CN114929249A

CN114929249A - 产生自然杀伤细胞及其组合物的方法

Info

Publication number: CN114929249A
Application number: CN202080091267.XA
Authority: CN
Inventors: 朴商佑; 金容万; 丁在燮; 姜允美
Original assignee: NKmax Co Ltd
Current assignee: NKmax Co Ltd
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2022-08-19
Also published as: WO2021108389A1; US20230002731A1; EP4048296A1; JP2023505102A; EP4048296A4; TW202128988A; KR20220119611A

Abstract

公开了一种用于产生自然杀伤细胞的方法。该方法包括从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)；从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3‑/CD56+细胞中的至少一种；以及在细胞因子的存在下，共培养CD56+细胞和/或CD3‑/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合。该方法可进一步包括冷冻和解冻CD56+细胞和/或CD3‑/CD56+细胞。还公开了一种用于治疗癌症的组合物。该组合物包含通过所公开的方法和细胞因子产生的CD56+自然杀伤细胞。

Description

产生自然杀伤细胞及其组合物的方法

通过引用结合到任何优先申请

本申请要求2020年8月7日提交的第63/062694号美国临时申请以及2019年11月29日提交的第KR-10-2019-0157727号韩国专利申请的权益，每件申请的公开内容通过引用整体并入本文。

背景

技术领域

本公开涉及制备、储存自然杀伤细胞和/或自然杀伤细胞本身。

相关技术的描述

自然杀伤细胞(NK细胞)是一种类型的先天免疫细胞，已知其非特异性地杀死癌症；识别和杀死病毒、细菌等；以及以酶(例如穿孔素和粒酶)或通过Fas-FasL相互作用杀死病原体。在癌症患者的情况下，据报道这些NK细胞的癌细胞细胞毒性的降低与各种类型的癌症的发作相关联，如肺癌(Carrega P等，Cancer,2008:112:863-875)、肝癌(Jinushi M等，J Hepatol.,2005:43；1013-1020)、乳腺癌(Bauernhofer T等，Eur J Immunol.,2003:33:119-124)、子宫癌(Mocchegiani E.等，Br j Cancer.,1999:79:244-250)、血癌(TajimaF.等，Lekemia1996:10:478-482)等。

发明内容

本申请涉及产生高纯度自然杀伤细胞的方法，以及用于治疗癌症的细胞治疗组合物，其包括高纯度自然杀伤细胞和细胞因子。本文中所公开的任何特征、结构或步骤可替换为本文所公开的任何其它特征、结构或步骤或与本文所公开的任何其它特征、结构或步骤组合，或被省略。此外，出于总结本公开的目的，本文已经描述了本发明的某些方面、优点和特征。应理解，根据本文公开的本发明的任何特定实施例，不一定实现任何或所有此类优点。本公开的各个方面没有是必需的或必不可少的。

在一些实施方式中，公开了在培养中扩增自然杀伤细胞的方法。该方法包括：从血液样品中分离CD56+细胞；在IL-21(和饲养细胞)的存在下，共培养分离的CD56+细胞进行第一周期；在第一周期之后，冷冻共培养的CD56+细胞；解冻冷冻的CD56+细胞；以及在IL-21(和饲养细胞)的存在下，共培养解冻的CD56+细胞进行第二周期。

本文提供的任何实施方式中的方法和/或本文公开的任何方法可包括以下特征中的一个或多个。该方法可进一步包括在低于-100℃的温度下储存冷冻的CD56+细胞。该方法可进一步包括在解冻之前将冷冻的CD56+细胞储存达一天以上。在冷冻之前，可共培养分离的CD56+细胞达13-16天(或9-25天)之间。可在IL-21的存在下共培养分离的CD56+细胞与一种或多种经辐照的饲养细胞。可在IL-21的存在下共培养解冻的CD56+细胞与一种或多种经辐照的饲养细胞。一种或多种饲养细胞可以是选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞和PBMC(包含例如自体PBMC)组成的组中的一种或多种。可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养CD56+细胞。在一些实施方式中，任何饲养细胞可用于第一扩增、第二扩增、或第一和第二扩增(例如，用IL-21)。可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:1、1:2、1:5、1:10、1:20、1:30或1:100的比值共培养CD56+细胞。在一些实施方式中，这些比值用于KL1/EBVLCL以及用于其它饲养细胞，例如可使用1:1至1:10。可在第一和/或第二周期期间以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。可在第一和/或第二周期期间以20-80ng/mL的浓度添加IL-21。可在第一和/或第二周期期间以30-70ng/mL的浓度添加IL-21。可在第一和/或第二周期期间不止一次添加IL-21。

在一些实施方式中，提供了在培养中扩增自然杀伤细胞的方法。该方法包括从血液样品(例如，来自新鲜或冷冻的PBMC、脐带血和/或血液，其中一个具有来自血液样品的分离的CD56+、CD56+CD3-和CD3-细胞)分离CD56+；在IL-21的存在下，共培养CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；冷冻CD56+细胞；解冻冷冻的CD56+细胞；以及扩增解冻的CD56+细胞(再次用任何类型的合适的饲养细胞)。

本文公开的任何实施方式中的方法和/或任何方法可包括以下特征中的一种或多种。冷冻CD56+细胞可在低于-100℃的温度下进行。该方法可进一步包括储存冷冻的CD56+细胞达1天以上且10年以下的时间段。在冷冻之前，可共培养CD56+细胞达13-16天(或9-25天)之间。在所有实施方式中，一种或多种饲养细胞是不受限制的，并且可以是选自由以下至少一种组成的组的一种或多种：经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞、mb15-k562、mb21-k562饲养细胞、HuT78和/或PBMC。可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养CD56+细胞。可以以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。可不止一次添加IL-21。在一些实施方式中，NK细胞可与任何饲养细胞类型一起使用，只要IL-21在冷冻之前使用，并且只要随后其在从冷冻解冻之后进行再刺激过程即可。

在一些实施方式中，公开了提高自然杀伤细胞的细胞毒性的方法。所述方法包括提供所述自然杀伤细胞；冷冻所述自然杀伤细胞；解冻冷冻的自然杀伤细胞；以及在IL-21的存在下，共培养解冻的自然杀伤细胞与一种或多种饲养细胞。任选地，在冷冻自然杀伤细胞之前，自然杀伤细胞可与饲养细胞和IL-21共培养(扩增)。

本文前述段落中的任何方法和/或本文公开的任何方法可包括以下特征中的一种或多种。该方法可进一步包括在低于-100℃的温度下储存冷冻的自然杀伤细胞。该方法可进一步包括在解冻之前储存冷冻的自然杀伤细胞达一天以上。一种或多种饲养细胞是选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系、经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞、mb15-k562、mb21-k562饲养细胞、HuT78、和/或PBMC组成的组中的一种或多种。可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养解冻的自然杀伤细胞。可以以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。可不止一次添加IL-21。

在一些实施方式中，公开了一种治疗受试者的方法。该方法包括从受试者收集CD56+细胞；在IL-21的存在下，共培养CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；将共培养的CD56+细胞冷冻至少一天；解冻冷冻的CD56+细胞；扩增解冻的CD56+细胞；以及向受试者施用扩增的CD56+细胞，其中来自培养扩增的细胞的细胞毒性是在冷冻之前共培养的CD56+的细胞毒性的至少X％。

本文公开的前述段落中的任何方法和/或本文公开的任何方法可包括以下特征中的一种或多种。该方法可进一步包括在低于-100℃的温度下储存冷冻的CD56+细胞。该方法可进一步包括在解冻之前储存冷冻的CD56+细胞一天以上。在冷冻之前，可共培养分离的CD56+细胞13-16天(或9-25天)之间。扩增解冻的CD56+细胞可包括在IL-21的存在下，共培养解冻的CD56+与一种或多种经辐照的饲养细胞。一种或多种饲养细胞可选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞、mb15-k562、mb21-k562饲养细胞、HuT78、和/或PBMC组成的组中的一种或多种。可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养CD56+细胞。可在第一和/或第二周期期间以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。可在第一和/或第二周期期间添加多于一次IL-21。

在一些实施方式中，提供了组合物。该组合物包含有效量的源自患者的外周血单核细胞(PBMC)的CD56+细胞。通过从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)来制备CD56+细胞；从PBMC中分离CD56+细胞；在一种或多种细胞因子的存在下，共培养CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；冷冻CD56+细胞；解冻冷冻的CD56+细胞；以及在一种或多种细胞因子的存在下，共培养解冻的CD56+细胞与一种或多种饲养细胞。

在一些实施方式中，公开了一种细胞组合物。该细胞组合物包含：源自患者的外周血单核细胞(PBMC)的有效量的CD56+细胞；IL-2；和IL-21。

在一些实施方式中，公开了一种组合物。所述组合物包含源自外周血单核细胞(PBMC)的第一CD56+细胞群；冰；IL-2；和IL-21。当解冻时，CD56+细胞具有第二CD56+细胞群的至少80％的细胞毒性，其中第二CD56+细胞群尚未被冷冻。

在一些实施方式中，提供了在培养中扩增自然杀伤细胞的方法。该方法可包括：从血液样品中分离CD56+细胞；在IL-21的存在下，共培养分离的CD56+细胞第一周期；在第一周期之后冷冻共培养的CD56+细胞；解冻冷冻的CD56+细胞；以及在IL-21的存在下，共培养解冻的CD56+细胞第二周期。

在一些实施方式中，提供了在培养中扩增自然杀伤细胞的方法。该方法包括：从血液样品中分离CD56+；在IL-21的存在下，共培养CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；冷冻CD56+细胞；解冻冷冻的CD56+细胞；以及扩增解冻的CD56+细胞。

在一些实施方式中，提供了提高自然杀伤细胞的细胞毒性的方法，该方法包括提供所述自然杀伤细胞；冷冻所述自然杀伤细胞；解冻冷冻的自然杀伤细胞；以及在IL-21的存在下，共培养解冻的自然杀伤细胞与一种或多种饲养细胞。

在一些实施方式中，提供了治疗受试者的方法，包括：从受试者收集CD56+细胞；在IL-21的存在下，共培养CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；冷冻共培养的CD56+细胞至少一天；解冻冷冻的CD56+细胞；扩增解冻的CD56+细胞；以及向受试者施用扩增的CD56+细胞，其中来自培养扩增的细胞的细胞毒性为在冷冻之前共培养的CD56+的细胞毒性的至少80％。

在一些实施方式中，提供了组合物，其包括：有效量的源自患者的外周血单核细胞(PBMC)的CD56+细胞，其中CD56+细胞通过以下制备：从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)；从PBMC中分离CD56+细胞；在一种或多种细胞因子的存在下，共培养CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；冷冻CD56+细胞；解冻冷冻的CD56+细胞；以及在一种或多种细胞因子的存在下，共培养解冻的CD56+细胞与一种或多种饲养细胞。

在一些实施方式中，提供了细胞组合物，其包含：有效量的源自患者的外周血单核细胞(PBMC)的CD56+细胞；IL-2；和IL-21。

在一些实施方式中，提供了组合物，其包含：源自外周血单核细胞(PBMC)的第一CD56+细胞群；冰；和IL-2，IL-2。当解冻时，CD56+细胞具有第二CD56+细胞群的至少80％的细胞毒性，并且第二CD56+细胞群尚未被冷冻。

在一些实施方式中，提供了在培养中扩增自然杀伤细胞的方法，其包括：提供PBMC；在IL-21的存在下，共培养PBMC第一周期；在第一周期之后冷冻共培养的PBMC；解冻冷冻的PBMC；以及在IL-21的存在下，共培养解冻的PBMC第二周期。

在一些实施方式中，组合物包含：IL-2、5-10％DMSO、90-95％FBS、和NK细胞(其任选地为CD56+细胞)。在一些实施方式中，其进一步包含CryoStor溶液。在一些实施方式中，组合物在再扩增之前用于冷冻细胞。

在一些实施方式中，组合物包含IL-2、5-10％DMSO、80-95％Hartman溶液、1-10％人血清白蛋白、和NK细胞。在一些实施方式中，其进一步包含CryoStor溶液。在一些实施方式中，组合物在注射之前用于冷冻细胞。

