KR20190043880A - 세사몰린을 유효성분으로 포함하는 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진 활성을 갖는 세사몰린의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 세사몰린(sesamolin)을 유효성분으로 포함하는 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물, 자연살해세포의 분화 또는 증식용 배지 조성물 및 세사몰린(sesamolin)을 자연살해세포에 처리하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세사몰린은 자연살해세포의 분화, 증식 및 성숙을 촉진시키는 활성이 우수하여 병인세포를 타겟팅하여 살해하는 기능을 하는 세포치료제로서의 자연살해세포를 대량으로 손쉽게 확보할 수 있는 효과가 있다.

Description

세사몰린을 유효성분으로 포함하는 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물{Composition for promoting differentiation or proliferation of natural killer cell comprising sesamolin}

본 발명은 세사몰린을 유효성분으로 포함하는 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다.

면역체계를 구성하는 세포들 중, 특히 자연살해세포(natural killer cell; NK 세포)는 항원에 의한 사전 감작없이도 종양세포, 박테리아, 세포 내 기생생물 또는 바이러스에 감염된 숙주세포를 제거하는 기능을 수행하며, 부적절한 골수 이식을 거부하고, T세포의 면역반응을 조절하는 등 생체 내 면역계 방어 기작의 제 1선에서 작용하는 행동세포이다.

NK 세포의 다양한 기능 중 특히, 암세포를 선택적으로 살상하는 능력이 밝혀지면서 많은 관련 연구들이 진행되었는데, 암 환자의 경우, 말초 혈액의 NK 세포 수나 활성이 정상인보다 감소하였으며, 동물실험에서 NK 세포활성이 저하되면 암 발생 및 암전이 위험이 증가하는 것으로 알려졌다. 또한, NK 세포는 숙주에 감염된 병원균 또는 암세포에 대항하기 위한 선천성 면역 반응과 사이토카인 분비를 통한 후천성 면역 반응에 중요한 역할을 하는데, NK 세포가 표적 세포를 살상하는데 사용하는 주된 메커니즘은 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme) B와 같은 세포 용해성 과립을 면역 시냅스를 통하여 표적 세포에 분비하는 것으로, 분비된 퍼포린은 표적 세포벽에 구멍을 만들고, 구멍을 통하여 표적 세포 내로 들어간 그랜자임이 표적 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도한다.

이와 같이, NK 세포는 세포가 악성으로 변형되는 발암과정이나, 바이러스 감염 초기의 방어기전에서 결정적인 역할을 하는 것으로 확인되었으며, 이러한 연구들을 바탕으로 암치료 및 면역질환 치료에 있어서, NK 세포를 이용하는 NK 세포 치료법이 대두됨에 따라, NK 세포에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, NK 세포를 항암 등 면역 세포치료에 효과적으로 이용하기 위해서는 많은 수의 NK 세포 확보가 요구된다. 그러나 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 혈액 내 림프구의 5~15%에 불과하고, 특히 암 환자에서는 종종 NK 세포의 수, 분화 및 기능이 저하되어 있어, 사실상 질병 치료를 위해 충분한 세포수의 확보가 어려운 실정이다. 또한 기존에 개발된 NK 세포의 증식 방법에 따라 얻어진 NK 세포는 증식율 및 세포독성 활성능에 있어서 다양한 편차가 존재한다. 따라서 충분한 암세포 살상능 등 질병 치료 활성을 유지하는 NK 세포의 다량 확보를 위한, 새로운 NK 세포의 증식, 분화 또는 성숙 방법이 절실히 요구된다.

이에 본 발명에서는 세사몰린이 자연살해세포(NK)의 분화, 증식 및 성숙을 촉진시키는 활성이 있음을 최초로 규명함으로써 NK 세포의 다량 확보를 위한 방법을 구축함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1283634호

따라서 본 발명의 목적은 세사몰린(sesamolin)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 세사몰린(sesamolin)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 세사몰린(sesamolin)을 자연살해세포에 처리하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 세사몰린(sesamolin)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세사몰린은 자연살해세포에서 CD56, CD107a 및 NKG2D의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 세사몰린(sesamolin)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세사몰린은 10~100㎍/ml로 포함되어 있을 수 있다.

또한, 본 발명은 세사몰린(sesamolin)을 자연살해세포에 처리하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세사몰린은 10~100㎍/ml의 농도로 상기 자연살해세포에 처리한 후, 24~72시간 동안 배양하는 것일 수 있다.

