
<223> Xaa = V或L
<220>
<221> 变体
<222> 87
<223> Xaa = E或G
<220>
<221> 变体
<222> 88
<223> Xaa = T或I
<220>
<221> 变体
<222> 91
<223> Xaa = I或V
<220>
<221> 变体
<222> 92
<223> Xaa = T或G
<220>
<221> 变体
<222> 94
<223> Xaa = K或I
<220>
<221> 变体
<222> 99
<223> Xaa = V或M
<220>
<221> 变体
<222> 103
<223> Xaa = E或S
<220>
<221> 变体
<222> 105
<223> Xaa = A或V
<220>
<221> 变体
<222> 108
<223> Xaa = S或L
<220>
<221> 变体
<222> 109
<223> Xaa = D或H
<220>
<221> 变体
<222> 122
<223> Xaa = P或S
<220>
<221> 变体
<222> 123
<223> Xaa = E或G
<220>
<221> 变体
<222> 125
<223> Xaa = Y或R
<220>
<221> 变体
<222> 126
<223> Xaa = I或L
<220>
<221> 变体
<222> 127
<223> Xaa = H或Q
<220>
<221> 变体
<222> 131
<223> Xaa = L或F
<220>
<221> 变体
<222> 133
<223> Xaa = V或I
<220>
<221> 变体
<222> 135
<223> Xaa = V或F
<220>
<221> 变体
<222> 137
<223> Xaa = E或无
<220>
<221> 变体
<222> 138
<223> Xaa = T或无
<220>
<221> 变体
<222> 143
<223> Xaa = E或V
<220>
<221> 变体
<222> 144
<223> Xaa = I或T
<220>
<221> 变体
<222> 145
<223> Xaa = R或G
<220>
<221> 变体
<222> 146
<223> Xaa = Q或L
<220>
<221> 变体
<222> 147
<223> Xaa = R或K
<220>
<221> 变体
<222> 150
<223> Xaa = S或Q
<220>
<221> 变体
<222> 152
<223> Xaa = P或L
<220>
<221> 变体
<222> 153
<223> Xaa = D或E
<220>
<221> 变体
<222> 157
<223> Xaa = I或N
<220>
<221> 变体
<222> 158
<223> Xaa = N或E
<220>
<221> 变体
<222> 168
<223> Xaa = V或E
<220>
<221> 变体
<222> 170
<223> Xaa = A或V
<220>
<221> 变体
<222> 172
<223> Xaa = G或V
<220>
<221> 变体
<222> 183
<223> Xaa = A或G
<220>
<221> 变体
<222> 184
<223> Xaa = L或M
<220>
<221> 变体
<222> 185
<223> Xaa = Y或S
<220>
<221> 变体
<222> 186
<223> Xaa = T或K
<220>
<221> 变体
<222> 187
<223> Xaa = L或R
<220>
<221> 变体
<222> 188
<223> Xaa = A或无
<220>
<221> 变体
<222> 189
<223> Xaa = V或无
<220>
<221> 变体
<222> 190
<223> Xaa = S或无
<220>
<221> 变体
<222> 191
<223> Xaa = T或无
<220>
<221> 变体
<222> 192
<223> Xaa = P或无
<220>
<221> 变体
<222> 193
<223> Xaa = S或无
<220>
<221> 变体
<222> 194
<223> Xaa = N或无
<220>
<221> 变体
<222> 195
<223> Xaa = E或无
<220>
<221> 变体
<222> 196
<223> Xaa = G或无
<220>
<221> 变体
<222> 197
<223> Xaa = A或无
<220>
<221> 变体
<222> 198
<223> Xaa = I或无
<220>
<221> 变体
<222> 199
<223> Xaa = I或无
<220>
<221> 变体
<222> 200
<223> Xaa = F或无
<220>
<221> 变体
<222> 201
<223> Xaa = L或无
<220>
<221> 变体
<222> 202
<223> Xaa = P或无
<220>
<221> 变体
<222> 203
<223> Xaa = P或无
<220>
<221> 变体
<222> 204
<223> Xaa = W或无
<220>
<221> 变体
<222> 205
<223> Xaa = L或无
<220>
<221> 变体
<222> 206
<223> Xaa = F或无
<220>
<221> 变体
<222> 207
<223> Xaa = S或无
<220>
<221> 变体
<222> 208
<223> Xaa = R或无
<220>
<221> 变体
<222> 209
<223> Xaa = R或无
<220>
<221> 变体
<222> 210
<223> Xaa = R或无
<220>
<221> 变体
<222> 211
<223> Xaa = R或无
<220>
<221> 变体
<222> 212
<223> Xaa = L或无
<220>
<221> 变体
<222> 213
<223> Xaa = E或无
<220>
<221> 变体
<222> 214
<223> Xaa = R或无
<220>
<221> 变体
<222> 215
<223> Xaa = M或无
<220>
<221> 变体
<222> 216
<223> Xaa = S或无
<220>
<221> 变体
<222> 217
<223> Xaa = R或无
<220>
<221> 变体
<222> 218
<223> Xaa = G或无
<220>
<221> 变体
<222> 219
<223> Xaa = R或无
<220>
<221> 变体
<222> 220
<223> Xaa = E或无
<220>
<221> 变体
<222> 221
<223> Xaa = K或无
<220>
<221> 变体
<222> 222
<223> Xaa = C或无
<220>
<221> 变体
<222> 223
<223> Xaa = Y或无
<220>
