KR102603628B1 - 자연살해세포 분화, 증식 또는 활성화용 조성물, 이를이용하여 자연살해세포를 분화, 증식 또는 활성화시키는 방법, 및 이를 통해 생산된 자연살해세포 - Google Patents
자연살해세포 분화, 증식 또는 활성화용 조성물, 이를이용하여 자연살해세포를 분화, 증식 또는 활성화시키는 방법, 및 이를 통해 생산된 자연살해세포 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자연살해세포로 분화, 증식 또는 활성화용 조성물, 이를 이용하여 자연살해세포로 분화, 증식 또는 활성화시키는 방법을 제공하고, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 생산방법을 제공하며, 상기 조성물 및 방법으로 생산된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 자연살해세포로 분화시키기 위한 조성물, 자연살해세포의 증식 또는 활성화용 조성물, 이를 이용하여 자연살해세포로 분화, 자연살해세포를 증식 또는 활성화시키는 방법, 및 이를 통해 생산된 자연살해세포에 관한 것이다.
자연살해(Natural killer, NK) 세포는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구이다. 자연살해 세포는 면역화 과정 없이 세포용해 작용을 일으키는 림프구로 종양세포나 바이러스 감염세포를 죽이는 역할을 담당한다. 체내에는 약 1억 개의 자연살해 세포가 있으며, 전체 림프구 중 5~10%를 차지하는데 T세포와 달리 간이나 골수에서 성숙한다.
체내에 존재하는 대부분의 NK 세포는 정상상태에서 비활성화 상태 (inactivated state)로 존재하나, 실제로 NK 세포를 질병 치료 용도로 이용하기 위해서는 활성화된 NK 세포가 필요하다. 이에 정상혈액으로부터 혹은 NK 세포가 비활성화된 환자 혈액으로부터 NK 세포를 활성화시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.
체외에서 NK 세포를 활성화시키는 경우, NK 세포는 높은 세포독성 (Cytotoxicity)을 나타내는 것으로 확인되었고, 이는 NK 세포를 이용한 면역세포 치료 가능성을 확인시켜 주었다. 체외에서 활성화된 NK 세포를 다양한 암 종류, 특히 백혈병과 같은 혈액암(Blood cancer) 환자를 대상으로 동종 골수이식 후에 투여하여 그 치료 효과를 확인한 보고가 있다.
NK 세포의 치료제로서의 가능성에도 불구하고 체내에 존재하는 NK 세포의 수는 많지 않으므로 NK 세포를 치료 용도로 사용할 수 있을 정도로 충분한 효능을 유지하면서 대량으로 생산하는 기술이 필수적이다. 그러나, NK 세포는 시험관 내에서(in-vitro) 대량 증식 및 배양이 제대로 이루어지지 않는다. 따라서 유용한 수준으로 NK 세포를 증폭, 배양하는 기술에 대한 관심이 집중되고 있으며, 많은 연구가 진행되고 있지만 아직 임상에 적용 가능한 수준에는 미치지 못하고 있다.
본 발명의 목적은, 자연살해세포로 분화시키기 위한 조성물, 자연살해세포 증식용 조성물 또는 자연살해세포 활성화용 조성물을 제공하고, 이를 이용하여 자연살해세포로 분화, 자연살해세포를 증식 또는 활성화시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 시험관 내(in-vitro)에서 우수한 항바이러스 활성을 가지는 자연살해세포를 대량으로 생산할 수 있는 조성물 및 이를 이용하여 우수한 항바이러스 활성을 가지는 자연살해세포를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기와 같이 대량으로 분화, 증식, 활성화 또는 생산된 우수한 항바이러스 활성을 가지는 자연살해세포를 바이러스 감염 예방 또는 치료용으로 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 분화용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 포함된 CCL-20 및 인터루킨-8은 CD56을 발현하는 세포를 증가시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 0.01 ng/mL 내지 1000 ng/mL로 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:9 내지 9:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 분화용 키트를 제공한다.
또한, CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 말초혈액단핵구에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 말초혈액단핵구에서 자연살해세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 증식용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 증식용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 자연살해세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 증식 방법을 제공한다.
