EA038848B1 - Способ пролиферации естественных клеток-киллеров и композиции для пролиферации естественных клеток-киллеров - Google Patents

Способ пролиферации естественных клеток-киллеров и композиции для пролиферации естественных клеток-киллеров Download PDF

Info

Publication number
EA038848B1
EA038848B1 EA201890121A EA201890121A EA038848B1 EA 038848 B1 EA038848 B1 EA 038848B1 EA 201890121 A EA201890121 A EA 201890121A EA 201890121 A EA201890121 A EA 201890121A EA 038848 B1 EA038848 B1 EA 038848B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
culture
interleukin
natural killer
culture medium
Prior art date
Application number
EA201890121A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201890121A1 (ru
Inventor
Ён Сок Бэк
Original Assignee
Ча Биотек Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ча Биотек Ко., Лтд. filed Critical Ча Биотек Ко., Лтд.
Priority claimed from PCT/KR2016/006754 external-priority patent/WO2016209021A1/ko
Publication of EA201890121A1 publication Critical patent/EA201890121A1/ru
Publication of EA038848B1 publication Critical patent/EA038848B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4634—Antigenic peptides; polypeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2318—Interleukin-18 (IL-18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу пролиферации естественных клеток-киллеров и композиции для пролиферации естественных клеток-киллеров, способных улучшать эффект пролиферации клеток и их противораковое действие, где способ включает в себя стадию культивирования естественных клеток-киллеров в культуральной жидкости, содержащей первый интерлейкин (IL-2), второй интерлейкин (по меньшей мере один интерлейкин выбран из группы, состоящей из IL-12, IL-15 и IL-18) и антитело к NKp46.

Description

Область техники
Настоящее раскрытие относится к способу пролиферации естественных клеток-киллеров, композиции для пролиферации естественных клеток-киллеров и повышенному противораковому действию пролиферированных естественных клеток-киллеров.
Предпосылки создания изобретения
Естественные клетки-киллеры (здесь и далее NK-клетки), используемые в клеточной иммунотерапии - это клетки, которые морфологически характеризуются крупными цитоплазматическими гранулами и которые составляют примерно от 5 до 15% от содержания лимфоцитов в крови. Основные функции NK-клеток, идентифицированные к настоящему времени, включают способность убивать опухолевые клетки, цитотоксичность против инфицированных вирусами клеток, способность убивать бактерии и грибы и т.д. Поэтому ожидается, что NK-клетки будут играть важную роль в противоопухолевом иммунитете и защитном иммунитете против микроорганизмов.
NK-клетки выделяются в отдельный класс иммунных клеток, отличающийся от Т-клеток или Вклеток, потому что у них нет рецепторов на клеточной поверхности, таких как Т-клеточный рецептор, CD4 или иммуноглобулин. В частности, известно, что NK-клетки способны неспецифически убивать опухоли. Эта способность NK-клеток используется в лечении солидных опухолей вместе с лимфокинактивированными клетками-киллерами (LAK) и инфильтрующими опухоль лимфоцитами (TIL) или для иммунотерапии путем вливания донорских лимфоцитов (Tilden. А.В. et al., J. Immunol., 136), которая применяется в качестве современной клеточной терапии для предотвращения отторжения при пересадке костного мозга или пересадке органов. Сообщалось также, что нарушение дифференцировки или активности NK-клеток связано с различными раковыми заболеваниями, в том числе раком молочной железы (Konjevic G, et al., Breast Cancer Res. Treat., 66: 255-263, 2001), меланомой (Ryuke Y, et al., Melanoma Res., 13: 349-356, 2003), раком легкого (Villegas F R, et al., Lung Cancer, 35: 23-28, 2002) и т.д., и поэтому NKклеточная терапия появилась в области лечения этих заболеваний.
Для эффективного применения NK-клеток в клеточной иммунотерапии, такой как лечение онкологических заболеваний, требуется большое число NK-клеток. Однако NK-клетки составляют только от 5 до 15% от содержания лимфоцитов в крови у здорового человека, как описано выше. В частности, число, дифференциация и функционирование NK-клеток часто снижены у онкологических пациентов, и обеспечить достаточное для лечения заболеваний количество NK-клеток действительно трудно. Кроме того, NK-клетки, созданные существующими способами пролиферации NK-клеток, отличаются друг от друга скоростью пролиферации и цитотоксичностью. Следовательно, срочно требуется новый способ пролиферации или дифференциации NK-клеток, который позволил бы обеспечивать большое количество NKклеток, сохраняющих способность убивать раковые клетки на достаточном уровне.
Подробное описание изобретения
Техническая проблема
Задачей настоящего раскрытия является предложить способ пролиферации естественных клетоккиллеров с улучшенным противоопухолевым действием.
Другой задачей настоящего раскрытия является предложить способ получения естественных клеток-киллеров.
Еще одной задачей настоящего раскрытия является предложить фармацевтическую композицию для лечения или предотвращения онкологического заболевания, включающую естественные клеткикиллеры.
И еще одной задачей настоящего раскрытия является предложить композицию для пролиферации естественных клеток-киллеров.
Техническое решение
В одном аспекте предложен способ пролиферации естественных клеток-киллеров (NK-клеток), причем способ включает культивирование NK-клеток в культуральной среде, содержащей первый интерлейкин, второй интерлейкин и антитело к NKp46.
Первый интерлейкин может представлять собой IL-2.
Второй интерлейкин может представлять собой один или несколько интерлейкинов из группы, состоящей из интерлейкина-12 (IL-12), интерлейкина-15 (IL-15) и интерлейкина-18 (IL-18). Предпочтительно, чтобы второй интерлейкин представлял бы собой IL-12, IL-18, IL-12/IL-18 или IL-12/IL-15/IL-18, и более предпочтительно IL-18.
Культивирование NK-клеток может быть культивированием клеток в культуральной среде, содержащей первый интерлейкин, второй интерлейкин и антитело к NKp46, в присутствии гаммаглобулина (IgG) и фибронектина. Способ настоящего раскрытия может дополнительно улучшить противораковое действие NK-клеток путем культивирования NK-клеток в присутствии гамма-глобулина (IgG) и фибронектина.
В данном контексте термин клеточная пролиферация или пролиферация клеток означает то, что число клеток растет в культуральной среде в ходе последовательного деления клеток или дифференциации клеток. В данном контексте термин пролиферация NK-клеток означает то, что число NK-клеток растет в культуральной среде в ходе последовательного деления клеток или число NK-клеток растет
- 1 038848 вследствие дифференциации незрелых клеток крови в NK-клетки. Поэтому пролиферация NK-клеток может включать увеличение числа NK-клеток, дифференциацию недифференцированных лимфоцитов в
NK-клетки путем приобретения признаков NK-клеток или созревание NK-клеток из незрелых NKклеток.
NK-клетку, которая является исходным материалом для пролиферации, можно приобрести в продаже или взять у человека или животного, предпочтительно у человека, который нуждается в терапии NK-клетками. Кроме того, NK-клетку можно выделить из любого тканевого источника в организме. Например, NK-клетки могут быть в крови, взятой из организма. При условии, что кровь содержит NKклетки, она может использоваться в качестве источника NK-клеток для осуществления способа пролиферации NK-клеток, например, это может быть цельная кровь, кровь пуповины, костный мозг или периферическая кровь.
Пролиферация NK-клеток может включать, например, культивирование одноядерных клеток периферической крови. Термин одноядерные клетки периферической крови (РВМС) означает одноядерные клетки, выделенные из периферической крови млекопитающего, предпочтительно человека, и включает иммунные клетки, такие как В-клетки, Т-клетки и NK-клетки, и гранулоциты, такие как базофилы, эозинофилы и нейтрофилы. РВМС можно получать из периферической крови, взятой из живого организма в соответствии с общим методом получения. Предпочтительно можно выделять РВМС из периферической крови с помощью центрифугирования по удельному весу с использованием Ficoll.
РВМС можно получать от субъекта, нуждающегося в лечении, а именно это может быть аутологичная одноядерная клетка периферической крови. Если РВМС представляет собой аутологичную одноядерную клетку периферической крови, то это предпочтительно, поскольку в этом случае не требуется удалять Т-клетки, т.к. все клетки взяты от самого пациента, хотя некоторые Т-клетки присутствуют в пролиферированных популяциях NK-клеток.