<221> 变体
<222> 224
<223> Xaa = S或无
<220>
<221> 变体
<222> 225
<223> Xaa = S或无
<220>
<221> 变体
<222> 226
<223> Xaa = P或无
<220>
<221> 变体
<222> 227
<223> Xaa = G或无
<220>
<221> 变体
<222> 228
<223> Xaa = Y或无
<220>
<221> 变体
<222> 229
<223> Xaa = P或无
<220>
<221> 变体
<222> 230
<223> Xaa = Q或无
<220>
<221> 变体
<222> 231
<223> Xaa = E或无
<220>
<221> 变体
<222> 232
<223> Xaa = S或无
<220>
<221> 变体
<222> 233
<223> Xaa = S或无
<220>
<221> 变体
<222> 234
<223> Xaa = N或无
<220>
<221> 变体
<222> 235
<223> Xaa = Q或无
<220>
<221> 变体
<222> 236
<223> Xaa = F或无
<220>
<221> 变体
<222> 237
<223> Xaa = H或无
<400> 6
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro Gly Xaa Xaa Cys Cys Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ala Ile Val Xaa Xaa Gln Xaa Gly Gly Cys Ile Xaa Xaa
20 25 30
Thr Ser Ser Ala Ser Gln Xaa Gly Xaa Arg Leu Xaa Leu Xaa Cys Thr
35 40 45
Xaa Trp His Lys Lys Xaa Glu Ala Glu Gly Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Cys
50 55 60
Lys Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ser Pro Glu Thr Xaa Leu Xaa Gln Leu
65 70 75 80
Arg Xaa Lys Arg Asp Pro Xaa Xaa Asp Gly Xaa Xaa Glu Xaa Ser Ser
85 90 95
Gln Leu Xaa Phe Thr Ile Xaa Gln Xaa Thr Pro Xaa Xaa Ser Gly Thr
100 105 110
Tyr Gln Cys Cys Ala Arg Ser Gln Lys Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly
115 120 125
His Phe Xaa Ser Xaa Leu Xaa Thr Xaa Xaa Gly Asn Tyr Thr Xaa Xaa
130 135 140
Xaa Xaa Xaa Gln Arg Xaa His Xaa Xaa Phe Ser His Xaa Xaa Gly Thr
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Phe Leu Gln Xaa Lys Xaa Trp Xaa Met Leu Val Thr
165 170 175
Ser Leu Val Ala Leu Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
210 215 220
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
225 230 235
<210> 7
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 3, 4, 5, 6, 7, 8
<223> n = A或T
<400> 7
ccnnnnnngg 10

Claims (49)

1.一种在其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中与不包括外源CD160蛋白质的前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中免疫细胞是T细胞。
2.根据权利要求1所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、抗原呈递细胞(APC)激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。
3.根据权利要求1所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。
4.根据权利要求2所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。
5.根据权利要求1所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。
6.根据权利要求1-5的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4的任何一个具有至少约90％同一性的其变体。
7.根据权利要求1-5的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质是膜结合的。
8.根据权利要求7所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中所述外源CD160蛋白质：(a)经GPI连接体结合至膜；或(b)包括跨膜结构域。
9.根据权利要求8所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质进一步包括细胞内结构域。
10.根据权利要求9所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中细胞内结构域包括源自TCR复合物的信号传导亚单位的细胞内信号传导结构域。
11.根据权利要求7所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。
12.根据权利要求11所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中免疫细胞结合部分结合至免疫细胞的表面分子。
13.根据权利要求1-12的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中修饰的抗原特异性免疫细胞进一步包括功能性外源受体。
14.根据权利要求13所述的修饰的抗原特异性免疫细胞，其中功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