상기 자연살해세포는 CCL20 및 인터루킨-8을 포함하는 조성물을 말초혈액단핵구에 처리하여 유도된 자연살해세포 또는 말초혈액에서 분리된 자연살해세포인 것일 수 있다.
상기 방법은 5일 이상을 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 활성화용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 자연살해세포의 항바이러스성을 활성화시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 자연살해세포에서 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46 중 선택된 하나 또는 둘 이상의 발현 수준을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 활성화용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 자연살해세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 활성화 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 자연살해세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 방법에 따라 얻어진 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 바이러스는 상기 바이러스는 알파 코로나 바이러스속(Alphacoronavirus), 베타 코로나 바이러스속(Betacoronavirus), 감마 코로나 바이러스속(Gammacoronavirus), 델타 코로나 바이러스속(Deltacoronavirus), 메르베코 바이러스(Merbecovirus) 아속 및 사르베코 바이러스(Sarbecovirus) 아속으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, CCL-20 및 인터루킨-8을 포함한 조성물을 이용하여 말초혈액단핵구로부터 항바이러스 활성을 갖는 자연살해세포를 유도할 수 있고, 자연살해세포를 증식 및 활성화시키는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따르면, CCL-20 및 인터루킨-8을 포함한 조성물을 이용하여 자연살해세포를 시험관 내(in-vitro)에서 대량으로 제조할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따르면, CCL-20 및 인터루킨-8을 포함한 조성물을 이용하여 우수한 항바이러스 활성을 가지는 자연살해세포를 대량으로 제조할 수 있으므로, 이를 바이러스 감염 예방 또는 치료용으로 사용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 SARS-CoV-2 오미크론 변이체에 감염된 세포의 배양액에서 존재하는 사이토카인의 종류 및 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 CCL-20 및 인터루킨-8을 포함(0, 5, 100 ng/mL 농도)하는 배지에서 말초혈액단핵구를 배양한 후 세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CCL-20 및 인터루킨-8을 포함하는 배지에서 자연살해세포를 배양한 후 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46의 발현 수준을 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 CCL-20 및 인터루킨-8을 포함하는 배지에서 배양된 자연살해세포와 3종의 대조군(NC, PBMC, chemokine 미처리 NK)의 항바이러스 활성을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 CCL-20 및 인터루킨-8을 포함(0, 5, 100 ng/mL 농도)하는 배지에서 말초혈액단핵구를 배양한 후 세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CCL-20 및 인터루킨-8을 포함하는 배지에서 자연살해세포를 배양한 후 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46의 발현 수준을 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 CCL-20 및 인터루킨-8을 포함하는 배지에서 배양된 자연살해세포와 3종의 대조군(NC, PBMC, chemokine 미처리 NK)의 항바이러스 활성을 비교하여 나타낸 그래프이다.
본 발명을 상세하기 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.
본 발명에서, "배양"은 생물체나 생물체의 일부(기관, 조직, 세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
본 발명에서, "배지"는 미생물이나 세포, 혹은 이끼 같은 작은 식물 등을 증식시키기 위해 고안된 액체나 겔(Gel) 상태의 영양원을 의미한다. 배지는 배양할 세포의 종류에 따라 각기 다른 종류의 배지를 사용할 수 있다.
본 발명에서, "케모카인"(chemokine; 화학유인물질 사이토카인, chemotactic cytokine)은 사이토카인(cytokine)의 일종으로, 화학주성(chemotaxis) 성질을 가지는 사이토카인을 의미한다. 본 발명의 CCL-20과 인터루킨-8도 케모카인의 일종이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명의 발명자들은 SARS-CoV-2 오미크론 변이체에 감염된 세포에서 CCL-20 및 인터루킨-8(이하, IL-8로 기재함)이 유의미하게 많이 분비되는 것을 확인하였고(도 1), 상기 케모카인 조합을 세포 배양에 적용하여 자연살해세포로 분화시키기 위한 조성물, 자연살해세포를 증식 또는 활성화용 조성물, 이를 이용하여 자연살해세포로 분화, 자연살해세포를 증식 또는 활성화시키는 방법, 및 이를 통해 배양된 항바이러스 활성을 가진 자연살해세포를 개발하였다.