附图说明

出于说明的目的，在随附的附图中描述了各种实施方式，并且其绝不应被解释为限制实施方式的范围。此外，公开的不同实施方式中的各种特征可被组合以形成作为本公开的一部分的附加的实施例。

图1描述了在IL21处理(预冷冻以及任选地后冷冻)之后用于扩增细胞的再扩增实验设计和实施方式。

图2A和2B描述了用和不用IL21(图2A)供体1、(图2B)供体2的细胞扩增之间的群体倍增水平(PDL)比较。

图3A和3B描述了用和不用IL21(图3A)供体1、(图3B)供体2的细胞扩增之间的扩增倍数比较。

图4A和4B描述了用和不用IL21(图4A)供体1、(图4B)供体2的细胞再刺激方法之间的群体倍增水平(PDL)比较。

图5A和5B描述了用和不用IL21(图5A)供体1、(图5B)供体2的细胞再刺激方法之间的扩增倍数比较。

图6描述了用IL-21(IL-21+)扩增的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。

图7描述了不用IL-21(IL-21-)扩增的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。

图8描述了用IL-21扩增并且用IL-21(IL-21+/+)再刺激的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。

图9描述了用IL-21扩增并且不用IL-21(IL-21+/-)再刺激的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。

图10描述了不用IL-21扩增并且用IL-21(IL-21-/+)再刺激的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。

图11描述了不用IL-21扩增并且不用IL-21(IL-21-/-)再刺激的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。

图12A描述了NK细胞的激活性受体的表型比较。

图12B描述了NK细胞的抑制性和趋化因子受体的表型比较。

图13A示出了用IL-21扩增并且用IL-21(IL-21+/+)再扩增的NK细胞以及不用IL-21扩增并且不用IL-21(IL-21-/-)再扩增的NK细胞的群体倍增水平(PDL)图。

图13B示出了用IL-21扩增并且用IL-21(IL-21+/+)再扩增的NK细胞以及用IL-21扩增并且不用IL-21(IL-21+/-)再扩增的NK细胞的群体倍增水平(PDL)图。

图14A示出了用IL-21扩增(第一刺激)和至少两次再扩增(第二和第三刺激)的NK细胞的群体倍增水平(PDL)图。

图14B示出了图14A中的结果的对应扩增倍数图。

详细描述

本文已经开发并提供了用于辅助NK细胞通过冻存并从其复苏的方法。已经发现，如果CD56+细胞最初(在初始扩增期间)在IL-21的存在下与饲养细胞共培养，则CD56+细胞可在冷冻和解冻之后成功地扩增。通过使用IL-21，可产生高纯度CD56+NK细胞，并且令人惊讶地，它们保留尤其大量的细胞毒性。此外，在解冻NK细胞之后，它们可进一步扩增(在不用IL-21的情况下，或者甚至更有利地，在额外的IL-21的存在下)。因此，在预冷冻过程(诸如第一扩增)中，IL-21可允许在以后的时间进行更优的再扩增。并且所得到的产物甚至在扩增两次和冷冻一次之后，保持令人惊讶的大量的细胞毒性，这在IL-21不仅仅在第一次扩增期间使用时，而且也在第二扩增期间使用时进一步增强。在一些实施方式中，冷冻和再扩增过程可重复多次(每次，任选地在再扩增期间具有另一轮IL-21)。

在一些实施方式中，提供了在培养中扩增自然杀伤细胞的方法。该方法包括：提供PBMC；在IL-21的存在下，共培养PBMC第一周期；在第一周期之后冷冻共培养的PBMC；解冻冷冻的PBMC；以及在IL-21的存在下，共培养解冻的PBMC第二周期。在一些实施方式中，PBMC与饲养细胞的比值为1:0.5:0.5。在一些实施方式中，对于PBMC(例如，作为CD56+的替代物)的比值可为约1:0.5:0.5～1:10:10。在一些实施方式中，对于CD56+细胞：比值乘以例如10或20(例如，1:1-100的CD56+细胞与饲养细胞)。在一些实施方式中，扩增来自CD56+或CD56+/CD3-细胞。

根据一些实施方式，用于生产高纯度NK细胞的方法可包括：在第一细胞因子(“第一培养步骤”或“第一扩增步骤”)如IL-21的存在下，共培养选自CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞的细胞与饲养细胞；冷冻共培养的细胞(冷冻步骤)；解冻冷冻的细胞(解冻步骤)；以及共培养解冻的细胞与添加的饲养细胞(“第二培养步骤”或“第二扩增步骤”)，任选地用更多的IL-21。在本文中更详细地描述了每个步骤。根据所公开的方法产生的CD3-/CD56+细胞不仅可表现出更高的纯度和更高的抗癌活性，而且还表现出其它的区别特征，例如具有不同的表面标志物或激活的受体，例如，来自CD16、CD25、CD27、CD28、CD69、CD94/NKG2C、CD94/NKG2E、CD266、CD244、NKG2D、KIR2S、KIR3S、Ly94D、NCRs、IFN-a、IFN-b、CXCR3、CXCR4、CX3CR1、CD62L和CD57中的一种或多种。

如本文所用，“步骤”是过程的一部分，并不要求在下一个“步骤”可开始之前完成一个“步骤”。除非另有说明，可以视情况在重叠的时间段或在相同的时间提供多个步骤。当然，当一个步骤发生在一个事件(例如冷冻)之前并且另一个步骤发生在同一事件之后时，那么就没有重叠(例如，第一IL-21孵育和第二IL-21孵育)。

在本说明书中，术语“CD56+细胞”可以与“CD56+NK细胞”或“CD56+自然杀伤细胞”互换使用，并且术语“CD3-/CD56+细胞”可以与“CD3-/CD56+NK细胞”互换使用。CD56+细胞或CD3-/CD56+细胞可包括其中位于细胞表面上的CD56糖蛋白被表达的细胞，或者进一步地，其中CD3糖蛋白不表达而CD56糖蛋白表达的细胞。即使是相同类型的免疫细胞，其附着在细胞表面的CD类型和表达率也可能不同，因此其功能也可能不同。

在一些实施方式中，CD56+细胞或CD3-/CD56+细胞通过以下步骤获得：从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)(“第一分离步骤”)；从外周血单核细胞分离选自由CD56+细胞和CD3-/CD56+细胞组成的组的细胞(“第二分离步骤”)。

在本说明书中，“血液样品”可以是，但不需限于，使用白细胞分离法从外周血分离的外周血或白细胞的全血。此外，外周血可从正常人、具有癌症风险的患者或癌症患者获得，但外周血的来源不限于此。

在本说明书中，术语“白细胞分离法”可指选择性地从所收集的血液中去除(分离)白细胞，并且然后再次将血液给与患者的方法，并且在一些实施方式中，通过该方法分离的白细胞可在没有额外的方法如Ficoll-Hypaque密度梯度法的情况下使用。

在本说明书中，术语“外周血单核细胞”可与“PBMC”，“单核细胞”互换使用，并且可指从外周血分离的通常用于抗癌免疫疗法的单核细胞。外周血单核细胞可使用已知的方法如Ficoll-Hypaque密度梯度法从所收集的人血获得。

在一些实施方式中，外周血单核细胞可以是自体的，但同种异体外周血单核细胞也可根据本文所述的方法用于产生用于抗癌免疫疗法的高纯度NK细胞。此外，在一些实施方式中，外周血单核细胞可从正常人获得，但是外周血单核细胞也可从具有癌症风险的患者和/或癌症患者获得。

在一些实施方式中，可使用选自由CD56微珠和CD3微珠组成的组中的至少一种，或使用诸如CliniMACSs、流式细胞术细胞分选仪或MACS分离器、磁力分选系统等设备的分离方法来执行用于从血液样品中分离CD56+自然杀伤细胞的第二分离步骤。

例如，使用CD56微珠和/或CD3微珠的分离方法可通过将CD56微珠添加到PBMC中并且然后去除非特异性结合进行，或通过将CD3微珠添加到PBMC中以去除特异性结合然后添加CD56微珠以去除非特异性结合来进行。在一些情况下，通过从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞，可去除T细胞或其它非自然杀伤细胞。

在本说明书中，术语"饲养细胞"可以指不分裂和增殖，但具有代谢活性以产生各种代谢物，并且因此有助于靶细胞增殖的细胞。

在一些实施方式中，饲养细胞可以是选自由经辐照的Jurkat细胞，经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、PBMC、HFWT、RPMI 1866、Daudi、MM-170、K562或通过靶向K562(例如，K562-mbIL-15-41BB配体)遗传修饰的细胞组成的组中的至少一种。例如，在一个实施方式中，饲养细胞可以是经辐照的Jurkat细胞和EBV-LCL细胞。在一些实施方式中，可使用任何饲养细胞类型，只要当NK细胞首先在IL-21的存在下扩增且然后冷冻、解冻，并且然后经受再扩增，其允许如本文提供的再扩增。

在本说明书中，术语“Jurkat细胞”或“Jurkat细胞系”可以指在旧金山加利福尼亚大学的Arthur Weiss博士开发的血癌(永生化急性T细胞白血病)细胞系。在其中表达各种趋化因子受体并能够产生IL-2的Jurkat细胞通常不被认为是用于抗癌免疫疗法的饲养细胞的可能候选物，因为作为自然杀伤细胞激活抑制剂的MHC I类在其细胞表面上高度表达。Jurkat细胞可从ATCC(ATCC TIB-152)获得。

在本说明书中，术语“EBV-LCL细胞”或“EBV-LCL细胞系”是指Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)(D.M.Koelle等，J Clin Invest,1993:91:961-968)，其是通过在试管中用Epstein-Barr病毒感染人B细胞制备的B细胞系。EBV-LCL细胞可通过在PBMC中感染EBV的过程中添加环孢菌素A的方法直接在一般实验室中制备和使用。在一些实施方式中，EBV-LCL细胞可通过以下步骤制备。在9mL培养基中添加30x10⁶PBMC，将该混合物添加在T 25培养瓶中，然后添加9mL EBV上清液。添加80μL环孢菌素A(50μg/mL)，然后在37℃培养。培养7天后，除去一半上清液，添加新鲜培养基，并且然后添加40μL环孢菌素A。每7天重复一次相同的过程，直到培养28天。细胞系可在培养28天后使用，并且从该时间开始，细胞系可在不添加环孢菌素A的培养基中培养。

Jurkat细胞和EBV-LCL细胞可在辐照后用作饲养细胞。

在一些实施方式中，在施用之前，方法可进一步包括在准备用于注射的溶液中第二次冷冻扩增的细胞。

在一些实施方式中，可以以1:0.1-5、1:0.1-4、1:0.1-3、1:0.1-2、1:0.1-1.5、1:0.5-1.5、1:0.75-1.25、0.1-5:1、0.1-4:1、0.1-3:1、0.1-2:1、0.1-1.5:1、0.5-1.5:1或0.75-1.25:1的含量比包含经辐照的Jurkat细胞和经辐照的EBV-LCL细胞。例如，可以以1:1的含量比包含经辐照的Jurkat细胞和经辐照的EBV-LCL细胞。

在一些实施方式中，经辐照的Jurkat细胞和经辐照的EBV-LCL细胞可通过用50-500、50-400、50-300、50-200、50-150、70-130、80-120或90-110Gy的辐照处理获得。例如，经辐照的Jurkat细胞和/或经辐照的EBV-LCL细胞可通过用100Gy辐照处理Jurkat细胞和/或EBV-LCL细胞获得。

在本说明书中，术语"细胞因子"可与“第一细胞因子”或“第二细胞因子”互换使用，并且可指可用于诱导外周血单核细胞分化为NK细胞的免疫活性化合物。在一些实施方式中，细胞因子是IL-21(用于第一扩增和第二扩增两者，以及任何进一步的多轮扩增)。

如本文所用，术语"共培养"和"扩增"是可互换的，并且表示NK细胞被培养以导致扩增的细胞群。术语"再扩增"表示NK细胞已经发生一轮共培养或扩增。在一些实施方式中，共培养或扩增将在饲养细胞和细胞因子(例如IL-21)的存在下发生。在本文中的一些情况下，术语"培养"被用作共培养的简略表达。

