CN111542595A - 经修饰的免疫细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或B细胞的经修饰的免疫细胞、包含所述免疫细胞的组合物、以及治疗赘生性或癌症病症的方法，所述方法包括向受试者给予所述免疫细胞。

Description

经修饰的免疫细胞及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月10日提交的中国专利申请号201711101450.X、2018年1月9日提交的中国专利申请号201810017770.5、2018年1月16日提交的中国专利申请号201810037682.1、2018年6月11日提交的PCT国际申请号PCT/CN2018/090638、2018年7月2日提交的PCT国际申请号PCT/CN2018/094126和2018年11月9日提交的PCT国际申请号PCT/CN2018/114897的权益，将其中的每一个通过引用以其整体并入本文。
背景技术
免疫疗法可能涉及修饰患者自身的免疫细胞，以将细胞的细胞毒性重新定向至感兴趣的细胞，例如肿瘤细胞。表达嵌合抗原受体(CAR)的经修饰的免疫细胞(如T细胞)可以利用内源免疫细胞信号传导来获得免疫细胞的细胞毒性。
免疫疗法的常规方法存在各种缺陷。此类缺陷包括来自共刺激受体的信号传导不足以产生持续和/或足够的免疫应答以达到治疗效果、经修饰的免疫细胞对患病细胞(如癌细胞)的特异性不足(例如，中靶脱肿瘤(on-target off-tumor)效应和毒性)、以及免疫抑制机制的激活，所有这些都可能使免疫应答的作用最小化。
发明内容
鉴于前述内容，存在对进行免疫疗法的替代系统和方法的相当大的需求。本公开文本的组合物和方法解决了这一需求，并且还提供了另外的优点。具体地，本公开文本的各个方面提供了用于经由通过结合通常引发免疫细胞失活信号的配体进行的信号传导来引发免疫细胞激活信号的组合物和方法。所述组合物和方法还可以经由结合B细胞表面蛋白来引发免疫细胞激活信号。
在一方面，本公开文本提供了一种特异性地结合肿瘤抗原的经修饰的免疫细胞，所述经修饰的免疫细胞包含嵌合刺激分子，其中所述嵌合刺激分子包含：在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，其中所述嵌合刺激分子与所述配体的结合在所述经修饰的免疫细胞中产生所述免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其中任选地，所述TIL可以表达PD-1、CD137和TIM-3中的至少一种。
在一方面，本公开文本提供了一种特异性地结合新抗原的经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含开关分子，其中所述开关分子包含：在未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞激活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，其中所述开关分子与所述配体的结合在所述经修饰的T细胞中产生所述免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号。
在一些实施方案中，所述T细胞可以包含展现出与所述新抗原的特异性结合的T细胞受体(TCR)复合物。在一些实施方案中，所述TCR复合物可以是内源TCR复合物。在一些实施方案中，所述TCR复合物可以是外源TCR复合物。
在一些实施方案中，所述新抗原可以包含由突变基因编码的蛋白质的肽片段，其中所述基因选自ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。在一些实施方案中，所述新抗原可以包含由突变基因编码的蛋白质的肽片段，其中所述基因选自JAK2、KRAS、BRAF、TP53、PIK3CA、EGFR、IDH1、NRAS、CTNNB1、NPM1、CALR、FGFR3、CDKN2A、KIT、MYD88、APC、HRAS、MED12、DNMT3A、GNAS、IDH2、KCNJ5、PTEN、NOTCH1、SF3B1、FLT3、ASXL1、SRSF2、FOXL2、PTPN11、GNAQ、RET、HLA-A、MPL、IKZF1、KMT2C、TET2、PDGFRA、FBXW7、H3F3A、ALK、CEBPA、ESR1、AKT1、RUNX1、GNA11、VHL、WT1、U2AF1、ABL1、ERBB2、DICER1、NOTCH4、EZH2、HNF1A、SMARCB1、CXCR4、PLCG1、TSHR、PRKACA、RHOA、STAT3、POLE、SETBP1、MET、AR、STK11、NF2、CBL、HLA-B、PRKCB、ATR、PPP2R1A、CASC5、CD79B、PBRM1、PTK2B、GATA2、KMT2D、SULT1A1、FLNB、PRPF8、RNF43、MSH6、FGFR2、SMAD4、JAK3、USP8、DLC1、ESRP1、LRP1B、MYH11、BRCA1、CARD11、HSP90AB1、MAP3K9、ADAMTSL3、PDGFRB、RPTOR、ROS1、NFKBIE、AMER1、KLF4、RAC1、TERT、MYOD1、ATP1A1、CSF3R、NOTCH2、CCR4、PAX5、SPTAN1、MLH1、CUBN、RNF213、SMO、ABCC4、AXIN2、CSF1R、PER1、PKHD1、IL7R、RB1、ARID1A、ATM、FES、MTHFR、PTCH2、FANCI、CDH5、CIC、IL6ST、MYH9、NF1、TGFBR2、INSR、PTPN12、TNFAIP3、MEN1、NSD1、SLITRK6、SYT1、TNKS、CCND3、PSMD13、CYP2D6、HELQ、LPHN3、PRAME、STAT5B、BCL6、CCDC6、CCND1、FLCN、LMO2、MUC1、NFKBIZ、NRP2、CTCF、HIST1H3B、KEAP1、SLC22A2、ABCC2、EED、GATA1、GLI3、IKZF3、PIK3CG、XPO1、CHRNA3、MAP2K1、SETD2、ZNF668、CCND2、FLT4、NT5C2、RECQL4、SSX1、ALOX12B、CDKN1B、ELF3、INPP4B、MARVELD3、MLLT4、MLPH、NTRK3、SPOP、BCL2、EPHB1、ERCC4、ERCC6、ETNK1、JAK1、LRP2、MUTYH、NFKBIA、ARNT、BRCA2和CDH2。
在一些实施方案中，可以基于来自个体的肿瘤样品的遗传谱选择所述新抗原。在一些实施方案中，可以基于来自个体的肿瘤样品的体细胞突变谱选择所述新抗原。
在一些实施方案中，在未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以是信号传导受体。在一些实施方案中，在未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以是检查点受体、细胞因子受体、趋化因子受体、生长因子受体或激素受体。在一些实施方案中，在未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以选自转化生长因子β受体(TGF-β-R)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)和TIGIT。
在一些实施方案中，所述共刺激分子可以是白细胞介素2受体(IL-2R)、白细胞介素12受体(IL-12R)、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C或OX40。
在一些实施方案中，所述免疫细胞激活信号可以由激活因子介导。在一些实施方案中，所述激活因子是可溶性细胞因子、可溶性趋化因子或生长因子。在一些实施方案中，所述激活因子是可溶性细胞因子，并且其中所述可溶性细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TNF、TGF、IFN或其任何功能片段或变体。在一些实施方案中，所述免疫细胞激活信号可以包含所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的克隆扩增；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的细胞因子释放；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的细胞毒性；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的增殖；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的分化、去分化或转分化；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的运动和/或运输；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的耗竭和/或再激活；以及所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的其他细胞间分子、代谢产物、化学化合物或其组合的释放。
在一些实施方案中，在所述开关分子与所述配体结合后，与未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞可以展现出增强的新抗原结合。
在一些实施方案中，当所述开关分子与所述配体结合并且所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞与存在于靶细胞上的所述新抗原结合时，与未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞可以展现出增加的针对所述靶细胞的细胞毒性。
在一些实施方案中，当所述开关分子结合所述配体并且所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞与存在于靶细胞上的所述新抗原结合时，与未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞可以展现出增加的细胞因子分泌。在一些实施方案中，所述细胞因子可以是IFN-γ或IL-2。
在一方面，本公开文本提供了一种经修饰的免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)和展现出与新抗原的特异性结合的T细胞受体(TCR)复合物，其中所述CAR包含：(a)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述免疫细胞可以是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，所述TIL可以是表达PD-1、CD137和TIM-3的三阳性T细胞。在一些实施方案中，展现出与新抗原的特异性结合的所述TCR复合物可以是内源TCR复合物。在一些实施方案中，展现出与新抗原的特异性结合的所述TCR复合物可以是外源TCR复合物。
在一些实施方案中，所述新抗原可以包含由突变基因编码的蛋白质的肽片段，其中所述基因选自ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。
在一些实施方案中，可以基于来自个体的肿瘤样品的遗传谱选择所述新抗原。在一些实施方案中，可以基于来自个体的肿瘤样品的体细胞突变谱选择所述新抗原。
在一些实施方案中，所述B细胞表面蛋白选自CD19、CD20和CD22。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含选自以下的分子的细胞内结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ的细胞内结构域。在一些实施方案中，CD3ζ的所述细胞内结构域可以包含ITAM。在一些实施方案中，所述CAR还可以包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域可以包含以下的信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体或Toll配体受体。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域可以包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFFR/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
在一些实施方案中，在所述免疫细胞与所述B细胞表面蛋白接触后，与未经修饰的免疫细胞相比，所述免疫细胞可以展现出增强的增殖。在一些实施方案中，可以在体外确定所述增强的增殖。在一些实施方案中，可以在体内确定所述增强的增殖。在一些实施方案中，与未经修饰的免疫细胞相比，在所述接触后至少约24、48或96小时之后，所述免疫细胞可以展现出至少2倍的增殖增加。
在一方面，本公开文本提供了一种特异性地结合新抗原的经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其中所述经修饰的TIL包含：(a)开关分子，所述开关分子包含在未经修饰的TIL中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，并且其中所述开关分子与所述配体的结合在所述经修饰的TIL中产生所述免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号；以及(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
在一方面，本公开文本提供了一种特异性地结合新抗原的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞包含：(a)开关分子，所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，并且其中所述开关分子与所述配体的结合在所述经修饰的免疫细胞中产生免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号；以及(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述免疫细胞可以包含展现出与新抗原的特异性结合的T细胞受体(TCR)复合物。在一些实施方案中，所述TCR复合物可以是内源TCR复合物。在一些实施方案中，所述TCR复合物是外源TCR复合物。
在一些实施方案中，所述新抗原包含由突变基因编码的蛋白质的肽片段，其中所述基因选自ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。
在一些实施方案中，可以基于来自个体的肿瘤样品的遗传谱选择所述新抗原。在一些实施方案中，可以基于来自个体的肿瘤样品的体细胞突变谱选择所述新抗原。
在一些实施方案中，在未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以是信号传导受体。在一些实施方案中，在未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以是检查点受体、细胞因子受体、趋化因子受体、生长因子受体或激素受体。在一些实施方案中，在未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以选自转化生长因子β受体(TGF-β-R)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)和TIGIT。
在一些实施方案中，所述共刺激分子可以是白细胞介素2受体(IL-2R)、白细胞介素12受体(IL-12R)、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C或OX40。
在一些实施方案中，所述免疫细胞激活信号可以由激活因子介导。在一些实施方案中，所述激活因子可以是可溶性细胞因子、可溶性趋化因子或生长因子。在一些实施方案中，所述激活因子可以是可溶性细胞因子，并且其中所述可溶性细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TNF、TGF、IFN或其任何功能片段或变体。
在一些实施方案中，所述免疫细胞激活信号可以包含所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的克隆扩增；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的细胞因子释放；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的细胞毒性；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的增殖；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的运动和/或运输；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的耗竭和/或再激活；以及所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的其他细胞间分子、代谢产物、化学化合物或其组合的释放。
在一些实施方案中，所述B细胞表面蛋白可以选自CD19、CD20和CD22。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含选自以下的分子的细胞内结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ的细胞内结构域。在一些实施方案中，CD3ζ的所述细胞内结构域可以包含ITAM。在一些实施方案中，所述CAR还可以包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域可以包含以下的信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体或Toll配体受体。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域可以包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
在一些实施方案中，在所述开关分子与所述配体结合后，与未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞可以展现出增强的新抗原结合。
在一些实施方案中，当所述开关分子与所述配体结合并且所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞与存在于靶细胞上的所述新抗原结合时，与未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞可以展现出增加的针对所述靶细胞的细胞毒性。
在一些实施方案中，当所述开关分子结合所述配体并且所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞与存在于靶细胞上的所述新抗原结合时，与未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞可以展现出增加的细胞因子分泌。在一些实施方案中，所述细胞因子可以是IFN-γ或IL-2。
在一方面，本公开文本提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：(a)向受试者给予根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的TIL、经修饰的T细胞或经修饰的免疫细胞；以及(b)使表达新抗原的所述癌症的靶细胞与所述经修饰的TIL、经修饰的T细胞或经修饰的免疫细胞在诱导所述经修饰的TIL、经修饰的T细胞或经修饰的免疫细胞针对所述癌症的靶细胞的细胞毒性的条件下接触，从而诱导所述癌症的靶细胞的死亡。
在一方面，本公开文本提供了一种扩增T细胞群的方法，所述方法包括：(a)提供包含根据权利要求21-40中任一项所述的至少一种经修饰的免疫细胞的T细胞群；以及(b)将所述T细胞群暴露于所述B细胞表面蛋白以实现所述T细胞群的扩增。在一些实施方案中，所述T细胞群体可以暴露于包含所述B细胞表面蛋白的B细胞。
在一方面，本公开文本提供了一种扩增T细胞群的方法，其包括：(a)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述T细胞群中，从而产生第一CAR表达细胞群，其中所述CAR包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域；以及(b)使所述第一CAR表达细胞群与B细胞表面蛋白接触，从而产生扩增的和/或激活的免疫细胞群。
在一方面，本公开文本提供了一种组合物，其包含编码以下中的一种或多种的一种或多种多核苷酸：(a)开关分子，其中所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激蛋白的细胞内结构域(ICD)融合；以及(b)抗原特异性T细胞受体复合物或其一种或多种组分。
本公开文本的另一方面提供了一种组合物，其包含编码以下中的一种或多种的一种或多种多核苷酸：(a)抗原特异性T细胞受体复合物或其一种或多种组分；以及(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞受体复合物可以结合新抗原。
在一些实施方案中，所述新抗原可以包含由突变基因编码的蛋白质的肽片段，其中所述基因选自ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。
在一些实施方案中，在未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以是信号传导受体。在一些实施方案中，所述蛋白质可以是检查点受体、细胞因子受体、趋化因子受体、生长因子受体或激素受体。在一些实施方案中，所述蛋白质可以选自转化生长因子β受体(TGF-β-R)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)和TIGIT。
在一些实施方案中，介导免疫细胞激活信号的所述共刺激蛋白可以是白细胞介素2受体(IL-2R)、白细胞介素12受体(IL-12R)、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C或OX40。
在一些实施方案中，所述B细胞表面蛋白可以选自CD19、CD20和CD22。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含选自以下的分子的细胞内结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还可以包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域可以包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
在一方面，本公开文本提供了一种组合物，其包含编码以下中的一种或多种的一种或多种多核苷酸：(a)开关分子，其中所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激蛋白的细胞内结构域(ICD)融合；(b)抗原特异性T细胞受体复合物或其一种或多种组分；以及(c)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
在一方面，本公开文本提供了一种特异性地结合新抗原的经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，所述经修饰的TIL包含嵌合刺激分子，其中所述嵌合刺激分子包含：与所述新抗原结合的多肽细胞外结构域(PED)，其中所述PED与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，其中所述嵌合刺激分子与所述新抗原的结合在所述经修饰的TIL中产生所述免疫细胞激活信号。
在一方面，本公开文本提供了经修饰的免疫细胞，其包含：(a)开关分子，所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，并且其中所述开关分子与所述配体的结合在所述经修饰的免疫细胞中产生免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号；以及(b)嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞可以表达PD1、CD137和TIM3中的至少一种。在一些实施方案中，所述免疫细胞可以从肿瘤获得。在一些实施方案中，所述免疫细胞可以从外周血单核细胞获得。在一些实施方案中，所述免疫细胞可以包含内源TCR复合物。在一些实施方案中，所述免疫细胞可以包含外源TCR复合物。在一些实施方案中，所述TCR复合物可以结合肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述TCR复合物可以结合新抗原。在一些实施方案中，在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以是信号传导受体。在一些实施方案中，在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以是检查点受体、细胞因子受体、趋化因子受体、生长因子受体或激素受体。在一些实施方案中，在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质可以选自转化生长因子β受体(TGF-β-R)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)和TIGIT。在一些实施方案中，所述共刺激分子可以是白细胞介素2受体(IL-2R)、白细胞介素12受体(IL-12R)、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C或OX40。在一些实施方案中，所述免疫细胞激活信号可以由激活因子介导。在一些实施方案中，所述激活因子可以是可溶性细胞因子、可溶性趋化因子或生长因子。在一些实施方案中，所述激活因子可以是可溶性细胞因子，并且其中所述可溶性细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TNF、TGF、IFN或其任何功能片段或变体。在一些实施方案中，所述免疫细胞激活信号可以包含所述经修饰的免疫细胞的克隆扩增；所述经修饰的免疫细胞的细胞因子释放；所述经修饰的免疫细胞的细胞毒性；所述经修饰的免疫细胞的增殖；所述经修饰的免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述经修饰的免疫细胞的运动和/或运输；所述经修饰的免疫细胞的耗竭和/或再激活；以及所述经修饰的免疫细胞的其他细胞间分子、代谢产物、化学化合物或其组合的释放。在一些实施方案中，所述B细胞表面蛋白可以选自CD19、CD20和CD22。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含选自以下的分子的细胞内结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ的细胞内结构域。在一些实施方案中，CD3ζ的所述细胞内结构域可以包含ITAM。在一些实施方案中，所述CAR还可以包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域可以包含以下的信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体或Toll配体受体。在一些实施方案中，所述共刺激结构域可以包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFFR/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。在一些实施方案中，在所述免疫细胞与所述B细胞表面蛋白接触后，与未经修饰的免疫细胞相比，所述免疫细胞可以展现出增强的增殖。在一些实施方案中，可以在体外确定所述增强的增殖。在一些实施方案中，可以在体内确定所述增强的增殖。在一些实施方案中，与未经修饰的免疫细胞相比，在所述接触后至少约24、48或96小时之后，所述免疫细胞可以展现出至少2倍的增殖增加。