특정 바이러스에 감염된 세포로부터 증가된 사이토카인을 바이러스 감염과 유사한 환경을 조성하기 위해 자연살해세포 세포 분화, 증식, 활성화용 배양에 사용했을 때 이로부터 고농도의 자연살해세포를 배양할 수 있고, 배양된 자연살해세포의 항바이러스 활성이 우수함을 확인하였다.
본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 분화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 분화용 키트를 제공한다.
상기 자연살해세포 분화용 조성물은 구체적으로는 말초혈액단핵구로부터 자연살해세포(이하, NK 세포와 병용함)로 분화시킬 수 있다.
상기 말초혈액단핵구(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 둥근 핵을 가진 말초혈액세포로 본 발명에서 말초혈액단핵구는 통상적으로 사용되는 의미인 말초혈액에서 분리된 단핵구(Mononuclear cell)를 의미한다.
상기 조성물은 배지 조성물로서 세포 배양용 배지를 포함할 수 있고, 상기 배지는 예를 들면 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's 배지, KBM 배지, i-배지(i-Medium) 및 X-Vivo 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있다.
상기 CCL-20 및 인터루킨-8을 포함하는 조성물은 CD56을 발현하는 세포를 증가시키는 것 일 수 있다. 상기 CD56은 자연살해세포의 마커로서, 본 발명의 실시예에서 CCL-20 및 IL-8을 포함하는 배지에서 말초혈액단핵구(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 배양한 결과, 이 배양 배지에서 CD56(NK 세포 마커)을 발현하는 세포가 증가하는 것을 확인하여 PBMC가 NK 세포로 분화된 것을 확인하였다(도 2).
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 0.01 ng/mL 내지 1000 ng/mL로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL로 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 2 ng/mL 내지 100 ng/mL, 3 ng/mL 내지 100 ng/mL, 4 ng/mL 내지 100 ng/mL, 또는 5 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도가 느릴 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 첨가하는 CCL-20 및 인터루킨-8의 농도에 비하여 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도 증가가 비효율적일 수 있다. 본 발명의 실시예에서, CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 저농도 5 ng/mL를 포함하는 조성물 및 고농도 100 ng/mL를 포함하는 조성물로 PBMC 배양하여 NK 세포로 분화시켰으므로 상기 범위의 농도에서 PBMC를 NK 세포로 분화시킬 수 있음을 알 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:9 내지 9:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 농도비를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 3:7 내지 7:3의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 말초혈액단핵구에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 말초혈액단핵구에서 자연살해세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
상기 조성물은 배지 조성물로서 세포 배양용 배지를 포함할 수 있고, 상기 배지는 예를 들면 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's 배지, KBM 배지, i-배지(i-Medium) 및 X-Vivo 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있다.
상기 처리는 상기 조성물을 포함하는 배지에서 자연살해세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배양은 1일 내지 30일, 바람직하게는 1일 내지 20일 동안 수행될 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 0.01 ng/mL 내지 1000 ng/mL로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL로 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 2 ng/mL 내지 100 ng/mL, 3 ng/mL 내지 100 ng/mL, 4 ng/mL 내지 100 ng/mL, 또는 5 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도가 느릴 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 첨가하는 CCL-20 및 인터루킨-8의 농도에 비하여 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도 증가가 비효율적일 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:9 내지 9:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 농도비를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 3:7 내지 7:3의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 증식용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 증식용 키트를 제공한다.
본 발명의 실시예에서 CCL-20 및 IL-8을 포함하는 배지에서 자연살해세포를 배양한 결과, 대조군과 비교하여 CCL-20 및 IL-8을 포함하는 배지에서 배양되는 자연살해세포의 증식 속도가 우수함을 확인하였다(도 2 참조).
