KR102081417B1

KR102081417B1 - Ｂｔｏ―１의 ｎｋ 세포 증식 용도

Info

Publication number: KR102081417B1
Application number: KR1020180146389A
Authority: KR
Inventors: 이세형; 강정화; 이수영
Original assignee: 주식회사 이뮤니스바이오
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2020-02-25

Abstract

본 발명은 BTO-1의 NK 세포 증식 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 NK 세포의 살상능 또는 활성화 정도에는 영향을 미치지 않으면서 NK 세포 증식을 유도하는 BTO-1의 NK 세포 증식 용도를 제공한다.

Description

ＢＴＯ―１의 ＮＫ 세포 증식 용도{Use of BTO-1 for proliferating NK cells}

본 발명은 BTO-1의 NK 세포 증식 용도에 관한 것이다.

NK 세포(자연살해세포)는 바이러스에 감염된 세포 혹은 암세포와 같이 세포막이 비정상적으로 변형된 특징은 세포독성을 갖는 자연살해세포인 NK 세포에 의해 인식된다. NK 세포는 활성 세포 독성 T 림프구가 많이 생성되기 전에 바이러스 감염 혹은 종양 형성 초기 단계에서 중요한 역할을 한다. 조직학적으로, NK 세포는 거대과립 림프구이다. 세포내 과립은 이미 형성된 강력한 생물학적 기능을 갖는 분자를 포함하고 있다가 NK 세포가 표적 세포와 접촉했을 때 분비된다. 이들 중 몇몇 분자는 표적 세포의 막에 구멍을 형성하여 세포를 용해시키며 또 다른 분자는 표적세포에 들어가서 핵 DNA의 분절을 증가시켜 세포 사멸(Apotosis)또는 세포 예정사(Programmed cell death)를 야기한다.

그러므로 NK 세포는 특정 바이러스에 감염된 세포와 암세포를 선 자극 없이 용해시킬 수 있다. TCR의 발현을 통해 항원-특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구와 다르게, NK 세포는 항원-특이적 수용체가 결여되어있다. NK 세포는 정상세포의 MHC 클래스 I과 결합하는 살해세포 억제수용체(KIR)를 발현한다. 살해세포 억제수용체는 MHC 클래스 I과 결합하면 특정 전사인자의 억제를 유도하는 세포 내 신호가 생성된다. 이 결과 NK 세포의 활성화, 표적세포의 분해 및 파괴가 억제된다. 바이러스 감염세포 또는 암세포는 그들의 표면에 MHC 클래스 I 분자가 크게 감소되어있다. 따라서 이런 세포가 NK 세포를 만나면, 효과적으로 살해세포 억제수용체와 결합하지 못하기 때문에 NK 세포-매개 세포독성에 노출되어 용해된다.

NK 세포를 항암 등 면역 세포치료에 효과적으로 이용하기 위해서는 많은 수의 NK 세포 확보가 요구된다. 그러나 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 혈액 내 림프구의 5~15%에 불과하고, 특히 암환자에서는 종종 NK 세포의 수, 분화 및 기능이 저하되어 있어, 사실상 질병 치료를 위해 충분한 세포 수의 확보가 어려운 실정이다. 또한, 기존에 개발된 NK 세포의 증식 방법에 따라 얻어진 NK 세포는 증식율 및 세포독성 활성능에 있어서 다양한 편차가 존재한다. 따라서 충분한 암세포 살상능을 유지하는 NK 세포의 다량 확보를 위한, 새로운 NK 세포의 증식 또는 분화 방법이 절실히 요구된다.

국내공개특허 제2017-0000798호 (2017.01.03)

본 발명의 목적은 NK 세포의 증식을 촉진하는 BTO-1의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BTO-1을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 증식용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 BTO-1을 함유하는 배지에서 NK 세포를 배양하는 것을 포함하는 NK 세포의 인 비트로 증식 방법을 제공한다.

본 발명은 NK 세포의 살상능 또는 활성화 정도에는 영향을 미치지 않으면서 NK 세포 증식을 유도하는 BTO-1의 NK 세포 증식 용도를 제공하는 효과가 있다.