在一些实施方式中，细胞因子可以是白介素-2(IL-2)、IL-15、IL-21、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胰岛素样生长因子1(IGF 1)，但不限于此。

在一些实施方式中，第一细胞因子可以是IL-2、IL-21、IL-15、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、GM-CSF、胰岛素样生长因子1(IGF1)或其任意组合。在一些实施方式中，第二细胞因子可以是IL-2、IL-21、IL-15、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、GM-CSF、胰岛素样生长因子1(IGF1)，或其任意组合。例如，第二细胞因子可以是IL-2。在一些实施方式中，多于一种细胞因子可存在本文提供的一个或多个步骤中。在一些实施方式中，IL-21和IL-2均存在于第一轮扩增和第二轮扩增(或其任何后续轮次)中的至少一轮。另外，由于本文提供的各种实施方式还涉及在各种扩增轮中的每一轮中细胞因子(例如IL-21)的重复使用，这样的细胞因子可在第一次(或在第一轮或第一步骤期间)和第二次(例如在再扩增步骤期间)使用。因此，在一些实施方式中，第一细胞因子(例如IL-21)可用于第一轮共培养和第二轮共培养两者。这也可可选地表述为，例如作为第一细胞因子和第二细胞因子，其中第一细胞因子和第二细胞因子都是IL-21。

产生NK细胞的方法

图1是示出使用各种示例性饲养细胞扩增NK细胞的一些方法的流程图。在一些实施方式中，CD56+细胞或CD3-/CD56+细胞通过在IL-21的存在下与饲养细胞一起共培养进行扩增。饲养细胞可以是任何类型的饲养细胞，例如Jurkat细胞和EBV-LCL细胞(“类型1”)、K562细胞(“类型2”)或PBMC(“类型3”)。在一些实施方式中，在培养的第17天或约第17天(或第16-21或9-25天中的任何时候)收集细胞，并且所产生的细胞可在此处或在本说明书中的其它地方称为“IL21+.”。没有冻存或第二培养步骤的这种细胞扩增过程可在此处或本说明书中其它地方称为“原始过程”。在一些实施方式中，在第14天或约第14天(或第14-18或9-25天中的任何时候)收集细胞并进行冻存。冻存之前的培养可在此处或本说明书中其它地方称为"第一培养步骤"或"第一扩增步骤"或“第一共培养步骤”。冻存的细胞可解冻并且在存在IL-21(“IL-21+/+”)或不存在IL-21(“IL-21+/-”)的情况下与饲养细胞一起共培养而再次扩增。这样的第二扩增过程可称为“第二培养步骤”或“再刺激过程”或“第二共培养步骤”或“第二扩增步骤”。可在培养的第17天或约第17天(或第16-21或9-25天中的任何时候)收集细胞。在一些实施方式中，可执行进一步的再扩增或再刺激步骤或循环。如图14B所示，在一些实施方式中，可存在第一刺激步骤，之后是两个或更多个再刺激步骤。

在一些实施方式中，在不存在IL-21的情况下，通过与饲养细胞一起共培养扩增CD56+细胞或CD3-/CD56+细胞。典型地，这应用在用IL-21的初始培养步骤之后的培养步骤。饲养细胞可以是用于NK细胞的任何类型的饲养细胞，包含例如Jurkat细胞和EBV-LCL细胞(“类型1”)、K562细胞(“类型2”)或PBMC(“类型3”)。在一些实施方式中，在培养的第17天或约第17天(或第16-21天)收集细胞，并且所产生的细胞可在此处或本说明书中其它地方称为“IL21-.”。在一些实施方式中，在第14天或约第14天(或第14-18天)收集细胞并进行冻存。冻存的细胞可解冻并在存在IL-21(“IL-21-/+”)或不存在IL-21(“IL-21-/-”)的情况下与饲养细胞一起共培养而再次扩增。这样的第二扩增过程可称为“第二培养步骤”或“再刺激过程”。可在培养的第17天或约第17天(或第16-21或9-25天)收集细胞。如本文所详述的，IL-21在第一扩增中的使用允许NK细胞的冷冻和解冻和随后的优良扩增，任选地与额外的IL-21(例如，其甚至具有改进的细胞毒性的进一步益处)。

第一培养(扩增或共培养)步骤

第一培养步骤可包括在培养的第0-6天之间添加一次或多次细胞因子。可使用多于一种的细胞因子(例如，也可采用IL-2)。例如，第一培养步骤可包括在培养的第0天和第3天的每一天添加一种或两种细胞因子一次。

当与饲养细胞和第一细胞因子共培养时，在第0-6天期间进一步添加另一种细胞因子一次或多次的培养可表现出优异的增殖和/或抗癌活性。在一些实施方式中，在14天的循环中，添加饲养细胞和额外的细胞因子进行培养六天可表现出优异的增殖和/或抗癌活性。在一些实施方式中，IL-21至少使用一次，并且任选地在冷冻之前和冷冻之后。在一些实施方式中，IL-2可作为另一细胞因子包含。

在一些实施方式中，可以以10-1,000、10-500、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100或10-50ng/mL的浓度使用第一细胞因子(例如，IL-21)。在一些实施方式中，可以以50-1,000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-550、100-550、150-550、200-550、250-550、300-550、350-550、400-550、或450-550IU/mL的浓度使用额外的细胞因子。在一些实施方式中，浓度为约50ng/mL。

常规的增殖NK细胞的方法利用高浓度的各种细胞因子。相反，在本文所述的增殖NK细胞的方法的一些实施方式中，可仅使用低浓度的一种细胞因子来增殖具有高收率和高纯度的NK细胞。

在一些实施方式中，共培养(培养、扩增(包含再扩增))可通过以1:1-100、1:1-90、1:1-80、1:1-70、1:10-65、1:20-65、1:30-65、1:40-65、1:50-65或1:55-65的混合比值包含外周血单核细胞和饲养细胞(例如，Jurkat细胞和EBV-LCL细胞)来执行。在一些实施方式中，可通过在各种混合比值包含外周血单核细胞和饲养细胞(例如，Jurkat细胞和EBV-LCL细胞)进行共培养。在一些实施方式中，用于PBMC(例如，作为CD56+的替代)的比值可为约1:0.5:0.5～1:10:10。在一些实施方式中，对于CD56+细胞：比值乘以例如10或20(例如，CD56+细胞与饲养细胞为1:1-100)。

可在培养基中进行共培养，并且可使用本领域通常用于将外周血单核细胞诱导和增殖为NK细胞的任何合适的培养基，而不受这样的培养基的限制。例如，RPMI-1640、DMEM、x-vivo10、x-vivo20或cellgro SCGM培养基可用作这样的培养基。此外，培养条件(如温度)可遵循本领域已知的外周血单核细胞的任何合适的培养条件。

在一些实施方式中，第一培养步骤可进行0-45、0-42、0-40、0-30、0-20、0-19、0-18、0-17、0-16、0-15或0-14天。

冷冻步骤

可收集从第一培养步骤培养的并提供的自然杀伤细胞并悬浮在培养基中，随后进行冷冻和冻存。在一些实施方式中，培养基可包括FBS和/或DMSO。例如，培养基可包括90％FBS和10％DMSO，或90-95％FBS和5-10％DMSO。在一些实施方式中，可包括其它可接受的低温防腐剂，例如CryoStor溶液(CS10、CS5)等或其它组分例如蔗糖或甘油。在一些实施方式中，合适的防腐剂包括DMSO、甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯烷酮等等。在一些实施方式中，可存在IL-2和/或人血清白蛋白(Human Serum Albumin)。

在一些实施方式中，冻存可包括将提供的自然杀伤细胞转移到具有异丙醇的冻存容器中，在超低冷冻器中的冻存容器中对自然杀伤细胞冷冻过夜，并将自然杀伤细胞保存在-192℃或更低的温度。在一些实施方式中，冷冻的自然杀伤细胞可在-10℃或更低、-20℃或更低、-50℃或更低、-70℃或更低、-100℃或更低、-150℃或更低、-192℃或更低、或-200℃或更低温度冷冻保存。在一些实施方式中，冷冻的自然杀伤细胞可保存一天或更多、2天或更多、3天或更多、7天或更多、14天或更多、30天或更多、60天或更多、或180天或更多(包含任何两个前述值之间的任何范围)。在一些实施方式中，温度为-135℃至-196℃。在一些实施方式中，细胞储存0.5、1、2、3、4或5年，包含任何两个前述值之间的任何范围。

在一些实施方式中，提供的自然杀伤细胞可使用程序降温仪(Controlled RateFreezer)(CRF)冷却和/或冷冻。在一些实施方式中，冷冻的自然杀伤细胞可在液氮下保存。

在一些实施方式中，提供的自然杀伤细胞可使用程序降温仪(CRF)冷却和/或冷冻。在一些实施方式中，这可慢速进行(例如，1-8小时，例如1、2、3、4、5、6、7或8小时或更长)。它也可通过使用异丙醇手动在其中缓慢冷冻。将NK细胞的小瓶放置在低温容器(例如，Nalgene Mr.Frosty)中，并在-70℃下储存过夜。第二天将细胞转移至液氮(LN₂)中。

解冻步骤

冷冻的自然杀伤细胞可在冻存后使用任何合适的方法解冻。在一些实施方式中，冷冻/冻存的自然杀伤细胞可使用水浴解冻，例如在37℃下。在一些实施方式中，冷冻的自然杀伤细胞可解冻一小时或更多、两小时或更多、五小时或更多或十小时。在一些实施方式中，该方法在水浴或珠浴中进行。在一些实施方式中，在从冷冻状态(例如，液氮)取出后尽快或立即进行解冻过程。

在一些实施方式中，冷冻的自然杀伤细胞可在37℃水浴中在10分钟内解冻，其中可摇晃冷冻的小瓶或袋子以加速解冻过程。在一些实施方式中，还可使用仪器(诸如加热板(Heat block)，一种用于小瓶的自动细胞解冻仪(例如，ThawStar,Biocision)，或用于袋子的解冻仪(例如，VIA Thaw,GE healthcare))解冻细胞。

第二培养(第二共培养、第二扩增或再扩增或任何随后的培养步骤)步骤

因为细胞最初在第一培养步骤中用IL-21处理，第二扩增步骤由此成为可能。因此，该方法可包括不仅一个扩增步骤，而是包括两个扩增步骤(例如，一个或多个再扩增步骤)。优选地，第二扩增步骤在样品已冷冻、储存一定时间、然后解冻后发生。

在第二培养步骤期间，解冻的自然杀伤细胞可在一次或多次添加饲养细胞的情况下培养。

在一些实施方式中，饲养细胞可在培养的14天周期(或9-25天周期)期间添加一次或多次。

在一些实施方式中，在14天周期期间一次或多次添加饲养细胞进行培养可不仅表现出优异的增殖和/或抗癌活性，而且在冷冻和解冻后维持持续的细胞生长，使得自然杀伤细胞以供临床应用的足够的量产生。

在一些实施方式中，第二培养步骤可包括添加第二轮细胞因子(例如，除了IL-21之外的额外的IL-21或其它细胞因子)。

在一些实施方式中，第二培养步骤可包括在培养的第0-6天期间，添加随后的一轮或多轮细胞因子。

本文其它地方的细胞因子的任何描述可应用于第二培养步骤的细胞因子。例如，在一些实施方式中，可以以10-1,000、10-500、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100或10-50ng/mL的浓度使用第二细胞因子，和/或可以以50-1,000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-550、100-550、150-550、200-550、250-550、300-550、350-550、400-550或450-550IU/mL的浓度使用额外的细胞因子。用于第二扩增的细胞因子优选为IL-21。

在一些实施方式中，组合物是在再扩增之前的冷冻的细胞的一种，其可包括：IL-2；5-10％DMSO；90-95％FBS；以及NK细胞，其可任选地为CD56+细胞。在一些实施方式中，组合物是冷冻的固体。在一些实施方式中，NK细胞是组合物的细胞群的至少90％。在一些实施方式中，其进一步包含CryoStor溶液。在一些实施方式中，组合物用于再扩增之前的冷冻的细胞。