РВМС, используемые в способе пролиферации NK-клеток настоящего изобретения, можно подвергать криоконсервации. В конкретном варианте осуществления после выделения РВМС из крови их можно замораживать. Затем РВМС можно размораживать и использовать для пролиферации NK-клеток. Замораживание можно выполнять способом, известным в уровне техники, предпочтительно способом, включающим первое замораживание в интервале температур от 4°C до -42°C, второе замораживание в интервале температур от -42°C до -15°C и третье замораживание в интервале температур от -15°C до -120°C. В этом случае температуру при каждом замораживании можно повышать или понижать до верхнего предела или нижнего предела температурного интервала каждого замораживания путем выдерживания образца в течение заранее определенного времени последовательно при перемежающихся температурах в пределах температурного интервала. В конкретном варианте осуществления первое замораживание можно выполнять при 0°C в течение 10-15 мин, при -12°C в течение 5-10 мин, при -42°C в течение 0,5-1 мин. После первого замораживания второе замораживание можно выполнять при -25°C в течение 13 мин и при -15°C в течение 1-3 мин, и после второго замораживания третье замораживание можно выполнять при -42°C в течение 20-40 мин и при -120°C в течение 20-50 мин. В другом варианте осуществления первое замораживание можно выполнять в интервале температур от 4 до -40°C со скоростью от 0,5 до 5°С/мин, второе замораживание можно выполнять в интервале температур от -40 до -90°C со скоростью от 1 до 10°С/мин после первого замораживания, и третье замораживание можно выполнять в интервале температур от -90 до -120°C со скоростью от 1 до 10°С/мин после второго замораживания. Каждое замораживание способа замораживания может выполняться с помощью программируемого криозамораживателя (CRF -controlled rate freezer). При заморозке РВМС настоящего изобретения РВМС предпочтительно замораживают после приведения количества выделенных клеток к требуемому значению путем флотации клеток в смеси CryoStor CS10 или Aly505NK-EX и альбумин+DMSO. После разморозки клеток замороженные РВМС можно использовать для культивирования и пролиферации NK-клеток в соответствии с настоящим изобретением, и способ замораживания обладает теми преимуществами, что NKклетки пригодны для использования путем процессов культивирования и пролиферации в любое время, когда NK-клетки потребуются после взятия крови у пациента. Неудобство большинства клеточных иммунотерапий состоит в том, что каждые две недели необходимо брать кровь у пациента с учетом периода культивирования при установленном 2-недельном периоде инкубации, чтобы получать клинически эффективное количество клеток, а на клеточную культуру может влиять состояние пациента. Однако данное изобретение может предложить способ замораживания и размораживания РВМС, который может позволить поддерживать высокую выживаемость и может успешно применяться в способе культивирования активированных NK-клеток. Таким образом, оно позволяет осуществлять регулярное получение NK-клеток и введение их пациенту вне зависимости от состояния пациента, поскольку большой объем крови пациента может быть взят, отделен и заморожен/сохранен, когда состояние у пациента хорошее.
Способ пролиферации NK-клеток согласно одному варианту осуществления может включать культивирование NK-клеток в присутствии гамма-глобулина (IgG) и фибронектина. Культивирование в присутствии гамма-глобулина (IgG) и фибронектина может быть, например, культивированием клеток в культуральной среде, содержащей гамма-глобулин и фибронектин, или культивированием клеток в культуральном планшете, в котором культуральная поверхность (поверхность культурального планшета, на- 2 038848 ходящаяся в контакте с клетками) покрыта гамма-глобулином (IgG) и фибронектином. Предпочтительно, чтобы культивирование NK-клеток могло проводиться в культуральном планшете с покрытием из гаммаглобулина и фибронектина. Культуральный планшет с покрытием из гамма-глобулина и фибронектина можно готовить, нанося на планшет раствор, содержащий гамма-глобулин и фибронектин. Вместо фибронектина - известного адгезивного белка - можно использовать, например, коллаген. В одном примере покрытие из гамма-глобулина и фибронектина на культуральный планшет можно наносить путем введения раствора, содержащего гамма-глобулин и фибронектин, в культуральный планшет (например, колбу Т75) и инкубирования культурального планшета при низкой температуре.
Концентрация гамма-глобулина может составлять от 0,1 до 1 нг/мл, от 1 до 10 нг/мл, от 10 до 100 нг/мл или от 1 до 100 нг/мл. Гамма-глобулин может активировать NK-клетки путем стимулирования FcyRIII рецептора NK-клеток.
Концентрация фибронектина может составлять от 0,1 до 50 мкг/мл, от 1 до 50 мкг/мл, от 5 до 50 мкг/мл или от 10 до 50 мкг/мл. Фибронектин может облегчать взаимодействие между клетками, способствуя движению NK-клеток.
Способ пролиферации NK-клеток согласно одному варианту осуществления может проводиться культивированием NK-клеток в культуральной среде, содержащей первый интерлейкин (IL-2), второй интерлейкин (один или несколько интерлейкинов, выбранных из группы, состоящей из IL-12, IL-15 и IL18) и антитело к NKp46. Культуральная среда может представлять собой среду, полученную введением антитела к NKp46, второго интерлейкина и IL-2 в обычную среду для иммунных клеток. Среда для иммунных клеток может включать, например, ALyS505NK-EX (Cell Science & Technology Inst. Inc., Япония), RPMI1640 (Life technologies, США), x-vivo10 (Lonza, США), CellGro SCGM (CellGenix, Германия), KBM (Kohjin bio, Япония) и т.д. Культуральную среду согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения можно приготовить, вводя антитело к NKp46, второй интерлейкин и IL-2 в описанную выше среду для иммунных клеток. Культуральную среду согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения можно также приготовить, вводя антитело к NKp46 и второй интерлейкин в поступающую в продажу среду для иммунных клеток, которая уже содержит IL-2.
Культуральная среда может без ограничения быть любой культуральной средой для иммунных клеток при условии, что эта среда для иммунных клеток содержит второй интерлейкин, антитело к NKp46 и IL-2.
Концентрация IL-2 в культуральной среде может быть от 500 до 5000 МЕ/мл, от 600 до 4000 МЕ/мл, от 700 до 3000 МЕ/мл, от 800 до 2000 МЕ/мл, от 900 до 1500 МЕ/мл, от 900 до 1200 МЕ/мл, или от 1000 до 1200 МЕ/мл. IL-2 может облегчать рост NK-клеток.
Концентрация антитела к NKp46 в культуральной среде может быть от 0,1 до 10 мкг/мл, от 0,5 до 10 мкг/мл, от 1 до 10 мкг/мл или от 5 до 10 мкг/мл. NKp46 является активирующим рецептором NKклеток, и, таким образом, антитело к NKp46 по настоящему изобретению может активировать NK-клетки путем стимулирования NKp46.
Концентрация второго интерлейкина в культуральной среде может быть от 0,1 до 100 нг/мл, от 1 до 100 нг/мл, от 10 до 100 нг/мл, от 20 до 100 нг/мл, от 30 до 100 нг/мл, от 50 до 100 нг/мл или от 70 до 100 нг/мл. Второй интерлейкин настоящего изобретения представляет собой компонент, который способен увеличивать эффективность пролиферации NK-клеток и в значительной степени улучшать активацию NK-клеток. Поэтому использование в соответствии с настоящим изобретением второго интерлейкина дополнительно к IL-2 и антителу к NKp46, может продемонстрировать усиливающее и синергическое воздействие на NK-клеточную пролиферацию и активацию со стороны IL-2 и антител к NKp46, и, соответственно, настоящее изобретение может предложить усовершенствованное воздействие на NKклеточную пролиферацию по сравнению с известным способом пролиферации NK-клеток.
В результате этого комбинация IL-2, второго интерлейкина и антитела к NKp46, которые являются компонентами, входящими в композицию для пролиферации NK-клеток настоящего изобретения, может максимизировать пролиферацию и эффективность культивирования NK-клеток, и настоящее изобретение является очень экономичным вследствие использования комбинации только основных компонентов.
Культуральная среда может дополнительно включать плазму или сыворотку. Плазму или сыворотку, включенную в культуральную среду, можно получить из периферической крови, из которой были выделены РВМС, использованные для пролиферации NK-клеток. Концентрация плазмы может быть от 1 до 20 об./об.%, от 1 до 15 об./об.%, от 2 до 15 об./об.%, от 5 до 15 об./об.% или от 5 до 10 об./об.% по отношению к общему объему культуральной среды.
В конкретном варианте осуществления РВМС и плазму (или сыворотку) можно выделять из периферической крови пациента, которому будут вводить NK-клетки, соответственно, и полученные РВМС можно культивировать в культуральной среде, содержащей IL-2, второй интерлейкин, антитело к NKp46 и плазму (или сыворотку), выделенную из периферической крови. Предпочтительно проводить культивирование в культуральном планшете с покрытием из гамма-глобулина и фибронектина.