15.一种产生其表面上包括外源CD160蛋白质的修饰的抗原特异性免疫细胞的方法，其包括：
使前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的第一核酸接触从而产生修饰的抗原特异性免疫细胞，
其中与前体抗原特异性免疫细胞相比，外源CD160蛋白质导致修饰的抗原特异性免疫细胞的上调，其中免疫细胞是T细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中修饰的抗原特异性免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒素αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞、APC激活的抗肿瘤T细胞和天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。
17.根据权利要求15所述的方法，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是细胞毒素T细胞。
18.根据权利要求16所述的方法，其中修饰的抗原特异性免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或APC激活的抗肿瘤T细胞。
19.根据权利要求16所述的方法，其中免疫细胞选自由以下组成的组：天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NK-T细胞)、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞和巨噬细胞。
20.根据权利要求15-19的任一项所述的方法，其中方法包括将前体抗原特异性免疫细胞与外源CD160蛋白质接触。
21.根据权利要求20所述的方法，其中外源CD160蛋白质包括结合至免疫细胞的表面分子的免疫细胞结合部分。
22.根据权利要求15-19的任一项所述的方法，其中方法包括将编码外源CD160蛋白质的核酸引入前体抗原特异性免疫细胞。
23.根据权利要求15-22的任一项所述的方法，其中CD160蛋白质包括SEQ ID NO:1-4的任何一个的氨基酸序列，或与SEQ ID No:1-4的任何一种具有至少约90％同一性的其变体。
24.根据权利要求15-23的任一项所述的方法，其中外源CD160蛋白质是膜结合的。
25.根据权利要求24所述的方法，其中外源CD160蛋白质：(a)经GPI连接体结合至膜；或(b)包括跨膜结构域。
26.根据权利要求24所述的方法，其中外源CD160蛋白质经免疫细胞结合部分结合至修饰的抗原特异性免疫细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中免疫细胞结合部分结合至免疫细胞的表面分子。
28.根据权利要求15-27的任一项所述的方法，其中前体抗原特异性免疫细胞包括编码功能性外源受体的第二核酸。
29.根据权利要求15-27的任一项所述的方法，其进一步包括使前体抗原特异性免疫细胞与编码功能性外源受体的第二核酸接触。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中功能性外源受体是工程化的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中第一核酸和第二核酸可操作地连接至相同的启动子。
32.根据权利要求29-31的任一项所述的方法，其中第一核酸和第二核酸在相同的载体上。
33.根据权利要求15-32的任一项所述的方法，其进一步包括分离或富集包括第一和/或第二核酸的免疫细胞。
34.根据权利要求15-33的任一项所述的方法，其进一步包括将表达CD160的修饰的抗原特异性免疫细胞与至少一种药学上可接受的载体配制。
35.通过根据权利要求15-34的任一项所述的方法获得的修饰的抗原特异性免疫细胞。
36.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-14和35的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞和药学上可接受的载体。
37.一种治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的根据权利要求1-14和35的任一项所述的修饰的抗原特异性免疫细胞或根据权利要求36所述的药物组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中修饰的抗原特异性免疫细胞源自个体。
39.一种治疗个体的疾病的方法，包括向个体施用有效量的外源CD160蛋白质或编码外源CD160蛋白质的核酸，其中外源CD160蛋白质包括识别个体中免疫细胞上的表面分子的结合部分。
40.根据权利要求37-39的任一项所述的方法，其中疾病是癌症。
41.根据权利要求40所述的方法，其中癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、脑癌、卵巢癌。
42.根据权利要求38-41的任一项所述的方法，其中个体是人。
43.一种抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性的方法，包括使抗原特异性免疫细胞与有效量的抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂接触。
44.一种激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的方法，包括使抗原特异性免疫细胞与有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂接触。
45.根据权利要求44所述的方法，其中方法增强抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性，并且其中试剂增强抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。
46.一种治疗个体中免疫学疾病的方法，其包括向个体施用治疗有效量的调节抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性的试剂。
47.根据权利要求46所述的方法，其中免疫学疾病是自身免疫性疾病或炎症性疾病，并且其中试剂抑制抗原特异性免疫细胞中CD160的内源免疫刺激活性。
48.一种治疗个体中癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。
49.一种治疗个体中感染的方法，包括向个体施用治疗有效量的激活抗原特异性免疫细胞中CD160的免疫刺激活性的试剂。
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