通过引用并入
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同明确且单独地指示每个单独出版物、专利或专利申请通过引用并入一般。
附图说明
本发明的新颖特征在随附权利要求书中具体阐述。将通过参考阐述了利用本发明原理的说明性实施方案的以下具体实施方式和附图获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在所述附图中：
图1展示了在有或没有转导NY-ESO-1TCR基因的情况下T细胞的T细胞受体(TCR)表达。
图2展示了新抗原反应性(或可识别的)T细胞的制备过程。
图3A和3B展示了PD1/CD28开关分子的慢病毒滴定，其中(a)示出了PD1表达的流式细胞术检测；并且(b)示出了滴定曲线。
图4展示了在TCR-T、TIL和neoT细胞中的PD1/CD28开关分子的表达。
图5展示了J82-NY-ESO-1-PDL1膀胱癌细胞系的测定。
图6A-6C展示了在表达PD1/CD28开关分子的靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞的体外测定中，在与肿瘤细胞一起培养的T细胞中的CD107a表达(a)以及IFN-γ(b)和IL-2(c)释放。
图7A-7B展示了在存在或不存在肿瘤细胞的情况下培养时，有或没有PD1/CD28开关分子的情况下，TIL细胞的IFN-γ(a)和IL-2(b)释放。
图8A-8B展示了在存在或不存在肿瘤细胞的情况下培养时，有或没有PD1/CD28开关分子的情况下，新抗原反应性T细胞(neoT)中的IFN-γ(a)和IL-2(b)释放。
图9示出了在TCR-T、TIL和NeoT中的靶向B细胞表面蛋白的嵌合抗原受体(BCAR)的表达。
图10和11展示了表达BCAR的NY-ESO1-TCR-T细胞的体外功效和扩增。
图12A和12B展示了表达BCAR的TIL的体外功效和扩增。
图13A和13B展示了表达BCAR的NeoT的体外功效和扩增。
图14展示了在TIL中的PD1sw-BCAR、TIM3sw-BCAR和TGFBR2sw-BCAR的表达。
图15展示了在pTIL中的PD1sw-BCAR、TIM3sw-BCAR和TGFBR2sw-BCAR的表达。
图16A和16B展示了从没有B细胞的不同TIL中的IFN-γ和IL-2释放。
图17A和17B展示了在不存在(A组)或存在(B组)B细胞的情况下不同TIL的肿瘤杀伤作用(a)和体外扩增(b)。
图18A和18B展示了从没有B细胞的不同TIL中的IFN-γ和IL-2释放。
图19A和19B展示了在不存在(A组)或存在(B组)B细胞的情况下不同pTIL的肿瘤杀伤作用(a)和体外扩增(b)。
图20展示了在有和没有B细胞存在的情况下BCAR-TCRT对J82-NYESO1肿瘤细胞的杀伤作用。
图21-24是受试者1-4的肿瘤图像分析。
图25展示了在输注STIL或SpTIL之后在外周血中循环肿瘤细胞(CTC)数量的变化。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文所公开的一些方法的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，它们在本领域的技术范围之内。参见例如Sambrook和Green,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)；系列Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑)；系列Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.),PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))；Harlow和Lane编辑(1988)Antibodies,A Laboratory Manual；以及Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique and Specialized Applications,第6版(R.I.Freshney编辑(2010))。
除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数指示物。例如，术语“一个开关分子”包括多个开关分子。
术语“约”或“大约”意指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其部分取决于如何测量或确定所述值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或超过1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的一个数量级内、优选地在值的5倍内、更优选地在值的2倍内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指在所述特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，“细胞”可以通常是指生物细胞。细胞可以是活生物体的基本结构、功能和/或生物学单位。细胞可以来源于具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性例子包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞(例如，来自以下的细胞：植物作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、玉蜀黍、小麦、种子、番茄、稻、木薯、甘蔗、南瓜、干草、马铃薯、棉花、大麻、烟草、开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类植物、石松、金鱼藻、地钱、苔藓)、藻类细胞(例如，布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、展枝马尾藻(Sargassum patens C.Agardh)等)、海藻(例如，海带)、真菌细胞(例如，酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人等)的细胞、等等。有时，细胞不是来源于天然生物体(例如，细胞可以是合成制得的，有时称为人造细胞)。
如本文所用，术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或其片段。作为一个例子，抗原可以是可以被选择性结合剂(如受体)结合的配体。作为另一个例子，抗原可以是可以被选择性结合剂(如免疫蛋白(例如，抗体)结合的抗原分子。抗原也可以是指能够被用于动物中以产生能够与所述抗原结合的抗体的分子或其片段。
如本文所用，术语“新抗原”通常是指由基因突变引起的肿瘤特异性抗原。所得的突变蛋白或其片段可以触发抗肿瘤T细胞反应。
如本文所用，术语“基因”是指参与编码RNA转录物的核酸(例如，DNA，如基因组DNA和cDNA)及其对应的核苷酸序列。如本文所用，关于基因组DNA，所述术语包括介于中间的非编码区以及调节区，并且可以包括5'和3'末端。在一些用法中，所述术语涵盖转录的序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录区将含有编码多肽的“开放阅读框”。在所述术语的一些用法中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录序列，而且此外还包括非转录区，其包括上游和下游调节区、增强子和启动子。基因可以是指在生物体基因组中其天然位置的“内源基因”或天然基因。基因可以是指“外源基因”或非天然基因。非天然基因可以是指通常不在宿主生物体中发现但通过基因转移被引入宿主生物体中的基因。非天然基因也可以是指不在生物体基因组中其天然位置的基因。非天然基因还可以是指包含突变、插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列(例如，非天然序列)。
如本文所用，术语“抗体”是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。术语抗体包括抗体(例如，单克隆和多克隆抗体)、以及其衍生物、变体和片段。抗体包括但不限于不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(如IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig)。其衍生物、变体或片段可以是指保留对应抗体的结合特异性(例如，完全和/或部分)的功能性衍生物或片段。抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、小抗体、双抗体和单结构域抗体(“sdAb”或“纳米抗体”或“骆驼抗体(camelids)”)。术语抗体包括已经被优化、被工程化或被化学偶联的抗体和抗体的抗原结合片段。已经被优化的抗体的例子包括亲和力成熟的抗体。已经被工程化的抗体的例子包括Fc优化的抗体(例如，在片段可结晶区域中优化的抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸组合。核苷酸可以包含合成核苷酸。核苷酸可以包含合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷酸腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞嘧啶三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)；以及脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP；或其衍生物。此类衍生物可以包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及对含有它们的核酸分子赋予核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文所用的术语核苷酸可以是指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的说明性例子可以包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的，或者可以通过熟知的技术可检测地标记。标记也可以用量子点进行。可检测的标记可以包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是呈单链、双链或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸对于细胞而言可以是外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸可以包含一种或多种类似物(例如，改变的骨架、糖或核碱基)。在聚合物组装之前或之后可以赋予对核苷酸结构的修饰(如果存在的话)。类似物的一些非限制性例子包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代、锁核酸、乙二醇核酸、苏阿糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。多核苷酸的非限制性例子包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(loci/locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、无细胞多核苷酸(包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA))、核酸探针和引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。
术语“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的一个或多个过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中表达可以包括mRNA的剪接。关于表达，“上调”通常是指相对于其在野生型状态下的表达水平，多核苷酸(例如，RNA，如mRNA)和/或多肽序列的表达水平增加，而“下调”通常是指相对于其在野生型状态下的表达，多核苷酸(例如，RNA，如mRNA)和/或多肽序列的表达水平降低。
如本文所用，关于表达或活性，术语“调节”是指改变表达或活性的水平。调节可以发生在转录水平和/或翻译水平。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过一个或多个肽键连接的至少两个氨基酸残基的聚合物。这一术语并不意味着聚合物的特定长度，也不旨在暗示或区分肽是使用重组技术、化学或酶促合成产生的还是天然存在的。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及包含至少一种经修饰的氨基酸的氨基酸聚合物。在一些情况下，聚合物可以被非氨基酸中断。所述术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，以及具有或不具有二级和/或三级结构(例如，结构域)的蛋白质。所述术语还涵盖已经例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、氧化和任何其他操作(如与标记组分缀合)被修饰的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“氨基酸(amino acid和amino acids)”通常是指天然和非天然氨基酸，包括但不限于经修饰的氨基酸和氨基酸类似物。经修饰的氨基酸可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸，它们已经被化学修饰以包括非天然存在于氨基酸上的基团或化学部分。氨基酸类似物可以是指氨基酸衍生物。术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。
当在本文中关于多肽使用时，术语“衍生物”、“变体”和“片段”是指例如通过氨基酸序列、结构(例如，二级和/或三级)、活性(例如，酶促活性)和/或功能与野生型多肽相关的多肽。与野生型多肽相比，多肽的衍生物、变体和片段可以包含一种或多种氨基酸变化(例如，突变、插入和缺失)、截短、修饰或其组合。
如本文所用，“融合物”可以是指包含一个或多个非天然序列(例如，部分)的蛋白质和/或核酸。融合物可以包含一个或多个相同的非天然序列。融合物可以包含一个或多个不同的非天然序列。融合物可以是嵌合体。融合物可以包含核酸亲和标签。融合物可以包含条码。融合物可以包含肽亲和标签。融合物可以提供定点多肽的亚细胞定位(例如，用于靶向细胞核的核定位信号(NLS)、用于靶向线粒体的线粒体定位信号、用于靶向叶绿体的叶绿体定位信号、内质网(ER)驻留信号等)。融合物可以提供可用于追踪或纯化的非天然序列(例如，亲和标签)。融合物可以是小分子(如生物素)或染料(如Alexa fluor染料、花菁3染料、花菁5染料)。
如本文所用，短语“外源T细胞受体(TCR)复合物”或“外源TCR复合物”是指这样的TCR复合物，其中TCR的一条或多条链被引入免疫细胞基因组中，所述免疫细胞可以或可以不内源表达TCR。在一些情况下，外源TCR复合物可以是指这样的TCR复合物，其中内源TCR复合物的一条或多条链具有一个或多个突变序列，例如在核酸或氨基酸水平上。外源TCR在免疫细胞上的表达可以赋予针对表位或抗原(例如，优先存在于癌细胞或其他引起疾病的细胞或颗粒的表面上的表位或抗原)的结合特异性。外源TCR复合物可以包含被引入基因组中的TCR-α、TCR-β链、CD3-γ链、CD3-δ链、CD3-ζ链或其任何组合。在一些情况下，引入基因组中的链可以替代内源存在的链。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选地哺乳动物，如人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物。还涵盖在体内获得的或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用，术语“治疗(treatment和treating)”是指用于获得有益或所需的结果的方法，所述有益或所需的结果包括但不限于治疗益处和/或预防益处。例如，治疗可以包括给予本文所公开的系统或细胞群。治疗益处意指对治疗中的一种或多种疾病、病症或症状的任何治疗相关的改进或作用。对于预防益处，可以将组合物给予有发生特定疾病、病症或症状的风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状(即使疾病、病症或症状可能尚未表现)的受试者。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以在给予有需要的受试者后产生所需的活性的本公开文本的组合物(例如包含免疫细胞如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)的组合物)的量。在本公开文本的上下文中，术语“治疗有效的”是指足以延迟通过本公开文本的方法治疗的障碍的表现、阻止其进展、缓解或减轻其至少一种症状的组合物的量。
如本文所用，术语“遗传谱”是指关于特定基因的信息，包括在个体中或在某种类型的组织中的变异和基因表达。遗传谱可以用于新抗原选择。如本文所用，术语“体细胞突变谱”是指关于与体细胞突变相关的特定基因的信息，包括但不限于由体细胞突变产生的特定基因。体细胞突变谱可以用于新抗原选择。
在一方面，本公开文本提供了特异性地结合肿瘤相关抗原(包括但不限于新抗原)的经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。经修饰的TIL可以包含嵌合刺激分子。嵌合刺激分子可以包含与新抗原结合的多肽细胞外结构域(PED)。PED可以与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合。嵌合刺激分子与新抗原的结合可以在经修饰的TIL中产生免疫细胞激活信号。在一些实施方案中，PED可以是未经修饰的TIL的表面蛋白的细胞外结构域。在一些实施方案中，PED的例子包括抗体、以及其衍生物、变体和片段。
在一方面，本公开文本提供了特异性地结合新抗原的经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，所述经修饰的TIL包含开关分子。开关分子可以包含在未经修饰的TIL中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)。ECD可以与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合。开关分子与配体的结合可以在经修饰的TIL中产生免疫细胞激活信号而非免疫细胞失活信号。
TIL可以是从肿瘤获得的任何细胞。例如，TIL可以是已经迁移至肿瘤的细胞。TIL可以是已经浸润肿瘤的细胞。在一些实施方案中，TIL是已经从受试者的血流迁移到肿瘤中的白细胞。TIL可以是例如T细胞、B细胞、单核细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些情况下，经修饰的TIL包含CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或M1巨噬细胞。包含TIL的免疫细胞群可以是混合的细胞群。TIL群体可以包含不同表型的细胞、不同分化程度的细胞、不同谱系的细胞或其任何组合。TIL通常可以使用细胞表面标记在生物化学上进行定义，或者可以通过其浸润肿瘤和实现治疗的能力在功能上进行定义。可以基于以下生物标记中的一种或多种的表达对TIL进行分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD25、CD27、CD28、CD56、CD137、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和TIM-3。在一些实施方案中，经修饰的TIL表达PD-1、CD137和TIM-3中的至少一种。在一些情况下，TIL可以通过在重新引入患者体内后其侵润实体瘤的能力在功能上进行定义。在一些情况下，经修饰的TIL包含“原代TIL”，其是指从患者组织样品中获得的TIL。在一些情况下，经修饰的TIL包含“次级TIL”，其是指已经扩增或增殖的TIL。TIL可以展现出与新抗原的特异性结合。在一些情况下，TIL的TCR复合物赋予抗原结合特异性(例如，新抗原结合)。
在一方面，本公开文本提供了特异性地结合新抗原的经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含开关分子。开关分子可以包含在未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)。ECD可以与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合。开关分子与配体的结合可以在经修饰的T细胞中产生免疫细胞激活信号而非免疫细胞失活信号。
经修饰的T细胞可以包含展现出与新抗原的特异性结合的T细胞受体(TCR)复合物。在一些实施方案中，TCR复合物是内源TCR复合物。在一些实施方案中，TCR是外源TCR复合物。经修饰的免疫细胞的TCR复合物(例如，内源的或外源的)可以赋予免疫细胞的抗原结合特异性(例如，新抗原结合)。在一些实施方案中，本公开文本提供了包含与新抗原特异性地结合的内源TCR复合物的经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含嵌合刺激分子，其中所述嵌合刺激分子包含：与在包括但不限于肿瘤细胞的细胞上的膜蛋白结合的多肽细胞外结构域(PED)，其中所述PED与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，其中所述嵌合刺激分子与所述膜蛋白在所述经修饰的T细胞中产生所述免疫细胞激活信号。
经修饰的免疫细胞(如本文提供的经修饰的T细胞或经修饰的TIL)与新抗原的结合可以激活免疫细胞。经修饰的细胞的开关分子可以用于提供对免疫细胞活性(例如但不限于免疫细胞激活和扩增)的进一步控制。在经修饰的免疫细胞(如经修饰的T细胞或经修饰的TIL)中开关分子与其配体的结合可以在经修饰的免疫细胞中引发免疫细胞激活信号而非免疫细胞失活信号。在经修饰的免疫细胞中引发免疫细胞激活信号而非免疫细胞失活信号可以使免疫细胞中的免疫抑制作用最小化。使免疫细胞中的免疫抑制作用最小化可以例如通过增加针对靶细胞(如肿瘤细胞)的免疫细胞的细胞毒性来增加免疫细胞在免疫应答中的有效性。
开关分子可以包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)。蛋白质可以是信号传导受体或其任何功能片段、衍生物或变体。在一些情况下，信号传导受体可以是膜结合受体。信号传导受体可以响应于配体结合而诱导细胞中的一个或多个信号传导途径。在一些情况下，信号传导受体可以是非膜结合受体。开关分子可以包含选自以下的受体的片段，例如细胞外结构域：G蛋白偶联受体(GPCR)；整合素受体；钙粘蛋白受体；催化受体(例如，激酶)；死亡受体；检查点受体；细胞因子受体；趋化因子受体；生长因子受体；激素受体；和免疫受体。
在一些实施方案中，开关分子包含免疫检查点受体的片段，所述片段可能参与免疫系统的调节。此类受体的非限制性例子包括但不限于程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)和具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
在一些实施方案中，开关分子包含TCR的至少一个细胞外片段，所述至少一个细胞外片段可能参与识别靶细胞的新抗原(例如，癌细胞抗原或肿瘤抗原)。在一些例子中，开关分子可以包含TCRα和/或β链的细胞外可变区。
包含免疫检查点受体或其任何衍生物、变体或片段的开关分子可以结合包含任何合适的免疫检查点受体配体或其任何衍生物、变体或片段的抗原。此类配体的非限制性例子包括但不限于B7-1、B7-H3、B7-H4、HVEM(疱疹病毒进入介导物)、AP2M1、CD80、CD86、SHP-2、PPP2R5A、MHC(例如，I类、II类)、PD-L1和PD-L2。
在一些实施方案中，开关分子包含细胞因子受体的片段。细胞因子受体可以发挥多种功能，其非限制性例子包括免疫细胞调节和介导炎症。在一些实施方案中，开关分子包含细胞因子受体(例如I型细胞因子受体或II型细胞因子受体)或其任何衍生物、变体或片段。在一些实施方案中，开关分子包含白细胞介素受体(例如，IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-9R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-15R、IL-21R、IL-23R、IL-27R和IL-31R)、集落刺激因子受体(例如，促红细胞生成素受体、CSF-1R、CSF-2R、GM-CSFR和G-CSFR)、激素受体/神经肽受体(例如，生长激素受体、催乳素受体和瘦蛋白受体)或其任何衍生物、变体或片段。在一些实施方案中，开关分子包含II型细胞因子受体或其任何衍生物、变体或片段。在一些实施方案中，开关分子包含干扰素受体(例如，IFNAR1、IFNAR2和IFNGR)、白细胞介素受体(例如，IL-10R、IL-20R、IL-22R和IL-28R)、组织因子受体(也称为血小板组织因子)或其任何衍生物、变体或片段。
在一些实施方案中，开关分子可以包含催化受体(如受体酪氨酸激酶(RTK))或其任何衍生物、变体或片段的至少一个细胞外区域(例如，配体结合结构域)。在一些实施方案中，开关分子包含I类RTK(例如，表皮生长因子(EGF)受体家族，包括EGFR；ErbB家族，包括ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4)、II类RTK(例如，胰岛素受体家族，包括INSR、IGF-1R和IRR)、III类RTK(例如，血小板衍生生长因子(PDGF)受体家族，包括PDGFR-α、PDGFR-β、CSF-1R、KIT/SCFR和FLK2/FLT3)、IV类RTK(例如，成纤维细胞生长因子(FGF)受体家族，包括FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3和FGFR-4)、V类RTK(例如，血管内皮生长因子(VEGF)受体家族，包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)、VI类RTK(例如，肝细胞生长因子(HGF)受体家族，包括肝细胞生长因子受体(HGFR/MET)和RON)、VII类RTK(例如，原肌球蛋白受体激酶(Trk)受体家族，包括TRKA、TRKB和TRKC)、VIII类RTK(例如，肝配蛋白(Eph)受体家族，包括EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5和EPHB6)、IX类RTK(例如，AXL受体家族，如AXL、MER和TRYO3)、X类RTK(例如，LTK受体家族，如LTK和ALK)、XI类RTK(例如，TIE受体家族，如TIE和TEK)、XII类RTK(例如，ROR受体家族ROR1和ROR2)、XIII类RTK(例如，盘状结构域受体(discoidin domain receptor，DDR)家族，如DDR1和DDR2)、XIV类RTK(例如，RET受体家族，如RET)、XV类RTK(例如，KLG受体家族，包括PTK7)、XVI类RTK(例如，RYK受体家族，包括Ryk)、XVII类RTK(例如，MuSK受体家族，如MuSK)或其任何衍生物、变体或片段。