Культивирование РВМС можно проводить в обычных условиях для культивирования клеток, т.е. в CO2 инкубаторе при 37°C, и оно может продолжаться с добавлением культуральной среды каждые 2 или 3 дня. Концентрация РВМС, вводимых в культуральную среду, может составлять от 4x105 до 5х107 клеток/мл, но не
- 3 038848 ограничивается этими условиями. Период культивирования может продолжаться, например, от 7 до 20 дней, от 8 до 18 дней, от 10 до 16 дней, от 10 до 15 дней или от 10 до 14 дней, но не ограничивается этим. Для обеспечения требуемого количества NK-клеток период культивирования можно определять соответственно в пределах вышеуказанного интервала или вне пределов вышеуказанного интервала. Культуральный планшет может представлять собой чашку, колбу, планшет, многолуночный планшет и культуральный мешок, которые находятся в продаже.
Между тем, с целью максимального выхода пролиферации NK-клеток, культивирование можно проводить постадийно. В этом случае компоненты культуральной среды, культуральный планшет и период культивирования на каждой стадии могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Путем нахождения оптимального периода культивирования для каждой стадии можно в конце концов достичь пролиферации NK-клеток. Кроме того, настоящее изобретение отличается тем, что культивирование производят путем введения композиции для культивирования (или культуральной среды) в колбу с интервалом в 2-3 дня в ходе периода культивирования, тем самым поддерживая культуру NK-клеток.
В одном варианте осуществления способ пролиферации NK-клеток настоящего изобретения может включать первое культивирование культивирования РВМС путем введения РВМС и культуральной среды, включающей первый интерлейкин, второй интерлейкин, антитело к NKp46 и плазму в культуральный планшет с покрытием из гамма-глобулина и фибронектина; и второе культивирование культивирования культуры, полученной при первом культивировании, путем дальнейшего введения туда культуральной среды, включающей первый интерлейкин, второй интерлейкин, антитело к NKp46 и плазму. В способе пролиферации первый интерлейкин может представлять собой интерлейкин-2 (IL-2). Далее второй интерлейкин может представлять собой один или несколько интерлейкинов из группы, состоящей из интерлейкина-12 (IL-12), интерлейкина-15 (IL-15) и интерлейкина-18 (IL-18). Первый интерлейкин и второй интерлейкин такие же, как описано выше.
Плазму можно получать из периферической крови, из которой были получены РВМС. Вместо плазмы можно использовать сыворотку.
Концентрация IL-2 в культуральной среде при первом культивировании может быть от 500 до 5000 МЕ/мл, от 600 до 4000 МЕ/мл, от 700 до 3000 МЕ/мл, от 800 до 2000 МЕ/мл, от 900 до 1500 МЕ/мл, от 900 до 1200 МЕ/мл или от 1000 до 1200 МЕ/мл.
При первом культивировании РВМС можно культивировать в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, например в течение 3, 4, 5, 6 дней, предпочтительно 5 дней, в культуральной среде, содержащей первый интерлейкин (IL-2), второй интерлейкин (один или несколько интерлейкинов, выбранных из группы, состоящей из IL-12, IL-15 и IL-18), антитело к NKp46 и плазму.
Способ пролиферации NK-клеток согласно настоящему изобретению может включать последующее введение культуральной среды, включающей IL-2 и плазму, в культуру в ходе первого культивирования. Например, культуральную среду, включающую IL-2 и плазму, предназначенную для последующего введения, можно вводить на 3-й день и/или 4-й день после первого культивирования. Концентрация IL-2 в культуральной среде, предназначенной для последующего введения, может быть такой же, как и в культуральной среде при первом культивировании, но не ограничивается этим. Объем культуральной среды, предназначенной для последующего введения, может быть равен объему культуры.
В конкретном варианте осуществления способ пролиферации NK-клеток настоящего изобретения включает второе культивирование культивирования культуры, полученной при первом культивировании, путем дополнительного введения туда культуральной среды, содержащей первый интерлейкин (IL-2), второй интерлейкин (один или несколько интерлейкинов, выбранных из группы, состоящей из IL-12, IL15 и IL-18), антитело к NKp46 и плазму.
Второе культивирование можно выполнять путем переноса культуры, полученной при первом культивировании, в новый планшет. Новый планшет может не включать гамма-глобулин и фибронектин. Концентрация IL-2 в культуральной среде при втором культивировании может быть такой же, как и в культуральной среде при первом культивировании, но не ограничивается этим. Концентрация IL-2 в культуральной среде при втором культивировании может быть от 500 до 5000 МЕ/мл, от 600 до 4000 МЕ/мл, от 700 до 3θ0θ МЕ/мл, от 800 до 2000 МЕ/мл, от 900 до 1500 МЕ/мл, от 900 до 1200 МЕ/мл или от 1000 до 1200 МЕ/мл. Объем культуральной среды, содержащей первый интерлейкин, второй интерлейкин (один или несколько, выбранных из группы, состоящей из IL-12, IL-15 и IL-18), антитело к NKp46 и плазму, который вводят в культуру при втором культивировании, может быть равен объему культуры.
Клетки могут быть культивированы в культуральной среде при втором культивировании в течение 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней, предпочтительно в течение 1, 2 или 3 дней.
Способ пролиферации NK-клеток настоящего изобретения может дополнительно включать третье культивирование культивирования после снижения концентрации IL-2 в культуре до 4/5 или ниже - до 1/10 или ниже относительно концентрации до введения культуры. Концентрация IL-2 может составлять, например, от 1/100 до 3/5, от 1/100 до 1/4, от 1/100 до 2/5, от 1/100 до 1/3 или от 1/100 до 1/5 относительно концентрации до введения культуры.
Концентрацию IL-2 в культуральной среде можно снижать путем введения в культуру культуральной среды без IL-2. Культуральная среда, вводимая при третьем культивировании, может содержать плазму.
- 4 038848
Концентрация IL-2 в культуре при третьем культивировании может быть от 1500 до 1300 МЕ/мл, от
1300 до 1000 МЕ/мл, от 1000 до 600 МЕ/мл, от 600 до 500 МЕ/мл, от 500 до 400 МЕ/мл, от 400 до
300 МЕ/мл, от 300 до 200 МЕ/мл или от 200 до 100 МЕ/мл.
Культуральная среда при каждом культивировании может содержать подходящие белки, цитокины, антитела, соединения и другие компоненты, при условии, что они не препятствуют пролиферативному эффекту NK-клеток.
В конкретном варианте осуществления пролиферированные клетки могут экспрессировать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из CD56, CD16, NKG2D, перфорина и гранзима В. Например, экспрессия может представлять собой экспрессию большого количества вышеуказанных факторов по сравнению с клетками периферической крови или их популяциями до пролиферации или NKклеток или их популяций до пролиферации. Например, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100% клеток периферической крови или их популяций, включая пролиферированные NK-клетки, или пролиферированных NK-клеток или их популяций от всего количества клеток или клеточных популяций могут экспрессировать вышеупомянутые факторы. И % экспрессии или уровень экспрессии означает процент NK-клеток, экспрессирующих один или несколько из вышеупомянутых факторов, относительно общего числа клеток в образце. Экспрессия или уровень экспрессии фактора в клетках или клеточных популяциях может определяться по значению, выявленному с помощью проточной цитометрии.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения, дополнительно включающий консервирование NK-клеток, пролиферированных способом пролиферации NK-клеток, после суспендирования NK-клеток в растворе, содержащем декстран и альбумин.
В одном примере было найдено, что NK-клетки, пролиферированные способом пролиферации NKклеток настоящего изобретения, экспрессировали противоопухолевые вещества с высоким выходом и продемонстрировали замечательное противораковое действие по сравнению с РВМС (см. фиг. 7-9).
В еще одном аспекте предложена фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения онкологического заболевания, включающая пролиферированные NK-клетки.
NK-клетки, включенные в фармацевтическую композицию, и способ пролиферации NK-клеток такие же, как и описано выше.
Субъектом может быть млекопитающее, включая человека.
Онкологическое заболевание может представлять собой лейкемию, рак молочной железы, рак яичника, рак мозга, злокачественную меланому, рак желудка, рак печени, колоректальный рак или рак легкого, но не ограничивается этим перечнем.