상기 조성물은 배지 조성물로서 세포 배양용 배지를 포함할 수 있고, 상기 배지는 예를 들면 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±mplete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's 배지, KBM 배지, i-배지(i-Medium) 및 X-Vivo 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 0.01 ng/mL 내지 1000 ng/mL로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL로 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 2 ng/mL 내지 100 ng/mL, 3 ng/mL 내지 100 ng/mL, 4 ng/mL 내지 100 ng/mL, 또는 5 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도가 느릴 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 첨가하는 CCL-20 및 인터루킨-8의 농도에 비하여 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도 증가가 비효율적일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 저농도 5 ng/mL를 포함하는 조성물 및 고농도 100 ng/mL를 포함하는 조성물로 배양하여 자연살해세포로 증식시켰으므로 상기 범위의 농도에서 자연살해세포를 증식시킬 수 있음을 알 수 있다(도 2 참조).
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:9 내지 9:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 농도비를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 3:7 내지 7:3의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 자연살해세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 증식 방법을 제공한다.
상기 자연살해세포는 CCL20 및 인터루킨-8을 포함하는 조성물을 말초혈액단핵구에 처리하여 유도된 자연살해세포 또는 말초혈액에서 분리된 자연살해세포인 것일 수 있다. 즉, 자연살해세포 분화용 조성물 및 전술한 말초혈액단핵구에서 자연살해세포로의 분화 유도 방법을 이용하여 유도된 말초혈액단핵구이거나 또는 말초혈액에 포함된 자연살해세포를 분리한 것일 수 있다.
상기 조성물은 배지 조성물로서 세포 배양용 배지를 포함할 수 있고, 상기 배지는 예를 들면 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's 배지, KBM 배지, i-배지(i-Medium) 및 X-Vivo 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있다.
상기 처리는 상기 조성물을 포함하는 배지에서 자연살해세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배양은 1일 내지 30일, 바람직하게는 1일 내지 20일 동안 수행될 수 있다. 또한 상기 조성물에서 자연살해세포를 5일 이상 배양하는 것일 수 있다. 도 2를 참조하면, CCL20 및 인터루킨-8을 포함하는 조성물에서 5일 이상 배양하는 경우, 바람직하게는 7일 이상 배양할 때 증식된 자연살해세포의 수가 크게 증가하는 것을 확인할 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 0.01 ng/mL 내지 1000 ng/mL로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL로 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 2 ng/mL 내지 100 ng/mL, 3 ng/mL 내지 100 ng/mL, 4 ng/mL 내지 100 ng/mL, 또는 5 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도가 느릴 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 첨가하는 CCL-20 및 인터루킨-8의 농도에 비하여 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도 증가가 비효율적일 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:9 내지 9:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 농도비를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 3:7 내지 7:3의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 활성화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포 활성화용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상기 자연살해세포의 항바이러스성을 활성화시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 상기 자연살해세포에서 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46 중 선택된 하나 또는 둘 이상의 발현 수준이 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 CCL-20 및 IL-8을 포함하는 배지에서 자연살해세포를 배양한 결과, CCL-20 및 IL-8을 포함하는 배지에서 배양되는 자연살해세포는 대조군에 비하여 항바이러스 활성과 관련 있는 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46의 발현수준이 모두 2배 이상 높아진 것을 확인하였다(도 4 참조).
상기 조성물은 배지 조성물로서 세포 배양용 배지를 포함할 수 있고, 상기 배지는 예를 들면 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's 배지, KBM 배지, i-배지(i-Medium) 및 X-Vivo 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 0.01 ng/mL 내지 1000 ng/mL로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL로 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 2 ng/mL 내지 100 ng/mL, 3 ng/mL 내지 100 ng/mL, 4 ng/mL 내지 100 ng/mL, 또는 5 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도가 느릴 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 첨가하는 CCL-20 및 인터루킨-8의 농도에 비하여 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도 증가가 비효율적일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 저농도 5 ng/mL를 포함하는 조성물 및 고농도 100 ng/mL를 포함하는 조성물로 PBMC 배양하여 NK 세포로 분화시켰으므로 상기 범위의 농도에서 PBMC를 NK 세포로 분화시킬 수 있음을 알 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:9 내지 9:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 농도비를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 3:7 내지 7:3의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 자연살해세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 활성화 방법을 제공한다.