본 발명은 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진 활성을 갖는 세사몰린의 신규한 용도에 관한 것으로, 본 발명의 세사몰린은 자연살해세포의 분화, 증식 및 성숙을 촉진하는 활성이 우수하여, 병인세포를 타겟팅하여 치료할 수 있는 세포치료제 기능을 갖는 자연살해세포를 대량 확보할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 자연살해세포에 세사몰린을 농도별 처리한 후, 세사몰린의 세포 독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 세사몰린 처리에 따른 자연살해세포의 세포분화 촉진 여부를 유세포분석기를 통해 세포분화 마커인 CD56 발현정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 세사몰린 처리에 따른 자연살해세포에서 세포 성숙 인자인 CD107a의 발현증가 정도를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이며,
도 3b는 세사몰린 처리에 따른 자연살해세포에서 세포 성숙 인자인 NKG2D의 발현증가 정도를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 세사몰린 처리에 의한 자연살해세포의 병인세포 살해능력 증가 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진 활성을 갖는 세사몰린의 신규한 용도를 제공함에 특징이 있다.

자연살해세포(NK: natural killer)는 감염이나 암세포에 대한 체내 1차 방어선으로서, 혈액 내 순환하고 있는 림프구이다. 분비성 전염증 사이토카인(secreting proinflammatory cytokines)과 세포독성(cytotoxicity)을 자극함으로써 자연살해세포는 체내에 있는 감염된 세포나 전이된 세포를 제거한다.

따라서 질병치료 효과를 갖는 자연살해세포를 세포치료제로서 효과적으로 사용하기 위해서는 많은 수의 자연살해세포가 필요하지만 혈액 내 림프구에서 자연살해세포는 소량 존재하고 있어 사실상 충분한 세포수의 확보가 어려운 실정이다. 뿐만 아니라 자연살해세포를 이용한 세포 치료를 위해서는 생체외(in vitro) 상에서 상기 세포를 배양하는 것이 필요하며, 자연살해세포의 생체외 분화 조건을 최적화하는 것은 필요하다.

이러한 점에서 본 발명은 다량의 자연살해세포를 확보할 수 있는 방법으로서, 세사몰린을 자연살해세포에 처리할 경우 자연살해세포의 분화, 증식 또는 성숙을 효과적으로 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명은 세사몰린(sesamolin)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물을 제공할 수 있다.

한편, 세사몰린은 참기름 특유의 미랑 성분의 하나로서 항산화 활성이 있다고 알려져 있을 뿐, 이외 다른 기능에 대한 연구 내용은 보고된 바가 없다. 이에 본 발명에서는 자연살해세포의 분화와 증식에 영향을 주는 세사몰린의 기능을 최초로 규명하였다.

본 발명에서 용어 “자연살해세포의 증식촉진”이란 순수 분리된 자연살상(Natural killer) 세포를 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 자연살해 세포의 수를 증가시키는 것을 의미하는 것으로, 구체적으로 세사몰린을 처리하지 않은 대조군에 비해 세사몰린을 처리하였을 때 자연살해 세포 증식능이 증가하는 것을 의미한다.

생체 내 자연살해세포는 골수에서 분화 과정을 거치며 골수의 미세환경은 자연살해세포의 분화에 필수적이다. 자연살해세포는 분화 과정을 거침에 따라 다양한 표면 분자들을 순차적으로 획득하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에서는 세사몰린 처리에 의한 자연살해세포의 분화 및 성숙 촉진능을 확인하기 위해, 자연살해세포의 분화 및 성숙 마커인 CD56, CD107a 및 NKG2D의 발현 증가를 확인하였다.

그러므로 본 발명에서 용어 “자연살해세포의 분화촉진”이란, 자연살해세포의 전구체 상태에서 성숙한 자연살해세포로의 분화를 증진시키는 것을 의미하며, 또한 성숙한 자연살해세포의 활성을 증가시키는 것을 의미한다. 구체적으로는 세사몰린을 처리하지 않은 대조군에 비해 세사몰린을 처리하였을 때 자연살해세포의 분화가 증가하는 것을 의미한다.

상기 자연살해세포의 활성이란 앞서 기술한 자연살해세포가 갖는 기능의 작용이 발생 또는 증가되는 것을 의미하는 것으로, 병인세포, 비특이적 감염 병원균, 암세포 등을 감지하고 이를 제거 또는 살상하는 능력을 말한다.

또한 본 발명은 세사몰린(sesamolin)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식용 배지 조성물을 제공함에 특징이 있다.