Фармацевтическая композиция может включать клеточные популяции NK-клеток, культивированных способом пролиферации NK-клеток. Композиция может включать культуральную среду, использованную при культивировании, или культуру дополнительно к клеточным популяциям, культивированным этим способом. Композиция может включать новую культуральную среду или физиологический раствор, не содержащие клеточные популяции, выделенные из культуры, и дополнительные компоненты, такие как цитокины. Новая культуральная среда может представлять собой среду, состав которой идентичен составу среды, использованной для культивирования NK-клеток, или отличается от него. В фармацевтической композиции вводимая доза NK-клеток может изменяться в зависимости от состояния и веса тела пациента, тяжести заболевания, режима введения, пути и продолжительности введения, и например, вводимая доза может быть от 1x106 до 1x109 клеток/кг, предпочтительно от 1х107 до 1x109 клеток/кг. Введение можно осуществлять один или несколько раз в день. При составлении фармацевтической композиции в виде жидкого состава композиции стандартной дозы, такого как раствор, суспензия, эмульсия и т.д., ее можно вводить пациенту при вышеуказанных клеточных концентрациях.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может включать NKклетки, пролиферированные способом настоящего раскрытия, как описано выше, и может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическую композицию можно готовить в соответствии с обычным способом в виде парентерального препарата, такого как раствор, суспензия, эмульсия, лиофилизированный препарат и т.д. Фармацевтически приемлемый носитель может включать водный разбавитель, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, очищенная вода, стерильная вода и т.д., или растворитель. Фармацевтически приемлемый носитель может включать другие обычные консерванты и т.д. Фармацевтическая композиция может включать в себя различные противораковые средства или другие терапевтические средства в дополнение к NK-клеткам или популяциям NKклеток.
Еще в одном аспекте предложен способ лечения или предотвращения онкологического заболевания, включающий введение субъекту пролиферированных NK-клеток.
Субъект и онкологическое заболевание такие же, как описано выше.
При введении пролиферированных NK-клеток путь введения может быть пероральным или парентеральным путем (например, инъекцией), и инъекция может представлять собой внутривенную инъекцию, подкожную инъекцию, внутримышечную инъекцию или внутрибрюшинную инъекцию, но особен- 5 038848 но не ограничивается этим перечнем.
Еще в одном аспекте предложено применение пролиферированных NK-клеток в получении терапевтического или профилактического средства против онкологического заболевания.
Еще в одном аспекте предложена композиция для пролиферации NK-клеток, включающая первый интерлейкин (IL-2), второй интерлейкин (один или несколько интерлейкинов, выбранных из группы, состоящей из интерлейкина-12 (IL-12), интерлейкина-15 (IL-15) и интерлейкина-18 (IL-18)) и антитело к NKp46.
Еще в одном аспекте предложено применение композиции, включающей первый интерлейкин (IL2), второй интерлейкин (один или несколько интерлейкинов, выбранных из группы, состоящей из интерлейкина-12 (IL-12), интерлейкина-15 (IL-15) и интерлейкина-18 (IL-18)) и антитело к NKp46, в получении композиции для пролиферации NK-клеток.
Композиция для пролиферации NK-клеток может дополнительно включать гамма-глобулин и фибронектин. В композиции первый интерлейкин и второй интерлейкин такие же, как описано выше.
Концентрация IL-2 в композиции для пролиферации NK-клеток может быть от 500 до 5000 МЕ/мл, от 600 до 4000 МЕ/мл, от 700 до 3000 МЕ/мл, от 80о до 2000 МЕ/мл, от 900 до 1500 МЕ/мл, от 900 до 1200 МЕ/мл или от 1000 до 1200 МЕ/мл.
Концентрация второго интерлейкина в композиции для пролиферации NK-клеток может быть от 0,1 до 100 нг/мл, от 1 до 100 нг/мл, от 10 до 100 нг/мл, от 20 до 100 нг/мл, от 30 до 100 нг/мл, от 50 до 100 нг/мл или от 70 до 100 нг/мл.
Концентрация антитела к NKp46 в композиции для пролиферации NK-клеток может быть от 0,1 до 10 мкг/мл, от 0,5 до 10 мкг/мл, от 1 до 10 мкг/мл или от 5 до 10 мкг/мл.
Композиция для пролиферации NK-клеток может предназначаться для пролиферации или дифференциации NK-клеток из РВМС.
Композиция для пролиферации NK-клеток может дополнительно включать плазму или сыворотку. Плазму или сыворотку, вводимые в композицию, можно получать из крови, из которой были выделены NK-клетки. В конкретном варианте осуществления плазму, входящую в состав композиции для пролиферации NK-клеток, можно получать из периферической крови, из которой выделены РВМС.
В состав композиции для пролиферации NK-клеток могут входить основные составляющие для культивирования РВМС и пролиферации NK-клеток, другие носители или вспомогательные вещества, в дополнение к гамма-глобулину, фибронектину, первому интерлейкину (IL-2), второму интерлейкину (один или несколько, выбранных из группы, состоящей из IL-12, IL-15 и IL-18) и антителу к NKp46.
Полезный эффект от изобретения
Способ пролиферации естественных клеток-киллеров (NK) или композиция для пролиферации NKклеток согласно одному аспекту может способствовать пролиферации и дифференциации NK-клеток и может стабильно обеспечивать NK-клетки с повышенной цитотоксичностью. Применение полученных этим способом NK-клеток может быть полезно в лечении заболеваний, таком как лечение онкологических заболеваний.
Описание графических материалов
На фиг. 1 показаны результаты в виде общего числа клеток (А) и кратно увеличение числа NK (естественных киллеров) клеток (В) с помощью способа пролиферации согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 2 показаны результаты в виде общего числа клеток (А) и процента NK-клеток (В), полученных с помощью способов пролиферации согласно различным конкретным вариантам осуществления.
На фиг. 3 показаны результаты характера NK-клеточной пролиферации в зависимости от концентраций IL-2.
На фиг. 4 показаны результаты активности NK в зависимости от концентраций IL-12 и IL-18.
На фиг. 5 показаны результаты проточной цитометрии NK-клеток, полученных с помощью способа пролиферации согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 6 показаны результаты проточной цитометрии активации рецепторов NK-клеток, полученных согласно конкретному варианту осуществления.
На фиг. 7 показаны результаты проточной цитометрии при исследовании экспрессии противораковых веществ в NK-клетках, полученных согласно конкретному варианту осуществления.
На фиг. 8 показаны результаты проточной цитометрии при исследовании % лизиса раковых клеток клеточной линии лейкемии - K562 - NK-клетками, полученными согласно различным конкретным вариантам осуществления.
На фиг. 9 показаны результаты проточной цитометрии при исследовании % лизиса раковых клеток K562 (хронический лейкоз), OVCAR3 (рак яичника), Hep3B (рак печени), HepG2 (рак печени), А704 (рак почки) и DU145 (рак простаты) NK-клетками, полученными согласно конкретному варианту осуществления.
На фиг. 10 приведены характеристики РВМС Донора 1 до культивации, где А представляет собой процент NK-клеток (Q9, CD3-CD56+), В представляет собой NK-клетки, экспрессирующие CD16 (Q2, CD16+CD56+), С представляет собой В-клетки (Q5, CD3-CD19+) и D представляет собой цитотоксичность
- 6 038848 в клетках K562 (7AAD+, E:T=10:1).
На фиг. 11 приведены характеристики РВМС Донора 1, культивированных в течение 14 дней после процессов замораживания и размораживания, где А представляет собой процент NK-клеток (Q5, CD3 CD56+), В представляет собой NK-клетки, экспрессирующие CD16 (Q10, CD16+CD56+), С представляет собой В-клетки (Q1, CD3-CD19+), D представляет собой цитотоксичность в клетках K562 (7AAD+, E:T=10:1).
Техническое выполнение изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако эти примеры приведены только для иллюстративных целей, и объем настоящего изобретения ими не должен ограничиваться.
Пример 1. Получение одноядерных клеток периферической крови (РВМС).
1. Выделение РВМС и аутологичной плазмы из крови.
Кровь отбирали из вены здорового человека. При выполнении этой процедуры использовали канюлю для взятия крови, содержащую гепарин. Каждые 30 мл взятой у пациента крови осторожно переносили в две пробирки (#352070, BD, или эквивалентную, или с лучшей спецификацией) с Ficoll (#17-144002, GE Healthcare, или эквивалент, или с лучшей спецификацией). Пробирки с кровью центрифугировали в течение 10 мин при 2500 об/мин с отламыванием и затем каждый верхний слой плазмы переносили в новую пробирку.