상기 자연살해세포는 CCL20 및 인터루킨-8을 포함하는 조성물을 말초혈액단핵구에 처리하여 유도된 자연살해세포 또는 말초혈액에서 분리된 자연살해세포인 것일 수 있다. 즉, 자연살해세포 분화용 조성물 및 전술한 말초혈액단핵구에서 자연살해세포로의 분화 유도 방법을 이용하여 유도된 말초혈액단핵구이거나 또는 말초혈액에 포함된 자연살해세포를 분리한 것일 수 있다.
상기 조성물은 배지 조성물로서 세포 배양용 배지를 포함할 수 있고, 상기 배지는 예를 들면 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±complete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's 배지, KBM 배지, i-배지(i-Medium) 및 X-Vivo 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있다.
상기 방법은 상기 조성물을 포함하는 배지에서 자연살해세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배양은 1일 내지 30일, 바람직하게는 1일 내지 20일 동안 수행될 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 0.01 ng/mL 내지 1000 ng/mL로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL로 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 2 ng/mL 내지 100 ng/mL, 3 ng/mL 내지 100 ng/mL, 4 ng/mL 내지 100 ng/mL, 또는 5 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도가 느릴 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 첨가하는 CCL-20 및 인터루킨-8의 농도에 비하여 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도 증가가 비효율적일 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:9 내지 9:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 농도비를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 3:7 내지 7:3의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 자연살해세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산 방법을 제공할 수 있다.
상기 조성물은 항바이러스 활성을 가지는 자연살해세포를 대량으로 배양, 생산, 또는 제조할 수 있다.
상기 자연살해세포는 말초혈액단핵구로부터 배양되거나, 말초혈액단핵구에 처리하여 유도된 자연살해세포 또는 말초혈액에서 분리된 자연살해세포로부터 배양될 수 있다.
상기 조성물은 배지 조성물로서 세포 배양용 배지를 포함할 수 있고, 상기 배지는 예를 들면 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's 배지, KBM 배지, i-배지(i-Medium) 및 X-Vivo 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 0.01 ng/mL 내지 1000 ng/mL로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL로 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 2 ng/mL 내지 100 ng/mL, 3 ng/mL 내지 100 ng/mL, 4 ng/mL 내지 100 ng/mL, 또는 5 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도가 느릴 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 첨가하는 CCL-20 및 인터루킨-8의 농도에 비하여 자연살해세포의 성장 또는 증폭 속도 증가가 비효율적일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 저농도 5 ng/mL를 포함하는 조성물 및 고농도 100 ng/mL를 포함하는 조성물로 PBMC 배양하여 NK 세포로 분화시켰으므로 상기 범위의 농도에서 PBMC를 NK 세포로 분화시킬 수 있음을 알 수 있다.
상기 조성물은 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:9 내지 9:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 농도비를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 3:7 내지 7:3의 농도비로 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:1의 농도비로 포함하는 것일 수 있다.
상기 처리는 상기 조성물을 포함하는 배지에서 자연살해세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배양은 1일 내지 30일, 바람직하게는 1일 내지 20일 동안 수행될 수 있다.
도 2를 참조하면 말초 혈액 단핵구를 CCL-20 및 IL-8을 포함하는 배지에서 배양했을 때 자연살해세포 마커인 CD56을 발현하는 세포 수가 배양 일수가 증가함에 따라 현저히 증가하고, 또한, 도 3 및 도 4를 참조하면 CCL-20 및 IL-8을 포함하는 배지에서 배양힌 자연살해세포의 항바이러스 활성이 증가 및/또는 향상되므로, 본 발명에 따른 조성물은 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산에 유용함을 알 수 있다.
본 발명은 전술한 자연살해세포 분화용 조성물, 자연살해세포 증식용 조성물, 자연살해세포 활성화용 조성물 또는 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산용 조성물을 이용하여 배양된 자연살해세포 또는 전술한 말초혈액단핵구에서 자연살해세포로의 분화 유도 방법, 자연살해세포의 증식 방법, 자연살해세포의 활성화 방법 또는 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산 방법에 따라 얻어진 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 코로나바이러스(SARS-CoV-2 오미크론 변이체)에 감염된 세포의 배양액에서 증가된 사이토카인으로 유도, 증식 및/또는 활성화시킨 자연살해세포를 포함하는 것을 특징으로 한다.