在一些实施方式中，组合物是在再扩增之前冷冻的细胞的一种，其可包括：IL-2；5-10％DMSO；80-95％Hartman溶液；1-10％人血清白蛋白；和NK细胞。在一些实施方式中，其进一步包含CryoStor溶液。在一些实施方式中，组合物用于在注射之前的冷冻的细胞。

在一些实施方式中，在培养中扩增自然杀伤细胞的方法可包括从血液样品中分离CD56+细胞；在IL-21的存在下，共培养分离的CD56+细胞第一周期；在第一周期后，冷冻共培养的CD56+细胞；解冻冷冻的CD56+细胞；以及在IL-21的存在下，共培养解冻的CD56+细胞第二周期。

在一些实施方式中，该方法还可包括在低于-100℃的温度下储存冷冻的CD56+细胞。在一些实施方式中，冷冻的CD56+细胞可在-10℃或更低、-20℃或更低、-50℃或更低、-70℃或更低、-150℃或更低、-192℃或更低、或-200℃或更低的温度下储存。在一些实施方式中，冷冻的CD56+细胞可在解冻之前储存一天以上。在一些实施方式中，冷冻的CD56+细胞可储存2天或更多天、3天或更多天、7天或更多天、14天或更多天、30天或更多天、60天或更多天或180天或更多天(包含任何两个前述值之间的任何范围)。在一些实施方式中，细胞可冷冻，只要它们在解冻时是能存活的。

在一些实施方式中，分离的CD56+细胞可在冷冻之前共培养13-16天之间。例如，分离的CD56+细胞可在冷冻之前共培养14天或15天。在一些实施方式中，共培养或扩增可视情况进行任何时间。在一些实施方式中，共培养或扩增(包含再扩增)可进行9-25天，例如10-24、11-23、13-22、14-21、14-18、14-16天等。这些时间范围可应用于本文提供的任何扩增和/或再扩增期间(包含针对其它细胞的实施方式)。

在一些实施方式中，可在IL-21的存在下共培养分离的CD56+细胞与一种或多种经辐照的饲养细胞。在一些实施方式中，可在IL-21的存在下共培养解冻的CD56+细胞与一种或多种经辐照的饲养细胞。一种或多种饲养细胞可包括，但不限于选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞、mb15-k562、mb21-k562饲养细胞、HuT78和/或PBMC组成的组中的一种或多种。在一些实施方式中，以PBMC、CD56+和/或CD56+CD3-细胞进行扩增。在一些实施方式中，可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养CD56+细胞。例如，可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:2、1:5、1:10、1:30或1:100的比值共培养CD56+细胞。

在一些实施方式中，可在第一和/或第二周期期间以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。例如，可在第一和/或第二周期期间以20-80ng/mL、30-70ng/mL、或40-60ng/mL的浓度添加IL-21。在一些实施方式中，可在第一和/或第二周期期间不止一次添加IL-21。

在一些实施方式中，在培养中扩增自然杀伤细胞的方法可包括从血液样品中分离CD56+；在IL-21的存在下，共培养CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；冷冻CD56+细胞；解冻冷冻的CD56+细胞；以及扩增解冻的CD56+细胞。

在一些实施方式中，可在低于-100℃的温度下冷冻CD56+细胞。在一些实施方式中，可在-10℃或更低、-20℃或更低、-50℃或更低、-70℃或更低、-150℃或更低、-192℃或更低、或-200℃或更低的温度下冷冻CD56+细胞。在一些实施方式中，冷冻的CD56+细胞可在解冻之前储存达一天以上。在一些实施方式中，冷冻的CD56+细胞可储存2天或更多天、3天或更多天、7天或更多天、14天或更多天、30天或更多天、60天或更多天、或180天或更多天(包含任何两个前述值之间的任何范围)。例如，冷冻的CD56+细胞可储存达一天以上且小于10年的时间段。

在一些实施方式中，CD56+细胞可在冷冻之前共培养13-16天之间。例如，CD56+细胞可在冷冻之前共培养14或15天。在一些实施方式中，共培养或扩增(包含再扩增)可为9-25天，例如10-24、11-23、13-22、14-21、14-18、14-16天等。这些时间范围可应用于本文提供的任何扩增和/或再扩增周期(包含针对其它细胞的实施方式)。

在一些实施方式中，一种或多种饲养细胞可以是选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞和PBMC组成的组中的一种或多种。可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养CD56+细胞。例如，可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:2、1:5、1:10、1:30或1:100的比值共培养CD56+细胞。

在一些实施方式中，可以以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。例如，可以以20-80ng/mL，30-70ng/mL或40-60ng/mL的浓度添加IL-21。在一些实施方式中，可不止一次添加IL-21。

在一些实施方式中，提高自然杀伤细胞的细胞毒性的方法可包括提供所述自然杀伤细胞；冷冻所述自然杀伤细胞；解冻冷冻的自然杀伤细胞；以及在IL-21的存在下，共培养解冻的自然杀伤细胞与一种或多种饲养细胞。

在一些实施方式中，该方法可进一步包括在低于-100℃的温度下储存冷冻的自然杀伤细胞。在一些实施方式中，冷冻的自然杀伤细胞可在-10℃或更低、-20℃或更低、-50℃或更低、-70℃或更低、-150℃或更低、-192℃或更低、或-200℃或更低的温度下储存。在一些实施方式中，冷冻的自然杀伤细胞可在解冻之前储存一天以上。在一些实施方式中，冷冻的自然杀伤细胞可储存2天或更多天、3天或更多天、7天或更多天、14天或更多天、30天或更多天、60天或更多天、或180天或更多天(包含任何两个前述值之间的任何范围)。在一些实施方式中，细胞被储存到只要一旦解冻任何细胞保持存活的尽可能长的时间。

在一些实施方式中，一种或多种饲养细胞可以是选自经由辐照的Jurkat细胞，经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞和PBMC组成的组中的一种或多种。在一些实施方式中，可以以约自然杀伤细胞与饲养细胞1:1-100的比值共培养解冻的自然杀伤细胞。

在一些实施方式中，用于产生自然杀伤细胞的方法可包括重复以下步骤：冷冻步骤；解冻步骤；以及包含与添加的饲养细胞共培养的第二培养步骤。

在一些实施方式中，如图14A所示(在数据曲线上方的线段时间点(bar timepoint))，可应用多于一个的再刺激或再扩增循环。在一些实施方式中，存在第一刺激，随后是细胞培养，随后是冷冻(任选的)，随后是第二刺激(再刺激)，随后是第二细胞培养步骤，随后是冷冻(任选的)，随后是第三刺激(第二再刺激)，随后是另一培养步骤。IL-21可在本文提供的每一个刺激步骤中使用。任选的冷冻步骤可应用于全部细胞或细胞的一部分。在一些实施方式中，存在2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多轮刺激(例如，一轮刺激，然后1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多轮再刺激)。在每个再刺激之后，可存在另外的细胞培养/扩增步骤。在一些实施方式中，每个细胞培养或再扩增可进行9-25天。在每个细胞培养步骤之后可存在冷冻步骤。在一些实施方式中，该过程可以是以下的循环：a)刺激(或再刺激)，随后b)细胞培养，随后是c)冷冻(任选的)，随后是d)解冻(任选的)，可根据需要被重复多次。在一些实施方式中，IL-21的量在10至100ng/mL之间，例如50ng/mL。图14A中的刺激/再刺激表示将IL-21添加到细胞中。

在一些实施方式中，本文提供的任何过程可包括一个或多个冷冻步骤。

在一些实施方式中，本文提供的任何关于NK细胞的实施方式可包括天然NK细胞以及遗传修饰的NK细胞。

治疗癌症的细胞治疗组合物

根据一些实施方式，用于治疗癌症的细胞治疗组合物可包括外周血来源的CD56+NK细胞。细胞将经历至少两轮扩增或是至少两轮扩增的结果，其中至少第一轮扩增存在IL-21。

在本说明书中，术语“外周血来源的”可意味着细胞源自“外周血中的全血”或“使用白细胞去除法从外周血分离的白细胞”。外周血来源的CD56+NK细胞可与外周血单核细胞(PBMC)来源的CD56+NK细胞互换使用。

在一些实施方式中，可以以18-180,000、20-100,000、50-50,000、50-1,000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-550,100-550,150-550,200-550、250-550、300-550、350-550、400-550、450-550IU/mL的浓度使用细胞因子。当在这些范围使用细胞因子时，它可抑制包括在癌症治疗组合物中的NK细胞的凋亡，并增加NK细胞的抗癌活性。

在一些实施方式中，组合物可包括IL-2作为额外的细胞因子(例如，除了IL-21之外)。

在一些实施方式中，CD56+NK细胞可按本文其它地方所描述的获得。例如，CD56+NK细胞可通过与饲养细胞(例如经辐照的Jurkat细胞和经辐照的EBV-LCL细胞)共培养获得。在一些实施方式中，CD56+NK细胞与全细胞(纯的)的比值可以是85％或更多、90％或更多、95％或更多、或98％或更多。

在一些实施方式中，癌症可以是血癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌，肾癌、前列腺癌或神经母细胞瘤，但不限于此。在一些实施方式中，该方法可应用在例如神经退行性疾病和急性感染的同种异体NK细胞疗法。

在一些实施方式中，组合物可不包括T细胞，或者可仅包括痕量的T细胞。例如，组合物中T细胞与全细胞的比值可小于15％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％或更小。

在本说明书中，术语"T细胞"是指源自胸腺的淋巴细胞，其可“记忆”先前遇到的抗原并将信息提供给B细胞，从而促进抗体的产生并在细胞免疫系统中发挥重要作用。由于这些T细胞可区分不同抗原之间的非常小的差异以诱导对同种异体抗原的免疫应答，因此自体疗法是可能的，但是可存在用于同种异体疗法的限制。因此，没有T细胞的细胞治疗组合物可适用于同种异体移植。

在本说明书中，术语"细胞治疗剂"是指通过一系列动作，例如在体外增殖和筛选自体、同种异体和异种活细胞，用于恢复细胞和组织的功能或通过其它方法改变细胞的生物学特性，用于治疗、诊断和预防的药物。从1993年在美国和2002年在韩国，细胞治疗剂已被规定为医疗产品。这些细胞治疗剂可主要分为两个领域，它们是，一，用于组织再生或器官功能恢复的干细胞治疗剂，以及二，用于调节免疫应答的免疫细胞治疗剂，例如在体内抑制免疫应答或增强免疫应答。

本文所述的细胞治疗组合物的施用途径可以是任何合适的途径，只要组合物到达目标组织即可。施用可以是肠胃外施用，例如腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用或皮内施用，但不限于此。

本文所述的细胞治疗组合物可与适合或通常用于细胞疗法的药学上可接受的载体一起以合适的形式配制。“药学上可接受的”是指生理上可接受的组合物，并且当向人体施用时通常不会引起过敏反应，例如胃肠病症、头晕等或与其类似的反应。药学上可接受的载体可包括例如肠胃外施用载体，例如水、合适的油、盐水、葡萄糖水和甘醇(glycol)等等，并且进一步包括稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂包括抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、或抗坏血酸、蔗糖、白蛋白等等。合适的防腐剂包括DMSO、甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯烷酮等等。

细胞治疗组合物也可通过在其中细胞治疗剂能够移动到靶细胞的任何装置施用。

细胞治疗组合物可包括治疗有效量的细胞治疗剂用于治疗疾病。术语"治疗有效量"意指在组织系统、动物或人类中诱导生物或医学反应的活性成分或细胞治疗组合物的量，其被研究人员、兽医、医师或其他临床医生考虑并且包括诱导缓解待治疗的疾病或病症的症状的量。对于本领域技术人员显而易见的是，包含在细胞治疗组合物中的细胞治疗剂可根据期望的效果而改变。因此，本领域技术人员可容易地确定细胞治疗剂的最佳含量，并且可根据各种因素，包括疾病的类型、疾病的严重性、组合物中所包含的其它成分的含量、制剂类型、年龄、体重、一般健康状况、性别、和患者的饮食、施用时间、施用途径、组合物的分泌物比例、治疗周期、以及同时使用的药物进行调节。重要的是包括能够通过考虑所有因素通过最小量获得最大效果而没有副作用的量。例如，细胞治疗组合物可包括每千克体重1×10⁶至5×10⁸个细胞的细胞治疗剂。