Перенесенную плазму инактивировали в течение 30 мин в термоблоке, а затем центрифугировали в течение 5 мин при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость в пробирке после центрифугирования переносили в другую, новую пробирку с этикеткой плазма и хранили при температуре от 2 до 8°C.
Плазму собирали из пробирки, содержащей кровь и Ficoll, после центрифугирования, и светложелтый слой в оставшемся нижнем слое осторожно переносили в новую пробирку, стараясь не смешивать со слоем красных кровяных телец, и затем в новую пробирку добавляли не содержащий Ca/Mg DPBS (физиологический раствор, забуференный фосфатом Дульбекко) (#14190, Gibco). После этого пробирку центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин и надосадочную жидкость затем отбрасывали. Осажденные клетки, оставшиеся после отбрасывания надосадочной жидкости, суспендировали в 5 мл буфера для лизиса красных кровяных телец (#158904, Qiagen). Клеточную суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин и надосадочную жидкость отбрасывали и затем в пробирку добавляли не содержащий Ca/Mg DPBS, с последующим центрифугированием в течение 5 мин при 1500 об/мин. Осажденные клетки, оставшиеся после отбрасывания надосадочной жидкости, суспендировали в 1 мл культуральной среды Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI).
Небольшое количество клеточной суспензии в Alys505NK-EX 100-кратно разбавляли в не содержащем Ca/Mg DPBS, и затем небольшое количество разбавленной суспензии смешивали с равным объемом трипанового синего, а затем подсчитывали число клеток и их жизнеспособность, используя гемоцитометр.
2. Замораживание РВМС.
Все суспензии, полученные в примере 1.1, центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин и надосадочную жидкость отбрасывали. Клетки суспендировали в Cryostor CS10 или смеси ALyS505NKEX+альбумин+DMSO, хранящихся при температуре от 2 до 8°C, таким образом, чтобы число клеток было от 1x106 до 100x106 клеток/мл. Каждый 1 мл клеточных суспензий отделяли в 2-миллилитровую криогенную ампулу, и первое замораживание выполняли при 0°C в течение периода от 10 до 15 мин, при 12°C в течение периода от 5 до 10 мин и при -42°C в течение периода от 0,5 до 1 мин, используя CRF (программируемые криозамораживатели). После первого замораживания выполняли второе замораживание при -25°C в течение периода от 1 до 3 мин и при -15°C в течение периода от 1 до 3 мин. После второго замораживания выполняли замораживание при -42°C в течение периода от 20 до 40 мин и при -120°C в течение периода от 20 до 50 мин. В альтернативном случае первое замораживание выполняли со скоростью 3°С/мин в интервале температур от 4 до -40°C, второе замораживание выполняли со скоростью 5°С/мин в интервале температур от -40 до -90°C после первого замораживания и дополнительное замораживание выполняли со скоростью 5°С/мин в интервале температур от -90 до -120°C после второго замораживания. Замороженные клетки переносили в LN2 резервуар на хранение (при температуре ниже -130°C).
3. Размораживание замороженных РВМС.
После установки термоблока на 37°C культуральную среду, дополненную 10% плазмы, помещали в Т колбу. Объем культуральной среды можно подбирать в соответствии с концентрацией клеток, например 4, 6, 8 или 10 мл. Криогенную ампулу, замороженную в примере 2.2, помещали в термоблок для разморозки замороженных РВМС. После размораживания половины замороженных РВМС их переносили в Т колбу с культуральной средой. Затем их инкубировали в инкубаторе при 37°C с 5% CO2 в течение дня. Культивированные РВМС собирали в пробирку, куда добавляли DPBS, не содержащий Са/Mg, и пробирку центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин, а затем надосадочную жидкость отбрасывали. Выделенные центрифугированием клетки суспендировали в небольшом количестве культуральной среды и подсчитывали число клеток. Жизнеспособность клеток после размораживания показана в табл. 1. Как видно из табл. 1, 93% или больше РВМС, которые были разморожены из замороженного состояния клеток, выжили, что свидетельствует о высокой жизнеспособности.
- 7 038848
Таблица 1. Жизнеспособность РВМС после разморозки
Происхождение Жизнеспособность(%)
Донор 1 98,07
Донор 2 93
Донор 3 97,4
Пример 2. Культивирование NK-клеток.
2.1. Подготовка культуральной колбы с покрытием из фибронектина и гамма-глобулина.
2.1.1. Культуральная колба с покрытием из фибронектина и гамма-глобулина (1).
0,1 мл фибронектина (#FC-010, Millipore) и 0,121 мл гамма-глобулина (#020А1004, Greencross) помещали в 15 мл пробирку и затем туда добавляли 9,779 мл DPBS, не содержащего Са/Mg. Полученный раствор для покрытия пипеткой вносили в Т75 колбу (#156499, Nunc) и давали прореагировать при температуре от 2 до 8°C в течение 16 ч или дольше. Оставшийся после этого раствор для покрытия перед культивированием удаляли, промывая не содержащим Са/Mg DPBS.
2.1.2. Культуральная колба с покрытием из фибронектина и гамма-глобулина (2).
Культуральную колбу с покрытием из фибронектина и гамма-глобулина готовили таким же образом, что и в примере 2.1.1, за исключением того, что количества фибронектина и гамма-глобулина в примере 2.1.1 только меняли на 10 мкл и 1,21 мл соответственно.
2.1.3. Культуральная колба с покрытием из фибронектина.
0,2 мл фибронектина (#FC-010, Millipore) помещали в 15 мл пробирку и туда же добавляли не содержащий Са/Mg DPBS, доводя до общего объема, равного 10 мл. Затем культуральную колбу с покрытием только из фибронектина готовили таким же образом, что и в примере 2.1.1.
2.2. Первое культивирование NK-клеток.
2.2.1. Первое культивирование NK-клеток (1).
Суспензию клеток, полученную в примере 1, брали и помещали в колбу с покрытием, подготовленную в примере 2.1, которая была дополнена 1,5 мл аутологичной плазмы, 0,03 мл раствора антитела к NKp46 (#MAB1850, R&D), 0,075 мл IL-18 (#B003-2, R&D) и 13,4625 мл Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI), затем культивировали в CO2 инкубаторе в течение 2-3 дней. После этого добавляли 1,5 мл аутологичной плазмы и 13,5 мл Alys505NK-EX, затем культивировали в CO2 инкубаторе в течение периода от 1 дня до 2 дней.
2.2.2. Первое культивирование NK-клеток (2).
Все процедуры выполняли таким же образом, что и в примере 2.2.1, за исключением того, что добавляли 3 мкл раствора антитела к NKp46 (идентичного приведенному выше), 37,5 мкл IL-18 (идентичного приведенному выше) и Alys505NK-EX дважды до общего объема, равного 35,95 мл.
2.2.3. Первое культивирование NK-клеток (3).
Все процедуры выполняли таким же образом, что и в примере 2.2.1, за исключением того, что добавляли 15 мкл раствора антитела к NKp46 (идентичного приведенному выше), 7,5 мкл IL-12 (#554613, BD) и Alys505NK-EX дважды до общего объема, равного 26,98 мл.
2.2.4. Первое культивирование NK-клеток (4).
Все процедуры выполняли таким же образом, что и в примере 2.2.1, за исключением того, что добавляли 15 мкл раствора антитела к NKp46 (идентичного приведенному выше), 7,5 мкл IL-12 (идентичного приведенному выше), 37,5 мкл IL-18 (идентичного приведенному выше) и Alys505NK-EX дважды до общего объема, равного 26,94 мл.
2.2.5. Первое культивирование NK-клеток (5).
Все процедуры выполняли таким же образом, что и в примере 2.2.1, за исключением того, что добавляли 0,03 мл раствора антитела к NKp46 (идентичного приведенному выше), 7,5 мл IL-12 (идентичного приведенному выше), 12,5 мкл IL-15 (#247-1L-0025, R&D), 37,5 мкл IL-18 и Alys505NK-EX дважды до общего объема, равного 26,913 мл.
2.3. Второе культивирование NK-клеток.
2.3.1. Второе культивирование NK-клеток (1).
После первого культивирования согласно примеру 2.2.1 культивированные клетки в колбе Т75 в инкубаторе собирали и переносили в колбу Т175 (#159910, Nunc), которая была дополнена 3 мл аутологичной плазмы и 27 мл Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI), культивировали в CO2 инкубаторе в течение периода от 1 дня до 2 дней. После этого добавляли 6 мл аутологичной плазмы, 0,12 мл раствора антитела к NKp46, 0,03 мл IL-18 и 53,85 мл Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI), затем культивировали в CO2 инкубаторе в течение периода от 1 дня до 2 дней.