包含RTK或其任何衍生物、变体或片段的开关分子可以结合包含任何合适的RTK配体或其任何衍生物、变体或片段的抗原。RTK配体的非限制性例子包括生长因子、细胞因子和激素。生长因子包括例如表皮生长因子家族的成员(例如，表皮生长因子或EGF、肝素结合EGF样生长因子或HB-EGF、转化生长因子-α或TGF-α、双调蛋白或AR、上皮调节蛋白或EPR、epigen、乙胞素或BTC、神经调节蛋白1或NRG1、神经调节蛋白2或NRG2、神经调节蛋白3或NRG3和神经调节蛋白4或NRG4)、成纤维细胞生长因子家族的成员(例如，FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15/19、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21和FGF23)、血管内皮生长因子家族的成员(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)和血小板衍生生长因子家族的成员(例如，PDGFA、PDGFB、PDGFC和PDGFD)。激素包括例如胰岛素/IGF/松弛素家族的成员(例如，胰岛素、胰岛素样生长因子、松弛素家族肽(包括松弛素1、松弛素2、松弛素3)、莱氏细胞特异性胰岛素样肽(基因INSL3)、早期胎盘胰岛素样肽(ELIP)(基因INSL4)、胰岛素样肽5(基因INSL5)和胰岛素样肽6)。
在一些实施方案中，开关分子包含催化受体(如受体苏氨酸/丝氨酸激酶(RTSK))或其任何衍生物、变体或片段的至少一个细胞外区域(例如，配体结合结构域)。开关分子可以包含I型RTSK、II型RTSK或其任何衍生物、变体或片段。开关分子可以包含选自以下的I型受体或其任何衍生物、变体或片段：ALK1(ACVRL1)、ALK2(ACVR1A)、ALK3(BMPR1A)、ALK4(ACVR1B)、ALK5(TGFβR1)、ALK6(BMPR1B)和ALK7(ACVR1C)。开关分子可以包含选自以下的II型受体或其任何衍生物、变体或片段：TGFβR2、BMPR2、ACVR2A、ACVR2B和AMHR2(AMHR)。在一些实施方案中，开关分子包含TGF-β受体或其任何衍生物、变体或片段。
包含RTSK或其任何衍生物、变体或片段的开关分子可以结合包含任何合适的RTSK配体或其任何衍生物、变体或片段的抗原。
开关分子可以包含引发免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)。共刺激分子可以结合配体。在一些情况下，共刺激分子可以被配体响应蛋白激活。在一些实施方案中，共刺激分子是可操作的以调节免疫细胞中的增殖和/或存活信号。在一些实施方案中，ICD是选自以下的共刺激分子的细胞内结构域：MHC I类蛋白、MHC II类蛋白、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA或Toll配体受体。在一些实施方案中，共刺激结构域包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD3、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、IL-12R、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
开关分子的ECD和ICD可以通过跨膜结构域连接，例如通过跨膜区段连接。在一些实施方案中，跨膜区段包含多肽。跨膜多肽可以具有任何合适的多肽序列。在一些情况下，跨膜多肽包含内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分相比具有至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)氨基酸取代、缺失和插入的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含非天然多肽序列，如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施方案中，跨膜多肽将信号(例如指示配体结合的信号)从ECD传递至ICD。
配体与开关分子的结合可以在经修饰的免疫细胞中产生免疫细胞激活信号。在一些实施方案中，免疫细胞激活信号由激活因子介导。激活因子可以是免疫调节分子。激活因子可以结合、激活或刺激T细胞或其他免疫细胞以调节其活性。在一些实施方案中，激活因子可以从免疫细胞分泌。激活因子可以是例如可溶性细胞因子、可溶性趋化因子或生长因子分子。可以介导免疫细胞激活的激活因子的非限制性例子包括可溶性细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)、干扰素(IFN)或其任何功能片段或变体。
免疫细胞激活信号可以包含或导致经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)的克隆扩增；经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)的细胞因子释放；经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)的细胞毒性；经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)的增殖；经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)的分化、去分化或转分化；经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)的运动和/或运输；经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)的耗竭和/或再激活；以及经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)的其他细胞间分子、代谢产物、化学化合物或其组合的释放。
在一些实施方案中，免疫细胞活性包含或导致免疫细胞的克隆扩增。克隆扩增可以包含由免疫细胞引起的子细胞产生。由克隆扩增产生的子细胞可以包含开关分子。经修饰的免疫细胞的克隆扩增可以比缺少开关分子的可比较免疫细胞的克隆扩增更多。经修饰的免疫细胞的克隆扩增可以比缺少开关分子的可比较免疫细胞多了约5倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约30倍、约30倍至约40倍、约40倍至约50倍、约50倍至约60倍、约60倍至约70倍、约70倍至约80倍、约80倍至约90倍、约90倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约300倍、约300倍至约400倍、约400倍至约500倍、约500倍至约600倍或约600倍至约700倍。在一些实施方案中，确定克隆扩增可以包括定量例如在有和没有开关分子的情况下以及在配体结合开关分子之后免疫细胞的数量。可以通过多种技术来实现对免疫细胞的数量的定量，所述技术的非限制性例子包括流式细胞术、台盼蓝排除和血细胞计数。
在一些实施方案中，免疫细胞活性包含或导致免疫细胞的细胞因子释放。在一些实施方案中，免疫细胞活性包含或导致细胞间分子、代谢产物、化学化合物或其组合的释放。经修饰的免疫细胞的细胞因子释放可以包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、IL-21、IL-22、IFNγ、TNFα、CSF、TGFβ、颗粒酶等的释放。在一些实施方案中，可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、western印迹等来定量细胞因子的释放。经修饰的免疫细胞的细胞因子释放可以比缺少开关分子的可比较免疫细胞的细胞因子释放更多。与缺少开关分子的可比较免疫细胞相比，本文提供的经修饰的免疫细胞可以产生约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍或超过300倍更多的细胞因子释放。与缺少开关分子的可比较免疫细胞(例如，未经修饰的)相比，当开关分子与配体结合并且经修饰的免疫细胞与靶细胞上存在的新抗原结合时，经修饰的免疫细胞可以展现出增加的细胞因子分泌。在一些实施方案中，所分泌的细胞因子是IFNγ或IL-2。在一些实施方案中，可以在体外或在体内定量细胞因子释放。
在一些实施方案中，免疫细胞活性包含或导致免疫细胞的细胞毒性。在一些情况下，本文提供的经修饰的免疫细胞的细胞毒性可以用于杀伤靶细胞。表达开关分子的免疫细胞或免疫细胞群可以诱导靶细胞死亡。杀伤靶细胞可用于多种应用，包括但不限于治疗其中希望消除细胞群或希望抑制其增殖的疾病或障碍。细胞毒性还可以是指免疫细胞的细胞毒性细胞因子(例如IFNγ或颗粒酶)的释放。在一些情况下，本文提供的经修饰的免疫细胞可能已经改变(i)诸如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素等细胞毒素的释放和/或(ii)经由T细胞与靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用的凋亡诱导。在一些实施方案中，可以通过细胞毒性测定来定量细胞毒性，所述细胞毒性测定包括共培养测定、ELISPOT、铬释放细胞毒性测定等。本文提供的经修饰的免疫细胞的细胞毒性可以比缺少开关分子的可比较免疫细胞的细胞毒性更大。与缺少开关分子的可比较免疫细胞(例如，未经修饰的)相比，当开关分子与配体结合并且经修饰的免疫细胞与靶细胞上存在的新抗原结合时，经修饰的免疫细胞可以展现出增加的针对靶细胞的细胞毒性。与缺少开关分子的可比较免疫细胞相比，本公开文本的经修饰的免疫细胞可以具有约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％更多的针对靶细胞的细胞毒性。本公开文本的经修饰的免疫细胞可以诱导比缺少开关分子的可比较免疫细胞多了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％的靶细胞死亡。在一些实施方案中，本文提供的免疫细胞可以诱导在其表面上展示靶表位(例如，新抗原)的靶细胞的凋亡。在一些实施方案中，可以在体外或在体内确定细胞毒性。在一些实施方案中，确定细胞毒性可以包括确定与给予本文提供的经修饰的免疫细胞之前的疾病水平相比在所述给予之后的疾病水平。在一些实施方案中，确定细胞毒性可以包括确定在给予本文提供的经修饰的免疫细胞之后的疾病水平以及在给予缺少开关分子的可比较免疫细胞之后的疾病水平。
在一些实施方案中，免疫细胞活性包含或导致免疫细胞的增殖。免疫细胞的增殖可以是指免疫细胞的扩增。免疫细胞的增殖可以是指免疫细胞的表型变化。本公开文本的经修饰的免疫细胞的增殖可以比缺少开关分子的可比较免疫细胞的增殖更多。本文提供的经修饰的免疫细胞的增殖可以比缺少开关分子的可比较免疫细胞的增殖多了约5倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约30倍、约30倍至约40倍、约40倍至约50倍、约50倍至约60倍、约60倍至约70倍、约70倍至约80倍、约80倍至约90倍、约90倍至约100倍、约100倍至约200倍、从约200倍至约300倍、从约300倍至约400倍、从约400倍至约500倍、从约500倍至约600倍或从约600倍至约700倍。在一些实施方案中，可以通过定量免疫细胞的数量来确定增殖。定量免疫细胞的数量可以包括流式细胞术、台盼蓝排除和/或血细胞计数。也可以通过免疫细胞的表型分析来确定增殖。
在一些实施方案中，免疫细胞活性可以包含或导致免疫细胞的分化、去分化或转分化。可以通过流式细胞术评价在细胞表面上的分化、去分化或转分化标记的表型表达来确定免疫细胞的分化、去分化或转分化。在一些实施方案中，与缺少开关分子的可比较免疫细胞相比，本文提供的经修饰的免疫细胞具有增加的分化能力。在一些实施方案中，与缺少开关分子的可比较免疫细胞相比，本文提供的经修饰的免疫细胞具有增加的去分化能力。在一些实施方案中，与缺少开关分子的可比较免疫细胞相比，本文提供的经修饰的免疫细胞具有更大的转分化能力。
在一些实施方案中，免疫细胞活性可以包含或导致免疫细胞的运动和/或运输。在一些实施方案中，可以通过定量免疫细胞到靶位点的定位来确定运动。例如，本文提供的经修饰的免疫细胞可以在给予之后在靶位点处定量，例如在不是靶位点的位点处定量。可以通过分离病灶并定量包含开关分子的免疫细胞(例如肿瘤浸润性淋巴细胞)的数量来进行定量。包含开关分子的免疫细胞的运动和/或运输可以比缺少开关分子的可比较免疫细胞的运动和/或运输更大。在一些实施方案中，包含开关分子的免疫细胞在靶位点(例如肿瘤病灶)处的数量可以是缺少开关分子的可比较免疫细胞的数量的约5X、10X、15X、20X、25X、30X、35X或40X。也可以利用跨孔(transwell)迁移测定在体外确定运输。在一些实施方案中，例如在跨孔迁移测定中，包含开关分子的免疫细胞在靶位点处的数量可以是缺少开关分子的可比较免疫细胞的数量的约5X、10X、15X、20X、25X、30X、35X或40X。
在一些实施方案中，免疫细胞活性可以包含或导致免疫细胞的耗竭和/或激活。可以通过流式细胞术的表型分析或显微镜分析来确定免疫细胞的耗竭和/或激活。例如，可以定量地和/或定性地确定耗竭标记(例如程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG3)、2B4、CD160、Tim3和具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT))的表达水平。在一些情况下，免疫细胞(如T细胞)可能以分层方式丧失效应子功能，并且变得耗竭。由于耗竭，可能丧失诸如IL-2产生和细胞因子表达等功能以及高增殖能力。耗竭还可能伴随着IFNγ、TNF和趋化因子产生以及脱颗粒的缺陷。本文提供的经修饰的免疫细胞的耗竭或激活可以比缺少开关分子的可比较免疫细胞的耗竭或激活更大。在一些实施方案中，与缺少开关分子的可比较免疫细胞相比，本文提供的免疫细胞可以经历至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍或超过300倍的耗竭或激活增加。在一些实施方案中，与缺少开关分子的可比较免疫细胞相比，本文提供的免疫细胞可以经历至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍或超过300倍的耗竭或激活减少。
在一些实施方案中，在开关分子与配体结合后，与缺少开关分子的可比较免疫细胞相比，经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)展现出增强的新抗原结合。
在一方面，本公开文本提供了经修饰的免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)和展现出与新抗原的特异性结合的T细胞受体(TCR)复合物。CAR可以包含能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
展现出与新抗原的特异性结合的T细胞受体(TCR)复合物可以是内源TCR复合物或外源TCR复合物。经修饰的免疫细胞的TCR复合物(例如，内源的或外源的)可以赋予免疫细胞的抗原结合特异性(例如，新抗原结合)。
在一些实施方案中，免疫细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。TIL可以是例如T细胞、B细胞、单核细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些情况下，TIL包含CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或M1巨噬细胞。在一些实施方案中，TIL可以表达PD-1、CD137和TIM-3中的至少一种。在一些情况下，经修饰的TIL包含“原代TIL”，其是指从患者组织样品中获得的TIL。在一些情况下，经修饰的TIL包含“次级TIL”，其是指已经扩增或增殖的TIL。
CAR可以包含能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域。B细胞表面蛋白可以是可在B细胞表面上发现的任何蛋白质。非限制性例子包括CD1d、CD5、CD10、CD11a、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD28、CD29、CD34、CD37、CD38、CD40、CD44、CD45、CD49b、CD69、CD72、CD74、CD80、CD83、CD84、CD86、CD93、CD95、CD117、CD127、CD138、CD147、CD148、CD185、CD270、CD284和CD360。在一些实施方案中，CAR的抗原相互作用结构域能够结合在非B细胞上的表面蛋白，只要与表面蛋白的结合不显著损害宿主的总体健康状态或免疫系统。在一些实施方案中，表面蛋白是免疫细胞上的表面蛋白。在一些实施方案中，表面蛋白是在除免疫细胞以外的细胞上的表面蛋白。在一些实施方案中，表面蛋白可以选自(条件是与表面蛋白的结合不显著损害宿主的总体健康状态或免疫系统)CD31、CD32、A、B、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、a、b、c、d、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49(a、b、c、d、e、f)、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62(E、L、P)、CD63、CD64(A、B、C)、CD66(a、b、c、d、e、f)、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD78、CD79(a、b)、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85(a、d、e、h、j、k)、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD1(a-c)、1A、1D、1E、CD2、CD3(γ、δ、ε)、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、a、CD9、CD10、CD11(a、b、c、d)、CD13、CD14、CD15、CD16、A、B、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107(a、b)、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120(a、b)、CD121(a、b)、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD146、CD147、CD148、CD150、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CDw199、CD200、CD201、CD202b、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CDw210(a、b)、CD212、CD213a(1、2)、CD217、CD218(a、b)、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD233、CD234、CD235(a、b)、CD236、CD238、CD239、CD240CE、CD240D、CD241、CD243、CD244、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD288、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD297、CD298、CD299、CD300A、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156(a、b、c)、CD157、CD158(a、d、e、i、k)、CD159(a、c)、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD166、CD167(a、b)、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172(a、b、g)、CD174、CD177、CD178、CD179(a、b)、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185和CD186。
在一些实施方案中，CAR的抗原相互作用结构域能够结合在死的B细胞上的B细胞表面蛋白或其片段。B细胞凋亡可以发生在免疫应答(例如，针对肿瘤细胞的免疫应答)产生之前或之后。因此，死的B细胞或其碎片仍然可以具有在表面上呈现的B细胞表面蛋白或其片段。CAR靶向活的和死的B细胞的能力可能增加包含CAR的免疫细胞(i)结合B细胞表面蛋白和(i)启动细胞内信号传导结构域的信号传导的机会。在一些情况下，细胞内信号传导结构域的信号传导可能促进包含CAR的免疫细胞的扩增(增殖)。
在一些实施方案中，CAR的抗原相互作用结构域能够结合B细胞表面蛋白或其片段，所述B细胞表面蛋白或其片段(例如，经由共价和/或非共价键)偶联至颗粒(例如，纳米颗粒)表面。颗粒可以是包含有机和/或无机材料的任何颗粒材料。颗粒可以具有各种形状和尺寸。颗粒在至少一个维度上可以为约1纳米(nm)至约50微米(μm)。颗粒在至少一个维度上可以为至少约1nm、5nm、10nm、50nm、100nm、500nm、1μm、5μm、10μm、50μm或更大。颗粒在至少一个维度上可以为至多约50μm、10μm、5μm、1μm、500nm、100nm、50nm、10nm、5nm、1nm或更小。颗粒可以是纳米颗粒、微粒、纳米球、微球、纳米棒、微棒、纳米纤维、纳米带等。颗粒的例子包括金属纳米颗粒(例如，金纳米颗粒、银纳米颗粒和铁纳米颗粒)、金属间纳米半导体纳米颗粒、核壳纳米颗粒、具有无机核与聚合物壳的颗粒、具有有机核与聚合物壳的颗粒、及其混合物。可替代地，颗粒可以是有机纳米颗粒，如交联聚合物、水凝胶聚合物、可生物降解聚合物、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)、共聚物、多糖、淀粉、纤维素、壳聚糖、聚羟基链烷酸酯(PHA)、PHB、PHV、脂质、肽、肽两亲物、多肽(例如，蛋白质)或其组合。可以将在表面上呈现B细胞表面蛋白的颗粒体外引入包含结合B细胞表面蛋白的CAR的免疫细胞中。可替代地或另外地，可以与包含CAR的免疫细胞一起体内引入(例如，局部或系统注射)呈现B细胞表面蛋白的颗粒。可以将此类颗粒用于在体外或在体内扩增包含CAR的免疫细胞群。
抗原结合结构域可以包含能够结合抗原(例如，B细胞表面蛋白)的任何蛋白质或分子。抗原结合结构域的非限制性例子包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠抗体或其功能衍生物、变体或片段，所述功能衍生物、变体或片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、小抗体、双抗体和单结构域抗体(如骆驼衍生纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv和scFv中的至少一种。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗体模拟物。抗体模拟物是指能以与抗体相当的亲和力结合靶分子的分子，并且包括单链结合分子、基于细胞色素b562的结合分子、纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白支架(例如，adnectin)、脂质运载蛋白支架、杯芳烃支架、A结构域和其他支架。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含跨膜受体或其任何衍生物、变体或片段。例如，抗原结合结构域可以包含跨膜受体的至少一个配体结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域可以包含scFV。scFv可以源自其可变区序列已知的抗体。在一些实施方案中，scFv可以源自从可用的小鼠杂交瘤获得的抗体序列。可以从肿瘤细胞或原代细胞的全外显子测序获得scFv。在一些实施方案中，scFv可以被改变。例如，能以多种方式修饰scFv。在一些情况下，可以将scFv突变，使得scFv可以对其靶标具有更高的亲和力。在一些情况下，可以针对在正常组织上以低水平表达的靶标来优化scFv对其靶标的亲和力。可以进行此优化以使潜在的毒性(如高细胞因子血症)最小化。在其他情况下，对靶标的膜结合形式具有更高亲和力的scFv的克隆可能优于其可溶性形式对应物。如果还可以在不同水平上以可溶形式检测到一些靶标，且其靶向可能引起不想要的毒性(如高细胞因子血症)，则可以进行此修饰。
可以将主题系统的CAR的抗原结合结构域经由跨膜结构域连接至细胞内信号传导结构域。跨膜结构域可以是跨膜区段。主题CAR的跨膜结构域可以将CAR锚定至细胞(例如免疫细胞)的质膜。在一些实施方案中，跨膜区段包含多肽。连接CAR的抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜多肽可以具有任何合适的多肽序列。在一些情况下，跨膜多肽包含内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分相比具有至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)氨基酸取代、缺失和插入的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含非天然多肽序列，如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施方案中，跨膜多肽例如经由抗原结合结构域将信号从细胞的细胞外区域传递至细胞内区域。可以在CAR中使用CD28的天然跨膜部分。在其他情况下，还可以在CAR中使用CD8α的天然跨膜部分。