도 1은 7일 및 14일간 배양된 농축된 NK 세포(NK-enriched cell)의 NK 활성화 수용체 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 2는 NK 세포의 증식을 유도하는 총 30개의 저분자화합물 중 5개의 화합물(3, 4, 6, 36, 39)의 1차 스크리닝 결과를 나타낸 것이다(plate #1).
도 3은 NK 세포의 증식을 유도하는 총 30개의 저분자화합물 중 3개의 화합물(54, 56, 70)의 1차 스크리닝 결과를 나타낸 것이다(plate #2).
도 4는 NK 세포의 증식을 유도하는 총 30개의 저분자화합물 중 2개의 화합물(86, 91)의 1차 스크리닝 결과를 나타낸 것이다(plate #3).
도 5는 NK 세포의 증식을 유도하는 총 30개의 저분자화합물 중 2개의 화합물(122, 136)의 1차 스크리닝 결과를 나타낸 것이다(plate #4).
도 6은 NK 세포의 증식을 유도하는 총 14개의 저분자화합물 중 5개의 화합물(3, 4, 39, 136, 119)의 2차 스크리닝 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 NK 세포의 증식을 유도하는 저분자화합물의 3차 스크리닝 모식도를 나타낸 것이다. 3차 스크리닝을 위해 7일간 3회 저분자화합물을 처리한 후 K562 암세포에 대한 살상능을 평가하였다.
도 8은 NK 세포의 증식을 유도하는 저분자화합물의 3차 스크리닝 결과를 나타낸 것으로, (A) 저분자화합물의 처리 6일차 CCK 결과 및 (B) 7일간 3회 저분자화합물의 처리 후 K562 암세포에 대한 살상능 평가 결과이다.

본 발명자들은 NK 세포의 활성은 저해하지 않으면서 NK 세포의 증식을 유도하는 물질을 스크리닝하고자 총 121개의 저분자화합물로 구성된 라이브러리를 이용해 NK 세포의 증식을 유도하는 물질로 BTO-1을 선정하였다.

따라서, 본 발명은 BTO-1을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 증식용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 BTO-1을 함유하는 배지에서 NK 세포를 배양하는 것을 포함하는 NK 세포의 인 비트로 증식 방법을 제공한다.

상기 BTO-1은 하기 화학식 1(C₉H₄N₄O₄S)로 표시될 수 있고, 몰 질량이264.215 g/mol이다:

[화학식 1]

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 BTO-1은 NK 세포의 살상능 또는 활성화 정도에는 영향을 미치지 않으면서 세포 증식을 유도함을 확인하였다. 따라서, BTO-1은 NK 세포의 배양 시 첨가제로 사용할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "세포 증식"은 세포가 일련의 세포 분열 단계를 거쳐 배양물에서 세포의 수가 증가하거나 또는 세포가 분화하는 것을 의미한다. 용어 "NK 세포 증식"은 일련의 세포 분열 단계를 거쳐 배양물에서 NK 세포의 수가 증가하거나 또는 미성숙 혈액 세포에서 NK 세포로의 분화에 의해 NK 세포의 수가 증가하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "NK 세포 증식"은 NK 세포 수의 증가, 또는 미분화된 림프구 세포가 NK 세포의 형질을 획득하여 NK 세포로 분화 또는 NK 세포가 미성숙 상태에서 성숙 NK 세포로 되는 상태를 포함할 수 있다.

상기 증식의 원료가 되는 NK 세포는 상업적으로 구입하거나, 인간 또는 동물로부터 채취할 수 있으며, 바람직하게는 NK 세포에 의한 치료를 필요로 하는 인간으로부터 공급받을 수 있다. 또한, 상기 NK 세포는 생체 내 임의의 조직 공급원으로부터 공급받을 수 있다. 예를 들면 상기 NK 세포는 생체로부터 채취된 혈액 중에 포함될 수 있다. 상기 혈액은 NK 세포를 포함하는 혈액이라면 본 발명의 NK 세포 증식 방법에 적용하기 위한 NK 세포 공급원으로서 이용가능하며, 예를 들면 전혈, 제대혈, 골수, 또는 말초혈액일 수 있다.