신종 코로나바이러스 감염증(코로나19) 환자들은 선천면역 반응을 담당하는 주된 면역세포인 자연살해세포의 수 및 항바이러스 기능이 감소되어 있다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물을 사용하면 자연살해세포의 세포 수 및 항바이러스 기능을 상향 조절할 수 있다.
본 발명에서, 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 바이러스의 활성, 복제 등을 억제하는 것뿐만 아니라, 바이러스에 의해 유발되는 모든 질환들의 예방 및/또는 치료 용도로도 사용될 수 있는 약학적 조성물을 의미한다.
상기 바이러스는 알파 코로나 바이러스속, 베타 코로나 바이러스속, 감마 코로나 바이러스속, 델타 코로나 바이러스속, 메르베코 바이러스 아속 및 사르베코 바이러스 아속으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 전신 또는 국부로 투여될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위해 일반적으로 사용될 수 있는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 부형제(또는 희석제)를 사용하여 제형화될 수 있다. 이하, 부형제 및 제형 방법에 대해 구체적으로 예시하지만, 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
경구 투여를 위한 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함할 수 있으며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제형은, 예를 들면 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 들 수 있으며, 액상 제형은 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 유제, 흡입제, 좌제 등을 포함할 수 있다. 주사제는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트 등과 같은 에스테르 등의 멸균된 수성 용제, 비수성 용제 및 현탁제를 포함할 수 있고, 좌제는 기제로서 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등을 포함할 수 있다. 또한, 국소 적용을 위해 본 발명의 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 연고나 크림으로 제형화할 수도 있다.
또한, 상기 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간 등의 다수의 인자에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 또한 투여 경로는 환자의 상태 및 그의 중증도에 따라 변화할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예 1
단일층으로 배양한 A549 세포(인간 폐암 세포)에 SARS-CoV-2 오미크론 변이체(hCoV-19/Korea/KDCA447321/2021, NCCP43408, 질병관리청 분양)를 3Х102 PFU/mL로 감염시켰다. 이후, 3 DPI (Day post inoculation)에 세포 상등액(Supernatant)을 회수하여 사이토카인 어레이를 진행하였다. 사이토카인 어레이는 R&D systems의 Proteome Profiler Human XL Cytokine Array Kit를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 면역블랏 이미지는 BIO-RAD의 Chemidoc XRS+system으로 확인하였고, 블랏의 각 스팟 (Spot)은 ImageJ 소프트웨어로 분석하였고, 그 결과를 도 1(청색: 대조군, 주황색: SARS-CoV-2 오미크론 감염세포)에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 대부분의 사이토카인은 발현 수준에 유의미한 변화가 없었으나, IL-8과 CCL20(CCL20은 MIP-3α로도 알려짐)의 발현은 대조군과 비교하여 상당히 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 2
건강한 공여자로부터 말초혈액을 분리하고, Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리를 사용하여 획득한 말초혈액으로부터 말초 혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell; 이하, PBMC로 기재함)를 분리하였다. 분리한 PBMC(1x106 cells)를 CCL-20 및 IL-8 각각을 무첨가, 저농도 5 ng/mL, 고농도 100 ng/mL로 포함하는 KBM502 배지에서 14일 동안 배양하였고, 그 결과를 도 2로 나타내었다.
도 2를 참조하면, 세포 배양 후 유세포분석을 수행한 결과, CCL-20 및 IL-8을 포함하는 배지에서 배양했을 때 자연살해세포 마커인 CD56을 발현하는 세포 수가 증가한 것을 알 수 있었다. 또한, 배양 초기에는 세포 증식 속도(세포 수)에 큰 차이가 없으나 CCL-20 및 IL-8을 포함하는 배지에서 7일 이상 배양하면 세포 수가 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3
실시예 2와 동일한 방법으로 분리한 PBMC를 CCL-20과 인터루킨-8 각각 4 ng/mL로 포함하는 KBM502 배지에서 14일 동안 배양하였다.