本公开文本的CAR可以包含参与免疫细胞信号传导的信号传导结构域或其任何衍生物、变体或片段。CAR的细胞内信号传导结构域可以诱导包含CAR的免疫细胞的活性。细胞内信号传导结构域可以转导效应子功能信号并指导细胞执行专门功能。信号传导结构域可以包含其他分子的信号传导结构域。在一些情况下，在CAR中使用信号传导结构域的截短部分。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含参与免疫细胞信号传导的多个信号传导结构域或其任何衍生物、变体或片段。例如，细胞内信号传导结构域可以包含至少2个免疫细胞信号传导结构域，例如至少2个、3个、4个、5个、7个、8个、9个或10个免疫细胞信号传导结构域。免疫细胞信号传导结构域能以刺激方式或抑制方式参与调节TCR复合物的初级激活。细胞内信号传导结构域可以是T细胞受体(TCR)复合物的细胞内信号传导结构域。主题CAR的细胞内信号传导结构域可以包含以下的信号传导结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。在一些实施方案中，信号传导结构域包括免疫受体酪氨酸基激活基序或ITAM。包含ITAM的信号传导结构域可以包含被6-8个氨基酸分开的氨基酸序列YxxL/I的两个重复，其中每个x独立地是任何氨基酸，从而产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。当抗原结合结构域与表位结合时，可以例如通过磷酸化来修饰包含ITAM的信号传导结构域。磷酸化的ITAM可以作为其他蛋白质(例如参与各种信号传导途径的蛋白质)的停泊位点。在一些实施方案中，初级信号传导结构域包含经修饰的ITAM结构域(例如，突变的、截短的和/或优化的ITAM结构域)，所述经修饰的ITAM结构域与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加的或减少的)活性。
在一些实施方案中，主题CAR的细胞内信号传导结构域包含FcγR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcγR信号传导结构域可以选自FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含FcεR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcεR信号传导结构域可以选自FcεRI和FcεRII(CD23)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含FcαR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcαR信号传导结构域可以选自FcαRI(CD89)和Fcα/μR。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，初级信号传导结构域包含CD3ζ的ITAM。
在一些实施方案中，主题CAR的细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸基抑制基序或ITIM。包含ITIM的信号传导结构域可以包含在免疫系统的一些抑制受体的胞质尾中发现的氨基酸保守序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)。可以通过诸如Src激酶家族成员(例如，Lck)等酶来修饰包含ITIM的初级信号传导结构域，例如使其磷酸化。磷酸化后，可以将其他蛋白质(包括酶)募集到ITIM。这些其他蛋白质包括但不限于酶，如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2、称为SHIP的肌醇磷酸酶、以及具有一个或多个SH2结构域的蛋白质(例如，ZAP70)。细胞内信号传导结构域可以包含以下的信号传导结构域(例如，ITIM)：BTLA、CD5、CD31、CD66a、CD72、CMRF35H、DCIR、EPO-R、FcγRIIB(CD32)、Fc受体样蛋白2(FCRL2)、Fc受体样蛋白3(FCRL3)、Fc受体样蛋白4(FCRL4)、Fc受体样蛋白5(FCRL5)、Fc受体样蛋白6(FCRL6)、蛋白G6b(G6B)、白细胞介素4受体(IL4R)、免疫球蛋白超家族受体转运相关蛋白1(IRTA1)、免疫球蛋白超家族受体转运相关蛋白2(IRTA2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL1(KIR2DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL2(KIR2DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL3(KIR2DL3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL5(KIR2DL5)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL1(KIR3DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL2(KIR3DL2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LIR1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(LIR2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3(LIR3)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员5(LIR5)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员8(LIR8)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)、肥大细胞功能相关抗原(MAFA)、NKG2A、天然细胞毒性触发受体2(NKp44)、NTB-A、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PILR、SIGLECL1、唾液酸结合Ig样凝集素2(SIGLEC2或CD22)、唾液酸结合Ig样凝集素3(SIGLEC3或CD33)、唾液酸结合Ig样凝集素5(SIGLEC5或CD170)、唾液酸结合Ig样凝集素6(SIGLEC6)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素10(SIGLEC10)、唾液酸结合Ig样凝集素11(SIGLEC11)、唾液酸结合Ig样凝集素4(SIGLEC4)、唾液酸结合Ig样凝集素8(SIGLEC8)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、血小板和内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、信号调节蛋白(SIRP2)和信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含经修饰的ITIM结构域(例如，突变的、截短的和/或优化的ITIM结构域)，所述经修饰的ITIM结构域与天然ITIM结构域相比具有改变的(例如，增加的或减少的)活性。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含至少2个ITAM结构域(例如，至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个ITAM结构域)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含至少2个ITIM结构域(例如，至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个ITIM结构域)(例如，至少2个初级信号传导结构域)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含ITAM结构域和ITIM结构域两者。
在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以包括共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域(例如来自共刺激分子)可以提供共刺激信号用于免疫细胞信号传导，如来自ITAM和/或ITIM结构域的信号传导，例如用于免疫细胞活性的激活和/或失活。在一些实施方案中，共刺激结构域是可操作的以调节免疫细胞中的增殖和/或存活信号。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域包含以下的信号传导结构域：MHC I类蛋白、MHCII类蛋白、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA或Toll配体受体。在一些实施方案中，共刺激结构域包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含多个共刺激结构域，例如至少两个(例如，至少3个、4个或5个)共刺激结构域。共刺激信号传导区域可以提供与初级效应子激活信号协同的信号，并且可以完成T细胞激活的要求。在一些实施方案中，向CAR添加共刺激结构域可以增强本文提供的免疫细胞的功效和持久性。
与缺少CAR的免疫细胞相比，CAR与B细胞表面蛋白的结合可以增强免疫细胞的增殖。免疫细胞的增殖可以是指免疫细胞的扩增。免疫细胞的增殖可以是指免疫细胞的表型变化。本文提供的包含CAR的免疫细胞的增殖可以比缺少展现出与B细胞表面蛋白的结合的CAR的可比较免疫细胞的增殖更多。包含CAR的免疫细胞的增殖可以比缺少CAR的可比较免疫细胞的增殖多了约5倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约30倍、约30倍至约40倍、约40倍至约50倍、约50倍至约60倍、约60倍至约70倍、约70倍至约80倍、约80倍至约90倍、约90倍至约100倍、约100倍至约200倍、从约200倍至约300倍、从约300倍至约400倍、从约400倍至约500倍、从约500倍至约600倍、从约600倍至约700倍。包含CAR的免疫细胞的增殖可以比缺少CAR的可比较免疫细胞的增殖多了约5倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约30倍、约30倍至约40倍、约40倍至约50倍、约50倍至约60倍、约60倍至约70倍、约70倍至约80倍、约80倍至约90倍、约90倍至约100倍、约100倍至约200倍、从约200倍至约300倍、从约300倍至约400倍、从约400倍至约500倍、从约500倍至约600倍、从约600倍至约700倍，并且其中在B细胞与B细胞表面蛋白接触之后至少约12、24、36、48、60、72、84或96小时确定增殖。可以在体外或在体内确定增强的增殖。在一些实施方案中，增殖可以包括定量免疫细胞的数量。定量免疫细胞的数量可以包括流式细胞术、台盼蓝排除和/或血细胞计数。也可以通过免疫细胞的表型分析来确定增殖。
在一方面，本公开文本提供了特异性地结合新抗原的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞包含：(a)包含与所述新抗原结合的多肽细胞外结构域(PED)的嵌合刺激分子，其中所述PED与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，并且其中所述嵌合刺激分子与所述新抗原的结合在所述经修饰的免疫细胞中产生所述免疫细胞激活信号；以及(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，PED可以是未经修饰的TIL的表面蛋白的细胞外结构域。在一些实施方案中，PED的例子包括抗体、以及其衍生物、变体和片段。
在一方面，本公开文本提供了特异性地结合新抗原的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞包含：(a)开关分子，所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，并且其中所述开关分子与所述配体的结合在所述经修饰的免疫细胞中产生所述免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号；以及(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
在一方面，本公开文本提供了特异性地结合新抗原的经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其中所述经修饰的免疫细胞包含：(a)开关分子，所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，并且其中所述开关分子与所述配体的结合在所述经修饰的TIL中产生所述免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号；以及(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
在一方面，本公开文本提供了过表达细胞因子(例如趋化因子)的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞是(i)肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)；(ii)基质肿瘤浸润性淋巴细胞(sTIL)；或(iii)展现出与抗原的特异性结合的T细胞。过表达趋化因子的经修饰的免疫细胞可以是本文提供的任何经修饰的免疫细胞。
细胞因子是指由细胞释放的可能影响细胞行为的蛋白质(例如，趋化因子、干扰素、淋巴因子、白细胞介素和肿瘤坏死因子)。细胞因子由广泛的细胞产生，所述细胞包括免疫细胞(如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞)、以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。给定的细胞因子可以由超过一种类型的细胞产生。细胞因子可以参与产生系统或局部免疫调节作用。
某些细胞因子可以用作促炎性细胞因子。促炎性细胞因子是指参与诱导或扩大炎性反应的细胞因子。促炎性细胞因子可以与免疫系统的各种细胞(如嗜中性粒细胞和白细胞)一起工作，以产生免疫应答。某些细胞因子可以用作抗炎性细胞因子。抗炎性细胞因子是指参与减少炎性反应的细胞因子。在一些情况下，抗炎性细胞因子可以调节促炎性细胞因子反应。一些细胞因子既可以用作促炎性细胞因子，也可以用作抗炎性细胞因子。某些细胞因子(例如，趋化因子)可以在趋化作用中发挥功能。趋化因子可以在附近的反应细胞中诱导定向趋化作用。
在一些实施方案中，可以在免疫细胞中上调具有促炎性功能和/或趋化功能的细胞因子的表达。上调具有促炎性功能和/或趋化功能的细胞因子的表达可用于例如在免疫疗法中刺激针对靶细胞的免疫应答。
可以由本文提供的免疫细胞过表达的细胞因子的例子包括但不限于淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体化激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α；米勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；Flt-3L；干细胞因子(SCF)；骨诱导因子；干扰素(IFN)，如IFN-α、IFN-β、IFN-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；巨噬细胞刺激因子(MSP)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1a、IL-1b、IL-1RA、IL-18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-20；肿瘤坏死因子，如CD154、LT-β、TNF-α、TNF-β、4-1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCE；以及其他多肽因子，包括LIF、抑瘤素M(OSM)和kit配体(KL)。细胞因子受体是指结合细胞因子的受体蛋白。细胞因子受体可以是膜结合的和可溶的。
在一些实施方案中，过表达的细胞因子是白细胞介素(IL-1)家族成员(例如，配体)、IL-1受体家族成员、白细胞介素6(IL-6)家族成员(例如，配体)、IL-6受体、白细胞介素10(IL-10)家族成员(例如，配体)、IL-10受体、白细胞介素12(IL-12)家族成员(例如，配体)、IL-12受体、白细胞介素17(IL-17)家族成员(例如，配体)或IL-17受体。
在一些实施方案中，过表达的细胞因子是白细胞介素1(IL-1)家族成员或相关蛋白；肿瘤坏死因子(TNF)家族成员或相关蛋白；干扰素(IFN)家族成员或相关蛋白；白细胞介素6(IL-6)家族成员或相关蛋白；或趋化因子或相关蛋白。在一些实施方案中，细胞因子选自IL18、IL18BP、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F3/IL1RA、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1RL2、IL1F9、IL33、BAFF/BLyS/TNFSF138、4-1BBL、CD153/CD30L/TNFSF8、CD40LG、CD70、Fas配体/FASLG/CD95L/CD178、EDA-A1、TNFSF14/LIGHT/CD258、TNFA、LTA/TNFB/TNFSF1、LTB/TNFC、CD70/CD27L/TNFSF7、TNFSF10/TRAIL/APO-2L(CD253)、RANKL/OPGL/TNFSF11(CD254)、TNFSF12、TNF-α/TNFA、TNFSF13、TL1A/TNFSF15、OX-40L/TNFSF4/CD252、CD40L/CD154/TNFSF5、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA7、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFNA8、IFNA5/IFNaG、IFNω/IFNW1、CLCF1、CNTF、IL11、IL31、IL6、瘦蛋白、LIF、OSM、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7/Ppbp、CXCL9、IL8/CXCL8、XCL1、XCL2、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4和FAM19A5。
可以使用多种方法来评价细胞因子表达。可以通过测定经修饰的免疫细胞在其中生长的细胞培养基(例如，体外产生)或从具有经修饰的免疫细胞的受试者获得的血清(例如，体内产生)中的一种或多种细胞因子的存在来评价细胞因子表达。可以使用任何合适的测定以各种合适的单位(包括浓度)来定量细胞因子水平。在一些实施方案中，检测细胞因子蛋白。在一些实施方案中，检测细胞因子的mRNA转录物。细胞因子测定的例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫荧光测定、放射免疫测定、允许平行检测样品中各种细胞因子的抗体阵列、基于珠的阵列、定量PCR、微阵列等。其他合适的方法可以包括蛋白质组学方法(2-D凝胶、MS分析等)。
在一些实施方案中，由本文提供的经修饰的免疫细胞过表达的细胞因子是趋化因子。趋化因子可以是例如CC趋化因子、CXC趋化因子、C趋化因子和CX3C趋化因子。在一些实施方案中，由经修饰的免疫细胞过表达的趋化因子是选自以下的CC趋化因子：CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27和CCL28。所述趋化因子是选自以下的CXC趋化因子：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16和CXCL17。在一些实施方案中，由经修饰的免疫细胞过表达的趋化因子是选自XCL1和XCL2的C趋化因子。在一些实施方案中，由免疫细胞过表达的趋化因子是CX3C趋化因子，并且所述CX3C趋化因子是CX3CL1。
在一方面，本公开文本提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括：(a)向受试者给予本文各方面的各种实施方案中任一个的经修饰的TIL、经修饰的T细胞或经修饰的免疫细胞；以及(b)使表达新抗原的所述癌症的靶细胞与所述经修饰的TIL、经修饰的T细胞或经修饰的免疫细胞在诱导所述经修饰的TIL、经修饰的T细胞或经修饰的免疫细胞针对所述癌症的靶细胞的细胞毒性的条件下接触，从而诱导所述癌症的靶细胞的死亡。
在一方面，本公开文本提供了扩增T细胞群的方法，所述方法包括：(a)提供包含本文各方面的各种实施方案中任一个的至少一种经修饰的免疫细胞的T细胞群；(b)将所述T细胞群暴露于B细胞表面蛋白以实现所述T细胞群的扩增。在一些实施方案中，在(b)中，将T细胞群暴露于包含B细胞表面蛋白的B细胞。
在一方面，本公开文本提供了扩增T细胞群的方法，其包括：(a)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述T细胞群中，从而产生第一CAR表达细胞群，其中所述CAR包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域；以及(b)使所述第一CAR表达细胞群与B细胞表面蛋白接触，从而产生扩增的和/或激活的免疫细胞群。
在一方面，本公开文本提供了组合物，其包含编码以下中的一种或多种的一种或多种多核苷酸：(a)开关分子，其中所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激蛋白的细胞内结构域(ICD)融合；以及(b)抗原特异性T细胞受体复合物或其一种或多种组分。
在一方面，本公开文本提供了组合物，其包含编码以下中的一种或多种的一种或多种多核苷酸：(a)抗原特异性T细胞受体复合物或其一种或多种组分；以及(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
在一方面，本公开文本提供了组合物，其包含编码以下中的一种或多种的一种或多种多核苷酸：(a)开关分子，其中所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激蛋白的细胞内结构域(ICD)融合；(b)抗原特异性T细胞受体复合物或其一种或多种组分；以及(c)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
在本文各方面的各种实施方案中，启动子可以与本公开文本的组合物一起使用。示例性启动子包括在真核生物、哺乳动物、非人哺乳动物或人细胞中有活性的那些。启动子可以是诱导型或组成型活性启动子。可替代地或另外地，启动子可以是组织或细胞特异性的。
合适的真核启动子(即在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性例子可以包括来自以下的那些：巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)、人类延伸因子1启动子(EF1)、包含与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂合构建体、小鼠干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)和小鼠金属硫蛋白-I。启动子可以是真菌启动子。启动子可以是植物启动子。可以找到植物启动子的数据库(例如，PlantProm)。表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包括用于扩增表达的适当序列。
在本文各方面的各种实施方案中，经修饰的免疫细胞可以特异性地结合新抗原和/或新表位。新抗原和新表位通常是指在一些情况下触发抗肿瘤T细胞反应的肿瘤特异性突变。例如，可以使用全外显子测序方法来鉴定这些内源突变。Tran E等人,“Cancerimmunotherapy based on mutation-specific CD4+T cells in a patient withepithelial cancer,”Science 344:641-644(2014)。包含开关分子的经修饰的免疫细胞(例如，经修饰的TIL或经修饰的T细胞)可以展现出与肿瘤特异性新抗原的特异性结合。由免疫细胞结合的新抗原可以在靶细胞上表达，并且例如由内源基因中的突变编码。在一些情况下，由免疫细胞特异性地结合的新抗原或新表位可以由突变基因编码。基因可以选自：ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B(编码NY-ESO-1)、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、NY-ESO、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。在一些实施方案中，基于来自个体的肿瘤样品的遗传谱选择新抗原。在一些实施方案中，可以基于来自个体的肿瘤样品的体细胞突变谱选择新抗原。
在本文各方面的各种实施方案中，经修饰的免疫细胞还包含杀伤开关。在严重毒性(如高细胞因子血症)的情况下，可以激活杀伤开关以消除免疫细胞。当免疫系统具有如此强烈的反应以致于释放出许多炎性细胞因子，从而触发轻度至严重的症状，包括发烧、头痛、皮疹、心跳加快、血压低和呼吸困难时，可能发生这种情况。杀伤开关可以是药物诱导型杀伤开关。杀伤开关可以包含诱导型半胱天冬酶9。
本文各方面的各种实施方案包含细胞，例如经修饰的免疫细胞。可以从受试者获得细胞，例如免疫细胞(例如，包括T细胞和NK细胞的淋巴细胞)。受试者的非限制性例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。来自可以衍生出细胞的受试者的样品的例子包括但不限于皮肤、心脏、肺、肾、骨髓、乳房、胰腺、肝、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、前列腺、食管、甲状腺、血清、唾液、尿液、胃和消化液、泪液、粪便、精液、阴道分泌物、源自肿瘤组织的间质液、眼内液、汗液、粘液、耳垢、油、腺分泌物、脊髓液、头发、指甲、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脑脊液、组织、咽拭子、活检、胎盘液、羊水、脐带血、淋巴液(emphaticfluid)、腔液、痰、脓、微生物群、胎粪、母乳和/或其他排泄物或身体组织。
在一些情况下，细胞可以是从受试者获得的T细胞、NK细胞、B细胞等的群体。T细胞可以从许多来源获得，所述来源包括PBMC、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、以及来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在一些实施方案中，可以使用多种技术(如FicollTM分离)从自受试者收集的血液单位获得T细胞。在一个实施方案中，通过单采术获得来自个体循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。可以将通过单采术收集的细胞洗涤，以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中进行后续处理步骤。