상기 NK 세포 증식은 예를 들면 말초혈액 단핵세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 용어 "말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)"는 포유동물, 바람직하게는 인간의 말초혈액으로부터 분리된 단핵의 세포로서, 주로 B 세포, T 세포, NK 세포와 같은 면역세포, 및 호염구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구 등을 포함한다. 상기 PBMC는 생체에서 채취한 말초혈액으로부터 통상의 제조방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직하게 상기 PBMC는 피콜(Ficoll)을 이용한 비중 원심분리법을 이용하여 말초혈액으로부터 분리할 수 있다.

또한, 상기 말초혈액 단핵세포는 치료를 필요로 하는 개체로부터 얻어지는 것, 즉 자가(autologous) 말초혈액 단핵세포일 수 있다. 상기 말초혈액 단핵세포가 자가 말초혈액 단핵세포일 경우, 증식된 NK 세포 집단에서 일부 T 세포가 존재하더라도, 모든 세포가 환자 본인 유래이기 때문에 T 세포를 제거할 필요가 없다는 장점이 있다.

상기 말초혈액 단핵세포의 배양은 통상의 세포배양 조건 즉, 약 37℃, CO₂ 배양기에서 수행될 수 있으며, 배양액을 2일 혹은 3일에 한 번씩 첨가해 주면서 계속적으로 배양할 수 있다. 또한, 배지에 가해지는 PBMC의 농도는 4×10⁵ ~ 5×10⁷ cells/㎖의 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다. 배양기간은 예를 들면 7~20일, 8~18일, 10~16일, 10~15일 또는 10~14일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 원하는 NK 세포 수의 수득을 위해 상기 배양일 수 범위 내 또는 범위 밖에서 적절히 설정할 수 있다. 배양 용기는, 상업적으로 입수 가능한 디쉬, 플라스크, 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 배양백을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 NK 세포 증식 방법에 사용하는 NK 세포는 인간의 말초혈액 단핵세포에서 유래한 CD16+CD56+의 표면 마커를 갖는 NK 세포 또는 NKG2D 및 DNAM의 발현이 증가한 농축된 NK 세포(NK-enriched cell)를 포함할 수 있다.

또한, NK 세포의 증식에 사용하는 배지는 예를 들면, ALyS505NK-EX (Cell Science ＆ Technology Inst. Inc., 일본), RPMI1640 (Life technologies, 미국), x-vivo10 (Lonza, 미국), CellGro SCGM (CellGenix, 독일), KBM (Kohjin bio, 일본) 등을 사용할 수 있다.

상기 배지는 영양성분이나, pH 조정제, 항생물질, 알부민, 혈청 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 NK 세포의 인 비트로 증식 방법에서 배양조건은 통상의 세포배양에 있어서 사용되는 조건으로 온도는 35 내지 38℃, CO₂는 5 ~ 10%로 4일 내지 9일 동안 배양할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> NK 세포의 증식을 촉진하는 저분자화합물의 스크리닝

건강한 자발적 지원자로부터 채취한 50 mL의 혈액에서 Ficoll-Paque와 밀도기울기 원심분리(density gradient centrifugation)을이용해 human PBMCs를 분리하였다. 림프구를 포함하고 있는 분리된 PBMC를 PBS를 이용해 세척하고 세포 수를 측정하였다. 이 과정에서 얻어지는 혈청은 56℃에서 30분간 비활성화시켰다. 분리된 PBMC의 배양에는 KBM502 (KOHJIN Bio, Sakado city, Saitama, Japan)를 기반으로 하는 배양액이 사용된다.

인간의 PBMC를 7일간 배양한 농축된 NK 세포(NK-enriched cell)는 50% 이상의 세포에서 NK 활성화 수용체인 NKG2D및 DNAM의 발현을 보였으며(도 1), 이를 약물 스크리닝에 사용하였다.