在一些实施方式中，细胞治疗组合物的NK细胞与它们的预冷冻的群相比可具有50％或更大、60％或更大、70％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、93％或更大、95％或更大、或98％或更大的细胞毒性。

在一些实施方式中，组合物可包括源自来自患者的外周血单核细胞(PBMC)的有效量的CD56+细胞。CD56+细胞可通过以下步骤来制备：从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)；从PBMC中分离CD56+细胞；在存在一种或多种细胞因子的情况下共培养CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；冷冻CD56+细胞；解冻冷冻的CD56+细胞；以及在存在一种或多种细胞因子的情况下，共培养解冻的CD56+细胞与一种或多种饲养细胞。

在一些实施方式中，CD56+细胞的有效量可以是每千克体重1×10⁶至5×10⁸细胞。

在一些实施方式中，细胞组合物可包括源自来自患者的外周血单核细胞(PBMC)的有效量的CD56+细胞；IL-2；和IL-21。

在一些实施方式中，组合物可包括源自外周血单核细胞(PBMC)的第一CD56+细胞群、冰、IL-2和IL-21；当解冻时，CD56+细胞具有第二CD56+细胞群的细胞毒性的至少80％，其中第二CD56+细胞群尚未被冷冻。在一些实施方式中，细胞毒性为至少85、90、95、96、97、98或99％。

在一些实施方式中，将非冷冻扩增(用和不用IL21、IL21+或IL21-)与冷冻但在第一步骤与IL21+共培养的扩增进行比较，冷冻扩增的平均细胞毒性为非冷冻的97.7％(表C：范围83％-131％)。在一些实施方式中，当将非冷冻扩增(用和不用IL21、IL21+或IL21-)与冷冻但在第一步骤不与IL21+共培养的扩增(IL21--、IL21-+)进行比较，冷冻扩增的平均细胞毒性可为非冷冻扩增的至少81.4％(表D范围61％-83％)。当在冷冻扩增的两个步骤中添加IL21时(IL21++)，平均细胞毒性为非冷冻扩增的114％(表C值98％-131％)。因此，在一些实施方式中，IL21+/+(72％)对IL21-/+(45％)表示当用IL21第一扩增且同样在第二步骤时，细胞毒性比在第一步骤不用IL21的高60％。因此，在一些实施方式中，IL21在第一扩增中的存在允许第二、冷冻后扩增高于60％。对于IL21+/-(62％)对IL21-/-(46.1％)，这意味着当在第一步骤用IL21第一扩增但在第二步骤不用IL21时，细胞毒性可比在第一步骤不用IL21的高至少35％。

在一些实施方式中，细胞毒性是比较非冷冻扩增(用和不用IL21)与冷冻但在第一步骤用IL21+共培养的扩增，其中冷冻扩增的平均细胞毒性为非冷冻的97.7％。在一些实施方式中，细胞毒性是比较非冷冻扩增(用和不用IL21)与冷冻但在第一步骤不用IL21+共培养的扩增，其中冷冻扩增的平均细胞毒性为非冷冻扩增的81.4％。在一些实施方式中，在冷冻之前和之后都添加IL21，并且其中平均细胞毒性为非冷冻扩增的114％。

在一些实施方式中，在共扩增期间初始IL21处理的优异性质允许随后的再扩增可与以下表A-D中的结果一致：

表A：细胞毒性k562％裂解

	10:1	3:1	1:1	0.5:1
					IL21+	95.8	98.8	74.6	53.3
IL21-	94.2	81.4	55.6	37.7
					IL21+/+	98.1	84.9	72.8	42.9
IL21+/-	99.6	83.2	62.2	33.6
					IL21-/+	89.1	81	45.3	31.2
IL21-/-	91.6	77.3	46.1	30.8

表B：第一步骤中具有IL21的比较

10:1

3:1

1:1

0.5:1

AVG

2-步骤冷冻/2-步骤冷冻

IL21++/IL21--

107％

110％

158％

139％

129％

2-步骤冷冻/2-步骤冷冻

IL21++/IL21+-

98％

102％

117％

128％

111％

2-步骤冷冻/2-步骤冷冻

IL21++/IL21-+

110％

105％

161％

138％

128％

2-步骤冷冻/2-步骤冷冻

IL21+-/IL21--

109％

108％

135％

109％

115％

表C：第一步骤中具有IL21的比较

10:1

3:1

1:1

0.5:1

AVG

2-步骤冷冻/1-步骤非冷冻

IL21++/IL21+

102％

86％

98％

80％

92％

2-步骤冷冻/1-步骤非冷冻

IL21++/IL21-

104％

131％

114％

113％

2-步骤冷冻/1-步骤非冷冻

IL21+-/IL21+

104％

84％

83％

63％

84％

2-步骤冷冻/1-步骤非冷冻

IL21+-/IL21-

106％

102％

112％

89％

102％

总均值：

97.7％

表D：第一步骤中不具有IL21的比较

10:1

3:1

1:1

0.5:1

AVG

2-步骤冷冻/1-步骤非冷冻

IL21--/IL21-

97％

95％

83％

82％

89％

2-步骤冷冻/1-步骤非冷冻

IL21--/IL21+

96％

78％

62％

58％

73％

2-步骤冷冻/1-步骤非冷冻

IL21-+/IL21-

95％

100％

81％

83％

90％

2-步骤冷冻/1-步骤非冷冻

IL21-+/IL21+

93％

82％

61％

59％

74％

总均值：

81.4％

在用于培养、扩增(包含再扩增)NK细胞的任何实施方式中，在共培养(培养、扩增(包含再扩增))开始的培养中的外周血单核细胞的数目在1×10⁴至1×10¹⁵细胞的范围内。在一些实施方式中，在共培养开始时培养中的外周血单核细胞的数目在1x10⁴至5x10⁴个细胞、5x10⁴至1x10⁵个细胞、1x10⁵至5x10⁵个细胞、5x10⁵至1x10⁶个细胞、1x10⁶至1x10⁷个细胞、1x10⁷至1x10⁸个细胞、1x10⁸至1x10⁹个细胞、1x10⁹至1x10¹⁰个细胞、1x10¹¹至1x10¹²个细胞、1x10¹²至1x10¹³个细胞、1x10¹³至1x10¹⁴个细胞、或1x10¹⁴至1x10¹⁵个细胞的范围内。在一些实施方式中，在第一或初始扩增开始时培养中的外周血单核细胞的数目在1x10⁴至5x10⁴个细胞、5x10⁴至1x10⁵个细胞、1x10⁵至5x10⁵个细胞、5x10⁵至1x10⁶个细胞、1x10⁶至1x10⁷个细胞、1x10⁷至1x10⁸个细胞、1x10⁸至1x10⁹个细胞、1x10⁹至1x10¹⁰个细胞、1x10¹¹至1x10¹²个细胞、1x10¹²至1x10¹³个细胞、1x10¹³至1x10¹⁴个细胞、或1x10¹⁴至1x10¹⁵个细胞的范围内。在一些实施方式中，在再扩增开始时培养中的外周血单核细胞的数目在1x10⁴至5x10⁴个细胞、5x10⁴至1x10⁵个细胞、1x10⁵至5x10⁵个细胞、5x10⁵至1x10⁶个细胞、1x10⁶至1x10⁷个细胞、1x10⁷至1x10⁸个细胞、1x10⁸至1x10⁹个细胞、1x10⁹至1x10¹⁰个细胞、1x10¹¹至1x10¹²个细胞、1x10¹²至1x10¹³个细胞、1x10¹³至1x10¹⁴个细胞、或1x10¹⁴至1x10¹⁵个细胞的范围内。与常规方法相比，本方法可提供NK细胞更大的扩增。因此，在任何上述实施方式中，在共培养(培养、扩增(包含再扩增))开始时培养中的外周血单核细胞的数目是在常规用于扩增NK细胞的方法(例如，没有细胞因子(例如IL-21和/或IL-2的扩增)中难以使用的细胞数目，从而提供类似数目的NK细胞，例如用于治疗用途和/或冻存。

如本文所公开的，在一些实施方式中，本公开的方法提供适用于治疗用途的NK细胞，例如用于免疫疗法。在一些实施方式中，本公开的方法提供NK细胞的冻存，其随后可被解冻并有效地扩增以用于治疗用途。因此，在用于培养或扩增(包含再扩增)NK细胞的任何实施方式中，扩增NK细胞以产生一种用于治疗用途的扩增的NK细胞群和另一种用于冻存的细胞群。在一些实施方式中，冻存的NK细胞随后解冻并重新扩增以用于治疗用途和/或进一步的冻存。

在用于培养或扩增(包含再扩增)NK细胞的任何实施方式中，在扩增或再扩增结束时NK细胞的数目大于有效用于治疗用途的NK细胞的数目。在一些实施方式中，过量的NK细胞被冻存以供将来使用，例如，将来的解冻、扩增和对有需要的患者的施用。在一些实施方式中，NK细胞扩增或再扩增到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更大的程度，或任何两个前述值之间的范围内的百分比的程度，细胞数目大于治疗(例如，免疫疗法)所使用的NK细胞的数目或待用于治疗(例如，免疫疗法)的细胞数目。

在用于培养或扩增(包含再扩增)NK细胞的任何实施方式中，该方法可包括重复冷冻-解冻-扩增循环。在一些实施方式中，该方法包括重复冷冻-解冻-扩增循环一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次或更多次。

本文还提供了冻存的NK细胞的组合物，其中NK细胞在解冻后保留其生物活性，例如细胞毒性。在一些实施方式中，冻存的NK细胞在解冻和再扩增之后保留其生物活性，例如细胞毒性。在一些实施方式中，冻存的NK细胞的组合物由如本文所公开的用于培养或扩增(包含再扩增)NK细胞的任何方法制备。在一些实施方式中，组合物包含免疫细胞群，其是至少80％、85％、90％、95％、97％或更多的NK细胞。所述组合物可包含合适的冻存培养基。在一些实施方式中，组合物包含二甲基亚砜(DMSO)和血清(例如，FBS、人血清)。在一些实施方式中，组合物包含1-15％、2-15％、5-15％、5-10％或约10％的DMSO。在一些实施方式中，组合物由冻存的免疫细胞群组成或包含冻存的免疫细胞群，其包含至少90％NK细胞、10％DMSO和90％FBS。在一些实施方式中，NK细胞源自从受试者获得的PBMC。在一些实施方式中，组合物由冻存的免疫细胞群组成或包含冻存的免疫细胞群，其包含至少90％NK细胞、5-10％DMSO和90-95％FBS。在一些实施方式中，NK细胞源自从受试者获得的PBMC。在一些实施方式中，其进一步包含CryoStor溶液。

预防或治疗癌症的方法

在一些实施方式中，提供了用于预防或治疗癌症的方法。该方法包括向受试者施用用于抗癌的细胞治疗组合物，其包含外周血来源的CD56+自然杀伤细胞和细胞因子。在一些实施方式中，细胞是在双重扩增过程的结果，其中至少首次扩增是在IL-21的存在下发生。

术语"受试者"是指哺乳动物，所述哺乳动物是用于治疗、观察或测试的受试者，并且优选地是人。受试者可以是患有血癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、前列腺癌或神经母细胞瘤的患者，但不限于此。

在一些实施方式中，就成人来说，可每天施用一次至几次细胞治疗组合物。细胞治疗组合物可每天施用或以2-180天的间隔施用。组合物中包含的细胞治疗剂可包含1x10⁶至1x10¹¹外周血来源的CD56+自然杀伤细胞，例如每千克体重约1x10⁶至1x10⁸NK细胞。在一些实施方式中，细胞治疗组合物中的外周血来源的CD56+自然杀伤细胞至少为约90％纯度。在一些实施方式中，细胞因子为浓度范围为约50–50,000IU/mL的IL-2。