2.3.2. Второе культивирование NK-клеток (2).
Для второго культивирования культуры, полученной в примере 2.2.2, все процедуры выполняли таким же образом, что и в примере 2.3.1, за исключением того, что использовали 0,06 мл раствора антитела к NKp46 (#MAB1850, R&D), 0,06 мл IL-18 (#B003-2, R&D) и 53,88 мл Alys505NK-EX.
- 8 038848
2.3.3. Второе культивирование NK-клеток (3).
Для второго культивирования культуры, полученной в примере 2.2.2, все процедуры выполняли таким же образом, что и в примере 2.3.1, за исключением того, что использовали 0,12 мл раствора антитела к NKp46 (#MAB1850, R&D), 0,03 мл IL-12 (#554613, BD) и 53,85 мл Alys505NK-EX.
2.3.4. Второе культивирование NK-клеток (4).
Для второго культивирования культуры, полученной в примере 2.2.4, все процедуры выполняли таким же образом, что и в примере 2.3.1, за исключением того, что использовали 0,06 мл раствора антитела к NKp46 (#MAB1850, R&D), 0,03 мл IL-12 (идентичного приведенному выше), 0,02 мл IL-18 (идентичного приведенному выше) и 44,89 мл Alys505NK-EX.
2.3.5. Второе культивирование NK-клеток (5).
Для второго культивирования культуры, полученной в примере 2.2.5, все процедуры выполняли таким же образом, что и в примере 2.3.1, за исключением того, что использовали 0,06 мл раствора антитела к NKp46 (#MAB1850, R&D), 0,03 мл IL-12 (идентичного приведенному выше), 0,06 мл IL-15 (идентично приведенному выше), 0,02 мл IL-18 (идентичного приведенному выше) и 62,83 мл Alys505NK-EX.
2.4. Третье культивирование NK-клеток.
Клетки из Т175 колбы, культивированные в примере 2.3, и аутологичную плазму вносили в культуральную среду, дополненную 300 МЕ/мл IL-2, и культивировали в СО2 инкубаторе. Через 2-3 дня новую культуральную среду (дополненную 300 МЕ/мл IL-2) смешивали в равных объемах с клеточной суспензией, в которой культивировали клетки, и затем культивировали в CO2 инкубаторе.
При вышеупомянутом культивировании (во всех культивированиях - первом, втором и третьем) не содержащую IL-2 культуральную среду для иммунных клеток можно дополнять заранее определенным количеством IL-2 и затем использовать вместо культуральной среды с добавленным IL-2.
Пример 3. Определение пролиферации и активации культивированных NK-клеток.
3.1. Определение общего числа культивированных клеток и порядок увеличения числа NK-клеток.
Все клетки, культивированные в примере 2.4, собирали и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Затем надосадочную жидкость отбрасывали и клетки суспендировали в фосфатном буферном растворе. 10 мкл клеточной суспензии разбавляли фосфатным буферным раствором и 10 мкл разбавленного раствора смешивали с 10 мкл трипанового синего. Смесь помещали в гемоцитометр, подсчитывали количество клеток и измеряли их жизнеспособность. Число клеток подсчитывали, используя следующую формулу: (число живых клеток + число мертвых клеток)х1/4х2хразведение χ общий объем х104, а жизнеспособность клеток рассчитывали по следующей формуле: число живых клеток - (число живых клеток + число мертвых клеток)х100.
Экспериментальные условия, использованные в настоящем изобретении, и результаты сведены в табл. 2, фиг. 2 и фиг. 8.
Таблица 2
№ Покрытие в колбе mAb Цитокин Число клеток (х107клеток) NK-клетки (%) Лизис К562 (%)
Фибронектин Гамма-глобулин NKp46 IL-2 IL-12 IL-15 IL-18 Среднее SD Среднее SD Среднее SD
1 0 0 68 9,8 21,3 5,1 0 0
2 о о о 96 11,12 25,6 3,4 0 0
3 о о о о 318 46,47 41,8 2,46 78 1,47
4 0 о 226 45,22 54,3 6,17 36 2,42
5 О О О 264 34,13 66,1 4,46 41 1,46
6 0 0 о 0 248 59,14 65,6 3,47 39 3,55
7 0 0 496 67,13 74,2 4,47 43 2,42
8 о 0 0 494 53,2 77,1 4,4 56 3,4
9 о о о 0 0 226 25,13 57,7 4,46 81,8 3,47
10 о о о 0 0 0 260 32,14 68,3 2,17 82,9 1,17
11 о о о 0 0 0 0 250 44,14 68,9 3,14 76,9 2,17
12 о о о 0 0 504 45,14 78,1 3,47 82,7 1,46
В совокупности комбинация IL-2 и IL-18 была эффективна для повышения числа клеток и процента NK-клеток. IL-12, IL-15, смесь IL-12 и IL-15 или IL-18 были эффективны для повышения процента NKклеток.
3.2. Определение эффекта NK-клеточной пролиферации в зависимости от концентрации первого интерлейкина.
Суспензию клеток, полученную в примере 1, брали и помещали в колбу с покрытием, подготовленную в примере 2.1. Туда же вносили 1,5 мл аутологичной плазмы, 0,03 мл раствора антитела к NKp46 (#МАВ1850, R&D), 0,075 мл IL-18 (#B003-2, R&D) и 13,4625 мл Alys505NK-EX (#01410Р10, CSTI) без IL-2 и добавляли IL-2 с концентрацией от 0 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл (фиг. 3), затем культивировали в CO2 инкубаторе в течение 14 дней. Через 14 дней культивированные клетки центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин и надосадочную жидкость отбрасывали. Клетки суспендировали в фосфатном буферном растворе. 10 мкл клеточной суспензии разбавляли фосфатным буферным раствором и 10 мкл разбавленного раствора смешивали с 10 мкл трипанового синего. Смесь помещали в гемоцитометр и подсчитывали количество клеток. Количество клеток подсчитывали таким же образом, что и в примере 3.1. Число
- 9 038848
NK-клеток подсчитывали на основании процентного содержания NK-клеток, определенного проточной цитометрией. 100 МЕ/мл IL-2 принимали за 1 и рассчитывали кратность увеличения количества NKклеток в зависимости от концентрации IL-2.
Как показано на фиг. 3, при концентрациях IL-2 в интервале от 500 до 5000 МЕ/мл наблюдали 6кратное или более увеличение пролиферации NK-клеток по сравнению с 100 МЕ/мл IL-2.
3.3 Определение активности NK-клеток в зависимости от концентрации второго интерлейкина.
мкл фибронектина (#FC-010, Millipore) и 1,21 мкл гамма-глобулина (#020А1004, Greencross) помещали в 1,7 мл пробирку и затем туда добавляли 97,79 мкл DPBS, не содержащего Са/Mg. Полученный раствор для покрытия пипеткой вносили в 96-луночный планшет (#167008, Nunc) и давали прореагировать при температуре от 2 до 8°C в течение 16 ч. Оставшийся после этого раствор для покрытия перед культивированием удаляли, промывая не содержащим Са/Mg DPBS. Суспензию клеток, полученную в примере 1, брали и вносили в 96-луночный планшет и затем туда добавляли 10 мкл аутологичной плазмы, 0,2 мкл раствора антитела к NKp46 (#МАВ1850, R&D), 89,9 мкл Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) с 1000 МЕ/мл IL-2 и добавляли IL-2 с концентрацией от 0 до 10 нг/мл (см. фиг. 4А), a IL-18 добавляли с концентрацией от 0 до 300 нг/мл (см. фиг. 4В) и затем культивировали в CO2 инкубаторе в течение 48 ч. Через 48 ч надосадочную жидкость переносили в новую пробирку и центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин. В новую пробирку переносили только полученную надосадочную жидкость. Активность NK-клеток определяли по выработанному IFN-гамма, используя IFN-гамма в наборе EILSA (#DIF50, R&D).
Как показано на фиг. 4А и В, высокую выработку IFN-гамма наблюдали при концентрации IL-2 от 0,1 до 10 нг/мл и при концентрации IL-18 от 1 до 100 нг/мл.
3.4. Определение экспрессии активного рецептора культивированных NK-клеток.
Поверхностные антигены NK-клеток, собранные в примере 2, анализировали, используя проточную цитометрию. Точнее, собранные клетки суспендировали в не содержащем Ca/Mg DPBS и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Затем надосадочную жидкость отбрасывали и собирали клеточный осадок. Антитела (CD3-FITC, CD56-APC и CD16-PE), содержащие флуоресцентные материалы, добавляли к осадку и инкубировали 20 мин при 4°C. Затем добавляли FACS буфер, центрифугировали один раз в течение 1 мин при 8000 об/мин и проводили анализ с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur, BD). Результаты показаны на фиг. 5.