多种免疫细胞中的任何一种均可以用于本文的各方面。在一些实施方案中，免疫细胞包含粒细胞，如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞；肥大细胞；可以发育成巨噬细胞的单核细胞；抗原呈递细胞，如树突细胞；以及淋巴细胞，如自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞和T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是免疫效应细胞。免疫效应细胞是指可以响应于刺激物而执行特定功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是可以诱导细胞死亡的免疫效应细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是NK细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是激活的T细胞。T细胞包括幼稚和记忆细胞(例如中枢记忆或TCM、效应记忆或TEM和效应记忆RA或TEMRA)、效应细胞(例如细胞毒性T细胞或CTL或Tc细胞)、辅助细胞(例如Thl、Th2、Th3、Th9、Th7、TFH)、调节细胞(例如Treg和Trl细胞)、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)、αβΤ细胞、γδΤ细胞、以及T细胞谱系的类似独特类别。基于细胞表面上存在的蛋白质，可以将T细胞分成两大类：CD8+T细胞和CD4+T细胞。表达主题系统的T细胞可以执行多种功能，包括杀伤感染的细胞以及激活或募集其他免疫细胞。CD8+T细胞被称为细胞毒性T细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。表达主题系统的CTL可以参与识别和去除病毒感染的细胞和癌细胞。CTL具有专门的隔室或颗粒，所述隔室或颗粒含有导致凋亡(例如程序性细胞死亡)的细胞毒素。CD4+T细胞可以被细分为四个亚组-Th1、Th2、Th17和Treg，其中“Th”是指“T辅助细胞”，但是可能存在另外的亚组。Th1细胞可以协调针对细胞内微生物(尤其是细菌)的免疫应答。它们可以产生和分泌警告和激活其他免疫细胞(像吞噬细菌的巨噬细胞)的分子。Th2细胞通过警告B细胞、粒细胞和肥大细胞参与协调针对细胞外病原体(像寄生虫(寄生蠕虫))的免疫应答。Th17细胞可以产生白细胞介素17(IL-17)，一种激活免疫和非免疫细胞的信号传导分子。Th17细胞对于募集嗜中性粒细胞是重要的。
在一些实施方案中，本文提供的免疫细胞群可以是异质的。在一些实施方案中，所用的细胞可以由CD4和CD8 T细胞的异质混合物构成。CD4和CD8细胞可以具有循环效应T细胞的表型特征。所述CD4和CD8细胞也可以具有效应记忆细胞的表型特征。在一些实施方案中，细胞可以是中枢记忆细胞。
在一些实施方案中，细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)和其他血细胞亚组(例如但不限于T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞)。在一些情况下，细胞可以是任何免疫细胞，包括任何T细胞，如肿瘤浸润性细胞(TIL)，如CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或任何其他类型的T细胞。T细胞还可以包括记忆T细胞、记忆干T细胞或效应T细胞。也可以从混合群体(bulkpopulation)中选择T细胞，例如从全血中选择T细胞。也可以从混合群体中扩增T细胞。T细胞也可以向特定群体和表型倾斜。例如，可以使T细胞倾斜以在表型上包含CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。可以选择合适的细胞，所述细胞包含选自包含以下的列表的一种或多种标记：CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。细胞还包括干细胞，举例来说，如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。细胞可以包含多种原代细胞，如人细胞、非人细胞和/或小鼠细胞。细胞可以是祖细胞。细胞可以源自待治疗的受试者(例如，患者)。细胞可以源自人供体。宿主细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+构成的干记忆TSCM细胞，所述干记忆细胞还可以表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并且显示出所述干记忆细胞特有的许多功能属性。宿主细胞可以是包含L-选择素和CCR7的中枢记忆TCM细胞，所述中枢记忆细胞可以分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。细胞也可以是包含L-选择素或CCR7的效应记忆TEM细胞，并且产生例如效应细胞因子如IFNγ和IL-4。
在本文各方面的各种实施方案中，免疫细胞包含淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是自然杀伤细胞(NK细胞)。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。T细胞可以从许多来源获得，所述来源包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾脏组织、脐带和肿瘤。在一些实施方案中，可以使用多种可用T细胞系。免疫细胞如淋巴细胞(例如，细胞毒性淋巴细胞)可以优选是自体细胞，但是也可以使用异源细胞。可以使用多种技术(如Ficoll分离)从自受试者收集的血液单位获得T细胞。可以通过单采术或白细胞单采术获得来自个体的循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。可以将通过单采术收集的细胞洗涤，以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或介质(如磷酸盐缓冲盐水(PBS))中进行后续处理步骤。在洗涤之后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(如不含Ca、不含Mg的PBS)中。可替代地，可以去除单采术样品的不希望组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。样品可以由受试者直接提供，或者通过一个或多个中间人(如样品收集服务提供者或医疗提供者(例如，医师或护士))间接提供。在一些实施方案中，从外周血白细胞分离T细胞可以包括裂解红细胞，并且通过例如离心(通过例如PERCOLTM梯度)从单核细胞中分离外周血白细胞。
可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，如CD4+或CD8+T细胞。例如，可以用针对阴性选择的细胞所特有的表面标记的抗体组合来完成T细胞群的阴性选择。一种合适的技术包括经由负磁免疫粘附的细胞分选，其利用针对在阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物。例如，为了分离CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD1 lb、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。负选择过程可以用于产生所需的T细胞群，所述T细胞群主要是同质的。在一些实施方案中，组合物包含两个或更多个(例如2个、3个、4个、5个或更多个)不同种类的T细胞的混合物。
在一些实施方案中，免疫细胞是富集细胞群的成员。可以通过任何合适的方法富集一种或多种所需的细胞类型，所述方法的非限制性例子包括处理细胞群以触发扩增和/或分化成所需的细胞类型、处理以停止不希望的一种或多种细胞类型的生长、处理以杀伤或裂解不希望的一种或多种细胞类型、纯化所需的细胞类型(例如在亲和柱上纯化以基于一种或多种细胞表面标记保留所需或不希望的细胞类型)。在一些实施方案中，富集细胞群是富集选自以下的细胞毒性淋巴细胞的细胞群：细胞毒性T细胞(也不同地称为细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞和杀伤T细胞)、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。
为了通过阳性或阴性选择分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒如珠)的浓度。在某些实施方案中，可能希望显著降低珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，可以使用20亿个细胞/mL的浓度。在一些实施方案中，使用10亿个细胞/mL的浓度。在一些实施方案中，使用大于1亿个细胞/mL。可以使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又另一个实施方案中，可以使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在另外的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量、细胞激活和细胞扩增增加。
使用本公开文本的系统和方法可以杀伤多种靶细胞。可以应用此方法的靶细胞包括各种细胞类型。靶细胞可以在体外。靶细胞可以在体内。靶细胞可以是离体的。靶细胞可以是分离的细胞。靶细胞可以是生物体内的细胞。靶细胞可以是生物体。靶细胞可以是细胞培养物中的细胞。靶细胞可以是细胞集合中的一个细胞。靶细胞可以是哺乳动物细胞或源自哺乳动物细胞。靶细胞可以是啮齿动物细胞或源自啮齿动物细胞。靶细胞可以是人细胞或源自人细胞。靶细胞可以是原核细胞或源自原核细胞。靶细胞可以是细菌细胞或可以源自细菌细胞。靶细胞可以是古细菌细胞或源自古细菌细胞。靶细胞可以是真核细胞或源自真核细胞。靶细胞可以是多能干细胞。靶细胞可以是植物细胞或源自植物细胞。靶细胞可以是动物细胞或源自动物细胞。靶细胞可以是无脊椎动物细胞或源自无脊椎动物细胞。靶细胞可以是脊椎动物细胞或源自脊椎动物细胞。靶细胞可以是微生物细胞或源自微生物细胞。靶细胞可以是真菌细胞或源自真菌细胞。靶细胞可以来自特定的器官或组织。
靶细胞可以是干细胞或祖细胞。靶细胞可以包括干细胞(例如，成年干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干(iPS)细胞)和祖细胞(例如，心脏祖细胞、神经祖细胞等)。靶细胞可以包括哺乳动物干细胞和祖细胞，包括啮齿动物干细胞、啮齿动物祖细胞、人干细胞、人祖细胞等。克隆细胞可以包含细胞的后代。靶细胞可以包含靶核酸。靶细胞可以是在活的生物体中。靶细胞可以是基因修饰的细胞。靶细胞可以是宿主细胞。
靶细胞可以是原代细胞。例如，可以将原代细胞的培养物传代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多次。细胞可以是单细胞生物体。细胞可以在培养中生长。
靶细胞可以是患病细胞。患病细胞可能具有改变的代谢、基因表达和/或形态特征。患病细胞可以是癌细胞、糖尿病细胞和凋亡细胞。患病细胞可以是来自患病受试者的细胞。示例性疾病可以包括血液障碍、癌症、代谢障碍、眼睛障碍、器官障碍、肌肉骨骼障碍、心脏病等。
如果靶细胞是原代细胞，则它们可以通过任何方法从个体中收获。例如，白细胞可以通过单采术、白细胞单采术、密度梯度分离等来收获。可以通过活检来收获来自组织(如皮肤、肌肉、骨髓、脾脏、肝、胰腺、肺、肠、胃等)的细胞。可以使用适当的溶液来分散或悬浮所收获的细胞。这样的溶液通常可以是方便地补充有胎牛血清或其他天然存在的因子的平衡盐溶液(例如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克氏(Hank’s)平衡盐溶液等)、以及低浓度的可接受缓冲液。缓冲液可以包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。细胞可以立即使用，或者可以将它们储存(例如，通过冷冻)。可以将冷冻的细胞解冻，并且它们能够重复使用。可以将细胞冷冻在DMSO、血清、培养基缓冲液(例如，10％DMSO、50％血清、40％缓冲培养基)和/或用于在冷冻温度下保存细胞的一些其他此类普通溶液中。
可以作为靶细胞的细胞的非限制性例子包括但不限于淋巴样细胞，如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞(参见例如US 20080241194)；骨髓细胞，如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/多分叶核嗜中性粒细胞(Hypersegmented neutrophil))、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、凝血细胞/巨核细胞、树突细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体(松果体细胞)细胞；神经系统的细胞，包括胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞(Boettchercell)和垂体(促性腺激素细胞(Gonadotrope)、促肾上腺皮质激素细胞(Corticotrope)、促甲状腺激素细胞(Thyrotrope)、促生长激素细胞(Somatotrope)、催乳激素细胞(Lactotroph))；呼吸系统的细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、噬尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、周细胞；消化系统的细胞，包括胃(胃主细胞、壁细胞)、杯状细胞、潘氏细胞(Paneth cell)、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝(肝细胞、枯否细胞(Kupffer cell))、软骨/骨骼/肌肉；骨骼细胞，包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿(成牙骨质细胞、造釉细胞)；软骨细胞(cartilage cell)，包括成软骨细胞、软骨细胞(Chondrocyte)；皮肤细胞，包括毛细胞(Trichocyte)、角化细胞、黑色素细胞(痣细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足细胞、近肾小球细胞、肾小球内系膜细胞/肾小球外系膜细胞、肾近端肾小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞，包括精子、塞尔托利氏细胞、莱氏细胞、卵子；以及其他细胞，包括脂肪细胞、成纤维细胞、腱细胞、表皮角化细胞(分化表皮细胞)、表皮基底细胞(干细胞)、指甲和脚趾甲的角化细胞、甲床基底细胞(干细胞)、髓质毛干细胞、皮质毛干细胞、表皮毛干细胞、表皮毛根鞘细胞、赫胥黎氏层的毛根鞘细胞、亨勒层的毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞(干细胞)、湿复层屏障上皮细胞，角膜、舌头、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的复层鳞状上皮的表面上皮细胞，角膜、舌头、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的上皮的基底细胞(干细胞)，泌尿上皮细胞(内衬膀胱和尿管)、外分泌分泌上皮细胞、唾液腺粘液细胞(富多糖分泌)、唾液腺浆液细胞(富糖蛋白酶分泌)、舌头中的冯·艾伯纳氏(Von Ebner's)腺细胞(洗涤味蕾)、乳腺细胞(乳汁分泌)、泪腺细胞(泪液分泌)、耳朵中的耵聍腺细胞(蜡分泌)、外泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)、外泌汗腺亮细胞(小分子分泌)、顶泌汗腺细胞(气味分泌、性激素敏感)、眼睑中的莫耳腺(Gland of Moll)细胞(专门汗腺)、皮脂腺细胞(富脂质皮脂分泌)、鼻子中的鲍曼氏腺细胞(洗涤嗅上皮)、十二指肠中的布伦纳氏腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊细胞(分泌精液组分，包括用于精子游泳的果糖)、前列腺细胞(分泌精液组分)、尿道球腺细胞(粘液分泌)、巴多林氏腺细胞(阴道润滑剂分泌)、利特雷腺细胞(粘液分泌)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)、呼吸道和消化道的分离的杯状细胞(粘液分泌)、胃壁粘膜细胞(粘液分泌)、胃腺酶原细胞(胃蛋白酶原分泌)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)、小肠的潘氏细胞(溶菌酶分泌)、肺的II型肺细胞(表面活性剂分泌)、肺的克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、促生长激素细胞、催乳素细胞(Lactotrope)、促甲状腺激素细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠道和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸的莱氏细胞、卵泡的卵泡内膜细胞、破裂卵泡的黄体细胞、颗粒黄体素细胞、黄体膜细胞、近肾小球细胞(肾素分泌)、肾的致密斑细胞、代谢和贮藏细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾、I型肺细胞(肺的内衬气室)、胰腺管细胞(泡心细胞)、无横纹管细胞(汗腺、唾液腺、乳腺等的)、导管细胞(精囊、前列腺等的)、上皮细胞内衬封闭的内部体腔、具有推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞(Erythrocyte/red blood cell)、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞(骨骼中)、树突细胞(淋巴组织中)、小胶质细胞(中枢神经系统中)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞，血液和免疫系统的自然杀伤细胞、网织红细胞、干细胞和定向祖细胞(各种类型)，多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成年干细胞、感官传感器细胞、自主神经元细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑色素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵原细胞/卵母细胞、精子细胞、精母细胞、精原细胞(精母细胞的干细胞)、精子、营养细胞、卵泡细胞、塞尔托利氏细胞(睾丸中)、胸腺上皮细胞、间质细胞和间质肾细胞。
特别感兴趣的是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。癌细胞的非限制性例子包括如下癌症的细胞：包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、肢端汗腺瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性成巨核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性粒细胞白血病伴成熟、急性骨髓性树突细胞白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺瘤样齿源性瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、未分化甲状腺癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管平滑肌脂肪瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、贝里尼导管癌(Bellini duct carcinoma)、胆道癌、膀胱癌、胚细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、布伦纳瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发部位不明癌(Cancer of Unknown Primary Site)、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发灶不明癌(Carcinoma of Unknown Primary Site)、癌肉瘤、卡斯尔曼病(Castleman's Disease)、中枢神经系统胚胎瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、肝胆管型肝癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索癌、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性单核细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性嗜中性粒细胞白血病、透明细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、德戈斯病(Degos disease)、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、胚胎性癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关T细胞淋巴瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、鼻腔胶质瘤、尤文家族肿瘤、尤文家族肉瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、乳腺外佩吉特病、输卵管癌、寄生胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡状甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、胚组织瘤、妊娠绒毛膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、骨巨细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、胶质瘤、脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、性腺胚细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌症、成血管细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管内皮瘤、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、肝脾型T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型骨髓单核细胞性白血病、卡波西肉瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、Klatskin瘤、库肯勃瘤(Krukenberg tumor)、喉癌、喉癌、雀斑样痣恶性黑色素瘤、白血病、白血病、嘴唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性周围神经鞘膜瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性蝾螈瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵隔生殖细胞瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、成神经管细胞瘤、成神经管细胞瘤、髓质上皮瘤、黑色素瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、转移性鳞状颈癌伴隐匿性原发灶、转移性尿路上皮癌、苗勒型混合瘤(Mixed Mullerian tumor)、单核细胞性白血病、口腔癌、粘液性肿瘤、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、蕈样真菌病、霉菌病、骨髓增生异常病、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、骨髓性肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、赘生物、神经鞘瘤、成神经细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼部肿瘤、少突星形细胞瘤、少突胶质瘤、大嗜酸粒细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳房佩吉特氏病、肺上沟瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中间分化的松果体实质肿瘤、松果体母细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘生物、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T成淋巴细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层肿瘤、前列腺癌、腹膜假粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及第15号染色体上的NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、里希特氏转化(Richter's transformation)、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性赘生物、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、塞尔托利-莱氏细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、性索间质瘤、塞扎里综合征、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆形细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓肿瘤、脊柱肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩散性黑色素瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、表面上皮间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞前淋巴细胞性白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖器赘生物、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、弗纳-莫里森综合征(Verner Morrison syndrome)、疣状癌、视通道胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、沃辛氏瘤(Warthin's tumor)、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、及其组合。在一些实施方案中，靶向的癌细胞代表癌细胞群(如癌症干细胞)内的亚群。在一些实施方案中，癌症是造血谱系的，如淋巴瘤。抗原可以是肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，靶细胞形成肿瘤。用本文的方法治疗的肿瘤可以导致稳定的肿瘤生长(例如，一个或多个肿瘤的尺寸增加不超过1％、5％、10％、15％或20％，和/或不转移)。在一些实施方案中，使肿瘤稳定持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周。在一些实施方案中，使肿瘤稳定持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月。在一些实施方案中，使肿瘤稳定持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在一些实施方案中，使肿瘤尺寸或肿瘤细胞数减少至少约5％、10％、15％、20％、25、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，肿瘤被完全消除，或被减少到检测水平以下。在一些实施方案中，受试者在治疗后保持无肿瘤(例如缓解)持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周。在一些实施方案中，受试者在治疗后保持无肿瘤持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月。在一些实施方案中，受试者在治疗之后保持无肿瘤持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。