96-웰 플레이트에 PBMC를 7일간 배양하여 얻은 NK-enriched cell을 웰당 5 Х 10⁴씩 분주하고 총 131개의 저분자화합물을 1, 10 mM의 농도로 처리한 후 24시간이 경과한 때에 세포 생존능과 세포 사멸의 정도를 각각 CCK와 LDH 키트를 사용하여 확인하였다(도 2-5). 선별의 기준은 처리 농도 중 높은 농도인 10 mM 처리 시 CCK가 비처리군 및 저분자화합물 용액의 용매인 DMSO 처리군에 비해 증가하고 LDH는 비처리군 및 DMSO 처리군에 비해 동등하거나 감소하는 것으로 하였다.

상기 1차 스크리닝을 통해 선별된 12개의 저분자화합물에 대해 1차 선별결과의 재확인이 필요한 2개를 추가하여 총 14개의 저분자화합물을 대상으로 2차 스크리닝을 실시하였다. 2차 스크리닝은 1, 5, 10 mM의 3가지의 농도를 사용하여 실시하였으며 선별 기준은 1차 스크리닝 기준과 동일하게 처리 농도 중 높은 농도인 10mM 처리 시 CCK가 비처리군 및 저분자화합물 용액의 용매인 DMSO 처리군에 비해 증가하고 LDH는 비처리군 및 DMSO 처리군에 비해 동등하거나 감소하는 것으로 하였다.

2차 스크리닝의 결과로 14개 저분자화합물 중 5개의 후보 물질이 선별되었으며 세포 사멸에 영향을 미치지 않는 유효 농도는 5 mM로 결정되었다(도 6).

2차 스크리닝을 거친 5종의 저분자화합물을 대상으로 항암 효과를 확인하는 3차 스크리닝을 실시하였다. 3차 스크리닝은 각 후보 저분자화합물을 7일간 처리한 NK-enriched cell의 항암 효과를 확인하는 것을 목표로 하였다. 24-웰 플레이트에 4 Х 10⁵/웰의 농도로 NK-enriched cell을 분주한 후 후보 화합물을 5 mM 농도로 1차 처리한 후 2일간 배양하였다. 2일 배양 후 12-웰 플레이트로 계대 배양하고 후보 화합물을 2차 처리하였다. 2일간 배양 후 6-웰 플레이트로 계대 배양하고 후보 화합물을 3차 처리하였다(도 7).

배양 6일 차 CCK 측정 결과 대조군 대비 CCK 값이 증가한 3개 후보 물질 중 저분자화합물 119번(BTO-1)을 처리한 군에서 CCK 값이 가장 높았다(도 8A).

배양 후 7일 차에 K562에 대한 살상능을 알아보기 위해 48-웰에 K562 세포를 웰당 5×10⁴씩 분주한 후 저분자화합물이 처리된 세포를 2:1의 비율(1×10⁵/웰)로 하여 24시간 후 LDH를 측정한 결과 역시 저분자화합물 119번(BTO-1)을 처리한 군에서 대조군과 가장 동등한 살상능을 확인하였다(도 8B).

상기 결과로부터, BTO-1이 NK 세포의 살상능 또는 활성화 정도에는 영향을 미치지 않으면서 세포 증식을 유도한다는 것을 알 수 있었다.

Claims

BTO-1을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 증식용 조성물.
BTO-1을 함유하는 배지에서 NK 세포를 배양하는 것을 포함하는 NK 세포의 인 비트로 증식 방법.
제2항에 있어서,
NK 세포는 인간의 말초혈액 단핵세포에서 유래한 CD16+CD56+의 표면 마커를 갖는 NK 세포 또는 NKG2D 및 DNAM의 발현이 증가한 농축된 NK 세포(NK-enriched cell)를 포함하는, NK 세포의 인 비트로 증식 방법.
제2항에 있어서,
배지는 영양성분, pH 조정제, 항생물질, 알부민 및 혈청으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는, NK 세포의 인 비트로 증식 방법.
제2항에 있어서,
배양은 35 내지 38 ℃에서 4일 내지 9일 동안 수행되는 것인, NK 세포의 인 비트로 증식 방법.