Как показано на фиг. 5, клетки, пролиферированные согласно конкретному варианту осуществления, продемонстрировали высокие уровни экспрессии CD56 и CD16 и низкую экспрессию CD3 по сравнению с РВМС до пролиферации.
Экспрессия активных рецепторов NK-клеток исследовали проточной цитометрией. Точнее, собранные клетки суспендировали в не содержащем Ca/Mg DPBS и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость затем отбрасывали и собирали клеточный осадок. Антитела (KIRDL1-PE, NKG2A-PE, NKG2D-PE, NKp30-PE и NKp44-PE, NKp46-PE), содержащие флуоресцентные материалы, добавляли к осадку и инкубировали 20 мин при 4°C. Затем добавляли FACS буфер, осадок центрифугировали один раз в течение 1 мин при 8000 об/мин и затем проводили анализ с помощью проточной цитометрии (Guava 8HT, MERK). Результаты показаны на фиг. 6.
Как показано на фиг. 6, клетки, пролиферированные согласно конкретному варианту осуществления, продемонстрировали высокий уровень экспрессии NKG2D, NKp30, NKp44 или NKp46 по сравнению с РВМС до пролиферации.
3.5. Анализ противораковой способности культивированных NK-клеток.
1) Анализ экспрессии противораковых веществ.
Экспрессию противораковых веществ NK-клетками, полученными в примере 2, анализировали проточной цитометрией. Точнее, собранные клетки суспендировали в не содержащем Ca/Mg DPBS и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость затем отбрасывали и собирали клеточный осадок. Полученный клеточный осадок обрабатывали фиксирующим/пермеабилизирующим раствором (#51-2090KZ, BD) и затем обрабатывали антителами (Перфорин-РЕ, ГранзимВ-РЕ и TRAIL-PE), содержащими флуоресцентные материалы, соответственно, затем инкубировали 30 мин при 4°C. Затем туда добавляли пермеабилизирующий/промывочный буфер (#51-2091KZ, BD) и дважды центрифугировали 1 мин при 8000 об/мин, а затем проводили анализ с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur, BD). Результаты показаны на фиг. 7.
Как показано на фиг. 7, клетки, пролиферированные согласно конкретному варианту осуществления, продемонстрировали высокий уровень экспрессии перфорина, гранзима В или TRAIL по сравнению с РВМС до пролиферации.
2) Определение способности убивать раковые клетки.
K562-клеточную линию хронического миелолейкоза и клеточные линии различных солидных опухолей (Hep3B, OVCAR3, HepG2, A704 и DU145) собирали в качестве целевых раковых опухолей и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Все надосадочные жидкости отбрасывали и каждый клеточный осадок собирали и промывали не содержащим Ca/Mg DPBS. К промытому клеточному осадку добавляли культуральную среду, чтобы приготовить клетки с плотностью 5x105 клеток/мл. Полученные клетки об- 10 038848 рабатывали CFSE (#с34554, Life technologies) и затем инкубировали в течение 10 мин в СО2 инкубаторе. Клетки дважды промывали не содержащим Ca/Mg DPBS и обрабатывали подготовленными NKклетками, а затем инкубировали 4 ч в СО2 инкубаторе. Клетки обрабатывали 7AAD за 10 мин до окончания инкубирования. После завершения инкубирования клетки собирали в пробирку. Затем способность полученных клеток убивать раковые клетки анализировали проточной цитометрией (FACSCalibur, BD). Способность убивать раковые клетки рассчитывали по следующему уравнению.
Цитотоксичность (%) = (обработанная группа образцов - спонтанное высвобождение)/(100 - спонтанное высвобождение)* 100
Результирующий лизис К562 приведен на фиг. 9 и в табл. 2, а результаты лизиса различных клеточных линий солидных опухолей приведены на фиг. 9.
Следовательно, комбинация антитела к NKp46 и колбы с покрытием из фибронектина и гаммаглобулина продемонстрировала высокую цитотоксичность в отношении К562, а также различных солидных опухолей, включая OVCAR3 (рак яичника), НерЗВ (рак печени), HepG2 (рак печени), А704 (рак почки) и DU145 (рак простаты) в соответствии с соотношением Е:Т (число эффекторных клеток:число клеток-мишеней). Эффекторные клетки представляют собой NK-клетки, а клетки-мишени представляют собой раковые клетки.
3.6. Результат культивирования NK-клеток из замороженных РВМС.
РВМС, выделенные из крови 3 доноров, и замороженные РВМС культивировали в течение 14 дней в соответствии со способом пролиферации настоящего изобретения и их свойства анализировали, используя проточную цитометрию, исследуя экспрессию CD3, CD16, CD19 и CD56 и клеточную цитотоксичность к К562.
В результате у донора 1 наблюдалось увеличение числа NK-клеток в 968 раз, а процентное содержание NK-клеток (CD3’CD56+) увеличилось с 10,5 до 78,8% (табл. 3, фиг. 10 и 11).
Таблица 3. Число и жизнеспособность клеток, культивированных в течение 14 дней из РВМС до культивирования и из замороженных РВМС
№ Происхождение Клетка-мишень Общее число клеток Число NK-клеток Жизнеспособность (%)
1 Донор 1 РВМС 3x10' 3,2х10ь 100
14 дней 3,9х 109 3,1 х109 97,4
2 Донор 2 РВМС 3,33x107 5,1 хЮ6 93,69
14 дней 5,4x109 4,2х109 96,73
3 Донор 3 РВМС 3x107 8,5х106 98,1
14 дней 3,1 х10® 2,66x109 94,6
У донора 2 наблюдалось увеличение числа NK-клеток в 823 раза (табл. 3), а процентное содержание NK-клеток (CD3’CD56+) увеличилось с 15,2 до 77,2% (табл. 4).
Таблица 4. Свойства клеток, культивированных в течение 14 дней из РВМС до культивирования и из замороженных РВМС
№ Происхо ждение Клетка-м ишень Определение фенотипа(%) Цитотокс ичность (%)
CD3CD56* CD16+CD56+ CD3CD19*
1 Донор 1 РВМС 10,5 11,2 8,08 4,03
14 дней 78,8 86,1 0,34 82,36
2 Донор 2 РВМС 15,2 13,2 8,72 5,89
14 дней 77,2 84,7 0,14 79,93
3 Донор 3 РВМС 28,4 5,88 16,6 6,8
14 дней 85,8 90 0,07 90,6
Результаты указывают на то, что NK-клетки можно получать из замороженных РВМС способом, включающим замораживание и размораживание РВМС, и способом, включающим культивирование NKклеток согласно настоящему изобретению.
По прочтении подробного описания настоящего изобретения специалистам в данной области понятно, что подробное описание представляет собой всего лишь предпочтительные варианты осуществления, и объем настоящего изобретения ими не ограничивается. Поэтому значительный объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ пролиферации естественных клеток-киллеров, причем способ включает культивирование естественных клеток-киллеров в культуральной среде, содержащей IL-2 в качестве первого интерлейки-
    - 11 038848 на; IL-18 в качестве второго интерлейкина и антитело к NKp46, где культивирование выполняют в присутствии гамма-глобулина и фибронектина.
  2. 2. Способ по п.1, где пролиферация естественных клеток-киллеров представляет собой культивирование одноядерных клеток периферической крови.
  3. 3. Способ по п.2, где одноядерные клетки периферической крови находятся в размороженном состоянии после криоконсервации.
  4. 4. Способ по п.3, где криоконсервация состоит из первого замораживания при температуре от 4 до -42°C, второго замораживания при температуре от -42 до -15°C и третьего замораживания при температуре от -15 до -120°C.
  5. 5. Способ по п.1, где способ пролиферации естественных клеток-киллеров включает в себя первое культивирование культивирования одноядерных клеток периферической крови в культуральной среде на культуральном планшете с покрытием из гамма-глобулина и фибронектина; и второе культивирование, состоящее в дополнительном введении культуральной среды в культуру, полученную при первом культивировании, где культуральная среда содержит IL-2 в качестве первого интерлейкина; IL-18 в качестве второго интерлейкина; антитело к NKp46 и плазму.
  6. 6. Способ по п.5, где плазму выделяют из периферической крови, из которой были получены одноядерные клетки периферической крови.