본 발명의 상기 배지 조성물은 세사몰린을 통상적인 자연살해세포 배양에 이용되는 기본 배지에 첨가시켜 이용할 수 있다. 본 발명에서 “기본 배지”는 사용 목적에 따라 차이가 있으나 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청알부민(BSA) 및 보조인자 등을 기본적으로 포함하는 동물세포 배양용 배지로서, 당업자들에게 잘 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다. 특히 바람직하게, 상기 배지는 무기염류로서 NaCl, KCl 및 NaHCO3 등을 포함하고, 탄소원으로서 글루코즈, 나트륨 피루베이트 및 젖산칼슘염 등을 포함하며, 아미노산으로서 글루타민을 비롯한 필수아미노산 및 비필수아미노산을 포함하며, 보조인자로서 기타 미량원소 및 완충액 등을 포함할 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 배지는 또한 항생제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예로서 상기 기본 배지로는 동물세포 배양용으로 공지되어 상업화된 여러 배지, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등을 그대로 사용할 수 있으며, RPMI 1640을 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

나아가 본 발명은 세사몰린(sesamolin)을 자연살해세포에 처리하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진방법을 제공한다.

상기 “자연살해세포에 처리”는 자연살해세포를 포함하는 조직, 혈액, 혈청 등으로 직접 투여하거나 in vitro 상에서 순수 분리된 자연살해세포를 배양 전 또는 배양 중에 배양용 배지에 첨가하는 것을 포함한다. 상기 세사몰린을 자연살해세포에 처리함으로써 세사몰린 처리에 의한 자연살해세포의 증식과 분화 효과는 보다 현저히 증가된 효과를 얻을 수 있다.

일반적으로 자연살해세포를 증식시키는 방법은 크게 두 가지가 있다. 그 중 하나는 자연살해세포만을 순수하게 분리한 다음 지지세포(feeder cell)을 사용하면서 적절한 자극을 주어 증식시키는 방법이 있고, 다른 방법으로는 전체 말초혈 백혈구 세포(PBL;peripheral blood lymphocyte) 또는 말초혈 단핵구 세포(PBMC; peripheral blood mononuclear cell)에서 자연살해세포만을 선택적으로 증폭하여 상대적으로 많은 자연살해세포를 수득하는 방법이 있다. 그러나 이러한 종래 방법으로 수득된 자연살해세포는 세포 살해능이 떨어지고 순수한 자연살해세포만이 아닌 T 세포도 존재하기 때문에, 자가 MHC 분자에 의하여 자기 (self)와 비자기 (non-self)를 인식하는 T 세포를 제거하지 않는 한 자가이식에 한정될 수 밖에 없는 문제점이 있다.

그러나 본 발명에 따른 세사몰린이 처리된 자연살해세포는 세사몰린만을 처리하는 간단한 방법으로 자연살해세포의 증식을 월등히 증가시킬 수 있으며, 세사몰린이 처리된 자연살해세포는 우수한 세포살해능을 갖는다는 것을 실험을 통해 확인하였다.

본 발명에 따른 세사몰린을 자연살해세포에 처리하는 방법은, 10~100㎍/ml의 세사몰린을 자연살해세포 자체 또는 상기 세포의 배양액에 처리하고 24~72시간 동안 배양하는 단계를 통해 수행한다.

상기 10㎍/ml 미만으로 처리하게 되면, 자연살해세포의 증식과 분화 효과를 도출할 수 없는 문제점이 있으며, 반면 100㎍/ml를 초과하여 처리하게 되면 자연살해세포 자체에 독성을 유발시킬 수 있으며, 또한 더 좋은 효과가 유도되지도 않아 비경제적인 문제점이 있다.

또한 본 발명의 방법에 의하면 세사몰린을 처리하게 되면 24~72시간의 단 기간 안에 증식과 분화가 충분히 진행된 성숙한 자연살해세포를 다량 확보할 수 있어, 자연살해세포의 생산 효율을 증진시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

세사몰린의 세포독성 여부 확인

세사몰린의 세포 독성 여부를 확인하기 위해, 자연살해세포(NK cell)에 세사몰린을 농도별로 처리한 후, 72시간 배양한 다음 세포 독성여부를 세포 생존 측정을 통해 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 세사몰린 무처리군과 처리군에서 세포생존율에 큰 변화를 초래하지 않는 것을 알 수 있었다.

따라서, 세사몰린이 세포에 독성을 유발시키지 않아 세포 내에 안정한 물질임을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2>

세사몰린의 자연살해세포 세포분화 증가 활성 확인

세사몰린이 자연살해세포의 세포분화에 미치는 영향을 분석하기 위해, 생체 외에서 NK 전구체 세포를 대상으로 세사몰린을 농도별로 처리한 후(10㎍/ml, 20㎍/ml, 40㎍/ml) NK 세포의 분화여부를 확인할 수 있는 인자인 CD56의 발현 여부를 유세포분석기를 통해 분석하였다.