在一些实施方式中，细胞治疗组合物可与适合或通常用于细胞疗法的药学上可接受的载体一起以合适的形式配制。“药学上可接受的”是指生理上可接受的，并且当向人体施用时通常不会引起过敏反应，例如胃肠病症、头晕等或与其类似反应的组合物。药学上可接受的载体可包括例如肠胃外施用载体，例如水、合适的油、盐水、葡萄糖水、甘醇、碱性化合物如Hartman溶液，或替代品如生理盐水溶液、勃脉力A(plasmalyte A)等等，并且进一步包括稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂包括抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、或抗坏血酸、蔗糖、白蛋白、人血清白蛋白等等。合适的防腐剂包括DMSO、甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯烷酮等等。

在一些实施方式中，细胞治疗组合物可通过任何合适的方法施用，例如通过直肠、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、胸骨内、经皮、局部、眼内或皮内途径施用。在一些实施方式中，包含在组合物中的NK细胞可以是同种异体的，即不同于正被治疗的受试者的人获得。在一些实施方式中，人可以是正常人或癌症患者。在一些实施方式中，包含在组合物中的NK细胞可以是自体的，即从正被治疗的受试者获得。

在一些实施方式中，本文公开的NK细胞和包含本文公开的NK细胞的细胞治疗组合物可用于治疗除了癌症之外的疾病或病症。据报道，NK细胞在免疫系统的调节中起重要作用，例如，通过调节T细胞，因此可施用具有NK细胞的细胞治疗组合物以治疗与免疫系统相关的病症。例如，可施用细胞治疗组合物以治疗神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病和帕金森病)或自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、脊柱关节病、SLE、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、系统性硬化)。

在一些实施方式中，治疗受试者的方法可包括从受试者收集CD56+细胞；在IL-21的存在下，共培养CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；冷冻共培养的CD56+细胞至少一天；解冻冷冻的CD56+细胞；扩增解冻的CD56+细胞；以及向受试者施用扩增的CD56+细胞，其中来自第二扩增的细胞的细胞毒性为在冷冻之前共培养的CD56+的细胞毒性的至少80％(例如，至少80、85、90、95或97％)。

在一些实施方式中，该方法还可进一步包括在低于-100℃的温度下储存冷冻的CD56+细胞。在一些实施方式中，冷冻的CD56+细胞可在-10℃或更低、-20℃或更低、-50℃或更低、-70℃或更低、-150℃或更低、-192℃或更低、或-200℃或更低的温度下储存。在一些实施方式中，冷冻的CD56+细胞可在解冻之前储存一天以上。在一些实施方式中，冷冻的CD56+细胞可储存2天或更多天、3天或更多天、7天或更多天、14天或更多天、30天或更多天、60天或更多天、或180天或更多天，包含任何两个前述值之间的任何范围。

在一些实施方式中，CD56+细胞可在冷冻之前共培养13-16天之间。例如，CD56+细胞可在冷冻之前共培养达14天或15天。在一些实施方式中，共培养或扩增(包含再扩增)可以是9-25天，例如10-24、11-23、13-22、14-21、14-18、14-16天等。这些时间范围可应用于本文提供的任何扩增和/或再扩增周期(包含对于其它细胞的实施方式)。

在一些实施方式中，扩增解冻的CD56+细胞包括在IL-21的存在下，共培养解冻的CD56+与一种或多种经辐照的饲养细胞。一种或多种饲养细胞是选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞和PBMC组成的组中的一种或多种。在一些实施方式中，可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养CD56+细胞。例如，可以以CD56+细胞与饲养细胞约1:2、1:5、1:10、1:30或1:100的比值共培养CD56+细胞。

在一些实施方式中，可在第一和/或第二周期期间以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。例如，可在第一和/或第二周期期间以20-80ng/mL、30-70ng/mL或40-60ng/mL的浓度添加IL-21。在一些实施方式中，可在第一和/或第二周期期间不止一次添加IL-21。

在一些实施方式中，IL-21是用于人NK细胞的人IL-21。

本文提供的一些实施方式包括如下特征和优点：

(a)产生自然杀伤细胞的方法；

(b)由于自然杀伤细胞甚至在冻存后以供临床应用的足够的量产生，因此，可增强预防和治疗癌症特别是使用自然杀伤细胞的同种异体疗法的效果。

(c)两次扩增所得的细胞的细胞毒性(至少第一次用IL-21，以及任选地第二次扩增也用IL-21)令人惊讶地优于不用IL-21扩增的细胞(一倍，甚至大于两倍)。在一些实施方式中，细胞位于1-50mL低温瓶或10-100mL低温袋中。

实施例

提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方式。这些实施例不应被解释为将本公开限制于所描述的特定特征或实施方式。

在用或不用IL-21处理的情况下使用LCL+KL-1型饲养细胞进行高纯度NK细胞制备方法的对比试验。本实施例中讨论的任何其它饲养细胞作为预示性实施例(propheticexample)提供。

验证IL-21在两种制备方法中的有效性：1)原始方法，其涉及经或不经IL-21处理(但没有随后的再扩增)以不同类型的饲养细胞培养分离的CD56+细胞14-17天。2)再刺激方法，其涉及经IL-21处理或不经IL-21处理以不同类型的饲养细胞培养来自原始方法的冻存的扩增的NK细胞。不同类型的饲养细胞和制备方法在表1和图1中示出，并且被理解为通常用于NK细胞扩增的饲养细胞的代表。

表1.NK细胞培养的饲养细胞类型和过程

应理解，本实施例提供的结果是通常跨越一系列比值的饲养细胞、储存时间和额外的成分(例如额外的细胞因子)，只要存在IL-21的代表。

实施例1：起始材料的分离和原始方法

从人血中获得外周血单核细胞(PBMC)。分离的PBMC用于CD56+细胞选择。以1.077g/mL Ficoll的密度梯度离心分离PBMC，用PBS洗涤数次，并用含CD56微珠试剂的AutoMACS冲洗溶液(Miltenyi Biotec，德国)重悬。CD56+细胞通过使用磁激活细胞分选(MACS)系统根据制造商的说明(Miltenyi Biotec，Germany)来选择。将CD56+选择的细胞重悬于含有或不含有50ng/mL IL-21的初始NK细胞培养基中。在添加100Gy经辐照的饲养细胞、LCL+KL-1、K562或PBMC之后，将悬浮细胞接种于培养瓶中，然后在37℃在5％CO₂中培养6或7天。以每种饲养细胞类型进行细胞培养的具体条件如下表所示。

表2.NK细胞扩增的培养条件

参考：Immune Netw.2018Aug；18(4):e31

在培养的第6或7天，通过离心从培养瓶中收集细胞，并评估细胞数目。用NK细胞培养基重悬细胞，接种于培养袋中，然后在37℃、在5％CO₂中中培养达至17或18天。每3天或4天，用新培养基对细胞进行继代培养(sub-cultured)。

实施例2：D14细胞的冻存

在培养的第14或15天，通过离心从培养袋中收获细胞并评估细胞数目。将细胞重悬于含有90％FBS、10％DMSO、含有或不含有500IU/mL IL-2的培养基中，以5.0-10.0×10⁶细胞/mL的浓度等分到小瓶中，然后在-196℃液氮罐中冻存细胞1周、1个月、3个月、6个月、12个月、24个月和更长时间。

实施例3：再刺激方法的冷冻细胞解冻和细胞培养

将来自原始方法的冻存的细胞在37℃水浴中解冻，并重悬在初始NK细胞培养基中，其在有或没有50ng/mL IL-21的情况下对每种饲养细胞条件包含补充物。在添加100Gy经辐照的饲养细胞、LCL+KL-1、K562或自体PBMC后，将悬浮细胞接种于培养瓶中，然后在37℃、在5％CO₂中培养6或7天。该过程被称为再刺激方法。在培养的第6或7天，通过离心从培养瓶中收集细胞，并评估细胞数目。将细胞用NK细胞培养基重悬，接种于培养袋中，然后在37℃、在5％CO₂中培养达至17或18天。每3天或4天，用新培养基对细胞进行继代培养。从原始方法D0到通过再刺激过程的最终收获，总细胞培养周期为31-33天。

实施例4：群体倍增水平和细胞生长

基于如图1和表3所示的实验设计，使用CD56+细胞进行根据六种不同条件的NK细胞培养。其显示了实验设计类型1的结果，为NK细胞与作为饲养细胞的经辐照的LCL和KL-1共培养。该过程的具体条件如表3所示。

表3培养条件

ID	第一步骤扩增	扩增的NK细胞冻存后的再扩增
			IL21+.	(+)IL-21	N/A
类型1.IL21+/+	(+)IL-21	(+)IL-21
			类型1.IL21+/-	(+)IL-21	(-)IL-21
IL21-.	(-)IL-21	N/A
			类型1.IL21-/+	(-)IL-21	(+)IL-21
类型1.IL21-/-	(-)IL-21	(-)IL-21

NK细胞的细胞扩增速率通过相对于接种的细胞数目的扩增倍数和在每个继代培养日的群体倍增水平(PDL)来评估，计算为3.32(log N-log No)，其中N是每代结束时的细胞数目，且No是最初铺平板的(plated)细胞数目。每个培养步骤的NK细胞数目通过用台盼蓝染色细胞来评估。

比较来自两种不同供体的生产批次的PDL和扩增倍数。如表4、5和图2A-3B所示，相比不用IL-21，通过用IL-21的原始方法来自一个供体的NK细胞的PDL和扩增倍数显示出高的生长速率。但是，来自另一供体的批次显示在两种条件下类似的生长速率。

表4原始方法的PDL

表5原始方法的扩增倍数

来自原始方法在D14的冻存的细胞通过或不通过IL-21处理用饲养细胞再刺激，并培养达至17或18天。从原始方法D0到通过再刺激过程的最终收获，总细胞培养周期为31-33天(如图1所示)。

比较来自两种供体的几个生产批次的PDL和扩增倍数。如表6、7和图4A-5B所示，用IL-21的再刺激方法的NK细胞的PDL和扩增倍数提供了比不用IL-21条件的更高的生长速率。因此，IL-21，特别是在第一轮扩增中，在允许更有效的后续扩增步骤方面是非常有用的。

来自供体2的NK细胞证明原始方法中用和不用IL-21的生长速率没有差异，但是在第31天，通过再刺激方法在IL-21条件下的生长速率显示出高于不用IL-21条件的生长速率。

表6再刺激方法的PDL

表7再刺激方法的扩增倍数

实施例5：NK细胞的纯度

已知NK细胞表达CD56且缺少CD3。为了研究通过原始和再刺激方法在扩增之前和在扩增之后的NK细胞的纯度，应用流式细胞术分析。将NK细胞用抗-CD56-FITC和抗-CD3-PE的荧光染料标记的抗体染色，然后通过使用流式细胞术进行分析。

随着在两种条件(用或不用IL-21处理)下通过原始和再刺激方法进行的NK细胞培养，NK细胞(CD56+CD3-)在来自2种不同供体的扩增的NK细胞中的比例迅速提高，其中在第31天超过99％(表7)。其它细胞类型的细胞表面标志物，如CD3+、CD20+和CD14+在最后培养阶段显示为非常低的群体(表8)。

表8.培养-扩增的NK细胞上的NK细胞标志物的表达(CD3-CD56+)模式

表9.在培养-扩增的NK细胞上的其它细胞标志物的表达(CD3、CD20、CD14)模式

实施例6NK细胞的细胞毒性功能

通过荧光细胞毒性试验评估NK细胞对肿瘤靶细胞系的细胞毒性。将NK细胞与K-562细胞共培养，K-562细胞在光保护下、以为10:1、3:1、1:1和0.5:1的E:T比值用钙黄绿素AM染色4小时。将含有10％FBS或2％triton X100的RPMI1640添加到靶细胞以提供自发和最大释放。对于钙黄绿素释放分析，回收NK细胞与靶细胞孵育后的上清液，并使用SpectraMaxM2酶标仪(Molecular devices,San Jose，加拿大)评估其荧光。使用公式[(测定的释放-自发的释放)/(最大释放-自发释放)]x100计算特异性裂解的百分比。