이후 상기와 같이 배양된 자연살해세포의 항바이러스 활성과 관련 있는 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46의 발현 수준을 대조군(PBMC, 배양 일수 DO)과 비교하여 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 대조군과 비교하여 케모카인(CCL-20+IL-8)을 포함하는 배지에서 배양한 자연살해세포의 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46의 발현 수준이 2배 이상으로 높은 것을 알 수 있었다. 이 결과는 CCL-20과 인터루킨-8에 의해 자연살해세포의 항바이러스 활성이 증가했음을 의미한다.
실시예 4
본 발명에 따른 CCL-20 및 인터루킨-8을 포함하는 배지에서 배양한 자연살해세포(chemokine 처리 NK)의 항바이러스 활성을 확인하기 위하여, Vero E6 세포에 SARS-CoV-2 오미크론 바이러스 3Х102 PFU/mL로 감염시킨 대조군(NC), 이에 대하여 PBMC로 처리(PBMC, 1.5x106 cells), CCL-20+IL-8 미처리 NK 세포로 처리(chemokine 미처리 NK: CCL-20+IL-8 미포함 배지에서 14일 배양함, 1.5x106 cells), CCL-20+IL-8 처리 NK 세포로 처리(chemokine 처리 NK: CCL-20 및 IL-8 각각을 4 ng/mL 포함 배지에서 14일 배양함, 1.5x106 cells)하고, DMEM 배지에서 2일 배양한 후 상층액을 수득하여 바이러스 양(TCID50)을 측정하였다.
도 4를 참조하면, 본 발명에 따라 CCL-20 및 인터루킨-8을 포함하는 배지에서 배양한 자연살해세포를 SARS-CoV-2 오미크론 바이러스에 처리한 결과, PBMC 또는 케모카인(CCL-20+IL-8) 미포함 배지에서 배양한 자연살해세포를 처리한 것에 비하여 잔존 바이러스 양이 감소하여 항바이러스 활성이 향상됨을 확인하였다.
지금까지 본 발명의 자연살해세포 분화, 증식, 활성화용 조성물, 또는 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산용 조성물, 이를 이용하여 자연살해세포로 분화, 증식, 활성화시키는 방법, 또는 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 생산방법 및 이를 통해 배양된 자연살해세포에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (21)
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8은 CD56을 발현하는 세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포 분화용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 0.01 ng/mL 내지 1000 ng/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포 분화용 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8을 1:9 내지 9:1의 농도비로 포함하는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포 분화용 조성물.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8은 CD56을 발현하는 세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포 분화용 키트.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 말초혈액단핵구에 처리하여 배양하는 단계를 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8은 CD56을 발현하는 세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 말초혈액단핵구에서 자연살해세포로의 분화 유도 방법.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8은 CD56을 발현하는 세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포 증식용 조성물.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8은 CD56을 발현하는 세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포 증식용 키트.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 자연살해세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8은 CD56을 발현하는 세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포의 증식 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 자연살해세포는
CCL20 및 인터루킨-8을 포함하는 조성물을 말초혈액단핵구에 처리하여 유도된 자연살해세포 또는 말초혈액에서 분리된 자연살해세포인 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포의 증식 방법.
- 제9항에 있어서,
5일 이상을 배양하는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포의 증식 방법.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8은 자연살해세포에서 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46의 발현 수준을 증가시켜 항바이러스 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포 활성화용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8은 자연살해세포에서 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46의 발현 수준을 증가시켜 항바이러스 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포 활성화용 키트.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 자연살해세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8은 자연살해세포에서 CD16, NKG2D, NKp44 및 NKp46의 발현 수준을 증가시켜 항바이러스 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 자연살해세포의 활성화 방법.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 1 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산용 조성물.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 유효성분으로 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 1 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산용 키트.
- CCL-20 (C-C Motif Chemokine Ligand 20) 및 인터루킨-8 (Interleukin-8)을 포함한 조성물을 자연살해세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하고,
상기 CCL-20 및 인터루킨-8을 각각 1 ng/mL 내지 100 ng/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는,
시험관 내(in-vitro) 바이러스 감염 예방 또는 치료용 자연살해세포의 대량 생산 방법.
- 삭제
- 삭제
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