可以通过任何合适的方法确定靶细胞的死亡，所述方法包括但不限于在治疗之前和之后对细胞计数或测量与活细胞或死细胞(例如活靶细胞或死靶细胞)相关的标记的水平。可以通过任何合适的方法确定细胞死亡的程度。在一些实施方案中，关于起始条件确定细胞死亡的程度。例如，个体可以具有靶细胞的已知起始量，如已知尺寸的起始细胞团或已知浓度的循环靶细胞。在此类情况下，细胞死亡的程度可以表示为治疗之后的存活细胞与起始细胞群的比率。在一些实施方案中，可以通过合适的细胞死亡测定来确定细胞死亡的程度。多种细胞死亡测定是可用的，并且可以利用多种检测方法。检测方法的例子包括但不限于使用细胞染色、显微镜检查、流式细胞术、细胞分选、以及这些的组合。
当在治疗期结束后对肿瘤进行手术切除时，可以通过测量坏死(即，死亡)的切除组织的百分比来确定治疗在减小肿瘤尺寸方面的功效。在一些实施方案中，如果切除组织的坏死百分比为大于约20％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)，则治疗是治疗有效的。在一些实施方案中，切除组织的坏死百分比为100％，即不存在或不可检测到活的肿瘤组织。
将靶细胞暴露于本文公开的免疫细胞或免疫细胞群可以在体外或在体内进行。将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群通常是指使靶细胞与免疫细胞接触和/或足够接近以使靶细胞的抗原(例如，膜结合的或非膜结合的)可以与免疫细胞中表达的开关分子结合。将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群通常也可以是指使靶细胞与免疫细胞接触和/或足够接近以使靶细胞的抗原(例如，膜结合的或非膜结合的)可以与免疫细胞中表达的CAR结合。通过将靶细胞和免疫细胞共培养可以完成在体外将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群。可以将靶细胞和免疫细胞例如作为粘附细胞或可替代地在悬浮液中共培养。可以将靶细胞和免疫细胞与例如补充剂、生长因子、离子等在各种合适类型的细胞培养基中共培养。在一些情况下，可以通过将免疫细胞给予受试者(例如人类受试者)并允许免疫细胞经由循环系统定位于靶细胞来完成在体内将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群。在一些情况下，可以例如通过直接注射将免疫细胞递送至靶细胞所定位的附近区域。
暴露可以进行任何合适的时间长度，例如至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或更长时间。
本文提供的开关分子和CAR的各种结构域可以借助于以下进行连接：化学键，例如酰胺键或二硫键；小的有机分子(例如，烃链)；氨基酸序列，如肽接头(例如，长度为约3-200个氨基酸的氨基酸序列)；或小的有机分子和肽接头的组合。肽接头可以提供所需的柔性，以允许嵌合多肽的所需表达、活性和/或构象定位。肽接头可以具有任何适当的长度以连接至少两个感兴趣的结构域，并且优选地被设计为具有足够的柔性以便允许其连接的一个或两个结构域的适当折叠和/或功能和/或活性。肽接头可以具有至少3个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸的长度。在一些实施方案中，肽接头具有在约0个与200个之间的氨基酸、在约10个与190个之间的氨基酸、在约20个与180个之间的氨基酸、在约30个与170个之间的氨基酸、在约40个与160个之间的氨基酸、在约50个与150个之间的氨基酸、在约60个与140个之间的氨基酸、在约70个与130个之间的氨基酸、在约80个与120个之间的氨基酸、在约90个与110个之间的氨基酸的长度。在一些实施方案中，接头序列可以包含内源蛋白质序列。在一些实施方案中，接头序列包含甘氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，接头可以含有GS、GGS、GGGGS、GGSG或SGGG的基序，例如多个或重复基序。接头序列可以包括任何天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或其组合。
可以将任何合适的递送方法用于将本公开文本的组合物和分子(例如，多肽和/或编码多肽的核酸)引入宿主细胞(如免疫细胞)中。可以将各种组分同时递送或在时间上分开。方法的选择可能取决于待转化的细胞的类型和发生转化的环境(例如，体外、离体或体内)。
递送方法可能涉及接触靶多核苷酸或将包含编码本公开文本的组合物的核苷酸序列的一种或多种核酸引入细胞(或细胞(如免疫细胞)群)中。包含编码本公开文本的组合物的核苷酸序列的合适核酸可以包括表达载体，其中包含编码本公开文本的一种或多种组合物的核苷酸序列的表达载体是重组表达载体。
递送方法或转化的非限制性例子包括例如病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射和纳米颗粒介导的核酸递送。
在一些方面，本公开文本提供了方法，所述方法包括将一种或多种多核苷酸或如本文所述的一种或多种载体或其一种或多种转录物和/或从其转录的一种或多种蛋白质递送至宿主细胞。在一些方面，本公开文本进一步提供了通过此类方法产生的细胞，以及包含此类细胞或由此类细胞产生的生物体(如动物、植物或真菌)。
可以将常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法用于将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。可以将此类方法用于将编码本公开文本的组合物的核酸给予培养中或宿主生物体中的细胞。非病毒载体递送系统可以包括DNA质粒、RNA(例如本文所述的载体的转录物)、裸核酸和与递送媒介物(如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其可以在递送至细胞之后具有游离型或整合的基因组。
核酸的非病毒递送方法可以包括脂转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子和DNA的药剂增强摄取。可以使用适合用于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质。递送可以是至细胞(例如体外或离体给予)或靶组织(例如体内给予)。可以使用脂质:核酸复合物的制剂，包括靶向脂质体，如免疫脂质复合物。
可以将基于RNA或DNA病毒的系统用于靶向体内的特定细胞，并且将病毒有效载荷运输到细胞核。可以直接(体内)给予病毒载体，或者可以将它们用于体外处理细胞，并且可以任选地(离体)给予经修饰的细胞。基于病毒的系统可以包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体，用于基因转移。可以在使用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法的情况下发生在宿主基因组中整合，这可能导致所插入转基因的长期表达。可以在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
逆转录病毒的向性可以通过掺入外来包膜蛋白来改变，从而扩大靶细胞的潜在靶群体。慢病毒载体是可以转导或感染非分裂细胞并产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择可能取决于靶组织。逆转录病毒载体可以包含顺式作用长末端重复序列，其具有对多达6-10kb的外来序列的包装能力。最小顺式作用LTR对载体的复制和包装而言可能是足够的，可以将所述载体用于将治疗性基因整合至靶细胞中以提供持久的转基因表达。逆转录病毒载体可以包括基于以下的那些：鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合。
可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的系统可以导致转基因的瞬时表达。基于腺病毒的载体可以在细胞中具有高转导效率，并且可能不需要细胞分裂。可以使用基于腺病毒的载体来获得高滴度和表达水平。可以将腺相关病毒(“AAV”)载体用于例如在核酸和肽的体外产生中用靶核酸转导细胞，以及用于体内和离体基因疗法程序。
可以将包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。此类细胞可以包括293细胞(例如，用于包装腺病毒)、以及Psi2细胞或PA317细胞(例如，用于包装逆转录病毒)。病毒载体可以通过产生将核酸载体包装到病毒颗粒中的细胞系来产生。载体可以含有包装和随后整合到宿主中所需的最小病毒序列。载体可以含有待被待表达的一种或多种多核苷酸的表达盒替代的其他病毒序列。失去的病毒功能可以由包装细胞系反式供应。例如，AAV载体可以包含包装和整合到宿主基因组中所需的来自AAV基因组的ITR序列。可以将病毒DNA包装于细胞系中，所述细胞系可以含有编码其他AAV基因(即，rep和cap)而缺少ITR序列的辅助质粒。细胞系还可以被作为辅助者的腺病毒感染。辅助病毒可以促进AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因的表达。腺病毒的污染可以通过例如热处理来减少，腺病毒对所述热处理比AAV更敏感。可以使用用于将核酸递送至细胞的另外方法，例如如US 20030087817(通过引用并入本文)中所述。
可以将宿主细胞用本文所述的一种或多种载体瞬时或非瞬时地转染。细胞由于其天然存在于受试者内而可以被转染。细胞可以取自或源自受试者并被转染。细胞可以源自从受试者取得的细胞，如细胞系。在一些实施方案中，将用本文所述的一种或多种载体转染的细胞用于建立包含一个或多个载体衍生序列的新细胞系。在一些实施方案中，将用本公开文本的组合物瞬时转染(例如通过一种或多种载体的瞬时转染，或用RNA的转染)的细胞用于建立新细胞系，所述新细胞系包含含有修饰但缺少任何其他外源序列的细胞。
可以将与宿主细胞相容的任何合适的载体与本公开文本的方法一起使用。用于真核宿主细胞的载体的非限制性例子包括pXT1、pSG5(StratageneTM)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(PharmaciaTM)。
使细胞与的组合物接触可以在任何培养基中和在促进细胞存活的任何培养条件下发生。例如，可以将细胞悬浮于任何适当的方便的营养培养基中，如伊斯科夫(Iscove's)改良的DMEM或RPMI 1640，其补充有胎牛血清或热灭活的山羊血清(约5％-10％)、L-谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)和抗生素(例如青霉素和链霉素)。培养物可以含有细胞对其有反应的生长因子。如本文所定义，生长因子是能够通过对跨膜受体的特异性作用而在培养中或在完整组织中促进细胞存活、生长和/或分化的分子。生长因子可以包括多肽和非多肽因子。
在许多实施方案中，所选的递送系统被靶向特定的组织或细胞类型。在一些情况下，通过将递送系统与组织或细胞特异性标记(如细胞表面蛋白)结合来实现递送系统的组织或细胞靶向。可以定制病毒和非病毒递送系统，以靶向感兴趣的组织或细胞类型。
可以给予含有本文所述的分子(例如，多肽和/或编码多肽的核酸)或免疫细胞的药物组合物，用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，可以将组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病或病症的症状或者足以治愈、痊愈、改进或改善所述病症的量给予已经患有疾病或病症的受试者。对此用途有效的量可以根据疾病或病症的严重程度和病程、既往疗法、受试者的健康状态、体重和对药物的反应、以及治疗医师的判断而变化。
能以任何顺序给予或同时给予多种治疗剂。如果同时的话，则能以单一的统一形式或以多种形式(例如，作为多个分开的药丸)提供多种治疗剂。可以将分子一起或分开包装在单个包装或多个包装中。可以将一种或所有治疗剂以多个剂量给予。如果不同时的话，则多个剂量之间的时间安排可以变化至长达约一个月。
可以在疾病或病症发生之前、期间或之后给予本文所述的分子，并且给予含有化合物的组合物的时间安排可以变化。例如，可以将药物组合物用作预防剂，并且可以连续地给予有病症或疾病倾向的受试者，以便防止所述疾病或病症的发生。可以在症状发作期间或在症状发作之后尽快将分子和药物组合物给予受试者。可以在症状发作的前48小时内、在症状发作的前24小时内、在症状发作的前6小时内或在症状发作的3小时内开始分子的给予。初始给予可以是经由任何可行的途径，例如使用本文所述的任何配制品通过本文所述的任何途径。在检测到或怀疑疾病或病症发作之后，只要是可行的就可以给予分子，并且持续治疗疾病所需的时间长度，例如像从约1个月至约3个月。对于每名受试者，治疗的长度可以变化。
可以将分子包装到生物隔室中。可以将包含分子的生物隔室给予受试者。生物隔室可以包括但不限于病毒(慢病毒、腺病毒)、纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、微粒、纳米胶囊、囊泡、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。
例如，生物隔室可以包含脂质体。脂质体可以是包含一个或多个脂质双层的自组装结构，每个脂质双层可以包含含有相反取向的两亲性脂质分子的两个单层。两亲性脂质可以包含共价连接至一条或两条或更多条非极性(疏水性)酰基或烷基链的极性(亲水性)头基。疏水性酰基链与周围的水性介质之间在能量上不利的接触诱导两亲性脂质分子自行排列，使得极性头基可以朝双层表面取向，并且酰基链朝双层内部取向，从而有效地防止酰基链与水性环境接触。
在脂质体中使用的优选两亲性化合物的例子可以包括磷酸甘油酯和鞘脂，其代表性例子包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二亚油酰磷脂酰胆碱和卵鞘磷脂或其任何组合。
生物隔室可以包含纳米颗粒。纳米颗粒可以包含从约40纳米至约1.5微米、从约50纳米至约1.2微米、从约60纳米至约1微米、从约70纳米至约800纳米、从约80纳米至约600纳米、从约90纳米至约400纳米、从约100纳米至约200纳米的直径。
在一些情形中，随着纳米颗粒的尺寸增加，释放速率可以减慢或延长，并且随着纳米颗粒的尺寸减小，释放速率可以增加。
纳米颗粒中白蛋白的量的范围可以从约5％至约85％白蛋白(v/v)、从约10％至约80％、从约15％至约80％、从约20％至约70％白蛋白(v/v)、从约25％至约60％、从约30％至约50％或从约35％至约40％。药物组合物可以包含多达30％、40％、50％、60％、70％或80％或更多的纳米颗粒。在一些情形中，本公开文本的核酸分子可以结合至纳米颗粒的表面。
生物隔室可以包含病毒。病毒可以是用于本公开文本的药物组合物的递送系统。示例性病毒可以包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒I或II、细小病毒、网状内皮增生症病毒和腺相关病毒(AAV)。可以使用病毒将本公开文本的药物组合物递送至细胞。病毒可以在体内、离体或在体外感染和转导细胞。在离体和体外递送中，可以将转导的细胞给予需要疗法的受试者。
可以将药物组合物包装到病毒递送系统中。例如，可以通过无HSV-1辅助病毒的包装系统将组合物包装到病毒粒子中。
可以通过直接注射、立体定向注射、脑室内地，通过微型泵输注系统，通过对流、导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和/或皮下注射将病毒递送系统(例如，包含本公开文本的药物组合物的病毒)给予有需要的受试者的细胞、组织或器官。在一些情形中，可以用病毒递送系统在体外或离体转导细胞。可以将转导的细胞给予患有疾病的受试者。例如，可以用包含药物组合物的病毒递送系统转导干细胞，并且可以将干细胞植入患者体内以治疗疾病。在一些情形中，向受试者给予的转导细胞的剂量可以是在一个单一剂量中约1×105个细胞/kg、约5×105个细胞/kg、约1×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg、约1×107个细胞/kg、约5×107个细胞/kg、约1×108个细胞/kg或更多。
将生物隔室引入细胞中可以通过以下进行：病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
在一些实施方案中，给予表达主题系统的免疫细胞。可以在疾病或病症发生之前、期间或之后给予表达主题系统的免疫细胞，并且给予免疫细胞的时间安排可以变化。例如，可以将表达主题系统的免疫细胞用作预防剂，并且可以连续地给予有病症或疾病倾向的受试者，以便防止所述疾病或病症的发生。可以在症状发作期间或在症状发作之后尽快将免疫细胞给予受试者。可以在症状发作的前48小时内、在症状发作的前24小时内、在症状发作的前6小时内或在症状发作的3小时内开始给予。初始给予可以是经由任何合适的途径，例如使用本文所述的任何配制品通过本文所述的任何途径。在检测到或怀疑疾病或病症发作之后，只要是可行的就可以给予免疫细胞，并且持续治疗疾病所需的时间长度，例如像从约1个月至约3个月。对于每名受试者，治疗的长度可以变化。
本文所述的分子(例如，多肽和/或核酸)能以如下的范围存在于组合物中：从约1mg至约2000mg、从约5mg至约1000mg、从约10mg至约25mg至500mg、从约50mg至约250mg、从约100mg至约200mg、从约1mg至约50mg、从约50mg至约100mg、从约100mg至约150mg、从约150mg至约200mg、从约200mg至约250mg、从约250mg至约300mg、从约300mg至约350mg、从约350mg至约400mg、从约400mg至约450mg、从约450mg至约500mg、从约500mg至约550mg、从约550mg至约600mg、从约600mg至约650mg、从约650mg至约700mg、从约700mg至约750mg、从约750mg至约800mg、从约800mg至约850mg、从约850mg至约900mg、从约900mg至约950mg或从约950mg至约1000mg。
本文所述的分子(例如，多肽和/或核酸)能以如下的量存在于组合物中：约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1150mg、约1200mg、约1250mg、约1300mg、约1350mg、约1400mg、约1450mg、约1500mg、约1550mg、约1600mg、约1650mg、约1700mg、约1750mg、约1800mg、约1850mg、约1900mg、约1950mg或约2000mg。
本文所述的分子(例如，多肽和/或核酸)可以存在于组合物中，所述组合物提供至少0.1个、0.5个、1个、1.5个、2个、2.5个、3个、3.5个、4个、4.5个、5个、5.5个、6个、6.5个、10个或更多单位的活性/mg分子。活性可以是基因表达的调节。在一些实施方案中，递送至受试者的分子的活性单位总数是至少25,000个、30,000个、35,000个、40,000个、45,000个、50,000个、60,000个、70,000个、80,000个、90,000个、110,000个、120,000个、130,000个、140,000个、150,000个、160,000个、170,000个、180,000个、190,000个、200,000个、210,000个、220,000个、230,000个或250,000个或更多单位。在一些实施方案中，递送至受试者的分子的活性单位总数是至多25,000个、30,000个、35,000个、40,000个、45,000个、50,000个、60,000个、70,000个、80,000个、90,000个、110,000个、120,000个、130,000个、140,000个、150,000个、160,000个、170,000个、180,000个、190,000个、200,000个、210,000个、220,000个、230,000个或250,000个或更多单位。
实施例
通过以下非限制性实施例来进一步阐明本公开文本的各个方面。
实施例1：制备靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞
来自单采术的肿瘤细胞呈NY-ESO-1阳性，并且患者具有HLA-A:0201白细胞。用Ficoll淋巴细胞分离法来分离外周血单核细胞(PBMC)。在贴壁培养两个小时之后取出T细胞。按感染复数(MOI)为1添加NY-ESO-1TCR慢病毒。然后培养并扩增T细胞。通过流式细胞术确定TCR表达。在图1中，左图示出了在T细胞中的TCR表达，并且右图示出了在转导的T细胞中的表达。图1中的直方图表明，转导NY-ESO-1TCR基因的T细胞中的TCR表达更高。
实施例2：制备三阳性T细胞
从患者中取出10g或更多的量的肿瘤组织。经由酶促消化来分离细胞。用CD3磁珠分离CD3阳性T细胞。使其他细胞在贴壁培养中生长以提供来自患者的肿瘤细胞。然后用磁珠分离T细胞。经由流式细胞术分选出PD-1、CD137和TIM-3三阳性T细胞，并且将其进一步培养和扩增。
实施例3：制备新抗原反应性T细胞
图2中展示了制备。对来自手术的PBMC或肿瘤组织进行全外显子组测序或RNA转录组测序。鉴于患者的HLA分型，然后根据亲和力预测选择20个突变。合成编码新抗原的基因并将其转录成RNA。分离PBMC，并且对其贴壁培养2小时。收集粘附单核细胞。添加细胞因子以促进树突细胞分化和成熟。经由电穿孔将RNA转染到树突细胞中。悬浮细胞主要作为T细胞获得，然后将其与树突细胞一起培养。然后分离CD137+阳性细胞以提供新抗原反应性(例如，可识别的)T细胞(“neoT”)。然后，扩增neoT。
实施例4：制备用于PD1/CD28开关分子(PD1sw，SEQ ID NO.:2)的慢病毒
使用第四代慢病毒载体系统。用磷酸钙或脂质体-PEI将PD1/CD28载体、包装载体pMDL-gag、Rev和包膜载体pMD2.G共转染到HEK293T细胞中。48小时之后收集上清液，并且将其离心以浓缩慢病毒。
慢病毒滴定以三倍系列稀释进行。用50ul慢病毒转导48至72小时之后收集HEK293T细胞，然后将其用PD-1染色。通过流式细胞术分析PD-1+的百分比(PD-1+％)，并且滴定计算为：
滴定(TU/ml)＝40000-45000(其是起始HEK293T细胞数)*PD1+％*稀释倍数*20(第一PD1+％<20％)
图3A和3B示出了PD1/CD28慢病毒滴定的计算。滴定超过3*107即可用于进一步使用。
实施例5：将PD1/CD28转导至新抗原反应性T细胞中
获得三种类型的T细胞：开关-NY-ESO-1-TCR-T、开关-TIL和开关-neoT。通过在来自实施例1的ESO-1-TCR-T细胞中表达开关分子获得开关-NY-ESO-1-TCR-T细胞。通过在来自实施例2的三阳性T细胞中表达开关分子获得开关-TIL细胞。通过在来自实施例3的neoT细胞中表达开关分子获得开关-neoT细胞。流式细胞术显示，对于所有三种类型的T细胞，开关分子的表达率均为约60％。参见图4。
实施例6：表达PD1/CD28开关分子的靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞的体外测定
HLA分型为A:0201，构建了J82-NY-ESO-1-PD-L1肿瘤细胞。将慢病毒载体以MOI＝5添加到J82(膀胱，移行细胞癌)中，以转导PD-L1和NY-ESO-1转基因。72小时之后添加G418和嘌呤霉素以筛选阳性细胞。在约两周之后进行流式细胞术以确定PD-L1和NY-ESO-1的表达(图5)。如图5所示，超过95％的转导的J82细胞同时表达PDL1和NY-ESO-1，证实了细胞构建的成功。
图6A-6C示出了其中J82或J82-NY-ESO1-PDL1膀胱癌细胞与T细胞、NY-ESO1-TCR T细胞或开关-NY-ESO1-TCR T细胞接触的体外细胞杀伤测定的数据。T细胞、NY-ESO1-TCR T细胞或开关-NY-ESO1-TCR T细胞通过CD8和CD107a的表达进行门控。通常在T细胞颗粒内部发现的脱粒标记CD107a(也称为LAMP-1)的表面定位是溶细胞活性的标志，因为T细胞从颗粒中释放穿孔素和颗粒酶以杀伤靶细胞。如图6A所示，数据表明与NY-ESO1-TCR T细胞相比，开关-NY-ESO1-TCR T细胞具有更大的细胞杀伤能力。图6B和6C显示，暴露于J82膀胱癌细胞不诱导T细胞、NY-ESO1-TCRT细胞或开关-NY-ESO1-TCRT细胞中IFN-γ和IL-2的分泌。另一方面，暴露于J82-NY-ESO1-PDL1膀胱癌细胞诱导NY-ESO1-TCR T细胞和开关-NY-ESO1-TCRT细胞中IFN-γ和IL-2的分泌，并且开关-NY-ESO1-TCR T细胞中IFN-γ和IL-2的分泌水平较高。
实施例7：表达PD1/CD28分子的TIL的体外功效测定
图7A-7B示出了当与肿瘤细胞一起培养时，TIL(和表达PD1/CD28开关分子的TIL(开关-TIL))中IFN-γ和IL-2的释放。数据显示，与没有PD1/Cd28开关分子的TIL细胞相比，在表达PD1/CD28开关分子的开关-TIL细胞中暴露于肿瘤细胞诱导的IFN-γ和IL-2分泌更高。
实施例8：表达PD1/CD28开关分子的neoT的体外测定
图8A-8B示出了当与肿瘤细胞一起培养时，新抗原反应性T细胞(neoT)和表达PD1/CD28开关分子的neoT细胞(开关-neoT)中IFN-γ和IL-2的释放。数据显示，与没有PD1/CD28开关分子的neoT细胞相比，在表达PD1/CD28开关分子的开关-neoT细胞中暴露于肿瘤细胞诱导的IFN-γ和IL-2分泌更高。
实施例9：对表达PD1/CD28开关的NY-ESO-1TCR-T细胞的动物研究
将1*106个肿瘤细胞(J82-NY-ESO-1-PD-L1)皮下接种到NSG小鼠中。预期约两周之后发展出肿瘤。在第23周测量肿瘤尺寸，并且使用30只小鼠。
对照组的小鼠用PBS皮下注射治疗(A0)。有5个治疗组：非治疗组PBS(A1)、T细胞(A2)、开关-T细胞(A3)、NY-ESO-1TCR-T细胞组(A4)和开关-NY-ESO-1TCRT组(A5)。通过将1*107个细胞静脉内注射到尾静脉中来给予细胞。
每2-3天测量一次肿瘤尺寸持续30天，并且观察小鼠的总体状态。根据下式确定肿瘤尺寸