  7. 7. Способ по п.5, где концентрация IL-2 в культуральной среде составляет от 500 до 5000 МЕ/мл.
  8. 8. Способ по п.5, дополнительно включающий третье культивирование культивирования путем снижения концентрации IL-2 в культуре после второго культивирования до 4/5-1/10 или ниже.
  9. 9. Способ по п.8, где концентрация IL-2 в культуральной среде при третьем культивировании составляет от 100 до 1500 МЕ/мл.
  10. 10. Способ по п.1, где 70% или более от всех естественных клеток-киллеров, пролиферированных согласно способу, экспрессируют любое одно или несколько, выбранных из группы, состоящей из CD56, CD16, NKG2D, перфорина и гранзима В.
  11. 11. Способ получения естественных клеток-киллеров, причем способ включает пролиферацию естественных клеток-киллеров согласно способу по любому из пп.1-10 и консервирование пролиферированных клеток после суспендирования в растворе, содержащем декстран и альбумин.
  12. 12. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения онкологического заболевания, причем фармацевтическая композиция включает естественные клетки-киллеры, пролиферированные согласно способу по любому одному из пп.1-11.
  13. 13. Композиция для пролиферации естественных клеток-киллеров, причем композиция содержит IL-2 в качестве первого интерлейкина; IL-18 в качестве второго интерлейкина; антитело к NKp46, где композиция дополнительно включает гамма-глобулин и фибронектин.
  14. 14. Композиция по п.13, где композиция предназначена для пролиферации естественных клетоккиллеров из одноядерных клеток периферической крови.
  15. 15. Композиция по п.14, где одноядерные клетки периферической крови находятся в размороженном состоянии после криоконсервации.
  16. 16. Композиция по п.13, где композиция дополнительно включает плазму, выделенную из периферической крови, из которой были получены одноядерные клетки периферической крови.
EA201890121A 2015-06-24 2016-06-24 Способ пролиферации естественных клеток-киллеров и композиции для пролиферации естественных клеток-киллеров EA038848B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20150089882 2015-06-24
KR1020160078622A KR101909879B1 (ko) 2015-06-24 2016-06-23 자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물
PCT/KR2016/006754 WO2016209021A1 (ko) 2015-06-24 2016-06-24 자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201890121A1 EA201890121A1 (ru) 2018-06-29
EA038848B1 true EA038848B1 (ru) 2021-10-28

Family

ID=57797429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201890121A EA038848B1 (ru) 2015-06-24 2016-06-24 Способ пролиферации естественных клеток-киллеров и композиции для пролиферации естественных клеток-киллеров

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101909879B1 (ru)
EA (1) EA038848B1 (ru)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102265437B1 (ko) 2017-11-24 2021-06-15 의료법인 성광의료재단 Nk 배양용 조성물 및 이를 이용하여 nk 세포를 배양하는 방법
KR102311057B1 (ko) * 2017-12-14 2021-10-08 (주)녹십자웰빙 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물 및 약학 조성물
KR102014467B1 (ko) * 2017-12-14 2019-08-26 (주)녹십자웰빙 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물 및 약학 조성물
KR102069704B1 (ko) * 2018-05-16 2020-01-23 고려대학교 산학협력단 Hdac 억제제를 이용한 사람 유래 자연살해세포의 확장 배양법
KR102081417B1 (ko) 2018-11-23 2020-02-25 주식회사 이뮤니스바이오 Ｂｔｏ―１의 ｎｋ 세포 증식 용도
EP3922715A4 (en) * 2019-04-17 2022-03-30 CHA Biotech Co., Ltd. NATURAL KILLER CELLS WITH INCREASED ANTI-CANCER EFFECTS AND IMMUNOTHERAPEUTIC USE THEREOF
CN111944754B (zh) * 2020-08-26 2024-04-19 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 一种自然杀伤细胞的培养方法
KR102581230B1 (ko) * 2020-10-16 2023-09-21 의료법인 성광의료재단 항암 관련 유전자 발현이 조절된 자연살해세포 및 이의 용도
CN113832101A (zh) * 2021-09-03 2021-12-24 秦红 自然杀伤细胞体外高效扩增的制备方法
KR20230150113A (ko) * 2022-04-21 2023-10-30 (주) 엘피스셀테라퓨틱스 유사 기억 자연 살해 세포 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 유사 기억 자연 살해 세포의 항암 용도
CN115039764B (zh) * 2022-07-14 2024-03-12 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种自然杀伤细胞的冻存方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100012586A (ko) * 2008-07-29 2010-02-08 주식회사 녹십자 자연살해세포의 증식방법
JP2010220479A (ja) * 2007-06-15 2010-10-07 Medeinetto:Kk Ｎｋ細胞の培養方法及びｎｋ細胞の利用
KR20120090485A (ko) * 2011-02-08 2012-08-17 (주)차바이오앤디오스텍 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR20140123503A (ko) * 2011-12-22 2014-10-22 재단법인 목암생명공학연구소 자연살해세포의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포 및 이를 포함하는 종양 및 감염성 질환 치료용 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101039843B1 (ko) * 2010-08-30 2011-06-09 주식회사 엔케이바이오 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010220479A (ja) * 2007-06-15 2010-10-07 Medeinetto:Kk Ｎｋ細胞の培養方法及びｎｋ細胞の利用
KR20100012586A (ko) * 2008-07-29 2010-02-08 주식회사 녹십자 자연살해세포의 증식방법
KR20120090485A (ko) * 2011-02-08 2012-08-17 (주)차바이오앤디오스텍 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR20140123503A (ko) * 2011-12-22 2014-10-22 재단법인 목암생명공학연구소 자연살해세포의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포 및 이를 포함하는 종양 및 감염성 질환 치료용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDRE, Pascale et al., "Comparative Analysis of Human NK Cell Activation Induced by NKG2D and Natural Cytotoxicity Receptors", European Journal of Immunology, 2004, vol. 34, no. 4, pages 961-971 See the entire document. *
DE MARIA, Andrea et al., "Revisiting Human Natural Killer Cell Subset Function Revealed Cytolytic CD56dimCD16+ NK Cells as Rapid Producers of Abundant IFN-gamma on Activation", PNAS, 2011, vol. 108, no. 2, pages 728-732 See abstract; results section. *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201890121A1 (ru) 2018-06-29
KR101909879B1 (ko) 2018-10-19
KR20170000798A (ko) 2017-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA038848B1 (ru) Способ пролиферации естественных клеток-киллеров и композиции для пролиферации естественных клеток-киллеров
US11766456B2 (en) Method for culturing natural killer cells using T cells
KR101644984B1 (ko) 자연살해세포의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포 및 이를 포함하는 종양 및 감염성 질환 치료용 조성물
KR100943087B1 (ko) 면역치료용 활성화 림프구 제조방법
ES2627910T3 (es) Métodos para potenciar la proliferación y la actividad de células destructoras naturales
JP6073417B2 (ja) 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物
ES2771248T3 (es) Diferenciación de células NK ex vivo de células hematopoyéticas CD34+
US9114100B2 (en) Methods of treatment using ex vivo expansion of cord blood T cells
US20180155690A1 (en) Method for preparing natural killer cells using irradiated pbmcs, and anti-cancer cell therapeutic agent comprising the nk cells
KR20120091012A (ko) 내추럴킬러 세포의 제조방법
KR20220038450A (ko) 면역치료를 위한 nk 세포 조성물 및 제제 및 이의 생산 방법
US20230002731A1 (en) Method of producing natural killer cells and compositions thereof
KR101706524B1 (ko) 안정성 높은 자연살해세포의 효율적인 제조방법
CA3123467A1 (en) Production and therapeutic use of off-the-shelf double negative t cells
US9944898B2 (en) Method of generating tumor-specific T cells
Domogala et al. Natural killer cells differentiated in vitro from cord blood CD34+ cells are more advantageous for use as an immunotherapy than peripheral blood and cord blood natural killer cells
KR101900807B1 (ko) 헬퍼 t1 특성들 및 세포용해 특성들을 발현하는 세포들
KR101799986B1 (ko) T 세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법
KR102663157B1 (ko) Ｔｃｒ감마 델타 양성 ｔ 세포의 생산 방법
KR20230142363A (ko) 활성화된 자연 살해세포의 대량 증식 방법 및 이의 용도
WO2024126827A1 (en) Methods for the production of lymphocytes
KR20220119080A (ko) 치료용 종양-침윤 림프구들 배양을 위한 개선된 방법
John et al. Non-Expanded PR1-Specific CTL Sort-Purified Directly From Cord Blood Lymphocytes Deplete Human AML In Vivo