使用是NK敏感的靶标的标准K-562细胞系测定通过原始和再刺激方法培养的NK细胞的细胞毒性。即使在低E:T比值(1:1和0.5:1)，来自原始方法的用和不用IL-21条件的扩增的细胞对K-562施加强烈的细胞毒性活性(图6-7)。但是，通过再刺激方法获得的NK细胞的细胞毒性活性在用和不用IL-21处理的不同条件下显示出不同的水平。而与其它条件相比，对于原始和再刺激方法，通过IL-21处理的NK细胞施加更强的细胞毒性活性(图8-11)。

但是，对于原始和再刺激条件二者通过非IL-21处理条件的NK细胞以0.05:1至3:1的E：T比值具有降低的细胞毒性活性。并且，在E:T比值为10:1时显示比IL-21处理条件更低的细胞毒性水平。

用IL-21处理的扩增的NK细胞显示出针对K-562细胞系的高度有效的细胞毒性，在由原始和再刺激方法制备的NK细胞二者中具有类似的细胞毒性(图6-11)。图6显示了用IL-21(IL-21+)扩增的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。图7显示了不用IL-21(IL-21-)扩增的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。图8显示了用IL-21扩增并且用IL-21(IL-21+/+)再刺激的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。图9显示了用IL-21扩增并且不用IL-21(IL-21+/-)再刺激的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。图10显示了不用IL-21扩增并且用IL-21(IL-21-/+)再刺激的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。图11显示了不用IL-21扩增并且不用IL-21(IL-21-/-)再刺激的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性。图12A显示NK细胞激活受体的表型比较。图12B显示NK细胞抑制和趋化因子受体的表型比较。

表面标志物表达

NK细胞功能通过在其表面上表达的激活性和抑制性受体之间的平衡来微调。为了表型上表征激活性[CD16、NKp30、NKp46、NKp44、NKG2D、2B4(CD244)、NKG2C、CRACC]或抑制性NK受体[NKG2A、KIR:CD158a(KIR2DL1)、CD158b(KIR2DL2/L3)、CD158e(KIR3DL1)]，在扩增之前(第0天；D0)和在通过原始(老的)过程以及用IL-21处理的再刺激过程扩增17-18天后分析了门控CD56+NK细胞的趋化因子受体(CXCR3、CXCR4)或粘附分子(CD62L)。将表面受体表达水平计算为样品中NK细胞的受体阳性子集的百分比。原始和再刺激过程的每个阶段的NK细胞用每个标志物的荧光染料标记的抗体进行染色，然后通过使用流式细胞术进行分析。

表面受体表达水平已经分析了来自起始和最终阶段(D0、D17和D32)的细胞，所述细胞已通过对于4个不同供体的类型1实验中原始和用IL-21处理的再刺激过程进行培养。表面受体表达水平计算为样品中NK细胞的受体阳性子集的百分比。

在激活性受体中，CD16、NKp30、NKp46、NKp44、NKG2D和CRACC的表达水平在通过原始过程(老的)制备的NK细胞的扩增期间提高，并且与通过再刺激过程(新的)扩增的NK细胞类似，而NKG2C和2B4的表达水平在通过两种方法培养扩增之后没有改变(图6)。抑制性受体CD158a和CD158e的表达在通过两种过程(老的和新的)培养时很大程度上保持不变，而NKG2A和CD158b的比例显著增加(图12A-B)。分析的所有抑制性受体表达水平在通过两种方法制备的NK细胞上类似。还评估了趋化因子受体如CXCR3和CXCR4的表达。

CXCR3+NK细胞的频率在通过具有类似表达水平的两种方法(老的和新的)的NK细胞扩增期间显著增加，而CXCR4+NK细胞的频率在通过两种方法培养扩增后降低，其中通过新方法制备的NK细胞具有略微更大的降低(图12A-B)。通过两种方法扩增的NK细胞的CD62L的表达水平略微增加。

如这些结果所证实的，IL21+和IL21+/+扩增的细胞的性质类似，尽管事实上一组已经历了再扩增程序。

实施例7：IL-21浓度

对于各种IL-21浓度，将分离的CD56+细胞重悬于RPMI培养基中含有10％FBS、500IU/mL IL-2、20μg/mL庆大霉素的初始NK细胞培养基中，其中含有10、30、50和100ng/mLIL-21的类型1实验设计(仅IL21+，不进行再刺激)。

实施例8：IL-21浓度

类型1实验通过以1:10:10(CD56+细胞：LCL：KL-1)和1:20:20、1:30:30(仅IL21+，不进行再刺激)的不同比值的饲养细胞进行。

实施例9

该非限制性实施例显示IL-21增强CD56+和CD3-/CD56+NK细胞以冷冻-解冻的扩增。

(1)CD56+自然杀伤细胞(NK细胞)的制备-1

首先，使用Ficoll密度梯度(Ficoll-Hypaque密度梯度法)分离血PBMC。根据以下1-1或1-2进一步处理PBMC。

1-1 CD56+细胞分离

通过添加MACS缓冲液(1x PBS+0.5％HSA)悬浮PBMC，并添加CD56微珠(MiltenyiBiotec)以每1.0×10⁷PBMC获得1-20μL，且在2-8℃孵育5-30分钟。孵育后，添加MACS缓冲液并混合，并且将混合物离心(600xg)以沉淀细胞。离心后，除去上清液，并且添加MACS缓冲液重悬细胞，并将细胞添加到与柱偶联的MACS分离器中。将MACS缓冲液通过柱以去除非特异性结合。将柱与MACS分离器分离并转移至15mL锥形管中，并添加MACS缓冲液以分离粘附到柱的CD56+细胞。

1-2 CD3-/CD56+细胞分离

如下分离CD3-/CD56+细胞。通过添加MACS缓冲液(1x PBS+0.5％HSA)悬浮PBMC，并添加CD3微珠(Miltenyi Biotec)以每1.0×10⁷PBMC获得1-20μL，且在2-8℃孵育5-30分钟。孵育后，添加MACS缓冲液并混合，并且将混合物离心(600xg)以沉淀细胞。离心后，除去上清液，并且添加MACS缓冲液重悬细胞，并将细胞添加到与柱偶联的MACS分离器中。将MACS缓冲液通过柱以回收CD3-细胞。

将MACS缓冲液(1x PBS+0.5％HSA)添加到回收的CD3-细胞中以重悬CD3-细胞，并添加CD56微珠(Miltenyi Biotec)以每1.0×10⁷CD3-细胞获得1-20μL，且在2℃至8℃孵育5至30分钟。孵育后，添加MACS缓冲液并混合，并且将混合物离心(600xg)以沉淀细胞。离心后，除去上清液，并添加MACS缓冲液重悬细胞，并将细胞添加到与柱偶联的MACS分离器中。将MACS缓冲液通过柱以去除非特异性结合。将柱与MACS分离器分离并转移至15mL锥形管中，并添加MACS缓冲液以分离粘附到柱的CD3-/CD56+细胞。

1-3初级培养

将获自1-1和1-2的分离的CD56+细胞或CD3-/CD56+细胞各自在培养箱中与饲养细胞(Jurkat细胞和EBV-LCL细胞)共培养，其中饲养细胞(Jurkat细胞和EBV-LCL细胞)在37℃、5％CO₂下，在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中，用浓度分别为500IU/mL和50ng/mL的IL-2和IL-21或在浓度分别为500IU/mL和50ng/mL的IL-2和IL-21的存在下通过100Gy辐照先前制备。

在第6天，将细胞以1.0x10⁵-2.0x10⁶/mL接种于350mL标准袋中并培养额外4天，并且在第10天，将细胞以1.0x10⁵-2.0x10⁶细胞/mL接种于1L袋中，并培养另外4天。此时，在孵育期间，比值(CD56+细胞或CD3-/CD56+细胞)：(Jurkat细胞)：(EBV-LCL细胞)为1:30:30。

1-4.冷冻和解冻后的第二培养

在培养1(1-3)的第十四天，将培养的细胞悬浮在含有90％FBS和10％DMSO的溶液中，在-192℃或更低的温度下冷冻储存，并根据培养计划在37℃恒温水浴中解冻。

然后向含有10％FBS的RPMI-1640中添加浓度分别为500IU/mL和50ng/mL的IL-2和IL-21，以及100Gy辐照的饲养细胞(Jurkat细胞和EBV-LCL细胞)。放入培养基中后，在37℃、5％CO₂的培养箱中共培养。

在解冻和培养后第6天，将细胞接种于350mL袋中(以1.0x10⁵-2.0x10⁶细胞/mL，并孵育额外四天，并在第10天将细胞以1.0x10⁵-2.0x10⁶细胞/mL接种于1L标准袋中，并进一步培养4天)。

为了维持培养中细胞的生长直至解冻后第14天，在浓度分别为500IU/mL和50ng/mL的IL-2和IL-21的存在下，将细胞与100Gy辐照的饲养细胞(Jurkat细胞和EBV-LCL细胞)共培养。在含有10％添加的FBS的RPMI-1640培养基中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养细胞。

解冻后第20天，将细胞以1.0x10⁵-2.0x10⁶细胞/mL接种于1L袋中，然后额外培养4天，在解冻后培养的第24天，将细胞以1.0x10⁵-2.0x10⁶细胞/mL接种于1L袋中，并进一步培养4天。

最后，在解冻后培养的第28天，将细胞以1.0x10⁵-2.0x10⁶细胞/mL接种于1L袋中，随后进行3-6天的额外培养。此时，(CD56+细胞或CD3-/CD56+细胞)：(Jurkat细胞)：(EBV-LCL细胞)以1:30:30的比值培养。

(2)CD56+自然杀伤细胞的制备-2

除在1-4中添加细胞因子的步骤外，以与(1)相同的方式制备自然杀伤细胞。

(3)比较实施例。排除细胞因子处理步骤的自然杀伤细胞的制备

除在1-3和1-4中添加细胞因子(IL-21)的步骤外，以与(1)相同的方式制备自然杀伤细胞。

(4)NK细胞增殖能力的确认

测定了通过(l)-(3)的方法培养的NK细胞的增殖能力。如图13A所示，当原始培养没有细胞因子处理时(IL-21-/-；如上(3)所示)，我们发现冷冻和解冻过程后并没有产生供临床应用的足够数目的NK细胞(图13A)。另一方面，当细胞用细胞因子处理后(IL-21+/+；如上(1)所示)，即使在冷冻和解冻过程后，也能产生供临床应用的足够数目的NK细胞，并且这些结果并不仅仅是在冷冻和解冻过程后当细胞因子处理时。在冷冻和解冻后细胞未使用细胞因子处理的情况下(IL-21+/-；如上(2)所示)，NK细胞扩增以及在冷冻和解冻后使用细胞因子处理NK细胞(图13B)。

实施例10

在图14A和14B中示出了各种扩增和冷冻和再冷冻过程的一些实施方式的进一步结果。图14A示出了所得的PDL(群体倍增水平)，并且描述了在扩增期间的不同时期的一些实施方式。图14B描述了该实施例所得的扩增倍数。

该实施例分析NK细胞是否可在至少冷冻一次后能被刺激或扩增多倍，以及NK细胞的增殖是否可停止和重启，而不是简单地维持。首先培养NK细胞14天。在第一个六天周期(第0-6天)期间，用IL-21(50ng/mL)和饲养细胞处理两次NK细胞，间隔为3天。

在该第一个14天-扩增后，将细胞冷冻90天，然后解冻，以培养另外的14天。在该第二扩增的第一个六天周期(第0-6天)期间，用IL-21(50ng/mL)和饲养细胞处理NK细胞两次，间隔为3天。