肿瘤尺寸＝1/2*长直径*短直径*短直径。
预期实验证明与组A1-A3相比，组A5的肿瘤尺寸减小或者保持差不多恒定或至少增加速率有所减小。
分析治疗之后肿瘤部位的T细胞的量：在给予后第10天时从每个治疗组A3-A5中随机选择小鼠，并且分离肿瘤组织以提供TIL。进行流式细胞术以测量在肿瘤部位存在的T细胞的总量。预期使用开关-NY-ESO-1TCRT细胞治疗(A5)导致在肿瘤部位存在更多的T细胞。
实施例10：制备靶向B细胞表面蛋白的慢病毒CAR(BCAR)
选择CD19作为B-CAR靶标，并且使用包含如SEQ ID NO.:1所示序列的抗原结合结构域来构建B-CAR。使用第四代慢病毒载体系统。用磷酸钙或脂质体-PEI将CA19 CAR载体、包装载体pMDL-gag、Rev和包膜载体pMD2.G共转导至HEK293T细胞中。48小时之后收集上清液，并且将其超离心以浓缩慢病毒。
CD19慢病毒滴定以三倍系列稀释进行。用50ul慢病毒转导48至72小时之后收集293T细胞，然后将其针对CAR表达进行染色。经由流式细胞术分析CAR+的百分比(CAR+％)，并且滴定计算为：
滴定(TU/ml)＝(起始293T细胞数)*CAR+％*稀释倍数*20(第一CAR+％<20％)
计算慢病毒滴定。认为滴定超过3*107即可用于进一步使用。
实施例11：将BCAR转导至肿瘤可识别的T细胞中
通过用BCAR慢病毒(BCAR-NY-ESO-1-TCR-T、BCAR-TIL和BCAR-neoT)转导NY-ESO1-TCRT细胞、TIL和neoT，获得了三种类型的T细胞。流式细胞术显示，对于所有三种类型的T细胞，B-CAR的表达均为约60％。参见图9。分别扩增三种类型的T细胞。
实施例12：对表达BCAR的NY-ESO1TCR-T细胞的体外测定
为了确认BCAR在靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞中的功能，构建了具有HLA类型A:0201的J82-NY-ESO-1-Luc肿瘤细胞系。为了确认BCAR-NY ESO1-TCR-T细胞的双重靶向功能，将1*105个J82-NY-ESO-1-Luc细胞接种到24孔板中，并且培养过夜，从而允许贴壁。将细胞分成四个组：A、B、C和D，并且每个孔还含有5*104个B细胞。将组A与2*105个T细胞共培养。将组B与2*105个BCAR-T细胞(CAR阳性率为60％)共培养。将组C与2*105个NY-ESO1-TCR-T细胞共培养。将组D与2*105个BCAR-NY-ESO1-TCR-T细胞共培养。进行了以下测定：
T细胞的扩增。在培养48h和96h之后计数T细胞的数量。如图10所示，在培养4天之后，组A的T细胞扩增约3倍；组B的BCAR-T细胞扩增约12倍；组C的NY-ESO1-TCR-T细胞扩增约10倍；并且BCAR-NY-ESO1-TCR-T细胞扩增约27倍。
肿瘤细胞的生长。在48h和96h之后，从组A-D的培养物中去除上清液。然后将培养物用PBS冲洗3次。将粘附肿瘤细胞裂解，并且测量萤光素酶活性作为肿瘤细胞存活率的指示。参见图11。数据显示，在培养48h之后，相对于其他治疗，对于用BCAR-NY-ESO1-TCR-T细胞治疗，来自肿瘤细胞的蛋白质的平均量(因此存在的肿瘤细胞数)最低。
实施例13：对表达BCAR的TIL的体外测定
为了确认CD19 CAR(BCAR)在TIL中的功能，从人类受试者新鲜肿瘤组织中分离出肿瘤细胞并将其接种到24孔板中。将细胞培养过夜，从而允许贴壁。向孔中添加TIL和BCAR-TIL。将相同量的B细胞添加到孔中，并且进行以下测定：
T细胞的扩增。在与肿瘤细胞共培养96小时之后，TIL扩增约10倍，而BCAR-TIL扩增约25倍，如图12A所示。结果显示，与缺少BCAR的TIL相比，当与B细胞和肿瘤细胞共培养时，BCAR-TIL的扩增更多。
肿瘤细胞的生长。在96小时之后，从培养混合物中去除上清液。然后将培养物用PBS冲洗3次。将粘附肿瘤细胞裂解，并且测量萤光素酶活性作为肿瘤细胞存活的指示。将萤光素酶水平示于图12B中。数据显示，在培养96h之后，与当用缺少BCAR的TIL细胞治疗时相比，当用BCAR-TIL细胞治疗时来自肿瘤细胞的蛋白质的平均量(因此存在的肿瘤细胞数)更低。
实施例14：对表达BCAR的新抗原反应性T细胞的体外测定
为了确认CD19 CAR(例如，BCAR)在neoT细胞中的功能，从人类受试者新鲜肿瘤组织中分离出肿瘤细胞并将其接种到24孔板中。将细胞培养过夜，从而允许贴壁。向培养物中添加neoT和BCAR-neoT细胞。将相同量的B细胞添加到孔中，并且进行以下测定：
T细胞的扩增。在与肿瘤细胞共培养96小时之后，neoT细胞扩增约9倍，而BCAR-neoT细胞扩增约23倍，如图13A所示。结果显示，与缺少BCAR的neoT细胞相比，当与B细胞和肿瘤细胞共培养时，BCAR-neoT细胞的扩增更多。
肿瘤细胞的生长。在96小时之后，从培养混合物中去除上清液。然后将培养物用PBS冲洗3次。将粘附肿瘤细胞裂解，并且测量萤光素酶活性作为肿瘤细胞存活的指示。将萤光素酶水平示于图13B中。数据显示，在培养96h之后，与当用缺少BCAR的neoT细胞治疗时相比，当用BCAR-neoT细胞治疗时来自肿瘤细胞的蛋白质的平均量(因此存在的肿瘤细胞数)更低。
实施例15：对表达BCAR的NY-ESO-1TCR-T细胞的动物测试
动物模型：将1*106个肿瘤细胞(J82-NY-ESO-1)皮下注射到NSG小鼠中。作为空白对照，向组A0的动物皮下注射PBS。在注射肿瘤细胞后约两周，在动物体内形成肿瘤。在第23天测量肿瘤尺寸。选择30只小鼠。
给予：经由尾静脉向空白对照(A0)组动物注射PBS。将携带肿瘤的组分成6个组：PBS组(A1)；T细胞组(A2)；BCAR-T组(A3)；NY-ESO-1TCR-T组(A4)；BCAR&NY-ESO-1TCR T双重靶向T细胞组(A5)；和较高剂量的NY-ESO-1TCRT组(A6)。经由尾静脉向组A1-A5的动物输注1*104个T细胞；向组A6的动物输注1*107个T细胞。经由输注向所有组给予1*107个B细胞。
每2-3天测量一次小鼠的肿瘤尺寸和健康状态，持续给予后28天。肿瘤尺寸计算为：
肿瘤尺寸＝1/2*长直径*短直径*短直径
肿瘤负荷的变化
预期本实验证明组5的小鼠展现出在所有其他组中最小的肿瘤尺寸。
所输注的T细胞总量的变化
在给予后第10天，从组A2-A5的动物中提取外周血。通过流式细胞术测量CD3+T细胞的总数，预期证明在携带BCAR的组A3和A5中的T细胞数多于组A4的T细胞数。预期BCAR T细胞和双重靶向T细胞都在体内扩增。
实施例16：对表达BCAR的TIL的动物测试
动物模型：从新鲜肿瘤组织中分离出肿瘤细胞，并且以每只动物1*106个细胞的量将其皮下注射到NSG小鼠中。作为空白对照，向组A0的动物皮下注射PBS。在注射肿瘤细胞后约两周，在动物体内形成肿瘤。在第25天测量肿瘤尺寸。选择30只小鼠。
给予：经由尾静脉向空白对照(A0)组动物注射PBS。将携带肿瘤的组分成5个组：PBS组(A1)；T细胞组(A2)；BCAR-T组(A3)；TIL组(A4)；和BCAR TIL组(A5)。经由尾静脉向组A1-A5的动物输注1*104个T细胞，并且经由输注向所有组给予1*107个B细胞。
每2-3天测量一次小鼠的肿瘤尺寸和健康状态，持续给予后28天。肿瘤尺寸计算为：
肿瘤尺寸＝1/2*长直径*短直径*短直径。
肿瘤负荷的变化
预期本实验证明组5的小鼠展现出在所有其他组中最小的肿瘤尺寸。
所输注的T细胞总量的变化
在给予后第10天，从组A2-A5的动物中提取外周血。通过流式细胞术测量CD3+T细胞的总数，证明在携带BCAR的组A3和A5中的T细胞数多于组A4的T细胞数。这显示BCAR T细胞和双重靶向T细胞都在体内扩增。
实施例17：对表达BCAR的neoT的动物测试
动物模型：从新鲜肿瘤组织中分离出肿瘤细胞，并且以每只动物1*106个细胞的量将其皮下注射到NSG小鼠中。作为空白对照，向组A0的动物皮下注射PBS。在注射肿瘤细胞后约两周，在动物体内形成肿瘤。在第25天测量肿瘤尺寸。选择30只小鼠。
给予：经由尾静脉向空白对照(A0)组动物注射PBS。将携带肿瘤的组分成6个组：PBS组(A1)；T细胞组(A2)；BCAR-T组(A3)；普通neoT组(A4)；BCAR neoT组(A5)；和较高剂量的普通neoT细胞组(A6)。经由尾静脉向组A1-A5的动物输注1*104个T细胞，而经由尾静脉向组A6的那些动物输注1*107个T细胞，并且经由输注向所有组给予1*107个B细胞。
每2-3天测量一次小鼠的肿瘤尺寸和健康状态，持续给予后28天。肿瘤尺寸计算为：
肿瘤尺寸＝1/2*长直径*短直径*短直径
肿瘤负荷的变化
预期实验证明与对照A1、A2和/或A3组相比，组A4、A5和/或A6的肿瘤尺寸更小。
所输注的T细胞总量的变化
在给予后第10天，从组A2-A5的动物中提取外周血。通过流式细胞术测量CD3+T细胞的总数，预期表明在携带BCAR的组A3和A5中的T细胞数多于组A4的T细胞数。这显示BCART细胞和双重靶向T细胞都在体内扩增。
实施例18：制备用于三种开关分子的慢病毒载体
构建了三种开关分子PD1/CD28(下文称为PD1sw，SEQ ID NO.:2)、TIM3/CD28(下文称为PD1sw，SEQ ID NO.:2)和TGFBR2/CD28(下文称为TGFBR2sw，SEQ ID NO.:4)。将PD1、TIM3和TGFBR2的细胞外结构域用作每种开关分子的免疫抑制蛋白，而将CD28用作共刺激信号传导蛋白。
以PD1sw作为例子，使用了第四代慢病毒载体系统。用磷酸钙或脂质体-PEI将PD1/CD28载体、包装载体pMDL-gag、Rev和包膜载体pMD2.G共转染到HEK293T细胞中。48小时之后收集上清液，并且将其超离心以浓缩慢病毒。
用三倍系列稀释液确定PD1sw慢病毒滴度。用50ul慢病毒转导48至72小时之后收集HEK293T细胞，然后将其用PD-1染色。经由流式细胞术分析PD1+细胞的百分比(CAR+％)，并且滴度计算为：
滴度(TU/ml)＝(起始293T细胞数)*PD1+％*稀释倍数*20(第一PD1+％<20％)
计算慢病毒滴度。认为滴度超过3*107即可用于进一步使用。
用相似的方法制备TIM3sw和TGFBR2sw。
实施例19：制备装载有开关+BCAR的慢病毒载体
根据实施例18的方法，分别构建了用于PD1sw-2A-CD19 CAR(下文称为“PD1sw-BCAR”)、TIM3sw-2A-CD19 CAR(下文称为“TIM3sw-BCAR”)、TGFBR2sw-2A-CD19 CAR(“TGFBR2sw-BCAR”)的慢病毒载体。
实施例20：将用于开关和BCAR的载体转导至TIL和pTIL中
将实施例19的用于开关和BCAR的慢病毒及其组合转导至TIL和外周TIL(pTIL)中。产生了以下细胞：
(1)TIL
1.PD1sw-TIL(PD1sw慢病毒转导至TIL中)；
2.TIM3sw-TIL(TIM3sw慢病毒转导至TIL中)；
3.TGFBR2sw-TIL(TGFBR2sw慢病毒转导至TIL中)；
4.BCAR-TIL(CD19 CAR慢病毒转导至TIL中)；
5.PD1sw-BCAR-TIL(PD1sw-CD19 CAR慢病毒转导至TIL中以提供SuperTIL，下文称为“PD1-STIL”)；
6.TIM3sw-BCAR-TIL(TIM3sw-CD19 CAR慢病毒转导至TIL中以提供SuperTIL，下文称为“TIM3-STIL”)；
7.TGFBR2sw-BCAR-TIL(TGFBR2sw-CD19 CAR慢病毒转导至TIL中以提供SuperTIL，下文称为“TGFBR2-STIL”)；
8.将PD1-STIL、TIM3-STIL和TGFBR2-STIL SuperTIL混合在一起以给出“XSTIL”
(2)pTIL：
1.PD1sw-pTIL(PD1sw慢病毒转导至pTIL中)；
2.TIM3sw-pTIL(TIM3sw慢病毒转导至pTIL中)；
3.TGFBR2sw-pTIL(TGFBR2sw慢病毒转导至pTIL中)；
4.BCAR-pTIL(CD19 CAR慢病毒转导至pTIL中)；
5.PD1sw-BCAR-pTIL(PD1sw-CD19 CAR慢病毒转导至pTIL中以提供Super-pTIL，下文称为“PD1-SpTIL”)；
6.TIM3sw-BCAR-pTIL(TIM3sw-CD19 CAR慢病毒转导至pTIL中以提供Super-pTIL，下文称为“TIM3-SpTIL”)；
7.TGFBR2sw-BCAR-pTIL(TGFBR2sw-CD19 CAR慢病毒转导至pTIL中以提供Super-pTIL，下文称为“TGFBR2-SpTIL”)；
8.将PD1-SpTIL、TIM3-SpTIL和TGFBR2-SpTIL混合在一起以给出“XSpTIL”
可以理解，Super-pTIL也是SuperTIL。特别指出Super-pTIL，以便指定细胞的不同来源。
(1)制备PD1sw-TILs/pTIL：
基于PD1sw慢病毒滴度，将慢病毒以MOI＝5添加到TIL/pTIL中。进行流式细胞术测定以分选出PD1sw-TIL/pTIL以使PD1的表达率为约60％。
通过相似的方法制备TIM3sw-TIL/pTIL、TGFBR2sw-TIL/pTIL和BCAR-TIL/pTIL。
(2)制备PD1-STIL/SpTIL：
基于PD1sw-CD19 CAR慢病毒滴度，将慢病毒以MOI＝5添加到TIL/pTIL中。进行流式细胞术测定以分选出PD1+细胞，以提供PD1和CD19CAR的表达率为约30％的PD1-STIL/SpTIL(图14和15)。
用与PD1-STIL/SpTIL相似的方法制备TIM3-STIL/SpTIL和TGFBR-STIL/SpTIL。
(3)制备XSTIL/XsTIL
将PD1-STIL/SpTIL、TIM3-STIL/SpTIL和TGFBR-STIL/SpTIL按一定比率混合，它们中的每一种分别组成0-100％。在本实施例中，比率为1:1:1。
实施例21：对SuperTIL功效的体外测定
为了确认SuperTIL的功效，单独观察当不添加B细胞时和当添加B细胞时的功效。
(1)当不添加B细胞时肿瘤杀伤效果的比较。
从患者的新鲜肿瘤组织中分离出肿瘤细胞，并且将其与萤光素酶标记一起接种到24孔板中。将细胞培养过夜，从而允许贴壁。根据以下将细胞分成10个组并与对照或T细胞共培养：不添加T细胞-CK的对照组(组A1)；普通TIL(组A2)；BCAR-TIL(组A3)；PD1sw-TIL(组A4)；TIM3sw-TIL(组A5)；TGFBR2sw-TIL(组A6)；PD1-STIL(组A7)；TIM3-STIL(组A8)；TGFBR2-STIL(组A9)；和XSTIL(组A10)。进行以下测定：
1.T细胞的细胞因子分泌。在与肿瘤细胞共培养24小时之后，通过ELISA测量每个组的IFN-γ和IL-2分泌。如图16A和16B所示，在对照组A1中未观察到IFN-γ或IL-2分泌，而在所有其他组(组A2-A10)中均观察到IFN-γ或IL-2分泌。在所有组中，有开关的那些组(组A4-A10)展现出比没有开关的组(组A2和A3)更高的IFN-γ或IL-2分泌。
2.肿瘤细胞的生长。在48h和96h之后，从培养物中去除上清液。然后将培养物用PBS冲洗3次。将粘附肿瘤细胞裂解，并且测量萤光素酶活性，以确定作为肿瘤细胞存活率的指示的蛋白质量。如图17A所示，与对照组(组A1)相比，每个组(组A2-A10)中的肿瘤细胞数减少，并且有开关的组(组A4-A10)显示出比没有开关的组(组A2和A3)更显著的肿瘤细胞数减少。
3.T细胞的扩增。在培养48h之后计数T细胞的数量。如图17B所示，没有开关的那些组(组A2-A3)的T细胞显示出轻微的扩增，而有开关的组(组A4-A10)显示出明显的扩增。
(2)在B细胞的存在下的肿瘤杀伤比较
从患者的新鲜肿瘤组织中分离出肿瘤细胞和TIL，并且将肿瘤细胞与萤光素酶标记一起接种到24孔板中，之后培养过夜，从而允许贴壁。向每个孔中添加相同量的B细胞。根据以下将所培养的细胞分成10个组并与对照或T细胞共培养：不添加T细胞-CK的对照组(组B1)；普通TIL(组B2)；BCAR-TIL(组B3)；PD1sw-TIL(组B4)；TIM3sw-TIL(组B5)；TGFBR2sw-TIL(组B6)；PD1-STIL(组B7)；TIM3-STIL(组B8)；TGFBR2-STIL(组B9)；和XSTIL(组B10)。进行以下测定：
1.肿瘤细胞的生长。在48h和96h之后，从培养物中去除上清液。然后将培养物用PBS冲洗3次。将粘附肿瘤细胞裂解，并且测量萤光素酶活性作为肿瘤细胞存活率的指示。如图17A所示，与对照组(组B1)相比，每个组(组B2-B10)中的肿瘤细胞数减少，并且与通过所有其他组(组B3-B10)获得的显著减少相比，普通TIL组(组B2)具有最小的肿瘤细胞减少。
2.T细胞的扩增。在培养48h之后计数T细胞的数量。如图17B所示，普通TIL组(组B2)显示出轻微的扩增，而有开关的那些组(组B4-B10)的T细胞显示出明显的扩增，其中具有BCAR的组(组B3和B7-B10)显示出甚至更多的扩增。
如体外测定所示，在用开关分子转导之后，TIL的肿瘤杀伤作用得到改进。当同时用开关和BCAR分子转导以提供SuperTIL时，SuperTIL在B细胞的存在下甚至产生更强的扩增和肿瘤细胞杀伤作用。
实施例22：对Super-pTIL功效的体外测定
为了确认Super-pTIL的功效，进行了与SuperTIL相似的实验(参见实施例21)。
(1)当不添加B细胞时肿瘤杀伤效果的比较。
各组是：不添加T细胞-CK的对照组(组A1)；普通pTIL(组A2)；BCAR-pTIL(组A3)；PD1sw-pTIL(组A4)；TIM3sw-pTIL(组A5)；TGFBR2sw-pTIL(组A6)；PD1-SpTIL(组A7)；TIM3-SpTIL(组A8)；TGFBR2-SpTIL(组A9)；和XSpTIL(组A10)。进行以下测定：
1.T细胞的细胞因子分泌。如图18A和18B所示，在对照组A1中未观察到IFN-γ或IL-2分泌，而在所有其他组(组A2-A10)中均观察到IFN-γ或IL-2分泌。在所有组中，有开关的那些组(组A4-A10)展现出比没有开关的组(组A2和A3)更高的IFN-γ或IL-2分泌。
2.肿瘤细胞的生长。如图19A所示，与对照组(组A1)相比，每个组(组A2-A10)中的肿瘤细胞数减少，并且有开关的组(组A4-A10)显示出更显著的肿瘤细胞数减少。
3.T细胞的扩增。在培养48h之后计数T细胞的数量。如图19B所示，没有开关的那些组(组A2-A3)的T细胞显示出轻微的扩增，而有开关的组(组A4-A10)显示出明显的扩增。
(2)在B细胞的存在下的肿瘤杀伤比较
各组是：不添加T细胞-CK的对照组(组B1)；普通pTIL(组B2)；BCAR-pTIL(组B3)；PD1sw-pTIL(组B4)；TIM3sw-pTIL(组B5)；TGFBR2sw-pTIL(组B6)；PD1-SpTIL(组B7)；TIM3-SpTIL(组B8)；TGFBR2-SpTIL(组B9)；和XSpTIL(组B10)。向每个孔中添加相同量的B细胞。
进行以下测定：
1.肿瘤细胞的生长。如图19A所示，与对照组(组B1)相比，每个组(组B2-B10)中的肿瘤细胞数减少，并且与通过所有其他组(组B3-B10)获得的显著减少相比，普通pTIL组(组B2)具有最小的肿瘤细胞减少。
2.T细胞的扩增。如图19B所示，普通pTIL组(组B2)显示出轻微的扩增，而有开关的那些组(组B4-B10)的T细胞显示出明显的扩增，其中具有BCAR的组(组B3和B7-B10)显示出甚至更多的扩增。
如体外测定所示，在用开关分子转导之后，pTIL的肿瘤杀伤作用得到高度改进。当同时用开关和BCAR转导以提供SuperTIL时，SuperTIL在B细胞的存在下甚至具有更强的扩增和肿瘤细胞杀伤作用。
实施例23：对SuperTIL的动物测试
动物模型：将来自新鲜肿瘤细胞的1*106个肿瘤细胞皮下注射到NSG小鼠中。作为空白对照，向组A0的动物皮下注射PBC。在注射肿瘤细胞后约两周，在动物体内形成肿瘤。在第25天测量肿瘤尺寸。选择132只小鼠，并且根据以下分成没有B细胞的组A(11个亚组)和有B细胞的组B(11个亚组)(总共22个组)：
组A由以下组成：经由尾静脉注射PBS的空白对照组(组A0)以及10个接种肿瘤细胞的小鼠的组：未治疗-PBS组(组A1)；普通TIL(组A2)；BCAR-TIL(组A3)；PD1sw-TIL(组A4)；TIM3sw-TIL(组A5)；TGFBR2sw-TIL(组A6)；PD1-STIL(组A7)；TIM3-STIL(组A8)；TGFBR2-STIL(组A9)；和XSTIL(组A10)。经由尾静脉向组A2-A10给予1*104个T细胞。
组B由以下组成：经由尾静脉注射PBS的空白对照组(组B0)以及10个接种肿瘤细胞的小鼠的组：未治疗-PBS组(组B1)；普通TIL(组B2)；BCAR-TIL(组B3)；PD1sw-TIL(组B4)；TIM3sw-TIL(组B5)；TGFBR2sw-TIL(组B6)；PD1-STIL(组B7)；TIM3-STIL(组B8)；TGFBR2-STIL(组B9)；和XSTIL(组B10)。经由尾静脉向组B2-B10给予1*104个T细胞，并且经由输注向所有组给予1*107个B细胞。
每2-3天测量一次小鼠的肿瘤尺寸和健康状态，持续给予后28天。肿瘤尺寸计算为：
肿瘤尺寸＝1/2*长直径*短直径*短直径。
(1)肿瘤负荷的变化
预期实验证明输注有开关的TIL的小鼠(组A4-A10和B4-B6)展现出延迟的肿瘤生长。预期有BCAR的TIL(组B3)在B细胞的存在下高度扩增，从而产生显著的肿瘤生长延迟作用。
(3)肿瘤细胞的PD1、TIM3和TFGBR2表达。
在肿瘤再次变得增大之前和之后测定来自组B7-B9的肿瘤组织。预期结果显示：(i)组B7(PD1-STIL)肿瘤不表达PD1，但表达TIM3和TGFBR2；(ii)组B8(TIM3-STIL)肿瘤不表达TIM3，但表达PD1和TGFBR2；并且(iii)组B9(TGFBR2-STIL)肿瘤不表达TGFBR2，但表达PD1和TIM3。在一些情况下，肿瘤微环境标记有可能逃逸，导致对应开关无效。
实施例24：对Super-pTIL的动物测试
为了确认Super-pTIL的体内功效，设计了与SuperTIL类似的动物测试。也将动物分成组A(不存在B细胞)和组B(存在B细胞)，总共包含22个亚组：
组A由以下组成：经由尾静脉注射PBS的空白对照组(组A0)以及10个接种肿瘤细胞的小鼠的组：未治疗-PBS组(组A1)；普通pTIL(组A2)；BCAR-pTIL(组A3)；PD1sw-pTIL(组A4)；TIM3sw-pTIL(组A5)；TGFBR2sw-pTIL(组A6)；PD1-SpTIL(组A7)；TIM3-SpTIL(组A8)；TGFBR2-SpTIL(组A9)；和XSpTIL(组A10)。经由尾静脉向组A2-A10给予1*104个T细胞。
组B由以下组成：经由尾静脉注射PBS的空白对照组(组B0)以及10个接种肿瘤细胞的小鼠的组：未治疗-PBS组(组B1)；普通pTIL(组B2)；BCAR-pTIL(组B3)；PD1sw-pTIL(组B4)；TIM3sw-pTIL(组B5)；TGFBR2sw-pTIL(组B6)；PD1-SpTIL(组B7)；TIM3-SpTIL(组B8)；TGFBR2-SpTIL(组B9)；和XSpTIL(组B10)。经由尾静脉向组B2-B10给予1*104个T细胞，并且经由输注向所有组给予1*107个B细胞。
每2-3天测量一次小鼠的肿瘤尺寸和健康状态，持续给予后28天。肿瘤尺寸可以计算为：
肿瘤尺寸＝1/2*长直径*短直径*短直径。
预期实验证明本文所公开的SuperTIL/pTIL经由多个靶标(来自TIL或pTIL)具有特异性的肿瘤识别和杀伤作用。SuperTIL/pTIL还可能展现出克服肿瘤环境以增强杀伤的能力(来自一个或多个开关)以及来自BCAR的自身扩增能力。这些经修饰的免疫细胞提供了一种有效的肿瘤疗法工具，以解决涉及肿瘤免疫细胞疗法的各种问题。
实施例25：BCAR-TCR T细胞对NY ESO1肿瘤细胞的体外杀伤作用
为了确认BCAR在靶向NY-ESO-1的TCR T中的功能，使用具有HLA基因型A:0201的肿瘤细胞系J82-NY ESO1作为靶细胞，以测量BCAR-TCR T细胞的杀伤作用。
将1×105个J82-NY ESO1肿瘤细胞接种在RTCA(实时细胞分析)电极板上，并且培养过夜以允许粘附。将细胞分成三个组：A、B和C。在组A中，将1×105个、1×104个、1×103个、1×102个BCAR-TCR T分别与J82-NY-ESO-1细胞共培养。在组B中，将1×105个、1×104个、1×103个、1×102个BCAR-TCR T连同1×105个B细胞与J82-NY-ESO-1细胞共培养。组C为空白对照。使用RTCA系统每十分钟记录一次“细胞指数”，持续24小时。
如图20所示，在其中不存在B细胞的组A中，只有最高剂量的1×105个BCAR-TCR T显示出对J82-NY ESO1肿瘤细胞的显著杀伤作用；而在组B中，在B细胞的存在下，甚至最低剂量的1×102个BCAR-TCR T也显示出对J82-NY ESO1肿瘤细胞的显著杀伤作用，这与组A中的1×105个BCAR-TCR T的剂量的杀伤作用相当，表明功效增加了约1000倍。
实施例26.STIL和SpTIL的临床抗肿瘤作用
在临床试验中招募了五名受试者并向其输注了STIL或SpTIL(如表1所示)：
表1
Figure BDA0002483116980000811
*注释：通过基因组中每百万个碱基的突变数来评估肿瘤突变负荷(TMB)。TMB<5被认为是低突变负荷，5-10是中突变负荷，而≥10是高突变负荷。据信具有较高TMB的受试者不太可能从PD1单克隆抗体和新抗原免疫疗法中受益。
如表1所示，招募的受试者具有不同实体瘤，但是它们全部处于晚期，是难治性和高度进展的，具有超过两处远端转移病灶。多线治疗无效。五分之三的受试者(60％)发生了TP53突变，其对靶向疗法有抗性并且预后较差。TMB评估和HLA多态性表明，所有这些受试者均不太可能从PD1/PDL1单克隆抗体疗法或常规新抗原疗法中受益。
治疗前的细胞制备
(1)分离TIL/pTIL
对于受试者编号3、4和5，在酶促消化之后，用CD3磁珠从新切除的肿瘤组织中分离出CD3阳性TIL。对于受试者编号1和2，从患者中分离出PBMC，其中PD1+T细胞量分别为总T细胞的19％和5％。这样高比率的PD1+T细胞被认为是来源于肿瘤组织的外周血中的TIL(pTIL)，并且用PD1磁珠进一步浓缩以提供PD1+T细胞(即，pTIL)。
制备STIL/SpTIL
将装载有PD1sw-CD19 CAR的慢病毒载体以2％至15％的转染效率转染到TIL/pTIL中。将细胞包装到输液袋中而不扩增。整个过程需要三至十天(不包括识别新抗原的T细胞的鉴定过程)。
表2示出了所有五名受试者用所得细胞进行的治疗，剂量的大小为105-106个细胞/kg，这比所报道的剂量108-109个细胞/kg低得多。
表2
Figure BDA0002483116980000821
安全性评估
在5名受试者中，观察到有3名患有由高烧所证明的1级细胞因子释放综合征(CRS)，发生率为60％(3/5)。三名全部得到缓解，其中1名未经干预并且另两名用托珠单抗治疗。CRS的发生率和分级均比CD19 CAR-T治疗低得多。未观察到治疗后的自身免疫性疾病。
功效评价
通过肿瘤成像证实了细胞输注治疗的功效(图21-24分别针对受试者编号1-4)。将结果总结于下表3中。
表3
Figure BDA0002483116980000822
Figure BDA0002483116980000831
*注释：功效评价是根据RECIST标准进行的。
CAR对体内STIL/SpTIL扩增的影响
监测受试者外周血中CAR+T细胞的比率。通过下式计算在外周血中扩增的STIL(或SpTIL)的倍数：
扩增倍数＝淋巴细胞计数/L*循环血量*淋巴细胞中的T细胞比率*T细胞中的STIL比率。
其中淋巴细胞计数/L是从常规血液检查获得的；淋巴细胞中的T细胞比率是通过流式细胞术作为CD3+细胞的比率获得的；T细胞中的STIL比率是通过流式细胞术作为CD3+细胞中的CAR+细胞的比率确定的。