분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 본 발명의 세사몰린을 처리한 NK 세포에서는 처리하지 않은 대조군에 비해 CD56의 발현이 증가된 세포가 더 많은 것으로 나타났고, 세사몰린 처리 농도 의존적으로 CD56의 발현 정도가 증가한 것으로 나타났다.

이러한 결과는 본 발명의 세사몰린이 자연살해세포의 분화를 촉진시키는 활성이 있음을 의미한다.

< 실시예 3>

세사몰린의 자연살해세포 세포성숙 촉진 활성 확인

또한 본 발명자들은 세사몰린이 자연살해세포의 세포성숙에도 영향을 미치는지 분석하기 위해, NK 세포에 세사몰린을 농도별로 처리한 후, 세포성숙 인자(마커)인 CD107a 및 NKG2D의 발현정도를 유세포분석기로 측정하였다.

그 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 세사몰린의 처리 농도 의존적으로 NK 세포 표면에 CD107a 및 NKG2D가 발현된 세포수가 증가되어 있는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 세사몰린이 자연살해세포의 분화 촉진뿐만 아니라 세포 성숙도 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

세사몰린에 의한 자연살해세포의 병인세포 살해능 확인

상기 실시예들을 통해 세사몰린을 NK(자연살해세포)에 처리할 경우, NK 세포의 세포분화와 세포 성숙을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 세사몰린 처리에 의해 분화 및 성숙이 촉진된 자연살해세포가 병인세포에 대한 살해능력을 증진시킬 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 하기 표와 같이 각각의 실험군에 세사몰린을 달리 처리한 후, NK 세포에 의한 암세포의 세포살해능을 세포독성 여부로 분석하였다.

실험군

실험군	처리 내용
A군	NK 세포에만 세사몰린 처리(20㎍/ml, 40㎍/ml), 암세포는 세사몰린 무처리
B군	암세포에 세사몰린 20㎍/ml 처리, NK 세포에 세사몰린 처리(20㎍/ml, 40㎍/ml)
C군	암세포에 세사몰린 40㎍/ml 처리, NK 세포에 세사몰린 처리(20㎍/ml, 40㎍/ml)

분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 암세포와 자연살해세포 모두에 세사몰린을 처리한 군이 암세포 또는 자연살해세포에만 세사몰린을 처리한 군에 비해 자연살해세포의 병인세포 살해능력이 월등하게 증가되는 것으로 나타났다. 또한 자연살해세포의 살해 능력 증가 효과는 세사몰린의 처리 농도에 비례하여 증가되는 것으로 나타났다.

< 실시예 5>

세사몰린에 의한 자연살해세포의 세포증식 활성 확인

나아가 본 발명자들은 본 발명의 세사몰린이 자연살해세포의 증식을 촉진하는 활성이 있는지 확인하기 위해, 상기 실시예에서 사용한 자연살해세포에 본 발명의 세사몰린을 농도별로 처리한 후(10㎍/ml, 20㎍/ml, 40㎍/ml), CFSE dividing 방법을 이용하여 세포 증식 정도를 측정하였다. 이때 대조군으로는 세사몰린을 처리하지 않은 군을 사용하였다. CFSE dilution은 세포내 단백질을 형광물질로 표지한 후 세포 분열(핵 분열 및 세포질 분열) 시 형광 표지된 단백질들이 절반으로 나뉘어져 모세포가 딸세포 2개로 나누어지는 것을 측정함으로써 세포증식을 확인할 수 있는 방법이다. 5 μM의 CFSE로 37℃에서 10분간 자연살해세포에 처리하여 반응시키고, PBS 완충용액으로 3번 세척한 후, CFSE-표지된 자연살해세포를 FACScalibur를 이용하여 형광의 세기를 측정함으로써 세포수를 확인하였다.

그 결과, 세사몰린을 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 자연살해 세포 증식이 현저하게 증가되는 것으로 나타났으며, 세사몰린 처리 농도 의존적으로 세포분열이 더 많이 일어난 것으로 확인됨에 따라, 궁극적으로 세사몰린이 자연살해세포의 증식을 유도 및 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

1. 세사몰린(sesamolin)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 세사몰린은 자연살해세포에서 CD56, CD107a 및 NKG2D의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물.
3. 세사몰린(sesamolin)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식용 배지 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 세사몰린은 10~100㎍/ml로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식용 배지 조성물.
5. 세사몰린(sesamolin)을 자연살해세포에 처리하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 세사몰린은 10~100㎍/ml의 농도로 상기 자연살해세포에 처리한 후, 24~72시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진방법.

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