最后，在该第二扩增的第一个六天周期期间(第0-6天)，通过第三次用IL-21(50ng/mL)和饲养细胞进行两次再刺激，间隔3天，；再培养细胞18天。

在46天的培养中监测NK细胞的扩增。如图14A和14B所示，当用饲养细胞和IL-21处理两次或更多次时，即使在细胞被冷冻后，NK细胞在每次刺激后表现出显著的扩增。

术语

仅出于说明和描述的目的已经呈现了示例性实施例的前述描述，并且不旨在穷举或将本发明限制为所公开的精确形式。鉴于上述教导，许多修改和变化是可能的。可预期的是，以上公开的实施方式的特定特征和方面的各种组合或子组合可被做出并且仍然落入本发明的一种或多种实施方式内。此外，本文中结合实施方式的任何特定特征、方面、方法、属性、特性、质量、特质、元素等的公开可在本文阐述的所有其它实施方式中使用。因此，应当理解，所公开的实施方式的各种特征和方面可彼此组合或替换，以形成所公开的发明的变化模式。因此，本文中公开的本发明的范围旨在不受上述特定公开的实施方式的限制。此外，虽然本发明可进行各种修改和替代形式，但是它的具体实施例已经在附图中示出并在本文中进行了详细描述。然而，应当理解，本发明不限于所公开的特定形式或方法，而是相反，本发明旨在涵盖所有落入所描述的各种实施方式和所附的权利要求的精神和范围内的修改、等同物以及替代物。本文公开的任何方法不需要以所述的顺序执行。本文公开的方法包括从业者采取的某些动作；然而，它们还可包括那些动作的任何第三方指令，无论是明确的还是暗示的。本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及其组合。

选择和描述的实施方式是为了解释本发明的原理及其实际应用，以便激发本领域其他技术人员来利用本发明和各种实施例，并且考虑适于特定用途的各种修改。替代实施方式对于本领域技术人员将变得显而易见，本发明由所附的权利要求限定而不是前面的描述和其中描述的示例性实施方式。

除非另有特别说明或在所使用的上下文中另外理解，否则条件语言例如，“能”、“会”、“可能”、“可”通常旨在传达某些实施方式包括而其它实施例不包括某些特征、元素和/或步骤。因此，这样的条件语言通常不旨在暗示对于一种或多种实施方式以任何方式特征、元素和/或步骤是必须的。

术语"包括"、"包含"、"具有"等是同义的，并且以开放的方式包含地使用，且不排除额外的元素、特征、动作、操作等。此外，术语"或"在其包含性意义(而不是其排他性意义)中使用，使得当例如用于连接元素列表时，术语"或"意指列表中的元素中的一个、一些或全部。

本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围以及它们的组合。例如“达至”、“至少”、“大于”、“少于”、“在……之间”等语言包括所述的数值。

跟随术语例如本文中所使用的“大约”、“约”和“基本上”的数值包括所述的数值(例如，大约10％＝10％)，并且还表示接近所述量的量，所述量仍然执行期望的功能或实现期望的结果。例如，术语"大约"、"约"和"基本上"可指在小于所述量10％内、在小于所述量5％内、在小于所述量1％内、在小于所述量0.1％内、以及在小于所述量0.01％内的量。

本文所用的术语"通常"表示主要包括或趋向于特定值、量或特性的值、量或特性。作为示例，在某些实施方式中，术语"大致均匀"是指相比于(depart from)完全均匀，小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.1％和小于0.01％的值、量或特性。

本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围以及它们的组合。例如“达至”、“至少”、“大于”、“小于”、“在……之间”等语言包括所述的数值。跟随术语例如“约”或“大约”的数值包括所述的数值。例如，“大约5.0cm”包括“5.0cm”。

已经结合示意图描述了一些实施方式。然而，应当理解，示意图未按比例绘制。距离仅仅是说明性的，并且不一定与所示装置的实际尺寸和布局具有确切关系。

出于本公开的目的，本文描述了某些方面、优点和新颖特征。应当理解，根据任何特定的实施方式不一定实现所有这些优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，本公开可以以实现如本文教导的一个优点或一组优点的方式实施或执行，而不必实现如本文所教导或建议的其它优点。

此外，虽然本文已经描述了示例性实施例，但是本领域技术人员基于本公开将理解具有等同元素、修改、省略、组合(例如，跨各种实施方式的方面的组合)、改编和/或改变的任何和所有实施方式的范围是可以理解的。权利要求中的限制应被基于权利要求中使用的语言广义地解读，并且不限于在本说明书中描述的或在本申请的审查期间所描述的示例，这些示例将被解释为非排他性的。此外，所公开的过程和方法的动作可以以任何方式修改，包括通过重新排序动作和/或插入额外的动作和/或删除动作。因此，意图是说明书和实施例仅被认为是说明性的，真正的范围和精神由权利要求及其等同物的全部范围来表明。

Claims

1.一种在培养中扩增自然杀伤细胞的方法，其包括：

从血液样品中分离CD56+细胞；

在IL-21的存在下，共培养分离的CD56+细胞第一周期；

在所述第一周期后，冷冻共培养的CD56+细胞；

解冻冷冻的CD56+细胞；以及

在IL-21的存在下，共培养解冻的CD56+细胞第二周期。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在低于-100℃的温度下储存所述冷冻的CD56+细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括在解冻之前储存所述冷冻的CD56+细胞一天以上。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在冷冻之前共培养所述分离的CD56+细胞13-16天之间。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在IL-21的存在下，共培养所述分离的CD56+细胞与一种或多种经辐照的饲养细胞。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在IL-21的存在下，共培养所述解冻的CD56+细胞与一种或多种经辐照的饲养细胞。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中一种或多种饲养细胞是选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞和PBMC组成的组中的一种或多种。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中以CD56+细胞与所述饲养细胞约1:1-100的比值共培养所述CD56+细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其中以CD56+细胞与饲养细胞约1:2的比值共培养所述CD56+细胞。

10.根据权利要求8所述的方法，其中以CD56+细胞与饲养细胞约1:5至1:30的比值共培养所述CD56+细胞。

11.根据权利要求8所述的方法，其中以CD56+细胞与饲养细胞约1:10的比值共培养所述CD56+细胞。

12.根据权利要求8所述的方法，其中以CD56+细胞与饲养细胞约1:30的比值共培养所述CD56+细胞。

13.根据权利要求8所述的方法，其中以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养所述CD56+细胞。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在第一和/或第二周期期间以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在第一和/或第二周期期间以20-80ng/mL的浓度添加IL-21。

16.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在第一和/或第二周期期间以30-70ng/mL的浓度添加IL-21。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在第一和/或第二周期期间不止一次添加IL-21。

18.一种在培养中扩增自然杀伤细胞的方法，其包括：

从血液样品中分离CD56+；

在IL-21的存在下，共培养所述CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；

冷冻所述CD56+细胞；

解冻冷冻的CD56+细胞；以及

扩增解冻的CD56+细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，其中在低于-100℃的温度下冷冻所述CD56+细胞。

20.根据权利要求18或19所述的方法，进一步包括储存所述冷冻的CD56+细胞一天以上且10年以下的时间段。

21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中在冷冻之前共培养所述CD56+细胞13-16天之间。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中一种或多种饲养细胞是选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞和PBMC组成的组中的一种或多种。

23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养所述CD56+细胞。

24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。

25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中，不止一次添加IL-21。

26.一种提高自然杀伤细胞的细胞毒性的方法，其包括：

提供所述自然杀伤细胞；

冷冻所述自然杀伤细胞；

解冻冷冻的自然杀伤细胞；以及

在IL-21的存在下，共培养解冻的自然杀伤细胞与一种或多种饲养细胞。

27.根据权利要求26所述的方法，进一步包括在低于-100℃的温度下储存冷冻的自然杀伤细胞。

28.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，进一步包括在解冻之前储存冷冻的自然杀伤细胞一天以上。

29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中一种或多种饲养细胞是选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞和PBMC组成的组中的一种或多种。

30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养解冻的自然杀伤细胞。

31.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。

32.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中，不止一次添加IL-21。

33.一种治疗受试者的方法，其包括：

从所述受试者收集CD56+细胞；

冷冻共培养的CD56+细胞至少一天；

解冻冷冻的CD56+细胞；

扩增解冻的CD56+细胞；以及

向所述受试者施用扩增的CD56+细胞，其中来自第二扩增的细胞的细胞毒性为在冷冻之前共培养的CD56+细胞的细胞毒性的至少80％。

34.根据权利要求33所述的方法，进一步包括在低于-100℃的温度下储存冷冻的CD56+细胞。

35.根据权利要求33或34所述的方法，进一步包括在解冻之前储存冷冻的CD56+细胞一天以上。

36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中在冷冻之前共培养分离的CD56+细胞13-16天之间。

37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中扩增解冻的CD56+细胞包括在IL-21的存在下，共培养解冻的CD56+与一种或多种经辐照的饲养细胞。

38.根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中一种或多种饲养细胞是选自由经辐照的Jurkat细胞、经辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞、K562细胞和PBMC组成的组中的一种或多种。

39.根据权利要求33-38中任一项所述的方法，其中以CD56+细胞与饲养细胞约1:1-100的比值共培养所述CD56+细胞。

40.根据权利要求33-39中任一项所述的方法，其中在第一和/或第二周期期间以10-100ng/mL的浓度添加IL-21。

41.根据权利要求33-40中任一项所述的方法，其中在第一周期和/或第二周期期间不止一次添加IL-21。

42.一种组合物，其包括：

有效量的源自患者的外周血单核细胞(PBMC)的CD56+细胞，其中所述CD56+细胞通过如下制备：

从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)；

从PBMC中分离CD56+细胞；

在一种或多种细胞因子的存在下，共培养所述CD56+细胞与一种或多种饲养细胞；

冷冻所述CD56+细胞；

解冻冷冻的CD56+细胞；以及

在一种或多种细胞因子的存在下，共培养解冻的CD56+细胞与一种或多种饲养细胞。

43.一种细胞组合物，其包括：

有效量的源自患者的外周血单核细胞(PBMC)的CD56+细胞；

IL-2；和

IL-21。

44.一种组合物，其包括：

源自外周血单核细胞(PBMC)的第一CD56+细胞群；

冰；

IL-2；和

IL-21；

其中，当解冻时，所述CD56+细胞具有第二CD56+细胞群的至少80％的细胞毒性，其中所述第二CD56+细胞群尚未被冷冻。

45.一种在培养中扩增自然杀伤细胞的方法，其包括：

提供PBMC；

在IL-21的存在下，共培养所述PBMC第一周期；

在所述第一周期之后冷冻共培养的PBMC；

解冻冷冻的PBMC；以及

在IL-21的存在下，共培养解冻的PBMC第二周期。

46.根据权利要求45的方法，其中PBMC与饲养细胞的比值为1:0.5:0.5。

47.根据权利要求2-17中任一项所述的方法，但是从属于权利要求45，而不是权利要求1。

48.根据权利要求33所述的方法，进一步包括在准备用于注射的溶液中冷冻。

49.根据权利要求33或34所述的方法，其中细胞毒性是将非冷冻扩增(用和不用IL-21)与冷冻但在第一步骤用IL-21+共培养的扩增进行比较，其中冷冻扩增的平均细胞毒性为非冷冻扩增的97.7％。

50.根据权利要求33或34所述的方法，其中细胞毒性是将非冷冻扩增(用和不用IL-21)与冷冻但在第一步骤未用IL-21+共培养的扩增进行比较，其中冷冻扩增的平均细胞毒性为非冷冻扩增的81.4％。

51.根据权利要求33或34所述的方法，其中在冷冻之前和之后都添加IL-21，并且其中平均细胞毒性为非冷冻扩增的114％。

52.一种组合物，其包括：

IL-2；

5-10％DMSO；

90-95％FBS；和

NK细胞，其任选地为CD56+细胞。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述组合物是冷冻的固体。

54.根据权利要求52所述的组合物，其中所述NK细胞是所述组合物的细胞群的至少90％。

55.一种组合物，其包括：

IL-2；

5-10％DMSO；

80-95％Hartman溶液；

1-10％人血清白蛋白；和

NK细胞。

56.根据权利要求52-55中任一项所述的组合物，进一步包括CryoStor溶液。