在第14天计算STIL/SpTIL扩增并确定B细胞减少。将结果示于表4中。
表4
Figure BDA0002483116980000832
Figure BDA0002483116980000841
在观察期间未给予外源免疫球蛋白，并且对于任何受试者未观察到免疫缺陷。
STIL和SpTIL的双特异性识别
监测受试者1、2和4的外周血中的循环肿瘤细胞(CTC)。然后将细胞输注后两个月的CTC数与输注当天的基线进行比较。将结果提供在下表5和图25中，显示了显著降低的CTC数。
表5
Figure BDA0002483116980000842
开关分子增强杀伤作用
观察到三名受试者(编号1、2和5)在第14天至第28天期间具有减少的外周血T细胞，以及持续存在的胸腔积液或腹水。具有胸膜转移的受试者4发生了胸腔积液，而具有腹膜转移的受试者1和2发生了腹水。在胸腔积液和腹水中，均发现了T细胞，并且IL6浓度高于外周血中的IL6浓度。将观察结果总结于表6中，表明STIL/SpTIL的杀伤作用被开关分子增强。
表6
Figure BDA0002483116980000843
Figure BDA0002483116980000851
表7：序列
Figure BDA0002483116980000852
尽管已经在本文中显示和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员应清楚的是此类实施方案仅以举例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。预期以下权利要求限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等效物范围内的方法和结构。

Claims (86)

1.一种特异性地结合肿瘤抗原的经修饰的免疫细胞，所述经修饰的免疫细胞包含嵌合刺激分子，其中所述嵌合刺激分子包含：
在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，
其中所述嵌合刺激分子与所述配体的结合在所述经修饰的免疫细胞中产生所述免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号。
2.权利要求1所述的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其中任选地，所述TIL表达PD-1、CD137和TIM-3中的至少一种。
3.一种特异性地结合新抗原的经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含开关分子，其中所述开关分子包含：
在未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞激活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，
其中所述开关分子与所述配体的结合在所述经修饰的T细胞中产生所述免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号。
4.权利要求3所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞包含展现出与所述新抗原的特异性结合的T细胞受体(TCR)复合物。
5.权利要求4所述的经修饰的T细胞，其中所述TCR复合物是内源TCR复合物。
6.权利要求4所述的经修饰的T细胞，其中所述TCR复合物是外源TCR复合物。
7.权利要求1-6中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中所述新抗原包含由突变基因编码的蛋白质的肽片段，其中所述基因选自ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。
8.权利要求1-6中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中基于来自个体的肿瘤样品的体细胞突变谱选择所述新抗原。
9.权利要求1-8中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中在未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质是信号传导受体。
10.权利要求1-9中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中在未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质是检查点受体、细胞因子受体、趋化因子受体、生长因子受体或激素受体。
11.权利要求1-10中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中在未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质选自转化生长因子β受体(TGF-β-R)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)和TIGIT。
12.权利要求1-11中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中所述共刺激分子是白细胞介素2受体(IL-2R)、白细胞介素12受体(IL-12R)、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C或OX40。
13.权利要求1-12中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中所述免疫细胞激活信号由激活因子介导。
14.权利要求13所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中所述激活因子是可溶性细胞因子、可溶性趋化因子或生长因子。
15.权利要求14所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中所述激活因子是可溶性细胞因子，并且其中所述可溶性细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TNF、TGF、IFN或其任何功能片段或变体。
16.权利要求1-15中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中所述免疫细胞激活信号包含所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的克隆扩增；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的细胞因子释放；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的细胞毒性；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的增殖；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的分化、去分化或转分化；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的运动和/或运输；所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的耗竭和/或再激活；以及所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞的其他细胞间分子、代谢产物、化学化合物或其组合的释放。
17.权利要求1-16中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中在所述开关分子与所述配体结合后，与未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞展现出增强的新抗原结合。
18.权利要求1-17中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中当所述开关分子与所述配体结合并且所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞与存在于靶细胞上的所述新抗原结合时，与未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞展现出增加的针对所述靶细胞的细胞毒性。
19.权利要求1-18中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中当所述开关分子结合所述配体并且所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞与存在于靶细胞上的所述新抗原结合时，与未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞展现出增加的细胞因子分泌。
20.权利要求19所述的经修饰的TIL或经修饰的T细胞，其中所述细胞因子是IFN-γ或IL-2。
21.一种经修饰的免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)和展现出与新抗原的特异性结合的T细胞受体(TCR)复合物，其中所述CAR包含：
(a)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域。
22.权利要求21所述的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
23.权利要求22所述的经修饰的免疫细胞，其中所述TIL表达PD-1、CD137和TIM-3中的至少一种。
24.权利要求21-23中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中展现出与新抗原的特异性结合的所述TCR复合物是内源TCR复合物。
25.权利要求21-23中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中展现出与新抗原的特异性结合的所述TCR复合物是外源TCR复合物。
26.权利要求21-25中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述新抗原包含由突变基因编码的蛋白质的肽片段，其中所述基因选自ABL1、ACOl1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。
27.权利要求21-25中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中基于来自个体的肿瘤样品的体细胞突变谱选择所述新抗原。
28.权利要求21-27中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述B细胞表面蛋白选自CD19、CD20和CD22。
29.权利要求21-28中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)。
30.权利要求21-28中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。
31.权利要求21-28中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含选自以下的分子的细胞内结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。
32.权利要求21-31中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内结构域。
33.权利要求32所述的经修饰的免疫细胞，其中CD3ζ的所述细胞内结构域包含ITAM。
34.权利要求21-29中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述CAR还包含共刺激结构域。
35.权利要求34所述的经修饰的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包含以下的信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体或Toll配体受体。
36.权利要求34所述的经修饰的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2R γ、IL7R α、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
37.权利要求21-27中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中在所述免疫细胞与所述B细胞表面蛋白接触后，与未经修饰的免疫细胞相比，所述免疫细胞展现出增强的增殖。
38.权利要求37所述的经修饰的免疫细胞，其中在体外确定所述增强的增殖。
39.权利要求37所述的经修饰的免疫细胞，其中在体内确定所述增强的增殖。
40.权利要求28-39中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中与未经修饰的免疫细胞相比，在所述接触后至少约24、48或96小时之后，所述免疫细胞展现出至少2倍的增殖增加。
41.一种特异性地结合新抗原的经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其中所述经修饰的TIL包含：
(a)开关分子，所述开关分子包含在未经修饰的TIL中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，并且其中所述开关分子与所述配体的结合在所述经修饰的TIL中产生所述免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号；以及
(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
42.一种特异性地结合新抗原的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞包含：
(a)开关分子，所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，并且其中所述开关分子与所述配体的结合在所述经修饰的免疫细胞中产生免疫细胞激活信号而非所述免疫细胞失活信号；以及
(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
43.权利要求42所述的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含展现出与新抗原的特异性结合的T细胞受体(TCR)复合物。
44.权利要求43所述的经修饰的免疫细胞，其中所述TCR复合物是内源TCR复合物。
45.权利要求43所述的经修饰的免疫细胞，其中所述TCR复合物是外源TCR复合物。
46.权利要求41-45中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述新抗原包含由突变基因编码的蛋白质的肽片段，其中所述基因选自ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。
47.权利要求41-45中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中基于来自个体的肿瘤样品的体细胞突变谱选择所述新抗原。
48.权利要求41-47中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中在未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质是信号传导受体。
49.权利要求41-47中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中在未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质是检查点受体、细胞因子受体、趋化因子受体、生长因子受体或激素受体。
50.权利要求41-47中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中在未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质选自转化生长因子β受体(TGF-β-R)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)和TIGIT。
51.权利要求41-50中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述共刺激分子是白细胞介素2受体(IL-2R)、白细胞介素12受体(IL-12R)、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C或OX40。
52.权利要求41-51中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞激活信号由激活因子介导。
53.权利要求52所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述激活因子是可溶性细胞因子、可溶性趋化因子或生长因子。
54.权利要求53所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述激活因子是可溶性细胞因子，并且其中所述可溶性细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TNF、TGF、IFN或其任何功能片段或变体。
55.权利要求41-54中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞激活信号包含所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的克隆扩增；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的细胞因子释放；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的细胞毒性；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的增殖；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的运动和/或运输；所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的耗竭和/或再激活；以及所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞的其他细胞间分子、代谢产物、化学化合物或其组合的释放。
56.权利要求41-55中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述B细胞表面蛋白选自CD19、CD20和CD22。
57.权利要求41-56中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)。
58.权利要求41-56中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。
59.权利要求41-56中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含选自以下的分子的细胞内结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。
60.权利要求41-59中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内结构域。
61.权利要求60所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中CD3ζ的所述细胞内结构域包含ITAM。
62.权利要求41-61中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述CAR还包含共刺激结构域。
63.权利要求62所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包含以下的信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体或Toll配体受体。
64.权利要求62所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2R γ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
65.权利要求41-47中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中在所述开关分子与所述配体结合后，与未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞展现出增强的新抗原结合。
66.权利要求41-65中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中当所述开关分子与所述配体结合并且所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞与存在于靶细胞上的所述新抗原结合时，与未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的T细胞展现出增加的针对所述靶细胞的细胞毒性。
67.权利要求41-66中任一项所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中当所述开关分子结合所述配体并且所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞与存在于靶细胞上的所述新抗原结合时，与未经修饰的TIL或未经修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞展现出增加的细胞因子分泌。
68.权利要求67所述的经修饰的TIL或经修饰的免疫细胞，其中所述细胞因子是IFN-γ或IL-2。
69.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：
(a)向受试者给予前述权利要求中任一项所述的经修饰的TIL、经修饰的T细胞或经修饰的免疫细胞；以及
(b)使表达新抗原的所述癌症的靶细胞与所述经修饰的TIL、经修饰的T细胞或经修饰的免疫细胞在诱导所述经修饰的TIL、经修饰的T细胞或经修饰的免疫细胞针对所述癌症的靶细胞的细胞毒性的条件下接触，从而诱导所述癌症的靶细胞的死亡。
70.一种扩增T细胞群的方法，所述方法包括：
(a)提供包含权利要求21-40中任一项所述的至少一种经修饰的免疫细胞的T细胞群；以及
(b)将所述T细胞群暴露于所述B细胞表面蛋白以实现所述T细胞群的扩增。
71.权利要求70所述的方法，其中在(b)中，所述T细胞群暴露于包含所述B细胞表面蛋白的B细胞。
72.一种扩增T细胞群的方法，其包括：
(a)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述T细胞群中，从而产生第一CAR表达细胞群，其中所述CAR包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域；以及
(b)使所述第一CAR表达细胞群与B细胞表面蛋白接触，从而产生扩增的和/或激活的免疫细胞群。
73.一种组合物，其包含编码以下中的一种或多种的一种或多种多核苷酸：
(a)开关分子，其中所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激蛋白的细胞内结构域(ICD)融合；以及
(b)抗原特异性T细胞受体复合物或其一种或多种组分。
74.一种组合物，其包含编码以下中的一种或多种的一种或多种多核苷酸：
(a)抗原特异性T细胞受体复合物或其一种或多种组分；以及
(b)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
75.权利要求73和74中任一项所述的组合物，其中所述抗原特异性T细胞受体复合物结合新抗原。
76.权利要求75所述的组合物，其中所述新抗原包含由突变基因编码的蛋白质的肽片段，其中所述基因选自ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。
77.权利要求73所述的组合物，其中在未经修饰的TIL或未经修饰的T细胞中在与其配体结合后引发免疫细胞失活信号的所述蛋白质是信号传导受体。
78.权利要求77所述的组合物，其中所述蛋白质是检查点受体、细胞因子受体、趋化因子受体、生长因子受体或激素受体。
79.权利要求78所述的组合物，其中所述蛋白质选自转化生长因子β受体(TGF-β-R)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)和TIGIT。
80.权利要求73所述的组合物，其中介导免疫细胞激活信号的所述共刺激蛋白是白细胞介素2受体(IL-2R)、白细胞介素12受体(IL-12R)、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C或OX40。
81.权利要求74所述的组合物，其中所述B细胞表面蛋白选自CD19、CD20和CD22。
82.权利要求74所述的组合物，其中所述细胞内信号传导结构域包含选自以下的分子的细胞内结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。
83.权利要求74所述的组合物，其中所述嵌合抗原受体还包含共刺激结构域。
84.权利要求83所述的组合物，所述共刺激结构域包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2R β、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
85.一种组合物，其包含编码以下中的一种或多种的一种或多种多核苷酸：
(a)开关分子，其中所述开关分子包含在未经修饰的免疫细胞中在与其配体结合后引发免疫失活信号的蛋白质的细胞外结构域(ECD)，其中所述ECD与介导免疫细胞激活信号的共刺激蛋白的细胞内结构域(ICD)融合；
(b)抗原特异性T细胞受体复合物或其一种或多种组分；以及
(c)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含(i)能够结合B细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域。
86.一种特异性地结合新抗原的经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，所述经修饰的TIL包含嵌合刺激分子，其中所述嵌合刺激分子包含：
与所述新抗原结合的多肽细胞外结构域(PED)，其中所述PED与介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的细胞内结构域(ICD)融合，
其中所述嵌合刺激分子与所述新抗原的结合在所述经修饰的TIL中产生所述免疫细胞激活信号。
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